ES2545083T3 - Planta de Brassica que comprende alelos mutantes de acil graso-ACP tioesterasa - Google Patents
Planta de Brassica que comprende alelos mutantes de acil graso-ACP tioesterasa Download PDFInfo
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Abstract
Una planta de Brassica, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizada porque comprende al menos tres alelos FATB mutantes en su genoma, que producen aceite de semillas, en la que el aceite de semillas tiene menos del 7 % en peso de ácidos grasos saturados, basado en la cantidad total de ácidos grasos en el aceite de semillas, en la que dichos alelos FATB mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína FATB funcional, en la que el gen FATB funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: - una molécula de ácido nucleico que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 11; y - una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12 en la que dichos alelos FATB mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, delecionados o sustituidos en comparación con una región de ADN no mutante correspondiente en el gen FATB funcional y en la que dichos alelos FATB mutantes codifican una proteína no funcional que no tiene actividad de acil ACP-tioesterasa in vivo, o no codifica proteína.
Description
Planta de Brassica que comprende alelos mutantes de acil graso-ACP tioesterasa
La presente invención se refiere al campo de los productos agrícolas, especialmente a plantas de cultivo que comprenden composiciones de lípidos de semillas novedosas. Se describen tanto moléculas no mutantes como mutante de ácidos nucleicos que codifica proteínas acil graso-proteína transportadora de acilo (ACP) tioesterasa B de Brassica (FATB) y las proteínas como tales. También se proporcionan plantas, tejido y semillas de Brassica que comprenden al menos tres alelos de fatB mutantes (de al menos tres genes de Brassica que codifican proteínas FATB diferentes) en su genoma, por lo que la composición o perfil de ácidos grasos del aceite de semillas está significativamente alterada. Además, en el presente documento se describen métodos para generar plantas de Brassica que producen semillas que comprenden aceite de semillas que tienen niveles de ácidos grasos saturados 15 reducidos, ya que es aceite de semillas obtenible de tales semillas. Tal aceite de semillas no requiere mezcla o modificación adicional y puede marcarse como “bajo en saturados” o como que contiene “no saturados” según la Agencia del Medicamento (FDA) del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (HHS). Adicionalmente se describen herramientas de detección (kits) y métodos para detectar la presencia de uno o más alelos fatB mutantes y/o FATB no mutantes en plantas, tejido(s) o semillas de Brassica, además de métodos para transferir uno o más alelos fatB mutantes y/o FATB no mutantes a otras plantas de Brassica y métodos para combinar diferentes alelos fatB y/o FATB en plantas. En particular, métodos para combinar un número adecuado de alelos fatB mutantes, que codifican proteínas FATB no funcionales y/o proteínas FATB que tienen actividad in vivo significativamente reducida tal que se reduzca significativamente la cantidad relativa de ácidos grasos saturados totales y/o de ácidos grasos saturados específicos que se acumulan en aceite de semillas de Brassica. Además, se
25 describen usos de las plantas, o partes de las mismas, y/o progenie de las mismas, semillas y aceites de semillas y los métodos y/o kits de la invención.
Los aceites vegetales son cada vez más importantes económicamente debido a que se usan ampliamente en dietas humanas y animales y en muchas aplicaciones industriales. Sin embargo, la composición de ácidos grasos de estos aceites frecuentemente no es óptima para muchos de estos usos. Debido a que se necesitan aceites de especialidad con composición de ácidos grasos particular para tanto fines nutricionales como industriales, hay un interés considerable en modificar la composición del aceite por cultivo de plantas y/o por nuevas herramientas
35 moleculares de biotecnología de plantas (véase, por ejemplo, Scarth y Tang, 2006, Crop Science 46:1225-1236, para la modificación de aceite de Brassica).
El rendimiento específico y los atributos para la salud de los aceites comestibles se determinan en gran medida por su composición de ácidos grasos. La mayoría de los aceites vegetales derivados de variedades de plantas comerciales están compuestos principalmente de ácidos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico
(18:2) y linolénico (18:3). Los ácidos palmítico y esteárico son, respectivamente, ácidos grasos saturados de 16 y 18 carbonos de longitud. Los ácidos oleico, linoleico y linolénico son ácidos grasos insaturados de 18 carbonos de longitud que contienen uno, dos y tres dobles enlaces, respectivamente. El ácido oleico se denomina ácido graso mono-insaturado, mientras que los ácidos linoleico y linolénico se denominan ácidos grasos poli-insaturados.
45 Las especies oleaginosas de Brassica, como Brassica napus (B. napus)y Brassica juncea (B. juncea), comúnmente conocidas como semilla de colza y mostaza, son ahora el segundo cultivo oleaginoso más grande después de la soja (FAO, 2005; Raymer (2002) en J. Janick y A. Whipkey (ed.) Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA Raymer, p. 122-126). El aceite de colza producido por cultivares oleaginosas de Brassica tradicionales (B. napus, B. rapa y B. juncea) (Shahidi (1990) en Shahidi (ed.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 3-13; Sovero (1993) en J. Janick y J.E. Simon (ed.) New crops. John Wiley & Sons, New York, p. 302-307), normalmente tuvieron una composición de ácidos grasos del 5 % de ácido palmítico (C16:0), 1 % de ácido esteárico (C18:0), 15 % de ácido oleico (C18:1), 14 % de ácido linoleico (C18:2), 9 % de ácido linolénico (C18:3) y 45 % de ácido erúcico (C22:1) en
55 peso basados en el contenido de ácidos grasos totales (llamado en el presente documento después % en peso) (Ackman (1990) en Shahidi (ed.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 81-98). El ácido erúcico es un ácido graso nutricionalmente no deseable y se ha reducido a niveles muy bajos en aceite de Brassica para usos comestibles. La cantidad relativa típica de ácidos grasos saturados basados en los ácidos grasos totales en el aceite de semillas está entre aproximadamente el 6,5 % y el 7,5 %, por lo que la mayoría es ácido palmítico y ácido esteárico.
En Canadá, los científicos de las plantas centraron sus esfuerzos en crear las llamadas variedades “dobles bajas” que fueron bajas en ácido erúcico en el aceite de semillas y bajas en glucosinolatos en la harina sólida que queda después de la extracción del aceite (es decir, un contenido de ácido erúcico inferior al 2 % en peso y un contenido 65 de glucosinolato inferior a 30 micromoles por gramo de la harina libre de aceite). Estas formas de mayor calidad de colza desarrolladas en Canadá se conocen como canola. El aceite de canola se caracteriza por un nivel
relativamente bajo de ácidos grasos saturados (en promedio aproximadamente el 7 % en peso), un nivel relativamente alto de ácidos grasos mono-insaturados (aproximadamente el 61 % en peso) y un nivel intermedio de ácidos grasos poli-insaturados (aproximadamente el 32 % en peso), con un buen equilibrio entre ácido linoleico, es decir, un ácido graso omega-6 (aproximadamente el 21 % en peso) y ácido alfa-linolénico, es decir, un ácido graso
5 omega-3 (aproximadamente el 11 % en peso).
Un motivo importante para el actual interés en la grasa dietética se refiere a la evidencia que liga los altos consumos de grasas, especialmente grasa saturada, con enfermedad cardíaca coronaria. Altos niveles de colesterol en sangre, en particular el colesterol “malo” (lipoproteína de baja densidad o LDL), constituyen un factor de riesgo importante en la enfermedad cardíaca coronaria. Varios estudios sugieren que dietas altas en grasa mono-insaturada y bajas en grasa saturada pueden reducir el colesterol “malo” (lipoproteína de baja densidad o LDL) mientras que mantienen el colesterol “bueno” (lipoproteína de alta densidad o HDL) (Nicolosi y Rogers, 1997, Med. Sci. Sports Exerc. 29:14221428).
15 Las recomendaciones de nutrición en América del Norte y Europa exigen una reducción en el consumo de grasas totales al 30 % o menos y una reducción en el consumo de grasas saturadas a menos del 10 % de la energía total (Artículo 21 del C.F.R. 101.75 (b) (3)) (en comparación con un consumo de grasas saturadas de aproximadamente el 15 % al 20 % del consumo calórico total en la mayoría de las naciones industrializadas). Para facilitar la conciencia del consumidor, las actuales directrices de etiquetado publicadas por la Agencia del Medicamento (FDA) del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (HHS) requieren ahora que los niveles de ácidos grasos saturados totales sean 1 g o menos de ácidos grasos saturados por cantidad de referencia normalmente consumida y no superior al 15 por ciento de calorías de ácidos grasos saturados para recibir la etiqueta de “bajo en grasas saturadas” o “bajo en saturadas” (Artículo 21 del C.F.R. 101.62 (c) (2)) y menos de 0,5 g de grasa saturada y menos de 0,5 g de ácido graso trans (un tipo de ácido graso insaturado producido por
25 hidrogenación (parcial) de aceites vegetales y considerado poco saludable ya que aumenta el riesgo de enfermedad cardíaca coronaria, a pesar de ser insaturado) por cantidad de referencia normalmente consumida y por etiqueta que sirve para recibir la etiqueta “sin (o cero) en grasas saturadas” o “sin (o cero) en saturadas” (Artículo 21 del C.F.R.
101.62 (c) (1)). Mediante cualquier medio el contenido de ácidos grasos saturados totales (el peso en porcentaje de ácidos grasos saturados basado en la cantidad total de ácidos grasos en el aceite), es decir, la suma del contenido de ácido láurico (C12:0; ácido dodecanoico), ácido mirístico (C14:0; ácido tetradecanoico), ácido palmítico (C16:0; ácido hexadecanoico), ácido esteárico (C18:0; ácido octadecanoico), ácido araquídico (C20:0; ácido eicosanoico), ácido behénico (C22:0; ácido docosanoico) y ácido lignocérico (C24:0; ácido tetracosanoico), de aceites de planta necesita ser inferior al 7 % en peso para recibir la etiqueta de “bajo en saturadas” e inferior al 3,5 % en peso para recibir la etiqueta de “sin saturadas” (basándose en una cantidad de referencia de 15 ml o 14 g de aceite – Artículo
35 21 del C.F.R. 101.12).
El aceite de canola contiene solo aproximadamente el 7 % en peso de ácidos grasos saturados, en comparación con el nivel de ácidos grasos saturados en otros aceites vegetales comestibles comúnmente usados tales como aceite de alazor (8 % en peso), aceite de semillas de lino (9 % en peso), aceite de girasol (12 % en peso), aceite de maíz (13 % en peso), aceite de oliva (15 % en peso), aceite de soja (15 % en peso), aceite de cacahuete (19 % en peso), aceite de semillas de algodón (27 % en peso), aceite de palma (51 % en peso) y aceite de coco (91 % en peso) (Fuente POS Pilot Plant Corporation). Se usaron diversos enfoques para intentar disminuir adicionalmente este nivel de ácidos grasos saturados.
45 La modificación de aceites vegetales puede efectuarse químicamente: la patente de EE.UU. nº 4.948.811 describe composiciones de aceite para ensaladas/de cocina de triglicéridos en las que el contenido de ácidos grasos del triglicérido del aceite comprende menos de aproximadamente el 3 % en peso de ácidos grasos saturados obtenidos por reacción química o por separación física de los saturados. Sin embargo, la modificación química de aceites vegetales para reducir el nivel de ácidos grasos saturados no es solo más cara que la extracción del aceite vegetal de plantas oleaginosas de Brassica (o cualquier otra planta oleaginosa) modificadas para proporcionar un aceite vegetal endógeno comestible mejorado como se ha desvelado presentemente, sino que también podría ser una forma deseada de mejorar la salubridad de aceites para consumo humano debido a la posible presencia involuntaria de residuos de los productos químicos usados y de supuestos productos secundarios.
55 Otra posibilidad de modificar la composición de ácidos grasos es usando ingeniería genética. Por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. 2004/0132189 describe la reducción del nivel de ácidos grasos saturados en líneas de Brassica que co-expresan las secuencias de la proteína transportadora de beta-cetoacil-acilo sintasa I y IV de Cuphea pulcherrima, además de una delta-9 desaturasa de alazor a aproximadamente el 3 % en peso y por debajo del 3,4 % en peso en comparación con un nivel de ácidos grasos saturados en líneas de control no transformadas de aproximadamente el 6,0 % en peso. El documento WO06/042049 describe plantas de Brassica con niveles “sin saturados” o reducidos en saturados de ácidos grasos en sus semillas que expresan un gen de delta-9 desaturasa. Sin embargo, desventajas de los enfoques transgénicos para la comercialización son las necesidades de autorización reglamentaria y la aceptación variable en diferentes partes del mundo.
65 La composición de ácidos grasos de aceites vegetales también puede modificarse mediante técnicas de cultivo tradicionales. Estas técnicas utilizan germoplasma existente como fuente de mutaciones que se producen
naturalmente que afectan la composición de los ácidos grasos. Por ejemplo, Raney et al. (1999, In Proc. 10th Int. Rapeseed Cong.: New horizons for an old crop, Canberra, Australia) describen poblaciones de cultivo derivadas de cruces interespecíficos de B. napus con B. rapa y B. oleracea en las que el nivel de ácidos grasos saturados, expresado como la suma de ácido mirístico, palmítico, esteárico, araquidónico, behénico y lignocérico, disminuyó a
5 menos del 6 % en peso y en las que el nivel de ácidos grasos saturados, expresado como la suma de ácido mirístico, palmítico y esteárico, disminuyó a menos del 5 % en peso.
Se han hecho intentos por aumentar el conjunto de mutaciones disponibles de las que seleccionar características deseadas usando mutágenos. Por ejemplo, el documento WO 91/15578 describe plantas de colza que tras la autopolinización pueden formar semillas de colza que dan aceite que tiene un contenido de ácidos grasos saturados de no superior al 4 % en peso en forma de ácido palmítico y esteárico que puede formarse por mutagénesis química seguida de selección.
En plantas, la síntesis de ácidos grasos de novo se localiza exclusivamente en el estroma de plástidos, en los que
15 las cadenas de acilo se unen covalentemente con una proteína transportadora de acilo (ACP) soluble durante los ciclos de extensión. El alargamiento de la cadena de carbono puede terminarse transfiriendo el grupo acilo a glicerol3-fosfato, reteniéndolo así en la vía de biosíntesis de lípidos de plástidos “procariotas”. Alternativamente, tioesterasas específicas pueden interceptar la vía procariota (de plástidos), hidrolizando la acil-ACP recientemente formada en un ácido graso libre y ACP. Posteriormente, el ácido graso libre sale de los plástidos y se suministra a la vía de biosíntesis de lípidos “eucariotas” citoplásmica. La última se localiza en el retículo endoplásmico y es responsable de la formación de fosfolípidos, triglicéridos y otros lípidos neutros. Por tanto, hidrolizando acil-ACP y liberando el ácido graso, acil-ACP tioesterasas catalizan la primera etapa comprometida en la vía de biosíntesis de lípidos eucariotas en células vegetales y desempeñan una función crucial en la distribución de grupos acilo sintetizados de novo entre las dos vías (Löhden y Frentzen, 1988, Plant 176:506-512; Browse y Somerville, 1991,
25 Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42: 467-506; Gibson et al., 1994, Plant Cell Environ 17: 627-637).
Jones et al. (1995, Plant cell 7:359-371) y Voelker et al. (1997, Plant Physiology 114, 669-677) describen dos clases de genes de tioesterasa distintas, pero relacionadas, en plantas superiores, llamadas FATA y FATB. Estas dos clases de tioesterasa pueden distinguirse por comparación de secuencias y/o por su especificidad/preferencia por sustrato. Las tioesterasas FATA (también llamadas tioesterasas de clase I) muestran una clara preferencia por acilu oleoil C18:1-ACP con solo actividad menor hacia acil C18:0-y acil C16:0-ACP (es decir, la preferencia por acilo es
18:1 >> 18:0 >> 16:0). A diferencia, miembros de FATB (también llamados tioesterasas de la clase II) prefieren grupos acil-ACP saturados como sustrato, y longitud de cadena del sustrato que varía enormemente de acil C8 a C18-ACP (Mayer y Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627). Además, los miembros de FATB pueden
35 subdividirse adicionalmente en dos grupos funcionales. Algunas enzimas FATB son específicas para acil-ACP saturadas en el intervalo de C8 a C14 (tioesterasas que prefieren acil-ACP de cadena media) y se encuentran en especies productoras de cadena media, con expresión limitada a tejidos productores de cadena media. Enzimas de un segundo grupo de FATB que prefieren acil C14 a C18-ACP (predominantemente palmitoil-ACP, por ejemplo enzimas con una preferencia de C16:0 > C18:1 > C18:0; tioesterasas que prefieren acil-ACP de cadena larga) están probablemente presentes en todas las partes de planta importantes y no están limitadas a especies productoras de cadena media (Jones et al., 1995, Plant cell 7:359-371). Por qué las plantas tienen estos tipos de tioesterasas diferentes y cuáles son sus funciones individuales sigue estando todavía poco claro.
Se aislaron genes de FATA de varias especies de plantas, que incluyen especies de Brassica. Por ejemplo, las
45 patentes de EE.UU. nº 5.530.186, nº 5.530.186 y nº 5.945.585 describen genes de FATA de soja; Hellyer et al. (1992, Plant Mol. Biol. 20:763-780) describen enzimas de FATA de Brassica napus; Loader et al. (1993, Plant Mol. Biol. 23(4): 769-778) describen el aislamiento y caracterización de dos clones de acil-ACP tioesterasa de una biblioteca de ADNc de embriones de Brassica napus usando oligonucleótidos derivados de datos de las secuencias de proteínas de oleoil-ACP tioesterasa de B. napus; y Mandal et al. (2000, Bioch. Soc. Transactions 28(6): 967-968) describen la clonación de secuencias de genes de acil-ACP tioesterasa de B. juncea que muestran una homología con los genes de FATA de diferentes especies.
Se aislaron genes de FATB que codifican enzimas de FATB específicas para acil-ACP saturadas en el intervalo de C8 a C14 (tioesterasas que prefieren acil-ACP de cadena media) de varias especies de plantas productoras de
55 cadenas medias, como se describe en las referencias a continuación:
El documento WO91/16421 describe el aislamiento de una tioesterasa que prefiere lauroil (C12:0)-ACP de bahía de California (Umbellularia californica), una tioesterasa que prefiere C10:0 acil-ACP de alcanfor (Cuphea hookeriana) y una tioesterasa que prefiere estearoil (C18:0)-ACP de cártamo (Carthamus tinctorius) y la expresión de la tioesterasa de bahía de California en semilla de Brassica, produciendo un elevado nivel de laurato en comparación con el nivel en semilla de Brassica no transgénica.
El documento WO92/20236 describe el aislamiento de tioesterasas que prefieren acil C8:0 a C14:0-ACP y la expresión de una tioesterasa que prefiere lauroil (C12:0)-ACP de la bahía de California en Arabidopsis y Brassica
65 campestris, produciendo elevados niveles de laurato.
Voelker et al. (1992, Science 257: 72-74) describen la expresión de un ADNc de FATB (Uc FATB1) que codifica una lauroil (C12:0)-ACP tioesterasa de bahía de California, una especie que acumula ácido cáprico (C10:0) y láurico (C12:0) en el aceite de semillas, en semillas de Arabidopsis thaliana, que normalmente no acumulan laureato, produciendo la acumulación de laurato en semillas maduras. Voelker et al. (1996, Plant J. 9:229-241) describen la
5 transformación del mismo transgén de FATB en Brassica napus, produciendo la acumulación de laurato a casi el 60 % en moles de los grupos acilo de triglicérido.
Eccleston y Ohlrogge (1998, Plant cell 10:613-621) describen la expresión de una acil C12:0-ACP tioesterasa de Umbellularia californica en semillas de Brassica napus que conduce a un aceite de semillas que contiene 1,8 % en moles al 59,6 % en moles de laurato (C12:0).
El documento WO94/10288 describe el aislamiento de tioesterasas que prefieren acil C8:0 a C10:0-ACP.
Martini et al. (1995, en Proc. 9th Int. Rapeseed Cong, Cambridge, UK, p. 461-463) describen que dos genes de
15 FATB de Cuphea lanceolata, transformados por separado en B. napus, produjeron la acumulación de ácido caprílico (C8:0) y cáprico (C10:0) en aceite de semillas de Brassica a bajos niveles.
Dehesh et al. (1996, Plant J. 9(2):167-172) describen la expresión de un ADNc de FATB (Ch FATB2) del arbusto mejicano Cuphea hookeriana, que acumula hasta el 75 % en moles de caprilato (C8:0) y caprato (C10:0) en su aceite de semillas, en semillas de canola transgénica, que normalmente no acumula estos ácidos grasos, produciendo la acumulación de caprilato (C8:0), caprato (C10:0) y laurato (C12:0) hasta el 11, 27 y 2 % en moles, respectivamente.
Se aislaron genes de FATB que codifican enzimas de FATB específicas para/que prefieren acil-ACP saturadas en el 25 intervalo de C14 a C 18 (tioesterasas que prefieren acil-ACP de cadena larga) de varias especies de planta:
El documento WO95/13390 describe el aislamiento de secuencias de palmitoil (C16:0)-ACP tioesterasa de puerro, mango, olmo y alcanfor y su uso en niveles crecientes y decrecientes de ácidos grasos saturados en soja y canola por transformación genética.
Jones et al. (1995, Plant cell 7:259-371) describen la expresión de un ADNc de palmitoil (C16:0)-ACP tioesterasa de alcanfor (Ch FATB1) en plantas transgénicas de Brassica napus produciendo un aumento de los niveles de palmitato (C16:0) del 6 % en moles hasta el 35 % en moles.
35 Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) describen la expresión de una acil C14:0 a C18:0-ACP tioesterasa de nuez moscada (Myristica fragrans), que acumula predominantemente aceite que contiene miristato (14:0), en semillas de Brassica napus, conduciendo a un aceite de semillas enriquecido en saturados C14 a C18.
Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) también describen la expresión de una acil C10:0 y C16:0-ACP tioesterasa de olmo (Ulmus americana), que acumula predominantemente aceite que contiene caprato (10:0), en semillas de Brassica napus, conduciendo a un aceite de semillas enriquecido en saturados C10 a C18, predominantemente palmitato (C16:0), miristato (C14:0) y caprato (C10:0).
El documento WO96/23892 describe secuencias de miristoil (C14:0)-ACP tioesterasa de Cuphea palustris, alcanfor y 45 nuez moscada y su uso en la producción de miristato en células vegetales.
El documento WO96/06936 describe soja y ADNc de palmitoil (C16:0)-ACP tioesterasa de canola y su uso en niveles crecientes y decrecientes de ácidos grasos saturados en soja y canola por transformación genética.
Dörmann et al. (2000, Plant Physiol 123:637-643) describen la expresión en exceso de un ADNc de acil de cadena larga-ACP de Arabidopsis (AtFATB1) bajo un promotor específico de semilla en Arabidopsis, produciendo la acumulación de altas cantidades de palmitato (C16:0) en semillas (del 10 % en moles en control no mutante al 38,6 % en moles). La expresión antisentido del ADNc de FATB1 de Arabidopsis bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor produjo una fuerte reducción del contenido de palmitato de semillas (del 11 % en moles en
55 control no mutante al 6 % en moles) y contenido de palmitato en las flores y solo cambios menores en ácidos grasos de las hojas y raíces.
Bonaventure et al. (2003, Plant cell 15:1020-1033) describen que el contenido de palmitato (C16:0) de glicerolípidos de un mutante de Arabidopsis con una inserción de T-ADN en el gen de FATB (en Arabidopsis dos genes para FATA están presentes, pero solo un único gen para FATB; véase Mekhedov et al. 2000, Plant Physiol. 122:389-402; y Beisson et al. 2003, Plant Physiol. 132: 681-697) se redujo el 42 % en hojas, el 56 % en flores, el 48 % en raíces y el 56 % en semillas. Además, el estearato (C18:0) se redujo el 50 % en hojas y el 30 % en semillas. La tasa de crecimiento fue significativamente reducida en las semillas mutantes y producidas de plantas mutantes con baja viabilidad, germinación reducida y morfología de semillas alterada, que indica que FATB es esencial para el
65 crecimiento de plantas y el desarrollo de semillas.
Bonaventure et al. (2004, Plant Physiol 135:1269-1279) describen que la tasa de síntesis de ácidos grasos en hojas de la planta Arabidopsis mutante inactivada en FATB transgénica aumenta el 40 %, produciendo aproximadamente la misma cantidad de palmitato exportado desde el plástido que en no mutantes, pero un aumento en la exportación de oleato de aproximadamente el 55 %.
5 Pandian et al. (2004, resumen de póster, 4th Int. Crop Sci. Cong.) informan del aislamiento de secuencias de genes de FATB de longitud completa de B. napus (número de acceso de GenBank DQ847275) y B. juncea (número de acceso de GenBank DQ856315), la construcción de una construcción de silenciamiento de genes de repeticiones invertidas (bajo el control de un promotor específico de semillas) con un fragmento conservado de 740 pb de una parte de la secuencia de B. napus que compartió más del 90 % de homología de secuencias con secuencias de FATB de B. juncea y Arabidopsis thaliana, pero menos del 40 % de homología con los genes de FATA de estas tres especies, y su transformación en Arabidopsis thaliana, B. napus y B. juncea. El objetivo es crear plantas transgénicas con contenido de ácido palmítico reducido en el aceite de semillas. La divulgación no enseña nada sobre el efecto de esta construcción de silenciamiento de genes sobre la eventual composición del aceite de
15 semillas (no se desvelan resultados) o sobre métodos alternativos para generar plantas de Brassica con aceites de semillas bajos en saturados.
Mayer y Shanklin (2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627) describen un modelo estructural de la proteína FATB de Arabidopsis en la que el dominio del extremo N contiene residuos que afectan la especificidad (véase también Mayer y Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11) y el dominio del extremo C contiene residuos catalíticos.
A pesar del hecho de que las secuencias de algunos genes FATB están disponibles en la materia, sigue existiendo la necesidad de entender completamente los genes y enzimas que participan en la producción y acumulación de ácidos grasos saturados en aceite de semillas y en el desarrollo de métodos (especialmente métodos no
25 transgénicos) para reducir la cantidad relativa de ácidos grasos saturados totales y/o de ácidos grasos saturados específicos en las semillas, sin tener un efecto negativo sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas. Hasta la fecha no están disponibles en la materia plantas de cultivo de Brassica (no transgénicas) que produzcan aceite de semillas que contengan significativamente menos del 7 % de ácidos grasos saturados. Sigue existiendo, por tanto, la necesidad de herramientas y métodos para desarrollar tales plantas y aceites como se describe en lo sucesivo en la descripción detallada, las figuras, los ejemplos y las reivindicaciones.
Los inventores han encontrado que las plantas de Brassica napus comprenden 6 genes FATB diferentes y que los
35 niveles de ácidos grasos saturados en plantas de Brassica, particularmente en el aceite de semillas de dichas plantas de Brassica, pueden controlarse controlando el número y/o tipos de genes/alelos de FATB que se “expresan funcionalmente” en semillas, es decir, que producen proteína FATB funcional (biológicamente activa). Combinando un número mínimo de alelos mutantes de los seis genes FATB (“alelos fatB”), mientras que se mantiene un número mínimo de alelos FATB no mutantes, produciendo un nivel mínimo de proteína FATB funcional, el nivel de ácidos grasos saturados en el aceite de semillas puede modificarse y especialmente las cantidades relativas de ácidos grasos saturados (especialmente la cantidad de ácido palmítico) se reducen significativamente. Se cree que se necesita un número mínimo de alelos FATB no mutantes para mantener la producción de una cantidad mínima de ácidos grasos saturados y/o de ácidos grasos saturados específicos en tejidos específicos para asegurar un crecimiento de planta y desarrollo de semillas normales.
45 Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona en una realización una planta de Brassica (y partes de la misma, tales como semillas) que comprende al menos tres alelos FATB mutantes en su genoma. También se describen plantas por las cuales los alelos FATB mutantes son alelos de al menos tres genes FATB diferentes seleccionados del grupo que consiste en FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3 y en las que las semillas de dicha planta producen un aceite de semillas que tiene igual o menos del 6 % en peso, 5 % en peso, 4 % en peso o 3,5 % en peso (tal como inferior o igual al 3 % en peso, 2 % en peso o 1 % en peso) de ácidos grasos saturados basados en la cantidad total de ácidos grasos en el aceite de semillas.
Se describen secuencias de ácidos nucleicos (aisladas) que codifican proteínas FATB no mutantes y/o mutantes,
55 además de fragmentos de las mismas, y métodos de uso de estas secuencias de ácidos nucleicos para modificar la composición del aceite de semillas de Brassica. También se describen las propias proteínas y su uso.
La invención se refiere además a semillas de Brassica, a plantas de Brassica y partes de plantas que comprenden al menos tres alelos fatB (mutantes), y así una cantidad significativamente reducida de proteínas FATB funcionales en comparación con semillas, plantas y tejidos que comprenden alelos FATB que codifican las proteínas funcionales correspondientes. Las semillas comprenden aceite de semillas con una cantidad y/o composición relativa modificada de ácidos grasos saturados. En un aspecto, especialmente la cantidad de ácido palmítico (C16:0) se reduce significativamente en comparación con el aceite de semillas derivado de semillas que carecen de (al menos tres) alelos fatB mutantes (es decir, que en su lugar comprenden alelos FATB no mutantes).
65 En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir aceite de semillas con una cantidad y/o
composición relativa modificada de ácidos grasos saturados, que puede obtenerse recogiendo semillas de una planta de Brassica según la presente invención y extrayendo el aceite de las semillas u obtenerse por extracción de una pluralidad de semillas de Brassica según la presente invención. También se describe el uso del aceite de semillas.
5 Adicionalmente se describen métodos para generar y seleccionar plantas, partes de plantas y semillas que contienen al menos tres de tales alelos fatB mutantes presentes en al menos tres loci diferentes en el genoma (es decir, en al menos tres loci diferentes de al menos tres genes FATB diferentes seleccionados del grupo que consiste en FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3), y para distinguir entre la presencia de alelos fatB mutantes y alelos FATB no mutantes en una planta o parte de planta. Así, se describen métodos (tales como mutagénesis y/o selección asistida por marcador) para generar y/o identificar alelos fatB o plantas o partes de planta que comprenden tales alelos y para combinar un número adecuado de alelos fatB y/o diferentes tipos de alelos fatB en una única planta, por lo que los niveles de ácidos grasos saturados del aceite de semillas de esta planta se reducen significativamente.
15 También se proporcionan métodos para usar las plantas, pluralidad de semillas, partes de las plantas, etc., de la invención, para obtener aceite de semillas “bajo en saturadas” o “sin saturadas” de semillas de Brassica trituradas. Como se usa en el presente documento, “producto de planta” incluye cualquiera derivado de una planta de la invención, que incluye partes de las plantas tales como semillas, harina de semillas, torta de semillas, grasas o aceites de semillas.
Figura 1 -Gráfico que muestra los resultados de la RT-PCR semi-cuantitativa del Ejemplo 3. Se indica el momento
25 exacto (11, 21 y 34 días después de la antesis) (eje x) y el nivel de expresión de cada gen FATB en semilla (basado en 10 ng de ARN) expresado como la cantidad de ADN genómico (en ng) que generó una intensidad de banda comparable a la intensidad de banda del producto de RT-PCR específico del gen FATB (eje y). Figura 2 -Representación esquemática del gen FATB-A1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 13) Figura 3 -Representación esquemática del gen FATB-A2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 15) Figura 4 -Representación esquemática del gen FATB-A3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 17) Figura 5 -Representación esquemática del gen FATB-C1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no
35 mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 19) Figura 6 -Representación esquemática del gen FATB-C2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 21) Figura 7 -Representación esquemática del gen FATB-C3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de verano (S) Brassica napus. (SEC ID Nº: 23) En la Figura 2-7 los exones se indican con recuadros grises, los intrones por las líneas horizontales entre los exones; la posición de las mutaciones descritas en los ejemplos (llamadas “EMSxx” según su nombre “FATB-Xx-EMSxx” respectivo como se describe en los ejemplos) se indica con líneas verticales; la longitud y posición de las sondas específicas de FATB con SEC ID Nº:25 y 28 se indican por líneas verticales debajo de la representación esquemática de los genes FATB; la posición de los cebadores específicos de FATB (llamados “ID xx” según su SEC
45 ID Nº: xx respectiva) se indica por puntas de flecha; la barra de escala indica la longitud de los genes FATB respectivos. Figura 8 -Gráfico que muestra la correlación entre la presencia de ninguno a cuatro alelos FATB mutantes en estado homocigótico en plantas de Brassica y el nivel de ácidos grasos saturados totales (es decir, ácidos grasos C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0 y C24:0) (en porcentaje en peso basado en la cantidad total de ácidos grasos) en aceite de semillas de las plantas de Brassica. Las plantas de Brassica analizadas fueron plantas de progenie de plantas de Brassica que comprenden tres o cuatro alelos FATB mutantes, es decir, alelos FATB-AX-EMSY o FATB-CX-EMSY como se indica en la Tabla 23, en estado heterocigótico como se indica. Los alelos FATB mutantes se denominan 'aX-Y' y 'cX-Y' o 'aX' y 'cX'; alelos FATB no mutantes se denominan 'AX' y 'CX'.
Aceite “bajo en saturados” se refiere en el presente documento a aceite derivado de semilla que contiene (en promedio) menos del 7 % en peso de ácidos grasos saturados totales basados en el % en peso total de ácidos grasos en el aceite. El % en peso de ácidos grasos saturados de aceite de semillas bajo en saturados puede ser igual o inferior al 6 % en peso, 5 % en peso, 4 % en peso, pero superior al 3,5 % en peso (por ejemplo, 3,6 % en peso).
Aceite “sin saturados” se refiere en el presente documento a aceite derivado de semilla que contiene (en promedio) 65 menos del 3,6 % en peso de ácidos grasos saturados totales basados en el % en peso total de ácidos grasos en el aceite. El % en peso de ácidos grasos saturados de aceite de semillas sin saturados puede ser igual o inferior al 3,5
% en peso, 3,0 % en peso, 2,5 % en peso, 2,0 % en peso, 1,5 % en peso o 1 % en peso.
“Planta de cultivo” se refiere a especies de planta cultivadas como un cultivo, tales como Brassica napus (AACC, 2n=38), Brassica juncea (AABB, 2n=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), Brassica rapa (sin. B. campestris) (AA, 5 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) o Brassica nigra (BB, 2n=16). La definición no engloba malas hierbas, tales como Arabidopsis thaliana.
