FI113184B - Restriktiofragmentin selektiivinen monistaminen, yleinen menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseksi - Google Patents
Restriktiofragmentin selektiivinen monistaminen, yleinen menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI113184B FI113184B FI941360A FI941360A FI113184B FI 113184 B FI113184 B FI 113184B FI 941360 A FI941360 A FI 941360A FI 941360 A FI941360 A FI 941360A FI 113184 B FI113184 B FI 113184B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- dna
- restriction
- fragments
- sequence
- primers
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 125
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 307
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 292
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 210
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 120
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 118
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 22
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 17
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 45
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 45
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 56
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 30
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 28
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 18
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 14
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 14
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 12
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 11
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 11
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 5
- 241001293495 Lactuca virosa Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 5
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 3
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 3
- 101000836337 Homo sapiens Probable helicase senataxin Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 102100027178 Probable helicase senataxin Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101001077660 Homo sapiens Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 235000015802 Lactuca sativa var crispa Nutrition 0.000 description 2
- 240000004201 Lactuca sativa var. crispa Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 102100025144 Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 7-hydroxy-8-[(E)-phenyldiazenyl]naphthalene-1,3-disulfonic acid Chemical compound OC1=CC=C2C=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C2=C1\N=N\C1=CC=CC=C1 MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100033886 Arylsulfatase F Human genes 0.000 description 1
- 101150116295 CAT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100326920 Caenorhabditis elegans ctl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 101000925557 Homo sapiens Arylsulfatase F Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 101100126846 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) katG gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 1
- 101150009150 TACR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000001949 Taraxacum officinale Species 0.000 description 1
- 235000005187 Taraxacum officinale ssp. officinale Nutrition 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Power Conversion In General (AREA)
- Auxiliary Devices For Music (AREA)
- Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
113184
Restriktiofragmentin selektiivinen monistaminen, yleinen menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee DNA-sormenjälkien ottamisen sovellutuksia ja DNA-tunnusten käyttöä monilla eri alueilla, kasvi- ja eläinjalostuksessa, alalajin tai lajikkeen identifioinnissa, diagnostisessa lääketieteessä, taudinmäärityksessä eläimillä tai kasveilla, geneettisesti periytyvien sai-10 rauksien identifioinnissa, sukulaisuussuhteen analyysissä, oikeuslääketieteellisessä analyysissä ihmisellä ja muun muassa mikrobityypityksessä, mutta keksintö ei rajoitu niihin.
Tarkemmin sanottuna tämä keksintö koskee menetelmiä DNA-sor-15 menjälkien ottamiseksi sekä spesifisten DNA-tunnusten havaitsemiseksi genomeissa, jotka ulottuvat mikro-organismeista korkeampiin kasveihin, eläimiin ja ihmisiin. Keksintö liittyy myös synteettisiin DNA-molekyyleihin sekä niihin perustuviin tuotteisiin, joita käytetään keksinnön mukaisissa menetel-20 missä sen eri sovellutusalueilla.
DNA-sormenjälkien ottaminen DNA-sormenjälkien ottaminen eli DNA-tyypitys samoin kuin muut ί,,,ϊ genotyypin määrittämis-, profilointi- ja DNA:n identifiointi- : 25 analyysimenetelmät luetaan kuuluviksi yksilön, alalajin, ro- dun tai lajien geenirakenteen joko samankaltaisuuksien tai yhden tai useamman erottavan piirteen luonnehtimiseen. On olemassa yleinen sääntö, että mitä läheisempi geneettinen suhde on, sitä suurempi on genomien yhtäläisyys tai sitä » · 30 tarkoituksenmukaisempi on genomien samankaltaisuus, ja sen ,, , seurauksena tunnusmerkilliset genomien piirteet ovat har- • vinaisia. Nämä samanlaiset tai erottavat piirteet voidaan ilmaista analysoimalla organismin DNA, sen jälkeen kun se on puhdistettu restriktioendonukleaasilla. Restriktioendonukle-35 aasit ovat entsyymejä, jotka tunnistavat lyhyitä nukleoti- tl» disekvenssejä, tavallisesti pituudeltaan 4-8 emäksen mit- i » * > · 2 113184 täisiä, ja pilkkovat kaksi DNA-säiettä tuottaen täten erimittaisia DNA-fragmentteja. Suuren sekvenssispesifisyytensä vuoksi restriktioendonukleaasit pilkkovat DNA-molekyylejä erittäin spesifisellä tavalla. Tämän tuloksena tuotetaan 5 kopioitava sarja DNA-fragmentteja. Nämä voidaan pituutensa perusteella fraktioida huokoisten matriisien tai geelien pinnalla, mikä tuottaa tyypillisiä vyöhykekuvia, jotka muodostavat organismin geenirakenteen DNA-sormenjäljet.
10 DNA-polymorfismit
Kun erittäin läheisten lajien, alalajien tai rotujen sormenjälkiä verrataan, DNA-sormenjäljet voivat olla yhtäläisiä tai erittäin samankaltaisia. Kun muutoin samankaltaisissa DNA-15 sormenjäljissä havaitaan eroja, niitä pidetään DNA-polymor- fismeinä: nämä ovat uusia DNA-fragmentteja, jotka sormenjäl-jissä tulevat esiin. DNA:n sanotaan olevan polymorfisen tuossa paikassa, ja uutta DNA-fragmenttia voidaan käyttää DNA-tunnuksena. Restriktioentsyymipilkonnalla saaduissa DNA-sor-_20 menjäljissä havaittu DNA-polymorfismi voi johtua mistä tahan- sa DNA-sekvenssissä tapahtuneista, seuraavista muutoksista: '.:.· mutaatioista, jotka poistavat restriktioendonukleaasin tavoi-• tekohdan, uusia tavoitekohtia luovista mutaatioista, kahden *:··; restriktiokohdan välisistä deleetioista tai inversioista.
••25 ;":·. Tällaisia DNA-polymorf ismejä pidetään yleensä RFLP:inä, res- triktiofragmentin pituuden polymorfismeina. Sellaiset mutaa-tioperäiset muutokset toimivat vilpittömästi geneettisinä tunnuksina, kun ne periytyvät Mendelin lakien mukaan. Niinpä ,30 DNA-polymorfismejä voidaan käyttää geneettisinä tunnuksina ·;·· suuressa määrin samalla tavalla kuin muita geneettisiä tun- ' nuksia: syntyperäanalyyseissä, ominaisuuksien periytymistä ; koskevissa geneettisissä tutkimuksissa, yksilöiden identifi- oinnissa.
-’’•3 5 3 113184 DNA-sormeniälkien ottämistekniikat Lähes kaikilla elävillä organismeilla, viruksia lukuun ottamatta, niiden genomisen kokonais-DNA:n käsittelyt, jotka 5 suoritetaan restriktioentsyymeillä, tuottavat niin monta vyöhykettä, että ei ole mahdollista arvioida yksittäisiä vyöhykkeitä. Sen tähden kaikki menetelmät DNA-sormenjälkien ottamiseksi perustuvat periaatteeseen, että vain pieni DNA-fragmenttien jae tehdään näkyväksi, niin että saadaan aikaan 10 yksinkertainen vyöhykekuva, joka muodostaa DNA-sormenjäljet.
Kaikista laajimmin käytettyyn menetelmään sisältyvät organismin DNA:n pilkkominen restriktioendonukleaaseilla, restrik-tio-fragmenttien fraktiointi geelielektroforeesin avulla, 15 fraktioitujen DNA-fragmenttien siirtäminen membraaneille ja sitominen niihin sekä membraanin hybridisaatio spesifisen DNA-fragmentin ("koettimen") kanssa. Membraanilla DNA-frag-mentti muodostaa kaksisäikeisiä DNA-molekyylejä DNA-frag-mentin (tai DNA-fragmenttien) kanssa, jolla (joilla) on 20 komplementaarisia nukleotidisekvenssejä. Kun koetin merkitään '··.· havainnollistettavalla tunnuksella, sellainen DNA-fragmentti, ·.:.· johon koetin on kiinnittynyt, voidaan tehdä näkyväksi. Tätä • *_· menettelytapaa nimitetään yleisesti "Southern-hybridisaatiok-·:·*.’ si". Kun havaitaan eroja sellaisten vastaavien restriktio- • *25 fragmenttien koossa, joihin koetin kiinnittyy toisilleen lä-heisesti sukua olevissa, genomisissa DNA-molekyyleissä, näitä eroja nimitetään DNA-polymorfismeiksi, tarkemmin sanottuna restriktiofragmentin pituuden polymorfismeiksi. Restriktio-fragmenttien pituuserot vastaavat DNA-koettimella tunniste-30 tun, geneettisen lokuksen erilaisia alleelimuotoja. Vaikka Southern-hybridisaatiomenetelmää on laajalti käytetty DNA-'.· 1 sormenjälkien ottamisessa, menetelmä on työläs ja vie aikaa.
Tämän lisäksi menetelmällä on vähäinen erotuskyky, ja sitä •’•35 voidaan täten käyttää ainoastaan yhden ainoan lokuksen tai muutamien lokusten arviointiin enintään yhdessä ainoassa reaktiossa.
4 113184
Polymeraasiketjureaktio
Polymeraasiketjureaktiotekniikka (PCR) on spesifisten DNA-fragmenttien syntetisointitekniikka in vitro. Menetelmä riip-5 puu sellaisten spesifisten oligonukleotidien käytöstä, jotka kiinnittyvät ainutlaatuisiin sekvensseihin DNA-molekyylin pinnalla, sekä lämmönkestävästä polymeraasista. Oligonukleo-tidit suunnitellaan siten, että ne lämpökäsittelyvaiheessa voivat pariutua DNA:n vastakkaisiin säikeisiin ja toimia DNA-10 synteesireaktiossa alukkeina sillä tavalla, että kukin ohjaa uusien DNA-säikeiden synteesiä. Siten yhdessä synteesikier-rossa valmistetaan DNA-molekyylin täydellinen kopio, niin että alukkeiden välinen DNA kaksinkertaistuu. DNA-synteesin kukin kierros kaksinkertaistaa DNA:n määrän, mikä sen tähden 15 johtaa kahden alukkeen välisen DNA:n monistumiseen. PCR-tek-niikalla on siten mahdollista syntetisoida täsmällinen DNA-segmentti "substraatti-DNA:n" pientä määrää käyttämällä.
WO-A-9008821 liittyy menetelmään, jossa kromosomaalinen DNA 20 mikroleikataan ja segmentit pilkotaan restriktioentsyymeillä. Saadut fragmentit ligoidaan ennaltamääriteltyihin alukedup-lekseihin. Ligointituotteet monistetaan PCR-reaktiolla ja monistettua DNA:ta käytetään koettimena cDNA- tai genomisissa ·;’ kirjastoissa. Restriktioendonukleaaseina käytetään edulli- 25 sesti Rsa-I: tä ja Alu-I: tä, jotka tuottavat tylppäpäisiä * » * .* restriktiofragmentteja.
, ’f WO-A-9105861 liittyy menetelmään, jossa epäspesifisesti monistetaan erilaisia sekvenssi fragmentteja duplexi - DNA-30 fragmenttien seoksessa. Fragmentit varustetaan linkkereillä jv; ja seos monistetaan peräkkäisissä, linkkereille homologisten alukkeiden avulla aloitetuissa replikaatioissa.
’ WO-A-9011372 kuvaa tekniikkaa testinukleotidin läsnäolon tai 35 poissaolon määrittämiseksi tietyssä asemassa DNA-juosteessa.
: Tekniikassa käytetään polymeroivaa tekijää, joka syntetisoi tuotteen siinä tapauksessa, että DNA-juosteessa oleva testi-nukleotidi ja alukkeessa oleva nukleotidi kykenevät pariutu- 5 113184 maan. Jos pariutumista ei tapahdu, tuotetta ei synny. Tekniikka soveltuu esimerkiksi tiettyjä sairauksia aiheuttavien pistemutaatioiden tunnistamiseen.
5 WO-A-9113075 koskee menetelmää tiettyjen nukleotidivariaa-tioiden tunnistamiseksi. Menetelmässä käytetään alukkeita, jotka ovat tunnettujen vaihtelevien nukleotidien välittömässä läheisyydessä ja siksi alukkeet, joita käytetään tunnistus-vaiheessa, riippuvat kiinnostuksen kohteena olevasta nukleo-10 tidisekvenssistä.
Esillä olevan keksinnön avulla saadaan aikaan uusi, PCR:ää käyttävä menetelmä organismin DNA:n sellaisten restriktio-fragmenttien monistamiseksi, jotka on saatu pilkkomalla aina-15 kin yhdellä restriktioentsyymillä. Niitä nukleotidejä, joita käytetään PCR-menetelmän tässä uudessa sovellutuksessa, ei suunnata tunnettua DNA-sekvenssiä vastaan, vaan ne konstruoidaan sellaisiksi, että ne tunnistavat restriktiofragmenttien päät. Restriktiofragmenttien päitä on välttämätöntä muuntaa, 20 siten että niihin lisätään kytkytfragmentteja eli linkkereitä (tai adaptoreita). Syy tähän on se, että restriktiofragmenttien päissä on tavallisesti vain harvoja yhteisiä nukleotide- ,·>·, jä, esim. 2-8 nukleotidiä, jotka ovat liian lyhyitä, jotta * · niitä voitaisiin käyttää alukkeiden konstruointiin PCR-monis- * 1 · 25 tamista varten.
* » 1 > · « 1 « · ’ 1 Keksintö perustuu polymeraasiketjureaktiotekniikan (PCR) käyttöön yhden tai useamman restriktiofragmentin monistami-V ’ seksi DNA-fragmenttien moninaisesta seoksesta, joka on saatu 30 pilkkomalla genomi-DNA-molekyylejä restriktioendonukleaaseil-la. Eräs keksinnön erityinen etu on, että se mahdollistaa DNA:n restriktiofragmenttien monistamisen tilanteissa, joissa restriktiofragmenttien 5'- ja 3'- päiden nukleotidisekvenssiä '·' ’ ei määritetä. Sellaisissa tapauksissa ei voida määritellä
* I
35 tavallisia, sekvenssin suhteen spesifisiä alukkeita, jotka > hybridisoituvat monistettavan restriktiofragmentin kumpaankin säikeeseen, ja sen tähden monistamistarkoituksiin ei voida käyttää tekniikan tason mukaisia menetelmiä.
6 113184
Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää kahdella eri tavalla, jotka johtavat kahteen erilaiseen so-vellutustyyppiin: (1) Sellaisiin menetelmiin genomien DNA-sormenjälkien otta-5 mistä varten, joissa PCR-tekniikalla suoritettavaa monistamista varten satunnaisesti valitaan alasarjoja, joita yksi tai useammat restriktiofragmentit muodostavat. Keksintö liittyy myös oligonukleotideihin, joita käytetään mainituissa menetelmissä, ja mainittujen menetelmien jotkut sovellutukset 10 voivat olla oikeuslääketieteellinen määrittely, mikrobin identifiointi, alalajin identifiointi, syntyperän analysointi sekä geneettisiin ominaisuuksiin kytkettyjen DNA-tunnuksien analyysi; (2) Menetelmiin, joilla identifioidaan yksi tai useampi en-15 naita valittu, mahdollisesti polymorfinen DNA-fragmentti PCR- monistamisen avulla. Keksintö liittyy myös spesifisiin, synteettisiin oligonukleotideihin, joita voidaan käyttää mainituissa menetelmissä, ja mainittujen menetelmien joitakin sovellutuksia voivat olla geneettisesti periytyvien sairauksien 20 seulonta ihmisellä, maataloustieteellisten ominaisuuksien periytymisen tarkkailu kasvi- ja eläinjalostuksessa sekä infektiotekijoiden ilmaisu sairauksissa.
Kuvio 1 esittää havainnollista luonnosta PCR-menetelmastä, 25 jolla monistetaan restriktioentsyymillä pilkottujen, geno-i misten DNA-molekyylien merkittyjä restriktiofragmentteja.
» * * ·
Kuvio 2 kuvaa jatkeiden kytkentää restriktiofragmenttien eri , päihin: tasaiset päät (flush ends) ja lomittaiset päät (stag- r e » 30 gered ends).
Kuvio 3 kuvaa täydennettyjen restriktiofragmenttien PCR-mo-*·;' nistamista. Kehystetyt alueet kuvaavat adaptoreita, jotka : : : kytketään restriktiofragmenttiin, sekä alukkeita, joita käy- 35 tetään PCR-monistamisessa. Nuolet ilmaisevat DNA-synteesin , *. suunnan.
Kuvio 4 esittää havainnollista luonnosta täydennettyjen rest- 7 113184 riktiofragmenttien PCR-monistamisesta.
Kuvio 5 esittää sellaisten selektiivisten alukkeiden konstruointia, joita käytetään täydennettyjen restriktiofragmenttien PCR-monistamisessa. Nuolet osoittavat invertoituja toistosek-5 venssejä restriktiofragmenttien päissä. Alukkeiden selektii-visyyttä kuvataan kahdessa esimerkissä, joissa vastaavasti on virheetön yhteensopivuus ja täydellinen yhteensopimattomuus selektiivisen ja restriktiofragmenttitemplaatti-DNA:n emäs-sekvenssien välillä.
10
Kuvio 6 esittää selektiivisen PCR-monistamisen periaatetta, kun käytetään PCR-aluketta, joka valitsee templaatti-DNA-molekyylejä, joilla on adaptorisekvenssille viereinen tri-nukleotidisekvenssi.
15
Kuvio 7 kuvaa täydennettyjen restriktiofragmenttien selektiivistä PCR-monistamista.
Kuva 8 esittää fragmenttispesifisen monistamisen periaatetta 20 käytettäessä kahden sellaisen PCR-alukkeen yhdistelmää, jossa kumpikin aluke sisältää 6 selektiivistä emästä. Kukin aluke muodostaa kaksisäikeisen rakenteen restriktiofragmentin eri .*··. säikeessä ja täten aluke-templaattikompleksin, josta DNA-syn- . .*. teesi voi alkaa (esitetty nuolin) .
;v. 25
Kuva 9 kuvaa yleisiä sekvenssielementtejä, jotka tunnistetaan • •II) selektiivisellä restriktiofragmentin monistamismenetelmällä, mukaan luettuna kaksi nukleotidi sekvenssiä, jotka tunniste-v * taan, sekä etäisyyttä, joka erottaa kahta sekvenssiä.
30 • \> Kuvio 10 kuvaa nukleotidisekvenssimuunnosten tyyppejä, jotka i *: ilmaistaan monistetun fragmentin pituuspolymorfismien identi- f iointimenetelmällä.
» I · » * # > » ;* 35 Kuvio 11 esittää tuloksia Pstlrllä pilkotun tomaatti-DNA:n * » *,· monistamista koskevasta analyysistä, joka on suoritettu 1,0- : : prosenttisella agaroosigeelillä, siten että käytetään aluk- keita, joilla on lisääntyvä selektiivisyys.
8 113184
Kuvio 12 esittää tuloksia tomaatin DNA:n kolmen erilaisen PstI-fragmentin spesifisen monistamisen analyysistä, joka on suoritettu 1,0-prosenttisella agaroosigeelillä, siten että 5 käytetään fragmentille spesifisiä alukkeita.
Kuvio 13 esittää 2,5-prosenttista polyakryyliamidi - 1-pro-senttista agaroosigeeliä, jossa on kahden tomaattisukupolven DNA-sormenjäljet, jotka on saatu selektiivisellä restriktio-10 fragmentin monistamisella.
Kuvio 14 esittää 4,5-prosenttisesta, denaturoivasta polyak-ryyliamidigeelistä osaa, jossa on 4 tomaattisukupolven DNA-sormenjäljet, jotka on saatu käyttämällä SRFA:ta ja PstI/ 15 Msel-entsyymiyhdistelmää.
Kuvio 15 esittää 4,5-prosenttisesta, denaturoivasta polyak-ryyliamidigeelistä osaa, jossa on 10 Lactuca-sukupolven sormenjäljet, jotka on saatu käyttämällä SRFA:ta ja Pstl-Msel-20 entsyymiyhdistelmää.
Kuvio 16 esittää 4,5-prosenttisesta, denaturoivasta polyak-ryyliamidigeelistä osaa, jossa on kahden maissisukupolven . sormenjäljet, jotka on saatu käyttämällä SRFA:ta ja Pstl- 25 Taql- sekä EcoRI-Taql- entsyymiyhdistelmiä.
Kuvio 17 esittää 4,5-prosenttisen, denaturoivan polyakryy-liamidigeelin osaa, jossa on 26 Xanthomonas campestris-kannan '·’ DNA-sormenjäljet, jotka on saatu käyttämällä SRFA:ta ja Apal- 30 Taql-entsyymiyhdistelmää.
' : Kuva 18 esittää 4,5-prosenttisen, denaturoivan polyakryyli- .;·. amidigeelin osaa, jossa on neljän kotieläimen, kanan, por- saan, lehmän ja hevosen eri yksilöiden DNA-sormenjäljet, 35 jotka on saatu käyttämällä SRFA:ta ja Ssel-Msel-entsyymivh- · distelmää.
9 113184 Määritelmät
Seuraavassa selityksessä sekä esimerkeissä käytetään useita termejä. Jotta selitys ja vaatimukset samoin kuin mainituin 5 termein esitettävä keksinnön piiri ymmärretään selvästi ja johdonmukaisesti, esitetään seuraavat määritelmät: -Restriktioendonukleaasi: restriktioendonukleaasi tai res-triktioentsyymi on entsyymi, joka tunnistaa spesifisen emäs-sekvenssin (tavoitekohdan) kaksisäikeisessä DNA-molekyylissä 10 ja pilkkoo DNA-molekyylin molemmat säikeet jokaisessa tavoi-tekohdassa.
-Restriktiofragmentit: Restriktioendonukleaaseilla pilkkomisella tuotettuja DNA-molekyylejä nimitetään restriktiofrag-menteiksi. Tietty restriktioendonukleaasi pilkkoo minkä ta-15 hansa annetun genomin restriktiofragmenttien erilliseksi sarjaksi. Restriktioendonukleaasilla pilkkomalla saadut DNA-fragmentit erotetaan ja ilmaistaan geelielektroforeesin avulla.
- Restriktiofragmentin pituuspolymorfismi (RFLP): Kahden lä-20 heisen sukulaisorganismin genomisessa DNA:ssa monessa kohdassa esimerkiksi on eroja niiden nukleotidisekvenssikoostumus-ten suhteen. Kun näitä eroja esiintyy restriktioendonukleaa-.··*. sin tavoitekohdassa, muunnettu tavoitekohta ei pilkkoudu W siinä paikassa. Samalla tavalla nukleotidisekvenssin muunnos » · · 25 voi lisätä uuden tavoitekohdan, jossa muilla organismeilla ei ‘ . ole mitään, aiheuttaen DNA:n pilkkoutumisen restriktioent- syymillä siinä paikassa. Vaihtoehtoisesti sellaiset nukleoti-dien insertiot ja deleetiot, jotka esiintyvät restriktioen-v * donukleaasin tavoitekohtien välillä, muuntavat noiden tavoi- 30 tekohtien välistä etäisyyttä. Tästä syystä kahden organismin : · : DNA:n pilkkominen tuottaa restriktiofragmentteja, joilla on erilaiset pituudet. Tuloksena on kahden organismin DNA:n pilkkomisella tuotettujen restriktiofragmenttien pituuden ;,, polymorf i smi.
t t 35 - Geelielektroforeesi: Restriktiofragmenttien ilmaisemiseksi : tarvitaan analyysimenetelmää, jossa kaksisäikeinen DNA frak- tioidaan koon perusteella. Yleisimmin käytetty tekniikka sellaisen fraktioinnin aikaansaamiseksi on geelielektroforee- 10 113184 si. DNA-fragmentit liikkuvat sellaisissa geeleissä nopeudella, johon fragmentin koko vaikuttaa; täten kuljetut matkat pienenevät, sikäli kuin fragmentin pituus suurenee. Geeli-elktroforeesilla fraktioidut fragmentit voidaan tehdä silmin 5 nähtäviksi suoraan värjäysmenettelyn avulla, jos näytteeseen sisältyvien fragmenttien lukumäärä on pieni.
- Synteettiset oligonukleotidit: yksisäikeisiä DNA-molekyyle-jä, joissa on mieluummin lähes 10 - 50 emästä, jotka voidaan syntetisoida kemiallisesti, nimitetään synteettisiksi oli- 10 gonukleotideiksi. Yleensä nämä synteettiset DNA-molekyylit konstruoidaan siten, että niillä on ainutlaatuinen nukleoti-disekvenssi, vaikka on mahdollista syntetisoida molekyyliper-heitä, joilla on läheiset sekvenssit ja joilla on erilaiset nukleotidikoostumukset spesifisissä kohdissa nukleotidisek- 15 venssin sisällä. Termiä synteettinen oligonukleotidi käytetään tarkoittamaan DNA-molekyylejä, joilla on ainutlaatuinen nukleotidisekvenssi. Termiä sekoitetut, synteettiset oligonukleotidit käytetään tarkoittamaan läheisten synteettisten oligonukleotidien perheitä.
20 - Ligaatio: Ligaasientsyymin katalysoimaa entsymaattista reaktiota, jossa kaksisäikeiset DNA-molekyylit yhdistetään nimitetään ligaatioksi. Yleensä molemmat DNA-säikeet yhdiste-tään kovalenttisesti, mutta on myös mahdollista estää kahdes- I · ta säikeestä toisen ligaatio, siten että toinen päistä muun- « · 25 netaan kemiallisesti tai entsymaattisesti. Tässä tapauksessa ’. kovalenttinen sitominen tapahtuu ainoastaan toisessa kahdesta DNA-säikeestä.
; - Adaptorit: Nämä ovat lyhyitä, kaksisäikeisiä DNA-molekyyle- ' jä, joilla on rajoitettu lukumäärä emäspareja, ne ovat esim.
30 10 - 30 emäsparin mittaisia, ja jotka on konstruoitu siten, että ne voidaan sitoa restriktiofragmentin päihin. Jatkeet ; : käsittävät kaksi synteettistä oligonukleotidiä, joilla on .toisiaan osittain täydentävät nukleotidisekvenssit. Kun kaksi
< » I
synteettistä oligonukleotidiä sekoitetaan, ne muodostavat * » 35 liuoksessa sopivissa olosuhteissa kaksisäikeisen rakenteen.
: Jatkemolekyylin päistä toinen konstruoidaan niin, että se voidaan sitoa restriktiofragmentin päähän, toinen pää suunnitellaan siten, että sitä ei voi sitoa.
11 113184 - Polymeraasiketjureaktio (PCR): Sellaista entsymaattista reaktiota, jossa DNA-fragmentit syntetisoidaan substraatti-DNArsta in vitro, nimitetään PCRrksi. Reaktiossa käytetään lämmönkestävää DNA-polymeraasia sekä kahta synteettistä oli- 5 gonukleotidia, jotka ovat täydentäviä DNA-molekyylin sellaisille nukleotidisekvensseille, joita muutaman sadan - tuhannen emäsparin etäisyys erottaa. Ketjureaktio käsittää esimerkiksi 10 - 30 kierroksen sarjan. Kussakin kierroksessa substraatti -DNA ensin denaturoidaan korkeassa lämpötilassa. Hyvin 10 suurena ylimääränä läsnäolevat, synteettiset oligonukleotidit muodostavat liuoksessa jäähdyttämisen jälkeen kaksisäikeisiä rakenteita substraattimolekyylin kanssa siinä sijaitsevissa spesifisissä kohdissa, joilla on täydentäviä nukleotidisek-venssejä. Oligonukleotidi-substraatti-DNA-kompleksit toimivat 15 sitten DNA-polymeraasin katalysoiman DNA-synteesireaktion aloituskohtina, mikä johtaa sellaisen uuden DNA-säikeen synteesiin, joka on komplementaarinen substraatti-DNA-säikeelle.
- DNA:n amplifikaatio: Termillä DNA:n amplifikaatio tarkoitetaan kaksisäikeisten DNA-molekyylien syntetisointia in vitro, 20 siten että käytetään polymeraasiketjureaktiota (PCR). PCR- reaktion tuotteita nimitetään monistetuiksi DNA-fragmenteiksi .
- Alukkeet: Termillä aluke tarkoitetaan yleensä DNA-säiettä, I » joka voi pohjustaa DNA:n synteesiä. DNA-polymeraasi ei voi * | ; '*t 25 ilman alukkeita syntetisoida DNA:ta alusta lähtien: entsyymi ί » voi ainoastaan pidentää olemassa olevaa DNA-säiettä reaktiossa, jossa täydentävää (komplementaarista) säiettä käytetään alukkeena, joka ohjaa koottavien nukleotidien järjestystä. Esillä olevassa keksinnössä tarkoitetaan synteettisiä oli-30 gonukleotidimollekyylejä, joita käytetään alukkeina PCR-reak-’ tiossa.
; : - Southern-hybridisaatiomenettely: Myös Southern-(blot- taus)tekniikaksi nimitetyn Southern-hybridisaatiomenettelyn tarkoituksena on siirtää DNA, joka on fraktioitu fysikaali-35 sesti agaroosigeelielektroforeesilla, kuten esimerkiksi nai-;,· · lonmembraanille tai nitroselluloosasuodatinpaperille, ja : ; säilyttää samalla niiden DNA-fragmenttien, jotka saatiin fraktiointimenettelyssä, suhteelliset asemat. DNA siirretään 12 113184 agarosegeeliltä kapillaaritoiminnan avulla kannattimelle.
- Nukleiinihappohybridisaatio: Nukleiinihappohybridisaatiota käytetään läheisten DNA-sekvenssien ilmaisemiseen, siten että yksisäikeinen DNA hybridisoidaan kannattimellä, kuten nailon- 5 membraanilla tai nitroselluloosasuodatinpapereilla. Sellaiset nukleiinihappomolekyylit, joilla on komplementaariset emäs-sekvenssit, muodostavat uudelleen kaksisäikeisen rakenteen, jos ne sekoitetaan liuoksessa sopivissa olosuhteissa. Kaksi -säikeinen rakenne muodostuu kahden komplementaarisen, yksilo säikeisen nukleiinihapon välille, vieläpä jos toinen kiinnitetään kannattimelle. Southern-hybridisaatiossa on viimeksi mainittu tilanne.
- Hybridisaatiokoetin: Kun ilmaistaan tietty DNA-sekvenssi Southern-hybridisaatiomenettelytavalla, leimatun DNA-mole- 15 kyylin tai hybridisaatiokoettimen annetaan reagoida fraktioidun DNA:n kanssa, joka on sidottu kannattimeen, kuten esimerkiksi nailonmembraaniin tai nitroselluloosasuodatinpaperiin. Suodatinpaperin alueet, joissa on leimatulle koettimelle komplementaarisia DNA-sekvenssejä, leimautuvat itse uudel-20 leenkahdentumisreaktion johdosta. Ne suodattimen alueet, joissa sellaista leimautumista ilmenee, voidaan sitten havaita käytetyn leiman perusteella. Hybridisaatiokoetin valmiste-taan yleensä spesifisen DNA-sekvenssin, joka muodostaa maissin genomin, molekyylikloonauksen avulla.
25 : Esillä oleva keksintö koskee lähemmin menetelmää ja keinoja, jotka tekevät mahdolliseksi polymeraasiketjureaktion soveltamisen restriktiofragmenttipolymorfismien (RFP:en) samoin kuin pituuspolymorfismien ilmaisuun. Esillä oleva keksintö sisäl-30 tää RFP:ien ilmaisumenetelmiä, synteettisiä oligonukleotide-jä, joita käytetään keksinnön mukaisissa menetelmissä, reak-tiopakkauksia, jotka sisältävät RFP:ien ilmaisuvälineitä, sekä menetelmien sovellutuksia ja keksinnön mukaisia menette- , lytapoja kasvi- ja eläinjalostusta, geneettisesti periytyvien 35 sairauksien diagnostiikkaa, organismien identifiointia sekä : oikeuslääketieteellistä määrittelyä jne. varten.
13 113184 Täsmällisemmin sanottuna esillä oleva keksintö saa aikaan käyttöön keinoja joko yksittäisten, genomisten restriktio-fragmenttien tai genomisten restriktiofragmenttien sarjojen identifioimiseksi mistä tahansa organismista, mikro-organis-5 mistä, kasvista, eläimestä tai ihmisestä, jotka fragmentit ovat joko yksilöllisesti, geneettisesti kytkeytyneet yhteen tai useampaan ominaisuuteen, tai kyseiset fragmentit yhdessä antavat käyttöön genomin sormenjäljet, joita voidaan käyttää organismin, muunnoksen tai yksilön identifiointiin.
10
Esillä olevan keksinnön mukainen, yleinen menetelmä restriktiof ragmenttien valmistamiseksi tai identifioimiseksi sisältää restriktioendonukleaasien käytön, synteettisten oligonuk-leotidien ligaation restriktiofragmentteihin sekä restriktio-15 fragmenttien PCR-monistamisen (kuvio 1). Restriktioendonuk-leaasit pilkkovat genomisia DNA-molekyylejä spesifisissä kohdissa, tavoitekohdissa, synnyttäen täten restriktiofrag-mentteja.
20 Restriktiofragmenttien PCR-monistaminen siitä huolimatta, tunnetaanko restriktiofragmenttien päiden nukleotidisekvens-*··' si, vai ei, voidaan keksinnön mukaan toteuttaa sitomalla synteettiset oligonukleotidit (adaptorit) ensin restriktio-* V fragmenttien päihin ja täten antaa käyttöön kukin restrik- tiofragmentti sellaisena, jossa on kaksi yhteistä pätkää, ’;· jotka toimivat PCR-monistamisessa käytetyille alukkeille ankkuriemäksinä.
Restriktioentsyymit saavat tyypillisesti aikaan joko tasaisia 30 päitä, joissa molempien säikeiden terminaaliset nukleotidit . ovat emäspariutuneet, tai vuorottaisia päitä, joissa yksi kahdesta säikeestä työntyy esiin lyhyen, yksisäikeisen ulok-·' keen muodostamiseksi (kuvio 2). Sellaisten restriktiofrag- : : ; menttien tapauksessa, jossa fragmenteilla on tasaiset päät, ;‘"35 käytetään adaptoreita yhden tasaisen pään kanssa.Kun kysymyk- V sessä ovat lomittaisia päitä sisältävät restriktiofragmentit, käytetään adaptoreita, joilla on yhden ainoan säikeen muodos- i » i • · 14 113184 tama uloke, joka on komplementaarinen restriktiofragmentin yksisäikeiselle ulokkeelle. Niin muodoin restriktiofragmentin kullekin tyypille käytetään spesifisiä adaptoreita, jotka eroavat ainoastaan yhden pään suhteen, niin että ne sallivat, 5 adaptorin sitomisen restriktiofragmenttiin. Tyypillisesti käytetään adaptoreita, jotka koostuvat kahdesta synteettisestä oligonukleotidistä, jotka ovat osittain toisilleen komplementaarisia ja jotka tavallisesti ovat noin 10 - 30, mieluummin 12 - 22 nukleotidin mittaisia ja jotka muodostavat 10 kaksisäikeisiä rakenteita, kun ne sekoitetaan liuoksessa yhteen. Ligaasientsyymiä käyttämällä jatkeet sidotaan rest-riktiofragmenttien seokseen. Kun käytetään suurta moolimäärää enemmän adaptoreita kuin restriktiofragmentteja, varmistetaan, että kaikissa restriktiofragmenteissa lopulta on adap-15 torit molemmissa päissä. Tällä menetelmällä valmistettuja restriktiofragmentteja nimitetään täydennetyiksi eli merkatuiksi restriktiofragmenteiksi ja lisäksi menetelmää nimitetään restriktiofragmenttien täydentämiseksi tai merkitsemiseksi .
20
Adaptorit voivat nyt toimia templaatteina alukkeille, joilla ’·" on yllä määritellyt ominaisuudet ja joita käytetään myöhem- '··· mässä PCR-monistamisreaktiossa. Keksinnön edullisessa sovel- : lutusmuodossa restriktiofragmentilla on sama adaptori molem- ”•"25 missä päissään ja yhtä ainoaa PCR-aluketta voidaan käyttää restriktiofragmentin monistamiseen, kuten kuviossa 3 esite-tään. Koska sellaisessa tapauksessa kaikkia restriktiofragmentteja on täydennetty samalla tavalla, on ilmeistä, että täydennettyjen restriktiofragmenttien seoksen PCR-monistami-30 nen kartuttaa kaikkia restriktiofragmentteja samanaikaisesti.
, Toisessa sovellutusmuodossa, jossa DNA:n pilkkomiseen käyte- *;;; tään kahta erilaista restriktioentsyymiä, restrikt iof ragment-
* I
\ , tien päihin sidotaan kaksi erilaista adaptoria. Tässä tapauk- : : _ sessa voidaan sellaisten restriktiofragmenttien monistamiseen ;'**35 käyttää kahta erilaista PCR-aluketta. Toisessa edullisessa V sovellutusmuodossa, jossa käytetään kahta restriktioentsyy- *;*· miä, toista entsyymiä varten päät biotinyloidaan. Täten 15 113184 käyttämällä menetelmiä, jotka soveltyvat biotinyloitujen molekyylien eristämiseen, on mahdollista valita restriktio-fragmenttien moninaisesta seoksesta ne restriktiofragmentit, joissa on ainakin yksi pää tätä restriktioentsyymiä varten.
5 Tämä vaihe vähentää restriktiofragmenttien lähtöseoksen moninaisuutta ja muodostaa ennen PCR-monistamista rikastamis-vaiheen sekä vähentää täten taustaa tietyissä tapauksissa. Useiden erilaisten fragmenttien samanaikaista monistamista nimitetään usein moninkertaiseksi PCR:ksi. Moninkertaisen 10 restriktiofragmenttimonistamisen periaatetta valaistaan kuviossa 4 .
Esillä oleva keksintö perustuu edelleen spesifisesti konstruoitujen alukkeiden ja spesifisten menetelmien tarkkuuteen, 15 jotta PCR-monistamisreaktio ohjataan sillä tavalla, että kontrolloitu monistaminen on mahdollista, ja keksinnön erityisessä suoritusmuodossa siten, että monistetaan vain täydennettyjen restriktiofragmenttien pieni alasarja.
20 Yleensä genomisen DNA:n ja erityisesti eläinten, kasvien tai ihmisen genomisen DNA:n pilkkomiset, jotka suoritetaan rajaa-'*· valla endonukleaasilla, tuottavat suuren lukumäärän restrik- tiofragmentteja. Restriktiofragmenttien lukumäärä riippuu ; V genomin koosta ja restriktioendonukleaasin tavoitekohdan U”25 esiintymisfrekvenssistä genomissa, jonka vuorostaan ensisi- ! jaisesti määrää tavoitekohdan nukleotidien lukumäärä. Nukle- ;Y otidien lukumäärä tavallisesti käytettyjen restriktioendonuk- leaasien tavoitekohdassa on alueella 4-8. Organismien geno-mien koot vaihtelevat laajalti muutamasta miljoonasta emäspa-30 rista mikro-organismien tapauksessa useaan biljoonaan emäspa-, riin eläimillä ja kasveilla. Sen tähden genomisen DNA:n rest- ·;;; riktioentsyymeillä suoritetussa pilkkomisessa saatujen rest riktiofragmenttien lukumäärä voi vaihdella muutamasta sadasta ! ;* useaan miljoonaan. Yleensä restriktiofragmenttien lukumäärä ;‘*3*5 on niin suuri, että ei ole mahdollista identifioida yksittäi siä restriktiofragmentteja genomisen DNA:n pilkkomistuotteis-; sa, jotka on fraktioitu geelielektroforeesilla. Sellaiset 16 113184 pilkkomistuotteet tuottavat tavallisesti vyöhykkeiden muodostaman läiskän.
Täydennettyjen restriktiofragmenttien PCR-monistamisen tulisi 5 täten antaa vyöhykkeiden muodostama täplä, koska kaikkien fragmenttien tulisi PCR-reaktiossa monistua yhdessä samanaikaisesti. Keksinnön edullisessa sovellutusmuodossa, joka on käyttökelpoinen suurikokoisille genomisille DNA:ille, on käytetty yleistä periaatetta rajoittaa monistettavien rest-10 riktiofragmenttien lukumäärää. Tämä suoritetaan valitsemalla ennalta täydennettyjen restriktiofragmenttien muodostama alasarja, niin että vain suhteellisen pieni lukumäärä täydennettyjä restriktiofragmentteja monistetaan PCR-monistamis-reaktion aikana.
15
Keksinnön tässä sovellutusmuodossa määritelty selektiivinen periaate on peräisin PCR-monistamisessa alukkeina käytettävien oligonukleotidien rakenteesta, kuten kuvataan kuviossa 5.
20 Täydennetyillä restriktiofragmenteilla on seuraava yleinen rakenne: vaihteleva DNA-sekvenssi (vastaten restriktiofrag- ,· » '·1’ menttia ennen täydentämistä) , molemmilta puoliltaan inver- t 1 *.!. toidun DNA-sekvenssin (vakio sekvenssin) reunustamana. Inver- t · » ] Y toitu DNA-sekvenssi (vakio DNA-sekvenssi) koostuu restriktio- * endonukleaasin kohdesekvenssin osasta ja restriktiofragmentin ! molempiin päihin kiinnittyneestä adaptorista. Muuttumattomien DNA-sekvenssien välissä sijaitsevien restriktiofragmenttien vaihtelevat sekvenssit ovat tavallisesti tuntemattomia, ja täten niillä on satunnainen sekvenssikoostumus. Niin muodoin 30 vakio DNA-sekvenssejä reunustavat nukleotidisekvenssit tule- , vat olemaan täydellisesti satunnaisia restriktiofragmenttien *;;; suuressa seoksessa.
» » * ! Sen tähden esillä oleva keksintö antaa käyttöön spesifisiä :“35 PCR-alukkeita, jotka sisältävät vakio nukleotidisekvenssin ja
1 S I
keksinnön sovellutusmuodossa, restriktioentsyymillä pilkotun Ύ restriktiofragmentin alasarjan monistumisen mukaan, vaihtele- * i 1 17 113184 van sekvenssiosan. Muuttumattomassa sekvenssiosassa nukleoti-disekvenssi konstruoidaan siten, että aluke emäspariutuu täydellisesti restriktiofragmentin päässä yhden DNA-säikeen muuttumattoman DNA-sekvenssin kanssa. Vaihteleva sekvenssiosa 5 sisältää satunnaisesti valitun nukleotidisekvenssin, joka ulottuu l.-stä ΙΟ.-neen valittuun emäkseen.
Ilmaisu "vaihteleva sekvenssi" merkitsee tarkemmin sekvenssiä, jonka valitut nukleotidit muodostavat ja joka sitten 10 säilyy vakiona restriktiofragmenttien alasarjan monistamis-tarkoitusta varten. Keksinnön erityisessä sovellutusmuodossa voidaan käyttää valittujen emästen useita sekvenssejä useiden erinomaisten alukkeiden määrittämiseksi. Sellaisessa tapauksessa alukkeilla voi olla sama vakio sekvenssi sekä vaihtele-15 via sekvenssejä, jotka on tehty valituista emäksistä, jotka ovat uusia näin muodostettujen alukkeiden joukossa.
Näiden vaihtelevien (valittujen) sekvenssien lisääminen alukkeiden 3'-päähän ohjaa sellaisten täydennettyjen restriktiof-20 fragmenttien esivalintaa, jotka monistetaan PCR-vaiheessa: .···_ kun PCR-reaktio suoritetaan sopivissa olosuhteissa, alukkeet "! ainoastaan aloittavat DNA-synteesin niillä täydennetyillä restriktiofragmenteilla, joissa vaihteleva DNA-sekvenssi voi • ’ täydellisesti emäspariutua täydennetyn restriktiofragmentin 25 templaattisäikeen kanssa, kuten kuviossa 5 esitetään. 1
Alukkeen vaihtelevassa sekvenssiosassa olevien nukleotidien lukumäärä määrää valinnan: alukkeiden selektiivisyys lisääntyy vaihtelevan (valitun) sekvenssiosan nukleotidien lukumää-30 rän myötä. Esillä olevassa keksinnössä käytetään myös termiä selektiiviset emäkset, jotka merkitsevät vaihtelevan sekvenssi sin nukleotidejä, mikä osoittaa täten, että näiden emästen . valinta tekee alukkeen selektiiviseksi. Täytyy ymmärtää, että täydennetty restriktiofragmentti monistetaan ainoastaan, kun 35 käytettyjen alukkeiden selektiiviset emäkset tunnistavat molemmat komplementaariset sekvenssit fragmentin päissä. Kun aluke sopii yhteen ainoastaan yhden pään kanssa, monistuminen 18 113184 tulee olemaan lineaarista pikemmin kuin eksponentiaalista ja tuote jää ilmaisematta.