El término “secuencia de ácidos nucleicos” (o molécula de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o de ARN en forma mono o bicatenaria, particularmente un ADN que codifica una proteína o fragmento de proteína según la invención. Una “secuencia de ácidos nucleicos endógena” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está dentro de una célula de planta, por ejemplo, un alelo endógeno de un gen FATB presente dentro del genoma nuclear de una célula de Brassica.
El término “gen” significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en
15 una molécula de ARN (por ejemplo, un pre-ARNm, que comprende secuencias de intrones, que entonces se corta y empalma en un ARNm maduro) en una célula, operablemente ligada a regiones reguladoras (por ejemplo, un promotor). Un gen puede así comprender varias secuencias operativamente ligadas, tales como un promotor, una secuencia conductora de 5' que comprende, por ejemplo, secuencias que participan en el inicio de la traducción, una región codificante (de proteínas) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia no traducida de 3' que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción. “Gen endógeno” se usa para diferenciar de un “gen extraño”, “transgén” o “gen quimérico” y se refiere a un gen de una planta de un cierto género de planta, especie o variedad, que no se ha introducido en esa planta por transformación (es decir, no es un 'transgén'), pero que normalmente está presente en plantas de ese género, especie, variedad, o que se introduce en esa planta de plantas de otro género, especie o variedad de planta, en el que normalmente está presente, por técnicas de cultivo normales o por
25 hibridación somática, por ejemplo, por fusión de protoplastos. Similarmente, un “alelo endógeno” de un gen que no se introduce en una planta o tejido de planta por transformación de plantas, pero, por ejemplo, se genera por mutagénesis y/o selección de plantas o se obtiene cribando poblaciones naturales de plantas.
“Expresión de un gen” o “expresión génica” se refiere al proceso en el que una región de ADN, que está operativamente ligada a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en una molécula de ARN. La molécula de ARN se procesa entonces adicionalmente (por procesos post-transcripcionales) dentro de la célula, por ejemplo, por corte y empalme de ARN e iniciación de la traducción y traducción en una cadena de aminoácidos (polipéptidos), y terminación de la traducción por codones de terminación de la traducción. El término “funcionalmente expresado” se usa en el presente documento para indicar que se produce una proteína
35 funcional; el término “no funcionalmente expresado” indica que una proteína con funcionalidad reducida o sin funcionalidad (actividad biológica) se produce o que no se produce proteína (véase también más adelante).
Los términos “proteína” o “polipéptido” se usan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo específico de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen. Un “fragmento” o “porción” de una proteína FATB puede así todavía denominarse una “proteína”. Una “proteína aislada” se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo, in vitro o en una célula huésped bacteriana o de planta recombinante. Una “enzima” es una proteína que comprende actividad enzimática, tal como proteínas FATB funcionales, que pueden hidrolizar el (los) sustrato(s) acil graso-ACP en ácidos grasos libres y ACP (número de EC 3.1.2.).
45 Los términos “péptido diana” o “péptido de tránsito” se refieren a secuencias de aminoácidos que dirigen una proteína a orgánulos intracelulares tales como plástidos. Proteínas FATB no mutantes comprenden un péptido diana de plástido (o péptido de tránsito de plástido) en su extremo N.
“Proteína madura” o “proteína FATB madura” se refiere a una enzima FATB funcional sin el péptido de tránsito de plástido. “Proteína precursora” se refiere a la proteína madura con su péptido de tránsito.
El “gen FATB” se refiere en el presente documento a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína tipo II de acil graso-ACP tioesterasa (es decir, una proteína FATB). Una “proteína FATB” funcional tiene actividad de acil
55 graso-ACP tioesterasa, es decir, puede hidrolizar sustratos de acil graso-ACP, preferentemente sustratos de acil graso saturado-ACP (por ejemplo, palmitoil-ACP; C16:0-ACP) en ácido graso libre (por ejemplo, C16:0) y ACP, que puede probarse usando un ensayo biológico. Para determinar la función y/o la funcionalidad de un gen/proteína FATB específico puede usarse, por ejemplo, el sistema de expresión bacteriano que se describe en Salas y Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34) o el cribado calorimétrico basado en placa de agar para actividad de tioesterasa descrito en Mayer y Shanklin (2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11). Para determinar la actividad de FATB global en una planta o un tejido de planta, pueden realizarse ensayos para la hidrólisis de acil graso-ACP sobre extractos de plantas como se ha descrito, por ejemplo, por Bonaventure et al. (2003, Plant cell 15:1020-1033) y Eccleston y Ohlrogge (1998, Plant cell 10: 613-622).
65 Como se usa en el presente documento, el término “alelo(s)” significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, los alelos de un gen dado
están localizados en una localización específica o locus (plural loci) sobre un cromosoma. Un alelo está presente sobre cada cromosoma del par de cromosomas homólogos.
Como se usa en el presente documento, el término “cromosomas homólogos” significa cromosomas que contienen
5 información para las mismas características biológicas y contienen los mismos genes en los mismos loci pero posiblemente diferentes alelos de aquellos genes. Cromosomas homólogos son cromosomas que se emparejan durante la meiosis. “Cromosomas no homólogos”, que representan todas las características biológicas de un organismo, forman un juego, y el número de juegos en una célula se llama ploidía. Los organismos diploides contienen dos juegos de cromosomas no homólogos, en los que cada cromosoma homólogo es heredado de un padre diferente. En especies anfidiploides, esencialmente existen dos juegos de genomas diploides, por lo que los cromosomas de los dos genomas se denominan cromosomas homeólogos (y similarmente, los loci o genes de los dos genomas se denominan loci o genes homeólogos). Una especie de planta diploide, o anfidiploide, puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus particular.
15 Como se usa en el presente documento, el término “heterocigótico” significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero están posicionados individualmente sobre pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula. En cambio, como se usa en el presente documento, el término “homocigótico” significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero están posicionados individualmente sobre pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula.
Como se usa en el presente documento, el término “locus” (plural loci) significa un lugar o lugares específicos o un sitio sobre un cromosoma en el que, por ejemplo, se encuentra un gen o marcador genético. Por ejemplo, el “locus FATB-A1” se refiere a la posición sobre un cromosoma del genoma A en el que se encuentra(n) el gen FATB-A1 (y
25 dos alelos FATB-A1).
Siempre que se hace referencia a una “planta” o “plantas” según la invención, se entiende que también partes de las plantas (células, tejidos u órganos, semillas, partes cortadas tales como raíces, hojas, flores, polen, etc.), progenie de las plantas que retienen las características diferenciadoras de los padres (especialmente la composición de aceite de semillas), tal como semilla obtenida por autofecundación o cruce, por ejemplo, semilla híbrida (obtenida cruzando dos líneas parentales puras), plantas híbridas y partes de las plantas derivadas de las mismas están englobadas en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Un “ensayo molecular” (o prueba) se refiere a un ensayo que indica (directamente o indirectamente) la presencia o
35 ausencia de uno o más alelos FATB particulares en uno o más loci FATB (es decir, en uno o más de los loci FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y/o FATB-C3). Puede permitir que uno determine si un alelo particular (no mutante o mutante) es homocigótico o heterocigótico en el locus en cualquier planta individual.
Como se usa en el presente documento, el término “FATB no mutante” (por ejemplo, FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 o FATB-C3 no mutante), significa un alelo que se produce naturalmente encontrado dentro de plantas de Brassica, que codifica una proteína FATB funcional (por ejemplo, una FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 o FATB-C3 funcional, respectivamente). A diferencia, “FATB mutante” (por ejemplo, FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 o FATB-C3 mutante) se refiere a un alelo FATB que no codifica una proteína FATB funcional, es decir, un alelo FATB que codifica una proteína FATB no funcional (por ejemplo, una
45 FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 o FATB-C3 no funcional, respectivamente) o que no codifica proteína FATB. Un “alelo FATB mutante” es un alelo FATB no mutante que comprende una o más mutaciones en su secuencia de ácidos nucleicos, por lo que la(s) mutación (mutaciones) producen preferentemente una cantidad significativamente reducida (absoluta o relativa) de proteína FATB funcional en la célula in vivo. Alelos mutantes de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteína FATB se designan “fatB” (por ejemplo, fatB-a1, fatB-a2, fatB-a3, fatB-c1, fatB-c2 o fatB-c3, respectivamente) en el presente documento. Los alelos mutantes pueden ser tanto alelos “mutantes naturales”, que son alelos mutantes encontrados en la naturaleza (por ejemplo, producidos espontáneamente sin la aplicación humana de mutágenos) o alelos “mutantes inducidos”, que se inducen por intervención humana, por ejemplo, por mutagénesis.
55 Una “cantidad significativamente reducida de proteína FATB funcional” (por ejemplo, proteína FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y/o FATB-C3 funcional) se refiere a una reducción en la cantidad de una proteína FATB funcional producida por la célula que comprende un alelo FATB mutante al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 100 % (es decir, se produce proteína no funcional por la célula) en comparación con la cantidad de la proteína FATB funcional producida por la célula que no comprende el alelo FATB mutante. Esta definición engloba así la producción de una proteína “no funcional” (por ejemplo, proteína truncada) que no tiene actividad biológica in vivo, la reducción en la cantidad absoluta de la proteína funcional (por ejemplo, proteína no funcional que se produce debido a la mutación en el gen) y/o la producción de una proteína con actividad biológica reducida, es decir, una proteína de “mal funcionamiento” (tal como una proteína truncada o una proteína producida por corte y empalme de ARNm alternativo) en comparación con la actividad de la proteína funcional no mutante.
65 Asimismo, el término “proteína FATB mutante” engloba tanto una proteína codificada por una secuencia de ácidos nucleicos mutante (“alelo fatB”) por la cual la mutación produce una actividad enzimática de FATB significativamente
reducida y/o sin ella in vivo, en comparación con la actividad de la proteína codificada por la secuencia no mutante (“alelo FATB”).
“Mutagénesis”, como se usa en el presente documento, se refiere al proceso en el que células vegetales (por
5 ejemplo, una semilla de Brassica o tejidos, tales como polen, etc.) se ponen en contacto una o más veces con un agente mutagénico, tal como una sustancia química (tal como etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea (ENU), etc.) o radiación ionizante (neutrones (tales como en mutagénesis de neutrones rápidos, etc.), rayos gamma (tales como los suministrados por una fuente de cobalto 60), rayos X, etc.), o una combinación de los anteriores. Aunque las mutaciones creadas por irradiación son frecuentemente deleciones grandes u otras lesiones macroscópicas tales como translocalizaciones o transposiciones complejas, mutaciones creadas por mutágenos químicos son frecuentemente lesiones más discretas tales como mutaciones puntuales. Por ejemplo, EMS alquila bases de guanina, que producen el desapareamiento erróneo de bases: una guanina alquilada se apareará con una base de timina, dando principalmente transiciones G/C a A/T. Tras la mutagénesis, plantas de Brassica se regeneran a partir de las células tratadas usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de Brassica resultantes pueden
15 sembrarse según procedimientos de cultivo convencionales y tras la auto-polinización se forma semilla sobre las plantas. Alternativamente, pueden extraerse plántulas haploides dobles para formar inmediatamente plantas homocigóticas. Semilla adicional que se forma como resultado de tal auto-polinización en la presente generación o una posterior puede recogerse y cribarse para la presencia de alelos FATB mutantes. Se conocen varias técnicas para cribar alelos mutantes específicos, por ejemplo, Deleteagene ™ (Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235242) usa ensayos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cribar mutantes de deleción generados por mutagénesis de neutrones rápidos, TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457) identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS, etc. Técnicas adicionales para cribar la presencia de alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos más adelante.
25 El término “ortólogo” de un gen o proteína se refiere en el presente documento al gen o proteína homóloga encontrada en otras especies, que tiene la misma función que el gen o proteína, pero (normalmente) se desvía en secuencia del momento de tiempo en el que las especies que alojan los genes se desviaron (es decir, los genes se desarrollaron de un ancestro común por especiación). Ortólogos de los genes FATB de Brassica napus pueden así identificarse en otras especies de plantas (por ejemplo, Brassica juncea, etc.) basándose en ambas comparaciones de secuencias (por ejemplo, basándose en porcentajes de identidad de secuencias sobre la secuencia entera o sobre dominios específicos) y/o análisis funcional.
Se usa una “variedad” en el presente documento en conformidad con el Convenio de la UPOV y se refiere a una agrupación de plantas dentro de un único taxón botánico del rango más bajo conocido, agrupación que puede
35 definirse por la expresión de las características resultantes de un genotipo dado o combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otra agrupación de plantas por la expresión de al menos una de dichas características y se considera una unidad con respecto a su idoneidad para ser propagadas sin cambiar (estables).
El término “que comprende” debe interpretarse como que especifica la presencia de las partes, etapas o componentes establecidos, pero no excluye la presencia de una o más partes, etapas o componentes adicionales. Una planta que comprende un cierto rasgo puede así comprender rasgos adicionales.
Se entiende que cuando se refiere a una palabra en singular (por ejemplo, planta o raíz), el plural también se incluye en el presente documento (por ejemplo, una pluralidad de plantas, una pluralidad de raíces). Así, referencia a un 45 elemento por el artículo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Así, el artículo indefinido “un”
o “una” normalmente significa “al menos uno”.
Para el propósito de la presente invención, la “identidad de secuencias” de dos secuencias de nucleótido o de aminoácidos relacionados, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias óptimamente alineadas que tienen residuos idénticos (x100) dividido entre el número de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posición en un alineamiento en el que un residuo está presente en una secuencia, pero no en la otra, se considera una posición con residuos no idénticos. El “alineamiento óptimo” de dos secuencias se encuentra alineando las dos secuencias sobre la longitud entera según el algoritmo de alineamiento global de Needleman y
55 Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) en The European Biology Molecular Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; véase, por ejemplo, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) usando parámetros por defecto (penalización por abertura de hueco = 10 (para nucleótidos) / 10 (para proteínas) y penalización por extensión de hueco = 0,5 (para nucleótidos) / 0,5 (para proteínas)). Para nucleótidos la matriz de puntuación por defecto usada es EDNAFULL y para proteínas la matriz de puntuación por defecto es EBLOSUM62.
“Sustancialmente idéntico” o “esencialmente similar”, como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias, que, cuando se alinean óptimamente como se ha definido anteriormente, comparten al menos un cierto porcentaje de identidad de secuencias mínimo (como se define adicionalmente más adelante).
65 Pueden usarse “condiciones de hibridación rigurosas” para identificar secuencias de nucleótidos, que son
sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos dada. Condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5 ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la
5 secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente apareada. Normalmente se elegirán condiciones rigurosas a las que la concentración de sales sea aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea al menos 60 ºC. Reduciendo la concentración de sales y/o aumentando la temperatura aumenta rigurosidad. Condiciones rigurosas para hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern usando una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, aquellas que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63 ºC durante 20 min, o condiciones equivalentes.
Pueden proporcionarse “condiciones de alta rigurosidad”, por ejemplo, por hibridación a 65 ºC en una disolución acuosa que contiene 6x SSC (20x SSC contiene NaCl 3,0 M, citrato de Na 0,3 M, pH 7,0), 5x Denhardt's (100X Denhardt contiene 2 % de Ficoll, 2 % de polivinilpirrolidona, 2 % de albúmina de suero bovino), 0,5 % de
15 dodecilsulfato de sodio (SDS) y 20 µg/ml de ADN de portador desnaturalizado (ADN de esperma de pescado monocatenario, con una longitud promedio de 120 -3000 nucleótidos) como competidor no específico. Tras la hibridación, puede hacerse lavado de alta rigurosidad en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente 30 min) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1 x SSC, 0,1 % de SDS.
“Condiciones de rigurosidad reducida” se refieren a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución anteriormente descrita pero a aproximadamente 60-62 ºC. Puede hacerse lavado de rigurosidad moderada a la temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1 % de SDS.
“Baja rigurosidad” se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución anteriormente descrita a
25 aproximadamente 50-52 ºC. Puede hacerse lavado de baja rigurosidad a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1 % de SDS. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).
Se encontró por los inventores que Brassica napus (genoma AACC, 2n=4x=38), que es una especie alotetraploide (anfidiploide) que contiene esencialmente dos genomas diploides (el genoma A y C) debido a su origen de ancestros diploides, comprende un total de seis loci FATB y genes FATB en su genoma, tres genes sobre el genoma A (denominado en el presente documento “FATB-A1”, “FATB-A2” y “FATB-A3”) y tres genes sobre el genoma C (denominado en el presente documento “FATB-C1”, “FATB-C2” y “FATB-C3”). El gen FATB-A1 se dice que es
35 “homeólogo” al gen FATB-C1, FATB-A2 es homeólogo a FATB-C2 y FATB-A3 es homeólogo a FATB-C3, es decir, los “genes A” se encuentran sobre el genoma A y se originan a partir de B. rapa de ancestro diploide (AA), mientras que los “genes C” se encuentran sobre el genoma C de B. napus y se originan a partir de B. oleracea de ancestro diploide (CC).
Como en cualquier genoma diploide, pueden estar presentes dos “alelos” para cada gen FATB en cada locus FATB en el genoma (siendo un alelo la secuencia génica encontrada sobre un cromosoma y el otro sobre el cromosoma homólogo). La secuencia de nucleótidos de estos dos alelos puede ser idéntica (homocigótica) o diferente (heterocigótica) en cualquier planta dada, aunque el número de diferentes alelos posibles que existen para cada gen FATB puede ser mucho mayor de dos en las especies en conjunto.
45 Además, se encontró que las plantas que comprenden una mutación, que producen una reducción significativa en la cantidad de proteína FATB funcional codificada por el equivalente no mutante del alelo fatB mutante, en solo uno o dos de estos seis genes FATB, no es suficiente para reducir significativamente el porcentaje (% en peso) de ácidos grasos saturados en el aceite de semillas de las plantas. Se creyó que al menos tres alelos fatB mutantes, de tres genes FATB diferentes (seleccionados de FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3) necesitan estar comprendidos en la planta con el fin de obtener plantas que producen un aceite de semillas bajo en saturados
o sin saturados.
Así, en una realización de la invención, en el presente documento se proporcionan plantas que comprenden al
55 menos 3 alelos fatB mutantes de tres genes FATB diferentes, por lo que los alelos fatB mutantes producen una cantidad significativamente reducida de proteína FATB funcional del tipo codificado por el equivalente no mutante de estos alelos mutantes y así una cantidad significativamente reducida global de las proteínas FATB funcionales producidas en las células vegetales, específicamente en las semillas en desarrollo, in vivo.
Combinando copias suficientes de alelos fatB mutantes específicos con copias suficientes de alelos FATB no mutantes específicos en una planta es posible ajustar la cantidad y/o tipo de proteínas FATB funcionales preparadas, que a su vez influye en la exportación de (la cantidad y/o tipo de) ácidos grasos saturados libres del plástido y así la composición de ácidos grasos del aceite de semillas producido. La cantidad absoluta y relativa de cada una de las seis proteínas FATB puede así ajustarse de tal forma que proporcione plantas que producen 65 suficiente(s) proteína(s) FATB para el crecimiento y desarrollo de la planta, mientras que la cantidad deseada y/o tipo de ácidos grasos se prepara y guarda en el aceite de semillas de estas plantas. Así, son adecuadas para la
invención plantas y partes de las plantas que comprenden al menos un alelo FATB funcionalmente expresado, seleccionado de FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3, que codifica una proteína FATB completamente funcional, mientras que los restantes alelos pueden ser alelos fatB mutantes.
5 Así, las plantas o partes de las plantas pueden comprender alelos fatB mutantes n-tuples (de los 6 genes FATB), por lo que n ≤ 12, preferentemente n ≤ 11 (por ejemplo n = 10, 9 u 8), de manera que al menos un alelo produce una proteína FATB funcional.
Son adecuadas para la invención plantas mutantes triples para FATB homocigóticas (n=6, es decir, homocigóticas para alelos mutantes de tres genes, seleccionados de los 6 genes FATB), mutantes cuádruples para FATB homocigóticas (n=8) y/o mutantes quíntuples para FATB homocigóticas (n=10) o partes de las plantas, por lo que los alelos mutantes están seleccionados de los genes FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3.
También son adecuadas para la invención plantas mutantes triples para FATB homocigóticas, en las que el genotipo 15 de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
25 -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
35 -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
También son adecuadas para la invención plantas mutantes cuádruples para FATB homocigóticas, en las que el genotipo de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
45 -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o
55 -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
También son adecuadas para la invención plantas mutantes quíntuples para FATB homocigóticas, en las que el genotipo de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o
65 -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
Además, las plantas mutantes triples (n=6), cuádruples (n=8) y/o quíntuples (n=10) para FATB homocigóticas o partes de las plantas pueden comprender otro alelo mutante, en las que las plantas mutantes o partes de las plantas son heterocigóticas para el mutante adicional.
5 Alelo FATB (es decir, n=7, n=9 y n=11, respectivamente), y en el que el alelo mutante está seleccionado de los genes FATB no mutantes restantes (es decir, genes FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 o FATB-C3).
Así, también son adecuadas para la invención plantas mutantes triples para FATB homocigóticas que comprenden un alelo FATB mutante adicional, en las que el genotipo de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3,
15 -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, FATB-C1FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3,
25 -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
35 -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3,
45 -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3lfatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3lfatB-c3,
55 -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3lfatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2lfatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2lFATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3lfatB-c3,
65 -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2lFATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
-FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o
5 -FATB-A1lFATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3lfatB-c3.
También son adecuadas para la invención plantas mutantes cuádruples para FATB homocigóticas que comprenden un alelo FATB mutante adicional, en las que el genotipo de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
15 -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
25 -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
35 -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o -FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
También son adecuadas para la invención plantas mutantes quíntuples para FATB homocigóticas que comprenden un alelo FATB mutante adicional, en las que el genotipo de la planta puede describirse como:
-fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/fatB-c3,
45 -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, -fatB-a1/fatB-a1, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3, o -fatB-a1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB-c1/fatB-c1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
En el presente documento se describen adicionalmente secuencias de ácidos nucleicos de genes/alelos FATB no mutantes y mutantes de especies de Brassica, además de las proteínas FATB no mutantes y mutantes. También se describen métodos de generación y combinación de alelos FATB mutantes y no mutantes en plantas de Brassica, además de plantas de Brassica y partes de las plantas que comprenden combinaciones específicas de alelos FATB
55 no mutantes y mutantes en su genoma, por lo que estas plantas producen aceite de semillas bajo en saturados o sin saturados, y por lo que las plantas crecen preferentemente normalmente y tienen un fenotipo normal. El uso de estas plantas para transferir alelos FATB mutantes a otras plantas también se describe en el presente documento, ya que son productos de planta de cualquiera de las plantas descritas. Además, se describen kits y métodos para la selección asistida por marcadores (MAS) para combinar o detectar genes y/o alelos FATB. Cada una de las realizaciones de la invención se describe en detalle en el presente documento a continuación.
Secuencias de ácidos nucleicos
Se describen tanto secuencias de ácidos nucleicos no mutantes (FATB), que codifican proteínas FATB funcionales,
65 como secuencias de ácidos nucleicos mutantes (fatB) (que comprenden una o más mutaciones, preferentemente mutaciones que producen una actividad biológica significativamente reducida de la proteína FATB codificada o que
no producen proteína FATB) de genes FATB de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivos de Brassica. Por ejemplo, especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C pueden comprender diferentes alelos de genes FATB-A o FATB-C que pueden identificarse y combinarse en una única planta según la invención. Además, pueden usarse métodos de mutagénesis para generar mutaciones en 5 alelos FATB no mutantes, generando así alelos mutantes para su uso según la invención. Debido a que los alelos FATB específicos se combinan preferentemente en una planta de Brassica napus por cruce y selección, en una realización las secuencias de ácidos nucleicos de FATB y/o fatB se proporcionan dentro de una planta de Brassica (es decir, endógenamente) que puede cruzarse con Brassica napus o que puede usarse para preparar una planta de Brassica napus “sintética”. Se describe en la materia hibridación entre diferentes especies de Brassica, por ejemplo, como se refiere en Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). La hibridación interespecífica puede, por ejemplo, usarse para transferir genes de, por ejemplo, el genoma C en B. napus (AACC) al genoma C en B. carinata (BBCC), o incluso de, por ejemplo, el genoma C en B. napus (AACC) al genoma B en B. juncea (AABB) (por el evento esporádico de recombinación ilegítima entre sus genomas C y B). Pueden producirse líneas de Brassica napus “resintetizadas” o “sintéticas” cruzando los ancestros originales, B. oleracea (CC) y B. rapa (AA). Pueden
15 vencerse satisfactoriamente barreras de incompatibilidad interespecíficas, y también intergenéricas, en cruces entre especies de cultivo de Brassica y sus familiares, por ejemplo, por técnicas de rescate de embriones o fusión de protoplastos (véase, por ejemplo, Snowdon, anteriormente).
Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos de FATB y fatB aisladas (por ejemplo, aisladas de la planta clonando o hechas sintéticamente por síntesis de ADN), además de variantes de las mismas y fragmentos de cualquiera de éstas, también se describen en el presente documento, ya que éstas pueden usarse para determinar qué secuencia está presente endógenamente en una planta o parte de la planta, si la secuencia codifica una proteína funcional o una proteína con significativamente funcionalidad reducida o sin funcionalidad (por ejemplo, por expresión en una célula huésped recombinante y ensayos enzimáticos) y para la selección y transferencia de alelos
25 específicos de una planta de Brassica a otra, con el fin de generar una planta que tiene la combinación deseada de alelos funcionales y mutantes.
Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3 han sido aisladas de colza oleaginosa de invierno (WOSR) y colza oleaginosa de verano (SOSR) de Brassica napus, como se representa en el listado de secuencias. Se representan las secuencias de FATB no mutantes, mientras que las secuencias de fatB mutantes de estas secuencias, y de secuencias esencialmente similares a éstas, se describen en el presente documento más adelante y en los ejemplos, con referencia a las secuencias de FATB no mutantes. El ADN que codifica la proteína FATB genómica, y pre-ARNm correspondiente, comprende 5 exones (numerados los exones 1-5 a partir del extremo 5') interrumpidos por 4 intrones (numerados los intrones 1-4, a partir del extremo 5').
35 En el ADNc y ARNm procesado correspondiente (es decir, el ARN cortado y empalmado), se eliminan los intrones y se unen los exones, como se representa en el listado de secuencias. Las secuencias de exones están más conservadas evolutivamente y son, por tanto, menos variables que las secuencias de intrones.
“Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-A1” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-A1” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 2 (FATB-A1 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 14 (FATB-A1 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de
45 secuencias con SEC ID Nº: 1 (FATB-A1 de WOSR) cuando se alinean con o sin los intrones 1-4 y/o con SEC ID Nº: 13 (FATB-A1 de SOSR) cuando se alinean con o sin los intrones 1-4. También puede denominarse que estas secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-A2” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-A2” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 4 (FATB-A2 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 16 (FATB-A2 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos el
55 80 %, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 3 (FATB-A2 de WOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4 y/o SEC ID Nº: 15 (FATB-A2 de SOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4. También puede denominarse que estas secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-A3” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-A3” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 6 (FATB-A3 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 18 (FATB-A3 65 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de
secuencias con SEC ID Nº: 5 (FATB-A3 de WOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4 y/o SEC ID Nº: 17 (FATB-A3 de SOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4. También puede denominarse que estas secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
5 “Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-C1” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-C1” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 8 (FATB-C1 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 20 (FATB-C1 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 7 (FATB-C1 de WOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4 y/o con SEC ID Nº: 19 (FATB-C1 de SOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4. También puede denominarse que estas secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB
15 proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-C2” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-C2” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 10 (FATB-C2 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 22 (FATB-C2 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90%, al menos el 95%, 96 %, 97%, 98 %, 99% o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 9 (FATB-C2 de WOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4 y/o SEC ID Nº: 21 (FATB-C2 de SOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4. También puede denominarse que estas
25 secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de ácidos nucleicos de FATB-C3” o “secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB-C3” según la invención son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 12 (FATB-C3 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 24 (FATB-C3 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos al menos el 80 %, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 11 (FATB-C3 de WOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4 y/o
35 SEC ID Nº: 23 (FATB-C3 de SOSR) cuando se alinean con o sin intrones los 1-4. También puede denominarse que estas secuencias de ácidos nucleicos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
Así, se describen tanto secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3 funcionales no mutantes que incluye variantes y fragmentos de las mismas (como se define adicionalmente más adelante), además de secuencias de ácidos nucleicos mutantes de cualquiera de estas, por lo que la mutación en la secuencia de ácidos nucleicos produce preferentemente uno o más aminoácidos que se insertan, delecionan o sustituyen en comparación con la proteína natural. Preferentemente, la(s) mutación (mutaciones) en la secuencia de ácidos nucleicos producen uno o más cambios de aminoácidos (es decir, en
45 relación con la secuencia de aminoácidos no mutante, uno o más aminoácidos se insertan, delecionan y/o sustituyen), por lo que la actividad biológica de la proteína FATB se reduce significativamente. Una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína FATB mutante se refiere a una reducción en la actividad enzimática (es decir, en la actividad de acil ACP-tioesterasa) de al menos el 30 %, al menos el 40 %, 50 % o más, al menos el 90 % o el 100 % (sin actividad biológica) en comparación con la actividad de la proteína natural.
Se describen tanto secuencias de ácidos nucleicos endógenas como aisladas en el presente documento. También se describen fragmentos de las secuencias de FATB y secuencias de ácidos nucleicos de variantes de FATB definidas anteriormente, para su uso como cebadores o sondas y como componentes de kits (véase adicionalmente más adelante). Un “fragmento” de una secuencia de ácidos nucleicos de FATB o fatB o variante de la misma (como
55 se define) puede ser de diversas longitudes, tales como al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 nucleótidos contiguos de la secuencia de FATB o fatB (o de la secuencia de variante).
Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FATB funcionales
Las secuencias de ácidos nucleicos representadas en el listado de secuencias codifican proteínas FATB funcionales no mutantes de Brassica napus. Así, estas secuencias son endógenas para las plantas WOSR y SOSR de las que se aislaron. Otras especies de cultivos de Brassica, variedades, líneas de cultivo o accesiones silvestres pueden cribarse para otros alelos FATB, que codifican las mismas proteínas FATB o variantes de las mismas. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, transferencia Southern, usando, por 65 ejemplo, condiciones de hibridación rigurosas) o técnicas basadas en PCR para identificar alelos FATB endógenos a otras plantas de Brassica, tales como diversas variedades, líneas o accesiones de Brassica napus, pero también
Brassica juncea (especialmente alelos FATB sobre el genoma A), Brassica carinata (especialmente alelos FATB sobre el genoma C) y pueden cribarse plantas y tejidos de Brassica rapa (genoma A) y Brassica oleracea (genoma C) para otros alelos FATB no mutantes. Para cribar tales plantas o tejido de plantas para la presencia de alelos FATB pueden usarse las secuencias de ácidos nucleicos de FATB proporcionadas en el listado de secuencias, o
5 variantes o fragmentos de cualquiera de estas. Por ejemplo, pueden usarse secuencias completas o fragmentos como sondas o cebadores. Por ejemplo, pueden usarse cebadores específicos o degenerados para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FATB a partir del ADN genómico de la planta o tejido de planta. Estas secuencias de ácidos nucleicos de FATB pueden aislarse y secuenciarse usando técnicas de biología molecular estándar. Entonces pueden usarse análisis de bioinformática para caracterizar el (los) alelo(s), por ejemplo, con el fin de determinar con qué alelo FATB se corresponde la secuencia y qué proteína FATB o variante de proteína está codificada por la secuencia.
Si una secuencia de ácidos nucleicos codifica o no una proteína FATB funcional puede analizarse por técnicas de ADN recombinante como se conocen en la técnica, por ejemplo, expresando la molécula de ácido nucleico en una
15 célula huésped (por ejemplo, una bacteria, tal como E. coli) y analizando la actividad de acil-ACP tioesterasa y/o especificidad por sustrato de la proteína resultante o células. Por ejemplo, la hidrólisis de acil graso-ACP después de la expresión recombinante en E. coli se describe por Doermann et al., 2000 (Plant Physiology 123: 637-643) y Doermann et al. 1995 (Arch Biochem Biophys 316: 612 -618), por Yuan et al. (1995, PNAS Vol 92: 10639-10643), por Salas y Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34) y por Mayer y Shanklin (2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11). Por tanto, ensayos para la hidrólisis de acil graso-ACP usando homogeneizados de tejido de planta en bruto se han descrito por Eccleston y Ohlrogge (para la hidrólisis de C12:0-y C18:1-ACP; 1998, Plant cell 10: 613-622), por Salas y Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34) y por Bonaventure et al. (para la hidrólisis de C16:0-ACP y C18:1-ACP; 2003, Plant cell 15:1020-1033).
25 Además, se entiende que las secuencias de ácidos nucleicos de FATB y variantes de las mismas (o fragmentos de cualquiera de estas) pueden identificarse por ordenador, cribando bases de datos de ácidos nucleicos para secuencias esencialmente similares. Asimismo, una secuencia de ácidos nucleicos puede sintetizarse químicamente. También se describen fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos adicionalmente más adelante. Los fragmentos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican solo la proteína madura, o fragmentos más pequeños que comprenden toda o parte de las secuencias de exones y/o de intrones, etc.
Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas FATB mutantes
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una o más deleciones, inserciones o sustituciones de
35 nucleótidos con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos no mutantes también son adecuadas para la invención, ya que son fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos mutantes. Tales secuencias de ácidos nucleicos mutantes (denominadas secuencias de fatB) pueden generarse y/o identificarse usando diversos métodos conocidos, como se describen adicionalmente más adelante. De nuevo, tales moléculas de ácidos nucleicos se describen tanto en forma endógena como en forma aislada. La(s) mutación (mutaciones) puede(n) producir uno o más cambios (deleciones, inserciones y/o sustituciones) en la secuencia de aminoácidos de la proteína FATB codificada (es decir, no es una “mutación silenciosa”). La(s) mutación (mutaciones) en la secuencia de ácidos nucleicos también puede(n) producir una actividad biológica significativamente reducida o completamente suprimida de la proteína FATB codificada con respecto a la proteína natural.