On mahdollista arvioida etukäteen selektiivisyyden aste, joka 5 saadaan vaihtelevilla sekvensseillä, joissa selektiivisten emästen lukumäärät vaihtelevat, siten että käytetään yleistä kaavaa 42n, jossa n on selektiivisten emästen lukumäärä: 1 selektiivistä emästä käyttämällä monistetaan 1 16:sta täydennettyä fragmenttia, 2 selektiivistä emästä käyttämällä monis-10 tetaan 1 256:stä, 3 selektiivistä emästä käyttämällä monistetaan 1 4096:sta, 4 selektiivistä emästä käyttämällä monistetaan 1 65536:sta jne. täydennetystä fragmentista, mistä tahansa pilkotusta genomisesta DNA:sta, siitä huolimatta, mikä on käytetyn restriktioentsyymin tuottamien fragmenttien 15 lukumäärä.
Edullisessa sovellutusmuodossa selektiivisten nukleotidien lukumäärä valitaan siten, että monistettavien restriktiofrag-menttien lukumäärä rajoitetaan 5 - 200:aan. Vaikka tämä luku-20 määrä voidaan laskea jakamalla fragmenttien lukumäärä ,···. 42n: llä, tarkkaa ennustetta ei voida tehdä, koska kaikki res- triktiofragmentit eivät monistu samalla tehokkuudella. Sen tähden käytännössä on monistuvia fragmentteja vähemmän kuin ’ teoreettisesti on odotettavissa. Olisi myös huomattava, että 25 voidaan käyttää kahden (tai useamman) alukkeen seoksia. Tämä tekee mahdolliseksi kunkin alukkeen tunnistamien fragmenttien ·’ monistamisen ja sen lisäksi kahden alukkeen tunnistaman fragmentin monistamisen. Lopuksi on huomattava, että alukkeen ja komplementaarisen templaatin selektiivisten nukleotidien 30 väliseen emäspariutumiseen perustuvaan selektioon vaikuttaa voimakkaasti PCR-reaktiossa kahdentumisvaihetta varten välit-tu lämpötila, joka on aluke-templaattikompleksin sulamispis-*. * teen alapuolella tai liian lähellä sitä, alukkeet pariutuvat : epätäydellisesti yhteen sopivien t empi aat ti sekvenssien kanssa 35 tehden mahdolliseksi, että kompleksissa esiintyy yhteensopi-mattomuutta. Tätä tulisi välttää, koska se johtaa ennustettua 19 113184 useamman fragmentin monistumiseen tuottaen vaihtelevia tuloksia .
Keksinnön mukaan saadut PCR-tuotteet voidaan identifioida 5 käyttämällä normaaleja fraktiointimenetelmiä DNA-molekyylien erottelemiseksi koon mukaan, mitä seuraa DNA-molekyylien värjääminen sopivilla aineilla. Vaihtoehtoisesti PCR-monistami-seen käytettyjä alukkeita voidaan merkitä sopivilla radioaktiivisilla leimoilla tai fluoroivalla kromoforeilla, mikä 10 sallii täten reaktiotuotteiden identifioinnin kokoluokittelun jälkeen. Keksinnön edullisessa sovellutusmuodossa PCR-tuotteet fraktioidaan geelielektroforeesilla käyttäen normaaleja geelimatriiseja, kuten esimerkiksi agaroosia, polyakryyliamidia tai agaroosin ja polyakryyliamidin seosta, mutta ei nii-15 hin rajoittuen. Keksinnön mukaan saatuja PCR-tuotteita ilmaistaan lisäksi termillä monistetut restriktiofragmentit (Amplified Restriction Fragments, ARF).
Esillä olevan keksinnön mukaisia keinoja sekä menetelmää 20 voidaan käyttää ARF-sarjojen valmistamiseen minkä tahansa .···, monimutkaisen genomin restriktioentsyymillä pilkotuista tuot-teista. Keksintö sallii virittää saadut restriktiofragmentit • t · .Ci ARF:ien erotteluun käytetyn geelifraktiointijärjestelmän ’ ·' mukaisesti. Eräässä erityisessä sovellutusmuodossa selektii-2*5 viset alukkeet konstruoidaan siten, että ne valmistavat 5 - 10 ARF:ää, jotka sitten eritellään agaroosigeelielektroforee-·’ sin avulla. Toiseen erityiseen sovellutusmuotoon sisältyy selektiivisten alukkeiden käyttö, jotka alukkeet konstruoidaan tuottamaan 20 - 50 ARSF:ää, jotka sitten erotellaan 30 suurresoluutiogeelielektroforeesijärjestelmällä kuten esimer kiksi polyakryyliamidigeeleillä tai polyakryyliamidi-agaroo-siseosgeeleillä, mutta ei niihin rajoittuen.
: Eräässä edullisessa sovellutusmuodossa restriktioentsyymi tai restriktioentsyymit valitaan siten, että ne antavat kooltaan 20 - 1000 emäsparin suuruisia restriktiofragmentteja, koska — kuten yleisesti tiedetään PCR-monistamisesta — tämä frag- 20 113184 menttialue monistetaan tehokkaimmin. Vaikka erilaisilla gee-limatriiseilla voidaan fraktioida paljon fragmentteja, parhaat tulokset saadaan fraktioimalla denaturoivilla polyak-ryyliamidigeelijärjestelmillä, joita nykyisin käytetään DNA-5 sekvensointiin.
Keksinnön mukaisesti PCR-monistamisreaktiossa saadaan ARF:ien erilaisia sarjoja kunkin erilaisen, selektiivisen alukkeen kanssa. ARF:ien kuvat, jotka identifioidaan erottelun jäl-10 keen, muodostavat genomisen DNA:n ainutlaatuisia ja täydellisesti toistettavia sormenjälkiä. Sellaisilla sormenjäljillä on useita sovellutuksia, kuten esimerkiksi oikeuslääketieteellinen määrittely, organismin diagnostinen ja lajien, rotujen, muunnosten tai yksilöiden identifiointi. Identifi-15 oinnin tason määrää spesifisen ryhmän eri jäsenten samankal taisuuden aste (muuntelun aste). Muuntelua ja samankaltaisuutta määrää läheisten genomien nukleotidikoostumuksen vaih-teluaste. Keksinnön perusperiaate on, että kussakin monistetussa restriktiofragmentissa ilmaistaan kaksi nukleotidi-20 sekvenssiä, joita toisistaan erottaa tietty etäisyys, kuten ,·*>, kuviossa 9 esitetään. Kukin kahdesta nukleotidisekvenssistä "! koostuu kahdesta osasta: (a) restriktionukleaasin tavoitekoh- dasta sekä (b) tavoitekohdalle viereisestä nukleotidisekvens-• · sistä, joka sisältyy selektiiviseen alukkeeseen. Läheisissä 2’5 organismeissa, lajeissa, muunnoksissa, roduissa tai yksilöis-sä nämä sekvenssielementit ja niiden suhteelliset etäisyydet : säilyvät suuremmassa tai vähäisemmässä määrin. Tästä syystä sormenjäljet muodostavat perustan genomien välisten sekvens-sisuhteiden asteen määrittämiselle. Toisaalta ARF-kuvien 30 eroja voidaan käyttää erottamaan genomit toisistaan. Esillä olevan keksinnön tiettyjä etuja verrattuna muihin menetel-, :· miin, joilla määritetään genomien sormenjälkiä, on erittäin . . suuri resoluutio, joka keksinnön mukaisella menetelmällä · voidaan saavuttaa: samanaikaisesti voidaan verrata useita kymmeniä vieläpä satoja ARF: iä.
> I » 21 113184
Esillä olevan keksinnön toiseen tiettyyn sovellutukseen sisältyy restriktiofragmenttipolymorfismien (RFP) seulonta ja identifiointi. Muutokset genomisen DNA:n nukleotidikoostumuk-sessa antavat usein tulokseksi restriktiofragmenttien poly-5 morfismejä: insertiot ja deleetiot vaikuttavat niitä sisältävien restriktiofragmenttien kokoon (kuva 10), nukleotidimuu-tokset voivat johtaa restriktioendonukleaasin tavoitekohtien poistumiseen tai luoda mainitulle entsyymille uusia tavoite-kohtia (kuva 11). Sellaisten muutosten identifiointiin ylei-10 simmin käytetyt tekniikat ovat Southern blottaus -kokeet, siten että käytetään kloonattuja DNA-koettimia, tekniikka, jota tavallisesti nimitetään restriktiofragmentin pituuspoly-morfismin (RFLP) ilmaisemiseksi. Tällä tekniikalla, Southern blottausta käyttämällä, satunnaisesti kloonatuista DNA-frag-15 menteista seulotaan laajalti niiden RFLP:t eri genomien joukossa. Esillä olevan keksinnön mukaisesti RFP:t voidaan identifioida suoraan vertaamalla eri genomeista saatuja ARFriä. Periaatteessa esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä ilmaisee RFP:t herkemmin, koska restriktioendonukleaasien 20 tavoitekohtien erojen lisäksi havaitaan eroja myös vierei-r’.*( sissä nukleotidisekvensseissä, jotka sisältyvät selektiivi-'I siin PCR-alukkeisiin. Niinpä esillä olevan keksinnön mukai- f ♦ sella menetelmällä RFLP:t havaitaan ylivoimaisesti parhaiten.
i ’25 RFLP:itä käytetään nykyisin useihin sovellutuksiin, joihin kuuluvat oikeustieteellinen määrittely, geneettisesti periy-·,· ‘ tyvien sairauksien seuranta ihmisillä ja maataloudellisesti tärkeiden ominaisuuksien periytymisen tarkkailu kasvi- ja eläinjalostuksessa. Perusperiaatteena on, että tiettyjä DNA-30 polymorfismeja, jotka läheisesti liittyvät spesifisiin, ge-!. neettisiin ominaisuuksiin, voidaan käyttää spesifisten ge-|· neettisten ominaisuuksien läsnäolon tai puuttumisen seuran- , taan.
i > > i
Esillä olevan keksinnön mukaan ARF-kuvien analyysiä voidaan käyttää määritettäessä polymorf isten ARF : ien geneettistä 22 113184 kytkentää spesifisiin, geneettisiin ominaisuuksiin. Lisäksi sellaisia polymorfisiä ARF:ia nimitetään monistetun fragmentin pituuspolymorfismeiksi (AFLPrt) niiden erottamiseksi RFLP-tyyppisistä DNA-polymorfismeistä, jotka ilmaistiin Sout-5 hern blottaus -kokeissa kloonattuja DNA-koettimia käyttäen.
Esillä olevan keksinnön yhteen erityiseen sovellutukseen sisältyy sellaisten AFLP:iden ilmaiseminen, jotka kytkeytyvät spesifisiin, geneettisiin ominaisuuksiin. Sovellutuksessa 10 analysoidaan ARF-kuvia, jotka on saatu erilaisten, selektiivisten alukkeiden avulla toisilleen läheisesti sukua olevien . yksilöiden genomisen DNA:n restriktiokäsittelyissä, joilla yksilöillä on eroja spesifisessä, geneettisessä ominaisuudessa, sekä käytetään analyysitekniikoita, joilla voidaan löytää 15 korrelaatioita yhden tai useamman AFLP:n periytyvyyden ja spesifisten, geneettisten ominaisuuksien esiintuoman feno-tyypin välillä.
Esillä olevan keksinnön toinen edullinen sovellutusmuoto 20 sisältää keksinnön mukaisen menetelmän käytön yhden tai '...· useamman spesifisen restriktiofragmentin identifioimiseksi.
Yksi spesifinen restriktiofragmentti voidaan monistaa täyden-I ': nettyjen restriktiofragmenttien moninaisesta seoksesta mää- ·;·; rittämällä ensin restriktiofragmentin kussakin päässä sijait- • |25 sevien ensimmäisten 8-12 emäksen nukleotidisekvenssi. Näi-:·. den sekvenssien perusteella voidaan konstruoida kaksi aluket- ta, joissa kussakin on 5 - 10 selektiivistä nukleotidiä, joilla on komplementaarinen sekvenssi sellaiselle sekvenssille, joka reunustaa restriktiofragmentin komplementaarista 30 säiettä. Kun käytetään sellaista alukkeiden sarjaa, PCR-mo-• : nistamisen jälkeen voidaan saada yksi ainoa monistettu frag- ’ mentti. Tässä menetelmässä käytetty restriktiofragmentti voi : olla joko kloonattu restriktiofragmentti tai monistettu rest- ,··. riktiofragmentti. Koska useita restriktiofragmentteja ei •35 voida monistaa erittäin tehokkaasti, keksinnön edullisessa menetelmässä polymorfisten DNA-tunnusten identifioimiseksi 23 113184 monistetaan ensiksi fragmenttien satunnaisesti valittu sarja ja PCR-monistamisen jälkeen identifioidaan voimakkaita vyöhykkeitä antavat AFLP:t. Nämä AFLP:t voidaan eristää restrik-tiofragmenttien suhteen spesifisten alukkeiden kehittämisek-5 si. AFLP:t eristetään leikkaamalla vastaava DNA-vyöhyke geelistä ja määrittämällä nukleotidisekvenssi molemmista päistä restriktioendonukleaasin tavoitekohdille viereisten, 5-10 ensimmäisen nukleotidin sekvenssin määrittämiseksi. Kun kerran nämä nukleotidisekvenssit tunnetaan, voidaan konstruoida 10 restriktiofragmentin suhteen spesifiset alukkeet, jotka mo nistavat ainoastaan yhden restriktiofragmentin genomisen DNA:n pilkkomistuotteista. Keksinnön tässä erityisessä sovel-lutusmuodossa voidaan spesifisen restriktiofragmentin ilmaisuun käyttää kahta erilaista selektiivistä aluketta. Yhden 15 sarjan kussakin kahdessa selektiivisessä alukkeessa emäkset valitaan siten, että ne ovat komplementaarisia restriktioendonukleaasin tavoitekohdan viereiselle nukleotidisekvenssil-le, kuten kuviossa 8 kuvataan. Kuhunkin alukkeeseen sisällytettävien selektiivisten emästen lukumäärä riippuu restrik-20 tioendonukleaasifragmenttiseoksen moninaisuudesta.
PCR-tekniikka on kehittynyt valtavasti muutaman viime vuoden | aikana, ja siitä on nopeasti tulossa yksi laajimmin käytetyis- *:·: tä diagnoosimenetelmistä ihmisen terveydenhoidossa. Sen so- ·25 velluttamiseen kuuluu muun muassa infektiosairauksien ja .:·. geneettisesti perittyjen sairauksien ilmaisu. Kukin diagnos tinen koe perustuu kahden spesifisen, synteettisen oligonuk-leotidin käyttöön PCR-reaktion alukkeina, jotta saadaan yksi tai useampia pituudeltaan spesifisiä DNA-fragmentteja. Sai-30 rauden ilmaisussa koe havaitsee näytettä kohti yhdenkin DNA-molekyylin läsnäolon, joka antaa luonteenomaisen DNA-fragmen-‘ tin. Geneettisesti periytyvien sairauksien tapauksessa aluk- keet konstruoidaan siten, että niiden tuotteet voivat tehdä .*. eron normaalien ja sairaiden alleelien välillä. Erottaminen •35 perustuu joko DNA-segmentissä vallitseviin sekvenssieroihin ·- tai alukkeiden välisiin etäisyyseroihin.
24 113184
Koska alukkeilla on äärimmäisen korkea-asteinen spesifisyys, on mahdollista tarkkailla eri sairauksia samanaikaisesti, menetelmää nimitetään usein moninkertaiseksi PCR:ksi. Moninkertainen PCR-menetelmä kärsii kuitenkin rajoituksesta, jonka 5 vuoksi vain muutamaa, 5-8 erilaista ominaisuutta voidaan tarkkailla samanaikaisesti. Tämän rajoituksen tieteellinen perusta on siinä, että PCR-monistamisen optimiolosuhteet (kaksoiskierteen avautumis- ja kahdentumislämpötila, Mg+:n pitoisuus, alukkeen pitoisuus) vaihtelevat huomattavasti käy-10 tetyn alukepari mukaan. Moninkertaisessa PCR:ssä on saatava aikaan kompromissiolosuhteet, joissa kaikki alukkeet tuottavat ilmaistavia tuotteita. Tämän ilmiön lisäksi erilaisten fragmenttien monistamisen tehokkuudessa esiintyy voimakkaita eroja. Niin muodoin on usein kohdattu sellainen ongelma, että 15 tiettyjä alukepareja ei voida ilmaista moninkertaisessa PCR-reaktioissa.
Esillä olevan keksinnön mukaiset menetelmät varsinaisesti voittavat nämä moninkertaisen PCR:n rajoitukset, koska kai-^20 kiila esillä olevassa keksinnössä käytetyillä alukkeilla ’··· niiden nukleotidisekvenssin oleellinen osa on yhteinen. Sen :.i.: lisäksi valikoivien AFLP:ien avulla esillä olevassa keksin- : V nössä valitaan DNA-tunnuksia, jotka lisääntyvät yhtäläisellä ·;·; teholla. Niin ollen suotuisimmissa PCR-monistamisolosuhteissa ••25 on paljon vähemmän vaihtelua kuin havaitaan yleisesti käyte-tyillä sekvenssispesifisillä alukkeilla. Pohjimmiltaan ihanteellinen on kompromissi synteettisen oligonukleotidin emästen lukumäärän, jotka ovat välttämättömiä yksinkertaisen DNA-fragmentin ilmaisuun tarvittavan spesifisyyden saamiseksi 30 monimutkaisessa genomissa, joka lukumäärä laskettiin edellä, sekä oligonukleotidin suotuisimpaan PCR-monistamiseen tarvit-' tavan pituuden ja koostumuksen välillä. Esillä olevan keksin- I nön mukainen menetelmä on täten erittäin ylivoimainen monin- .”·. kertaiseen PCR:ään nähden.
35 ·: Esillä oleva keksintö antaa käyttöön yleisen menetelmän tun- ·.’·: nusten eristämiseksi mistä tahansa genomista sekä sellaisten 25 113184 DNA-tunnusten käyttämiseksi DNA-sormenjälkien ottamisen kaikissa mahdollisissa sovellutuksissa.
Seuraavat esimerkit ja kuviot valaisevat esillä olevaa kek-5 sintöä, joka missään tapauksessa ei rajoitu näihin esimerkkeihin.
Esimerkit 10 Esimerkki 1: Tomaatin DNA:n restriktiofragmentin selektiivinen lisääminen PSTI:tä käyttämällä A) DNA:n eristäminen ia muuntaminen 15 Tomaatin (Lvcopersion esculentum c.v., Moneymaker) koko DNA eristettiin nuorista lehdistä Bernatzskin ja Tanksleyn (Theor. Appi. Genet. 72, 314-321) kuvaamalla tavalla. Tyypillinen saanto oli 50 - 100 /xg tuoreen lehtimateriaalin grammaa kohti. DNA pilkottiin PSTI:llä (Pharmacia), ja restriktio-20 fragmentteihin sidottiin kaksisäikeiset (= ds) Pstl-liitti- met siten että noudatettiin alla kuvattua menettelytapaa.
·.:.· Näillä liittimillä oli seuraava rakenne: :*·: 5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA -3 • •2 5 3- CATCTGACGCATGT -5 Näiden liittimien 3'TGCA-uloke kahdentuu PstI:llä luotuihin lomittaisiin päihin. Tämän jatkeen kytkennässä PstI-tunnista-missekvenssi ei säily tätä liitintä sidottaessa, koska 5'C-30 tähde korvautuu A:11a. Sidontareaktio konstruoitiin sillä *>*: tavalla, että lähes yksinomaan DNA-fragmentti sitoutuu lii- : tinmolekyyleihin. Tämä saavutettiin seuraavasti: 1. käyttä- : mällä fosforyloimattomia liittimiä, mikä poistaa liittimen .*··. mahdollisen yhdistymisen liittimeen, 2. suorittamalla sidos- **35 sekä restriktioreaktio samaan aikaan. Viimeksi mainittu me- nettelytapa tuottaa tulokseksi minkä tahansa fragmentti-frag-menttiinkytkennän pilkkomisen, jolla nämä tuotteet poistetaan 26 113184 lähes täydellisesti. Liitin-fragmenttiinsidonnan tuotteita ei voida pilkkoa restriktioentsyymillä, koska PstI:n tunnista-missekvenssi ei säily näissä tuotteissa. Liittimen kytken-nälle käytetyt reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 5 2 /ig tomaatin DNA: ta 0,2 /xg liittimiä 20 yksikköä Pst:tä 1 yksikkö T4 DNA-ligaasia 10-mmolaarista Tris-etikkahappoa, pH 7,5, 10-mmolaarista 10 Mg-asetaattia, 50 mmolaarista K-asetaattia, 2-mmolaarista ditiotreitolia, 0,5 mmolaarista ATP:tä.
Sidonta suoritettiin 20 μ1:η suuruisessa reaktiotilavuudessa 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Liittimen sidonnan jälkeen sitoutu-15 mattomat jatkeet poistettiin valikoivan saostuksen avulla.
Tätä tarkoitusta varten reaktioseos suurennettiin 100 μΐ-.aan ja NH4-asetaattia lisättiin lopulliseksi 2,5-molaariseksi konsentraatioksi saakka. Lisättiin 100 μ.1 etanolia -20 °C:ssa, ja seosta inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpöti-...20 lassa. DNA koottiin sentrifugoimalla jäähdytetyssä eppendorf-’·*·' sentrifugissa 4 °C:ssa 10 minuutin ajan nopeudella 14000 kierrosta minuutissa. DNA-saostuma pestiin huoneenlämpötilas- • sa kerran 0,5 ml :11a 70-prosenttista etanolia ja liuotettiin 4 0 μΐ-.aan T0.1E:tä (10-mmolaarinen Tris.HCl, pH 8,0, 0,1-:25 mmolaarinen EDTA) . DNA säilytettiin -20 °C:ssa. Tässä yh- teydessä kuvattu selektiivinen saostamismenettelytapa poistaa kytkeytymättömät liittimet tehokkaasti reaktioseoksesta, mutta pieniä DNA-fragmentteja (<. 200 emäsparia) myös häviää.
.3 0 B) Monistamisreaktio
Yllä valmistettua DNA:ta käytettiin templaattina Pstl-fraq- • ;’· nenttien lisäämiseen. PCR:ää varten reaktioseos sisälsi seu- ;“· raavat komponentit: '35 1 ng templaatti-DNA:ta *·' 150 ng aluketta 7 1 yksikkö Tag DNA-polymeraasia (Perkin Elmer) 27 113184 200 μιτιοοϋβ kaikkia 4 dNTP:itä 10-mmolaarista Tris.HCl:a, pH 8,5, 1,5-mmolaarista
MgCl2:a, 50-mmolaarista KCl:a, H20:ta 50 μ1:η kokonaistilavuuteen saakka.
5
Reaktioseos peitettiin 20 μ1:1ΐ3 kevyttä mineraaliöljyä, jotta haihtuminen estettiin monistamisreaktion aikana. PCR suoritettiin Perkin Elmerin "DNA Thermal Cyclerillä" käyttämällä reaktiokierroksen aikana seuraavia olosuhteita: 1 mi-10 nuutti 94 °C:ssa, 1 minuutti 60 °C:ssa, lämpötilan nosto 60 0C:sta 72 °C:seen nopeudella 1 °C 5 sekunnissa ja 2 1/2 minuuttia 72 °C:ssa. Kaikkiaan suoritettiin 33 reaktiokierros-ta. Reaktion jälkeen lisättiin 20 μΐ kloroformia ja 10 μΐ täyteväriä, tässä tapauksessa 50 prosenttia sakkaroosia sekä 15 0,1 painoprosenttia tilavuutta kohti Orange G -väriä (Merck).
Tämä sekoitettiin hyvin reaktioseoksen kanssa ja sentrifugoi-tiin nopeasti orgaanisen jakeen (mineraaliöljy ja kloroformi) erottamiseksi reaktioseoksesta, jota oli täydennetty täytevä-rillä. 20 μΐ tätä reaktioseosta analysoitiin 1,0-prosenttiako sella agaroosigeelillä.
'···’ C) Tomaatin DNA:n monistaminen alukkeiden kanssa, joilla on : .· lisääntyvä selektiivisvvs ,,/25 PstI:llä pilkottua DNA:ta, johon oli kiinnitetty Pstl-liitin.
; monistettiin tarkoin määritellyissä olosuhteissa. Valittiin neljä erilaista aluketta, joilla oli seuraavat sekvenssit: 1. 5 -CTCGTAGACTGCGTACA-3 2. 5-GACTGCGTACAtgcagA-3 .30 3. 5-GACTGCGTACAtgcagAC-3 '::; 4. 5 -GACTGCGTACAtgcagACC-3 : ; Aluke 1 on osa DNA:n muuntamiseen käytetyn liittimen yläosa- säiettä, ja sen tähden sen pitäisi lisätä kaikkia Pstl-frag-,35 mentteja. Aluke 2 sisältää liitinsekvenssin osan, Pstl-tun-nistamissekvenssin (pienet kirjaimet) sekä yhden selektiivisen nukleotidin (puolilihava kirjasintyyppi), ja sen pitäisi 28 113184 monistaa teoreettisesti noin l/16-osa kaikista Pst_I-fragmenteista. Alukkeet 3 ja 4 ovat samanlaisia kuin aluke 2, mutta ne sisältävät vastaavasti 2 ja 3 selektiivistä nukleotidiä, ja sen tähden niiden otaksutaan monistavan PstI-fragmenteista 5 noin 1/256 sekä 1/4096. Reaktioseosten osa analysoitiin 1,0-prosenttisella agroosigeelillä ja analyysin tulos esitetään kuviossa 11. Tämän kuvion kaistat 1 ja 6 sisältävät DNA-tunnuksia, joiden koot esitetään vasemmalla. Kaistat 2, 3, 4 ja 5 sisältävät PCR:iä, jotka saatiin vastaavasti alukkeilla 1, 10 2, 3 ja 4. Tulokset ilmaisevat, että ainoastaan tapauksessa, jossa alukkeella on 3 selektiivistä nukleotidiä, monistettujen fragmenttien lukumäärä oli sellainen, että saatiin selvä vyöhykekuva. Muut 3 aluketta antoivat vyöhykekuvia, joita ei voitu erottaa agaroosigeeleillä, koska syntyi liian paljon 15 PCR-tuotteita. Näiden monien PCR-tuotteiden joukossa vallitsivat lähes aina tietyt fragmentit, ja ne ovat nähtävissä vyöhykkeinä muiden PCR-tuotteiden taustatäplässä. Nämä voimakkaammat tuotteet luultavasti ovat tomaatin genomissa suurempana kopiolukumääränä tai ne lisääntyvät tehokkaammin kuin ><t20 muut tuotteet. Tomaatin genomisen DNA: n PstI-fragmenttien '···' kokonaislukumäärän (20 000 - 100 000) vuoksi oli otaksutta- vissa, että selvän vyöhykekuvan saamiseksi agaroosigeelillä : V oli käytettävä alukkeita, joissa oli 3 selektiivistä nukle- otidiä.
,.!i25 D) Monistettujen fragmenttien Souhthern blottaus -analyysi
Monistetut fragmentit tutkittiin Southern blottauksella, jotta varmistuttiin siitä, että nämä fragmentit vastasivat .30 aidosti samankokoisia restriktiofragmentteja. Tätä tarkoi-*;;; tusta varten alukkeella 4 saadut yksittäiset fragmentit lei kattiin agaroosigeelistä. Näistä geelileikkeistä DNA puhdis-; ;*· tettiin absorboimalla se lasipalloihin (Gene Clean, valmis- taja Bio 101), ja puhdistetun DNA:n osa monistettiin uudel- 1 > v ' t3 5 leen, jotta saatiin noin 1 ^g kutakin neljää DNA-fragmenttia.
Uudelleenmonistamisreaktioille suoritettiin myöhemmin elekt- i t t '· '· roforeesi 1,0-prosenttisella agaroosigeelillä, ja halutut 29 113184 DNA-fragmentit puhdistettiin. 200 ng kutakin fragmenttia leimattiin (a-32P)dATP:llä, siten että käytettiin satunnaisen heksameerin leimausvälineitä valmistajan (Boehringer Mannheim) esittämien menettelytapojen mukaisesti. Tomaatin koko-5 nais-DNA pilkottiin PstI:llä. sille suoritettiin elektroforeesi 1,O-prosenttisella agaroosigeelillä. Käytettiin neljä selvästi erotettua kaistaa, jotka kukin sisälsivät noin 3 μg käytettyä, pilkottua DNA:ta. Seuraavaksi agaroosigeeli siirrettiin Genescreen+ -hybridisaatiomembraanille valmistajan 10 ohjeiden mukaisesti (New England Nuclear). Siirtämisen jälkeen geeli leikattiin neljään palaan, joista kukin sisälsi yhden kaistan PstI:llä pilkottua tomaatin DNA:ta. Nämä neljä palaa hybridisoitiin kukin yhteen neljästä DNA-koettimesta noudattamalla Klein-Lankhorst et al.:n kuvaamaa menetelmää 15 (Theor. Apll. Genet. 81, 661-667). Hybridisoiduille "bloteil-le" suoritettiin autoradiografia 40 tunnin ajan Kodak XAR5-filmejä käyttäen. Saadut tulokset osoittivat, että kaikilla genomisilla DNA-fragmenteilla, jotka neljä DNA-koetinta tunnistivat, oli sama pituus kuin näillä koettimilla. Tämä ha-...20 vainnollisti, että monistetut fragmentit, joita käytettiin *···' koettimina, olivat peräisin bloteilla ilmaistuista fragmen- teista.
» • * ’:'‘: E) Yhden ainoan restriktiofragmentin selektiivinen monistami- ‘:25 nen
Konstruoitiin kolme alukkeiden sarjaa kolmea (3) vastaavaa satunnaista PstT-fragmenttia varten, jotka olivat peräisin tomaatin genomisesta DNA:sta, josta tunnettiin PstT-tunnistako missekvenssiä seuraava sekvenssi. Alla esitetyllä tavalla *;;; valmistettiin sarja alukkeita, joilla oli 5 selektiivistä ’ · j § nukleotidiä.
Alukesarja 1: \3 5 * · · Sekvenssi 1: 1.'' ’ 5 -ctgcagCAGTACCAGC-----CCGGCACCTGctgcag-3 30 113184 5-TGCGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5
Aluke 1.1 Aluke 1.2
Alukesarja 2: 5
Sekvenssi 2: 5 -ctgcagCCGAATCTCT-----AGTGAGTTAGctgcag-3 5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5
Aluke 2.1 Aluke 2.2 10
Alukesarja 3:
Sekvenssi 1: 5 -ctgcagAATACCAAGA-----GCAAGCACAGctgcag-3 15 5-TGCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5
Aluke 3.1 Aluke 3.2
Tomaatin DNA pilkottiin PstI:llä ja liittimet sidottiin rest-riktiofragmenttien päihin alla kuvatulla tavalla. Tätä DNA:ta 20 käytettiin templaattina PCR:issä alukesarjojen 1 tai 2 tai 3 '··· kanssa ja käytettiin olosuhteita, joita kuvataan yhdessä aiem- mistä kappaleista. Kunkin PCR:n reaktiotuotteet analysoitiin : V 1,O-prosenttisella agaroosigeelillä. Tämä geeli esitetään kuviossa 12. Kuvio 12 esittää 13 kaistaa, joista kaistat 1, '•25 2, 12 ja 13 ovat DNA-tunnuksia. Näiden tunnusten koot kilo- :Y* emäksinä esitetään geelin molemmin puolin. Kaistat 3, 6 ja 9 esittävät plasmidi-DNA:ta kunkin kolmen PstI:llä pilkotun PstI-fragmentin kanssa, joka DNA tuottaa vektorifragmentin pUC18 (Yanish-Perron et ai., Gene 33, 103-119) sekä inser-30 toidun PstI-fragmentin. Kaistat 4 ja 5 esittävät monistamista 1 ;; vastaavan plasmidi-DNA:n 5 fg:n painoisen alukesarjan 1 kans- _ sa sekä vastaavasti 1 ng:n painoista genomista kokonais-DNA:- ; ta. Kaistat 7 ja 8 esittävät monistamista plasmidi DNA:n alukesarjan 2 kanssa sekä genomista kokonais-DNA:ta, ja kais- '35 tat 10 ja 11 esittävät monistamista alukesarjan 3 kanssa.
> * "· Nämä tulokset havainnollistavat, että on mahdollista monistaa yhtä ainoaa PstI-fragmenttia ainakin 20 000 fragmentin muo- 31 113184 dostamasta seoksesta, siten että käytetään selektiivistä restriktiofragmentin monistamistekniikkaa alukkeiden kanssa, joilla on 5 selektiivistä nukleotidiä.
5 F) DNA-polvmorfismien identifiointi SRFA:ta käyttämällä
Aiemmissa kappaleissa havainnollistettiin selvästi, että selektiivisellä restriktiofragmentin monistamistekniikalla on mahdollista monistaa restriktiofragmentteja, joko satunnai-10 silla tai spesifisillä restriktiofragmenteilla, kun sekvenssi-informaatio on saatavilla. Sen tähden olisi mahdollista tutkia restriktiokohtapolymorfismeja saman lajin kahden yksilön välillä. Tätä kuvataan alla kahden tomaattisukupolven välillä, jotka ovat hyvin läheisiä toisilleen mutta eroavat 15 juurinystyn sukkulamadolle resistenssin antavan geeniin Mi:n nähden, joka esiintyy yhdessä tomaattilinjoista. Tämä Mi-geeni on peräisin Lvcopersicon peruvianumilta. lajilta, joka on syötäväksi kelpaavan tomaatin L. esculentumin etäinen sukulainen. Se vietiin L. esculentum-polveen risteyttämällä #>>20 ja tämän jälkeen takaisinristeyttämällä 12 kertaa L. esculen- *··*’ turn-vanhempaan sekä valikoimalla jälkeläinen Mi-geenin suh- * * « teen. Sen tähden kaksi tomaattipolvea eroavat ainoastaan i V niiden geneettisen materiaalin pienen osan, eli Mi-geenin ja ">*· ympäröivän alueen suhteen. Klassisia geneettisiä menetelmiä '•25 käyttämällä Mi-alueen laskettiin muodostavan < 1 % tämän «/;*. polven genomista.
DNA eristettiin kahdesta tomaattisukupolvesta (polvi 83M-71392, joka on Mi-herkkä, ja polvesta 83M-71398, joka on Mi-30 resistentti, saatu De Ruiter Seedsilta, Bleiswijk, Alanko- maat) ja pilkottiin myöhemmin PstI: llä ja annettiin käyttöön _ liittimien kanssa yllä kuvatulla tavalla. Suoritettiin suuri • määrä monistamisreaktioita ja käytettiin alukkeita, jotka erosivat selektiivisten nukleotidien laajennuksiensa suhteen. '2’5 Käytettiin kolmea selektiivistä nukleotidiä ja, paitsi yksin- «’ kertaisia alukkeita, käytettiin myös kahden erilaisen aluk- ’.· keen muodostamia yhdistelmiä. Reaktiotuotteet analysoitiin 32 113184 polyakryyliamidi-agaroosiseosgeeleillä: käytettiin 2,5 prosenttia polyakryyliamidia ja 1,0 prosenttia agaroosia, siten että akryyliamidin suhde bisakryyliamidiin oli 20:1. Geelit ajettiin Protean II -geeliyksiköllä (Biorad) ja käytettiin 5 1,5 mm:n välilevyä. Kaikkiaan käytettiin 16 erilaista aluket- ta, jotka antoivat 16 reaktiota yhden ainoan alukkeen kanssa ja 120 reaktiota kahden alukkeen kaikilla mahdollisilla yhdistelmillä. Tyypillinen esimerkki geelistä, jossa on näistä yhdistelmistä kuusi kappaletta, esitetään kuviossa 13. Tämän 10 geelin kaistat 1 ja 14 sisältävät DNA-tunnuksia, joiden koot kiloemäksinä esitetään geelin oikealla laidalla. Kaistat 2 ja 3, 4 ja 5, 6 ja 7 jne. monistamisia, jotka on suoritettu yhden spesifisen alukkeen kahden tomaattisukupolven alukepa-rin kanssa. Restriktiokohdan polymorfismien seulonta antoi 15 joukon fragmentteja, joista kolme oli hyvin vallitsevaa ja joita kuvataan kuvion 13 kaistoissa 9, 11 ja 12 (ilmaistu pienellä ympyrällä). Polymorfiset vyöhykkeet kaistoissa 9 ja 11 otaksuttiin samoiksi, koska sama aluke oli läsnä molemmissa reaktioissa (ero on toisen alukkeen läsnäolo kaistassa )it20 11) . Kaistojen 11 ja 12 kaksi polymorfista fragmenttia lei- '···' kattiin geelistä, geelipalat murskattiin ajamalla ne 18 gau- ·.*..· gen neulan läpi, ja DNA eluoitiin geelipaloista eluoimalla ne
* Y diffuusion avulla 200 μΐ-.ssa 100-mmolaarista Tris-HCl:a, pH
8,0, joka oli 10-mmolaarinen EDTA:n suhteen. 2 μΐ käytettiin • »25 näiden fragmenttien uudelleenmonistamiseen yllä kuvatulla » i * · •V tavalla. 200 ng kustakin fragmentista tehtiin tylppäpäiseksi T4 DNA -polymeraasia käyttämällä ja sidottiin myöhemmin 100 ng:aan plasmidivektoria pUC18 (Yanisch-Perron et ai., Gene 33, 103-119), joka pilkottiin Smalrllä. Sidontaseos trans-β0 formoitiin E. coliin ja kutakin fragmenttia varten valittiin t t • ; yksi yhdistelmä-E. coli-klooni sekvenssianalyysiin. Kaikki V nämä käsittelyt suoritettiin normaaleja menettelytapoja käyt- ; täen, kuten Sambrook, Fritsch ja Maniatis kuvaavat julkaisus- ."· sa Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor ‘3*5 Laboratory Press, New York) .
t »
t I
33 113184
Kaksi sarjaa alukkeita, jotka sisälsivät kuusi selektiivistä nukleotidiä, syntetisoitiin kahden fragmentin sekvenssien perusteella yllä kuvatulla tavalla. Esillä olevan keksinnön yhteydessä pystyttiin myös monistamaan kukin fragmentti spe-5 sifisesti, siten että käytettiin näitä alukesarjoja. Fragmentit monistettiin vain tomaattisukupolvista, joilla esiintyi sama polymorfismi, joka alussa havaittiin sellaisilla aluk-keilla, joilla oli 3 selektiivistä nukleotidiä, joita käytettiin tämän polymorfismin löytämiseen.
10
Esimerkki 2: Tomaatin DNA:n selektiivinen restriktiofracrmen-tin monistaminen kahden restriktioentsvvmin kanssa
Esimerkissä 1 restriktiofragmentin selektiivistä monistamista 15 (SRDA) havainnollistetaan siten, että käytetään tomaatin DNA:ta ja restriktioentsyymiä PstI. Tässä esimerkissä valaistaan SRFA:ta, jossa käytetään kahta erilaista restriktioentsyymiä, nimittäin PstI:tä ja Msel:tä.
20 DNA:n eristäminen ia muuntaminen
Tomaatin kokonais-DNA eristettiin nuorista lehdistä esimer-kissä 1 esitetyllä tavalla. DNA:n lähteenä käytettiin niin : sanottujen isogeenisten sukupolvien kahta paria, nimittäin 25 GemR:ää ja Gems:ää sekä vastaavasti GCR26:a ja GCR151:ä (näi-tä sukupolvia kuvataan seuraavissa viitteissä: Denby ja Wil-: liams, [1962], Can. J. Plant Sei. 42, 681-685, Smith ja Rit chie, [1983], Plant Mol. Biol. Rep. 1, 41-45). Isogeenisten sukupolvien kunkin parin kaksi yksilöä ovat geneettisesti 30 hyvin samanlaisia, mutta ne eroavat sellaisen ominaisuuden esiintymisen suhteen, joka antaa vastustuskyvyn patogeeni-sientä Verticillium albo-atratumia kohtaan.
: DNA: iden muuntamisen ensimmäisessä vaiheessa ne pilkottiin ',.35 kahdella entsyymillä, nimittäin PstI: llä ja Msel: llä . DNA .pilkottiin ja sen jälkeen DNA-fragmentteihin sidottiin liit-timet samassa puskurissa, joka oli nimeltään RL-puskuri 34 113184 (restriktio-ligaatiopuskuri) ja joka sisälsi 10 mmoolia Tris.HCl:a, 10 mmoolia Mg-asetaattia ja 50 mmoolia K-asetaat-tia, 5 mmoolia DTT.-tä, pH 7,5.
5 DNA:iden restriktio Pstl:llä ia Msel:llä 2.5 /xg DNA: ta 12.5 yksikköä PstI:tä (Pharmacia, 10 yksikköä/μΐ) 12.5 yksikköä Msel:tä (N.E. Biolabs, 4 yksikköä/μΐ) 10 5 μΐ 10 x RL-puskuria H20:ta 50 μΐ-.aan saakka
Seosta inkubointiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan.
15 DNA:n muuntamisen seuraava vaihe oli liitinmolekyylien sidonta DNA-fragmenttien päihin. Ensin oli valmistettava sopivia, kaksisäikeisiä liitinmolekyylejä.
Liittimien valmistaminen 2 0 Msel-liitin: 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 ... 3 - TACTCAGGACTCAT - 5 • · ;·; Sellaisen liuoksen valmistamiseksi, jossa oli 50 pmoolia/μΐ • ·' tätä liitintä, 8 μg (1430 pmoolia) 16-mer 5-GACGATGAGTCCTGAG- * 25 3:a, sekoitettiin 7 μg:n kanssa (1430 pmoolia) 14-mer 5-TACT- CAGGACTCAT-3 : a 28,6 μ1:η suuruisessa H20:n kokonaistilavuu-dessa.
PstI-liitin: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 3 0 3 -CATCTGACGCATGT-5
Sellaisen liuoksen valmistamiseksi, jossa oli 5 pmoolia/μΐ . tätä liitintä, sekoitettiin 5,25 μg (715 pmoolia) biotinyloi- j.i ! tua 21-mer 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 :a 14-mer 5-TGTACG- :^35 CAGTCTAC-3:n kanssa, jota viimeksi mainittua oli 3,5 μg (715 V pmoolia) 143 μ1:η suuruisessa H20:n kokonaistilavuudessa.
35 113184
Liitinmolekwlien sitominen
Pilkottuun DNA:han lisättiin 10 μ1:η suuruinen seos, joka sisälsi 5 1 μΐ Pst-bio-liitintä (= 5 pmoolia) 1 μΐ Msel.-liitintä (= 50 pmoolia) 1,2 μΐ 10 mmolaarista ATP:tä 1 μΐ 10 x RL-puskuria 1 yksikön T4 DNA -ligaasia (Pharmacia, 5 yksikköä/μΐ) 10 H20:ta 10 μ1:33η saakka
Muodostuvaa, 60 μ1:η suuruista reaktioseosta inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 °C:ssa.
15 Liittimet konstruoitiin siten, etteivät restriktiokohdat säilyneet sidonnan jälkeen. Tällä tavalla estettiin fragmentin sidonta fragmenttiin, kun kerran konkatameerit pilkkoutuvat, koska restriktioentsyymit ovat aktiivisia vielä sidonta-reaktion ajan. Liittimen sidonta liittimeen ei ollut mahdol-20 lista, koska liittimet eivät olleet fosforyloituneita (katso .···. myös esimerkki 1) .
.;( Biotinvloituien DNA-fragmenttien valinta 25 Templaatti-DNA:iden valmistaminen SRFA:ta varten, siten että ...: käytettiin kahta restriktioentsyymiä, yleensä sisälsi ylimää- ·.· · räisen vaiheen, jota ei käytetty, kun SRFA suoritettiin yhden ainoan entsyymin kanssa. Tässä vaiheessa erotettiin kaikista muista fragmenteista sellaiset DNA-fragmentit, joihin oli 30 liitetty biotinyloitu liitin.
Biotinyloidut fragmentit erotettiin biotinyloitumattomista · fragmenteista (Msel-Msel-fragmenteista) sitomalla ne tässä : vaiheessa paramagneettisiin streptavidiinipalloihin (Dynal) .
• ,,.35 10 μΐ palloja pestiin kerran 100 μΐ-.ssa STEX:ää (100 mmoolia
NaCl:a, 10 mmoolia Tris.HCl:a, 1 mmoolia EDTA:ta, 0,1 % Tri-ton X-100:aa, pH 8,0), ja ne lietettiin uudelleen 140 μΐ-.aan 36 113184 STEX:ää. Pallot lisättiin myöhemmin ligaatioseokseen, siten että lopulliseksi tilavuudeksi saatiin 200 μΐ. Tätä inkuboi-tiin 30 minuutin ajan ravistellen samalla varovasti huoneenlämpötilassa, jotta varmistuttiin biotinyloitujen DNA-frag-5 menttien sopivasta kiinnittymisestä palloihin. Pallot koottiin, siten että palloja sisältäviä putkia pidettiin lähellä magneettia. Tämä esti sen, ettei palloja pipetoitu, kun su-pernatantti siirrettiin toiseen putkeen. Pallot pestiin kerran ja sen jälkeen ne siirrettiin uuteen putkeen. Sitten 10 pallot pestiin kolme kertaa 200 μ1:1ΐ3 STEX:iä. Lopuksi pallot lietettiin uudelleen 200 μΐ-.aan Tol.E:tä (10 mmoolia Tris/0,1 mmoolia EDTArta, pH 8,0) ja ne siirrettiin uuteen putkeen. DNA pidettiin 4 °C:ssa.