45 Las moléculas de ácidos nucleicos pueden así comprender una o más mutaciones, tales como:
- (a)
- una “mutación de aminoácido”, que es un cambio en la secuencia de ácidos nucleicos que produce la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido;
- (b)
- una “mutación terminadora” o “mutación de codón de terminación”, que es un cambio en la secuencia de ácidos nucleicos que produce la introducción de un codón de terminación prematuro y así la terminación de la traducción (produciendo una proteína truncada); genes de planta contienen los codones de terminación de la traducción “TGA” (UGA en ARN), “TAA” (UAA en ARN) y “TAG” (UAG en ARN); así, cualquier sustitución, inserción, deleción de nucleótido que haga que uno de estos codones esté en el ARNm maduro que se traduce (en el marco de lectura) terminará la traducción.
55 (c) una “mutación de inserción” de uno o más aminoácidos, debido a uno o más codones que se han añadido a la secuencia codificante del ácido nucleico;
- (d)
- una “mutación de deleción” de uno o más aminoácidos, debido a uno o más codones que se han delecionado en la secuencia codificante del ácido nucleico;
- (e)
- una “mutación de desplazamiento de marco”, que hace que la secuencia de ácidos nucleicos se traduzca en un marco diferente en la dirección 3' de la mutación. Una mutación de desplazamiento de marco puede tener diversas causas, tales como la inserción, deleción o duplicación de uno o más nucleótidos, pero también mutaciones que afectan el corte y empalme de pre-ARNm (mutaciones del sitio de corte y empalme) pueden producir desplazamientos de marco;
- (f)
- una “mutación del sitio de corte y empalme”, que altera o suprime el corte y empalme correcto de la
65 secuencia de pre-ARNm, produciendo una proteína de secuencia de aminoácidos diferente de la no mutante. Por ejemplo, pueden saltarse uno o más exones durante el corte y empalme del ARN, produciendo una
proteína que carece de los aminoácidos codificados por los exones saltados. Alternativamente, el marco de lectura puede alterarse mediante el corte y empalme incorrecto, o uno o más intrones pueden retenerse, o pueden generarse donantes o aceptores de corte y empalme alternativos, o puede iniciarse el corte y empalme en una posición alternativa (por ejemplo, dentro de un intrón), o pueden generarse señales de poliadenilación 5 alternativas. El corte y empalme de pre-ARNm correcto es un proceso complejo, que puede afectarse por diversas mutaciones en la secuencia de nucleótidos del gen que codifica FATB. En eucariotas superiores, tales como plantas, el principal espliceosoma corta y empalma intrones que contienen GU en el sitio de corte y empalme de 5' (sitio donante) y AG en el sitio de corte y empalme de 3' (sitio aceptor). Esta regla de GU-AG (o regla de GT-AG; véase Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp885-920, ISBN 0198577788) se
10 sigue en aproximadamente el 99 % de los sitios de corte y empalme de genes eucariotas nucleares, mientras que los intrones que contienen otros dinucleótidos en el sitio de corte y empalme de 5' y 3', tal como GC-AG y AU-AC, explican solo aproximadamente el 1 % y el 0,1 %, respectivamente.
Como ya se ha mencionado, se desea que la(s) mutación (mutaciones) en la secuencia de ácidos nucleicos 15 produzca(n) preferentemente una proteína mutante que comprende actividad enzimática significativamente reducida
o ninguna in vivo. Básicamente, cualquier mutación que produzca una proteína que comprende al menos una inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido con respecto a la proteína natural puede conducir a actividad enzimática significativamente reducida o ninguna. Sin embargo, se entiende que es más probable que las mutaciones en ciertas partes de la proteína produzcan una función reducida de la proteína FATB mutante, tal como
20 mutaciones que conducen a proteínas truncadas, por lo que carecen de porciones significativas de los dominios funcionales, tales como el dominio catalítico.
Las proteínas FATB de Brassica descritas en el presente documento tienen aproximadamente 412 -424 aminoácidos de longitud y comprenden varios dominios estructurales (y funcionales). Éstos incluyen los siguientes: 25 un péptido diana de plástido del extremo N de aproximadamente 60 aminoácidos seguido de una región hidrófoba de aproximadamente 18 aminoácidos (propuesta para formar un anclaje transmembranario helicoidal). Esta parte del extremo N de aproximadamente 90 aminoácidos en total va seguida de lo que constituye la proteína FATB madura (que empieza con los aminoácidos del extremo N LPDWSM). Contiene una repetición en tándem de un dominio en hélice/de hoja de 4 cadenas (dominio “HEEEE” o “4HBT”, también “motivo de perrito caliente”) separado de una 30 región de conector (Mayer y Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627). El primer dominio en hélice/de hoja de 4 cadenas (del extremo N) (que está codificada por una parte de exón 1, el exón 2 y 3 complejos y una parte del exón 4) comprende residuos de aminoácidos que se cree que afectan la especificidad por sustrato, en particular dos metioninas conservadas (Met o M), una lisina conservada (Lys o K), una valina conservada (Val o V) y una serina conservada (Ser o S) (Mayer y Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11) y el segundo dominio en hélice/de hoja 35 de 4 cadenas (del extremo C) (ampliamente codificado por el exón 5) comprende residuos de aminoácidos catalíticos, en particular una tríada catalítica tipo papaína de una asparagina conservada (Asn o N), un residuo de histidina conservado (His o H) y una cisteína conservada (Cys o C). La tríada catalítica se localiza dentro del segundo dominio en hélice/de hoja de 4 cadenas, codificado por el exón 5 de la proteína. El segundo dominio de HEEEE comprende además residuos de aminoácidos que se cree que afectan la especificidad por sustrato, en
40 particular un triptófano conservado (Trp o W) (Mayer y Shanklin, 2007, arriba).
Tabla 1a: Proteínas FATB de WOSR -aminoácidos (aa) regiones y posiciones
- FATB-A1 SEC ID: 2
- FATB-A2 SEC ID: 4 FATB-A3 SEC ID: 6 FATB-C1 SEC ID: 8 FATB-C2 SEC ID: 10 FATB-C3 SEC ID: 12 AtFATB SEC ID: 80
- Tamaño de proteína (aa)
- 414 424 415 412 415 415 412
- Extremo N
- 1-90 1-90 1-91 1-88 1-90 1-91 1-88
- Proteína madura
- 91-414 91-424 92-415 89-412 91-415 92-415 89-412
- aa codificados por el exón 1
- 1-168 1-168 1-169 1-166 1-168 1-169 1-166
- aa codificados por el exón 2
- 169-213 169-213 170-214 167-211 169-213 170-214 167-211
- aa codificados por el exón 3
- 214-251 214-251 215-252 212-249 214-251 215-252 212-249
- aa codificados por el exón 4
- 252-308 252-308 253-309 250-306 252-308 253-309 250-306
- aa codificados por el exón 5
- 309-414 309-424 310-415 307-412 309-415 310-415 207-412
- 4HBT
- 140-277 140-277 141-278 138-275 140-277 141-278 138-275
- conector
- 278-302 278-302 279-303 276-300 278-302 279-303 276-300
- 4HBT
- 303-407 303-407 304-408 301-405 303-407 304-408 301-405
- FATB-A1 SEC ID: 2
- FATB-A2 SEC ID: 4 FATB-A3 SEC ID: 6 FATB-C1 SEC ID: 8 FATB-C2 SEC ID: 10 FATB-C3 SEC ID: 12 AtFATB SEC ID: 80
- Conservados Met (M) Lys (K)
- 164 176 164 176 165 177 162 174 164 176 165 177 162 174
- Val (V) Met (M) Ser (S) Trp (W) Asn (N) His (H) Cys (C)
- 200 231 264 311 317 319 354 200 231 264 311 317 319 354 201 232 265 312 318 320 355 198 229 262 309 315 317 352 200 231 264 311 317 319 354 201 232 265 312 318 320 355 198 229 262 309 315 317 352
Tabla 1b: Proteínas FATB de SOSR -aminoácido (aa) regiones y posiciones
- FATB-A1 SEC ID: 14
- FATB-A2 SEC ID: 16 FATB-A3 SEC ID: 18 FATB-C1 SEC ID: 20 FATB-C2 SEC ID: 22 FATB-C3 SEC ID: 24
- Tamaño de proteína (aa)
- 413 415 415 412 415 415
- Extremo N
- 1-89 1-90 1-91 1-88 1-90 1-91
- Proteína madura
- 90-413 91-415 92-415 89-412 91-415 92-415
- aa codificados por el exón 1
- 1-167 1-168 1-169 1-166 1-168 1-169
- aa codificados por el exón 2
- 168-212 169-213 170-214 167-211 169-213 170-214
- aa codificados por el exón 3
- 213-250 214-251 215-252 212-249 214-251 215-252
- aa codificados por el exón 4
- 251-307 252-308 253-309 250-306 252-308 253-309
- aa codificados por el exón 5
- 308-413 309-415 310-415 307-412 309-415 310-415
- 4HBT
- 139-276 140-277 141-278 138-275 140-277 141-278
- Conector
- 277-301 278-302 279-303 276-300 278-302 279-303
- 4HBT
- 302-406 303-407 304-408 301-405 303-407 304-408
- Conservados Met (M) Lys (K) Val (V) Met (M) Ser (S) Trp (W) Asn (N) His (H) Cys (C)
- 163 175 199 230 263 310 316 318 353 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355 162 174 198 229 262 309 315 317 352 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355
Así, se describen secuencias de ácidos nucleicos que comprenden uno o más de cualquiera de los tipos de 5 mutaciones descritos anteriormente. Además, se describen secuencias de fatB que comprenden unas o más mutaciones de deleción, una o más mutaciones del codón de terminación (terminadoras) y/o una o más mutaciones del sitio de corte y empalme. Cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos mutantes anteriores se describen por sí mismas (en forma aislada). Plantas y partes de las plantas que comprenden tales secuencias endógenamente se proporcionan en el presente documento. 10 Una mutación de deleción en un alelo FATB, como se usa en el presente documento, es una mutación en un alelo FATB por la cual al menos 1, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 500, 1000 o más bases se delecionan del alelo FATB no mutante correspondiente, y por la cual la deleción hace que el alelo FATB mutante se transcriba y traduzca en una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene in vivo. Una deleción 15 puede conducir a un desplazamiento del marco y/o puede introducir un codón de terminación prematuro, o puede conducir a que se eliminen un aminoácido o más aminoácidos (por ejemplo, grandes partes) de la secuencia codificante, etc. La base molecular subyacente exacta por la que la deleción produce una proteína mutante que tiene actividad biológica significativamente reducida no es importante. También son adecuadas plantas y partes de las plantas en las que alelos FATB específicos se delecionan completamente, es decir, plantas y partes de las plantas 20 que carecen de uno o más alelos FATB.
Una mutación terminadora en un alelo FATB, como se usa en el presente documento, es una mutación en un alelo
FATB por la cual uno o más codones de terminación de la traducción se introducen en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del alelo FATB no mutante correspondiente. Codones de terminación de la traducción son TGA (UGA en el ARNm), TAA (UAA) y TAG (UAG). Así, cualquier mutación (deleción, inserción o sustitución) que conduzca a la generación de un codón de terminación en marco en la secuencia codificante 5 (secuencia de exones) producirá la terminación de la traducción y truncación de la cadena de aminoácidos. Un alelo FATB mutante que comprende una mutación terminadora puede ser un alelo FATB en el que un codón de terminación en marco se introduce en la secuencia de codones de FATB por una única sustitución de nucleótidos, tal como la mutación de CAG a TAG, TGG a TAG, TGG a TGA, o CGA a TGA. Un alelo FATB mutante que comprende una mutación terminadora puede ser un alelo FATB en el que un codón de terminación en marco se introduce en la 10 secuencia de codones de FATB por dobles sustituciones de nucleótidos, tales como la mutación de CAG a TAA, TGG a TAA, CGG a TAG o TGA, CGA a TAA. Un alelo FATB mutante que comprende una mutación terminadora también puede ser un alelo FATB en el que un codón de terminación en marco se introduce en la secuencia de codones de FATB por triples sustituciones de nucleótidos, tales como la mutación de CGG a TAA. La proteína truncada carece de los aminoácidos codificados por el ADN codificante en la dirección 3' de la mutación (es decir, la 15 parte del extremo C de la proteína FATB) y mantiene los aminoácidos codificados por el ADN codificante en la dirección 5' de la mutación (es decir, la parte del extremo N de la proteína FATB). La mutación terminadora puede estar presente en cualquier parte delante del residuo de Cys conservado de la tríada catalítica, de manera que al menos el residuo de Cys conservado esté ausente, produciendo actividad significativamente reducida de la proteína truncada. Cuanto más truncada esté la proteína mutante en comparación con la proteína natural, más probable es 20 que carezca de cualquier actividad enzimática. Así, se describe un alelo FATB mutante que comprende una mutación terminadora que produce una proteína truncada inferior a 350 aminoácidos (que carece de la Cys conservada), inferior a 315 aminoácidos (que carece de los tres aminoácidos conservados de la tríada catalítica tipo papaína), inferior a 300 aminoácidos (que carece del segundo dominio de 4HBT), inferior a 262 aminoácidos (que carece de la Ser conservada), inferior a 229 aminoácidos (que carece de la segunda Met conservada), inferior a 198 25 aminoácidos (que carece de la Val conservada), inferior a 174 aminoácidos (que carece de la Lys conservada), inferior a 162 aminoácidos (que carece de la primera Met conservada), o incluso menos aminoácidos de longitud. La mutación terminadora puede producir uno o más exones que no se traducen en proteína, tales como el exón 5,
exones 4 y 5, los exones 3-5, o incluso más.
30 Las tablas en el presente documento a continuación describen un intervalo de posibles mutaciones terminadoras en las secuencias de Brassica napus descritas en el presente documento:
Tabla 2a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A1 (WOSR, SEC ID Nº: 1 y 2)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 53 157 cag → tag exón 1 157+159 cag → taa exón 1 79 235 cag → tag exón 1 235+237 cag → taa exón 1 90 268 cag → tag exón 1 268+270 cag → taa exón 1 94 281 tgg → tag exón 1 282 tgg → tga exón 1 281+282 tgg → taa exón 1 111 331 cag → tag exón 1 331+333 cag → taa exón 1 112 335 tgg → tag exón 1 336 tgg → tga exón 1 335+336 tgg → taa exón 1 117 350 tgg → tag exón 1 351 tgg → tga exón 1 350+351 tgg → taa exón 1 136 406 cag → tag exón 1 406+408 cag → taa exón 1 143 427 cag → tag exón 1 427+429 cag → taa exón 1 148 442+443 cgg → tag exón 1 442+444 cgg → tga exón 1 442+443+444 cgg → taa exón 1 168 502 cag → tag exón 1 502+504 cag → taa exón 2 198 678 tgg → tag exón 2 679 tgg → tga exón 2 678+679 tgg → taa exón 2 204 695 cag → tag exón 2 695+697 cag → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 2 213 723 tgg → tag
exón 3 798 tgg → tga
exón 2-3 723+798 tgg → taa
exón 3 222 824 tgg → tag
exón 3 825 tgg → tga
exón 3 824+825 tgg → taa
exón 3 225 832 cag → tag
exón 3 832+834 cag → taa
exón 3 235 863 tgg → tag
exón 3 864 tgg → tga
exón 3 863+864 tgg → taa
exón 3 238 871 cga → tga
exón 3 871+872 cga → taa
exón 4 253 986 tgg → tag
exón 4 987 tgg → tga
exón 4 986+987 tgg → taa
exón 4 271 1039 cga → tga
exón 4 1039+1040 cga → taa
exón 5 311 1250 tgg → tag
exón 5 1251 tgg → tga
exón 5 1250+1251 tgg → taa
exón 5 318 1270 cag → tag
exón 5 1270+1272 cag → taa
exón 5 328 1301 tgg → tag
exón 5 1302 tgg → tga
exón 5 1301+1302 tgg → taa
exón 5 341 1339 cag → tag
exón 5 1339+1341 cag → taa
exón 5 361 1399 cag → tag
exón 5 1399+1401 cag → taa
exón 5 383 1465 cag → tag
exón 5 1465+1467 cag → taa
exón 5 389 1483 cag → tag
exón 5 1483+1485 cag → taa
exón 5 401 1520 tgg → tag
exón 5 1521 tgg → tga
exón 5 1520+1521 tgg → taa
exón 5 410 1547 tgg → tag
exón 5 1548 tgg → tga
exón 5 1547+1548 tgg → taa
Tabla 2b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A1 (SOSR, SEC ID Nº: 13 y 14)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 53 157 cag → tag exón 1 157+159 cag → taa exón 1 78 232 cag → tag exón 1 232+234 cag → taa exón 1 89 265 cag → tag exón 1 265+267 cag → taa exón 1 93 278 tgg → tag exón 1 279 tgg → tga exón 1 278+279 tgg → taa exón 1 110 328 cag → tag exón 1 328+330 cag → taa exón 1 111 332 tgg → tag exón 1 333 tgg → tga exón 1 332+333 tgg → taa exón 1 116 347 tgg → tag exón 1 348 tgg → tga exón 1 347+348 tgg → taa exón 1 135 403 cag → tag exón 1 403+405 cag → taa exón 1 142 424 cag → tag exón 1 424+426 cag → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 1 147 439+440 cgg → tag
exón 1 439+441 cgg → tga
exón 1 439+440+441 cgg → taa
exón 1 167 499 cag → tag
exón 1 499+501 cag → taa
exón 2 197 675 tgg → tag
exón 2 676 tgg → tga
exón 2 675+676 tgg → taa
exón 2 203 692 cag → tag
exón 2 692+694 cag → taa
exón 2 212 720 tgg → tag
exón 3 795 tgg → tga
exón 2-3 720+795 tgg → taa
exón 3 221 821 tgg → tag
exón 3 822 tgg → tga
exón 3 821+822 tgg → taa
exón 3 224 829 cag → tag
exón 3 829+831 cag → taa
exón 3 234 860 tgg → tag
exón 3 861 tgg → tga
exón 3 860+861 tgg → taa
exón 3 237 868 cga → tga
exón 3 868+869 cga → taa
exón 4 252 983 tgg → tag
exón 4 984 tgg → tga
exón 4 983+984 tgg → taa
exón 4 270 1036 cga → tga
exón 4 1036+1037 cga → taa
exón 5 310 1247 tgg → tag
exón 5 1248 tgg → tga
exón 5 1247+1248 tgg → taa
exón 5 317 1267 cag → tag
exón 5 1267+1269 cag → taa
exón 5 327 1298 tgg → tag
exón 5 1299 tgg → tga
exón 5 1298+1299 tgg → taa
exón 5 340 1336 cag → tag
exón 5 1336+1338 cag → taa
exón 5 360 1396 cag → tag
exón 5 1396+1398 cag → taa
exón 5 382 1462 cag → tag
exón 5 1462+1464 cag → taa
exón 5 388 1480 cag → tag
exón 5 1480+1482 cag → taa
exón 5 400 1517 tgg → tag
exón 5 1518 tgg → tga
exón 5 1517+1518 tgg → taa
exón 5 409 1544 tgg → tag
exón 5 1545 tgg → tga
exón 5 1544+1545 tgg → taa
Tabla 3a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A2 (WOSR, SEC ID Nº: 3 y 4)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 cag → tag exón 1 235+237 cag → taa exón 1 90 268 cag → tag exón 1 268+270 cag → taa exón 1 94 281 tgg → tag exón 1 282 tgg → tga exón 1 281+282 tgg → taa exón 1 111 331 cag → tag exón 1 331+333 cag → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 1 112 335 tgg → tag exón 1 336 tgg → tga exón 1 335+336 tgg → taa exón 1 117 350 tgg → tag exón 1 351 tgg → tga exón 1 350+351 tgg → taa exón 1 136 406 cag → tag exón 1 406+408 cag → taa exón 1 143 427 cag → tag exón 1 427+429 cag → taa exón 1 168 502 cag → tag exón 1 502+504 cag → taa exón 2 198 672 tgg → tag exón 2 673 tgg → tga exón 2 672+673 tgg → taa exón 2 204 689 cag → tag exón 2 689+691 cag → taa exón 2 213 717 tgg → tag exón 3 812 tgg → tga exón 2-3 717+812 tgg → taa exón 3 222 838 tgg → tag exón 3 839 tgg → tga exón 3 838+839 tgg → taa exón 3 225 846 cag → tag exón 3 846+848 cag → taa exón 3 235 877 tgg → tag exón 3 878 tgg → tga exón 3 877+878 tgg → taa exón 3 238 885+886 cgg → tag exón 3 885+887 cgg → tga exón 3 885+886+887 cgg → taa exón 3 248 915 cga → tga exón 3 915+916 cga → taa exón 4 253 1064 tgg → tag exón 4 1065 tgg → tga exón 4 1064+1065 tgg → taa exón 4 271 1117 cga → tga exón 4 1117+1118 cga → taa exón 5 311 1316 tgg → tag exón 5 1317 tgg → tga exón 5 1316+1317 tgg → taa exón 5 318 1336 cag → tag exón 5 1336+1338 cag → taa exón 5 328 1367 tgg → tag exón 5 1368 tgg → tga exón 5 1367+1368 tgg → taa exón 5 341 1405 cag → tag exón 5 1405+1407 cag → taa exón 5 361 1465 cag → tag exón 5 1465+1467 cag → taa exón 5 383 1531 cag → tag exón 5 1531+1533 cag → taa exón 5 387 1543 cga → tga exón 5 1543+1544 cga → taa exón 5 389 1549 cag → tag exón 5 1549+1551 cag → taa exón 5 401 1586 tgg → tag exón 5 1587 tgg → tga exón 5 1586+1587 tgg → taa exón 5 404 1594 cag → tag exón 5 1594+1596 cag → taa exón 5 410 1613 tgg → tag exón 5 1614 tgg → tga exón 5 1613+1614 tgg → taa
Tabla 3b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A2 (SOSR, SEC ID Nº: 15 y 16)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 cag → tag exón 1 235+237 cag → taa exón 1 90 268 cag → tag exón 1 268+270 cag → taa exón 1 94 281 tgg → tag exón 1 282 tgg → tga exón 1 281+282 tgg → taa exón 1 111 331 cag → tag exón 1 331+333 cag → taa exón 1 112 335 tgg → tag exón 1 336 tgg → tga exón 1 335+336 tgg → taa exón 1 117 350 tgg → tag exón 1 351 tgg → tga exón 1 350+351 tgg → taa exón 1 136 406 cag → tag exón 1 406+408 cag → taa exón 1 143 427 cag → tag exón 1 427+429 cag → taa exón 1 168 502 cag → tag exón 1 502+504 cag → taa exón 2 198 672 tgg → tag exón 2 673 tgg → tga exón 2 672+673 tgg → taa exón 2 204 689 cag → tag exón 2 689+691 cag → taa exón 2 213 717 tgg → tag exón 3 812 tgg → tga exón 2-3 717+812 tgg → taa exón 3 222 838 tgg → tag exón 3 839 tgg → tga exón 3 838+839 tgg → taa exón 3 225 846 cag → tag exón 3 846+848 cag → taa exón 3 235 877 tgg → tag exón 3 878 tgg → tga exón 3 877+878 tgg → taa exón 3 238 885+886 cgg → tag exón 3 885+887 taa exón 3 885+886+887 cgg → taa exón 3 248 915 cga → tga exón 3 915+916 cga → taa exón 4 253 1064 tgg → tag exón 4 1065 tgg → tga exón 4 1064+1065 tgg → taa exón 4 271 1117 cga → tga exón 4 1117+1118 cga → taa exón 5 311 1316 tgg → tag exón 5 1317 tgg → tga exón 5 1316+1317 tgg → taa exón 5 318 1336 cag → tag exón 5 1336+1338 cag → taa exón 5 328 1367 tgg → tag exón 5 1368 tgg → tga exón 5 1367+1368 tgg → taa exón 5 341 1405 cag → tag exón 5 1405+1407 cag → taa exón 5 361 1465 cag → tag exón 5 1465+1467 cag → taa exón 5 383 1531 cag → tag exón 5 1531+1533 cag → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 5 387 1543 cga → tga exón 5 1543+1544 cga → taa exón 5 389 1549 cag → tag exón 5 1549+1551 cag → taa exón 5 401 1586 tgg → tag exón 5 1587 tgg → tga exón 5 1586+1587 tgg → taa exón 5 410 1613 tgg → tag exón 5 1614 tgg → tga exón 5 1613+1614 tgg → taa
Tabla 4a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A3 (WOSR, SEC ID Nº: 5 y 6)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 caa → taa exón 1 81 241 caa → taa exón 1 82 244 caa → taa exón 1 91 271 cag → tag exón 1 271+273 cag → taa exón 1 95 284 tgg → tag exón 1 285 tgg → tga exón 1 284+285 tgg → taa exón 1 112 334 cag → tag exón 1 334+336 cag → taa exón 1 113 338 tgg → tag exón 1 339 tgg → tga exón 1 338+339 tgg → taa exón 1 137 409 cag → tag exón 1 409+411 cag → taa exón 1 144 430 cag → tag exón 1 430+432 cag → taa exón 1 169 505 cag → tag exón 1 505+507 cag → taa exón 2 199 828 tgg → tag exón 2 829 tgg → tga exón 2 828+829 tgg → taa exón 2 205 845 cag → tag exón 2 845+847 cag → taa exón 2 214 873 tgg → tag exón 3 947 tgg → tga exón 2-3 873+947 tgg → taa exón 3 223 973 tgg → tag exón 3 974 tgg → tga exón 3 973+974 tgg → taa exón 3 236 1012 tgg → tag exón 3 1013 tgg → tga exón 3 1012+1013 tgg → taa exón 3 239 1020+1021 cgg → tag exón 3 1020+1022 cgg → tga exón 3 1020+1021+1022 cgg → taa exón 4 254 1146 tgg → tag exón 4 1147 tgg → tga exón 4 1146+1147 tgg → taa exón 4 272 1199 cga → tga exón 4 1199+1200 cga → taa exón 5 312 1420 tgg → tag exón 5 1421 tgg → tga exón 5 1420+1421 tgg → taa exón 5 319 1440 cag → tag exón 5 1440+1442 cag → taa exón 5 329 1471 tgg → tag exón 5 1472 tgg → tga exón 5 1471+1472 tgg → taa exón 5 362 1569 cag → tag exón 5 1569+1571 cag → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 5 384 1635 cag → tag exón 5 1635+1637 cag → taa exón 5 388 1647 cga → tga exón 5 1647+1648 cga → taa exón 5 390 1653 cag → tag exón 5 1653+1655 cag → taa exón 5 399 1680 cga → tga exón 5 1680+1681 cga → taa exón 5 402 1690 tgg → tag exón 5 1691 tgg → tga exón 5 1690+1691 tgg → taa exón 5 411 1717 tgg → tag exón 5 1718 tgg → tga exón 5 1717+1718 tgg → taa
Tabla 4b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-A3 (SOSR, SEC ID Nº: 17 y 18)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 81 241 caa → taa exón 1 82 244 caa → taa exón 1 91 271 cag → tag exón 1 271+273 cag → taa exón 1 95 284 tgg → tag exón 1 285 tgg → tga exón 1 284+285 tgg → taa exón 1 112 334 cag → tag exón 1 334+336 cag → taa exón 1 113 338 tgg → tag exón 1 339 tgg → tga exón 1 338+339 tgg → taa exón 1 137 409 cag → tag exón 1 409+411 cag → taa exón 1 144 430 cag → tag exón 1 430+432 cag → taa exón 1 169 505 cag → tag exón 1 505+507 cag → taa exón 2 199 828 tgg → tag exón 2 829 tgg → tga exón 2 828+829 tgg → taa exón 2 205 845 cag → tag exón 2 845+847 cag → taa exón 2 214 873 tgg → tag exón 3 947 tgg → tga exón 2-3 873+947 tgg → taa exón 3 223 973 tgg → tag exón 3 974 tgg → tga exón 3 973+974 tgg → taa exón 3 236 1012 tgg → tag exón 3 1013 tgg → tga exón 3 1012+1013 tgg → taa exón 4 254 1144 tgg → tag exón 4 1145 tgg → tga exón 4 1144+1145 tgg → taa exón 4 272 1197 cga → tga exón 4 1197+1198 cga → taa exón 5 312 1402 tgg → tag exón 5 1403 tgg → tga exón 5 1402+1402 tgg → taa exón 5 319 1422 cag → tag exón 5 1422+1424 cag → taa exón 5 329 1453 tgg → tag exón 5 1454 tgg → tga exón 5 1453+1454 tgg → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 5 362 1551 cag → tag exón 5 1551+1553 cag → taa exón 5 384 1617 cag → tag exón 5 1617+1619 cag → taa exón 5 388 1629 cga → tga exón 5 1629+1630 cga → taa exón 5 390 1635 cag → tag exón 5 1635+1637 cag → taa exón 5 399 1662 cga → tga exón 5 1662+1663 cga → taa exón 5 402 1672 tgg → tag exón 5 1673 tgg → tga exón 5 1672+1673 tgg → taa exón 5 411 1699 tgg → tag exón 5 1700 tgg → tga exón 5 1699+1700 tgg → taa
Tabla 5a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C1 (WOSR, SEC ID Nº: 7 y 8)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 caa → taa exón 1 88 262 cag → tag exón 1 262+264 cag → taa exón 1 92 275 tgg → tag exón 1 276 tgg → tga exón 1 275+276 tgg → taa exón 1 109 325 cag → tag exón 1 325+327 cag → taa exón 1 110 329 tgg → tag exón 1 330 tgg → tga exón 1 329+330 tgg → taa exón 1 115 344 tgg → tag exón 1 345 tgg → tga exón 1 344+345 tgg → taa exón 1 134 400 cag → tag exón 1 400+402 cag → taa exón 1 141 421 cag → tag exón 1 421+423 cag → taa exón 1 146 436+437 cgg → tag exón 1 436+438 cgg → tga exón 1 436+437+438 cgg → taa exón 1 166 496 cag → tag exón 1 496+498 cag → taa exón 2 196 667 tgg → tag exón 2 668 tgg → tga exón 2 667+668 tgg → taa exón 2 202 684 cag → tag exón 2 684+686 cag → taa exón 2 211 712 tgg → tag exón 3 791 tgg → tga exón 2-3 712+791 tgg → taa exón 3 220 817 tgg → tag exón 3 818 tgg → tga exón 3 817+818 tgg → taa exón 3 223 825 cag → tag exón 3 825+827 cag → taa exón 3 233 856 tgg → tag exón 3 857 tgg → tga exón 3 856+857 tgg → taa exón 3 236 864 cga → tga exón 3 864+865 cga → taa exón 4 251 1000 tgg → tag exón 4 1001 tgg → tga
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 4 1000+1001 tgg → taa exón 4 269 1053 cga → tga exón 4 1053+1054 cga → taa exón 5 309 1259 tgg → tag exón 5 1260 tgg → tga exón 5 1259+1260 tgg → taa exón 5 316 1279 cag → tag exón 5 1279+1281 cag → taa exón 5 326 1310 tgg → tag exón 5 1311 tgg → tga exón 5 1310+1311 tgg → taa exón 5 339 1348 cag → tag exón 5 1348+1350 cag → taa exón 5 359 1408 cag → tag exón 5 1408+1410 cag → taa exón 5 381 1474 cag → tag exón 5 1474+1476 cag → taa exón 5 387 1492 cag → tag exón 5 1492+1494 cag → taa exón 5 399 1529 tgg → tag exón 5 1530 tgg → tga exón 5 1529+1530 tgg → taa exón 5 408 1556 tgg → tag exón 5 1567 tgg → tga exón 5 1556+1557 tgg → taa
Tabla 5b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C1 (SOSR, SEC ID Nº: 19 y 20)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 caa → taa exón 1 88 262 cag → tag exón 1 262+264 cag → taa exón 1 92 275 tgg → tag exón 1 276 tgg → tga exón 1 275+276 tgg → taa exón 1 109 325 cag → tag exón 1 325+327 cag → taa exón 1 110 329 tgg → tag exón 1 330 tgg → tga exón 1 329+330 tgg → taa exón 1 115 344 tgg → tag exón 1 345 tgg → tga exón 1 344+345 tgg → taa exón 1 134 400 cag → tag exón 1 400+402 cag → taa exón 1 141 421 cag → tag exón 1 421+423 cag → taa exón 1 146 436+437 cgg → tag exón 1 436+438 cgg → tga exón 1 436+437+438 cgg → taa exón 1 166 496 cag → tag exón 1 496+498 cag → taa exón 2 196 667 tgg → tag exón 2 668 tgg → tga exón 2 667+668 tgg → taa exón 2 202 684 cag → tag exón 2 684+686 cag → taa exón 2 211 712 tgg → tag exón 3 791 tgg → tga exón 2-3 712+791 tgg → taa exón 3 220 817 tgg → tag exón 3 818 tgg → tga exón 3 817+818 tgg → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 3 223 825 cag → tag
exón 3 825+827 cag → taa
exón 3 233 856 tgg → tag
exón 3 857 tgg → tga
exón 3 856+857 tgg → taa
exón 3 236 864 cga → tga
exón 3 864+865 cga → taa
exón 4 251 1000 tgg → tag
exón 4 1001 tgg → tga
exón 4 1000+1001 tgg → taa
exón 4 269 1053 cga → tga
exón 4 1053+1054 cga → taa
exón 5 309 1259 tgg → tag
exón 5 1260 tgg → tga
exón 5 1259+1260 tgg → taa
exón 5 316 1279 cag → tag
exón 5 1279+1281 cag → taa
exón 5 326 1309 tgg → tag
exón 5 1310 tgg → tga
exón 5 1309+1310 tgg → taa
exón 5 339 1348 cag → tag
exón 5 1348+1350 cag → taa
exón 5 359 1408 cag → tag
exón 5 1408+1410 cag → taa
exón 5 381 1474 cag → tag
exón 5 1474+1476 cag → taa
exón 5 387 1492 cag → tag
exón 5 1492+1494 cag → taa
exón 5 399 1529 tgg → tag
exón 5 1530 tgg → tga
exón 5 1529+1530 tgg → taa
exón 5 408 1556 tgg → tag
exón 5 1557 tgg → tga
exón 5 1556+1557 tgg → taa
Tabla 6a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C2 (WOSR, SEC ID Nº: 9 y 10)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 cag → tag exón 1 235+237 cag → taa exón 1 90 268 cag → tag exón 1 268+270 cag → taa exón 1 94 281 tgg → tag exón 1 282 tgg → tga exón 1 281+282 tgg → taa exón 1 111 331 cag → tag exón 1 331+333 cag → taa exón 1 112 335 tgg → tag exón 1 336 tgg → tga exón 1 335+336 tgg → taa exón 1 117 350 tgg → tag exón 1 351 tgg → tga exón 1 350+351 tgg → taa exón 1 136 406 cag → tag exón 1 406+408 cag → taa exón 1 143 427 cag → tag exón 1 427+429 cag → taa exón 1 168 502 cag → tag exón 1 502+504 cag → taa exón 2 198 669 tgg → tag exón 2 670 tgg → tga exón 2 669+670 tgg → taa exón 2 204 686 cag → tag
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 2 686+688 cag → taa
exón 2 213 714 tgg → tag
exón 3 945 tgg → tga
exón 2-3 714+945 tgg → taa
exón 3 222 971 tgg → tag
exón 3 972 tgg → tga
exón 3 971+972 tgg → taa
exón 3 225 979 cag → tag
exón 3 979+981 cag → taa
exón 3 235 1010 tgg → tag
exón 3 1011 tgg → tga
exón 3 1010+1011 tgg → taa
exón 3 238 1018+1019 cgg → tag
exón 3 1018+1020 cgg → tga
exón 3 1018+1019+1020 cgg → taa
exón 3 248 1048 cga → tga
exón 3 1048+1049 cga →taa
exón 4 253 1195 tgg → tag
exón 4 1196 tgg → tga
exón 4 1195+1196 tgg → taa
exón 4 271 1248 cga → tga
exón 4 1248+1249 cga → taa
exón 5 311 1454 tgg → tag
exón 5 1455 tgg → tga
exón 5 1454+1455 tgg → taa
exón 5 318 1474 cag → tag
exón 5 1474+1476 cag → taa
exón 5 328 1505 tgg → tag
exón 5 1506 tgg → tga
exón 5 1505+1506 tgg → taa
exón 5 341 1543 cag → tag
exón 5 1543+1545 cag → taa
exón 5 361 1603 cag → tag
exón 5 1603+1605 cag → taa
exón 5 383 1669 cag → tag
exón 5 1669+1671 cag → taa
exón 5 389 1687 cag → tag
exón 5 1687+1689 cag → taa
exón 5 401 1724 tgg → tag
exón 5 1725 tgg → tga
exón 5 1724+1725 tgg → taa
exón 5 410 1751 tgg → tag
exón 5 1752 tgg → tga
exón 5 1751+1752 tgg → taa
Tabla 6b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C2 (SOSR, SEC ID Nº: 21 y 22)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 cag → tag exón 1 154+156 cag → taa exón 1 79 235 cag → tag exón 1 235+237 cag → taa exón 1 90 268 cag → tag exón 1 268+270 cag → taa exón 1 94 281 tgg → tag exón 1 282 tgg → tga exón 1 281+282 tgg → taa exón 1 111 331 cag → tag exón 1 331+333 cag → taa exón 1 112 335 tgg → tag exón 1 336 tgg → tga exón 1 335+336 tgg → taa exón 1 117 350 tgg → tag exón 1 351 tgg → tga exón 1 350+351 tgg → taa
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 1 136 406 cag → tag
exón 1 406+408 cag → taa
exón 1 143 427 cag → tag
exón 1 427+429 cag → taa
exón 1 168 502 cag → tag
exón 1 502+504 cag → taa
exón 2 198 669 tgg → tag
exón 2 670 tgg → tga
exón 2 669+670 tgg → taa
exón 2 204 686 cag → tag
exón 2 686+688 cag → taa
exón 2 213 714 tgg → tag
exón 3 945 tgg → tga
exón 2-3 714+945 tgg → taa
exón 3 222 971 tgg → tag
exón 3 972 tgg → tga
exón 3 971+972 tgg → taa
exón 3 225 979 cag → tag
exón 3 979+981 cag → taa
exón 3 235 1010 tgg → tag
exón 3 1011 tgg → tga
exón 3 1010+1011 tgg → taa
exón 3 238 1018+1019 cgg → tag
exón 3 1018+1020 cgg → tga
exón 3 1018+1019+1020 cgg → taa
exón 3 248 1048 cga → tga
exón 3 1048+1049 cga → taa
exón 4 253 1195 tgg → tag
exón 4 1196 tgg → tga
exón 4 1195+1196 tgg → taa
exón 4 271 1248 cga → tga
exón 4 1248+1249 cga → taa
exón 5 311 1454 tgg → tag
exón 5 1455 tgg → tga
exón 5 1454+1455 tgg → taa
exón 5 318 1474 cag → tag
exón 5 1474+1476 cag → taa
exón 5 328 1505 tgg → tag
exón 5 1506 tgg → tga
exón 5 1505+1506 tgg → taa
exón 5 341 1543 cag → tag
exón 5 1543+1545 cag → taa
exón 5 361 1603 cag → tag
exón 5 1603+1605 cag → taa
exón 5 383 1669 cag → tag
exón 5 1669+1671 cag → taa
exón 5 389 1687 cag → tag
exón 5 1687+1689 cag → taa
exón 5 401 1724 tgg → tag
exón 5 1725 tgg → tga
exón 5 1724+1725 tgg → taa
exón 5 410 1751 tgg → tag
exón 5 1752 tgg → tga
exón 5 1751+1752 tgg → taa
Tabla 7a: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C3 (WOSR, SEC ID Nº: 11 y 12)
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 1 52 154 caa → taa exón 1 81 241 caa → taa exón 1 82 244 caa → taa exón 1 91 271 cag → tag exón 1 271+273 cag → taa exón 1 95 284 tgg → tag exón 1 285 tgg → tga
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