15 Restriktioentsyymeillä pilkottuja DNA:itä, jotka varustettiin liittimillä, kiinnitettiin paramagneettisiin streptavi-diinipalloihin ja yllä kuvatulla tavalla niistä poistettiin Msel-Msel-fragmentit. nimitetään seuraavissa vaiheissa temp-laatti-DNA:iksi.
20 .···. Pstl-Msel-fragment tien monistaminen . ’ ^ Yllä kuvatulla tavalla valmistettujen templaatti-DNA:iden tulisi sisältää kaikki Pstl-Msel-fragmentit mainituista to-'25 maattisukupolvista ja sen lisäksi pieni määrä Pstl-Pstl-frag-··· mentteja, mutta niiden ei tulisi sisältää mitään sisäisiä ·.· ’ Msel-fragmentteja. Tässä kokeessa joukko näitä Pstl-Msel- fragmentteja havainnollistettiin monistamalla niitä oleellisesti esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Monistamistuotteet 30 analysoitiin denaturoivia akryyliamidigeelejä käyttämällä (Maxam ja Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 560-564), koska ne fragmentit, jotka saatiin tässä esimerkissä, olivat paljon pienempiä kuin esimerkissä 1 kuvatut fragments tit. Lisäksi näillä geelityypeillä oli mahdollista erottaa •.,35 aina 100 vyöhykettä kaistaa kohti, mikä oli noin 10 kertaa enemmän kuin esimerkissä 1 kuvatuilla agaroosigeeleillä.
37 113184
Fragmentit havainnollistettiin leimaamalla yksi PCR-alukkeis-ta 5'-päästä (r-32P)ATP:n ja polynukleotidikinaasin avulla.
PCR-alukkeen leimaaminen 5
Leimaamista varten valittu aluke oli 19-mer 5-GATGAGTCCTGAG-TAAgaa-3, joka nimitettiin MseI-aluke-1:ksi ja jossa selektiiviset nukleotidit esitetään pienin kirjaimin. Leimaus suoritettiin seuraavalla tavalla: 10 3.0 μΐ 18-meriä (liuoksesta, jossa oli 50 ng/μΐ = 150 ng) 5.0 μΐ (τ-32Ρ) -ATP: tä (liuoksesta, jossa oli 10 μ0ΐ/μ1 = 50 μΟί) 3.0 μΐ 250-mmolaarista Tris.HCl:a, joka oli 100-mmolaarinen 15 MgCl2:n ja 50 mmolaarinen DTT:n suhteen, pH 7,5 0,5 μΐ T4-kinaasia (Pharmacia, 10 yksikköä/μΐ) 18,5 μΐ H20 : ta Tämä antoi kokonaistilavuudeksi 30 μΐ, jota inkuboitiin 37 20 °C:ssa 30 minuutin ajan. Kutakin PCR:ää kohti lisättiin 1 μΐ ,··*, tätä 5'-leimattua aluketta.
.!'! Suoritettiin kaikkiaan 28 PCR:ää, joissa kukin neljästä temp- * laatti-DNA:sta monistettiin 7 alukeyhdistelmän kanssa. Kulla- 25 kin alukeyhdistelmällä oli sama Msel-aluke (Msel-aluke-l. ku-vattu yllä), mutta yhdistelmä vaihteli Ps11-alukkeen valinnan · suhteen. Valittiin kaikkiaan 7 erilaista aluketta (kuten
MseI-alukkeen yhteydessä selektiiviset nukleotidit ilmaistaan pikkukirjäimin): 30
Pstl-aluke-l: 5 -GACTGCGTACATGCAGga-3 ! i'. PstI-aluke-2: 5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
PstI-aluke-3: 5-GACTGCGTACATGCAGgg-3 : : ; PstI-aluke-4: 5-GACTGCGTACATGCAGag-3 ;,,35 PstI-aluke-5 : 5 -GACTGCGTACATGCAGat - 3 !;! PstI-aluke-6: 5-GACTGAGTACATGCAGct-3
PstI.-aluke-7 : 5 - GACTGCGTACATGCAG t a - 3 38 113184
Kaikki PCR-alukkeet liuotettiin H20:teen pitoisuutena 50 ng/μΐ.
5 Monistamisreaktio PCR-seos sisälsi seuraavat aineosat: 2.0 μΐ templaatti-DNA:ta 10 1,0 μΐ 5'-leimattua Msel-aluketta (5 ng) 0,5 μΐ leimaamatonta Msel-aluketta (25 ng) 0,6 μΐ Pst-aluketta (30 ng) 2.0 μΐ 100-mmolaarista Tris.HCl:a, joka oli 15-mmolaarinen
MgCl2:n ja 500-mmolaarinen KCl:n suhteen, pH 8,5 15 0,8 μΐ 5-mmolaarisia dNTP-.itä 0,1 μΐ Taq-polymeraasia (Cetus Perkin Elmer, 5 yksikköä μΐ:ssa) 13.0 μΐ H20: ta 20 Reaktion kaikki komponentit lisättiin ja niitä sekoitettiin .··*. hyvin, viimeksi lisättiin PCR:n oleellinen komponentti, yleensä entsyymi. Myöhemmin reaktio käynnistettiin niin pian kuin mahdollista.
♦ * M I
25 Monistamiset suoritettiin Perkin Elmer 9600 -lämpökiertojär- *·*! jestelmällä. Kierroksen profiili oli seuraava: I kierros: denaturointi 30 sekuntia 94 °C:ssa alukkeiden 30 kiinnittäminen 30 sekuntia 65 °C:ssa -j. pidentäminen 60 sekuntia 72 °C:ssa II kierrosta: denaturointi: 30 sekuntia 94 °C:ssa h! · alukkeiden kiinnittämislämpötilan alentaminen :,.35 0,7 °C:tta kutakin kierrosta kohti, .1. 64,3 °C, 63,6 °C, 62,9 °C, 62,2 °C, 61,5 °C, 60,8 °C, 60,1 °C, 59,4 °C, 58,7 °C, 39 113184 58,0 °C, 57,3 °C. Inkubointi 30 sekunnin ajan kussakin lämpötilassa.
pidentäminen: 60 sekuntia 72 °C:ssa 5 23 kierrosta: denaturointi: 30 sekuntia 94 °C:ssa alukkeiden kiinnittäminen: 30 sekuntia 56 °C:ssa pidentäminen: 60 sekuntia 72 °C:ssa 10 Monistettujen fragmenttien geelianalvvsi
Reaktiotuotteet analysoitiin 4,5-prosenttisilla, denaturoivilla polyakryyliamidigeeleillä. Käytettiin geelejä, joiden koko oli 50 x 38 cm ja joiden geelikasetit näiden geelien 15 valmistamista varten ostettiin Bioradilta. Käytettiin 100 ml geeliliuosta, joka sisälsi 4,5 painoprosenttia tilavuutta kohti akryyliamidia, 0,225 painoprosenttia tilavuutta kohti bisakryyliamidia ja joka oli 50-mmolaarinen Trisin, 7,5-mo-laarinen urean, 50-mmolaarinen boorihapon ja 1-mmolaarinen 20 EDTA:n suhteen, pH 8,3. 100 ml geeliliuosta sekoitettiin 500 ,··. μ1:η kanssa 10-prosenttista ammoniumpersulfaattia ja välittö mästi ennen geelin valamista 100 μ1:η kanssa TEMED:iä. Elekt-.''* roforeesipuskurina käytettiin Tris-boorihappo-EDTA-puskuria, ‘ ja se sisälsi 100 mmoolia Trisiä, 100 mmoolia boorihappoa, 2 25 mmoolia EDTA:a, pH 8,3. Reaktioseoksia sekoitettiin yhtä <· * t . suurten tilavuuksien kanssa (20 μΐ) 98-prosenttista formami- v ‘ dia, joka oli 10-mmolaarinen EDTA:n suhteen ja jossa oli 0,01 painoprosenttia bromifenolisinistä sekä 0,01 painoprosenttia ksyleenisyanolia. Muodostuvia seoksia kuumennettiin 3 minuu-30 tin ajan 95 °C:ssa ja sitten ne jäähdytettiin nopeasti jään päällä. Kutakin näytettä pantiin 2 μ1:ΆΆ geelin pinnalle.
, ;* Geelit ajettiin 110 watin suuruisella vakio teholla, jotta « lämmön kehittyminen elektroforeesin aikana oli vakio. Näissä :: . olosuhteissa geelien kenttävoimakkuus vastasi 40 - 50 voit--,,35 tia/cm.
! I
40 113184 SRFA-reaktioiden tulokset esitetään kuviossa 14. Kaistat numeroidaan yhdestä 28:aan, ja ne kukin sisältävät neljä to-maattisukupolvea 7 alukeyhdistelmästä yhden kanssa. Tomaat-tisukupolvien järjestys geelillä on seuraava: 1. GCR26, 2.
5 GCR151, 3. GemR, 4. Gems.
Kaistat 1-4 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja Pstl-aluke-l:n avulla, kaistat 5-8 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja PstI-aluke-2:n avulla, 10 kaistat 9-12 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-alu-ke-l:n ja PstI-aluke-3:n kanssa, kaistat 13 - 16 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja PstI-aluke-4:n kanssa, kaistat 17 - 20 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja PstI-aluke-2:n kanssa, kaistat 21 - 24 15 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja Pstl-aluke-6:n kanssa, ja kaistat 25 - 28 sisältävät nämä DNA:t monistettuina Msel-aluke-l:n ja PstI-aluke-7:n kanssa. Geeli ei sisällä mitään kokotunnuksia, mutta havainnollistetut DNA-fragmentit vastaavat + 200 nukleotidiä kuvion alaosassa aina 20 + 500 nukleotidiin kuvion yläosassa.
» « · I · * 1! Esimerkki 3: Eri Lactuca-lai ien DNA:n selektiivinen restrik- tiofragmenttimonistaminen kahden restriktioentsvvmin kanssa * I · » » 1 25 Esimerkissä 2 esitetään selektiivisen restriktiofragmentin monistamisen (SRFA) periaate, jossa käytetään kahta restrik- * i V · tioentsyymiä, ja esimerkkiä havainnollistetaan tomaatin DNA:n avulla. Tässä esimerkissä valaistaan sitä, että samanlaisia tuloksia saadaan käyttämällä erilaisten Lactuca-lajien 30 DNA:itä sekä samoja kahta restriktioentsyymiä, nimittäin PstI: tä ja Msel: tä .
f I 1 » i < i t . DNA:n eristäminen ia muuntaminen * » » » 1
» · I
: 35 DNA:t eristettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, siten että käytettiin erilaisten Lactuca-lajien lehtimateriaalia. Kuten alla esitetään, näihin kasveihin kuuluu kaupallisia lehti- 41 113184 salaatin (L.sativa) muunnoksia sekä useita kahden luonnonvaraisen Lactuca-lajin yksilöä, nimittäin L. salicrna ja L. virosa. Kasvit nimitettiin mielivaltaisesti seuraavalla tavalla : 5 1. L. saliqna. nro 21, kasvi 1 2. L. saliqna. nro 21, kasvi 2 3. L. saliqna. nro 22, kasvi 1 4. L. saliqna. nro 22, kasvi 2 10 5. L. virosa. nro 01, kasvi 1 6. L. virosa. nro 01, kasvi 2 7. L. virosa. nro 02, 8. L. virosa. nro 03, kasvi 1 9. 1- virosa. nro 03, kasvi 2 15 10. L. sativa. kaupallinen voikukanlehtimäinen (butterhead) muunnos
Geneettinen materiaali, joka täten analysoitiin, edusti kuutta erilaista kasvityyppiä, näistä kasveista numeron neljä 20 kaksi erilaista yksilöä mukaan luettuina.
. .·. Lactuca-DNA:t muunnettiin templaattien muodostamiseksi SRFA:-ta varten ja käytettiin samanlaista menetelmää kuin kuvataan esimerkissä 2.
' is ·;;; Pstl-Msel-fragmenttien monistaminen SRFA-reaktioissa käytettiin templaatteina DNA:itä, jotka valmistettiin yllä kuvatulla tavalla. Käytettiin kahta alukeyh-30 distelmää, joissa oli yksi ainoa Msel-aluke ja kaksi erilais-·;· ta Pst-aluketta. Nämä alukkeet (selektiivisiä nukleotidejä -'[ kuvataan pienin kirjaimin) ovat seuraavat:
Msel-aluke: 5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3 '*•35 PstI -aluke-1: 5 -GACTGCGTACATGCAGaa - 3 ··· Pst I -aluke-2 : 5 - GACTGCGTACATGCAGc a - 3 42 113184
Pstl-Mstl-fraamentit monistettiin käyttämällä edellä kuvattuja alukkeita sekä noudattamalla täsmällisesti esimerkissä 2 kuvattua tapaa, ja aikaansaadut fragmentit havainnollistettiin denaturoivilla polyakryyliamidigeeleillä kuten esimer-5 kissä 2 kuvataan. Saadut vyöhykekuvat esitetään kuviossa 15. Kaistat 1- 10 esittävät DNA:itä, jotka monistettiin Msel-alukkeen ja Pstl-aluke-l:n muodostaman yhdistelmän avulla, kaistat 11 - 20 osoittavat DNA:itä 1-10, jotka monistettiin Msel-alukkeen kanssa yhdistettynä PstI-aluke-2:een. Nukleoti-10 dien kokotunnukset (eivät näy kuviossa) esitetään geelin oikealla puolella. Vyöhykekuvien erot heijastavat erilaisten kasvien sukulaisuuden välisiä eroja.
Esimerkki 4: Maissin luontaisten sukupolvien restriktiofrag-15 mentin valikoiva monistaminen erilaisten restriktioentsvvmi-vhdistelmien kanssa
Esimerkeissä 2 ja 3 havainnollistetaan selektiivistä res-triktiofragmentin monistamista (SRFA) kahden restriktioent-20 syymin avulla, siten että vastaavasti käytetään tomaatin DNA:ta ja lehtisalaatin (Lactuca species) DNA:ita. Tässä esi-. .·. merkissä valaistaan sitä, että samanlaisia tuloksia saadaan maissisukupolvilla (Zea-maissi) . Sen lisäksi esitetään, että ’ voidaan käyttää erilaisia restriktioentsyymiyhdistelmiä, 25 jotta tässä tapauksessa saadaan maissisukupolvien DNA-sormen-*;;; jälkiä.
DNA:n eristäminen ia muuntaminen 30 Käytettiin maissin kahta luontaista sukupolvea, nimeltään 1 ··· ja 2. Näiden sukupolvien alkuperä on asiaankuulumaton, koska esillä olevassa kokeessa mikä tahansa valittu sukupolvi antoi , V hyviä DNA-sormenjälkiä, kun käytettiin SRFA:ta. Näiden suku- · polvien DNA eristettiin nuoresta lehtimateriaalista, kuten ‘•*•35 Saghai-Mahoof et ai. (1984) kuvaavat julkaisussa Proc. Natl.
I· Acad. Sei. U.S.A. 81, 8014-8918. Templaatti-DNA: iden valmis- : tamiseksi käytettiin seuraavia restriktioentsyymiyhdistelmiä 43 113184 (EK: itä) : Pstl/Tacrl. EcoRl/Taal. Asel/Taal. Sse8387-I/Taal. Kaikki entsyymit ostettiin Pharmacialta paitsi Asel. joka hankittiin New England Biolabsilta, ja Sse8387-I. joka ostettiin Amershamilta. Templaatti-DNA:t valmistettiin suurin 5 piirtein siten, kuin esimerkeissä 2 ja 3 kuvataan, seuraavin poikkeuksin: DNA pilkottiin inkuboimalla ensin Tacrl:n kanssa 65 °C:ssa yhden tunnin ajan ja sen jälkeen toisen entsyymin PstI:n.
10 Asel:n, EcoRI:n tai Sse8387-I:n kanssa 37 °C:ssa vielä yhden tunnin ajan. Liittimet sidotaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sekä käytetään liittimiä, jotka ovat seuraavat:
Taol-liitin: 5 -GACGATGAGTCCTGAC-3 15 3 -TACTCAGGACTGGC-5
PstI & Sse8387-I-liitin: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 3 -CATCTGACGCATGT-5 20 Asel-liitin: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3 : *=': 3 -CTGACGCATGGAT-5
EcoRI-liitin: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3 -CTGACGCATGGTTAA-5 25 * · * t *!" Restriktiofraamenttien monistaminen
Restriktiofragmentit monistettiin, kuten esimerkissä 2 kuvataan. Monistamistuotteiden leimaamista varten valitut aluk-30 keet olivat seuraavat Taal-alukkeet. joissa oli 3 selektii-j’ vistä nukleotidiä (ilmastu pienin kirjaimin): . V Taal-alukkeet 1. 5-TGAGTCCTGACCGAacc-3 (5'-leimatut) 2. 5 -TGAGTCCTGACCGAaca-3 ' '[‘35 3.5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3 : 4. 5 - TGAGTCCTGACCGAcac - 3 44 113184 Näitä neljää aluketta käytettiin monistamistuotteiden ilmaisuun kaikkien neljän entsyymiyhdistelmän kanssa. Kullekin entsyymiyhdistelmälle valittiin 4 aluketta toista entsyymiä varten, jotta kullekin entsyymille saatiin 16 yhdistelmää.
5 Nämä alukkeet esitetään alla (selektiiviset nukleotidit ilmaistaan pikkukirjäimin). EcoRI- ja Asel-alukkeille valittiin 3 selektiivistä nukleotidiä, Pstl-alukkeille valittiin 2 selektiivistä nukleotidiä ja Ssel-alukkeille valittiin yksi ainoa selektiivinen nukleotidi. Maissin genomista DNA:ta 10 tiheästi leikkaavia entsyymejä varten valittiin alukkeet, jotka sisälsivät pidennyksiä, joissa on vähemmän selektiivisiä nukleotidejä.
EcoRI-alukkeet: 1. 5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3 15 2. 5-CTGCGTTACCAATTCaca-3 3. 5-CTGCGTTACCAATTCaac-3 4. 5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
Asel-alukkeet: 1. 5 -GACTGCGTACCTAATaac-3 20 2. 5-GACTGCGTACCTAATaag-3 3. 5 -GACTGCGTACCTAATacc - 3 . 4. 5 - GACTGCGTACCTAATgaa - 3 * * · I · < > I (
PstI-alukkeet: 1. 5 - GACTGCGTACATGCAGac - 3 *25 2. 5 -GACTGCGTACATGCAGaa-3 ’;;; 3.5-GACTGCGTACATGCAGca-3 '·' ! 4. 5 - GACTGCGTACATGCAGc c - 3
Sse8387-1-alukkeet:1.5-GACTGCGTACATGCAGGa-3 30 2. 5-GACTGCGTACATGCAGGg-3 I · 3.5-GACTGCGTACATGCAGGc-3 : ‘; ‘. 4.5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
Suoritettiin kaikkiaan 128 PCR:ää (2 DNA x 4 entsyymiä x 16 ’*>35 alukeyhdistelmää) noudattamalla ohjetta, jota kuvataan esimerkissä 2. Näiden PCR:ien reaktiotuotteet analysoitiin kol-mella geelillä (jotka sisälsivät 48 kaistaa geeliä kohti), 45 113184 kuten esimerkissä 2 kuvataan. Kaikki alukeyhdistelmät antoivat 50 - 100 vyöhykkeen muodostamat sormenjäljet kaistaa kohti, lukuun ottamatta Ssel-Taql-yhdistelmää, joka antoi ainoastaan 10 - 15 vyöhykettä kaistaa kohti. Yhden geelin 5 muodostama esimerkki esitetään kuviossa 16. Tämä kuvio esittää osaa geelistä, jossa on analyysi DNA-sormenjäljistä, jotka on saatu Pstl-Taql- ja EcoRI-Taal-entsvvmivhdistelmil-lä. Kaistat 1-8 esittävät kahden maissin DNA:n sormenjälkiä, jotka on saatu SRFA:lla TaqI-aluke-3:n ja vastaavasti 10 PstI-alukkeiden -1, -2, -3 ja -4 kanssa, kaistat 9-16 esittävät kahden maissin DNA:iden sormenjälkiä, jotka on saatu SRFA:11a vastaavasti TaaI-aluke-4:llä sekä Pstl-alukkeilla - 1, -2, -3 ja -4, kaista 17 esittää PstI:llä pilkotun lambda-DNA-kokotunnuksia, joiden fragmenttien jotkut koot esitetään 15 nukleotideinä oikeassa reunassa, ja kaistat 18 - 25 esittävät kahden maissin DNA:iden DNA-sormenjälkiä, jotka on saatu SRFA:11a vastaavasti Taal-aluke-l:n ja EcoRI-alukkeiden -1, - 2, -3 ja -4 kanssa.
20 Esimerkki 5: Bakteeriperäisten DNA:iden selektiivinen rest-riktiof ragmentti lii • * * t ? · > * * ·
Esimerkissä 2, 3 ja 4 esitetään selektiivisen restriktiofrag-mentin monistamisen (SRFA) periaate käyttämällä kahta rest- • · 25 riktioentsyymiä ja menetelmää havainnollistetaan vastaavasti ' * t tomaatin, lehtisalaatin (Lactuca-lajit) sekä maissin DNA:il-la. Tässä esimerkissä valaistaan sitä, että tätä tekniikkaa voidaan käyttää myös bakteeriperäisten DNA:iden luonnehtimiseen. Joukko Xanthomonas campestris-kantoia saatiin Laborato-30 ry of Microbiologylta Gentistä, Belgiasta ja niitä käytettiin ;· valaisemaan tekniikan soveltamista bakteereihin.
' ί i , ,' DNA:n eristäminen ia muuntaminen ’•>•35 Kaikki DNA:t valmistettiin Xanthomonas campestris-kannoista.
t jotka eristettiin eri lähteistä, enimmäkseen infektoituneista ; kasveista. Nämä kannat luetellaan alla numeroituina 1 - 26 ja 46 113184 ne voidaan saada Laboratory of Microbiology].ta Gentistä, Belgiasta.