exón 1 284+285 tgg → taa exón 1 112 334 cag → tag exón 1 334+336 cag → taa exón 1 113 338 tgg → tag exón 1 339 tgg → tga exón 1 338+339 tgg → taa exón 1 137 409 cag → tag exón 1 409+411 cag → taa exón 1 144 430 cag → tag exón 1 430+432 cag → taa exón 1 169 505 cag → tag exón 1 505+507 cag → taa exón 2 199 1018 tgg → tag exón 2 1019 tgg → tga exón 2 1018+1019 tgg → taa exón 2 205 1035 cag → tag exón 2 1035+1037 cag → taa exón 2 214 1063 tgg → tag exón 3 1138 tgg → tga exón 2-3 1063+1138 tgg → taa exón 3 223 1164 tgg → tag exón 3 1165 tgg → tga exón 3 1164+1165 tgg → taa exón 3 236 1203 tgg → tag exón 3 1204 tgg → tga exón 3 1203+1204 tgg → taa exón 3 239 1211+1212 cgg → tag exón 3 1211+1213 cgg → tga exón 3 1211+1212+1213 cgg → taa exón 4 254 1329 tgg → tag exón 4 1330 tgg → tga exón 4 1329+1330 tgg → taa exón 4 272 1382 cga → tga exón 4 1382+1383 cga → taa exón 5 312 1578 tgg → tag exón 5 1579 tgg → tga exón 5 1578+1579 tgg → taa exón 5 319 1598 cag → tag exón 5 1598+1600 cag → taa exón 5 329 1629 tgg → tag exón 5 1630 tgg → tga exón 5 1629+1630 tgg → taa exón 5 362 1727 cag → tag exón 5 1727+1729 cag → taa exón 5 384 1793 cag → tag exón 5 1793+1795 cag → taa exón 5 388 1805 cga → tga exón 5 1805+1806 cga → taa exón 5 390 1811 cag → tag exón 5 1811+1813 cag → taa exón 5 399 1838 cga → tga exón 5 1838+1839 cga → taa exón 5 402 1848 tgg → tag exón 5 1849 tgg → tga exón 5 1848+1849 tgg → taa exón 5 411 1875 tgg → tag exón 5 1876 tgg → tga exón 5 1875+1876 tgg → taa
Tabla 7b: Posibles mutaciones del codón de terminación en FATB-C3 (SOSR, SEC ID Nº: 23 y 24)
- Número de exón
- Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante
- exón 1
- 52 154 caa → taa
- exón 1
- 81 241 caa → taa
- exón 1
- 82 244 caa → taa
- exón 1
- 91 271 cag → tag
- exón 1
- 271+273 cag → taa
- exón 1
- 95 284 tgg → tag
- exón 1
- 285 tgg → tga
- exón 1
- 284+285 tgg → taa
- exón 1
- 112 334 cag → tag
- exón 1
- 334+336 cag → taa
- exón 1
- 113 338 tgg tag
- exón 1
- 339 tgg → tga
- exón 1
- 338+339 tgg → taa
- exón 1
- 137 409 cag → tag
- exón 1
- 409+411 cag → taa
- exón 1
- 144 430 cag → tag
- exón 1
- 430+432 cag → taa
- exón 1
- 169 505 cag → tag
- exón 1
- 505+507 cag → taa
- exón 2
- 199 1019 tgg → tag
- exón 2
- 1020 tgg → tga
- exón 2
- 1019+1020 tgg → taa
- exón 2
- 205 1036 cag → tag
- exón 2
- 1036+1038 cag → taa
- exón 2
- 214 1064 tgg → tag
- exón 3
- 1139 tgg → tga
- exón 2-3
- 1064+1139 tgg → taa
- exón 3
- 223 1165 tgg tag
- exón 3
- 1166 tgg → tga
- exón 3
- 1165+1166 tgg → taa
- exón 3
- 236 1204 tgg → tag
- exón 3
- 1205 tgg → tga
- exón 3
- 1204+1205 tgg → taa
- exón 3
- 239 1212+1213 cgg → tag
- exón 3
- 1212+1214 cgg → tga
- exón 3
- 1212+1213+1214 cgg → taa
- exón 4
- 254 1330 tgg → tag
- exón 4
- 1331 tgg → tga
- exón 4
- 1330+1331 tgg → taa
- exón 4
- 272 1383 cga tga
- exón 4
- 1383+1384 cga → taa
- exón 5
- 312 1579 tgg → tag
- exón 5
- 1580 tgg → tga
- exón 5
- 1579+1580 tgg → taa
- exón 5
- 319 1599 cag → tag
- exón 5
- 1599+1601 cag → taa
- exón 5
- 329 1630 tgg → tag
- exón 5
- 1631 tgg → tga
- exón 5
- 1630+1631 tgg → taa
- exón 5
- 362 1728 cag → tag
- exón 5
- 1728+1730 cag → taa
- exón 5
- 384 1794 cag → tag
- exón 5
- 1794+1796 cag → taa
- exón 5
- 388 1806 cga → tga
- exón 5
- 1806+1807 cga → taa
- exón 5
- 390 1812 cag → tag
- exón 5
- 1812+1814 cag → taa
- exón 5
- 399 1839 cga → tga
- exón 5
- 1839+1840 cga → taa
- exón 5
- 402 1849 tgg → tag
- exón 5
- 1850 tgg → tga
- exón 5
- 1849+1850 tgg → taa
- exón 5
- 411 1876 tgg → tag
Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante exón 5 1877 tgg → tga exón 5 1876+1877 tgg → taa
Obviamente, las mutaciones no se limitan a las mostradas en las tablas anteriores y se entiende que mutaciones de terminación análogas pueden estar presentes en alelos fatB distintos de aquellos representados en el listado de secuencias y citados en las tablas anteriores.
5 Una mutación del sitio de corte y empalme en un alelo FATB, como se usa en el presente documento, es una mutación en un alelo FATB por la cual una mutación en el alelo FATB no mutante correspondiente produce corte y empalme aberrante del pre-ARNm, produciendo así una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene. La mutación puede estar en la secuencia del sitio de corte y empalme consenso. Por ejemplo, la
10 siguiente tabla describe secuencias consenso, que -si están mutadas -es probable que afecten el corte y empalme correcto. Los sitios de corte y empalme de GT-AG tienen comúnmente otros nucleótidos conservados, tales como 2 nucleótidos altamente conservados en el extremo 5' del intrón (en el exón), que es frecuentemente 5'-AG-3'. En el lado de 3' del dinucleótido GT (así en el intrón) puede encontrarse alta conservación para un tetranucleótido 5'-AAGT-3'. Esto significa que pueden identificarse 8 nucleótidos como altamente conservados en el sitio donante.
- Tipo de intrón
- Sitio de unión de 5' (exón^intrón) Sitio de corte y empalme cerca de 3' Sitio de unión de 3' (intrón^exón) Encontrado en
- GU-AG (intrones canónicos; aproximadamente el 99 %)
- CRN^GU(A/G)AGU A YnAG^N pre-ARNm nuclear
- (aproximadamente el 1 %)
- ^GC AG^ pre-ARNm nuclear
- Intrones no canónicos (< aproximadamente el 0,1 %)
- ^AU AC^ pre-ARNm nuclear
- Sitios de ramificación canónicos
- CUPuAPy 20-50 nucleótidos 5' con respecto al aceptor del sitio de corte y empalme de pre-ARNm nuclear
^ representa el sitio de corte y empalme; R = A o G; Y = C o T; N = A, C, G o T (pero frecuentemente G); n = múltiples nucleótidos; en negrita = dinucleótidos consenso en la secuencia del intrón. Pu = base de purina; Py = base de pirimidina.
Se describen secuencias de la estructura del sitio de corte y empalme y consenso en la materia y están disponibles programas informáticos para identificar exones y secuencias de sitios de corte y empalme, tales como NetPLAntgene, BDGP o Genio, est2genome, FgeneSH y similares. La comparación de la secuencia genómica o pre
20 secuencia de ARNm con la proteína traducida puede usarse para determinar o verificar sitios de corte y empalme y corte y empalme anómalo.
Cualquier mutación (inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos) que altere el corte y empalme del pre-ARNm y así conduzca a una proteína con actividad biológica significativamente reducida está englobada en el 25 presente documento. Un alelo FATB mutante que comprende una mutación del sitio de corte y empalme puede ser un alelo FATB en el que el corte y empalme alterado se produce por la introducción en la región de ADN transcrito de FATB de una o más sustituciones de nucleótidos de los dinucleótidos consenso representados en negrita anteriormente. Por ejemplo, ^GU puede, por ejemplo, mutarse a ^AU en el sitio de corte y empalme donante y/o AG^ puede mutarse a AA^ en la secuencia del sitio de corte y empalme aceptor. Un alelo FATB mutante que comprende
30 una mutación del sitio de corte y empalme puede ser un alelo FATB en el que el corte y empalme alterado se produce por la introducción en la región de ADN transcrita de FATB de una o más sustituciones de nucleótidos en los nucleótidos conservados en las secuencias de exón.
Las siguientes tablas indican posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en genes FATB, especialmente en
35 los dinucleótidos conservados de intrones canónicos y el nucleótido que flanquea inmediatamente estos dinucleótidos en el exón (los símbolos '[' y ']' indican los límites de exón-intrón e intrón-exón y el sitio de corte y empalme; los nucleótidos subrayados están mutados).
Tabla 8a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A1 (WOSR, SEC ID Nº: 1)
40 Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 1 -donante 504 g[gt... → a[gt... intrón 1 -donante 505 g[gt... →g[at... intrón 1 -aceptor 589 ...ag]g → ...aa]g intrón 1 -aceptor 590 ...ag]g → ...ag]a intrón 2 -donante 723 g[gt... → a[gt...
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 2 -donante 724 g[gt... → g[at... intrón 2 -aceptor 797 ... ag]g → ...aa]g intrón 2 -aceptor 798 ...ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 911 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 912 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 980 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1153 t[gt... → t[at... intrón 4 -aceptor 1242 ...ag]c →...aa]c intrón 4 -aceptor 1243 ...ag]c → ...ag]t
Tabla 8b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A1 (SOSR, SEC ID Nº: 13)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 501 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 502 g[gt... →g[at...
intrón 1 -aceptor 586 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 587 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 720 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 721 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 794 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 795 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 908 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 909 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 977 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1150 t[gt... → t[at...
intrón 4 -aceptor 1239 ...ag]c → ...aa]c
intrón 4 -aceptor 1240 ...ag]c → ...ag]t
5 Tabla 9a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A2 (WOSR, SEC ID Nº: 3)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 504 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 505 g[gt... →7 g[at...
intrón 1 -aceptor 583 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 584 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 717 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 718 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 811 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 812 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 925 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 926 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 1058 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1231 t[gt... → t[at...
intrón 4 -aceptor 1308 ...ag]c → ...aa]c
intrón 4 -aceptor 1309 ...ag]c → ...ag]t
Tabla 9b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A2 (SOSR, SEC ID Nº: 15)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 504 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 505 g[gt...→g[at...
intrón 1 -aceptor 583 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 584 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 717 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 718 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 811 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 812 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 925 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 926 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 1058 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1231 t[gt... → t[at...
intrón 4 -aceptor 1308 ...ag]c →...aa]c
intrón 4 -aceptor 1309 ...ag]c → ...ag]t 10
Tabla 10a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A3 (WOSR, SEC ID Nº: 5)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 507 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 508 g[gt... →g[at...
intrón 1 -aceptor 739 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 740 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 873 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 874 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 946 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 947 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 1060 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 1061 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 1140 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1312 c[gt... → t[gt...
intrón 4 -donante 1313 c[gt... → c[at...
intrón 4 -aceptor 1412 ...ag]c → ...aa]c
intrón 4 -aceptor 1413 ...ag]c → ...ag]t
Tabla 10b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-A3 (SOSR, SEC ID Nº: 17)
5 Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 1 -donante 507 g[gt... → a[gt... intrón 1 -donante 508 g[gt... → g[at... intrón 1 -aceptor 739 ...ag]g → ...aa]g intrón 1 -aceptor 740 ...ag]g → ...ag]a intrón 2 -donante 873 g[gt... → a[gt... intrón 2 -donante 874 g[gt... → g[at... intrón 2 -aceptor 946 ...ag]g → ...aa]g intrón 2 -aceptor 947 ...ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 1060 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 1061 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 1138 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1310 c[gt... → t[gt... intrón 4 -donante 1311 c[gt... → c[at... intrón 4 -aceptor 1394 ...ag]c → ...aa]c intrón 4 -aceptor 1395 ...ag]c → ...ag]t
Tabla 11a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C1 (WOSR, SEC ID Nº: 7)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 1 -donante 498 g[gt... → a[gt... intrón 1 -donante 499 g[gt... → g[at... intrón 1 -aceptor 578 ...ag]g → ...aa]g intrón 1 -aceptor 579 ...ag]g → ...ag]a intrón 2 -donante 712 g[gt... → a[gt... intrón 2 -donante 713 g[gt... → g[at... intrón 2 -aceptor 790 ...ag]g → ...aa]g intrón 2 -aceptor 791 ... ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 904 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 905 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 994 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1167 t[gt... → t[at... intrón 4 -aceptor 1251 ... ag]c → ...aa]c intrón 4 -aceptor 1252 ...ag]c → ...ag]t
10 Tabla 11b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C1 (SOSR, SEC ID Nº: 19)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 498 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 499 g[gt... → g[at...
intrón 1 -aceptor 578 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 579 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 712 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 713 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 790 ...ag]g → ...aa]g
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 2 -aceptor 791 ...ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 904 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 905 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 994 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1167 t[gt... → t[at... intrón 4 -aceptor 1251 ...ag]c → ...aa]c intrón 4 -aceptor 1252 ...ag]c → ...ag]t
Tabla 12a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C2 (WOSR, SEC ID Nº: 9)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 1 -donante 504 g[gt... → a[gt... intrón 1 -donante 505 g[gt.... → g[at... intrón 1 -aceptor 580 ...ag]g → ...aa]g intrón 1 -aceptor 581 ...ag]g → ...ag]a intrón 2 -donante 714 g[gt... → a[gt... intrón 2 -donante 715 g[gt... → g[at... intrón 2 -aceptor 944 ...ag]g → ...aa]g intrón 2 -aceptor 945 ...ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 1058 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 1059 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 1189 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1362 t[gt... → t[at... intrón 4 -aceptor 1446 ...ag]c → ...aa]c intrón 4 -aceptor 1447 ...ag]c → ...ag]t
5 Tabla 12b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C2 (SOSR, SEC ID Nº: 21)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante intrón 1 -donante 504 g[gt... → a[gt... intrón 1 -donante 505 g[gt... →g[at... intrón 1 -aceptor 580 ...ag]g → ...aa]g intrón 1 -aceptor 581 ...ag]g → ...ag]a intrón 2 -donante 714 g[gt... → a[gt... intrón 2 -donante 715 g[gt... → g[at... intrón 2 -aceptor 944 ...ag]g → ...aa]g intrón 2 -aceptor 945 ...ag]g → ...ag]a intrón 3 -donante 1058 g[gt... → a[gt... intrón 3 -donante 1059 g[gt... → g[at... intrón 3 -aceptor 1189 ...ag]t → ...aa]t intrón 4 -donante 1362 t[gt... → t[at... intrón 4 -aceptor 1446 ...ag]c → ...aa]c intrón 4 -aceptor 1447 ...ag]c → ... ag]t
Tabla 13a: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C3 (WOSR, SEC ID Nº: 11)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 507 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 508 g[gt... → □g[at...
intrón 1 -aceptor 929 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 930 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 1063 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 1064 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 1137 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 1138 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 1251 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 1252 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 1323 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1495 c[gt... → t[gt...
intrón 4 -donante 1496 c[gt... → c[at...
intrón 4 -aceptor 1570 ...ag]c → ...aa]c
intrón 4 -aceptor 1571 ...ag]c → ...ag]t 10
Tabla 13b: Posibles mutaciones del sitio de corte y empalme en FATB-C3 (SOSR, SEC ID Nº: 23)
Número de intrón Posición de nucleótido Sitio de corte y empalme no mutante → mutante
intrón 1 -donante 507 g[gt... → a[gt...
intrón 1 -donante 508 g[gt... → □g[at...
intrón 1 -aceptor 930 ...ag]g → ...aa]g
intrón 1 -aceptor 931 ...ag]g → ...ag]a
intrón 2 -donante 1064 g[gt... → a[gt...
intrón 2 -donante 1065 g[gt... → g[at...
intrón 2 -aceptor 1138 ...ag]g → ...aa]g
intrón 2 -aceptor 1139 ...ag]g → ...ag]a
intrón 3 -donante 1252 g[gt... → a[gt...
intrón 3 -donante 1253 g[gt... → g[at...
intrón 3 -aceptor 1324 ...ag]t → ...aa]t
intrón 4 -donante 1496 c[gt... → t[gt...
intrón 4 -donante 1497 c[gt... → c[at...
intrón 4 -aceptor 1571 ...ag]c → ...aa]c
intrón 4 -aceptor 1572 ...ag]c → ...ag]t
Secuencias de aminoácidos
5 Se describen tanto secuencias de aminoácidos de FATB no mutantes (funcionales) como secuencias de aminoácidos de FATB mutantes (que comprenden una o más mutaciones, preferentemente mutaciones que producen una actividad biológica significativamente reducida o ninguna de la proteína FATB) de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivo de Brassica. Por ejemplo,
10 especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C pueden codificar aminoácidos de FATB-A o FATB-C diferentes. Además, pueden usarse métodos de mutagénesis para generar mutaciones en alelos FATB no mutantes, generando así alelos mutantes que pueden codificar adicionalmente proteínas FATB mutantes. En una realización, las secuencias de aminoácidos de FATB no mutantes y/o mutantes se proporcionan dentro de una planta de Brassica (es decir, endógenamente). Sin embargo, secuencias de aminoácidos de FATB aisladas (por ejemplo,
15 aisladas de la planta o preparadas sintéticamente), además de variantes de las mismas y fragmentos de cualquiera de estas, también se describen en el presente documento.
Se han aislado secuencias de aminoácidos de las proteínas FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3 de colza oleaginosa de invierno (WOSR) y colza oleaginosa de verano (SOSR) de Brassica napus, como
20 se representa en el listado de secuencias. Se representan las secuencias de FATB no mutantes, mientras que las secuencias de FATB mutantes de estas secuencias, y de secuencias esencialmente similares a éstas, se describen en el presente documento más adelante, con referencia a las secuencias de FATB no mutante.
Como se ha descrito anteriormente, las proteínas FATB de Brassica descritas en el presente documento tienen
25 aproximadamente 412 -424 aminoácidos de longitud y comprenden varios dominios estructurales y funcionales. Las secuencias de la parte del extremo N de las proteínas FATB están menos conservadas evolutivamente que las secuencias de las proteínas FATB maduras. Las secuencias de las proteínas FATB maduras son, por tanto, menos variables que las secuencias de las proteínas precursoras.
30 “Secuencias de aminoácidos de FATB-A1” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-A1” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 2 (FATB-A1 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 14 (FATB-A1 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son “esencialmente
35 similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de aminoácidos de FATB-A2” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-A2” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 4 (FATB-A2 de
40 WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o SEC ID Nº: 16 (FATB-A2 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
45 “Secuencias de aminoácidos de FATB-A3” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-A3” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 6 (FATB-A3 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o SEC ID Nº: 18 (FATB-A3 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son
50 “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de
secuencias.
“Secuencias de aminoácidos de FATB-C1” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-C1” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al
5 menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 8 (FATB-C1 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o con SEC ID Nº: 20 (FATB-C1 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de aminoácidos de FATB-C2” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-C2” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 10 (FATB-C2 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o SEC ID Nº: 22 (FATB-C2 de SOSR) cuando se alinean
15 con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de aminoácidos de FATB-C3” o “secuencias de aminoácidos de variantes de FATB-C3” según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 12 (FATB-C3 de WOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito y/o SEC ID Nº: 24 (FATB-C3 de SOSR) cuando se alinean con o sin péptido de tránsito. También puede denominarse que estas secuencias de aminoácidos son “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias de FATB proporcionadas en el listado de
25 secuencias.
Así, se describen tanto secuencias de aminoácidos de proteínas FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3 funcionales no mutantes, que incluye variantes y fragmentos de las mismas (como se define adicionalmente más adelante), además de secuencias de aminoácidos mutantes de cualquiera de éstas, por lo que la mutación en la secuencia de aminoácidos produce preferentemente una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína FATB. Una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína FATB mutante se refiere a una reducción en la actividad enzimática (es decir, en la actividad de acil ACP-tioesterasa) de al menos el 30 %, al menos el 40 %, 50 % o más, al menos el 90 % o el 100 % (sin actividad biológica) en comparación con la actividad de la proteína natural.
35 En el presente documento se describen tanto secuencias de aminoácidos endógenas como aisladas. Un “fragmento” de una secuencia de aminoácidos de FATB o variante de la misma (como se define) puede ser de diversas longitudes, tales como al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 400 aminoácidos contiguos de la secuencia de FATB (o de la secuencia de variante).
Secuencias de aminoácidos de proteínas FATB funcionales
Las secuencias de aminoácidos representadas en el listado de secuencias son proteínas FATB funcionales no mutantes de Brassica napus. Así, estas secuencias son endógenas para las plantas WOSR y SOSR de las que se
45 aislaron. Otras especies, variedades, líneas de cultivo o accesiones silvestres de cultivos de Brassica pueden cribarse para otras proteínas FATB funcionales con las mismas secuencias de aminoácidos o variantes de las mismas, como se ha descrito anteriormente.
Además, se entiende que secuencias de aminoácidos de FATB y variantes de las mismas (o fragmentos de cualquiera de éstas) pueden identificarse por ordenador, cribando bases de datos de aminoácidos para secuencias esencialmente similares. También se describen fragmentos de moléculas de aminoácidos. Los fragmentos incluyen secuencias de aminoácidos de la proteína madura, o fragmentos más pequeños que comprenden toda o parte de las secuencias de aminoácidos, etc.
55 Secuencias de aminoácidos de proteínas FATB mutantes
Secuencias de aminoácidos que comprenden una o más deleciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos no mutantes son adecuadas para la invención, ya que son fragmentos de tales moléculas de aminoácido mutantes. Tales secuencias de aminoácidos mutantes pueden generarse y/o identificarse usando diversos métodos conocidos, como se ha descrito anteriormente. De nuevo, tales moléculas de aminoácido pueden estar presentes tanto en forma endógena como en forma aislada.
La(s) mutación (mutaciones) en la secuencia de aminoácidos puede(n) producir una actividad biológica significativamente reducida o completamente suprimida de la proteína FATB con respecto a la proteína natural. 65 Como se ha descrito anteriormente, básicamente, cualquier mutación que produzca una proteína que comprende al menos una inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido con respecto a la proteína natural puede conducir a
actividad enzimática significativamente reducida (o no). Sin embargo, se entiende que es más probable que las mutaciones en ciertas partes de la proteína produzcan una función reducida de la proteína FATB mutante, tal como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, por lo que carecen de porciones significativas de los dominios funcionales, tales como el dominio catalítico o aminoácidos que participan en la especificidad del sustrato (véase
5 anteriormente), o mutaciones por las cuales se sustituyen residuos de aminoácidos conservados que tienen una función catalítica o que participan en la especificidad del sustrato.
Así, se describen proteínas FATB mutantes que comprenden una o más mutaciones de deleción o de inserción, por lo que la(s) deleción (deleciones) o inserción (inserciones) produce(n) una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene in vivo. Tales proteínas FATB mutantes son proteínas FATB en las que al menos 1, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400 o más aminoácidos se delecionan o insertan en comparación con la proteína FATB no mutante por lo que la(s) deleción (deleciones) o inserción (inserciones) produce(n) una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene in vivo.
15 Por tanto, se describen proteínas FATB mutantes que están truncadas, por lo que la truncación produce una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene in vivo. Tales proteínas FATB truncadas son proteínas FATB que carecen de dominios funcionales en la parte del extremo C de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente y que mantiene la parte del extremo N de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente. Así, una proteína FATB truncada puede comprender la parte del extremo N de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente hasta, pero que no incluye, el residuo de Cys conservado de la tríada catalítica tipo papaína (como se ha descrito anteriormente). Cuanto más truncada esté la proteína mutante en comparación con la proteína natural, más probable es que carezca de cualquier actividad enzimática. Así, una proteína FATB truncada puede comprender la parte del extremo N de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente hasta, pero que no incluye, el residuo de His o Asn conservado de la tríada catalítica tipo papaína (como se ha
25 descrito anteriormente). Además, una proteína FATB truncada puede comprender la parte del extremo N de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente hasta, pero que no incluye, los residuos de Met, Lys, Val, Ser o Trp conservados que participan en la especificidad del sustrato (como se ha descrito anteriormente). Además, una proteína FATB truncada puede comprender la parte del extremo N de la proteína FATB no mutante (madura) correspondiente que carece de parte o todo el segundo dominio de 4HBT o que carece de parte o todo el primer dominio de 4HBT (como se ha descrito anteriormente), o incluso más aminoácidos.
Se describen proteínas FATB mutantes que comprenden una o más mutaciones de sustitución, por lo que la(s) sustitución (sustituciones) produce(n) una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o no tiene in vivo. Tales proteínas FATB mutantes son proteínas FATB, por lo que los residuos de aminoácidos
35 conservados que tienen una función catalítica o que participan en la especificidad del sustrato (por ejemplo, aquellos descritos anteriormente) están sustituidos. Así, una proteína FATB mutante puede comprender una sustitución de un residuo de aminoácido conservado que tiene una función catalítica, tal como los residuos de Asn, His y Cys conservados de la tríada catalítica tipo papaína. Además, una proteína FATB mutante puede comprender una sustitución de un residuo de aminoácido conservado que participa en la especificidad del sustrato, tal como los residuos de Met, Lys, Val, Ser o Trp conservados.
Métodos
Pueden generarse alelos fatB mutantes (por ejemplo, inducidos por mutagénesis) y/o identificarse usando una
45 variedad de métodos, que son convencionales en la materia, por ejemplo, usando métodos basados en PCR para amplificar parte o todo el ADN genómico o ADNc de fatB.
El término “mutagénesis”, como se usa en el presente documento, se refiere al proceso en el que células vegetales (por ejemplo, una pluralidad de semillas de Brassica u otras partes, tales como polen) se someten a una técnica que induce mutaciones en el ADN de las células, tales como contacto con un agente mutagénico, tal como una sustancia química (tal como etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea (ENU), etc.) o radiación ionizante (neutrones (tales como en mutagénesis de neutrones rápidos, etc.), rayos alfa, rayos gamma (tales como aquellos suministrados por una fuente de cobalto 60), rayos X, radiación UV, etc.), o una combinación de dos o más de estos. Así, la mutagénesis deseada de uno o más alelos FATB puede llevarse a cabo por uso de medios químicos tales como por contacto de
55 uno o más tejidos de planta con etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea, etc., por el uso de medios físicos tales como rayos X, etc., o por radiación gamma, tal como aquella suministrada por una fuente de cobalto 60.
Tras la mutagénesis, plantas de Brassica se cultivan a partir de las semillas tratadas, o se regeneran a partir de las células tratadas usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de Brassica resultantes pueden sembrarse según procedimientos de cultivo convencionales y tras la auto-polinización se forma semilla sobre las plantas. Alternativamente, pueden extraerse plántulas haploides dobles de células de microesporas o de polen tratadas para formar inmediatamente plantas homocigóticas. Semilla adicional que se forma como resultado de tal autopolinización en la presente generación o una posterior puede recogerse y cribarse para la presencia de alelos FATB mutantes, usando técnicas que son convencionales en la materia, por ejemplo, técnicas basadas en la reacción en 65 cadena de la polimerasa (PCR) (amplificación de los alelos fatB) o técnicas basadas en hibridación, por ejemplo, análisis de transferencia Southern, y/o secuenciación directa de alelos fatB. Para cribar para la presencia de
mutaciones puntuales (los llamados polimorfismos de un único nucleótido o SNP) en alelos FATB mutantes, pueden usarse métodos de detección de SNP convencionales en la materia, por ejemplo, técnicas basadas en oligoligación, técnicas basadas en extensión de una única base o técnicas basadas en diferencias en sitios de restricción, tales como TILLING.
5 Como se ha descrito anteriormente, la mutagenización (espontánea además de inducida) de un alelo FATB no mutante específico se produce en presencia de uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos (llamada en lo sucesivo “región de mutación”) en el alelo FATB mutante resultante. El alelo FATB mutante puede así caracterizarse por la localización y la configuración del uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en el alelo FATB no mutante. El sitio en el alelo FATB no mutante en el que uno o más nucleótidos se han insertado, delecionado o sustituido, respectivamente, también se denomina la “región de mutación”. Una “región o secuencia flanqueante de 5' o 3'”, como se usa en el presente documento, se refiere a una región o secuencia de ADN en el alelo FATB mutante (o el no mutante correspondiente) de al menos 20 pb, preferentemente al menos 50 pb, al menos 750 pb, al menos 1500 pb y hasta 5000 pb de ADN diferentes del ADN que contiene el uno o más
15 nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos, preferentemente ADN del alelo FATB mutante (o el no mutante correspondiente) que se localiza tanto inmediatamente en la dirección 5' de y contiguo a (región o secuencia flanqueante de 5') o inmediatamente en la dirección 3' de y contiguo a (región o secuencia flanqueante de 3') la región de mutación en el alelo FATB mutante (o en el alelo FATB no mutante correspondiente).
Las herramientas desarrolladas para identificar un alelo FATB mutante específico o la planta o material de planta que comprende un alelo FATB mutante específico, o productos que comprenden material de planta que comprende un alelo FATB mutante específico, se basan en las características genómicas específicas del alelo FATB mutante específico en comparación con las características genómicas del alelo FATB no mutante correspondiente, tales como un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende la región de mutación, marcadores
25 moleculares o la secuencia de las regiones flanqueantes y/o de mutación.
Una vez se ha secuenciado un alelo FATB mutante específico, pueden desarrollarse cebadores y sondas que reconocen específicamente una secuencia dentro de las regiones flanqueantes de 5', flanqueantes de 3' y/o de mutación del alelo FATB mutante en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra a modo de una técnica de biología molecular. Por ejemplo, puede desarrollarse un método de PCR para identificar el alelo FATB mutante en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material de planta o productos que comprenden material de planta). Una PCR tal se basa en al menos dos “cebadores” específicos: uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante de 5' o 3' del alelo FATB mutante y el otro que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante de 3' o 5' del alelo FATB mutante, respectivamente; o uno que reconoce una secuencia dentro de la
35 región flanqueante de 5' o 3' del alelo FATB mutante y el otro que reconoce una secuencia dentro de la región de mutación del alelo FATB mutante; o uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante de 5' o 3' del alelo FATB mutante y el otro que reconoce una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante de 3' o 5' y la región de mutación del alelo FATB mutante específico (como se describe adicionalmente más adelante), respectivamente.
Los cebadores tienen preferentemente una secuencia de entre 15 y 35 nucleótidos que bajo condiciones de PCR optimizadas “reconocen específicamente” una secuencia dentro de la región flanqueante de 5' o 3', una secuencia dentro de la región de mutación, o una secuencia que abarca la región de unión entre las regiones flanqueantes y de mutación de 3' o 5' del alelo FATB mutante específico, de manera que un fragmento específico (“fragmento
45 específico de FATB mutante” o amplicón discriminante) se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende el alelo FATB mutante específico. Mediante cualquier medio solo el alelo FATB mutante dirigido, y no otra secuencia en el genoma de la planta, se amplifica bajo condiciones de PCR optimizadas.
Cebadores de PCR adecuados para la invención pueden ser los siguientes:
- -
- oligonucleótidos que oscilan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante de 5' de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, la secuencia 5' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB
55 mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' que flanquea las mutaciones de deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente o la secuencia 5' que flanquea las posibles mutaciones del codón de terminación o del sitio de corte y empalme indicadas en las tablas anteriores) en su extremo 3' (cebadores que reconocen secuencias flanqueantes de 5'); o
- -
- oligonucleótidos que oscilan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados de la secuencia flanqueante de 3' de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, el complemento de la secuencia 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB mutantes de la invención, tal como el complemento de la secuencia 3' que flanquea las mutaciones de deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente o el complemento 65 de la secuencia 3' que flanquea las posibles mutaciones del codón de terminación o del sitio de corte y empalme indicadas en las tablas anteriores) en su extremo 3' (cebadores que reconocen secuencias flanqueantes de 3');
o
- -
- oligonucleótidos que oscilan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos seleccionados de la secuencia de la región de mutación de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, la secuencia de
5 nucleótidos insertada o sustituida en los genes FATB de la invención, o el complemento de los mismos) en su extremo 3' (cebadores que reconocen secuencias de mutación).
Los cebadores pueden, por supuesto, ser más largos que los 17 nucleótidos consecutivos mencionados, y pueden, por ejemplo, tener 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de longitud o incluso más largos. Los cebadores pueden consistir enteramente en la secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de secuencias flanqueantes y de mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos localizados en 3') es menos crítica. Así, la secuencia de 5' de los cebadores puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o de mutación, según convenga, pero puede contener varios desapareamientos (por ejemplo, 1, 2, 5,
15 10). La secuencia de 5' de los cebadores puede incluso consistir enteramente en una secuencia de nucleótidos sin relacionar con las secuencias flanqueantes o de mutación, tales como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que representa sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Tales secuencias sin relacionar o secuencias de ADN flanqueantes con desapareamientos deben ser preferentemente no más largas de 100, más preferentemente no más largas de 50 o incluso 25 nucleótidos.
Además, cebadores adecuados pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos en su extremo 3' que abarca la región de unión entre secuencias flanqueantes y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB mutantes de la invención y la secuencia del uno o más nucleótidos insertados o sustituidos o la
25 secuencia 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, tales como la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea mutaciones de deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme en los genes FATB de la invención descrita anteriormente y la secuencia de las mutaciones terminadoras o del sitio de corte y empalme o la secuencia 3' que flanquea la mutación de deleción, o la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea una posible mutación del codón de terminación o del sitio de corte y empalme como se indica en las tablas anteriores y la secuencia de la posible mutación del codón de terminación o del sitio de corte y empalme), siempre que los nucleótidos localizados en 3' mencionados no se deriven exclusivamente de tanto la región de mutación como regiones flanqueantes.
También será inmediatamente claro para el experto que pares de cebadores de PCR apropiadamente seleccionados 35 tampoco deben comprender secuencias complementarias entre sí.
Con el fin de la invención, el “complemento de una secuencia de nucleótidos representada en SEC ID Nº: X” es la secuencia de nucleótidos que puede derivarse de la secuencia de nucleótidos representada reemplazando los nucleótidos por su nucleótido complementario según las reglas de Chargaff (A⇔T; G⇔C) y leyendo la secuencia en la dirección de 5' a 3', es decir, en dirección opuesta de la secuencia de nucleótidos representada.
Ejemplos de cebadores adecuados para identificar alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos.
Como se usa en el presente documento, “la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº. Z de posición X a posición Y” 45 indica la secuencia de nucleótidos que incluye ambos puntos extremos de nucleótidos.
Preferentemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 1000 nucleótidos, tal como una longitud entre 50 y 500 nucleótidos, o una longitud entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos pueden tener una secuencia que es entre el 80 y el 100 % idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante de 5' o 3', una secuencia dentro de la región de mutación, o una secuencia que abarca la región de unión entre las regiones flanqueantes de 3' o 5' y de mutación del alelo FATB mutante específico, siempre que los desapareamientos todavía permitan la identificación específica del alelo FATB mutante específico con estos cebadores bajo condiciones de PCR optimizadas. El intervalo de desapareamientos permisible, sin embargo, puede determinarse fácilmente experimentalmente y son conocidos para un experto en la materia.
55 La detección y/o identificación de un “fragmento específico de FATB mutante” puede producirse de diversas formas, por ejemplo, mediante la estimación del tamaño después de electroforesis en gel o capilar o mediante métodos de detección basados en fluorescencia. Los fragmentos específicos de FATB mutantes también pueden secuenciarse directamente. También se conocen en la técnica otros métodos específicos de secuencia para la detección de fragmentos de ADN amplificados.
En la materia se describen protocolos de PCR estándar, tales como en 'PCR Applications Manual” (Roche Molecular Biochemicals, 2ª edición, 1999) y otras referencias. Las condiciones óptimas para la PCR, que incluyen la secuencia de los cebadores específicos, se especifica en un “protocolo de identificación de PCR” para cada alelo FATB 65 mutante específico. Se entiende, sin embargo, que puede necesitarse ajustar varios parámetros en el protocolo de identificación de PCR a condiciones de laboratorio específicas, y pueden modificarse ligeramente para obtener
resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación de ADN puede requerir el ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa, concentración de MgCl2 o condiciones de hibridación usadas. Similarmente, la selección de otros cebadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación de PCR. Sin embargo, estos ajustes serán evidentes para un experto en la materia, y además se
5 detallan en los actuales manuales de aplicación de PCR tales como el citado anteriormente.
Ejemplos de protocolos de identificación de PCR para identificar alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos.
Alternativamente, pueden usarse cebadores específicos para amplificar un fragmento específico de FATB mutante que puede usarse como “sonda específica” para identificar un alelo FATB mutante específico en muestras biológicas. La puesta en contacto de ácido nucleico de una muestra biológica, con la sonda, en condiciones que permiten la hibridación de la sonda con su fragmento correspondiente en el ácido nucleico produce la formación de un híbrido de ácido nucleico/sonda. La formación de este híbrido puede detectarse (por ejemplo, marcando el ácido 15 nucleico o sonda), por lo que la formación de este híbrido indica la presencia del alelo FATB mutante específico. En la materia se han descrito tales métodos de identificación basados en hibridación con una sonda específica (tanto sobre un vehículo en fase sólida como en disolución). La sonda específica es preferentemente una secuencia que, bajo condiciones optimizadas, se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante de 5' o 3' y/o dentro de la región de mutación del alelo FATB mutante específico (denominada en lo sucesivo “región específica de mutación de FATB”). Preferentemente, la sonda específica comprende una secuencia de entre 20 y 1000 pb, 50 y 600 pb, entre 100 y 500 pb, entre 150 y 350 pb, que es al menos el 80 %, preferentemente entre el 80 y 85 %, más preferentemente entre el 85 y el 90 %, especialmente preferentemente entre el 90 y el 95 %, lo más preferentemente entre el 95 % y el 100 % idéntica (o complementaria) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferentemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 15 a
25 aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idéntica (o complementaria) a una región específica del alelo FATB mutante específico.
Sondas específicas adecuadas para la invención pueden ser las siguientes:
- -
- oligonucleótidos que oscilan en longitud de 20 nt a aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante de 5' de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, la secuencia 5' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' que flanquea las mutaciones de deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente o
35 la secuencia 5' que flanquea las posibles mutaciones del codón de terminación o del sitio de corte y empalme indicadas en las tablas anteriores), o una secuencia que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencias con la misma (sondas que reconocen secuencias flanqueantes de 5'); o -oligonucleótidos que oscilan en longitud de 20 nt a aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante de 3' de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, la secuencia 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB mutantes de la invención, tal como la secuencia 3' que flanquea las mutaciones de deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme descritas anteriormente o la secuencia 3' que flanquea las posibles mutaciones del codón de terminación o del sitio de corte y empalme indicadas en las tablas anteriores), o una secuencia que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencias con
45 la misma (sondas que reconocen secuencias flanqueantes de 3'); o -oligonucleótidos que oscilan en longitud de 20 nt a aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación de un alelo FATB mutante específico (es decir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos insertada o sustituida en los genes FATB de la invención, o el complemento de la misma), o una secuencia que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencias con la misma (sondas que reconocen secuencias de mutación).
Las sondas pueden consistir enteramente en la secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias flanqueantes y de mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de las sondas en sus extremos 5' o 3' es menos crítica. Así, las secuencias de 5' o 3' de las sondas pueden consistir en
55 una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o de mutación, según convenga, pero pueden consistir en una secuencia de nucleótidos sin relacionar con las secuencias flanqueantes o de mutación. Tales secuencias sin relacionar deben ser preferentemente no más largas de 50, más preferentemente no más largas de 25 o incluso no más largas de 20 ó 15 nucleótidos.
Además, sondas adecuadas pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos que abarca la región de unión entre secuencias flanqueantes y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos FATB mutantes de la invención y la secuencia del uno o más nucleótidos insertados o sustituidos o la secuencia 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, tal como la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea mutaciones de 65 deleción, terminadoras o del sitio de corte y empalme en los genes FATB de la invención descrita anteriormente y la secuencia de las mutaciones terminadoras o del sitio de corte y empalme o la secuencia 3' que flanquea la mutación
de deleción, o la región de unión entre una secuencia 5' que flanquea una posible mutación del codón de terminación o del sitio de corte y empalme como se indica en las tablas anteriores y la secuencia de la posible mutación del codón de terminación o del sitio de corte y empalme), siempre que la secuencia de nucleótidos mencionada no se derive exclusivamente de tanto la región de mutación como regiones flanqueantes.
5 Ejemplos de sondas específicas adecuadas para identificar alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos.
La detección y/o identificación de una “región específica de FATB mutante” que se hibrida con una sonda específica puede producirse de diversas formas, por ejemplo, mediante la estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o mediante métodos de detección basados en fluorescencia. También se conocen en la técnica otros métodos específicos de secuencia para la detección de una “región específica de FATB mutante” que se hibrida con una sonda específica.
15 Alternativamente, pueden generarse e identificarse plantas o partes de las plantas que comprenden uno o más alelos fatB mutantes usando otros métodos, tales como el método “Delete-a-gene™” que usa PCR para cribar mutantes de deleción generados por mutagénesis de neutrones rápidos (revisado por Li y Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258), por método de TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) que identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC) para detectar cambios de pares de bases por análisis de heterodúplex (McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, y McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442), etc. Como se ha mencionado, TILLING usa cribado de alto rendimiento para mutaciones (por ejemplo, usando la escisión con Cel 1 de heterodúplex de ADN mutante-no mutante y detección usando un sistema de gel de secuenciación). Así, el uso de TILLING para identificar plantas, semillas y tejidos que comprenden uno o más alelos fatB mutantes en uno o más tejidos y métodos para generar e
25 identificar tales plantas está englobado en el presente documento. Así, un método puede comprender las etapas de mutagenizar semillas de planta (por ejemplo, mutagénesis EMS), mezcla de individuos de plantas o ADN, amplificación por PCR de una región de interés, formación de heterodúplex y detección de alto rendimiento, identificación de planta mutante, secuenciación del producto de PCR mutante. Se entiende que igualmente pueden usarse otras mutagénesis y métodos de selección para generar tales plantas mutantes.
En lugar de inducir mutaciones en alelos fatB, pueden identificarse alelos mutantes naturales (espontáneos) por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6) para cribar una pluralidad de plantas o partes de las plantas para la presencia de alelos fatB mutantes naturales. En cuanto a las técnicas de mutagénesis anteriores, preferentemente se criban especies de Brassica que
35 comprenden un genoma A y/o C, de manera que el alelo fatB identificado pueda introducirse posteriormente en otras especies de Brassica, tales como Brassica napus, por cruce (cruces inter-o intraespecíficos) y selección. En ECOTILLING, los polimorfismos naturales en líneas de cultivo o especies relacionadas se criban para la metodología de TILLING descrita anteriormente, en la que plantas individuales o mezclas de plantas se usan para la amplificación por PCR de la diana fatB, formación de heterodúplex y análisis de alto rendimiento. Esto puede seguirse hasta seleccionar plantas individuales que tienen una mutación requerida que puede usarse posteriormente en un programa de cultivo para incorporar el alelo mutante deseado.
Los alelos mutantes identificados pueden entonces secuenciarse y la secuencia puede compararse con el alelo no mutante para identificar la(s) mutación (mutaciones). Opcionalmente, puede probarse la funcionalidad por expresión
45 en un huésped homólogo o heterólogo y probar la proteína FATB mutante para funcionalidad en un ensayo enzimático. Usando este enfoque puede identificarse una pluralidad de alelos fatB mutantes (y plantas de Brassica que comprenden uno o más de estos). Los alelos mutantes deseados pueden entonces combinarse con los alelos no mutantes deseados por métodos de cruces y de selección como se describe adicionalmente más adelante. Finalmente, se genera una única planta que comprende el número deseado de fatB mutante y el número deseado de alelos FATB no mutantes.
También pueden usarse oligonucleótidos adecuados como cebadores de PCR o sondas específicas para la detección de un alelo FATB mutante específico para desarrollar métodos para determinar el estado de cigosidad del alelo FATB mutante específico.
55 Para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, puede desarrollarse un ensayo basado en PCR para determinar la presencia de un mutante y/o alelo específico FATB no mutante correspondiente:
Para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, pueden diseñarse dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FATB no mutante de tal forma que se dirijan el uno hacia el otro y tengan la región de mutación localizada entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes de 5' y 3', respectivamente. Este conjunto de cebadores permite la amplificación por PCR diagnóstica simultánea del mutante, además del alelo FATB no mutante correspondiente.
65 Alternativamente, para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, pueden diseñarse dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FATB no mutante de tal forma que se dirijan el uno hacia el
otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante de 5' o 3' y la región de mutación del alelo FATB no mutante, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la secuencia de la región de mutación en el alelo FATB mutante, permite la amplificación por PCR
5 diagnóstica simultánea del gen FATB mutante, además del gen FATB no mutante.
Alternativamente, para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, pueden diseñarse dos cebadores que reconocen específicamente el alelo FATB no mutante de tal forma que se dirijan el uno hacia el otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de unión entre la región flanqueante de 5' o 3' y la 10 región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia flanqueante de 5' o 3' y la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante de 3' o 5' del alelo FATB no mutante, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante de 3' o 5' del alelo FATB mutante, respectivamente, permite la amplificación por PCR diagnóstica simultánea del gen FATB mutante, además
15 del gen FATB no mutante.
Alternativamente, el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico puede determinarse usando conjuntos de cebadores alternativos que reconocen específicamente alelos FATB mutantes y no mutantes.
20 Si la planta es homocigótica para el gen FATB mutante o el gen FATB no mutante correspondiente, los ensayos de PCR de diagnóstico descritos anteriormente darán lugar a un único producto de PCR típico, preferentemente de longitud típica, para tanto el alelo FATB mutante como no mutante. Si la planta es hemicigótica para el alelo FATB mutante, aparecerán dos productos de PCR específicos, reflejando tanto la amplificación del alelo FATB mutante como no mutante.
25 La identificación de los productos de PCR específicos de FATB no mutante y mutante puede producirse, por ejemplo, por estimación del tamaño después de electroforesis en gel o capilar (por ejemplo, para alelos FATB mutantes que comprenden varios nucleótidos insertados o delecionados que producen una diferencia de tamaño entre los fragmentos amplificados del alelo FATB no mutante y mutante, de forma que dichos fragmentos puedan
30 separarse visiblemente sobre un gel); evaluando la presencia o ausencia de los dos fragmentos diferentes después de electroforesis en gel o capilar, por lo que la amplificación por PCR de diagnóstico del alelo FATB mutante puede, opcionalmente, realizarse por separado de la amplificación por PCR de diagnóstico del alelo FATB no mutante; por secuenciación directa de los fragmentos amplificados; o por métodos de detección basados en fluorescencia.
35 Ejemplos de cebadores adecuados para determinar la cigosidad de alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos.
Alternativamente, para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, puede desarrollarse un ensayo basado en hibridación para determinar la presencia de un alelo específico FATB mutante y/o no mutante
40 correspondiente:
Para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, pueden diseñarse dos sondas específicas que reconocen el alelo FATB no mutante de tal forma que cada sonda reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo no mutante FATB y que la región de mutación se localice entre las secuencias
45 reconocidas por las sondas. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes de 5' y 3', respectivamente. El uso de una o, preferentemente, ambas de estas sondas permite hibridación diagnóstica simultánea del mutante, además del alelo FATB no mutante correspondiente.
Alternativamente, para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, pueden diseñarse
50 dos sondas específicas que reconocen el alelo FATB no mutante de tal forma que una de ellas reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo no mutante FATB en la dirección 5' o en la dirección 3' de la región de mutación, preferentemente en la dirección 5' de la región de mutación, y que una de ellas reconozca específicamente la región de mutación. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante de 5' o 3', preferentemente la región flanqueante de 5', y la región de mutación
55 del alelo FATB no mutante, respectivamente. El uso de una o, preferentemente, ambas de estas sondas, opcionalmente, junto con una tercera sonda que reconoce específicamente la secuencia de la región de mutación en el alelo FATB mutante, permite hibridación diagnóstica del gen FATB mutante y del no mutante.
Alternativamente, para determinar el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico, puede diseñarse una
60 sonda específica que reconoce el alelo FATB no mutante de tal forma que la sonda reconozca específicamente la región de unión entre la región flanqueante de 5' o 3', preferentemente la región flanqueante de 5', y la región de mutación del alelo FATB no mutante. Esta sonda, opcionalmente, junto con una segunda sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante de 5' o 3', preferentemente la región flanqueante de 5', y la región de mutación del alelo FATB mutante, permite la hibridación diagnóstica del gen FATB mutante y del no
65 mutante.
Alternativamente, el estado de cigosidad de un alelo FATB mutante específico puede determinarse usando conjuntos alternativos de sondas que reconocen específicamente alelos FATB mutantes y no mutantes.
Si la planta es homocigótica para el gen FATB mutante o el gen FATB no mutante correspondiente, los ensayos de
5 hibridación diagnósticos descritos anteriormente darán lugar a un único producto de hibridación específico, tal como uno o más fragmentos de ADN de hibridación (restricción), típicos, preferentemente de longitud típica, para tanto el alelo FATB mutante como no mutante. Si la planta es hemicigótica para el alelo FATB mutante, aparecerán dos productos de hibridación específicos, que reflejan tanto la hibridación del alelo FATB mutante como no mutante.
La identificación de los productos de hibridación específicos de FATB no mutante y mutante puede producirse, por ejemplo, por estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o capilar (por ejemplo, para los alelos FATB mutantes que comprenden varios nucleótidos insertados o delecionados que producen una diferencia de tamaño entre los fragmentos de ADN de hibridación (restricción) del alelo FATB no mutante y mutante, de forma que dichos fragmentos puedan separarse visiblemente sobre un gel); evaluando la presencia o ausencia de los dos productos
15 de hibridación específicos diferentes después de la electroforesis en gel o capilar, por lo que la hibridación diagnóstica del alelo FATB mutante puede, opcionalmente, realizarse por separado de la hibridación diagnóstica del alelo FATB no mutante; por secuenciación directa de fragmentos de ADN de hibridación (restricción); o por métodos de detección basados en fluorescencia.
Ejemplos de sondas adecuadas para determinar la cigosidad de alelos FATB mutantes específicos se describen en los ejemplos.
Además, también pueden desarrollarse métodos de detección específicos para un alelo FATB mutante específico que se diferencian de métodos de amplificación de PCR o basados en hibridación usando la información de
25 secuencias específica de alelo FATB mutante específico proporcionada en el presente documento. Tales métodos de detección alternativos incluyen métodos de detección por amplificación de señales lineales basados en la escisión invasiva de estructuras de ácido nucleico particulares, también conocidos como tecnología InvaderTM, (como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.985.557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”, 6.001.567 “Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage), métodos de detección basados en RT-PCR, tales como Taqman, u otros métodos de detección, tales como SNPlex.
Kits
Un “kit”, como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de reactivos con el fin de realizar el método
35 como se describe en el presente documento, más particularmente, la identificación de un alelo FATB mutante específico en muestras biológicas o la determinación del estado de cigosidad de material de planta que comprende un alelo FATB mutante específico. Más particularmente, un kit puede comprender al menos dos cebadores específicos, como se ha descrito anteriormente, para la identificación de un alelo FATB mutante específico, o al menos dos o tres cebadores específicos para la determinación del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en el presente documento en el protocolo de identificación de PCR. Alternativamente, el kit puede comprender al menos una sonda específica, que se hibrida específicamente con ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de un alelo FATB mutante específico en su interior, como se ha descrito anteriormente, para la identificación de un alelo FATB mutante específico, o al menos dos o tres sondas específicas para la determinación del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede
45 comprender además cualquier otro reactivo (tal como, pero no se limita a, tampón de hibridación, marca) para la identificación de un alelo FATB mutante específico en muestras biológicas, usando la sonda específica.
El kit puede usarse, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, para fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia de un alelo FATB mutante específico en material de planta o material que comprende o derivado de material de planta, tal como, pero no se limita a, productos alimenticios o de pienso.
El término “cebador”, como se usa en el presente documento, engloba cualquier ácido nucleico que pueda cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde, tal como PCR. Normalmente, los
55 cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero pueden emplearse secuencias más largas. Pueden proporcionarse cebadores en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Las sondas pueden usarse como cebadores, pero se diseñan para unirse al ADN o ARN diana y no necesitan usarse en un proceso de amplificación.
El término “reconocer”, como se usa en el presente documento cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos se hibridan específicamente con una secuencia de ácidos nucleicos en un alelo FATB mutante específico en las condiciones expuestas en el método (tal como las condiciones del protocolo de identificación de PCR), por lo que la especificidad se determina por la presencia de controles positivos y negativos.
65 El término “hibridar”, como se usa en el presente documento cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al
hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácidos nucleicos de un alelo FATB mutante específico bajo condiciones de rigurosidad estándar. Condiciones de rigurosidad estándar, como se usan en el presente documento, se refiere a las condiciones para la hibridación descrita en el presente documento o para las condiciones de hibridación convencionales como se describen por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A
5 Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, pueden comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico de planta o ADN de biblioteca de BAC sobre un filtro, 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 65 ºC en 6 X SSC, 5 X reactivo de Denhardt, 0,5 % de SDS y 20 µg/ml de ADN de portador desnaturalizado, 3) añadir la sonda de hibridación que se ha marcado, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro una vez durante 30 min a 68 ºC en 6X SSC, 0,1 % de SDS, 6) lavar el filtro tres veces (dos veces durante 30 min en 30 ml y una vez durante 10 min en 500 ml) a 68 ºC en 2 X SSC, 0,1 % de SDS, y 7) exponer el filtro durante 4 a 48 horas a película de rayos X a -70 ºC.
Como se usa en el presente documento, una “muestra biológica” es una muestra de una planta, material de planta o producto que comprende material de planta. El término “planta” pretende englobar tejido de plantas de Brassica, en
15 cualquier estado de madurez, además de cualquier célula, tejido u órgano tomado de o derivado de cualquier planta tal, que incluye sin limitación, cualquier semilla, hoja, tallo, flor, raíz, célula individual, gameto, cultivo celular, cultivo de tejido o protoplasto. “Material de planta”, como se usa en el presente documento, se refiere a material que se obtiene o deriva de una planta. Los productos que comprenden material de planta se refieren a alimento, pienso u otros productos que se producen usando material de planta o pueden estar contaminados por material de planta. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, tales muestras biológicas se prueban para la presencia de ácidos nucleicos específicos para un alelo FATB mutante específico, que implican la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Así, los métodos citados en el presente documento para identificar un alelo FATB mutante específico en muestras biológicas se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el alelo FATB mutante específico.
25 También se describe la transferencia de uno o más alelo(s) FATB mutante(s) específico(s) en una planta de Brassica a otra planta de Brassica, a la combinación de alelos FATB específicos en una planta, a las plantas que comprenden uno o más alelo(s) FATB mutante(s) específico(s), la progenie obtenida de estas plantas y a las células vegetales, o material de planta derivado de estas plantas.
Así, es adecuado para la invención un método para transferir un alelo FATB mutante de una planta de Brassica a otra planta de Brassica que comprende las etapas de:
- (a)
- cruzar una planta de Brassica que comprende un alelo FATB mutante, como se ha descrito 35 anteriormente, con una segunda planta de Brassica,
- (b)
- recoger semillas híbridas F1 del cruce,
- (c)
- opcionalmente, retrocruzar las plantas F1, derivadas de las semillas F1, durante una o más generaciones (x), recoger semillas BCx de los cruces e identificar en cada generación plantas BCx, derivadas de las semillas BCx, que comprenden el alelo FATB mutante como se ha descrito anteriormente,
- (d)
- opcionalmente, extraer plantas haploides dobles de las células de microespora o de polen tratadas de plantas F1 o BC1 para obtener plantas homocigóticas,
- (e)
- autofecundar las plantas F1 o BCx, derivadas de las semillas F1 o BCx,
- (f)
- recoger semillas F1 S1 o BCx S1 de la autofecundación,
- (g)
- identificar plantas F1 S1 o BCx S1, derivadas de las semillas F1 S1 o BCx S1, que comprenden el alelo 45 FATB mutante como se ha descrito anteriormente.
También se describe un método para combinar al menos dos alelos FATB mutantes en una planta de Brassica que comprende las etapas de:
- (a)
- transferir alelo(s) FATB mutante(s) de una planta de Brassica a otra planta de Brassica como se ha descrito anteriormente,
- (b)
- repetir la etapa (a) hasta que se combinen el número deseado y/o tipos de alelos FATB mutantes en la segunda planta.
55 Por tanto, se describe un método para preparar una planta de Brassica que comprende al menos 3 alelos fatB mutantes de tres genes FATB diferentes en el presente documento, que comprende las etapas de:
- (a)
- combinar al menos tres alelos FATB mutantes de al menos tres genes FATB diferentes en una planta de Brassica, como se ha descrito anteriormente,
- (b)
- opcionalmente, identificar una planta, o parte de la misma, que es homocigótica o heterocigótica para uno o más alelos FATB mutantes determinando el estado de cigosidad del uno o más alelos FATB mutantes, como se ha descrito anteriormente,
- (c)
- opcionalmente, identificar una planta, o parte de la misma, con una cantidad significativamente reducida de proteína FATB funcional,
65 (d) opcionalmente, identificar una planta, que produce un aceite de semillas, cuya composición de ácidos grasos es significativamente alterada en comparación con la composición de ácidos grasos del aceite de
semillas de una planta de Brassica no mutante correspondiente,
(e) opcionalmente, cultivar tales plantas y aislar el aceite de semillas de tales plantas para consumo humano.
5 Aceites de semillas de plantas
Se describen tanto aceite “bajo en saturados” como “sin saturados” derivado de semillas de plantas de Brassica según la invención, especialmente de plantas de Brassica napus como se ha proporcionado en el presente documento, pero también de otras especies oleaginosas de Brassica. Por ejemplo, especies oleaginosas de Brassica que comprenden los genes FATB-A y/o FATB-C mutantes, tales como Brassica juncea y Brassica rapa.
Se encontró que las plantas de Brassica napus que comprenden una mutación, que produce una reducción significativa en la cantidad de proteína FATB funcional codificada por el equivalente no mutante del alelo fatB mutante, en solo uno o dos de los seis genes FATB no es suficiente para reducir significativamente el porcentaje (%
15 en peso) de ácidos grasos saturados en el aceite de semillas de las plantas. Se cree que al menos tres alelos fatB mutantes, de tres genes FATB diferentes (seleccionados de FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3) necesitan estar comprendidos en la planta con el fin de obtener plantas que produzcan un aceite de semillas bajo o sin saturados.
Así, en un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir aceite de semillas “bajo en saturados” o “sin saturados” que comprende recoger semillas de plantas de Brassica que comprenden al menos 3 alelos fatB mutantes de tres genes FATB diferentes (seleccionados de FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3), por lo que los alelos fatB mutantes producen una cantidad significativamente reducida de proteína FATB funcional del tipo codificado por el equivalente no mutante de estos alelos mutantes y así una cantidad
25 significativamente reducida global de las proteínas FATB funcionales producidas en las células vegetales, específicamente en las semillas en desarrollo, in vivo.
El aceite de semillas “bajo en saturados” o “sin saturados” puede derivarse de semillas de plantas de Brassica mutantes triples para FATB homocigóticas, mutantes cuádruples para FATB homocigóticas y/o mutantes quíntuples para FATB homocigóticas, por lo que los alelos mutantes están seleccionados de los genes FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3.
Además, el aceite de semillas “bajo en saturados” o “sin saturados” puede derivarse de semillas de plantas de Brassica mutantes triples para FATB homocigóticas, mutantes cuádruples para FATB homocigóticas y/o mutantes
35 quíntuples para FATB homocigóticas, en el que las plantas mutantes o partes de las plantas son heterocigóticas para el alelo FATB mutante adicional, y en el que los alelos mutantes están seleccionados de los genes FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3.
Combinando copias suficientes de alelos fatB mutantes específicos con copias suficientes de alelos FATB no mutantes específicos en una planta es posible ajustar la cantidad y/o tipo de proteínas FATB funcionales preparadas, que a su vez influye en la exportación de (la cantidad y/o tipo de) ácidos grasos saturados libres del plástido y así la composición de ácidos grasos del aceite de semillas producido.
Así, es adecuado para la invención aceite de semillas que comprende una cantidad específica y/o tipo de ácidos
45 grasos saturados derivados de semillas de plantas de Brassica que comprende al menos un alelo FATB mutante específico según la invención y al menos un alelo FATB no mutante específico según la invención, por lo que la combinación específica del mutante y el (los) alelo(s) FATB no mutante(s) produce una cantidad específica y/o tipo de proteínas FATB funcionales producidas en las células vegetales, específicamente en las semillas en desarrollo, in vivo.
También se describe el uso del aceite de semillas de la presente invención en aplicaciones alimentarias, en particular aplicaciones alimentarias en las que se prevé un beneficio para la salud humana. Aunque los aceites como se describe en el presente documento son principalmente útiles como aceites para la dieta humana (aplicaciones alimentarias), también podrían tener utilidad en la dieta de animales (aplicaciones alimentarias). Otras aplicaciones,
55 tales como mezclar aceite de semillas con una cantidad y/o composición específica relativa modificada de ácidos grasos saturados como se describe en el presente documento, en particular aceite de semillas que contiene significativamente menos del 7 % de ácidos grasos saturados como se describe en el presente documento, con otros aceites vegetales, en particular aceites vegetales que contienen significativamente más del 7 % de ácidos grasos saturados, tales como los mencionados en la sección de antecedentes, para reducir el nivel de ácidos grasos saturados en el último haciéndolo así más adecuado para ciertas aplicaciones tales como, pero no se limitan a, para la producción de biodiesel, también son adecuados para la invención.
SECUENCIAS
65 El listado de secuencias representa el ADN que codifica la proteína FATB genómica de las secuencias de FATB no mutantes. Estas secuencias comprenden 5 exones interrumpidos por 4 intrones. En el ADNc y ARNm procesado
correspondiente (es decir, el ARN cortado y empalmado) se eliminan intrones y se unen exones. Así, por ejemplo, el ADNc del gen FATB-A1 que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 de posición 1-504, 590-723, 798-911, 981-1152 y 1243-1560.
5 Genes FATB
SEC ID Nº 1: ADN del gen FATB-A1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza
oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 2: proteína FATB-A1 no mutante codificada por SEC ID Nº: 1.
SEC ID Nº 3: ADN del gen FATB-A2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A2 no mutante de colza
oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 4: proteína FATB-A2 no mutante codificada por SEC ID Nº: 3.
15 SEC ID Nº 5: ADN del gen FATB-A3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A3 no mutante de colza oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus. SEC ID Nº 6: proteína FATB-A3 no mutante codificada por SEC ID Nº: 5.
SEC ID Nº 7: ADN del gen FATB-C1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C1 no mutante de colza
oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 8: proteína FATB-C1 no mutante codificada por SEC ID Nº: 7.
SEC ID Nº 9: ADN del gen FATB-C2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C2 no mutante de colza oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus. 25 SEC ID Nº 10: proteína FATB-C2 no mutante codificada por SEC ID Nº: 9.
SEC ID Nº 11: ADN del gen FATB-C3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C3 no mutante de colza
oleaginosa de invierno (WOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 12: proteína FATB-C3 no mutante codificada por SEC ID Nº: 11.
SEC ID Nº 13: ADN del gen FATB-A1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A1 no mutante de colza
oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 14: proteína FATB-A1 no mutante codificada por SEC ID Nº: 13.
35 SEC ID Nº 15: ADN del gen FATB-A2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A2 no mutante de colza oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus. SEC ID Nº 16: proteína FATB-A2 no mutante codificada por SEC ID Nº: 15.
SEC ID Nº 17: ADN del gen FATB-A3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-A3 no mutante de colza
oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 18: proteína FATB-A3 no mutante codificada por SEC ID Nº: 17.
SEC ID Nº 19: ADN del gen FATB-C1 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C1 no mutante de colza oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus. 45 SEC ID Nº 20: proteína FATB-C1 no mutante codificada por SEC ID Nº: 19.
SEC ID Nº 21: ADN del gen FATB-C2 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C2 no mutante de colza
oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 22: proteína FATB-C2 no mutante codificada por SEC ID Nº: 21.
SEC ID Nº 23: ADN del gen FATB-C3 (con intrones), que codifica una proteína FATB-C3 no mutante de colza
oleaginosa de verano (SOSR) Brassica napus.
SEC ID Nº 24: proteína FATB-C3 no mutante codificada por SEC ID Nº: 23.
Cebadores y sondas
SEC ID Nº 25: sonda 5' At FATB1
SEC ID Nº 26: cebador de oligonucleótidos KVA05-14
SEC ID Nº 27: cebador de oligonucleótidos KVA05-15
SEC ID Nº 28: sonda 3' At FATB1
SEC ID Nº 29: cebador de oligonucleótidos KVA05-16
65 SEC ID Nº 30: cebador de oligonucleótidos KVA05-17 SEC ID Nº 31: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1 (SEC ID Nº: 13)
SEC ID Nº 32: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1 (SEC ID Nº: 13) SEC ID Nº 33: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2 (SEC ID Nº: 15) SEC ID Nº 34: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2 (SEC ID Nº: 15) SEC ID Nº 35: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A3 (SEC ID Nº: 17)
5 SEC ID Nº 36: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3 (SEC ID Nº: 17)
SEC ID Nº 37: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1 (SEC ID Nº: 19)
SEC ID Nº 38: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C1 (SEC ID Nº: 19)
SEC ID Nº 39: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2 (SEC ID Nº: 21)
SEC ID Nº 40: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2 (SEC ID Nº: 21)
SEC ID Nº 41: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C3 (SEC ID Nº: 23)
SEC ID Nº 42: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C3 (SEC ID Nº: 23)
SEC ID Nº 43: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1
SEC ID Nº 44: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2
SEC ID Nº 45: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2
15 SEC ID Nº 46: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3 SEC ID Nº 47: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C1 SEC ID Nº 48: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2 SEC ID Nº 49: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C3 SEC ID Nº 50: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1-EMS05 SEC ID Nº 51: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1 SEC ID Nº 52: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1-EMS05 y -A1 SEC ID Nº 53: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1-EMS06 SEC ID Nº 54: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1 SEC ID Nº 55: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1-EMS06 y -A1
25 SEC ID Nº 56: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2-EMS05 SEC ID Nº 57: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2 SEC ID Nº 58: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2-EMS05 y -A2 SEC ID Nº 59: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2-EMS01 SEC ID Nº 60: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2 SEC ID Nº 61: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2-EMS01 y -A2 SEC ID Nº 62: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3-EMS01 SEC ID Nº 63: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3 SEC ID Nº 64: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A3-EMS01 y -A3 SEC ID Nº 65: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1-EMS05
35 SEC ID Nº 66: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1 SEC ID Nº 67: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C1-EMS05, -C1-EMS04 y -C1 SEC ID Nº 68: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1-EMS04 SEC ID Nº 69: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1 SEC ID Nº 70: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2-EMS02 SEC ID Nº 71: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2 SEC ID Nº 72: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2-EMS02 y -C2 SEC ID Nº 73: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2-EMS03 SEC ID Nº 74: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2 SEC ID Nº 75: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2-EMS03 y -C2
45 SEC ID Nº 76: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C3-EMS02 SEC ID Nº 77: Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C3 SEC ID Nº 78: Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C3-EMS02 y -C3 SEC ID Nº 81: Oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS05 SEC ID Nº 82: Oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS05 SEC ID Nº 83: Oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS06 SEC ID Nº 84: Oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS06 SEC ID Nº 85: Oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS01 SEC ID Nº 86: Oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS01 SEC ID Nº 87: Oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS05
55 SEC ID Nº 88: Oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS05 SEC ID Nº 89: Oligonucleótido para la detección de FATB-A3-EMS01 SEC ID Nº 90: Oligonucleótido para la detección de FATB-A3-EMS01 SEC ID Nº 91: Oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS04 SEC ID Nº 92: Oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS04 SEC ID Nº 93: Oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS05 SEC ID Nº 94: Oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS05 SEC ID Nº 95: Oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS02 SEC ID Nº 96: Oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS02 SEC ID Nº 97: Oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS03
65 SEC ID Nº 98: Oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS03 SEC ID Nº 99: Oligonucleótido para la detección de FATB-C3-EMS02
SEC ID Nº 100: Oligonucleótido para la detección de FATB-C3-EMS02
SEC ID Nº 101: Oligonucleótido para la detección de ENDO1
SEC ID Nº 102: Oligonucleótido para la detección de ENDO1
5 A menos que se establezca de otro modo en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según protocolos convencionales como se describen en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU., y en los volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (UK). Materiales y métodos convencionales para el trabajo molecular de plantas se describe en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications, RU. Materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR -Basics: From Background to Bench, primera edición, Springer Verlag, Alemania. Procedimientos convencionales
15 para el análisis de AFLP se describen en Vos et al. (1995, NAR 23:4407-4414) y en la solicitud de patente EP publicada EP 534858.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 -Determinación del número de genes FATB en Brassica napus y aislamiento de las secuencias deADN de los genes FATB
Para determinar el número de genes FATB en Brassica napus y las secuencias de los diferentes genes FATB, se cribaron bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de diferentes variedades de Brassica napus del
25 siguiente modo:
Para identificar colonias de Escherichia coli que contienen un clon de BAC que comprende una secuencia de FATB de diferentes variedades de Brassica napus, bibliotecas de BAC de una línea de colza oleaginosa de verano élite de Brassica napus (en lo sucesivo llamada “SOSR”) y de la variedad Express de colza oleaginosa de invierno de Brassica napus (en lo sucesivo llamada “WOSR Express”) (tamaño promedio de clones superior a 120 kb) presentadas como clones duplicados individuales sobre filtros de nailon de alta densidad se cribaron por procedimientos de hibridación Southern estándar:
35 -Se prepararon moldes de ADN para la preparación de sondas para detectar los genes FATB de Brassica por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR): -Moldes:
- (a)
- un vector pGEM5Zf(+) que comprende un fragmento de 487 pb de la parte 5' del gen FATB1 de Arabidopsis thaliana cv. Colombia (Atlg08510) (SEC ID Nº: 25) (pKVA48)
- (b)
- un vector pGEM5Zf(+) que comprende un fragmento de 352 pb de la parte 3' del gen FATB1 de
Arabidopsis thaliana cv. Colombia (SEC ID Nº: 28) (pKVA49)
-Cebadores:
(a) Cebador directo: 5'-GAACTTTCATCAACCAGTTACC-3' (KVA05-14 -SEC ID Nº: 26) 45 Cebador inverso: 5'-TTATGC-AAGAGGATAGCTTACC-3' (KVA05-15 -SEC ID Nº: 27)
(b) Cebador directo: 5-CAGTGTGTGGGTGATGATGA-3' (KVA05-16 -SEC ID Nº: 29) Cebador inverso: 5'-TATTCCCACTGGAGCACTCT-3' (KVA05-17 -SEC ID Nº: 30)
- -
- Mezcla de PCR: 20 µl de 10 x tampón de PCR, 2 µl de dNTP (25 mM), 1 µl de Taq polimerasa (5 U/µl), 168 µl de H2O, y -4 µl de KVA05-14 (10 µM), 4 µl de KVA05-15 (10 µM), 1 µl de pKVA48 (20 pg/µl), -4 µl de KVA05-16 (10 µM), 4 µl de KVA05-17 (10 µM), 1 µl de pKVA49 (20 pg/µl), dividido en 4x 50 µl
- -
- Perfil de termociclado: 4 min a 94 ºC; 5x [1 min a 94 ºC (desnaturalización) y 1 min a 50 ºC 55 (hibridación) y 2 min a 72 ºC (extensión)]; 25 x [40 s a 94 ºC (desnaturalización) y 40 s a 50 ºC (hibridación) y 1 min a 72 ºC (extensión)]; 5 min a 72 ºC; enfriamiento 10 ºC -Esto generó:
- (a)
- el fragmento de ADN de 487 pb del gen FATB1 de Arabidopsis (SEC ID Nº: 25; “sonda 5' AtFATB1”) comprendido en el vector pKVA48.
- (b)
- el fragmento de ADN de 352 pb del gen FATB1 de Arabidopsis (SEC ID Nº: 28; “sonda 3' AtFATB1”) comprendido en el vector pKVA49.
- -
- Se purificaron los fragmentos de ADN y los fragmentos de ADN de 478 pb (“sonda 5' AtFATB1”) se marcaron según procedimientos convencionales (por ejemplo, usando -32P-dCTP y perlas de marcado de ADN Ready-To-Go -Amersham Bioscience®) y se usaron para hibridarse con el ADN
65 sobre la membrana de nailon. Alternativamente, pueden marcarse los fragmentos de ADN de 352 pb (“sonda 3' AtFATB1”) y usarse para hibridarse con el ADN sobre la membrana de nailon.
- -
- Se realizó pre-hibridación durante 2 horas a 65 ºC en 30 ml del siguiente tampón de hibridación: 6X SSC (20X SSC contiene NaCl 3,0 M, citrato de Na 0,3 M, pH 7,0), 5X Denhardt's (100X Denhardt contiene 2 % de Ficoll, 2 % de polivinilpirrolidona, 2 % de albúmina de suero bovino), 0,5 % de SDS y 20 µg/ml de ADN de portador desnaturalizado (ADN de esperma de pescado
5 monocatenario, con una longitud promedio de 120 -3000 nucleótidos)
-La hibridación se realizó bajo las siguientes condiciones:
- -
- La sonda marcada se desnaturalizó calentando durante 5 minutos a 95 ºC y enfriando sobre hielo durante 5 minutos y se añadió a 15 ml de tampón de hibridación (mismo tampón que para la pre-hibridación)
- -
- La hibridación se realizó durante la noche a 65 ºC.
- -
- Las transferencias se lavaron tres veces durante 30 minutos a 65 ºC en los tubos de hibridación (una vez con 30 ml de 6x SSC con 0,1 % de SDS y dos veces con 30 ml de 2x SSC con 0,1 % de SDS) y una vez durante 10 minutos a 65 ºC con 500 ml de 2x SSC con 0,1 % de SDS en una caja. -Se expusieron películas Kodak X-OMAT AR a las transferencias radiactivas durante 4 horas a -70
15 ºC. -Basándose en las señales positivas, 72 colonias de E. coli que contienen un clon de BAC que comprende una secuencia de FATB se recogieron cribando la biblioteca de BAC de WOSR Express (nº total de positivos: 114) y 40 cribando la biblioteca de BAC de SOSR (nº total de positivos: 135) en un segundo cribado de bibliotecas de BAC (en lo sucesivo llamadas “colonias positivas”).
Para identificar colonias positivas que comprenden un clon de BAC con una secuencia genómica de longitud
25 completa de uno de los genes FATB, se realizó un análisis de transferencia Southern sobre ADN del clon BAC aislado de las colonias positivas y sobre ADN genómico aislado de Brassica napus:
- -
- Se aisló ADN de clon de BAC mediante lisis alcalina como se ha descrito en la materia de las colonias positivas cultivadas en 100 ml (para WOSR Express) o en 25 ml (para SOSR) de medio de caldo de Luria que contenía 25 µg/ml de cloranfenicol.
- -
- Se aisló ADN genómico de tejido de hoja de la colza oleaginosa de invierno de B. napus variedad Darmor (en lo sucesivo llamada “WOSR Darmor”) según el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15).
- -
- La concentración de ADN de cada preparación se estimó comparando la intensidad de banda de 1 µl de cada
35 muestra con la intensidad de banda de 1, 2, 4, 8 y 20 µl de una disolución que contenía 25 ng/µl de ADN lambda (Life Technologies®) sobre un gel de agarosa al 1 % de TBE (Invitrogen®) (Roche®) que contenía bromuro de etidio (ICN Biochemicals®). -Se digirieron 100-200 ng (para WOSR Express) o 10 ng (para SOSR) de ADN de clon de BAC y 1,7 µg de ADN genómico aislado de WOSR Darmor con las enzimas de restricción AseI y EcoRV en un volumen de reacción final de 20 µl, aplicando condiciones propuestas por el fabricante (New England Biolabs). El tiempo de digestión y/o cantidad de enzima de restricción se ajustaron para garantizar la digestión completa de las muestras de ADN genómico sin degradación no específica.
- -
- Después de la digestión, se añadieron 2 µl de colorante de carga que contenía RNasa (12,5 ml de 1 % de xilenocianol FF; 12,5 ml de 1 % de azul de bromofenol soluble en indicador de agua; 25 ml de glicerol; 100 µl de 45 EDTA 0,5 M a pH 8; 1 µl de RNasa (10 mg/ml)) a las muestras de ADN digeridas y las muestras se incubaron
durante 30 min a 37 ºC. -Las muestras se cargaron sobre un 1 % de gel de agarosa TAE. -Se incluyó ADN de fago lambda (Fermentas®) digerido con PstI (que genera 29 fragmentos (en pb): 11501,
5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 – los fragmentos en cursiva no son visibles en electroforesis estándar) (para WOSR Express) o escalera de ADN de1 kbp (Life Technologies) (para SOSR) como patrón de tamaño.
- -
- Después de la electroforesis, las muestras de ADN (clon de BAC digerido y ADN genómico) se transfirieron a una membrana de nailon (Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech®) por transferencia capilar en álcali seco. -Las membranas de nailon con clon de BAC digerido y ADN genómico se cribaron por procedimientos de
55 hibridación Southern estándar como se ha descrito anteriormente para los cribados de bibliotecas de BAC, excepto que para el ADN genómico las películas Kodak XOMAT AR se expusieron a las transferencias radiactivas durante 2 días a -70 ºC. -Basándose en una comparación entre los patrones de hibridación obtenidos después de la digestión de ADN de clon de BAC de las colonias positivas identificadas y de ADN genómico aislado de Brassica napus WOSR Darmor con las enzimas de restricción AseI y EcoRV e hibridación con la sonda 5' At FATB1 (SEC ID Nº: 25) (véase la Tabla 14) y el número de clones de BAC que muestran un patrón de restricción particular, los clones de BAC se agruparon en 6 grupos y para cada uno de los 6 grupos se seleccionó un clon de BAC que contenía un secuencia de FATB de longitud completa (llamada FATB1 a 6). -Las secuencias de FATB comprendidas en los clones de BAC de las colonias positivas seleccionadas se
65 determinaron por técnicas de secuenciación estándar (Agowa).
Tabla 14: Patrón de hibridación del clon de BAC digerido y ADN genómico hibridado con la sonda 5' AtFATB1 (SEC ID Nº: 25)
- Muestra de ADN:
- ADN genómico de WOSR Darmor ADN de clon de BAC de WOSR Express ADN de clon de BAC de SOSR Se corresponde con
- limitado con:
- Longitud estimada de los fragmentos de ADN de hibridación:
- AseI
- 2,2 2,2 2,2 FATB1
- 8,8
- 8,8
- 4,5 FATB2
- 2,4
- 5,5 2,4 FATB3
- 2,2
- 2,2
- 2,2
- FATB4
- 3,0
- 3,0
- 3,0
- FATB5
- 1,7
- 1,7
- 1,7
- FATB6 (a)
- 0,8
- 0,8
- 0,8
- FATB6 (b)
- EcoRV
- 12 11 FATB1
- 2,7
- 2,7
- FATB2
- 3,5
- 3,5
- FATB3 (a)
- 0,65
- 0,65
- FATB3 (b)
- 4,5
- 4,5
- FATB4
- 2,9
- 2,9
- FATB5
- 4,2
- 4,2
- FATB6
5 La presencia de 6 grupos distintos de clones de BAC se confirmó por análisis de AFLP sobre el ADN de clon de BAC de las colonias positivas identificadas y de ADN genómico aislado de WOSR Darmor de Brassica napus (Vos et al., 1995, Nucleic Acids Research 23 (21):4407-4414).
Ejemplo 2 -Caracterización de secuencias de genes FATB de Brassica napus
10 Después de la secuenciación, las regiones codificantes de las secuencias de FATB se determinaron con FgeneSH (Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA) y genoma de est2 (Rice et al., 2000, Trends en Genetics 16 (6): 276-277; Mott, 1997, Comput. Applic. 13:477-478) como se representa en el listado de secuencias.
15 El alineamiento de las diferentes secuencias de FATB con secuencias de FATB parciales aisladas de B. rapa (AA) y
B. oleracea (CC) indicó que las secuencias de FATB1, FATB2 y FATB3 se originaron a partir del genoma de A y las secuencias de FATB4, FATB5 y FATB6 a partir del genoma C.
El alineamiento multidireccional (programa Align Plus -Scientific & Educational Software, EE.UU.; usando los
20 siguientes parámetros por defecto: penalización por desapareamiento = 2, penalización por hueco abierto = 4, penalización por extensión de hueco = 1; para nucleótidos la matriz de puntuación por defecto usada es Standard linear y para proteínas la matriz de puntuación por defecto es BLOSUM62) de las diferentes regiones codificantes de FATB con o sin secuencias de intrones y secuencias de aminoácidos de FATB mostró que FATB1 y FATB4, FATB2 y FATB5, y FATB3 y FATB6 están más relacionados entre sí que con los otros genes FATB, que indica que son
25 genes homeólogos.
Basándose en estos análisis, las secuencias FATB1-FATB6 se renombraron FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 y FATB-C3, respectivamente, y esta designación se usa en toda la memoria descriptiva. Tanto las secuencias de proteínas como de ácidos nucleicos de genes de WOSR y SOSR de Brassica napus se proporcionan
30 en el presente documento.
Secuencias de WOSR
Las secuencias genómicas, es decir, las regiones que codifican proteína de FATB-A1 a FATB-A3 y FATB-C1 a
35 FATB-C3 que incluyen las secuencias de intrones, de WOSR Express se representan en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 11, respectivamente. Las secuencias de proteínas FATB-A1 a FATB-A3 y FATB-C1 a FATB-C3, codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos, se representan en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 12, respectivamente.
40 Secuencias de SOSR
Las secuencias genómicas, es decir, las regiones que codifican proteína de FATB-A1 a FATB-A3 y FATB-C1 a FATB-C3 que incluyen las secuencias de intrones, de SOSR se representan en SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21 y SEC ID Nº: 23. Las secuencias de proteínas FATB-A1 a FATB-A3 y
45 FATB-C1 a FATB-C3, codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos, están en SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 24, respectivamente.
La Tabla 15 muestra el porcentaje de identidad de secuencias (de nucleótidos) entre las diferentes regiones
codificantes de FATB de WOSR Express (Tabla 15a) y SOSR (Tabla 15b), con y sin secuencias de intrones, y muestra el mayor grado de vinculación entre FATB-A1 y FATB-C1, FATB-A2 y FATB-C2, y FATB-A3 y FATB-C3 homólogas (véanse los valores subrayados) e indica que los diferentes genes FATB están más conservados en el exón que en las secuencias de intrones.
Tabla 15a: Porcentaje de identidad de secuencias (de nucleótidos) entre las diferentes regiones codificantes de FATB obtenidas de WOSR Express, con / sin secuencias de intrones
- % de identidad de secuencias
- FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
- FATB-A1
- 100/100 75,0/82,5 75,4/87,6 91,3/94,8 71,4/85,7 68,5/87,3
- FATB-A2
- 100/100 70,6/83,0 77,5/83,4 85,2/94,3 64,4/83,3
- FATB-A3
- 100/100 75,3/88,0 67,4/85,4 83,5/96,7
- FATB-C1
- 100/100 73,0/86,6 68,5/88,0
- FATB-C2
- 100/100 61,2/86,0
- FATB-C3
- 100/100
10 Tabla 15b: Porcentaje de identidad de secuencias (de nucleótidos) entre las diferentes regiones codificantes de FATB obtenidas de SOSR con / sin secuencias de intrones
- % de identidad
- FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
- FATB-A1
- 100/100 76,1/84,1 75,6/87,6 91,4/94,8 71,4/85,7 68,6/87,5
- FATB-A2
- 100/100 72,3/84,8 78,8/85,3 86,6/96,4 65,3/85,1
- FATB-A3
- 100/100 76,1/87,9 68,0/85,3 84,2/96,4
- FATB-C1
- 100/100 73,0/86,7 68,7/88,0
- FATB-C2
- 100/100 61,1/86,0
- FATB-C3
- 100/100
La Tabla 16, a continuación, muestra el porcentaje de identidad de secuencias de (nucleótidos) entre las diferentes
15 regiones codificantes de FATB (con / sin secuencias de intrones) obtenidas de WOSR Express (W) y SOSR (S) y muestra que el mayor grado de vinculación entre las FATB-A1 y FATB-C1, FATB-A2 y FAT-C2 y FATB-A3 y FATB-C3 homeólogas se conserva entre diferentes variedades o líneas de cultivo de Brassica napus (véanse los valores subrayados), es decir, el porcentaje de identidad de secuencias entre las FATB-A1 y FATB-C1 homeólogas, por ejemplo, entre secuencias de diferentes variedades es superior al porcentaje de identidad de secuencias entre estos
20 genes FATB y los otros genes FATB de la misma variedad.
Además, puede observarse que hay un alto porcentaje de identidad de secuencias entre los alelos WOSR y SOSR del mismo gen (por ejemplo, FATB-A1 de WOSR y FATB-A1 de SOSR; véanse los valores en negrita), que indica que las variedades y líneas de cultivo de Brassica napus tienen alelos FATB estrechamente relacionados en sus
25 genomas.
Tabla 16: Identidad de secuencias entre las diferentes regiones codificantes de FATB con / sin secuencias de intrones de WOSR Express (W) y de SOSR (S)
- % de identidad
- FATB-A1(W) FATB-A2(W) FATB-A3 (W) FATB-C1 (W) FATB-C2 (W) FATB-C3 (W)
- FATB-A1 (S)
- 99,7/99,6 76,3/84,3 75,4/87,4 91,2/94,6 71,4/85,7 68,4/87,2
- FATB-A2 (S)
- 74,8/82,3 983/97,8 71,2/82,9 77,5/83,4 85,2/94,3 64,3/83,2
- FATB-A3 (S)
- 75,6/87,9 71,7/84,9 97,8/98,6 75,4/88,0 67,4/85,4 83,4/96,6
- FATB-C1 (S)
- 91,5/95,0 78,8/85,3 76,0/88,0 99,8/99,7 73,0/86,6 68,5/87,9
- FATB-C2 (S)
- 71,4/85,7 86,6/96,4 68,0/85,3 73,0/86,7 100/100 61,1/86,0
- FATB-C3 (S)
- 68,7/87,5 65,3/85,2 84,3/96,5 68,6/87,9 61,2/86,0 99,9/99,9
30 La Tabla 17a y b muestran el porcentaje de identidad de secuencias (de aminoácidos) entre las diferentes secuencias de aminoácidos de FATB de WOSR Express (Tabla 17a) y SOSR (Tabla 17b).
Tabla 17a: Porcentaje de identidad de secuencias entre las diferentes secuencias de aminoácidos de FATB de 35 WOSR Express
- % de identidad
- FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
- FATB-A1
- 100,0 86,5 90,2 96,2 88,5 89,3
- FATB-A2
- 100,0 85,0 86,8 95,3 83,8
- FATB-A3
- 100,0 89,7 87,6 98,6
- FATB-C1
- 100,0 88,9 88,7
- FATB-C2
- 100,0 86,4
- FATB-C3
- 100,0
SOSR
- % de identidad
- FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
- FATB-A1
- 100,0 89,0 90,1 96,6 89,0 89,7
- FATB-A2
- 100,0 87,3 88,9 98,6 86,6
- FATB-A3
- 100,0 89,4 87,3 97,8
- FATB-C1
- 100,0 88,9 88,7
- FATB-C2
- 100,0 86,4
- FATB-C3
- 100,0
La Tabla 18 muestra el porcentaje de identidad de secuencias (de aminoácidos) entre las diferentes secuencias de
5 aminoácidos de FATB de WOSR Express (W) y de SOSR (S). Los porcentajes de identidad de secuencias indican que FATB-A1 y FATB-C1, FATB-A2 y FATB-C2 y FATB-A3 y FATB-C3 son genes homeólogos (véanse los valores subrayados) y que el mayor grado de vinculación entre estos homeólogos se conserva entre diferentes variedades.
Además, puede observarse que hay un alto porcentaje de identidad de secuencias entre proteínas WOSR y SOSR
10 del mismo gen FATB (por ejemplo, FATB-A1 de WOSR y FATB-A1 de SOSR; véanse los valores en negrita), que indica que las variedades de Brassica napus y líneas de cultivo tienen alelos FATB estrechamente relacionados en sus genomas, que codifican las mismas proteínas o altamente similares.
Tabla 18: Porcentaje de identidad de secuencias entre las diferentes secuencias de aminoácidos de FATB de 15 WOSR Express (W) y de SOSR (S)
- % de identidad
- FATB-A1 (W) FATB-A2 (W) FATB-A3 (W) FATB-C1 (W) FATB-C2 (W) FATB-C3 (W)
- FATB-A1 (S)
- 99,5 88,6 89,7 96,2 88,5 89,3
- FATB-A2 (S)
- 86,9 96,5 84,5 86,8 95,3 83,8
- FATB-A3(S)
- 90,7 87,8 99,3 89,7 87,6 98,6
- FATB-C1 (S)
- 96,6 88,9 89,4 100,0 88,9 88,7
- FATB-C2 (S)
- 89,0 98,6 87,3 88,9 100,0 86,4
- FATB-C3 (S)
- 89,7 86,6 97,8 88,7 86,4 100,0
Ejemplo 3 -Expresión de genes FATB de Brassica
20 Para analizar la expresión de los diferentes genes FATB en diferentes tejidos se realizaron ensayos de RT-PCR semicuantitativa específicos para cada gen FATB sobre ARN total aislado de diversos tejidos de planta de Brassica:
Moldes: -Se aisló una serie de cantidades crecientes de ARN total, es decir, 0,1 ng, 1 ng, 10 ng y 100 ng, de hojas,
25 raíces, capullos de flores sin abrir y ápices, cotiledones, vainas 11 días después de la antesis con y sin semillas y semillas de aquellas vainas, semillas de vainas 21 y 34 días después de la antesis y callo de SOSR de Brassica napus, con el minikit de plantas RNeasy (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
- -
- Se aisló una serie de cantidades crecientes de ADN genómico, es decir, 0,1 ng, 1 ng y 10 ng, de tejido de hojas de SOSR de Brassica napus según el método de CTAB (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 30 19:11-15).
Cebadores y longitud del fragmento amplificado del gen FATB diana:
- -
- para determinar la expresión del gen FATB-A1 (SEC ID Nº: 13): 35 Directo: 5'-CTGATAACGAGACGTCCTCAC -3' (SEC ID Nº: 31) Inverso: 5'-CATCCTGGAGACGGAGCAGG -3' (SEC ID Nº: 32)
→ 957 pb para molde de ARN de FATB-A1 y
→ 1275 pb para molde de ADN genómico de FATB-A1
-para determinar la expresión del gen FATB-A2 (SEC ID Nº: 15):
40 Directo: 5'-CTGCCTGACTGGAGTATGCTG -3' (SEC ID Nº: 33) Inverso: 5'-GTTGTTGCTCCTGTCTTGGAG -3' (SEC ID Nº: 34)
→ 956 pb para molde de ARN de FATB-A2 y
→ 1340 pb para molde de ADN genómico de FATB-A2
-para determinar la expresión del gen FATB-A3 (SEC ID Nº: 17):
45 Directo: 5'-GCAGTGGATGATGCTTGATAC -3' (SEC ID Nº: 35) Inverso: 5'-CAAGTCGTTGATGGTGTTTTC -3' (SEC ID Nº: 36)
→ 900 pb para molde de ARN de FATB-A3 y
→ 1367 pb para molde de ADN genómico de FATB-A3
-para determinar la expresión del gen FATB-C1 (SEC ID Nº:19):
50 Directo: 5'-CTGCCTGACTGGAGCATGCTC -3' (SEC ID Nº: 37) Inverso: 5'-GTTCTTCCTCTCACCACTTCG -3' (SEC ID Nº: 38/67)
→ 926 pb para molde de ARN de FATB-C1 y
→ 1259 pb para molde de ADN genómico de FATB-C1
-para determinar la expresión del gen FATB-C2 (SEC ID Nº:21):
Directo: 5'-ATCGTTCAGGATGGTCTTGTC -3' (SEC ID Nº: 39)
5 Inverso: 5'-GCAGTCTTGTCATCAAGTTTG -3' (SEC ID Nº: 40)
→ 500 pb para molde de ARN de FATB-C2 y
→ 937 pb para molde de ADN genómico de FATB-C2
-para determinar la expresión del gen FATB-C3 (SEC ID Nº:23):
Directo: 5'-ACAGTGGATGATGCTTGACTC -3' (SEC ID Nº: 41) 10 Inverso: 5'-CGAACATAGTCAGCAGTCTTC -3' (SEC ID Nº: 42)
- →
- 582 pb para molde de ARN de FATB-C3 y
- →
- 1151 pb para molde de ADN genómico de FATB-C3.
Mezcla de PCR:
15 -para RT-PCR sobre ARN (preparado con el sistema de RT-PCR Superscript™ III One-Step con Taq ADN polimerasa Platinum® (Invitrogen)): 12,5 µl de 2x mezcla de reacción, 1 µl de Superscript™ III/ Taq ADN polimerasa Platinum®, 9,5 µl de H2O Milli-Q, 1 µl de ARN (0,1 ng/µl, 1 ng/µl, 10 ng/µl y 100 ng/µl), 0,5 µl de cebador directo (20 µM), 0,5 µl de cebador inverso (20 µM)) = Volumen total de 25 µl;
20 -para PCR sobre ADN genómico: 12,5 µl de 2x mezcla de reacción, 0,2 µl de Taq ADN polimerasa Platinum® (5 U/µl; Invitrogen), 0,5 µl de cebador directo (20 µM), 0,5 µl de cebador inverso (20 µM), 1 µl de ADN (0,1 ng/µl, 1 ng/µl y 10 ng/µl), 10,3 µl de H2O Milli-Q = Volumen total de 25 µl;
Perfil de termociclado: 30 min a 55 ºC (síntesis de ADNc), 2 min a 94 ºC; 30x [15 s a 94 ºC (desnaturalización) y 30 s 25 a 57 ºC (hibridación) y 2 min a 68 ºC (extensión)]; 5 min a 68 ºC; enfriamiento a 10 ºC.
Después de la amplificación, se añadieron 5 µl de colorante de carga (2,5 ml 0,1 % de azul de bromofenol, 2,5 ml de 0,1 % de xilenocianol, 5 ml de glicerol, 50 µl de EDTA 0,5 M a pH 8) a las muestras de PCR y 15 µl de las muestras se cargaron sobre un gel de agarosa al 1 % de TAE (10 x (Tris-acetato 400 mM + EDTA 100 mM); Invitrogen®)
30 (Roche®) que contenía bromuro de etidio junto con un marcador de peso molecular apropiado (escalera de ADN de 1 Kb, GibcoBRL® Life Technologies).
Los patrones de bandas obtenidos después de la amplificación del ARN total de diferentes tejidos y el ADN genómico de SOSR de Brassica napus con los cebadores específicos del gen FATB se evaluaron del siguiente
35 modo:
- -
- Datos de las muestras de ARN dentro de una única ejecución de RT-PCR y una única mezcla de RT-PCR no fueron aceptados, a menos que los productos de PCR y los productos de RT-PCR (si los hay, en el caso de los productos de RT-PCR; véase más adelante) amplificados de las series de cantidades
40 crecientes de ADN genómico y ARN total, respectivamente, mostraran las longitudes de fragmento esperadas para el gen FATB diana (como se indica anteriormente) y aumentaran en cantidad proporcionalmente a la cantidad creciente de molde de ADN y ARN, respectivamente.
- -
- Carriles que no comprenden productos de RT-PCR amplificados de las series de cantidades crecientes de ARN total para el gen FATB diana específico del tamaño esperado indican que el gen FATB diana 45 específico no se expresa o se expresa a niveles muy bajos en el tejido correspondiente a partir del cual
se preparó el ARN de molde.
- -
- Carriles que comprenden productos de RT-PCR amplificados de las series de cantidades crecientes de ARN total para el gen FATB diana específico del tamaño esperado indican que el gen FATB diana específico se expresa en el tejido correspondiente a partir del cual se preparó el ARN de molde.
50 Para determinar el nivel de expresión de cada gen FATB en un tejido específico con respecto al nivel de expresión de los otros genes FATB en ese tejido específico, la intensidad de las bandas observadas sobre el gen de electroforesis (resultante de la tinción con bromuro de etidio del ADN y observada bajo luz UV) de los productos de RT-PCR de FATB se comparó con la intensidad de las bandas observadas sobre el gel de electroforesis de los
55 productos de PCR de FATB amplificados a partir de las series de cantidades crecientes de ADN genómico.
Resultados
Todos los genes FATB se expresaron en todos los tejidos analizados (+ en la Tabla 19). El nivel de expresión de
60 cada gen FATB en hojas y semillas de vainas de 11, 21 y 34 días (basado en 10 ng de ARN) expresado como la cantidad de ADN genómico (en ng) que generó una intensidad de banda comparable a la intensidad de banda del producto de RT-PCR específico del gen FATB (como se ha explicado anteriormente) se indica entre paréntesis en la Tabla 20.
Tabla 20
- Tejido
- FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
- Hoja
- + (0,1) + (5) + (> 10) + (< 0,1) + (5) +(10)
- Raíz
- + + + + + +
- Capullo de flor sin abrir + ápice
- + + + + + +
- Cotiledones
- + + + + + +
- Callo
- + + + + + +
- Vainas 11 d sin semilla
- + + + + + +
- Vainas 11 d con semilla
- + + + + + +
- Semilla de vainas 11 d
- + (< 0,1) + (1) + (10) + (< 0,1) + (5) + (1)
- Vainas 21 d sin semilla
- + + + + + +
- Vainas 21 d con semilla
- + + + + + +
- Semilla de vainas 21 d
- + (0,1) + (1) + (1) + (0,1) + (5) + (1)
- Vainas 34 d sin semilla
- + + + + + +
- Semilla de vainas 34 d
- + (< 0,01) + (0,05) + (0,05) + (0,05) + (0,5) + (0,05)
El momento exacto (11, 21 y 34 días después de la antesis) y el nivel de expresión de cada gen FATB en semilla (basado en 10 ng de ARN) expresado como la cantidad de ADN genómico (en ng) que generó una intensidad de 5 banda comparable a la intensidad de banda del producto de RT-PCR específico del gen FATB (como se ha explicado anteriormente) se indica en la Figura 1.
Ejemplo 4 -Generación y aislamiento de alelos FATB de Brassica mutantes (fatB)
10 Las mutaciones en los genes FATB identificados en el Ejemplo 1 se generaron e identificaron usando los siguientes enfoques, descritos a continuación. En la sección 4.1 se describe la generación de alelos fatB que comprenden deleciones de uno o más nucleótidos, por ejemplo, que carecen de partes o del alelo fatB completo (“mutantes de deleción”). En la Sección 4.2 se describe la generación y aislamiento de alelos fatB que comprenden mutaciones del codón de STOP (“mutantes terminadores”) y/o una o más mutaciones del sitio de corte y empalme.
- -
- Semillas de SOSR de Brassica napus (no mutantes, denominadas semillas “M0”) se mutagenizaron usando el enfoque de mutagénesis de neutrones rápidos como se describe en la materia para generar una población de 20 semillas mutantes (denominadas semillas “M1”). -Se cultivaron 60.000 plantas M1 y se autofecundaron. Las semillas M2 resultantes se recogieron para cada planta M1 individual. -Se cultivaron 1000 plantas M2, derivadas de diferentes plantas M1, y se prepararon muestras de ADN a partir de muestras de hoja de cada planta M2 individual según el método de CTAB (Doyle y Doyle, 1987, 25 Phytochemistry Bulletin 19:11-15). Las plantas M2 se autofecundaron para obtener semillas M3.
- -
- La concentración de las muestras de ADN se estimó como se describe en el Ejemplo 1. Se digirieron 1,7 µg de ADN genómico con las enzimas de restricción AseI y EcoRV en un volumen de reacción final de 20 µl, bajo las siguientes condiciones (enzimas y tampones de New England Biolabs®): -Digestión con AseI: 17 µl de ADN (100 ng/µl), 1 µl de AseI (10 U/µl), 2 µl de tampón NEB3
30 -Digestión con EcoRV: 17 µl de ADN (100 ng/µl), 1 µl de EcoRI (10 U/µl), 2 µl de tampón NEB3, 0,2 µl de 100x albúmina de suero bovino incubada durante la noche a 37 ºC o durante 4 horas a 37 ºC -Después de la digestión, 2 µl de colorante de carga que contenía RNasa (12,5 ml de 1 % de xilenocianol FF; 12,5 ml de 1 % de azul de bromofenol soluble en indicador de agua; 25 ml de glicerol; 100 µl de EDTA 0,5 M a pH 8; se añadió 1 µl de RNasa (10 mg/ml)) a las muestras de ADN digeridas y las muestras se incubaron
35 durante 30 min a 37 ºC. Las muestras se cargaron sobre un gel de agarosa al 1 % de TAE (Invitrogen®). Se incluyó ADN de fago lambda (Fermentas®) digerido con enzima de restricción PstI (que genera 29 fragmentos (en pb): 11501, 5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 (los fragmentos en cursiva no son visibles en electroforesis estándar) como patrón de tamaño.
40 -Después de la electroforesis, las muestras de ADN (ADN genómico digerido) se transfirieron a una membrana de nailon (Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech®) por transferencia capilar en álcali seco. Las membranas de nailon con ADN genómico digerido se cribaron por procedimientos de hibridación Southern estándar como se ha descrito en el Ejemplo 1 para el ADN genómico con la sonda 5' At FATB1 (SEC ID Nº: 25). Se expusieron películas Kodak XOMAT AR a las transferencias radiactivas durante 2 días a -70 ºC.
Resultados
Los patrones de hibridación obtenidos después de la digestión de ADN genómico de plantas M2 de Brassica con AseI y EcoRV e hibridación con la sonda 5' At FATB1 (SEC ID Nº: 25) se compararon con los patrones de
50 hibridación obtenidos después de la digestión de ADN genómico de plantas SOSR de Brassica no mutantes con AseI y EcoRV e hibridación con la sonda 5' At FATB1 (SEC ID Nº: 25) (Tabla 21). Para determinar la
correspondencia entre los fragmentos de ADN de hibridación y los diferentes genes FATB, el último patrón de hibridación se comparó con el patrón de hibridación del ADN de clon de BAC con una secuencia de longitud completa de uno de los genes FATB identificados en el Ejemplo 1 digeridos con AseI y EcoRV y se hibridó con la sonda 5' At FATB1 (SEC ID Nº: 25) (véase la Tabla 14 anterior).
Tabla 21: Patrón de hibridación de ADN genómico digerido de Brassica napus hibridado con la sonda 5' AtFATB1
- ADN genómico limitado con
- Migración de fragmentos de ADN de hibridación entre bandas de marcador de tamaño Longitud estimada de los fragmentos de ADN de hibridación. Se corresponde con
- Superiores a (kbp)
- Inferiores a (kbp)
- AseI
- 2,1 2,4 2,2 FATB-A1
- 2,8
- 4,7 4,5 FATB-A2
- 2,1
- 2,5 2,4 FATB-A3
- 2,1
- 2,4 2,2 FATB-C1
- 2,8
- 4,5 3,0 FATB-C2
- 1,1
- 2,0 1,7 FATB-C3 (a)
- 0,5
- 1,1 0,8 FATB-C3 (b)
- EcoRV
- 5,1 11,5 11 FATB-A1
- 2,6
- 2,8 2,7 FATB-A2
- 2,8
- 4,5 3,5 FATB-A3 (a)
- 0,5
- 0,8 0,65 FATB-A3 (b)
- 2,8
- 4,7 4,5 FATB-C1
- 2,8
- 4,5 2,9 FATB-C2
- 2,8
- 4,5 4,2 FATB-C3
La ausencia de uno de los fragmentos de ADN de hibridación indicados en la Tabla 21 indicó que los alelos FATB completos se delecionaron en las plantas mutagenizadas con el enfoque de mutagénesis de neutrones rápidos.
10 Plantas M2 homocigóticas de Brassica que comprenden una deleción de fatB así identificada y el fragmento de ADN de hibridación ausente se indican en la Tabla 22.
Tabla 22 15
- Alelo FATB mutado
- Fragmento de ADN de hibridación ausente: Planta M2 nº Alelo nº
- ADN genómico limitado con
- Migración de fragmentos de ADN de hibridación ausentes entre bandas de marcadores de tamaño Longitud estimada de los fragmentos de ADN de hibridación ausentes.
- Superiores a (kbp)
- Inferiores a (kbp)
- FATB-A1 (SEC ID Nº: 13)
- AseI EcoRV 2,1 5,1 2,4 11,5 2,2 11 LOSA018 FATB-A1-FN1
- FATB-A2 (SEC ID Nº: 15)
- AseI EcoRV 2,8 2,6 4,7 2,8 4,5 2,7 LOSA002, LOSA003, LOSA005 FATB-A2-FN1, FATB-A2-FN2, FATB-A2-FN3
- FATB-C2 (SEC ID Nº: 21)
- AseI EcoRV 2,4 2,8 4,5 4,5 3 2,9 LOSA004 FATB-C2-FN1
La ausencia de un alelo FATB específico en las plantas M2 homocigóticas de Brassica se confirmó por los siguientes ensayos de PCR:
20 -Molde de ADN: -ADN genómico aislado de material de hoja de las plantas M2 de Brassica identificadas por comprender una deleción en o de un gen FATB específico (“FATBx”). -Control positivo: ADN de clon de BAC del gen FATBx (la amplificación satisfactoria de este control positivo demuestra que la PCR se ejecutó en condiciones que permiten la amplificación de la secuencia de FATBx 25 diana específica).
- -
- Controles negativos: ADN de clon de BAC de genes FATB diferentes del gen FATBx (cuando el resultado esperado, es decir, la no amplificación del producto de PCR de FATBx específico, se observa, esto indica que no hay amplificación de fondo detectable de otros genes FATB).
- -
- Un control de ADN no mutante: Ésta es una PCR en la que el molde de ADN proporcionado es ADN
30 genómico preparado a partir de una planta de Brassica M2 sin una deleción del gen FATBx. Cuando se observa el resultado esperado, es decir, solo la amplificación del producto de PCR de FATBx específico, esto indica que no hay amplificación de fondo detectable, por ejemplo, de otros genes FATB, en una muestra de ADN genómico. -
- -
- Cebadores y longitud del fragmento amplificado del gen FATBx diana no mutante (“fragmento de PCR específico de FATBx”):
-para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-A1 (SEC ID Nº: 13):
5 Directo: 5'-CTGATAACGAGACGTCCTCAC-3' (SEC ID Nº: 31)
Inverso: 5'-CAGTCTTAACATGGTTGAGTG-3' (SEC ID Nº: 43)
→ 403 pb
- para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-A2 (SEC ID Nº: 15):
Directo: 5'-CATGTTCCATCTTCTTCCTCG -3' (SEC ID Nº: 44)
Inverso: 5'-TATTGGGACAACATGTGAGTG -3' (SEC ID Nº: 45)
→ 513 pb
-para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-A3 (SEC ID Nº: 17):
Directo: 5'-GCAGTGGATGATGCTTGATAC -3' (SEC ID Nº: 35)
Inverso: 5'-TTCTTCTTAACCATCTCAGGT -3' (SEC ID Nº: 46)
15 → 487 pb
- para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-C1 (SEC ID Nº: 19):
Directo: 5'-CTGCCTGACTGGAGCATGCTC -3' (SEC ID Nº: 37)
Inverso: 5'-CCAAACCCATCTCCAAGCAGC -3' (SEC ID Nº: 47)
→ 367 pb
- para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-C2 (SEC ID Nº: 21):
Directo: 5'-ATCGTTCAGGATGGTCTTGTC -3' (SEC ID Nº: 39)
Inverso: 5'-TAACTCACAACGAGAACCAGG -3' (SEC ID Nº: 48)
→ 397 pb
-para confirmar la presencia de una deleción en o del gen FATB-C3 (SEC ID Nº: 23):
25 Directo: 5'-ACAGTGGATGATGCTTGACTC -3' (SEC ID Nº: 41) Inverso: 5'-CTTTGATAATCTCCTTGTCAC -3' (SEC ID Nº: 49)
→ 1035 pb
- -
- Mezcla de PCR: 2,5 µl de 10x tampón de PCR, 0,25 µl de dNTP (20 µM), 0,5 µl de cebador directo (10 µM), 0,5 µl de cebador inverso (10 µM), 0,25 µl de Taq-polimerasa (5 U/µl), 20 µl de H2O Milli-Q, 1 µl de ADN (50 ng/µl) = Volumen total de 25 µl;
- -
- Perfil de termociclado: 4 min a 94 ºC; 25x [1 min a 94 ºC (desnaturalización) y 1 min a 57 ºC (hibridación) y 2 min a 72 ºC (extensión)]; 5 min a 72 ºC; enfriamiento a 4 ºC. -Después de la amplificación, 5 µl de colorante de carga (2,5 ml de 0,1 % de azul de bromofenol, 2,5 ml de 0,1 % de xilenocianol, 5 ml de glicerol, 50 µl de EDTA 0,5 M a pH 8) se añadió a las muestras de PCR y las
35 muestras se cargaron sobre un gel de agarosa de 1 % de TAE (10 x (Tris-acetato 400 mM + EDTA 100 mM); Invitrogen®) (Roche®) junto con un marcador de peso molecular apropiado (marcador de ADN de 100 pb; Invitrogen®).
- -
- Los patrones de bandas obtenidos después de la amplificación de ADN genómico de plantas M2 de Brassica con los cebadores específicos de FATBx se evaluaron del siguiente modo:
- -
- Datos de muestras de ADN aisladas de material de hoja de las plantas M2 de Brassica identificadas por comprender una mutación de deleción en o de un gen FATBx dentro de una única ejecución de PCR y una única mezcla de PCR no deben ser aceptables a menos que: -los controles negativos sean negativos para la amplificación por PCR (no fragmentos), -el control positivo muestre el producto de PCR esperado (fragmento de FATBx específico),
45 -el control de ADN no mutante muestre el resultado esperado (solo fragmento de FATBx específico).
- -
- Carriles que no muestran producto de PCR para el gen FATBx específico del tamaño esperado indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el molde de ADN genómico comprende una deleción en o del gen FATBx específico.
- -
- Carriles que muestran el producto de PCR para el gen FATBx específico del tamaño esperado indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el molde de ADN genómico no comprende una deleción en o de un gen FATBx.
Se confirmó que la planta M2 homocigótica nº LOSA018 comprende una deleción de FATB-A1, las pantas M2 55 homocigóticas nº LOSA002, 3, 5 comprenden una deleción de FATB-A2 y la planta M2 homocigótica nº LOSA004 comprende una deleción de FATB-C2.
- -
- 30.000 semillas de SOSR de Brassica napus (semillas M0) se empaparon previamente durante dos horas sobre papel de filtro húmedo en agua desionizada o destilada. La mitad de las semillas se expusieron a 0,8 % de EMS y la mitad a 1 % de EMS (Sigma: M0880) y se incubaron durante 4 horas.
- -
- Las semillas mutagenizadas (semillas M1) se aclararon 3 veces y se secaron en una campana extractora durante la noche. Se cultivaron 30.000 plantas M1 en tierra y se autofecundaron para generar semillas M2. Las 65 semillas M2 se recogieron para cada planta M1 individual. -Se cultivaron dos veces 4800 plantas M2, derivadas de diferentes plantas M1, y se prepararon muestras de
ADN a partir de muestras de hojas de cada planta M2 individual según el método de CTAB (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). Las plantas M2 se autofecundaron para obtener semillas M3.
- -
- Las muestras de ADN se cribaron para la presencia de mutaciones puntuales en los genes FATB causando la introducción de codones de STOP o mutaciones del sitio de corte y empalme por secuenciación directa por 5 técnicas de secuenciación estándar (Agowa) y analizando las secuencias para la presencia de las mutaciones
puntuales usando el software NovoSNP (VIB Antwerp).
-Así se identificaron los siguientes alelos FATB mutantes (fatB):
Tabla 23a Mutaciones del codón de STOP en genes FATB de SOSR 10
- Gen FATB mutado
- Número de exón Posición de aminoácido Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante Planta M2 nº Alelo nº
- FATB-A1 (SEC ID Nº: 13)
- exón 1 93 279 tgg → tga LOSA101, LOSA103, LOSA102 FATB-A1-EMS01, FATB-A1-EMS02, FATB-A1-EMS03
- exón 1
- 111 333 tgg → tga LOSA104 FATB-A1-EMS05(1)
- exón 1
- 116 348 tgg → tga LOSA105 FATB-A1-EMS06(2)
- FATB-A2 (SEC ID Nº: 15)
- exón 1 94 282 tgg → tga LOSA111, LOSA112 FATB-A2-EMS04, FATB-A2-EMS05(3)
- exón 1
- 136 406 cag →tag LOSA108 FATB-A2-EMS01(2)
- FATB-A3 (SEC ID Nº: 17)
- exón 2 205 845 gag →tag LOSA114 FATB-A3-EMS01(1)
- FATB-C1 (SEC ID Nº: 19)
- exón 2 196 668 tgg → tga LOSA129 FATB-C1-EMS05(2,3)
- FATB-C2 (SEC ID Nº: 21)
- exón 1 79 235 cag →tag LOSA119 FATB-C2-EMS02(3)
- exón 1
- 111 331 cag →tag LOSA122 FATB-C2-EMS05
- exón 1
- 112 336 tgg → tga LOSA120, LOSA123 FATB-C2-EMS03(2) FATB-C2-EMS06
(1) Las semillas que comprenden FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 y FATB-C3-EMS02 (designadas 08MBBN000584) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, RU) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41568.
15 (2) Las semillas que comprenden FATB-A1-EMS06, FATB-A2-EMS01, FATB-C1-EMS05 y FATB-C2-EMS03 (designadas 08MBBN000572) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, RU) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41567.
(3) Las semillas que comprenden FATB-A2-EMS05, FATB-C1-EMS05 y FATB-C2-EMS02 (designadas
20 08MBBN000553) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, RU) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41566.
Tabla 23b Mutaciones del sitio de corte y empalme en genes FATB de SOSR
- Gen FATB mutado
- Número de intrón Posición de nucleótido Codón no mutante → mutante Planta M2 nº Alelo nº
- FATB-A1 (SEC ID Nº: 13)
- intrón 1 -donante intrón 1 -aceptor 502 587 g[gt... →g[at... ...ag]g→ ...ag]a LOSA106 LOSA107 FATB-A1-EMS07 FATB-A1-EMS09
- FATB-A2 (SEC ID Nº: 15)
- intrón 1 -donante 505 504 g[gt... →g[at... g[gt... →a[gt... LOSA109 LOSA110 FATB-A2-EMS02 FATB-A2-EMS03
- FATB-C1 (SEC ID Nº: 19)
- intrón 1 -donante 498 g[gt... →a[gt... LOSA128 FATB-C1-EMS04(1)
- FATB-C2 (SEC ID Nº: 21)
- intrón 1 -aceptor 581 ...ag]g → ...ag]a LOSA121 FATB-C2-EMS04
- FATB-C3 (SEC ID Nº: 23)
- intrón 1 -donante 508 g[gt... →g[at... LOSA125 FATB-C3-EMS02(1)
(1) Las semillas que comprenden FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 y FATB-C3-EMS02
25 (designadas 08MBBN000584) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, RU) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41568
En conclusión, los ejemplos anteriores muestran cómo los alelos FATB mutantes pueden generarse y aislarse. Por tanto, el material de planta que comprende tales alelos mutantes puede usarse para combinar los alelos mutantes 30 y/o no mutantes deseados en una planta, como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 5 -Identificación de una planta de Brassica que comprende un alelo FATB de Brassica mutante
Plantas de Brassica que comprenden las mutaciones en los genes FATB identificadas en el Ejemplo 5 se 35 identificaron del siguiente modo:
- -
- Para cada planta M2 homocigótica identificada por comprender una deleción de un gen FATB, se cultivaron 5 plantas M3 y muestras de ADN se prepararon a partir de muestras de hoja de cada planta M3 individual -Sobre cada muestra de ADN de cada planta M3 individual se realizó un ensayo específico de PCR para el gen FATB identificado por comprender una mutación de deleción (como se describe en el Ejemplo 4.1). -Plantas M3 homocigóticas que comprenden la mutación identificada se autofecundaron y se recogieron semillas M4. 10 5,2. Identificación de pantas de Brassica que comprenden una mutación puntual en un gen FATB
- -
- Para cada gen FATB mutante identificado en la muestra de ADN de una planta M2 se cultivaron 50 plantas M2 derivadas de la misma planta M1 que la planta M2 que comprendía la mutación FATB y se prepararon muestras 15 de ADN a partir de muestras de hoja de cada planta M2 individual. -Las muestras de ADN se cribaron para la presencia de la mutación FATB puntual identificada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4.2. -Se autofecundaron plantas M2 heterocigóticas y homocigóticas (como se ha determinando basándose en los electroferogramas) que comprendían la misma mutación y se recogieron semillas M3. 20
Ejemplo 6 -Análisis de la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de Brassica quecomprenden un gen FATB de Brassica mutante
Para determinar la correlación entre la presencia de genes FATB mutantes en plantas de Brassica y la composición
25 de ácidos grasos del aceite de semillas de las plantas de Brassica, la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de Brassica que comprenden gen(es) FATB mutante(s) se analizó extrayendo los acilos grasos de las semillas y analizando sus niveles relativos en el aceite de semillas por cromatografía de gases-líquidos capilar del siguiente modo:
30 -Se secaron y pesaron muestras de semilla. Se pusieron 0,8 g de semillas en viales de plástico. Se añadió una varilla de machacado de acero a cada vial. Entonces, este vial se llenó con 2 ml de disolución de metilación (10 g de metóxido de sodio en 500 ml de metanol) y 0,8 ml de éter de petróleo. Los viales tapados se agitaron durante 30 min en un agitador Eberbach. Se añadió un ml de agua desionizada a cada vial antes de volver a tapar y agitar. Los viales se centrifugaron durante 5 min a 3500 rpm.
35 -Se transfirieron 25-50 µl de la capa de éter de petróleo de cada muestra a viales de inyector automático de cromatografía de gases (CG). Se añadieron 100 µl de tampón fosfato 0,4 M y 800 µl de éter de petróleo a cada vial antes de agitarlos. Se inyectaron 0,4 a 0,6 µl de la capa de éter de petróleo de las muestras para el análisis en el cromatógrafo de gases. Se analizaron impresiones del cromatógrafo de gases y se calculó el contenido de cada ácido graso.
6.1. Correlación entre la presencia de un alelo FATB de Brassica mutante en plantas de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de aquellas plantas de Brassica
Para determinar la correlación entre la presencia de un alelo FATB mutante en estado homocigótico y/o
45 heterocigótico en una planta de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de la planta de Brassica se analizó la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5.1, como se ha descrito anteriormente.
No se observó diferencia significativa en la composición de ácidos grasos del aceite de semillas, en particular el nivel
50 de ácidos grasos saturados totales (es decir, nivel de ácidos grasos C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0 y C24:0), ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0), para plantas mutantes individuales homocigóticas en comparación con la composición de ácidos grasos de aceite de semillas de plantas no mutantes (véase la Tabla 24).
Tabla 24: Nivel de ácidos grasos saturados totales (es decir, ácidos grasos C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0,
55 C24:0; 'saturados'), ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0) (en porcentaje en peso basado en la cantidad total de ácidos grasos) en aceite de semillas de plantas de Brassica que comprenden un alelo FATB mutante (es decir, un alelo FATB-AX-FNY o FATB-CX-FNY como se indica en la Tabla 22, denominado 'aX-fnY' y 'cX-fnY' en la columna 2; los alelos FATB no mutantes se denominan 'AX' y 'CX') en estado homocigótico
- Progenie de planta
- Genotipo Saturados totales DE C16:0 DE C18:0 DE
- No mutante
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1lC1, C2/C2, C3/C3 7,06 0,05 4,39 0,05 1,42 0,02
- LOSA002 LOSA003 LOSA005
- A1/A1, a2-fn1/a2-fn1, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 A1lA1, a2-fn2/a2-fn2, A3/A3, C1lC1, C2/C2, C3/C3 A1/A1, a2-fn3/a2-fn3, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 6,93 7,04 7,17 1,93 0,22 0,08 4,21 4,23 4,36 1,04 0,18 0,08 1,50 1,61 1,73 0,44 0,16 0,10
- LOSA004
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2-fn1/ c2-fn1, C3/C3 6,97 0,27 4,04 0,38 1,82 0,20
6.2. Correlación entre la presencia de uno a cuatro alelos FATB de Brassica mutantes en plantas de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de aquellas plantas de Brassica
5 Para determinar la correlación entre la presencia de uno a cuatro alelos FATB mutantes en estado homocigótico y/o heterocigótico en una planta de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de la planta de Brassica, las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5.2, o progenie de las mismas que comprende los alelos FATB mutantes, se cruzaron entre sí y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de plantas de progenie individuales de Brassica se analizó como se ha descrito anteriormente.
10 La Tabla 25 y Figura 8 muestran que los niveles de ácidos grasos saturados totales promedio oscilan del 8,24 al 10,52 % en plantas no mutantes, del 6,53 al 12,12 % en plantas FATB mutantes individuales homocigóticas, del 6,47 al 10,01 % en plantas FATB mutantes dobles homocigóticas, del 5,68 al 8,43 % en plantas FATB mutantes triples homocigóticas y del 5,72 al 7,7 % en plantas FATB mutantes cuádruples homocigóticas. La Tabla 25 y la Figura 8
15 indican adicionalmente que las mutaciones en genes FATB específicos, tales como FATB-A2 y FATB-C2, podrían tener un efecto más fuerte sobre el nivel de ácidos grasos saturados que las mutaciones en otros genes FATB.
Las plantas analizadas se cultivaron en el invernadero. Como los niveles de ácidos grasos saturados totales promedio en aceite de semillas de plantas no mutantes cultivadas en el campo normalmente están entre
20 aproximadamente el 6,5 % y el 7,5 % en lugar del 8,24 al 10,52 % observado para las plantas cultivadas en invernadero, se espera que los niveles de ácidos grasos saturados totales en aceite de semillas de las plantas mutantes cultivadas en el campo sean menores. Las plantas mutantes se cultivan en el campo y se determina la composición de ácidos grasos del aceite de semillas.
25 Tabla 25: Nivel de ácidos grasos saturados totales (es decir, ácidos grasos C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0, C24:0; 'saturados'), ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0) (en porcentaje en peso basado en la cantidad total de ácidos grasos) en aceite de semillas de plantas de Brassica que comprende al menos un alelo FATB mutante (es decir, un alelo FATB-AX-EMSY o FATB-CX-EMSY como se indica en la Tabla 23, denominado 'aXemsY' y 'cX-emsY' en la columna 1 y como 'aX' y 'cX' en la columna 2; los alelos FATB no mutantes se denominan
30 'AX' y 'CX') en estado homocigótico
- Progenie de planta que comprende:
- Genotipo: Saturados totales DE C16:0 DE C18:0 DE
- A1/a1-ems05, A2/a2-
- A1lA1,A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,39 0,69 5,43 0,19 1,52 0,35
- ems05, A3/a3-ems01,
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 7,98 0,37 4,83 0,19 1,64 0,13
- C1/C1, C2/C2, C3/C3
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 7,58 0,51 4,38 0,22 1,64 0,16
- A1/A1, a2/a2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,00 0,32 4,17 0,14 1,43 0,16
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,71 0,25 4,88 0,44 1,40 0,13
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,88 0,28 4,85 0,22 1,52 0,20
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,47 0,39 4,21 0,30 1,66 0,30
- a1/a1, a2/a2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,34 0,30 3,88 0,12 1,73 0,12
- A1/a1-ems05, A2/a2-
- A1/A1,A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,97 ND 5,84 ND 1,52 ND
- ems05, A3/A3, C1/c1-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3 7,85 0,35 4,77 0,53 1,76 0,41
- ems04, C2/c2-ems03,
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3 7,59 0,21 4,87 0,18 1,27 0,25
- C3/C3
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3 6,92 0,07 4,12 0,20 1,47 0,18
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1lC1, C2/C2, C3/C3
- 6,53 ND 4,05 ND 1,25 ND
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, a2/a2, C3/C3
- 6,68 0,48 4,02 0,25 1,35 0,11
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,76 ND 3,88 ND 1,92 ND
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 5,68 0,30 3,40 0,10 1,09 0,06
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,67 0,44 4,79 0,33 1,52 0,11
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 7,25 0,13 4,36 0,39 1,52 0,25
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,57 0,54 4,90 0,33 1,45 0,18
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 6,24 ND 3,88 ND 1,31 ND
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,00 ND 4,51 ND 1,92 ND
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 6,38 0,24 3,94 0,03 1,25 0,10
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 6,32 0,19 3,74 0,09 1,40 0,04
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 6,09 0,67 3,62 0,20 1,21 0,30
- A1/a1-ems05, A2/A2,
- A1/A1,A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,28 0,54 4,84 0,26 1,66 0,17
- A3/a3-ems01, C1/c1-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, c3/c3 8,12 0,52 4,93 0,38 1,69 0,23
- ems04, C2/C2, C3/c3-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3 8,03 0,75 4,62 0,12 1,77 0,30
- ems02
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, c3/c3 7,05 ND 4,42 ND 1,38 ND
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, C1lC1, C2/C2, C3/C3
- 7,23 ND 4,41 ND 1,44 ND
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, c3/c3
- 7,74 ND 4,38 ND 1,71 ND
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, c1/c1, C2/C2, c3/c3
- 8,08 ND 4,86 ND 1,72 ND
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/Cl, C2/C2, C3/C3
- 7,90 0,59 4,71 0,43 1,61 0,11
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C7/C7, C2/C2, c3/c3
- 7,86 0,41 4,79 0,24 1,67 0,23
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,20 0,36 4,35 0,04 1,35 0,06
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, c3/c3
- 7,57 0,24 4,58 0,23 1,60 0,06
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2,C3/C3
- 8,93 ND 5,46 ND 1,68 ND
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, c3/c3
- 7,45 0,17 4,44 0,12 1,57 0,07
- Progenie de planta que comprende:
- Genotipo: Saturados totales DE C16:0 DE C18:0 DE
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, c1/c1, C2/C2, C3/C3 a1/a1, A2/A2, a3/a3, c1/c1, C2/C2, c3/c3(1)
- 7,82 ND 7,70 0,53 4,65 ND 4,39 0,12 1,56 ND 1,81 0,28
- A1/a1-ems06, A2/a2-
- A1/A1,A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,46 0,67 4,74 0,11 1,85 0,29
- ems01, A3/a3-ems01,
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, C1/0C1, C2/C2, C3/C3 7,79 0,48 4,62 0,18 1,57 0,17
- C1/C1, C2/C2, C3/C3
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,14 0,55 4,45 0,40 1,80 0,12
- A1/A1, a2/a2, a3/a3, C1lC1, C2/C2, C3/C3
- 7,01 0,13 4,24 0,10 1,43 0,16
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,77 0,93 4,99 0,49 2,02 0,31
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,73 0,32 5,44 0,40 1,65 0,54
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,64 0,58 4,44 0,54 1,51 0,18
- a1/a1, a2/a2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 6,82 0,40 3,93 0,16 1,41 0,11
- A1/a1-ems06, A2/a2-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,51 0,91 5,49 0,73 1,46 0,16
- ems01, A3/A3, C1/c1-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3 7,74 1,72 5,05 1,22 1,28 0,06
- ems05, C2/c2-ems03,
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3 7,85 0,23 4,70 0,35 1,54 0,35
- C3/C3
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3 6,47 0,77 4,13 0,59 1,14 0,07
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 6,98 0,54 4,21 0,21 1,36 0,23
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 6,83 ND 3,65 ND 1,59 ND
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 6,94 0,81 4,39 0,34 1,24 0,17
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 6,70 0,15 4,32 0,18 1,21 0,05
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 7,47 0,93 4,64 0,59 1,33 0,11
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 6,44 0,73 3,97 0,74 1,15 0,16
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 6,37 0,47 3,68 0,09 1,25 0,18
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3(2)
- 5,72 0,34 3,24 0,04 1,22 0,20
- A1/a1-ems06,
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 9,88 1,03 6,03 1,29 1,96 0,39
- A2/a2-ems05, A3/a3-
- A1/A1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,89 0,63 5,06 0,57 2,03 0,33
- ems01, C1/C1, C2/C2,
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,79 0,72 5,17 0,95 1,81 0,36
- C3/C3
- A1/A1, a2/a2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,70 0,72 5,04 1,17 1,81 0,43
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 9,34 0,41 4,93 0,67 2,31 0,30
- a1/a1, A2/A2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,78 1,00 5,14 0,98 1,89 0,02
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,52 0,60 4,35 0,38 2,24 0,37
- a1/a1, a2/a2, a3/a3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,24 1,06 4,59 0,61 1,87 0,46
- A1/a1-ems06, A2/a2-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 10,52 ND 6,91 ND 1,83 ND
- ems05, A3/A3, C1/c1-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3 10,45 3,52 6,45 2,01 1,84 0,61
- ems05, C2/c2-ems02,
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3 8,42 0,54 5,45 0,60 1,38 0,10
- C3/C3
- A1/A1,A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3 7,20 0,40 4,20 0,22 1,42 0,19
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 8,89 ND 5,50 ND 1,67 ND
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 7,32 0,47 4,26 0,21 1,47 0,11
- A1/A1, a2/a2,A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,31 1,23 4,63 1,00 1,25 0,16
- A1/A1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3(3)
- 7,57 0,96 4,42 0,53 1,47 0,22
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 12,12 ND 7,04 ND 2,23 ND
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 8,91 0,95 5,50 0,70 1,65 0,28
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 8,59 0,81 5,41 0,77 1,50 0,20
- a1/a1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 8,43 1,72 4,71 0,96 1,92 0,23
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3
- 10,01 ND 6,32 ND 1,79 ND
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3
- 5,72 ND 3,53 ND 1,03 ND
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,01 1,14 4,32 0,59 1,27 0,27
- a1/a1, a2/a2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 6,47 0,54 3,55 0,42 1,39 0,15
- A1/A1, A2/A2, A3/A3,
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, C3/C3 8,24 0,62 4,66 0,21 1,66 0,29
- C1/c1-ems05, C2/c2-
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, C2/C2, c3/c3 7,59 0,95 4,47 0,27 1,64 0,43
- ems02, C3/c3-ems02
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c2, C3/C3 7,46 0,42 4,06 0,01 1,48 0,20
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, C1/C1, c2/c1, c3/c3
- 7,91 0,30 4,12 0,11 2,06 0,12
- A1/A1, A2/0A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, C3/C3
- 7,31 0,49 4,14 0,05 1,48 0,15
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, C2/C2, c3/c3
- 7,76 0,33 4,55 0,15 1,67 0,16
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, C3/C3
- 6,81 0,23 3,73 0,01 1,39 0,13
- A1/A1, A2/A2, A3/A3, c1/c1, c2/c2, c3/c3
- 6,66 0,48 3,84 0,16 1,44 0,21
(1) Las semillas que comprenden FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 y FATB-C3-EMS02 (designadas 08MBBN000584) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41568. 5 (2) Las semillas que comprenden FATB-A1-EMS06, FATB-A2-EMS01, FATB-C1-EMS05 y FATB-C2-EMS03 (designadas 08MBBN000572) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41567.
(3) Las semillas que comprenden FATB-A2-EMS05, FATB-C1-EMS05 y FATB-C2-EMS02 (designadas 10 08MBBN000553) se han depositado en NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41566.
6.3. Correlación entre la presencia de cinco a seis alelos FATB de Brassica mutantes en estado homocigótico y/o heterocigótico en plantas de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de aquellas plantas 15 de Brassica
Para determinar la correlación entre la presencia de cinco a seis genes FATB mutantes en estado homocigótico y/o heterocigótico en una planta de Brassica y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de la planta de Brassica, las plantas de Brassica identificadas en el Ejemplo 5.2, o progenie de las mismas que comprende los alelos FATB mutantes, se cruzan entre sí y la composición de ácidos grasos del aceite de semillas de la progenie
5 plantas de Brassica se analiza como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 7 -Transferencia de genes FATB mutantes en líneas de Brassica (élite)
Los genes FATB mutantes se transfieren en líneas de cultivo de Brassica (élite) por el siguiente método:
10 Una planta que contiene un gen FATB mutante (planta donante) se cruza con una línea de Brassica (élite) (parental élite / parental recurrente) o variedad que carece del gen FATB mutante. Se usa el siguiente esquema de introgresión (el gen FATB mutante se abrevia fatB, mientras que el no mutante se representa FATB):
Cruce inicial: fatB / fatB (planta donante) X FATB / FATB (parental élite)
Planta F1: FATB/fatB
Cruce de BC1: FATB/fatB X FATB / FATB (parental recurrente)
Plantas BC1: 50 % de FATB/fatB y 50 % de FATB / FATB
El 50%de FATB/ fatB se selecciona usando, por ejemplo, marcadores de AFLP o PCR para el alelo FATB mutante
(fatB).
Cruce de BC2: FATB/fatB (BC1 planta) X FATB / FATB (parental recurrente)
Plantas BC2: 50 % de FATB/ fatB y 50% de FATB / FATB
El 50 % de FATB/ fatB se selecciona usando, por ejemplo, marcadores de AFLP o PCR para el alelo FATB mutante
(fatB).
15 El retrocruce se repite hasta que BC3 a BC6
Plantas BC6: 50 % de FATB/ fatB y 50% de FATB/ FATB El 50 % de FATB/ fatB se selecciona usando, por ejemplo, marcadores de AFLP o PCR para el alelo FATB mutante (fatB). Cruce de BC6 S1: FATB/fatB X FATB/ fatB Plantas BC6 S1: 25 % de FATB / FATB y 50 % de FATB/fatB y 25% de fatB/ fatB Se seleccionan plantas que contienen fatB usando, por ejemplo, marcadores de AFLP o PCR para el alelo FATB mutante (fatB).
Se seleccionan plantas BC6 S1 individuales que son homocigóticas para el alelo FATB mutante (fatB/fatB) usando, 20 por ejemplo, marcadores de AFLP o PCR para el alelo mutante y no mutante.
Estas plantas se usan entonces para la producción de semillas.
Para seleccionar plantas que comprenden una deleción de un alelo FATB, pueden usarse ensayos de hibridación o 25 ensayos de PCR tales como aquellos descritos en el Ejemplo 4.1.
Para seleccionar plantas que comprenden una mutación puntual en un alelo FATB, puede usarse secuenciación directa por técnicas de secuenciación estándar conocidas en la técnica, tales como aquellas descritos en el Ejemplo
4.2. Alternativamente, pueden desarrollarse ensayos de PCR para discriminar plantas que comprenden una
30 mutación puntual específica en un alelo FATB de plantas que no comprende esa mutación puntual específica. Así se desarrollaron los siguientes ensayos de PCR de discriminación para detectar la presencia o ausencia y el estado de cigosidad de alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4.2. (véase la Tabla 23):
- -
- Molde de ADN: 35 -ADN genómico aislado de material de hoja de plantas de Brassica mutantes homocigóticas o heterocigóticas (que comprende un alelo FATB mutante, llamado en lo sucesivo “FATB-Xx-EMSXX”). -Control de ADN no mutante: ADN genómico aislado de material de hoja de plantas de Brassica no mutantes (que comprende el equivalente no mutante del alelo FATB mutante, llamado en lo sucesivo 40 “FATB-Xx-WT”). -Control de ADN positivo: ADN genómico aislado de material de hoja de plantas de Brassica mutantes homocigóticas conocido por comprender FATB-Xx-EMSXX.
- -
- Cebadores y longitud del fragmento amplificado del mutante y gen FATB diana no mutante correspondiente
45 se indican en la Tabla 26. Cada conjunto de cebadores consiste en un cebador específico para el mutante y el gen diana no mutante (por ejemplo, el cebador LOSA104R5 es específico para FATB-A1-EMS06 y FATB-A1-WT) y un cebador específico para la diferencia de nucleótidos (por ejemplo, el cebador LOSA105MF1 es específico para FATB-A1-EMS06 y el cebador LOSA105WF1 es específico para FATB-A1-WT). Normalmente, el último nucleótido del último cebador coincide con la diferencia de nucleótidos (nucleótido subrayado en la Tabla 26), pero pueden añadirse uno (o más) nucleótidos específicos de diana adicionales para mejorar la hibridación entre el cebador y su secuencia diana (véase, por ejemplo, nucleótido en negrita en el cebador LOSA112MR2, que es específico para el alelo FATB-A2-EMS05, en comparación con el cebador LOSA112WR2, que es específico para el alelo FATB-A2-WT).
5 -Mezcla de PCR: 2,5 µl de 10x tampón de PCR (MgCl2 15 mM), 0,25 µl de dNTP (20 mM), 1 µl de cebador directo (10 µM), 1 µl de cebador inverso (10 µM), 0,25 µl de Taq-polimerasa (5 U/µl), 19,5 µl de H2O Milli-Q, 0,5 µl de ADN (20-50 ng/µl) = Volumen total de 25 µl;
- -
- Perfil de termociclado: 4 min a 95 ºC; 30x [1 min a 95 ºC (desnaturalización) y 1 min a temperatura de hibridación especificada en la Tabla 26 y 2 min a 72 ºC (extensión)]; 5 min a 72 ºC; enfriamiento a 4 ºC. La 10 temperatura de hibridación óptima se determinó por PCR de gradiente de temperatura en la que la temperatura de hibridación se varió entre 57 ºC y 70 ºC en un ciclador térmico MJ Research PTC-200 (Biozym). La temperatura de hibridación óptima para los cebadores específicos de FATB no mutantes es aquella temperatura a la que un fragmento de PCR claro del tamaño detectado puede detectarse (como se describe más adelante) para la muestra de ADN de la planta de Brassica no mutante y no para la muestra
15 de ADN de la planta de Brassica mutante. La temperatura de hibridación óptima para los cebadores específicos de FATB mutantes es aquella temperatura a la que puede detectarse un fragmento de PCR claro del tamaño esperado (como se describe más adelante) para la muestra de ADN de la planta de Brassica mutante y no para la muestra de ADN de la planta de Brassica no mutante.
- -
- Después de la amplificación, se añadieron 5 µl de colorante de carga (colorante naranja) a 15 µl de las 20 muestras de PCR y las muestras se cargaron sobre un 1,5 % de gel de agarosa. -Los patrones de bandas obtenidos después de la amplificación de ADN genómico de plantas de Brassica mutantes se evalúan del siguiente modo:
- -
- No debe aceptarse datos de muestras de ADN aislado de material de hoja de plantas de Brassica 25 mutantes dentro de una única ejecución de PCR y una mezcla de PCR individual a menos que:
- -
- el control de ADN no mutante muestre el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-WT y no el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-EMSXX
30 -el control de ADN positivo muestra el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-EMSXX y no el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-WT
- -
- Carriles que no muestran producto de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de
35 FATB-Xx-WT y el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-EMSXX indican que la planta correspondiente a partir de la que se preparó el molde de ADN genómico es un mutante homocigótico para FATB-Xx-EMSXX.
- -
- Carriles que muestran el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-WT y el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-EMSXX indican que la planta 40 correspondiente a partir de la cual se preparó el molde de ADN genómico es un mutante heterocigótico
para FATB-Xx-EMSXX.
- -
- Carriles que muestran el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-WT y no producto de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de FATB-Xx-EMSXX indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el molde de ADN
45 genómico es un planta no mutante. Tabla 26:
- Alelo nº
- Cebadores Tª de hibridación (ºC) Tamaño del fragmento de PCR (pb)
- FATB-A1-EMS05 FATB-A1-WT
- 5' GGCGGCTGAGAAGCAGTGAATA3' (LOSA104MF1 -SEC ID Nº: 50) 5' GGACTGAAGCACACTGTCC 3' (LOSA104R3 -SEC ID Nº: 52) 5' GGCGGCTGAGAAGCAGTGGATG3' (LOSA104WF1 -SEC ID Nº: 51) 5' GGACTGAAGCACACTGTCC 3' (LOSA104R3 -SEC ID Nº: 52) 57 71,8 1087 1087
- FATB-A1-EMS06 FATB-A1-WT
- 5' CAGTGGATGATGCTTGACTGA3' (LOSA105MF1 -SEC ID Nº: 53) 5' GCATACGAGTAACAACCCAA 3' (LOSA104R5 -SEC ID Nº: 55) 5' CAGTGGATGATGCTTGACTGG3' (LOSA105WF1 -SEC ID Nº: 54) 5' GCATACGAGTAACAACCCAA 3' 67 68,9 365 365
- Alelo nº
- Cebadores Tª de hibridación (ºC) Tamaño del fragmento de PCR (pb)
- (LOSA104R5 -SEC ID Nº: 55)
- FATB-A2-EMS01 FATB-A2-WT
- 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 -SEC ID Nº: 58/59) 5' CGGAACACAAGACCATCCTA3' (LOSA108MR1' -SEC ID Nº: 60) 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 -SEC ID Nº: 58/59) 5' CGGAACACAAGACCATCCTG3' (LOSA108WR1' -SEC ID Nº: 61) 67 67 346 346
- FATB-A2-EMS05 FATB-A2-WT
- 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 -SEC ID Nº: 58/59) 5' AGCAGCAAGCAGCATACTTC 3' (LOSA112MR2 -SEC ID Nº: 56) 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 -SEC ID Nº: 58/59) 5'TAGCAGCAAGCAGCATACTC 3' (LOSA112WR1 -SEC ID Nº: 57) 67 67 222 222
- FATB-A3-EMS01 FATB-A3-WT
- 5' CAATGGCAAAACCAACAAAGC 3' (LOSA114F1 -SEC ID Nº: 64) 5' TATTTATCAACTACAACCTA 3' (LOSA114MR1 -SEC ID Nº: 62) 5' CAATGGCAAAACCAACAAAGC 3' (LOSA114F1 -SEC ID Nº: 64) 5' TATTTATCAACTACAACCTG 3' (LOSA114WR1 -SEC ID Nº: 63) 60 63 805 805
- FATB-C1-EMS04 FATB-C1-WT
- 5' CGGTTATGAATCATTTACAA 3' (LOSA128MF1 -SEC ID Nº: 68) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 -SEC ID Nº: 38/67) 5' CGGTTATGAATCATTTACAG 3' (LOSA128WF1 -SEC ID Nº: 69) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 -SEC ID Nº: 38/67) 62,1 57-70 1045 1045
- FATB-C1-EMS05 FATB-C1-WT
- 5' GTTAAGAAGAACTTGATATGA3' (LOSA129MF1 -SEC ID Nº: 65) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 -SEC ID Nº: 67) 5' GTTAAGAAGAACTTGATATGG3' (LOSA129WF1 -SEC ID Nº: 66) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 -SEC ID Nº: 67) 60 64,7 876 876
- FATB-C2-EMS02 FATB-C2-WT
- 5' GTCTGACAACGAGACTTCGT3' (LOSA119MF1 -SEC ID Nº: 70) 5' CAGTATTGCAATCCCGAACC 3' (LOSAC2R3 -SEC ID Nº: 72) 5' GTCTGACAACGAGACTTCGC3' (LOSA119WF1 -SEC ID Nº: 71) 5' CAGTATTGCAATCCCGAACC 3' (LOSAC2R3 -SEC ID Nº: 72) 69,7 57-70 818 818
- FATB-C2-EMS03 FATB-C2-WT
- 5' TGGCGGCTGAGAAACAGTGA3' (LOSA120MF1 -SEC ID Nº: 73) 5' AGGGTACTTACAGTGAGACCC 3' (LOSAC2R1 -SEC ID Nº: 75) 5' TGGCGGCTGAGAAACAGTGG3' (LOSA120WF1 -SEC ID Nº: 74) 5' AGGGTACTTACAGTGAGACCC 3' (LOSAC2R1 -SEC ID Nº: 75) 70 71,1 1056 1056
- FATB-C3-EMS02 FATB-C3-WT
- 5' CAGTCATGAACCACTTACAGA3' (LOSA125MF2 -SEC ID Nº: 76) 5' CAACCTGCATACGAGTAACG 3' (LOSA124R2 -SEC ID Nº: 78) 5' CAGTCATGAACCACTTACAGG3' (LOSA125WF2 -SEC ID Nº: 77) 67 69,7 555 555
- Alelo nº
- Cebadores Tª de hibridación (ºC) Tamaño del fragmento de PCR (pb)
- 5' CAACCTGCATACGAGTAACG 3' (LOSA124R2 -SEC ID Nº: 78)
* ho=homocigótico, he=heterocigótico
Alternativamente, puede usarse tecnología Invader™ (Third Wave Agbio) para discriminar plantas que comprenden una mutación puntual específica en un alelo FATB de plantas que no comprende esa mutación puntual específica. 5 Las siguientes sondas Invader™ discriminadoras pueden así desarrollarse para detectar la presencia o ausencia y el estado de cigosidad de los alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4 (véase la Tabla 23a y b):
- -
- Se desarrollan sondas específicas para el mutante (que puede discriminarse uniéndose a una secuencia 'flap1')
o gen FATB diana no mutante correspondiente (que puede discriminarse uniéndose a una secuencia 'flap2') e
10 “invadiendo” sondas que pueden usarse en combinación con ellas. Generalmente, cada conjunto de sonda consiste en una sonda específica para el gen diana mutante o no mutante del cual el primer nucleótido después de la secuencia flap de 5' coincide con la diferencia de nucleótidos (nucleótido subrayado en la Tabla 27) (la llamada “sonda primaria”; por ejemplo, la sonda con SEC ID Nº: 82 es específica para FATB-A1-EMS05) y una sonda específica para los nucleótidos en la dirección 5' de la diferencia de nucleótidos (la llamada “invader®
15 oligo”; por ejemplo, la sonda con SEC ID Nº: 81 es específica para los nucleótidos en la dirección 5' de la diferencia de nucleótidos entre FATB-A1-EMS05 y FATB-A1-WT). El último nucleótido del último cebador puede coincidir con la diferencia de nucleótidos en el mutante, pero también pueden usarse otros nucleótidos para este último nucleótido (como se indica por los nucleótidos en negrita en la Tabla 27) en tanto que la sonda primaria e invader® oligo sean todavía capaces de formar un solapamiento de una única base cuando se hibrida con el
20 ADN diana para generar la estructura invasiva específica reconocida por las enzimas Cleavase® (Third Wave Agbio). El procedimiento de ensayo Invader™ y la interpretación de los datos se realizan como se ha prescrito por el fabricante (Third Wave Agbio). Brevemente, las secuencias de nucleótidos indicadas como “flap1” y “flap2” representan las secuencias de las “flaps” de 5' que se escinden de las sondas primarias en la fase primaria del ensayo Invader™ y que son complementarias a las secuencias en el casete FRET™ 1 y 2,
25 respectivamente, y no complementarias a las secuencias mutantes o no mutantes diana. Si las sondas primarias se escinden en la fase primaria y las sonda de flap1 y/o la sonda de flap2 se hibridan con el casete FRET™ 1 y 2, respectivamente, en la fase secundaria, se genera una señal indicativa de la presencia en la muestra del gen FATB mutante o diana no mutante correspondiente, respectivamente. -Alternativamente, sondas específicas para el gen FATB diana mutante (indicadas como “5' flap1-x” en la Tabla
30 27) se usan en combinación con sondas específicas para un gen de control interno (indicado como “5' flap2-x” en la Tabla 27: el gen de control se indica como ENDO1). Si las sondas primarias se escinden en la fase primaria y la sonda flap1 y/o sonda flap2 se hibridan con el casete FRET™ 1 y 2, respectivamente, en la fase secundaria, se genera una señal indicativa de la presencia en la muestra del gen FATB diana mutante y el gen de control endógeno, respectivamente. Basándose en la cantidad de señal generada a partir del casete FRET™
35 1 con respecto a la cantidad de señal generada a partir del casete FRET™ 2, puede determinarse el estado de cigosidad del alelo FATB mutante (los alelos FATB homocigóticos generan aproximadamente dos veces más señal que los alelos FATB heterocigóticos).
Tabla 27 40
- Alelo nº
- Sondas
- FATB-A1-EMS05
- 5' GCGCCTCGGTTTCCAGTCAAGCATCATC 3' 5' flap1-TCACTGCTTCTCAGCC 3' (SEC ID Nº: 81) (SEC ID Nº: 82)
- FATB-A1-EMS06
- 5'GATCCATAATCACGTCAGAGCGCCTCGGTTTC3' 5' flap1-TCAGTCAAGCATCATCC 3' (SEC ID Nº: 83) (SEC ID Nº: 84)
- FATB-A2-EMS01
- 5' flap1-AAACAATTCTCCCTAAACCA 3' (SEC ID Nº: 85) (SEC ID Nº: 86)
- FATB-A2-EMS05
- 5' flap1-TCAGTCAGGCAGCT 3' (SEC ID Nº: 87) (SEC ID Nº: 88)
- FATB-A3-EMS01
- 5' flap1-ACATACGAGTAACAACCC 3' (SEC ID Nº: 89) (SEC ID Nº: 90)
- FATB-C1-EMS04
- 5' flap1-TTGTAAATGATTCATAACCGTTT 3' (SEC ID Nº: 91) (SEC ID Nº: 92)
- FATB-C1-EMS05
- (SEC ID Nº: 93)
- 5' flap1-TCATATCAAGTTCTTCTTAACCA 3'
- (SEC ID Nº: 94)
- FATB-C2-EMS02
- 5' flap1-TAGCCCGCACCC 3' (SEC ID Nº: 95) (SEC ID Nº: 96)
- FATB-C2-EMS03
- 5' AGAACGCCTGGGTTTCCAGTCAAGCATCATC 3' 5' flap1-TCACTGTTTCTCAGCC 3' (SEC ID Nº: 97) (SEC ID Nº: 98)
- FATB-C3-EMS02
- 5' flap1-ATATATTACAATCACACTCGATTG 3' (SEC ID Nº: 99) (SEC ID Nº: 100)
- ENDO1
- 5' TGAGGAGCGTGGTGGTCCCACACCTT 3' 5' flap2-CGATGCGACCAGC 3' (SEC ID Nº: 101) (SEC ID Nº: 102)
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Bayer BioScience N.V. Laga, Benjamin den Boer, Bart Lambert, Bart
5
<120> Planta de Brassica que comprende alelos mutantes de acil graso-ACP tioesterasa
<130> BCS 07-2011
10 <160> 102
<170> Patentln versión 3.3
<210> 1 15 <211> 1563
<212> ADN
<213> FATB-Al de Brassica naupus WOSR
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<213> FATB-C2 de tipo silvestre de Brassica Napus WOSR
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> CDS
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<212> PRT
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<211> 1770
<212> ADN
<213> FATB-C2 de tipo silvestre de Brassica Napus SOSR
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(504)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(1767)
<223> el péptido maduro comienza en el aminoácido 91
<220>
<221> misc_feature
<222> (490)..(492)
<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (581)..(714)
<220>
<221> misc_feature
<222> (602)..(604)
<223> Lys conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (674)..(676)
<223> val conservada
<220>
<221> CDS
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1190)..(1361)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1227)..(1229)
<223> ser conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1447)..(1767)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1453)..(1455)
<223> Trp conservado
<220>
<221> misc_feature
<222> (1471)..(1473)
<223> Asn conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1477)..(1479)
<223> His conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1582)..(1584)
<223> cys conservada
<400> 21
<210> 22
<211> 415
<212> PRT
<213> FATB-C2 de tipo silvestre de Brassica Napus SOSR
<400> 22
<210> 23
<211> 1892
<212> ADN
<213> FATB-C3 de tipo silvestre de Brassica Napus SOSR
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(507)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(1889)
<223> el péptido maduro comienza en el aminoácido 92
<220>
<221> raisc_feature
<222> (493)..(495)
<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (931)..(1064)
<220>
<221> misc_feature
<222> (952)..(954)
<223> Lys conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1024)..(1026)
<223> val conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1139)..(1252)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1191)..(1193)
<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1325)..(1496)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1362)..(1364)
<223> ser conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1572)..(1889)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1578)..(1580)
<223> Trp conservado
<220>
<221> misc_feature
<222> (1596)..(1598)
<223> Asn conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1602)..(1604)
<223> His conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1707)..(1709)
<223> cys conservada
<400> 23
<210> 24
<211> 415
<212> PRT
<213> FATB-C3 de tipo silvestre de Brassica Napus SOSR
<400> 24
<210> 25
<211> 487
5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> sonda 5' AtFATB1 10
<400> 25
- 5
- <210> 26 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> cebador de oligonucleótido KVA05-14 <400> 26 gaactttcat caaccagtta cc 22
- 15
- <210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> cebador de oligonucleótido KVA05-15
- <400> 27 ttatgcaaga ggatagctta cc
- 22
- 25
- <210> 28 <211> 352 <212> ADN <213> Artificial
- 30
- <220> <223> sonda 3' AtFATB1
- <400> 28
- 35 40
- <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador de oligonucleótido KVA05-16
- 45
- <400> 29 cagtgtgtgg gtgatgatga 20
- <210> 30
- <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> cebador de oligonucleótido KVA05-17
- <400> 30 tattcccact ggagcactct
- 20
- <210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-A1 (SOSR)
- <400> 31 ctgataacga gacgtcctca c
- 21
- <210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador inverso para la detección de FATB-A1 (SORS)
- <400> 32 catcctggag acggagcagg
- 20
- <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-A2 (SOSR)
- <400> 33 ctgcctgact ggagtatgct g
- 21
- <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador inverso para la detección de FATB-A2 (SOSR)
- <400> 34 gttgttgctc ctgtcttgga g
- 21
- <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-A3 (SOSR)
- <400> 35 gcagtggatg atgcttgata c
- 21
- <210> 36
- <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador inverso para la detección de FATB-A3 (SOSR)
- <400> 36 caagtcgttg atggtgtttt c
- 21
- <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-C1 (SOSR)
- <400> 37 ctgcctgact ggagcatgct c
- 21
- <210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador inverso para la detección de FATB-C1 (SOSR)
- <400> 38 gttcttcctc tcaccacttc g
- 21
- <210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-C2 (SOSR)
- <400> 39 atcgttcagg atggtcttgt c
- 21
- <210> 40 . <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador inverso para la detección de FATB-C2 (SOSR)
- <400> 40 gcagtcttgt catcaagttt g
- 21
- <210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> Cebador directo para la detección de FATB-C3 (SOSR)
- <400> 41 acagtggatg atgcttgact c
- 21
- <210> 42
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de FATB-C3 (SOSR)
<400> 42 cgaacatagt cagcagtctt c 21
<210> 43
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-A1
<400> 43 cagtcttaac atggttgagt g 21
<210> 44
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador directo para la detección de mutación de deleción en FATB-A2
<400> 44 catgttccat cttcttcctc g 21
<210> 45
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-A2
<400> 45 tattgggaca acatgtgagt g 21
<210> 46
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-A3
<400> 46 ttcttcttaa ccatctcagg t 21
<210> 47
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-C1
<400> 47 ccaaacccat ctccaagcag c 21
<210> 48
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-C2
<400> 48 taactcacaa cgagaaccag g 21
<210> 49
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la detección de mutación de deleción en FATB-C3
<400> 49 ctttgataat ctccttgtca c 21
<210> 50
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1-EMS05
<400> 50 ggcggctgag aagcagtgaa ta 22
<210> 51
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1
<400> 51 ggcggctgag aagcagtgga tg 22
<210> 52
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1-EMS05 y –A1
<400> 52 ggactgaagc acactgtcc 19
<210> 53
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1-EMS06
<400> 53 cagtggatga tgcttgactg a 21
<210> 54
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A1
<400> 54 cagtggatga tgcttgactg g 21
<210> 55
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A1-EMS06 y –A1
<400> 55 gcatacgagt aacaacccaa 20
<210> 56
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2-EMS05
<400> 56 agcagcaagc agcatacttc 20
<210> 57
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2
<400> 57 tagcagcaag cagcatactc 20
<210> 58
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2-EMS05 y -A2
<400> 58 gagttgggtc cactaatttt g 21
<210> 59
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2-EMS01
<400> 59 gagttgggtc cactaatttt g 21
<210> 60
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A2
<400> 60 cggaacacaa gaccatccta 20
<210> 61
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A2-EMS01 y -A2
<400> 61 cggaacacaa gaccatcctg 20
<210> 62
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3-EMS01
<400> 62 tatttatcaa ctacaaccta 20
<210> 63
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-A3
<400> 63 tatttatcaa ctacaacctg 20
<210> 64
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-A3-EMS01 y -A3
<400> 64 caatggcaaa accaacaaag c 21
<210> 65
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1-EMS05
<400> 65 gttaagaaga acttgatatg a 21
<210> 66
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1
<400> 66 gttaagaaga acttgatatg g 21
<210> 67
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C1-EMS05, -C1-EMS04, y –C1
<400> 67 gttcttcctc tcaccacttc g 21
<210> 68
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1-EMS04
<400> 68 cggttatgaa tcatttacaa 20
<210> 69
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C1
<400> 69 cggttatgaa tcatttacag 20
<210> 70
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2-EMS02
<400> 70 gtctgacaac gagacttcgt 20
<210> 71
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2
<400> 71 gtctgacaac gagacttcgc 20
<210> 72
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2-EMS02 y -C2
<400> 72 cagtattgca atcccgaacc 20
<210> 73
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2-EMS03
<400> 73 tggcggctga gaaacagtga 20
<210> 74
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C2
<400> 74 tggcggctga gaaacagtgg 20
<210> 75
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C2-EMS03 y -C2
<400> 75 agggtactta cagtgagacc c 21
<210> 76
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C3-EMS02
<400> 76 cagtcatgaa ccacttacag a 21
<210> 77
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido directo para la detección de FATB-C3
<400> 77 cagtcatgaa ccacttacag g 21
<210> 78
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido inverso para la detección de FATB-C3-EMS02 y -C3
<400> 78 caacctgcat acgagtaacg
<210> 79
<211> 2864
<212> ADN
<213> FATB1 de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana
<220>
<221> CDS
<222> (501)..(998)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (501)..(2361)
<223> el péptido maduro comienza en el aminoácido 89
<220>
<221> misc_feature
<222> (984)..(986)
<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1080)..(1213)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1101)..(1103)
<223> Lys conservada
<220>
<221> misc_feature
<222> (1173)..(1175)
<223> val conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1441)..(1554)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1493)..(1495)
<223> Met conservada
<220>
<221> CDS
<222> (1782)..(1953)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1819)..(1821)
<223> ser conservada
<220>
<221> CDS
<222> (2044)..(2361)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2050)..(2052)
<223> Trp conservado
5 <220>
<221> misc_feature
<222> (2068)..(2070)
<223> Asn conservada
10 <220>
<221> misc_feature
<222> (2074)..(2076)
<223> His conservada
<221> misc_feature
<222> (2179)..(2181)
<223> cys conservada
20 <400> 79
<210> 80
<211> 412
<212> PRT
<213> FATB1 de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana
<400> 80
- 5
- <210> 81 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS05 <400> 81 gcgcctcggt ttccagtcaa gcatcatc 28
- 15
- <210> 82 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS05
- <400> 82 tcactgcttc tcagcc
- 16
- <210> 83 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS06
- <400> 83 gatccataat cacgtcagag cgcctcggtt tc
- 32
- <210> 84 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A1-EMS06
- <400> 84 tcagtcaagc atcatcc
- 17
- <210> 85 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS01
- <400> 85 acctaatgga aaaattctga cggaacacaa gaccatcctt
- 40
- <210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS01
- <400> 86 aaacaattct ccctaaacca
- 20
- <210> 87 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS05
- <400> 87 tgccaagaaa atggtagtta tagcagcaag cagcatactc
- 40
- <210> 88 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A2-EMS05
- <400> 88 tcagtcaggc agct
- 14
- <210> 89 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A3-EMS01
- <400> 89 aagagagctt accaagtagg atatttatca actacaacct t
- 41
- <210> 90 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-A3-EMS01
- <400> 90 acatacgagt aacaaccc
- 18
- <210> 91 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS04
- <400> 91 ccagtaacaa caagcgacta caatcataat cataatcagt ace
- 43
- <210> 92 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS04
- <400> 92 ttgtaaatga ttcataaccg ttt
- 23
- <210> 93 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS05
- <400> 93 taggatattt atcaacgaca acctgcatac gagtaacaac c
- 41
- <210> 94 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C1-EMS05
- <400> 94 tcatatcaag ttcttcttaa cca
- 23
- <210> 95 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS02
- <400> 95 cctggttctg tagagatatc aaagtctgac aacgagactt cgc
- 43
- <210> 96 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS02
- <400> 96 tagcccgcac cc
- 12
- <210> 97 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS03
- <400> 97 agaacgcctg ggtttccagt caagcatcat c
- 31
- <210> 98 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C2-EMS03
- <400> 98 tcactgtttc tcagcc
- 16
- <210> 99 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
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- <400> 99 cgctctgcgt ctatagaaac agtcatgaac cacttacagt
- 40
- <210> 100 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> oligonucleótido para la detección de FATB-C3-EMS02
- <400> 100 atatattaca atcacactcg attg
- 24
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5 <213> Artificial
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10 <400> 101 tgaggagcgt ggtggtccca cacctt 26
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<220>
<223> oligonucleótido para la detección de ENDO1 20
<400> 102 cgatgcgacc agc 13
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Una planta de Brassica, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizada porque comprende al menos tres alelos FATB mutantes en su genoma, que producen aceite de semillas, en la que el aceite de semillas tiene menos del 7 % en peso de ácidos grasos saturados, basado en la cantidad total de ácidos grasos en el aceite de semillas, en la que dichos alelos FATB mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína FATB funcional, en la que el gen FATB funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- una molécula de ácido nucleico que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 11; y -una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12
en la que dichos alelos FATB mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, delecionados o sustituidos en comparación con una región de ADN no mutante correspondiente en el gen FATB funcional y en la que dichos alelos FATB mutantes codifican una proteína no funcional que no tiene actividad de acil ACP-tioesterasa in vivo, o no codifica proteína. -
- 2.
- La planta de Brassica, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dichos alelos FATB mutantes están seleccionados del grupo que consiste en:
-un alelo FATB mutante que comprende una deleción de un gen FATB que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 13; -un alelo FATB mutante que comprende una deleción de un gen FATB que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 15; -un alelo FATB mutante que comprende una deleción de un gen FATB que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 21; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 13, en la que la g en la posición 279 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 13, en la que la g en la posición 333 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 13, en la que la g en la posición 348 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 15, en la que la g en la posición 282 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 15, en la que la c en la posición 406 está sustituida con t; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 17, en la que la c en la posición 845 está sustituida con t; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 19, en la que la g en la posición 668 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 21, en la que la c en la posición 235 está sustituida con t; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 21, en la que la c en la posición 331 está sustituida con t; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 21, en la que la g en la posición 336 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 13, en la que la g en la posición 502 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 13, en la que la g en la posición 587 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 15, en la que la g en la posición 505 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 15, en la que la g en la posición 504 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 19, en la que la g en la posición 498 está sustituida con a; -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 21, en la que la g en la posición 581 está sustituida con a; y -una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 23, en la que la g en la posición 508 está sustituida con a. -
- 3.
- Una planta según la reivindicación 1 ó 2, en la que el aceite de semillas tiene igual o inferior al 3,5 % en peso de ácidos grasos saturados, especialmente ácido palmítico y/o esteárico, basado en la cantidad total de ácidos grasos en el aceite de semillas.
-
- 4.
- Una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha planta es una especie oleaginosa de Brassica, preferentemente Brassica napus, Brassica juncea o Brassica rapa.
-
- 5.
- Un método para producir aceite de semillas que comprende las etapas de recoger las semillas de una planta de Brassica que comprende al menos tres alelos FATB mutantes como se describen en la reivindicación 1 ó 2 en su genoma, y extraer el aceite de dichas semillas.
-
- 6.
- Una planta de Brassica, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma
- -
- que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 13 en la que la g en la posición 333 está sustituida con a, una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 17 en la que la c en la posición 845 está sustituida con t, una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 19 en la que la g en la posición 498 está sustituida con a, y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 23 en la que la g en la posición 508 está sustituida con a, semilla de Brassica de referencia que se ha depositado en la NCIMB Limited el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41568, -que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 13 en la que la g en la posición 348 está sustituida con a, una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 15 en la que la c en la posición 406 está sustituida con t, una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 19 en la que la g en la posición 668 está sustituida con a, y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 21 en la que la g en la posición 336 está sustituida con a, semilla de Brassica de referencia que se ha depositado en la NCIMB Limited el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41567, o -que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 15 en la que la g en la posición 282 está sustituida con a, una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 19 en la que la g en la posición 668 está sustituida con a, y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 21 en la que la c en la posición 235 está sustituida con t, semilla de Brassica de referencia que se ha depositado en la NCIMB Limited el 27 de junio de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41566.
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