DNA alalajit pathovar eristys 5 1. albilineans 494 2. fragariae 708 3. oryzae oryzae 5047 4. oryzae populi 5743 5. maltophilia 958 10 6. campestris campestris 568 7. campestris alfalfae 497 8. campestris coracanae 686 9. campestris citri 8655 10. campestris citri 9658 15 11. campestris citri 9181 12. campestris citri 8657 13. campestris citri 8654 14. campestris citri 8650 15. campestris citri 682 20 16. campestris citri 681 : : 17. campestris citri 9325 : 18. campestris citri 9321 j'.\ 19. campestris citri 9176 ____: 20. campestris citri 9671 <;2 5 21. campestris citri 9665 22. campestris citri 9182 23. campestris citri 568 24. campestris citri 9167 25. campestris citri 9175 30 26. campestris citri 9160 ♦ · · · : : : Näiden bakteereiden DNA eristettiin, niin kuin Marmur on . V kuvannut (J. Mol. Biol. 3, 208-218). DNA:t pilkottiin oleel- lisesti esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, paitsi että Taql ja '135 Aoal valittiin rajaaviksi entsyymeiksi. Liittimet yhdistet- tiin tavalla, jota kuvataan esimerkissä 2, ja käyttämällä : ·.: seuraavia jatkeita: 47 113184
Tacrl- j atke : 5 -GACGATGAGTCCTGAC- 3 3 -TACTCAGGACTGGC-5
Apal-j atke: 5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3 5 3 -CATCTGACGCATGT-5
Restriktiofraqmenttien monistaminen
Restriktiofragmentit monistettiin, kuten esimerkissä 2 kuva-10 taan. SRFA:ta varten valitut alukkeet olivat Taql-aluke 5- CGATGAGTCCTGACCGAg-3 (jossa on yksi selektiivinen nukleotidi, joka ilmaistaan pienellä kirjaimella) sekä Apal-aluke 5-GACT-GCGTACAGGCCCg-3 (jossa on yksi selektiivinen nukleotidi, joka ilmaistaan pienellä kirjaimella). Apal-aluke leimattiin esi-15 merkissä 2 kuvatulla tavalla 5'-päästä, jotta monistetut fragmentit voitiin ilmaista.
Kukin 26 DNA:sta monistettiin käyttämällä alukesarjaa, jota edellä kuvataan. Monistamisolosuhteet esitettiin esimerkissä 20 2, paitsi että PCR.-n viimeiset 9 kierrosta poistettiin : : DNA:iden yksinkertaisemman rakenteen vuoksi verrattuna kasvi- : DNA:hän, jota käytettiin esimerkeissä 2, 3 ja 4.
....: Esillä olevassa esimerkissä kuvatulla tavalla bakteeripe- ,:25 räisten DNA:iden avulla saadut DNA-sormenjäljet esitetään kuviossa 17. Kaistat 1-26 edustavat bakteeriperäisiä DNA:-ita 1-26. Tunnus-DNA:iden koot (eivät näkyvissä geelillä) nukleotideinä ilmaistaan geelin oikealla puolella. Nämä kuviot osoittavat selvästi, että vyöhykekuvien samankaltaisuus 30 heijastaa bakteeriperäisten kantojen sukulaisuussuhdetta.
48 113184
Esimerkki 6: Erilaisten eläinten DNÄ:n selektiiviset restrik-tiofragmenttien monistamiset, siten että käytetään kahta restriktioentsvvmiä 5 Aiemmissa esimerkeissä selektiivistä restriktiofragmentin monistamista (SRFA) havainnollistettiin kasvi-DNA:n suhteen, joka oli peräisin eri lähteistä. Esillä olevassa esimerkissä valaistaan menetelmän tehokkuutta käyttämällä satunnaisia DNA-näytteitä, jotka on saatu erilaisista kotieläimistä.
10 Tutkitut eläinlajit ovat seuraavat: Gallus domesticus (kanan-poika); Susscrofa domestica L. (porsas); Bos taurus (lehmä), Eauus caballus (hevonen). Käytetyt restriktioentsyymit ovat Sse8387I ja Msel.
15 DNA:n eristäminen ja muuntaminen DNA:t eristettiin verinäytteistä, siten että noudatettiin menettelytapoja, joita Maniatis et ai., (1982) kuvaavat). DNA-näytteet 1-3 (kananpoika),4-7 (porsas),8-11 (lehmä) 20 sekä 12 - 15 (hevonen) pilkottiin restriktioentsyymeillä : : Sse8387I ja Msel. DNA-fragmentit yhdistettiin liittimiin, :niin kuin esimerkissä 2 kuvataan. Koska restriktioentsyymit Sse8387I ja PstI tuottavat yhteensopivia 3'-ulokkeita, voi-tiin käyttää Päti- ja Msel-liitintä, joka kuvataan esimerkis-,j25 sä 2.
Restriktiofragmenttien monistaminen
Yllä mainitut ja esimerkissä 2 kuvatut templaatti-DNA:t toi-30 mivat SRFA-reaktiossa templaatteina. Käytetyt alukeyhdistel-mät koostuivat yhdestä ainoasta Msel-alukkeesta ja erilaisis-: : : ta Ssel-alukkeista, jotka olivat seuraavat: ‘::. ‘ Msel-aluke: 5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3 ’(3.5 Sse8387I-aluke-l: 5 - GACTGCGTACATGCAGGaa - 3 ..;: Sse8387I-aluke-2: 5-GACTGCGTACATGCAGGag-3 49 113184
Sse83871-Msel-fragmentit monistettiin, siten että käytettiin yllä kuvattuja alukepareja sekä ohjetta, jota kuvataan esimerkissä 2. Reaktiotuotteet ajettiin denaturoivilla polyak-ryyliamidigeeleillä, joita kuvataan myös esimerkissä 2. Auto-5 radiografia, joka esittää mainittujen näytteiden sormenjälkiä, on kuviossa 18. Kaistat 1-15 esittävät DNA:iden 1-15 sormenjälkiä, jotka on monistettu Msel-alukkeen kanssa, jonka parina on ollut Sse8387I-aluke-l. kaistat 16 - 30 esittävät samanlaisia kuvia, jotka on saatu Msel-alukkeella yhdistetty-10 nä Sse8387I-aluke-2:en kanssa. Sormenjälkien erot yhden lajin eläinten välillä heijastavat heterogeenisuutta eläinpopulaa-tioissa; kokonaiskuvat ovat spesifiselle lajille ominaisia.
Erityisessä sovellutusmuodossa keksintö koskee menetelmää 15 lähtö-DNA:n ainakin yhden sellaisen osan kontrolloitua monistamista varten, joka sisältää suuren määrän tietyn, spesifisen restriktioendonukleaasin pilkkomiskohtia ja jonka nukle-iinihapposekvenssistä ainakin osa on tuntematonta, joka menetelmä sisältää: 20 (a) mainitun lähtö-DNA:n pilkkomisen mainitulla, spesi- fisellä restriktioendonukleaasilla fragmentiksi, sen : pilkkomisen restriktiofragmenttien sarjaksi, jotka f·'; vastaavasti sisältävät 5'- ja 3'-päitä, ....: (b) paitsi 5'- ja 3'-adaptoreita, jotka määritellään _;25 myöhemmin esillä olevassa yhteydessä ja jotka jo ".!! olivat erillisissä muodoissa, myös mainitulla, spe sifisellä endonukleaasilla käsittelemällä pilkotaan määrätty, kaksisäikeinen oligonukleotidilinkkeri, joka omassa nukleotidisekvenssissään sisältää yhden 30 ainoan kohdan mainittua, spesifistä endonukleaasia varten mainitun linkkerin pilkkomiseksi täten vas-: taavasti näissä 5'- ja 3'-adaptoreissa, . V (c) lähtö-DNA:sta saadut restriktiofragmentit sidotaan 5'- ja 3'-päistään vastaavasti mainittujen 3'- ja ;·35 5' -adaptor e iden kanssa, jotta täten tuotetaan täy- j‘ dennettyjä lähtö-DNA:n kiinnitettyjä restriktiofrag- mentteja, jotka sitten vastaavasti 5'- ja 3'- 50 113184 päissään sisältävät lisäyksiä, joiden nukleotidisek-venssit koostuvat em. 3'- ja 5'-adaptoreiden nukleo-tidisekvensseistä, mukaan luettuina nukleotidisek-venssit, jotka sisältyvät spesifiseen restriktiokoh-5 taan, (d) paitsi siinä tapauksessa, että on tarkoituksenmukaista saada aikaan sopivia templaatteja alukkeita varten, mainitut 5'- ja 3'-adaptorit ennen edellä esitettyä sidontaa pidennetään lisäämällä niihin 10 oligonukleotidisegmenttejä, joilla on määrätyt, muuttumattomat sekvenssit vastaavissa 5'- ja 3'-päissään, pidentämällä, jos samassa tarkoituksessa on sopivaa, mainittujen, täydennettyjen restriktiof-ragmenttien päitä mainituilla oligonukleotidisek-15 vensseillä, jolloin saadaan täydennettyjä restrik- tiofragmentteja, jotka ovat molemmista päistään pidennettyjä mainituilla vakio sekvensseillä; (e) mainitut, täydennetyt tai, kun on tarkoituksenmukaista, pidennetyt restriktiofragmentit saatetaan 20 hybridisointiolosuhteissa kosketuksiin kahden oli- gonukleotidialukkeen kanssa; : : : (f) jolloin mainitut alukkeet sisältävät sekvenssejä, ·*·'; joissa on sama nukleotidisekvenssi kuin mainittujen, täydennettyjen tai, kun on tarkoituksenmukaista, ,i>5 pidennettyjen restriktiofragmenttien 5'- ja 3'-päi- • · den säikeiden terminaalisissa osissa, jotka itse ovat komplementaarisia säikeille, jotka toimivat mainittujen alukkeiden templaatteina, mainittujen alukkeiden vastaavasti sisältäessä nukleotidejä, 30 jotka ovat komplementaarisia nukleotideille, jotka liittyvät mainitun, määrätyn, spesifisen endonukle-. aasin pilkkomiskohdan muodostumiseen templaattisäi- ; keessä; (g) mainitut, pidennetyt restriktiofragmentit, jotka on "."is hybridisoitu mainittujen alukkeiden kanssa, moniste- taan PCR:llä tai sen kaltaisilla tekniikoilla sel-laisten nukleotidien sekä polymeraasin läsnäollessa, 51 113184 joita tarvitaan hybridisoitujen alukkeiden lisäpi-dennykseen niitä lähtö-DNA:n restriktiofragmentteja pitkin, joihin mainitut alukkeet alunperin hybridi-soituivat koko pituudeltaan, ja 5 (h) sanotut, viimeksi mainitut restriktiofragmentit identifioidaan ja otetaan talteen.
Tämän menetelmän erityisessä sovellutusmuodossa mainittujen alukkeiden ainakin yhden pään terminaalinen nukleotidi piden-10 nyksen kysymyksessä olevassa suunnassa, vastaa viimeisintä nukleotideistä, jotka liittyvät mainitun spesifisen endonukleaa-sin restriktiokohtaan, ja menetelmä käsittää mainitun, monistetun lähtö-DNA:n restriktiofragmenttien identifioinnin ja talteenottamisen.
15 Tämän menetelmän toisessa, erityisessä sovellutusmuodossa ainakin osa mainituista alukkeista sisältää valitun sekvenssin, joka käsittää määrätyn lukumäärän (yhden tai useampia nukleotidejä) ja ulottuu nukleotideistä, jotka sisältyvät 20 mainittuun spesifiseen endonukleaasin restriktiokohtaan, vii-meisimmän toiselle puolelle sen itsensä pidentymisen suun-: : : nassa vastaavien restriktiofragmenttien sisällä monistamis- vaiheen aikana.
,:¾5 Yllä kuvatun menetelmän spesifisessä sovellutusmuodossa kak- sisäikeinen DNA-linkkeri sisältää useita kohtia erilaisia, spesifisiä endonukleaaseja varten, jotka kaikki eroavat toinen toisestaan, jotka menetelmät sisältävät yllä määritellyn menetelmän vaiheiden toistoa, joka tapahtuu samalla lähtö-30 DNA:11a yhden kanssa näistä restriktioendonukleaaseista ja vielä muun mainitun, erillisen, spesifisen endonukleaasin kanssa, ja menetelmissä käytetään sellaisia alukkeita, joiden ;nukleotidisekvenssit valitaan yllä esitetyssä kuvauksessa määrätyllä tavalla ja vielä ottamalla huomioon mainittu muu, ",^5 spesifinen endonukleaasi.
t I
» · 52 113184
Yllä kuvattu tai keksinnön oligonukleotidimenetelmä on sopiva polymorfismien identifiointiin määritellyissä DNA:issa, jotka ovat peräisin samasta elävästä lajista, esimerkiksi genomi-sista DNA:ista, jotka ovat mikrobi-, kasvi- tai eläinperäi-5 siä, ihmisperäiset mukaan luettuina, tai niiden fragmenteista, joko niiden itsensä piirissä tai suhteessa vastaavaan, määritettyyn DNA-standardiin, joka käyttö sisältää DNA:iden tutkimisen menetelmällä tai niiden saattamisen oligonukleoti-dikosketukseen olosuhteissa, jotka tekevät mahdolliseksi 10 monistamis- tai pidentämisreaktion, verrattuna restriktioku-viin, jotka saadaan aloittamalla kustakin mainituista DNA:is-ta ja valinnaisesti kustakin mainitusta, standardi DNA:sta, ja asettamalla tämän DNA-polymorfismin olemassaolo, ja missä se on tarkoituksenmukaista, sijainti suhteeseen erojen kans-15 sa, joita havaittiin erilaisten DNA:iden restriktiofragment-tien kokojen välillä.
Keksintö koskee myös fragmentoitua DNA:ta, jonka eri fragmenteilla on sekvenssejä, jotka kaikki vastaavat alkuperäisiä 20 pilkkomistuotteita sellaisesta, fragmentoimattomasta lähtö-DNA: sta, josta ne tuotetaan samalla, määritellyllä, spesifi-: :: sellä endonukleaasilla, jolle DNA:lle on ominaista, että kaikkia mainittuja fragmenttea täydennettiin niiden 5'- ja 3'-päissä vastaavasti 3'- ja 5'-adaptoreilla, jotka vastaavat .:25 saman lähtö-DNA-linkkerin pilkottua osaa, joka DNA aluksi 1 (»Il sisälsi yhden ainoan restriktiokohdan mainitulle spesifiselle endonukleaasille ja valinnaisesti pidennettiin määrätyillä vakiosekvensseillä. Fragmentoitu DNA voi olla vaellusvyöhyk-keiden kuvan muodossa sopivalla kannattimellä, esimerkiksi 30 geelikannattimella, jossa sen fragmentit on saatu vaeltamaan sähkökentän vaikutuksen alla.
: ,·. Fragmentoitu DNA voi sisältää myös pääteosia, joihin sisäl- • ·_ tyy oligonukleotidi, jolle seuraava koostumus on luonteen- ".'35 omainen, kun aloitetaan 5'-päästä: (i) ainakin 10 emäksen muodostama nukleotidisekvenssi ; ; (vakiosekvenssi) , mutta ei 30 nukleotidiä pitem- 53 113184 pi, komplementaarinen määrätylle DNA-sekvenssille, jota käytettiin adaptorina, välittömästi seuraa (ii) nukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen vaiheessa (a) käytetyn restriktioendonukleaasin ta- 5 voitekohdalle, sikäli kuin tuo nukleotidisekvenssi tai sen osa ei sisälly (ii):hin, välittömästi seuraa (iii) ainakin yhden nukleotidin muodostama nukleotidisekvenssi, jossa kuitenkin on vähemmän kuin 10 nukleotidiä ja joka on valittu sekvenssien joukosta, 10 jotka ovat esimerkiksi 1-5 nukleotidin mittaisia.
Tämän lisäksi keksintö liittyy välinepakkaukseen määrättyjen DNA:iden pilkkomiseksi ainakin yhdellä spesifisellä restrik-tioendonukleaasilla fragmenteiksi ja näiden fragmenttien 15 analysoimiseksi, joka välinepakkaus käsittää - spesifisen restriktioendonukleaasin; - kaksisäikeiden DNA-oligonukleotidilinkkeri, joka sisältää oman nukleotidisekvenssinsä sisällä yhden ainoan kohdan mainittua, spesifistä endonukleaasia 20 varten, jotta mainittu linkkeri täten pilkotaan vastaavasti vastaavissa 5'- ja 31-adaptoreissa, jolloin mainitulla kaksisäikeisellä DNA-linkkerilla on ; riittävä koko, jotta saadaan aikaan 5'- ja 3'-osat, . jotka myöhemmin voivat antaa käyttöön templaatteja ;· , 25 tämän välinepakkauksen PCR-alukkeita varten; t » ’ - PCR-alukkeita, jotka vastaavasti sisältävät toi saalta samoja sekvenssejä kuin ne 5'- ja 3'-adapto-•;;; reiden säikeet, jotka ovat komplementaarisia säi- ’ keille, jotka myöhemmin toimivat mainittujen aluk- 30 keiden templaatteina, jolloin mainittuihin alukkei- siin lisäksi sisältyy nukleotideja, jotka ovat kom-: plementaarisia niille, jotka sisältyvät templaat- , tisäikeessä tavoitekohdan muodostamiseen mainittua, ... spesifistä restriktioendonukleaasia varten; < !’ 35 - jos on tarkoituksenmukaista, oligonukleoti- .: : disegmenttejä, joilla on määrätyt (vakio) ,,,· sekvenssit, jotta aikaansaadaan riittä vän pitkiä kohtia hybridisaatiota 113184 54 varten mainittujen alukkeiden kanssa mainittujen 5'-adaptoreiden 5'-päiden tai 3'-adaptoreiden 3'-päiden tai molempien pidentämiseksi, ennen kuin mainittu lin-kkeri pilkotaan mainitulla, spesifisellä restriktioen-5 donukleaasilla, jotta vastaavasti tuotetaan mainittuja 5'- ja 3'-adaptoreita, tai sitten sellaisten kiinnitettyjen fragmenttien, jotka on saatu sen jälkeen kun mainitut 5'- ja 3'-adaptorit on liitetty lähtö-DNA:n fragmenttien äärimmäisiin päihin, pidentämistä varten; 10 - valinnaisesti pakkaus sisältää fragmentoidun DNA-stan- dardin, joka vastaa määrättyä DNA-kohdetta fragmen-tointitutkimukselle, jolla mainitun DNA-standardin fragmentit saatiin, kun sitä pilkottiin mainitulla, spesifisellä endonukleaasilla.
15 Tämän välinepakkauksen tietty sovellutusmuoto on sellainen, että niillä mainituilla oligonukleotidisekvensseillä, jotka ovat mainittujen 5'- ja 3'-adaptoreiden tai täydennettyjen DNA-fragmenttien 5'- ja 3'-päiden jatkamista varten, on 20 identtiset nukleotidisekvenssit.
f i · I t IToisessa sovellutusmuodossa linkkeri, joka on välinepakkauk- ; ·'· sessa, sisältää useita, vastaavia, ainutlaatuisia tavoitekoh- ·; ·; tia spesifisiä, toisistaan eroavia endonukleaaseja varten, ja ,:25 mainittu välipakkaus sisältää lisäksi alukkeita, jotka vas- t t < t ,.* taavat kutakin 3'- ja 5'-adaptoreista, jotka muodostuvat, kun mainittua linkkeriä vastaavasti pilkotaan mainituilla, erilaisilla, spesifisillä endonukleaaseilla, jolloin mainitut alukkeet ovat vastaavasti patenttivaatimuksessa 8 esitetyn 30 määritelmän mukaisia niiden 3'- ja 5'-adaptoreiden suhteen, joita tuotetaan mainitussa linkkerissä, kun sitä pilkotaan kullakin mainituista, spesifisistä endonukleaaseista.
• i
i I
Myös erityisessä sovellutusmuodossa välinepakkaus voi sisälsi 5 tää fragmentoituja DNA-standardeja, jotka edellä määriteltiin vastaavien restriktioendonukleaasien suhteen, jolloin kukin ? » 55 113184 mainituista, fragmentoiduista DNA-standardeista on suhteessa määrättyihin, spesifisiin restriktioentsyymeihin.
Claims (28)
1. Menetelmä vähintään yhden lähtö-DNA:sta saadun restrik-tiofragmentin monistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 menetelmä käsittää: (a) pilkotaan lähtö-DNA vähintään yhdellä restriktio-endonukleaasilla restriktiofragmenttien aikaansaamiseksi, (b) ligoidaan saadut restriktiofragmentit vähintään yhden kaksisäikeisen synteettisen oligonukleotidiadaptorin 10 kanssa, jolla on yksi pää, joka on yhteensopiva, jotta se voidaan ligoida yhteen tai molempiin restriktiofragmenttien päihin niin, että siten tuotetaan täydennettyjä restriktio-fragmentteja, (c) saatetaan mainitut täydennetyt restriktiofragmentit 15 hybridisointiolosuhteissa kosketuksiin ainakin yhden oligo- nukleotidialukkeen kanssa, johon mainittuun alukkeeseen tai alukkeisiin sisältyy nukleotidisekvenssi, joka emäspariutuu osaan restriktioendonukleaasin kohteena olevasta sekvenssistä, joka sijaitsee täydennetyissä restriktiofragmenteissa 20 ja joka emäspariutuu osaan adaptorisekvenssistä ja jolloin vähintään yksi mainituista alukkeista sisältää 3'päässään , valitun sekvenssin, joka käsittää vähintään yhden nukleotidin * mainitun kohdesekvenssin muodostumiseen osallistuvien nukleotidien välittömässä läheisyydessä, 25 (d) monistetaan mainitut, täydennetyt restriktiofrag mentit, jotka on hybridisoitu mainitun alukkeen tai aluk- keiden kanssa tarvittavien nukleotidien ja DNA-polymeraasin läsnäollessa tai pidennetään hybridisoidut alukkeet täydennettyjä restriktiofragmentteja pitkin, ja 30 (e) identifioidaan ja otetaan talteen amplifioidut tai ! S > ··' pidennetyt DNA-fragmentit, jotka on tuotettu kohdassa (d) . « * * I » I
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet - t u siitä, että kohdassa (c) , aluke tai alukkeet sisältävät 35 sekvenssejä, joilla on sama nukleotidisekvenssi kuin mainittujen täydennettyjen restriktiofragmenttien päissä olevien 113184 juosteiden terminaalisissa osissa, sisältäen nukleotidit, jotka osallistuvat restriktioendonukleaasin kohdesekvenssin muodostumiseen ja jotka sisältävät vähintään osan ligoiduissa adaptoreissa olevista nukleotideista, jolloin vähintään yksi 5 mainituista alukkeista sisältää 3'päässään valitun sekvenssin, joka käsittää vähintään yhden nukleotidin, joka sijaitsee restriktioendonukleaasin kohdesekvenssin muodostumiseen osallistuvien nukleotidien välittömässä läheisyydessä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kohdassa (c) aluke tai alukkeet emäspariutuvat täydellisesti muuttumattomana pysyvän DNA-sekvenssin kanssa, joka koostuu restriktioendonukleaasin kohdesekvenssin osasta ja adaptorin sekvenssistä. 15
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi aluke käsittää 1-10 nukleotidin pituisen valitun sekvenssin.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alukkeet käsittävät 10 - 50 nukleotidia ja että restriktioendonukleaasin kohdesekvenssi ' * · ...* käsittää 4-8 nukleotidia. • * * * » V 25
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, ***· tunnettu siitä, että niiden alukkeiden nukleotidi* disekvenssit, jotka emäspariutuvat adaptorin kanssa käsit- : tävät 10-30 nukleotidia.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, d tunnettu siitä, että adaptorit suunnitellaan siten, \ : että endonukleaasin vastaava kohdesekvenssi ei säily, kun adaptori hybridisoituu täydennettyjen restriktiofragmenttien • t kanssa ja että aluke tai alukkeet ovat oligonukleotideja, ' 35 jotka käsittävät muuttumattomana pysyvän sekvenssin, joka emäspariutuu täydellisesti vähintään yhden seoksessa olevan 113184 täydennetyn restriktiofragmentin sekvenssin vähintään yhden pään kanssa, joka muuttumattomana pysyvä sekvenssi käsittää nukleotideja, jotka emäspariutuvat mainitun restriktioendonukleaasin kohdesekvenssin osan kanssa ja 5 vähintään yksi mainituista alukkeista sisältää 1-10 valittua lisänukleotidia lähellä niiden nukleotidien 3'päätä, jotka osallistuvat mainitun kohdesekvenssin muodostumiseen.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että lähtö-DNA:n nukleotidisekvenssi on ainakin osittain tuntematon.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään kahta 15 erilaista restriktioendonukleaasia.
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaikissa alukkeissa on sama muuttumattomana pysyvä nukleotidisekvenssi. 20
11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään eri-laisten alukkeiden seosta.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi aluke sisältää ;* 1,2 tai 3 valittua nukleotidia 3'päässään.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kohdassa (a) käytetään kahta erilaista restriktioendonukleaasia ja että vähintään yksi : kaksijuosteinen synteettinen oligonukleotidiadaptori yhdelle • endonukleaasille on biotinyloitu.
14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, 113184 tunnettu siitä, että vähintään yksi aluke on leimattu.
15. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 14 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valittujen nukleotidien määrä on valittu siten, että monistettavien restriktiofragmenttien määrä on rajattu 5 - 200:aan.
16. Menetelmä monistetun restriktiofragmenttijoukon 10 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) monistetaan restriktiofragmenttien alajoukko tuotettujen restriktiofragmenttien seoksesta, joka on saatu lähtö-DNA:sta jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaisella menetel- 15 mällä, (b) erotetaan monistetut täydennetyt fragmentit, (c) identifioidaan monistetut restriktiofragmentit.
17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että monistettava lähtö-DNA on genomista DNA:ta ihmisen tai eläimen biologisesta näytteestä, erityisesti kudos- tai verinäytteestä.
18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, ·’ 25 tunnettu siitä, että monistettava lähtö-DNA on * * * ' genomista DNA:ta kasvista tai kasvikudoksesta. » · - *
19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monistettava lähtö-DNA on mik- ; 30 ro-organismin DNA:ta.
* > · ;*·,· 20. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä • · • :>.j polymorfismien tunnistamiseen erilaisten lähtö-DNA:iden ’. välillä, jotka ovat peräisin samoista elävistä lajeista, <»•11 , 35 jotka käsittävät erilaisista lähtö-DNA:ista monistettujen * » 113184 restriktiofragmenttien välillä havaittujen erojen identifioimisen.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä 5 sellaisten polymorfismien tunnistamiseen, joita on mikro- organismien, kasvien tai eläinten, mukaan lukien ihmisen genomisessa DNArssa, tai niiden fragmenteissa, joko niiden joukossa tai vastaaviin määritettyihin DNA-standardeihin liittyen. 10
22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä sellaisten polymorfismien tunnistamiseen, jotka liittyvät geneettisesti periytyviin ominaisuuksiin ihmisillä, eläimillä, tai kasveilla, ja DNA-markkereiden tunnistamiseen, 15 jotka perustuvat tällaisiin DNA-polymorfismeihin.
23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, joka edelleen käsittää sen, että verrataan kahta tai useampaa monistettua tai pidennettyä DNA-fragmenttia, jotka on 20 identifioitu tai otettu talteen menetelmän vaiheessa (e), samankaltaisuuksien tunnistamiseen kasvi- ja eläinlajikkeiden välillä, lajien, viljeltyjen lajikkeiden, mikro- * *' organismien välillä tai geneettisten etäisyyksien arviointiin ‘sekä kasvi- tai eläinlajikkeiden, lajien, viljeltyjen ·’ 25 lajikkeiden tai mikro-organismien karakterisointiin.
24. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, * tunnettu siitä, että vaiheessa (e) tuotetut monis tetut tai pidennetyt DNA-fragmentit identifioidaan tai ote- : V 30 taan talteen DNA-sormenjälkinä. • » ♦
25. Menetelmä perinnöllisiin ominaisuuksiin liittyvien DNA- ....j markkereiden tunnistamiseen, tunnettu siitä, että ' . menetelmä käsittää polymorfismien tunnistamisen patentti- • * i > , 35 vaatimuksen 23 mukaisesti samasta elävästä lajista peräisin olevan lähtö-DNA:n, joka laji osoittaa eroja mainitussa 113184 perinnöllisessä ominaisuudessa ja vertaamalla mainittua polymorfismia mainitun perinnöllisen ominaisuuden ilmaisemaan fenotyyppiin.
26. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, joka edelleen käsittää vaiheet: (f) eristetään vähintään yksi DNA-fragmentti, joka on identifioitu tai otettu talteen vaiheessa (e), (g) määritetään niiden ensimmäisten 8-10 10 nukleotiditähteen nukleotidisekvenssi, jotka sijaitsevat sisäisesti lähellä restriktioendonukleaasin kohdesekvenssiä mainitun DNA-fragmentin molemmissa päissä, (h) suunnitellaan oligonukleotidialukkeet, joilla on patenttivaatimuksen 1 kohdan (c) alukkeiden mukainen nuk- 15 leotidisekvenssi, jolloin valittu nukleotidisekvenssi käsittää 5-10 nukleotiditähdettä, jotka vastaavat esimmäisiä 8-12 nukleotiditähdettä, jotka sijaitsevat sisäisesti lähellä restriktioendonukleaasin kohdesekvenssiä mainitun DNA-fragmentin molemmissa päissä. 20
27. Monistettujen restriktiofragmenttien joukko, tunnettu siitä, että se on saatavissa menetelmällä, joka käsittää: (a) pilkotaan lähtö-DNA vähintään yhdellä restriktio- 25 endonukleaasilla lähtö-DNA:n fragmentoimiseksi restriktio-fragmenteiksi; t ; (b) ligoidaan saadut restriktiofragmentit vähintään yhden kaksijuosteisen synteettisen oligonukleotidiadaptorin kanssa, jolla on yksi pää, joka on yhteensopiva ligoitavaksi ’ 30 yhden tai molempien restriktiofragmentin päiden kanssa täydennettyjen restriktiofragmenttien tuottamiseksi; '.: (c) saatetaan täydennetyt restriktiofragmentit * kontaktiin vähintään yhden oligonukleotidialukkeen kanssa hybridisoivissa olosuhteissa; 35 jolloin mainittu aluke tai alukkeet sisältävät nukelotidisek-venssin, joka emäspariutuu osaan restriktioendonukleaasin 113184 kohdesekvenssistä, joka sijaitsee täydennetyissä restriktio-fragmenteissa ja emäspariutuu osaan adaptorisekvenssistä ja jolloin vähintään yksi mainituista alukkeista sisältää 3'päässään valikoidun sekvenssin, joka käsittää vähintään 5 yhden nukleotidin joka sijaitsee niiden nukleotidien välittömässä läheisyydessä, jotka osallistuvat kohdesekvens-sin muodostamiseen; (d) monistetaan mainitut täydennetyt restriktiofragmen-tit, jotka hybridisoituvat mainitun alukkeen tai alukkeiden 10 kanssa tarvittavien nukleotidien ja DNA -polymeraasin läsnäollessa tai pidennetään hybridisoituja alkukkeita täydennettyjä restriktiofragmentteja pitkin, ja (e) identifioidaan ja otetaan talteen monistetut tai pidennetyt vaiheessa (d) tuotetut DNA-fragmentit. 15
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen monistettujen restriktio-fragmenttien joukko, tunnettu siitä, että se sijaitsee geelillä, membraanilla tai filmillä. » ‘ f * » * < * 1. t t I * * ► » » * t t t 113184
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91402542 | 1991-09-24 | ||
| EP91402542 | 1991-09-24 | ||
| EP9202216 | 1992-09-24 | ||
| PCT/EP1992/002216 WO1993006239A1 (en) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Selective restriction fragment amplification: a general method for dna fingerprinting |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI941360A0 FI941360A0 (fi) | 1994-03-24 |
| FI941360A FI941360A (fi) | 1994-05-24 |
| FI113184B true FI113184B (fi) | 2004-03-15 |
Family
ID=8208616
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI941360A FI113184B (fi) | 1991-09-24 | 1994-03-24 | Restriktiofragmentin selektiivinen monistaminen, yleinen menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseksi |
| FI20031526A FI115402B (fi) | 1991-09-24 | 2003-10-17 | Välinepakkaukset käytettäviksi restriktiofragmenttien selektiivisessä monistamisessa |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20031526A FI115402B (fi) | 1991-09-24 | 2003-10-17 | Välinepakkaukset käytettäviksi restriktiofragmenttien selektiivisessä monistamisessa |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6045994A (fi) |
| EP (2) | EP0534858B2 (fi) |
| JP (3) | JP3236295B2 (fi) |
| KR (1) | KR100321510B1 (fi) |
| AT (2) | ATE382094T1 (fi) |
| AU (1) | AU672760B2 (fi) |
| CA (1) | CA2119557C (fi) |
| CZ (2) | CZ291877B6 (fi) |
| DE (2) | DE69233719T2 (fi) |
| DK (2) | DK0534858T4 (fi) |
| ES (2) | ES2147550T5 (fi) |
| FI (2) | FI113184B (fi) |
| GR (1) | GR3033895T3 (fi) |
| HU (1) | HU223760B1 (fi) |
| IL (1) | IL103267A (fi) |
| NO (1) | NO318016B1 (fi) |
| PT (2) | PT534858E (fi) |
| RU (1) | RU2182176C2 (fi) |
| WO (1) | WO1993006239A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA927323B (fi) |
Families Citing this family (282)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6074818A (en) * | 1990-08-24 | 2000-06-13 | The University Of Tennessee Research Corporation | Fingerprinting of nucleic acids, products and methods |
| US20100267023A1 (en) * | 1992-09-24 | 2010-10-21 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| US7026115B1 (en) * | 1991-09-24 | 2006-04-11 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| ZA929319B (en) * | 1991-12-11 | 1993-05-24 | Igen Inc | Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer. |
| DE69333650T2 (de) * | 1992-02-19 | 2006-01-12 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren |
| GB9301776D0 (en) * | 1993-01-29 | 1993-03-17 | Univ Alberta | Method for detecting genomic variation |
| US5470723A (en) * | 1993-05-05 | 1995-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5650274A (en) * | 1993-06-25 | 1997-07-22 | Hitachi, Ltd. | DNA analyzing method |
| GB2283568B (en) * | 1993-10-13 | 1997-12-24 | Mini Agriculture & Fisheries | Identification of fruit juice components |
| RU2111254C1 (ru) * | 1994-07-11 | 1998-05-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ МАТРИЧНЫХ РНК И КЛОНИРОВАНИЯ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ФРАГМЕНТОВ кДНК |
| US5710000A (en) | 1994-09-16 | 1998-01-20 | Affymetrix, Inc. | Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping |
| GB2295011A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-15 | Unilever Plc | Selection of DNA markers using adaptor molecules |
| GB2295228A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-22 | Unilever Plc | Selective amplification of DNA having a plurality of sites for a specific endonuclease |
| DE69507646T2 (de) * | 1994-11-28 | 1999-09-16 | Du Pont | Mikrosatelliteverbindung für detektion genetisches polymorphismen |
| EP0718409A3 (en) * | 1994-12-22 | 1999-02-03 | Hitachi, Ltd. | DNA preparation method |
| EP0721987A1 (en) * | 1995-01-16 | 1996-07-17 | Keygene N.V. | Amplification of simple sequence repeats |
| US6031153A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-29 | Novartis Ag | Method for protecting plants |
| US5565340A (en) * | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
| US5707807A (en) * | 1995-03-28 | 1998-01-13 | Research Development Corporation Of Japan | Molecular indexing for expressed gene analysis |
| US6395887B1 (en) | 1995-08-01 | 2002-05-28 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS |
| US5712126A (en) * | 1995-08-01 | 1998-01-27 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA |
| EP0843727A2 (en) * | 1995-08-07 | 1998-05-27 | Keygene N.V. | Resistance against wilt inducing fungi |
| US5871697A (en) | 1995-10-24 | 1999-02-16 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US5972693A (en) * | 1995-10-24 | 1999-10-26 | Curagen Corporation | Apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6418382B2 (en) | 1995-10-24 | 2002-07-09 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6218119B1 (en) | 1996-01-16 | 2001-04-17 | Keygene, N. V. | Amplification of simple sequence repeats |
| AU2264197A (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-28 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Restriction display (rd-pcr) of differentially expressed mrnas |
| US6091004A (en) * | 1996-06-21 | 2000-07-18 | Novartis Finance Corporation | Gene encoding a protein involved in the signal transduction cascade leading to systemic acquired resistance in plants |
| EP0823481A1 (en) | 1996-08-09 | 1998-02-11 | Keygene N.V. | Resistance against nematodes |
| NZ334077A (en) | 1996-08-09 | 2000-09-29 | Keygene Nv | Genes having resistance against nematodes and/or aphids |
| WO1998006736A1 (en) | 1996-08-14 | 1998-02-19 | Life Technologies, Inc. | Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing |
| WO1998008981A1 (en) | 1996-08-30 | 1998-03-05 | Life Technologies, Inc. | METHODS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA |
| US20040142327A1 (en) * | 1996-11-22 | 2004-07-22 | Jhy-Jhu Lin | Methods for identifying and isolating DNA polymorphisms or genetic markers |
| US5986082A (en) * | 1996-12-13 | 1999-11-16 | Novartis Ag | Altered forms of the NIM1 gene conferring disease resistance in plants |
| US5861295A (en) | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
| AU6024598A (en) * | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hybridization-based genetic amplification and analysis |
| US6306588B1 (en) | 1997-02-07 | 2001-10-23 | Invitrogen Corporation | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof |
| ES2563643T3 (es) | 1997-04-01 | 2016-03-15 | Illumina Cambridge Limited | Método de secuenciación de ácido nucleico |
| US6090556A (en) * | 1997-04-07 | 2000-07-18 | Japan Science & Technology Corporation | Method for quantitatively determining the expression of a gene |
| EP1005481B1 (en) | 1997-04-22 | 2009-10-14 | Life Technologies Corporation | Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits |
| JP2001512700A (ja) | 1997-08-07 | 2001-08-28 | キュラジェン コーポレイション | 公知の末端配列に厳密にハイブリダイズするサブ配列および未同定の配列にハイブリダイズするサブ配列を含むオリゴヌクレオチドの使用による核酸配列の検出および確認 |
| US6673577B1 (en) * | 1997-08-07 | 2004-01-06 | Curagen Corporation | Detection and confirmation of nucleic acid sequences by use of poisoning oligonucleotides |
| US6833242B2 (en) * | 1997-09-23 | 2004-12-21 | California Institute Of Technology | Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size |
| CA2307674C (en) * | 1997-10-30 | 2013-02-05 | Cold Spring Harbor Laboratory | Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing dna |
| EP1051523A2 (en) * | 1998-02-02 | 2000-11-15 | Amersham Pharmacia Biotech AB | Nucleic acid analysis method |
| US6500616B1 (en) | 1998-04-16 | 2002-12-31 | Case Western Reserve University | Methods of monitoring genomic integrity and detecting genomic destabilization of plant cells in tissue culture |
| US6324479B1 (en) | 1998-05-08 | 2001-11-27 | Rosetta Impharmatics, Inc. | Methods of determining protein activity levels using gene expression profiles |
| US6218122B1 (en) | 1998-06-19 | 2001-04-17 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles |
| DE69813203T2 (de) * | 1998-07-21 | 2004-02-12 | Keygene N.V. | Verbesserte Primer zur AFLP Amplifizierung |
| ATE244771T1 (de) | 1998-07-29 | 2003-07-15 | Keygene Nv | Verfahren zur erkennung von nukleinsäuremethylierungen durch aflp |
| US6306593B1 (en) * | 1998-09-17 | 2001-10-23 | Union Camp Corporation | Selective AFLP primers for reduction of complexity of maker genotyping and DNA markers for loblolly pine identified using the AFLP primers |
| US6146830A (en) | 1998-09-23 | 2000-11-14 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Method for determining the presence of a number of primary targets of a drug |
| US6703228B1 (en) | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| JP3855492B2 (ja) * | 1998-10-08 | 2006-12-13 | 株式会社日立製作所 | 混合核酸断片分析法 |
| WO2000021358A1 (en) | 1998-10-14 | 2000-04-20 | Agriculture And Agri-Food Canada | Hybrid alfalfa (medicago sativa) |
| JP2002528096A (ja) * | 1998-10-27 | 2002-09-03 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | ゲノムｄｎａの複雑性制御および分析 |
| US6203987B1 (en) | 1998-10-27 | 2001-03-20 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| US6950752B1 (en) | 1998-10-27 | 2005-09-27 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for removing artifact from biological profiles |
| US6468476B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-10-22 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using-co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| ATE274069T1 (de) * | 1998-11-09 | 2004-09-15 | Methexis Genomics N V | ANALYSE VON ßAMPLIKONSß ERHALTEN DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN |
| US6801859B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-10-05 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods of characterizing drug activities using consensus profiles |
| US6222093B1 (en) | 1998-12-28 | 2001-04-24 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles |
| US6370478B1 (en) | 1998-12-28 | 2002-04-09 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for drug interaction prediction using biological response profiles |
| US6605432B1 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-12 | Curators Of The University Of Missouri | High-throughput methods for detecting DNA methylation |
| US6630333B1 (en) | 1999-03-23 | 2003-10-07 | Invitrogen Corporation | Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof |
| WO2000061801A2 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Keygene N.V. | METHOD FOR THE DETECTION AND/OR ANALYSIS, BY MEANS OF PRIMER EXTENSION TECHNIQUES, OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN RESTRICTION FRAGMENTS, IN PARTICULAR IN AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS GENERATED USING AFLP$m(3) |
| US6994969B1 (en) | 1999-04-30 | 2006-02-07 | Methexis Genomics, N.V. | Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry |
| US20020119448A1 (en) * | 1999-06-23 | 2002-08-29 | Joseph A. Sorge | Methods of enriching for and identifying polymorphisms |
| JP3969091B2 (ja) | 1999-06-23 | 2007-08-29 | 株式会社日立製作所 | 遠心分離機及びこれを用いる試料調製装置 |
| US6420117B1 (en) | 1999-09-14 | 2002-07-16 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Miniature inverted repeat transposable elements and methods of use |
| US6221600B1 (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis |
| US6958225B2 (en) | 1999-10-27 | 2005-10-25 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| AUPQ439699A0 (en) * | 1999-12-01 | 1999-12-23 | University Of Sydney, The | Detection of nucleic acid fragments |
| ATE317024T1 (de) * | 1999-12-29 | 2006-02-15 | Keygene Nv | Verfahren zur erzeugung von oligonukleotiden, im besonderen zur detektion amplifizierter restriktionsfragmente, die durch aflp erhalten wurden |
| AU2001254670A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-09-12 | Akzo Nobel N.V. | Detection of hepatitis b virus rna |
| NZ521626A (en) | 2000-03-29 | 2005-09-30 | Cambia | Methods for genotyping by hybridization analysis |
| EP1282729A2 (en) * | 2000-05-15 | 2003-02-12 | Keygene N.V. | Microsatellite-aflp |
| US7078208B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-07-18 | Invitrogen Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| JP2004511211A (ja) | 2000-05-26 | 2004-04-15 | インヴィトロジェン コーポレーション | 耐熱性逆転写酵素およびその使用 |
| US20040209276A1 (en) | 2002-09-13 | 2004-10-21 | Smith Michael D. | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| AU2001271720A1 (en) | 2000-07-05 | 2002-01-14 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods and compositions for determining gene function |
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| US20030143554A1 (en) * | 2001-03-31 | 2003-07-31 | Berres Mark E. | Method of genotyping by determination of allele copy number |
| AU2002307152A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-21 | California Institute Of Technology | Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices |
| CA2443999A1 (en) * | 2001-04-16 | 2002-10-24 | Applera Corporation | Methods and compositions for nucleotide analysis |
| WO2002086169A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-10-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and methylation |
| US20030044785A1 (en) * | 2001-05-01 | 2003-03-06 | American Type Culture Collection | Method for identifying and genotyping microorganisms |
| CA2449782C (en) | 2001-06-07 | 2011-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Qtl controlling sclerotinia stem rot resistance in soybean |
| GB0114853D0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Happier Mapping |
| US7229810B2 (en) | 2001-06-28 | 2007-06-12 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of proteinases |
| WO2003010516A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-02-06 | Curagen Corporation | Method for identifying a nucleic acid sequence |
| US6872529B2 (en) * | 2001-07-25 | 2005-03-29 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| US20110151438A9 (en) | 2001-11-19 | 2011-06-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of Analysis of Methylation |
| CA2467460A1 (en) * | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Parallele Bioscience, Inc. | Multiplex oligonucleotide addition and target amplification |
| ES2364037T3 (es) * | 2001-12-10 | 2011-08-23 | Novartis Ag | Métodos de tratamiento de psicosis y esquizofrenia basados en polimorfismos del gen del cntf. |
| US7418351B2 (en) | 2002-01-31 | 2008-08-26 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for analysis of measurement errors in measured signals |
| CA2474982A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for identifying genes and determining pathways associated with traits |
| WO2003074734A2 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-12 | Solexa Ltd. | Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype |
| US20040110166A1 (en) * | 2002-03-07 | 2004-06-10 | Macevicz Stephen C. | Genome-wide scanning of genetic polymorphisms |
| CA2480728A1 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| US7563567B1 (en) | 2002-04-12 | 2009-07-21 | The Curators of the Univeristy of Missouri of Columbia | Use of ECIST microarrays in an integrated method for assessing DNA methylation, gene expression and histone acetylation |
| US7115370B2 (en) * | 2002-06-05 | 2006-10-03 | Capital Genomix, Inc. | Combinatorial oligonucleotide PCR |
| US20040072217A1 (en) * | 2002-06-17 | 2004-04-15 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of linkage disequilibrium |
| US9388459B2 (en) | 2002-06-17 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| ATE546547T1 (de) | 2002-08-22 | 2012-03-15 | Novartis Pharma Gmbh | Diagnose der chronischen abstossung |
| EP2298448A3 (en) | 2002-09-25 | 2012-05-30 | California Institute of Technology | Microfluidic large scale integration |
| US8871446B2 (en) | 2002-10-02 | 2014-10-28 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US7459273B2 (en) * | 2002-10-04 | 2008-12-02 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US20040219565A1 (en) | 2002-10-21 | 2004-11-04 | Sakari Kauppinen | Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest |
| JP4690307B2 (ja) * | 2003-01-10 | 2011-06-01 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | 物理的および遺伝的地図を統合するためのａｆｌｐに基づいた方法 |
| US7996155B2 (en) | 2003-01-22 | 2011-08-09 | Microsoft Corporation | ANOVA method for data analysis |
| EP2159285B1 (en) * | 2003-01-29 | 2012-09-26 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
| JP4691014B2 (ja) * | 2003-02-26 | 2011-06-01 | カリダ ゲノミクス，インコーポレーテッド | ハイブリダイゼーションによるランダムアレイｄｎａ分析 |
| JP4773338B2 (ja) * | 2003-03-07 | 2011-09-14 | ルビコン ゲノミクス， インコーポレイテッド | Ｄｎａ重合プロセスにより生成される全ゲノムおよび全トランスクリプトームライブラリーの増幅および分析 |
| US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US8609830B2 (en) | 2003-05-16 | 2013-12-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods and compositions for RNA interference |
| US8694263B2 (en) | 2003-05-23 | 2014-04-08 | Cold Spring Harbor Laboratory | Method of identifying virtual representations of nucleotide sequences |
| EP1636337A4 (en) * | 2003-06-20 | 2007-07-04 | Illumina Inc | METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR THE AMPLIFICATION AND GENOTYPING OF THE GENOME |
| US20050181394A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20040259100A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| WO2005003393A2 (en) * | 2003-07-02 | 2005-01-13 | Keygene N.V. | Splice site aflp |
| US20050032102A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-10 | Affymetrix, Inc. | Mapping genomic rearrangements |
| US8114978B2 (en) | 2003-08-05 | 2012-02-14 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US7269517B2 (en) | 2003-09-05 | 2007-09-11 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for analyzing experiment design |
| WO2005024068A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| JP2007507770A (ja) | 2003-09-29 | 2007-03-29 | パスワーク インフォーマティクス，インコーポレーテッド | 生物学的特徴を検出するためのシステムおよび方法 |
| EP2380993B1 (en) | 2004-03-08 | 2015-12-23 | Rubicon Genomics, Inc. | Method for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
| EP1574585A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-09-14 | Plant Research International B.V. | Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting |
| WO2005098050A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Sequenom, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US8192937B2 (en) * | 2004-04-07 | 2012-06-05 | Exiqon A/S | Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs |
| US8135595B2 (en) | 2004-05-14 | 2012-03-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Computer systems and methods for providing health care |
| WO2005118877A2 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Vicus Bioscience, Llc | Producing, cataloging and classifying sequence tags |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| FR2876378B1 (fr) * | 2004-10-08 | 2007-01-05 | Univ Joseph Fourier Etablissem | Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes |
| US7335760B2 (en) | 2004-12-22 | 2008-02-26 | Ceres, Inc. | Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins |
| US9505846B2 (en) | 2005-01-28 | 2016-11-29 | Life Technologies Corporation | Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases |
| WO2006094774A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Reverse progeny mapping |
| CA2599796C (en) | 2005-03-03 | 2016-07-12 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Near reverse breeding |
| US20060223066A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Applera Corporation | Methods for normalizing and for identifying small nucleic acids |
| US7452671B2 (en) | 2005-04-29 | 2008-11-18 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping with selective adaptor ligation |
| WO2006122215A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | State Of Oregon Acting By & Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays |
| US20090264299A1 (en) * | 2006-02-24 | 2009-10-22 | Complete Genomics, Inc. | High throughput genome sequencing on DNA arrays |
| EP3492602A1 (en) * | 2005-06-15 | 2019-06-05 | Complete Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| CA2613248A1 (en) * | 2005-06-23 | 2006-12-28 | Keygene N.V. | Improved strategies for sequencing complex genomes using high throughput sequencing technologies |
| ATE557105T1 (de) | 2005-06-23 | 2012-05-15 | Keygene Nv | Strategien für eine hohe durchsatzidentifikation und erkennung von polymorphismen |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| EP1924705A1 (en) * | 2005-08-02 | 2008-05-28 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
| US20070031857A1 (en) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Rubicon Genomics, Inc. | Compositions and methods for processing and amplification of DNA, including using multiple enzymes in a single reaction |
| US7622121B2 (en) | 2005-09-21 | 2009-11-24 | New York University | Heat shock proteins from Mycobacterium leprae and uses thereof |
| DK1929039T4 (en) | 2005-09-29 | 2014-02-17 | Keygene Nv | High throughput-screening af mutageniserede populationer |
| US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
| EP1951900B1 (en) | 2005-10-07 | 2016-06-15 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| US7960104B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-06-14 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| GB0522310D0 (en) * | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| KR20080073748A (ko) | 2005-11-16 | 2008-08-11 | 노파르티스 아게 | 척수 손상에서의 항-ｎｏｇｏ-ａ 항체 치료를 위한바이오마커 |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| US8137936B2 (en) * | 2005-11-29 | 2012-03-20 | Macevicz Stephen C | Selected amplification of polynucleotides |
| US11306351B2 (en) | 2005-12-21 | 2022-04-19 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| ES2882401T3 (es) | 2005-12-22 | 2021-12-01 | Keygene Nv | Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento |
| US8222482B2 (en) | 2006-01-26 | 2012-07-17 | Ceres, Inc. | Modulating plant oil levels |
| CN101415839B (zh) | 2006-02-08 | 2012-06-27 | 亿明达剑桥有限公司 | 对多核苷酸模板进行测序的方法 |
| CA2643700A1 (en) | 2006-02-24 | 2007-11-22 | Callida Genomics, Inc. | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| ES2301342B1 (es) * | 2006-03-14 | 2009-05-01 | Oryzon Genomics, S.A. | "metodo de analisis de acidos nucleicos". |
| WO2007107710A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Solexa Limited | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| US20090253581A1 (en) * | 2006-04-04 | 2009-10-08 | Keygene N.V. | High Throughput Detection of Molecular Markers Based on AFLP and High Throughput Sequencing |
| US20130191941A1 (en) | 2006-07-05 | 2013-07-25 | Shing Kwok | Modulating light response pathways in plants, increasing light-related tolerances in plants, and increasing biomass in plants |
| DK2038425T3 (da) | 2006-07-12 | 2010-12-06 | Keygene Nv | Fysisk kortlægning med høj kapacitet ved anvendelse af AFLP |
| EP2049682A2 (en) * | 2006-07-31 | 2009-04-22 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| CA2665016A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Carrots having increased lycopene content |
| US7910302B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20080221832A1 (en) * | 2006-11-09 | 2008-09-11 | Complete Genomics, Inc. | Methods for computing positional base probabilities using experminentals base value distributions |
| US20090111706A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
| EP2121983A2 (en) | 2007-02-02 | 2009-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008111453A1 (ja) * | 2007-03-07 | 2008-09-18 | The University Of Tokyo | Dna断片の増幅方法 |
| US20080293589A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-11-27 | Affymetrix, Inc. | Multiplex locus specific amplification |
| AR066922A1 (es) | 2007-06-08 | 2009-09-23 | Monsanto Technology Llc | Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido |
| ES2545083T3 (es) | 2007-07-09 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Nv | Planta de Brassica que comprende alelos mutantes de acil graso-ACP tioesterasa |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| WO2009052214A2 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-23 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| US7897344B2 (en) * | 2007-11-06 | 2011-03-01 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs |
| US8298768B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-10-30 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| US8415099B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-04-09 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US8518640B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-08-27 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing and process |
| US20090263872A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-10-22 | Complete Genomics Inc. | Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions |
| CA2707535A1 (en) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Ceres, Inc. | Materials and methods for use in biomass processing |
| WO2009061840A1 (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation |
| NL2000992C2 (nl) | 2007-11-09 | 2009-05-12 | Nunhems Bv | Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze. |
| WO2009068313A2 (en) | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Bayer Bioscience N.V. | Brassica plant comprising a mutant indehiscent allele |
| US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
| WO2009097368A2 (en) | 2008-01-28 | 2009-08-06 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| ES2535011T3 (es) | 2008-02-15 | 2015-05-04 | Ceres Inc. | Tolerancia a la sequía y al calor en plantas |
| US9074244B2 (en) | 2008-03-11 | 2015-07-07 | Affymetrix, Inc. | Array-based translocation and rearrangement assays |
| US20090270273A1 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Complete Genomics, Inc. | Array structures for nucleic acid detection |
| MX349774B (es) | 2008-05-26 | 2017-08-10 | Bayer Cropscience Nv | Metodos y medios para modificar la resistencia de las fibras en plantas que producen fibras. |
| EA036845B1 (ru) | 2008-07-17 | 2020-12-28 | Басф Агрикалчерал Солюшнс Сид Юс Ллк | Способ идентификации частично нокаутированного мутантного аллеля ind гена в биологическом образце и набор для осуществления этого способа |
| EP2172565A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-07 | Cyano Biotech GmbH | Method of identifying and/or differentiating cyanophyta |
| EP2367937B1 (en) * | 2008-12-04 | 2013-04-17 | Keygene N.V. | Method for the reduction of repetitive sequences in adapter-ligated restriction fragments |
| EP2379751B1 (en) | 2009-01-13 | 2013-03-20 | Keygene N.V. | Novel genome sequencing strategies |
| EP2406402B1 (en) | 2009-03-13 | 2018-05-16 | Cornell University | Method to assess human allograft status from microrna expression levels |
| US8362332B2 (en) | 2009-04-15 | 2013-01-29 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV165560 |
| US8071865B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV589782 |
| US8071864B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV897903 |
| EP2248914A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| JP2013505002A (ja) | 2009-07-07 | 2013-02-14 | エンザ・ザーデン・ベヘール・ベスローテン・フェンノートシャップ | キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．） |
| EP2659771B1 (en) | 2009-07-20 | 2018-10-03 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased biomass |
| US20110059453A1 (en) * | 2009-08-23 | 2011-03-10 | Affymetrix, Inc. | Poly(A) Tail Length Measurement by PCR |
| EP2470669B1 (en) | 2009-08-25 | 2014-06-18 | Illumina, Inc. | Methods for selecting and amplifying polynucleotides |
| WO2011071382A1 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Keygene N.V. | Polymorfphic whole genome profiling |
| EP2333104A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | Lexogen GmbH | RNA analytics method |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| AU2010330936B2 (en) | 2009-12-17 | 2014-05-22 | Keygene N.V. | Restriction enzyme based whole genome sequencing |
| EP2354243A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-10 | Lexogen GmbH | Complexity reduction method |
| US9746479B2 (en) | 2010-03-09 | 2017-08-29 | Cornell University | Methods and compositions to predict and detect acute rejection |
| NL2004412C2 (en) | 2010-03-16 | 2011-09-20 | Nickerson Zwaan B V | Male sterile leek plants. |
| AU2011242727B2 (en) | 2010-04-20 | 2015-09-10 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | White-stem trait containing plants |
| US9441233B2 (en) | 2010-05-06 | 2016-09-13 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased biomass |
| EP3425062B1 (en) | 2010-06-09 | 2023-08-02 | Keygene N.V. | Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening |
| WO2012058223A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having altered biomass composition |
| US8766054B2 (en) | 2010-12-08 | 2014-07-01 | Hm.Clause | Phytophthora resistance in sweet peppers |
| WO2012084742A1 (en) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Bayer Cropscience Nv | Brassica plant comprising a mutant alcatraz allele |
| EP2663655B1 (en) | 2011-01-14 | 2015-09-02 | Keygene N.V. | Paired end random sequence based genotyping |
| TWI465572B (zh) * | 2011-05-19 | 2014-12-21 | Univ Chang Gung | Method, composition and system of amplification and detection of target microbial DNA |
| JP6028025B2 (ja) | 2011-07-08 | 2016-11-16 | キージーン・エン・フェー | オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイに基づく配列ベースの遺伝子型決定 |
| WO2013036929A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior | Methods for obtaining a sequence |
| US9938536B2 (en) | 2011-11-02 | 2018-04-10 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased tolerance to aluminum |
| WO2013086499A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having altered biomass composition |
| US20130184165A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
| PT3363901T (pt) * | 2012-02-17 | 2021-01-22 | Hutchinson Fred Cancer Res | Composições e métodos para identificar mutações com precisão |
| ES2776673T3 (es) | 2012-02-27 | 2020-07-31 | Univ North Carolina Chapel Hill | Métodos y usos para etiquetas moleculares |
| US10119147B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-11-06 | Washington State University | Brassica plants with modified seed oil composition |
| AU2013285456B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-08-02 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof |
| US9968041B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-05-15 | Bayer Cropscience Nv | Soybean ROD1 gene sequences and uses thereof |
| EP2728013A1 (en) * | 2012-10-31 | 2014-05-07 | Universitätsspital Basel | Method for the simultaneous amplification of a plurality of different nucleic acid target sequences |
| US9758828B2 (en) | 2013-01-31 | 2017-09-12 | Cornell University | Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts |
| ES2694131T3 (es) | 2013-04-19 | 2018-12-18 | Bayer Cropscience Nv | Plantas de Brassica híbridas y métodos para producir las mismas |
| RU2549453C2 (ru) * | 2013-04-26 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВЕРЕСКА ОБЫКНОВЕННОГО (Calluna vulgaris (L.) Hull.) |
| CN103233072B (zh) * | 2013-05-06 | 2014-07-02 | 中国海洋大学 | 一种高通量全基因组dna甲基化检测技术 |
| RU2535060C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ АРАЛИИ ВЫСОКОЙ (Aralia elata (Miq.) Seem.) |
| RU2535063C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕCКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СУШЕНИЦЫ БОЛОТНОЙ (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) |
| RU2535064C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СВОБОДНОЯГОДНИКА КОЛЮЧЕГО, ЭЛЕУТЕРОКОККА (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.) |
| US9982301B2 (en) | 2014-01-07 | 2018-05-29 | Cornell University | Urine mRNA profile and acute dysfunction of kidney allograft |
| CN106164261A (zh) | 2014-01-22 | 2016-11-23 | 生命技术公司 | 适用于高温核酸合成的新颖逆转录酶 |
| US20140245471A1 (en) | 2014-05-02 | 2014-08-28 | Nunhems B.V. | Carrot plants with a high anthocyanin level |
| US9107356B2 (en) | 2014-05-02 | 2015-08-18 | Nunhems B.V. | Hybrid carrot variety NUN 85931 |
| EP3169785B1 (en) | 2014-07-15 | 2021-09-15 | Ceres, Inc. | Methods of increasing crop yield under abiotic stress |
| RU2573937C1 (ru) * | 2014-10-20 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.) |
| EP3777526A1 (en) | 2014-10-30 | 2021-02-17 | Nunhems B.V. | Lettuce plants comprising resistance against nasonovia ribisnigri biotype 1 |
| US10494642B2 (en) | 2015-04-28 | 2019-12-03 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Brassica plants with modified seed oil composition |
| JP6978152B2 (ja) | 2015-09-04 | 2021-12-08 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 複相胞子生殖遺伝子 |
| US10226015B2 (en) | 2015-11-10 | 2019-03-12 | Pop Vriend Research B.V. | Peronospora resistance in Spinacia sp |
| US11277983B2 (en) | 2015-11-10 | 2022-03-22 | Pop Vriend Seeds Bv | Peronospora resistance in spinacia sp |
| WO2018091438A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Nunhems B.V. | Multibranching artichoke plant |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2019068647A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Hild Samen Gmbh | TOTAL RESISTANCE TO THE MILDIOU IN THE BASIL |
| BR112020014168A2 (pt) | 2018-01-12 | 2020-12-08 | Basf Se | Proteína, ácido nucleico isolado, gene recombinante, vetor, célula hospedeira, planta, parte de planta ou semente de trigo, métodos para produzir, produto de trigo, farinha, farelo integral, amido, grânulos de amido ou farelo de trigo e métodos para identificar e/ou selecionar uma planta de trigo |
| CN111655026A (zh) | 2018-01-26 | 2020-09-11 | 纽海姆有限公司 | 对至少粉霜霉8、9、11、13和16号小种具有抗性的菠菜植物 |
| CA3117768A1 (en) | 2018-11-28 | 2020-06-04 | Keygene N.V. | Targeted enrichment by endonuclease protection |
| CA3121350A1 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Nunhems B.V. | Solanaceous plant capable of stenospermocarpic fruit formation |
| CA3127572A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Keygene N.V. | Genotyping of polyploids |
| CN113874388A (zh) | 2019-05-29 | 2021-12-31 | 主基因有限公司 | 孤雌生殖基因 |
| CA3134097A1 (en) | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Wim VRIEZEN | Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics |
| WO2021105296A2 (en) | 2019-11-26 | 2021-06-03 | Nunhems B.V. | Molecular markers for reduced pyruvate level trait in allium cepa |
| JP2023505712A (ja) | 2019-12-12 | 2023-02-10 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 半固体状態での核酸操作 |
| JP2023506631A (ja) | 2019-12-20 | 2023-02-17 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製 |
| IL297475A (en) | 2020-04-23 | 2022-12-01 | Nunhems Bv | Tomato plants with improved resistance to Tobamo virus |
| AU2021273328A1 (en) | 2020-05-13 | 2022-12-15 | Nunhems B.V. | Tomato plants having suppressed meiotic recombination |
| WO2021249826A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Nunhems B.V. | Capsicum annuum plants having improved thrips resistance |
| EP4225914A1 (en) | 2020-10-06 | 2023-08-16 | Keygene N.V. | Targeted sequence addition |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Adapted promoter of parthenogenesis gene |
| EP4251761A1 (en) | 2020-11-24 | 2023-10-04 | Keygene N.V. | Targeted enrichment using nanopore selective sequencing |
| AU2021410073A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-07-06 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| CN116888276A (zh) * | 2020-12-31 | 2023-10-13 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种用于高通量靶向测序的多重pcr文库构建方法 |
| WO2022265965A1 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Reverse transcriptase variants for improved performance |
| CN117794357A (zh) | 2021-07-23 | 2024-03-29 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | 抗黑胫病植物及用于鉴定抗黑胫病植物的方法 |
| US12004476B2 (en) | 2022-01-26 | 2024-06-11 | Monsanto Technology Llc. | Cotton variety 20R750B3XF |
| WO2024121354A1 (en) | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Keygene N.V. | Duplex sequencing with covalently closed dna ends |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
| US5093245A (en) * | 1988-01-26 | 1992-03-03 | Applied Biosystems | Labeling by simultaneous ligation and restriction |
| EP0456721A4 (en) * | 1989-01-31 | 1992-06-03 | University Of Miami | Microdissection and amplification of chromosomal dna |
| WO1990012115A1 (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-18 | Collaborative Research, Inc. | A dna diagnostic test using an exonuclease activity |
| AU6646190A (en) * | 1989-10-16 | 1991-05-16 | Genelabs Technologies, Inc. | Non-specific dna amplification |
| WO1991014003A2 (en) * | 1990-03-09 | 1991-09-19 | Ig Laboratories, Inc. | Characterization and analysis of polymorphic vntr loci |
| US5126239A (en) * | 1990-03-14 | 1992-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| AU1426392A (en) * | 1991-01-22 | 1992-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences |
-
1992
- 1992-09-24 CZ CZ1994669A patent/CZ291877B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 DE DE69233719T patent/DE69233719T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 PT PT92402629T patent/PT534858E/pt unknown
- 1992-09-24 DE DE69230873T patent/DE69230873T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 AU AU26629/92A patent/AU672760B2/en not_active Expired
- 1992-09-24 ES ES92402629T patent/ES2147550T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DK DK92402629T patent/DK0534858T4/da active
- 1992-09-24 CA CA002119557A patent/CA2119557C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 WO PCT/EP1992/002216 patent/WO1993006239A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-24 AT AT99115309T patent/ATE382094T1/de active
- 1992-09-24 HU HU9400809A patent/HU223760B1/hu active IP Right Grant
- 1992-09-24 KR KR1019940700959A patent/KR100321510B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 ES ES99115309T patent/ES2299229T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 ZA ZA927323A patent/ZA927323B/xx unknown
- 1992-09-24 EP EP92402629A patent/EP0534858B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 IL IL10326792A patent/IL103267A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 JP JP50580793A patent/JP3236295B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 PT PT99115309T patent/PT969102E/pt unknown
- 1992-09-24 EP EP99115309A patent/EP0969102B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DK DK99115309T patent/DK0969102T3/da active
- 1992-09-24 RU RU94033149/13A patent/RU2182176C2/ru active
- 1992-09-24 AT AT92402629T patent/ATE191510T1/de active
- 1992-09-24 CZ CZ0321397A patent/CZ298187B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-12 US US08/180,470 patent/US6045994A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-23 NO NO19941064A patent/NO318016B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 FI FI941360A patent/FI113184B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-05 GR GR20000401580T patent/GR3033895T3/el unknown
- 2000-07-25 JP JP2000224187A patent/JP4088403B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-10-17 FI FI20031526A patent/FI115402B/fi not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-21 JP JP2007329833A patent/JP4385072B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI113184B (fi) | Restriktiofragmentin selektiivinen monistaminen, yleinen menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseksi | |
| US7935488B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| CN105039313B (zh) | 用于多态性的高通量鉴定和检测的策略 | |
| US7544473B2 (en) | Nucleic acid analysis using sequence tokens | |
| WO2003060163A2 (en) | Discrimination and detection of target nucleotide sequences using mass spectrometry | |
| JP2021523704A (ja) | 方法 | |
| JPH10509594A (ja) | 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー | |
| KR20050008651A (ko) | 표현형과 관련된 게놈 와이드 서열 변형을 검출하는 방법 | |
| US20040197774A1 (en) | Representational approach to DNA analysis | |
| US7572583B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| JPH05505311A (ja) | ゲノム変異を分析するための組成物及び方法 | |
| AU772995B2 (en) | Methods of synthesizing polynucleotides by ligation of multiple oligomers | |
| WO1993011261A1 (en) | A novel pcr method with a single primer for nucleic acid analysis | |
| EP1458889A2 (en) | Discrimination and detection of target nucleotide sequences using mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |