JP5677839B2 - 突然変異脂肪酸アシル−ａｃｐチオエステラーゼ対立遺伝子を含むアブラナ属植物 - Google Patents

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Description

発明の属する技術分野本発明は、農産物、特に新規種子脂質組成物を含む作物植物の分野に関する。アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）脂肪酸アシル−アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢタンパク質（ＦＡＴＢ）及びそのようなタンパク質をコード化する野生型及び突然変異核酸分子の両方を提供する。（少なくとも３つの異なるＦＡＴＢタンパク質をコード化するアブラナ属遺伝子の）少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子をそのゲノム中に含むアブラナ属植物、組織、及び種子も提供し、ここで種子油脂肪酸組成又はプロファイルが有意に変化する。また、低減レベルの飽和脂肪酸を有する種子油を含む種子を産生するアブラナ属植物を生成するための方法を本明細書において提供し、そのような種子から入手可能な種子油も同様である。そのような種子油はさらなる混合又は修飾を必要とせず、米国保健福祉省（ＨＨＳ）の食品医薬品局（ＦＤＡ）に従って、「低飽和物（ｌｏｗ ｉｎ ｓａｔｕｒａｔｅｓ）」として、又は、「無飽和物（ｎｏ ｓａｔｕｒａｔｅｓ）」を含むとしてラベル付けできる。アブラナ属植物、組織、又は種子において１つ又は複数のｆａｔＢ及び／又は野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在を検出するための検出ツール（キット）及び方法、ならびに１つ又は複数の突然変異ｆａｔＢ及び／又は野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を他のアブラナ属植物に移入するための方法及び植物において異なるｆａｔＢ及び／又はＦＡＴＢ対立遺伝子を組み合わせるための方法をさらに提供する。特に、非機能的ＦＡＴＢタンパク質及び／又はインビボで有意に低減した活性を有するＦＡＴＢタンパク質をコード化する、適した数の突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を組み合わせるための方法であって、アブラナ属種子油中に蓄積する相対量の全飽和脂肪酸及び／又は特定の飽和脂肪酸を有意に低減させる。また、植物、又はその部分、及び／又はその子孫、種子及び種子油、ならびに本発明の方法及び／又はキットの使用を提供する。
発明の背景
植物油は経済的にますまず重要になっている。なぜなら、それらはヒト及び動物の食事中及び多くの産業的用途において広く使用されるためである。しかし、これらの油の脂肪酸組成はしばしばこれらの使用の多くに最適ではない。特定の脂肪酸組成を伴う特殊油が、栄養的及び産業的な目的の両方のために必要とされるため、植物育種により、及び／又は、植物バイオテクノロジーの新しい分子ツールにより油組成を修飾することに相当の興味がある（アブラナ油の修飾については、例えば、Scarth and Tang, 2006, Crop Science 46: 1225-1236を参照のこと）。
食用油の特定の性能及び健康特質は、概して、それらの脂肪酸組成により決定される。市販の植物種に由来する大半の植物油は、主に、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、及びリノレン酸（１８：３）から成る。パルミチン酸及びステアリン酸は、それぞれ、１６及び１８の炭素長の飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸は、それぞれ、１つ、２つ、及び３つの二重結合を含む１８の炭素長の不飽和脂肪酸である。オレイン酸は一不飽和脂肪酸と呼ばれ、リノール酸及びリノレン酸は多価不飽和脂肪酸と呼ばれる。
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）及びセイヨウカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ属脂肪種子種は、一般に菜種及びカラシナとして公知であり、現在、ダイズに次いで２番目に大きな脂肪種子作物である（FAD, 2005; Raymer (2002) In J. Janick and A. Whipkey (ed.) Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA Raymer, p. 122-126）。伝統的なアブラナ属脂肪種子品種により産生される菜種油（セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ． ｒａｐａ）、及びセイヨウカラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ））（Shahidi (1990) In Shahidi (ed) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p.3-13; Sovero (1993) In J. Janick and J. E. Simon (ed.) New crops. John Wiley & Sons, New York, p. 302-307）は、典型的に、全脂肪酸含量（以下、重量%と呼ぶ）に基づき、５%パルミチン酸（Ｃ１６：０）、１%ステアリン酸（Ｃ１８：０）、１５%オレイン酸（Ｃ１８：１）、１４%リノール酸（Ｃ１８：２）、９%リノレン酸（Ｃ１８：３）、及び４５%エルカ酸（Ｃ２２：１）の脂肪酸組成を有した（Ackman (1990) In Shahidi (ed.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 81-98）。エルカ酸は栄養的に望ましくない脂肪酸であり、食用での使用のためのアブラナ油中で非常に低レベルにまで低減されている。種子油中の全脂肪酸に基づく飽和脂肪酸の典型的な相対量は約６．５%と７．５%の間であり、ここで大部分がパルミチン酸及びステアリン酸である。
カナダにおいて、植物学者は、種子油中のエルカ酸が低く、油抽出後に残る固形食中のグルコシノレートが低い（即ち、無油食１グラム当たりエルカ酸含量が２重量%未満、及び、グルコシノレート含量が３０マイクロモル未満）いわゆる「二重低」品種を作成することに彼らの努力の焦点を合わせた。カナダにおいて開発されたこれらの高品質型の菜種は、キャノーラとして公知である。キャノーラ油は、比較的低レベルの飽和脂肪酸（平均約７重量%）、比較的高レベルの一不飽和脂肪酸（約６１重量%）、及び中間レベルの多価不飽和脂肪酸（約３２重量%）により特徴付けられ、リノール酸、即ちオメガ−６脂肪酸（約２１重量%）とアルファ−リノレン酸、即ちオメガ−３脂肪酸（約１１重量%）の間の良好なバランスを伴う。
食事脂肪における現在の関心の主な理由は、高脂肪摂取、特に飽和脂肪と、冠動脈心疾患とを関連付ける証拠に関連する。高レベルの血中コレステロール、特に「悪玉」（低密度リポタンパク質又はＬＤＬ）コレステロールは、冠動脈心疾患における主な危険因子を構成する。いくつかの研究により、一不飽和脂肪が高く、飽和脂肪が低い食事によって「悪玉」（低密度リポタンパク質又はＬＤＬ）コレステロールが低減されうるが、「善玉」（高密度リポタンパク質又はＨＤＬ）コレステロールは維持されることが示唆される（Nicolosi and Rogers, 1997, Med. Sci. Sports Exerc. 29: 1422-1428）。
北米及びヨーロッパにおける栄養的な推奨事項では、全エネルギーの３０%未満までの全脂肪摂取量の低減及び１０%未満までの飽和脂肪摂取量の低減を要求する（２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １０１．７５ （ｂ） （３））（大半の工業国における全カロリー消費量の約１５%〜２０%の飽和脂肪摂取量との比較）。消費者の意識を促進するために、米国保健福祉省（ＨＨＳ）の食品医薬品局（ＦＤＡ）により発行された現行のラベリングガイドラインは、現在、全飽和脂肪酸レベルを、習慣的に消費される基準量当たり１g又はそれ未満の飽和脂肪酸、及び、「低飽和脂肪」又は「低ｓａｔ」ラベル（２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．１０１．６２ （ｃ） （２））を受けるための飽和脂肪酸からのカロリーの１５パーセントまで、ならびに、習慣的に消費される基準量当たり、及び、「無（又はゼロ）飽和脂肪」又は「無（又はゼロ）ｓａｔ」ラベル（２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １０１．６２（ｃ） （１））を受けるためのラベル付き給仕当たり０．５g未満の飽和脂肪及び０．５g未満のトランス脂肪酸（植物油の（部分的）水素化により産生され、不飽和であるにもかかわらず、冠状動脈性心臓病のリスクを増大させるため健康に害があるとみなされる不飽和脂肪酸の型）を必要とする。このことは、総飽和脂肪酸含量（油中の脂肪酸の総量に基づく飽和脂肪酸の重量パーセント）、即ち、植物油のラウリン酸（Ｃ１２：０；ドデカン酸）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０；テトラデカン酸）、パルミチン酸（Ｃ１６：０；ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（Ｃ１８：０；オクタデカン酸）、アラキジン酸（Ｃ２０：０；エイコサン酸）、ベヘン酸（Ｃ２２：０；ドコサン酸）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０；テトラコサン酸）含量の合計が、「低ｓａｔ（ｌｏｗ ｓａｔ）」ラベルを受けるために７重量%未満であり、「無ｓａｔ（ｎｏ ｓａｔ）」ラベルを受けるために３．５重量%未満であることが必要である（１５ml又は１４gの油の基準量に基づく−２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １０１．１２）ことを意味する。
キャノーラ油は、サフラワー油（８重量%）、アマニ油（９重量%）、ヒマワリ油（１２重量%）、コーン油（１３重量%）、オリーブ油（１５重量%）、大豆油（１５重量%）、ピーナッツ油（１９重量%）、綿実油（２７重量%）、パーム油（５１重量%）、及びココナッツ油（９１重量%）（情報源POS Pilot Plant Corporation）などの他の一般的に使用される食用植物油中の飽和脂肪酸のレベルと比較し、わずか約７重量%の飽和脂肪酸を含む。様々なアプローチを使用して、飽和脂肪酸のこのレベルをさらに低減することを試みた。
植物油の修飾は化学的に影響を受けうる：米国特許第４，９４８，８１１号には、トリグリセリドサラダ／調理油の組成について記載されており、油のトリグリセリドの脂肪酸含量は、飽和物の化学反応により、又は、物理的分離により得られる約３重量%未満の飽和脂肪酸を含む。しかし、飽和脂肪酸のレベルを低減するための植物油の化学修飾は、本明細書において開示する改善した食用の内因性植物油を提供するために修飾したアブラナ属脂肪種子植物（又は任意の他の脂肪種子植物）からの植物油の抽出よりも費用がかかるのみならず、また、使用される化学産物からの残留物及び推定副産物の潜在的な不注意による存在のため、ヒトの消費のための油の健康性を改善する所望の方法ではないであろう。
脂肪酸組成を修飾する別の可能性は、遺伝子工学を使用することによる。例えば、米国特許出願第２００４／０１３２１８９号には、クフェア・プルケリマ（Ｃｕｐｈｅａ ｐｕｌｌｃｈｅｒｉｍａ）ベータ−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質シンターゼＩ及びＩＶ配列ならびにサフラワーデルタ−９デサチュラーゼを同時発現するアブラナ属系統における飽和脂肪酸レベルの、非形質転換コントロール系統における飽和脂肪酸レベルの約６．０重量%と比較した、約３重量%及び３．４重量%未満までの低下について記載される。国際公開第０６／０４２０４９号には、デルタ−９デサチュラーゼ遺伝子を発現するそれらの種子中の「無飽和」又は脂肪酸の飽和物レベルが低減したアブラナ植物が記載される。しかし、商品化のためのトランスジェニックアプローチの不利点は、規制認可及び世界の様々な地域における様々な承認の必要性である。
植物油の脂肪酸組成は、また、伝統的な育種技術を通して修飾できる。これらの技術では、既存の生殖質を、脂肪酸組成に影響を及ぼす天然の突然変異の源として利用する。例えば、Raney et al.（1999, In Proc. 10th Int. Rapeseed Cong.: New horizons for an old crop, Canberra, Australia）は、セイヨウアブラナとブラッシカ・ラパ及びブラッシカ・オレラケア（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ）との種間交雑に由来する育種集団を記載し、ここでは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、及びリグノセリン酸の合計として表わす飽和脂肪酸のレベルは６重量%未満まで低減し、ミリスチン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸の合計として表わす飽和脂肪酸のレベルは５重量%未満まで低減した。
突然変異原を使用することにより所望の特性を選択するために利用可能な突然変異のプールを増大させるための試みがなされてきた。例えば、国際公開第９１／１５５７８号には、自家受粉時に、化学的突然変異誘発、それに続く選択により形成できるパルミチン酸及びステアリン酸の形態で４重量%までの飽和脂肪酸含量を有する油を産生する菜種を形成できる菜種植物が記載される。
植物において、デノボ脂肪酸合成はもっぱら色素体の間質中に位置し、アシル鎖は伸展サイクル中に可溶性のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に共有結合している。炭素鎖伸長は、アシル基をグリセロール−３−リン酸に移入することにより終結でき、それにより色素体の「原核生物」脂質生合成経路においてそれを保持する。あるいは、特異的チオエステラーゼが、新たに形成されたアシル−ＡＣＰを遊離脂肪酸及びＡＣＰに加水分解することにより原核生物の（色素体の）経路を妨害できる。続いて、遊離脂肪酸が色素体を出て、細胞質の「真核生物」脂質生合成経路を供給する。後者は小胞体内に位置し、リン脂質、トリグリセリド、及び他の中性脂質の形成に関与する。従って、アシル−ＡＣＰを加水分解し、脂肪酸を放出することにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、植物細胞中の真核生物の脂質生合成経路における第１委託工程を触媒し、２つの経路間のデノボ合成されたアシル基の分布において重要な役割を果たす（Lohden and Frentzen, 1988, Planta 176: 506-512;Browse and Somerville, 1991, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42: 467-506; Gibson et al., 1994, Plant Cell Environ 17: 627-637）。
Jones et al.（1995, Plant cell 7: 359-371）及びVoelker et al.（1997, Plant Physiology 114, 669-677）は、高等植物における、ＦＡＴＡ及びＦＡＴＢと名付けられた、２つの異なるが、しかし、関連したチオエステラーゼ遺伝子クラスを記載する。これらの２つのチオエステラーゼクラスは、配列比較により、及び／又は、基質の特異性／優先度により区別できる。ＦＡＴＡチオエステラーゼ（別名クラスＩチオエステラーゼ）は、Ｃ１８：１アシル−又はオレオイル−ＡＣＰについて明らかな優先度を示し、Ｃ１８：０アシル−及びＣ１６：０アシル−ＡＣＰに対してわずかに小さな活性を伴う（即ち、アシル優先度は１８：１≫１８：０≫１６：０）。対照的に、ＦＡＴＢメンバー（別名クラスＩＩチオエステラーゼ）は飽和アシル−ＡＣＰ基を基質として優先し、基質鎖の長さはＣ８からＣ１８アシル−ＡＣＰまで大幅に変動する（Mayer and Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627）。また、ＦＡＴＢメンバーは２つの官能基にさらに細分できる。一部のＦＡＴＢ酵素はＣ８からＣ１４の範囲において飽和アシル−ＡＣＰに特異的であり（中位鎖アシルＡＣＰ優先チオエステラーゼ）、中位鎖産生種において見出され、発現は中位鎖産生組織に限定される。Ｃ１４からＣ１８アシル−ＡＣＰを優先する第２ＦＡＴＢ群の酵素（主にパルミトイル−ＡＣＰ、例、Ｃ１６：０＞Ｃ１８：１＞Ｃ１８：０の優先度を伴う酵素；長鎖アシル−ＡＣＰ優先チオエステラーゼ）は、恐らくは全ての主な植物部分に存在し、中位鎖産生種に限定されない（Jones et al., 1995, Plant cell 7: 359-371）。なぜ植物がこれらの異なる型のチオエステラーゼを有するのか、及び、それらの個々の役割が何であるのかは依然として大部分が不明確である。
ＦＡＴＡ遺伝子は、アブラナ属の種を含む、多くの植物種から単離された。例えば、米国特許第５，５３０，１８６号、第５，５３０，１８６号、及び第５，９４５，５８５号には、大豆からのＦＡＴＡ遺伝子が記載される；Hellyer et al.（1992, Plant Mol. Biol. 20: 763-780）は、セイヨウアブラナからのＦＡＴＡ酵素を記載する；Loader et al.（1993, Plant Mol. Biol. 23(4): 769-778）は、セイヨウアブラナのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質配列データに由来するオリゴヌクレオチドを使用してセイヨウアブラナ胚ｃＤＮＡライブラリーからの２つのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローンの単離及び特性付けを記載する；及びMandal et al.（2000, Bioch. Soc. Transactions 28(6): 967-968）は、異なる種からのＦＡＴＡ遺伝子と相同性を示すセイヨウカラシナからのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子配列のクローニングを記載する。
Ｃ８からＣ１４の範囲において飽和アシル−ＡＣＰに特異的なＦＡＴＢ酵素（中位鎖アシル−ＡＣＰ優先チオエステラーゼ）をコード化するＦＡＴＢ遺伝子を、以下の参考文献において記載する多くの中位鎖産生植物種から単離した：
国際公開第９１／１６４２１号には、カリフォルニアベイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｂａｙ）（カリフォルニアゲッケイジュ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ））からのラウロイル（Ｃ１２：０）−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼ、カンファー（クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ））からのＣ１０：０アシル−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼ及びサフラワー（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））からのステアロイル（Ｃ１８：０）−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼの単離、ならびに、非トランスジェニックアブラナ属種子におけるレベルと比較して増大したレベルのラウリン酸をもたらすアブラナ属種子におけるカリフォルニアベイチオエステラーゼの発現が記載される。
国際公開第９２／２０２３６号には、Ｃ８：０からＣ１４：０アシル−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼの単離、及び、ラウリン酸の増大レベルをもたらす、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びブラシッカ・カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）におけるカリフォルニアベイからのラウロイル（Ｃ１２：０）−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼの発現が記載される。
Voelker et al.（1992, Science 257: 72-74）は、通常、ラウリン酸を蓄積せず、成熟種子中にラウリン酸の蓄積をもたらすシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の種子において、種子油中にカプリン酸（Ｃ１０：０）及びラウリン酸（Ｃ１２：０）を蓄積する種であるカリフォルニアベイからのラウロイル（Ｃ１２：０）−ＡＣＰチオエステラーゼをコード化するＦＡＴＢ ｃＤＮＡ（Ｕｃ ＦＡＴＢ１）の発現を記載する。Voelker et al.（1996, Plant J. 9: 229-241）は、トリグリセリドアシル基のほぼ６０モル%までのラウリン酸の蓄積をもたらす、同じＦＡＴＢトランスジーンのセイヨウアブラナ中への形質転換を記載する。
Eccleston及びOhlrogge（1998, Plant cell 10: 613-621）は、１．８モル%〜５９．６モル%のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含む種子油をもたらす、セイヨウアブラナ種子中のカリフォルニアゲッケイジュからのＣ１２：０アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を記載する。
国際公開第９４／１０２８８号には、Ｃ８：０からＣ１０：０のアシル−ＡＣＰ−優先チオエステラーゼの単離が記載される。
Martini et al.（1995, In Proc. 9th Int. Rapeseed Cong, Cambridge, UK, p. 461-463）は、クフェア・ランケオラータ（Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）からの２つのＦＡＴＢ遺伝子を別々にセイヨウアブラナにおいて形質転換し、アブラナ属種子油において低レベルでカプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）の蓄積をもたらすことを記載する。
Dehesh et al.（1996, Plant J. 9(2): 167-172）は、メキシコ低木クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）からのＦＡＴＢ ｃＤＮＡ（Ｃｈ ＦＡＴＢ２）の発現を記載し、その種子油中に７５モル%までのカプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）を蓄積し、通常、これらの脂肪酸を蓄積しないトランスジェニックキャノーラの種子において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）のそれぞれ１１、２７、及び２モル%までの蓄積をもたらす。
Ｃ１４からＣ１８の範囲において飽和アシル−ＡＣＰに特異的／優先的なＦＡＴＢ酵素（長鎖アシル−ＡＣＰ優先チオエステラーゼ）をコード化するＦＡＴＢ遺伝子を、多くの植物種から単離した：
国際公開第９５／１３３９０号は、ニラ、マンゴー、ニレ、及びカンファーからのパルミトイル（Ｃ１６：０）−ＡＣＰチオエステラーゼ配列の単離、ならびに、遺伝子形質転換により大豆及びキャノーラ中の飽和脂肪酸のレベルを増大及び低下する際でのそれらの使用を記載する。
Jones et al.（1995, Plant cell 7: 259-371）は、６モル%から３５モル%までのパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルの増大をもたらす、トランスジェニックセイヨウアブラナ植物におけるカンファー（Ｃｈ ＦＡＴＢ１）からのパルミトイル（Ｃ１６：０）−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡの発現を記載する。
Voelker et al.（1997, Plant Physiol. 114: 669-677）は、セイヨウアブラナ種子において主にミリスチン酸（１４：０）含有油を蓄積し、Ｃ１４からＣ１８飽和物が濃縮した種子油をもたらす、ナツメグ（ミリスティカ・フラグランス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ））からのＣ１４：０からＣ１８：０アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を記載する。
Voelker et al.（1997, Plant Physiol. 114: 669-677）は、また、セイヨウアブラナ種子において主にカプリン酸（１０：０）含有油を蓄積し、Ｃ１０からＣ１８飽和物、主にパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、及びカプリン酸（Ｃ１０：０）が濃縮した種子油をもたらす、ニレ（ウルムス・アメリカナ（Ｕｌｍｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ））からのＣ１０：０及びＣ１６：０アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を記載する。
国際公開第９６／２３８９２号には、クフェア・パラストゥリス（Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、カンファー、及びナツメグからのミリストイル（Ｃ１４：０）−ＡＣＰチオエステラーゼ配列、及び、植物細胞におけるミリスチン酸の産生におけるそれらの使用が記載される。
国際公開第９６／０６９３６号には、大豆及びキャノーラパルミトイル（Ｃ１６：０）−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ及び遺伝子形質転換による大豆及びキャノーラにおける飽和脂肪酸レベルを増大及び低下する際でのそれらの使用が記載される。
Dormann et al.（2000, Plant Physiol 123: 637-643）は、種子中に多量のパルミチン酸（Ｃ１６：０）の蓄積をもたらす（野生型コントロールにおける１０モル%から３８．６モル%まで）、シロイヌナズナにおける種子特異的プロモーター下でシロイヌナズナからの長鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ（ＡｔＦＡＴＢ１）の過剰発現を記載する。カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター下でのシロイヌナズナＦＡＴＢ１ ｃＤＮＡのアンチセンス発現は、種子パルミチン酸含量（野生型コントロールにおける１１モル%から６モル%まで）及び花パルミチン酸含量の強い低減、ならびに、葉及び根の脂肪酸におけるわずかな小さな変化をもたらした。
Bonaventure et al.（2003, Plant Cell 15: 1020-1033）は、ＦＡＴＢ遺伝子においてＴ−ＤＮＡ挿入を伴うシロイヌナズナ突然変異体のグリセロ脂質のパルミチン酸含量（シロイヌナズナにおいて、ＦＡＴＡについて２つの遺伝子が存在し、しかし、ＦＡＴＢについてはわずかに単一の遺伝子が存在する；Mekhedov et al. 2000, Plant Physiol. 122: 389-402；及びBeisson et al. 2003, Plant Physiol. 132: 681-697を参照のこと）が、葉において４２%、花において５６%、根において４８%、及び種子において５６%低減されたことを記載する。また、ステアリン酸（Ｃ１８：０）は、葉において５０%、種子において３０%低減された。生育率は突然変異体において有意に低減され、突然変異植物は、生存率が低く、発芽が低減し、及び、種子の形態が変化した種子を産生し、ＦＡＴＢが植物の生育及び種子の発生に必須であることを示唆する。
Bonaventure et al.（2004, Plant Physiol 135: 1269-1279）は、トランスジェニックＦＡＴＢノックアウト突然変異シロイヌナズナ植物の葉における脂肪酸合成の速度が４０%増大し、野生型とほぼ同じ量のパルミチン酸が色素体から排出されるが、しかし、オレイン酸の排出が約５５%の増大することを記載する。
Pandian et al.（２００４，ポスター要旨，4th Int. Crop Sci. Cong.）は、セイヨウアブラナ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８４７２７５）及びセイヨウカラシナ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８５６３１５）からの全長ＦＡＴＢ遺伝子配列の単離、セイヨウカラシナ及びシロイヌナズナのＦＡＴＢ配列と９０%を上回る配列相同性、しかし、これらの３種のＦＡＴＡ遺伝子と４０%未満の相同性を共有するセイヨウアブラナ配列の一部の７４０bpの保存フラグメントを伴う、逆方向反復遺伝子サイレンシングコンストラクト（種子特異的プロモーターの制御下）の構築、ならびに、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、及びセイヨウカラシナ中へのその形質転換を報告する。目的は、種子油中のパルミチン酸含量が低減したトランスジェニック植物を作製することである。開示によって、最終的な種子油組成（結果は開示せず）に及ぼすこの遺伝子サイレンシングコンストラクトの効果、又は、低い飽和種子油を伴うアブラナ属植物を作成するための代替法について何も教示しない。
Mayer and Shanklin（2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627）は、Ｎ末端ドメインが特異性に影響を及ぼす残基を含み（Mayer and Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1): 1-11も参照のこと）、Ｃ末端ドメインが触媒残基を含む、シロイヌナズナＦＡＴＢタンパク質の構造モデルを記載する。
一部のＦＡＴＢ遺伝子の配列が当技術分野において利用可能であるとの事実にもかかわらず、種子油中での飽和脂肪酸の産生及び蓄積に関与する遺伝子及び酵素を十分に理解するため、及び、植物の生育及び発生に負の影響を及ぼすことなく、総飽和脂肪酸及び／又は特定飽和脂肪酸の相対量を低減するための方法（特に、非トランスジェニック方法）の開発における必要性が残る。今日まで、７%より有意に少ない飽和脂肪酸を含む種子油を産生する、無（非トランスジェニック）アブラナ属作物植物が当技術分野において利用可能である。従って、詳細な説明、図、実施例、及び特許請求の範囲において後に記載するそのような植物及び油を開発するためのツール及び方法の必要性が残る。
発明の概要
本発明者らは、セイヨウアブラナ植物が６つの異なるＦＡＴＢ遺伝子を含むこと、及び、アブラナ属植物中、特に前記アブラナ属植物の種子油中の飽和脂肪酸レベルが、種子中で「機能的に発現された」、即ち、機能的（生物学的に活性な）ＦＡＴＢタンパク質をもたらす、ＦＡＴＢ遺伝子／対立遺伝子の数及び／又は型を制御することにより制御できることを見出している。６つのＦＡＴＢ遺伝子（「ｆａｔＢ対立遺伝子」）の最小数の突然変異対立遺伝子を組み合わせ、最小数の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を維持し、最低レベルの機能的ＦＡＴＢタンパク質をもたらすことにより、種子油中の飽和脂肪酸レベルを修飾でき、特に飽和脂肪酸の相対量（特にパルミチン酸の量）を有意に低減する。最小数の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子が、正常な植物生育及び種子発生を確実にするために、最小量の飽和脂肪酸及び／又は特定飽和脂肪酸の産生を維持するために必要となることが考えられる。
このように、第１局面において、本発明は、一実施態様において、少なくとも３つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子をそのゲノム中に含むアブラナ属植物（及び、種子などのその部分）を提供し、それにより、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３からなる群より選択される少なくとも３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の対立遺伝子であり、前記植物の種子が、種子油中の脂肪酸の総量に基づき、６重量%、５重量%、４重量%、又は３．５重量%と等しい、又は、それ未満の（３重量%、２重量%、又は１重量%未満、又は、それに等しい）飽和脂肪酸を有する種子油を産生する。
別の局面において、本発明は、野生型及び／又は突然変異ＦＡＴＢタンパク質、ならびに、そのフラグメントをコード化する（単離）核酸配列、及び、アブラナ属種子油組成を修飾するためにこれらの核酸配列を使用する方法を提供する。また、タンパク質自体及びそれらの使用を提供する。
本発明は、さらに、少なくとも３つの（突然変異）ｆａｔＢ対立遺伝子を含み、それ故に、対応する機能的タンパク質をコード化するＦＡＴＢ対立遺伝子を含む種子、植物、及び組織と比較して有意に低減した量の機能的ＦＡＴＢタンパク質を含む、複数個のアブラナ属種子、アブラナ属植物、及び植物の部分に関する。複数個の種子は、修飾された相対量及び／又は組成の飽和脂肪酸を伴う種子油を含む。一局面において、特に、パルミチン酸（Ｃ１６：０）の量は、（少なくとも３つの）突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を欠く（即ち、代わりに野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む）種子に由来する種子油と比較して、有意に低減される。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアブラナ属植物から種子を収集し、種子から油を抽出することにより得ることができる、又は、本発明の複数個のアブラナ属種子からの抽出により得ることができる、修飾された相対量及び／又は組成の飽和脂肪酸を伴う種子油、ならびに、種子油の使用に関する。
本発明のさらなる局面において、ゲノム中の少なくとも３つの異なる遺伝子座（ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３からなる群より選択される少なくとも３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子からの少なくとも３つの異なる遺伝子座）に存在する少なくとも３つのそのような突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含む植物、植物部分、及び種子を生成及び選択するため、及び、植物又は植物部分における突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子と野生型ＦＡＴＢの存在の間を区別するための方法を提供する。このように、ｆａｔＢ対立遺伝子、又は、そのような対立遺伝子を含む植物もしくは植物部分を生成及び／又は同定するため、ならびに、単一の植物における適した数のｆａｔＢ対立遺伝子及び／又は異なる型のｆａｔＢ対立遺伝子を組み合わせ、それにより、この植物の種子油の飽和脂肪酸レベルを有意に低減させるための方法（突然変異誘発及び／又はマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ：ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））を提供する。
破砕したアブラナ属種子からの「低飽和物」又は「無飽和物」種子油を得るために、本発明の植物、複数個の種子、植物部分などを使用するための方法も提供する。本明細書において使用する「植物産物」には、種子、種子食、種子ケーキ、種子脂肪又は油などの植物部分を含む、本発明の植物に由来するいずれもが含まれる。
実施例３の半定量的ＲＴ−ＰＣＲからの結果を示すグラフ。ＦＡＴＢ遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物のバンド強度（Ｙ軸）と同程度のバンド強度を生成したゲノムＤＮＡ量（ｎｇ）として表わされる種子中の各ＦＡＴＢ遺伝子の発現の時期（開花後１１、２１、及び３４日目）（Ｘ軸）及びレベル（１０ng ＲＮＡに基づく）を示す。 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号１３） 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号１５） 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号１７） 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号１９） 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号２１） 春アブラナ（Ｓ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子（イントロンを伴う）の概略図（配列番号２３）図２〜７において、エクソンを灰色ボックスで示し、イントロンをエクソンの間の水平線により示す；実施例において記載する突然変異の位置（実施例において記載するそれらのそれぞれの「ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳｘｘ」名に従って「ＥＭＳｘｘ」と名付ける）を垂直線で示す；配列番号２５及び２８を伴うＦＡＴＢ特異的プローブの長さ及び位置を、ＦＡＴＢ遺伝子の概略図の下の垂直線により示す；ＦＡＴＢ特異的プライマーの位置（それらのそれぞれの配列番号ｘｘに従って「ＩＤ ｘｘ」と名付ける）を矢印により示す；スケールバーはそれぞれのＦＡＴＢ遺伝子の長さを示す。 アブラナ属植物におけるホモ接合状態での無から４つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油中の総飽和脂肪酸（即ち、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸）（脂肪酸の総量に基づく重量パーセント）の間の相関関係を示すグラフ。分析したアブラナ属植物は、３つ又は４つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子、即ち、示したヘテロ接合状態の、表２３において示すＦＡＴＢ−ＡＸ−ＥＭＳＹ又はＦＡＴＢ−ＣＸ−ＥＭＳＹ対立遺伝子を含むアブラナ属植物の子孫植物であった。突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ａＸ−Ｙ」及び「ｃＸ−Ｙ」又は「ａＸ」及び「ｃＸ」と呼ぶ；野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ＡＸ」及び「ＣＸ」と呼ぶ。） アブラナ属植物におけるホモ接合状態での無から４つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油中の総飽和脂肪酸（即ち、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸）（脂肪酸の総量に基づく重量パーセント）の間の相関関係を示すグラフ。分析したアブラナ属植物は、３つ又は４つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子、即ち、示したヘテロ接合状態の、表２３において示すＦＡＴＢ−ＡＸ−ＥＭＳＹ又はＦＡＴＢ−ＣＸ−ＥＭＳＹ対立遺伝子を含むアブラナ属植物の子孫植物であった。突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ａＸ−Ｙ」及び「ｃＸ−Ｙ」又は「ａＸ」及び「ｃＸ」と呼ぶ；野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ＡＸ」及び「ＣＸ」と呼ぶ。）
一般的な定義
「低飽和物」又は「低ｓａｔ」油は、本明細書において、油中の脂肪酸の総重量%に基づき、（平均で）７重量%未満の総飽和脂肪酸を含む種子由来の油を指す。低ｓａｔ種子油の重量%飽和脂肪酸は、６重量%、５重量%、４重量%と等しい、又はそれ未満でありうるが、しかし、３．５重量%（例、３．６重量%）を上回る。
「無飽和物」又は「無ｓａｔ」油は、本明細書において、油中の脂肪酸の総重量%に基づき、（平均で）３．６重量%未満の総飽和脂肪酸を含む種子由来の油を指す。無ｓａｔ種子油の重量%飽和脂肪酸は、３．５重量%、３．０重量%、２．５重量%、２．０重量%、１．５重量%、又は１重量%と等しい、又はそれ未満でありうる。
「作物植物」は、セイヨウアブラナ（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、セイヨウカラシナ（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、アビシニアガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、ブラッシカ・ラパ（同義語、ブラシッカ・カンペストリス）（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラッシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ＣＣ、２ｎ＝１８）、又はクロカラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）（ＢＢ、２ｎ＝１６）など、作物として栽培される植物種を指す。定義には、シロイヌナズナなどの草は包含されない。
「核酸配列」（又は核酸分子）という用語は、一本又は二本鎖の形態のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特に本発明のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコード化するＤＮＡを指す。「内因性核酸配列」は、植物内にある核酸配列、例えば、アブラナ属細胞の核ゲノム内に存在するＦＡＴＢ遺伝子の内因性対立遺伝子を指す。
「遺伝子」という用語は、細胞においてＲＮＡ分子（例、イントロン配列を含むプレｍＲＮＡ、次に成熟ｍＲＮＡにスプライスされる）に転写され、調節領域（例、プロモーター）に機能的に連結された領域（転写される領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。遺伝子は、このように、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び、例えば、転写終結部位を含む３’非翻訳配列など、いくつかの機能的に連結された配列を含みうる。「内因性遺伝子」を使用して、「外来遺伝子」、「トランスジーン」、又は「キメラ遺伝子」から区別し、特定の植物属、種、又は品種の植物からの遺伝子を指し、形質転換によりその植物中に導入されていないが（即ち、それは「トランスジーン」ではないが）、しかし、通常はその属、種、又は品種の植物中に存在し、又は、別の植物属、種、又は品種の植物からのその植物中に導入し、それにおいて、通常の育種技術により、又は、体細胞雑種、例えば、プロトプラスト融合により通常存在する。同様に、遺伝子の「内因性対立遺伝子」は、植物形質転換により植物又は植物組織中に導入せず、しかし、例えば、植物の突然変異誘発及び／又は選択により生成し、又は、植物の天然集団をスクリーニングすることにより得る。
「遺伝子の発現」又は「遺伝子発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに機能的に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡ分子に転写されるプロセスを指す。ＲＮＡ分子は次に細胞内で（転写後プロセスにより）、例えば、ＲＮＡスプライシング及び翻訳開始及びアミノ酸鎖（ポリペプチド）への翻訳、ならびに翻訳終止コドンによる翻訳終結により、さらにプロセッシングされる。「機能的に発現される」という用語は、本明細書において、機能的タンパク質が産生されることを示す；「機能的に発現されない」という用語は、機能性（生物学的活性）が低減した、又は、無いタンパク質が産生されること、又は、タンパク質が産生されないことを示す（以下も参照のこと）。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、特定の作用機序、サイズ、３次元構造、又は由来に言及することなく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。ＦＡＴＢタンパク質の「フラグメント」又は「部分」は、このように、依然として「タンパク質」と呼ばれうる。「単離タンパク質」を使用して、もはやその自然環境中になく、例えば、インビトロ又は組み換え細菌もしくは植物宿主細胞中にあるタンパク質を指す。「酵素」は、機能的ＦＡＴＢタンパク質などの酵素活性を含むタンパク質であり、基質である脂肪酸アシル−ＡＣＰを遊離脂肪酸及びＡＣＰに加水分解できる（ＥＣ＿ｎｕｍｂｅｒ ３．１．２．）。
「標的ペプチド」又は「輸送ペプチド」という用語は、タンパク質が色素体などの細胞内オルガネラを標的とするためのアミノ酸配列を指す。野生型ＦＡＴＢタンパク質はそれらのＮ末端に色素体標的ペプチド（又は色素体輸送ペプチド）を含む。
「成熟タンパク質」又は「成熟ＦＡＴＢタンパク質」は、色素体輸送ペプチドを伴わない機能的ＦＡＴＢ酵素を指す。「前駆体タンパク質」は、その輸送ペプチドを伴う成熟タンパク質を指す。
「ＦＡＴＢ遺伝子」は、本明細書において、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＩＩ型タンパク質（即ち、ＦＡＴＢタンパク質）をコード化する核酸配列を指す。機能的「ＦＡＴＢタンパク質」は脂肪酸−アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有し、即ち、それは脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質、好ましくは飽和脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質（例、パルミトイル−ＡＣＰ；Ｃ１６：０−ＡＣＰ）を遊離脂肪酸（例、Ｃ１６：０）及びＡＣＰに加水分解でき、生物学的アッセイを使用してテストできる。特定のＦＡＴＢ遺伝子／タンパク質の機能及び／又は機能性を決定するために、Salas and Ohlrogge（2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403: 25-34）において記載される細菌発現システム又はMayer and Shanklin（2007, BMC Plant Biology 7(1): 1-11）において記載するチオエステラーゼ活性についての比色スクリーンに基づくアガープレートを、例えば、使用できる。植物又は植物組織における全ＦＡＴＢ活性を決定するために、脂肪酸アシル−ＡＣＰ加水分解についてのアッセイを、例えば、Bonaventure et al.（2003, Plant Cell 15: 1020-1033）及びEccleston and Ohlrogge（1998, Plant Cell 10: 613-622）により記載される通りに、植物抽出物で実施できる。
本明細書において記載される「対立遺伝子」という用語は、特定の遺伝子座の遺伝子の任意の１つ又は複数のオルタナティブな形態を意味する。生物の二倍体（又は複二倍体）細胞において、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の位置又は遺伝子座（複数の遺伝子座）に位置する。１つの対立遺伝子が１対の相同染色体の各染色体上に存在する。
本明細書において記載する「相同染色体」という用語は、同じ生物学的特徴についての情報を含み、同じ遺伝子座の同じ遺伝子、しかし、恐らくはそれらの遺伝子の異なる対立遺伝子を含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂中に対になる染色体である。「非相同染色体」は、生物の全ての生物学的特徴を表し、１組を形成し、細胞における組数は倍数性と呼ばれる。二倍体生物は２組の非相同染色体を含み、各相同染色体は異なる親から遺伝される。複二倍体種において、本質的に２組の二倍体ゲノムが存在し、それにより、２つのゲノムの染色体を相同染色体と呼ぶ（及び同様に、２つのゲノムの遺伝子座又は遺伝子を相同遺伝子座又は遺伝子と呼ぶ）。二倍体、又は複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含みうる。
本明細書において使用する「ヘテロ接合」という用語は、２つの異なる対立遺伝子が特定の遺伝子座にある時存在するが、しかし、細胞において対応する対の相同染色体上に個々に位置付けられる遺伝子の状態を意味する。逆に、本明細書において使用する「ホモ接合」という用語は、２つの同一の対立遺伝子が特定の遺伝子座にある時存在するが、しかし、細胞において対応する対の相同染色体上に個々に位置付けられる遺伝子の状態を意味する。
本明細書において使用する「遺伝子座」（複数の遺伝子座）という用語は、例えば、遺伝子又は遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の場所（ｐｌａｃｅ）もしくは場所（ｐｌａｃｅｓ）又は部位を意味する。例えば、「ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子座」は、ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（及び２つのＦＡＴＢ−Ａ１対立遺伝子）が見出されるＡゲノムの染色体上の位置を指す。
本発明の「植物（ｐｌａｎｔ）」又は「植物（ｐｌａｎｔｓ）」に言及する場合はいつでも、植物部分（細胞、組織又は器官、種子、根、葉、花、花粉などの切断部）、親の識別特性（特に種子油組成）を保持し、自家受粉又は交配により得られる種子など植物の子孫、例えば、雑種種子（２つの近交系親系統を交配することにより得られる）、雑種植物、及びそれに由来する雑種部分も、特記しない場合、本明細書において包含されることが理解される。
「分子アッセイ」（又はテスト）は、１つ又は複数のＦＡＴＢ遺伝子座での（遺伝子座ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及び／又はＦＡＴＢ−Ｃ３の１つ又は複数での）１つ又は複数の特定のＦＡＴＢ対立遺伝子の有無を（直接的又は間接的に）示す。一実施態様において、特定の（野生型又は突然変異）対立遺伝子が任意の個々の植物においてその遺伝子座でホモ接合又はヘテロ接合であるかを決定することを可能にする。
本明細書において使用する「野生型ＦＡＴＢ」（例、野生型ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、又はＦＡＴＢ−Ｃ３）は、アブラナ属植物内で見いだされる天然の対立遺伝子を意味し、機能的ＦＡＴＢタンパク質（例、それぞれ機能的ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、又はＦＡＴＢ−Ｃ３）をコード化する。対照的に、「突然変異ＦＡＴＢ」（例、突然変異ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、又はＦＡＴＢ−Ｃ３）は機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化しないＦＡＴＢ対立遺伝子、即ち、非機能的ＦＡＴＢタンパク質（例、それぞれ非機能的ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、又はＦＡＴＢ−Ｃ３）をコード化する又はＦＡＴＢタンパク質をコード化しないＦＡＴＢ対立遺伝子を指す。そのような「突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子」は野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子であり、その核酸配列中に１つ又は複数の突然変異を含み、それにより、突然変異が好ましくは細胞においてインビボで有意に低減した（絶対的又は相対的）量の機能的ＦＡＴＢタンパク質をもたらす。核酸配列をコード化するＦＡＴＢタンパク質の突然変異対立遺伝子は、本明細書において「ｆａｔＢ」（例、それぞれｆａｔＢ−ａ１、ｆａｔＢ−ａ２、ｆａｔＢ−ａ３、ｆａｔＢ−ｃ１、ｆａｔＢ−ｃ２、又はｆａｔＢ−ｃ３）と命名される。突然変異対立遺伝子は、天然で見いだされる（例、突然変異原のヒト適用なしに自然発生的に産生される）突然変異対立遺伝子である「天然突然変異」対立遺伝子、又は、ヒトの介入により、例えば、突然変異誘発により、誘導される「誘導突然変異」対立遺伝子のいずれかでありうる。
「有意に低減した量の機能的ＦＡＴＢタンパク質」（例、機能的ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及び／又はＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質）は、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含まない細胞により産生される機能的ＦＡＴＢタンパク質の量と比較し、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む細胞により産生される機能的ＦＡＴＢタンパク質の量における少なくとも３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%、又は１００%の低減を指す。この定義は、このように、インビボで生物学的活性を有さない「非機能的」タンパク質（例、切断タンパク質）の産生、機能的タンパク質の絶対量における低減（例、遺伝子中の突然変異に起因して機能的タンパク質が作られない）、及び／又は生物学的活性が低減したタンパク質、即ち、野生型の機能的タンパク質の活性と比較した「機能不全（mal-functional）」タンパク質（オルタナティブｍＲＮＡスプライシングにより産生される切断タンパク質又はタンパク質など）の産生が包含される。同様に、「突然変異ＦＡＴＢタンパク質」という用語は、突然変異核酸配列（「ｆａｔＢ対立遺伝子」）によりコード化されるタンパク質を包含し、突然変異によって、非突然変異の野生型配列（「ＦＡＴＢ対立遺伝子」）によりコード化されるタンパク質の活性と比較して、ＦＡＴＢ酵素活性がインビボで有意に低減する、及び／又は、無くなる。
本明細書において使用する「突然変異誘発」は、植物細胞（例、アブラナ属種子又は花粉などの組織）を、化学物質（エチルメチルスルホネート（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）もしくは電離放射線（中性子（高速中性子突然変異誘発など）、ガンマ線（コバルト６０源により供給されるものなど）、Ｘ線など）、又は前述のものの組み合わせなどの突然変異誘発物質に１又は複数回接触させるプロセスを指す。放射線照射により作製される突然変異は転座又は転位のようなしばしば大きな欠失又は他の全体的な損傷であり、化学突然変異原により作製される突然変異はしばしば点突然変異などのより別個の損傷である。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、塩基の誤対合をもたらす：アルキル化グアニンはチミン塩基と対になり、主にＧ／ＣからＡ／Ｔへの転移をもたらす。突然変異誘発後、アブラナ属植物を、公知の技術を使用して処置細胞から再生する。例えば、結果として得られるアブラナ属種子を従来の生育手順に従って植えてよく、自家受粉後、種子が植物で形成される。あるいは、倍加半数体の小植物を抽出し、迅速にホモ接合植物を形成できる。現在又は次の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収集し、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在についてスクリーニングできる。特定の突然変異対立遺伝子についてスクリーニングするためにいくつかの技術が公知であり、例えば、Deleteagene（商標）（Delete-a-gene； Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242）では高速中性子突然変異誘発により生成した欠失突然変異についてスクリーニングするためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用し、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的誘発局所損傷；McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18: 455-457）によってＥＭＳ誘発点突然変異などが同定される。特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在についてスクリーニングするための追加技術を以下の実施例において記載する。
遺伝子又はタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書において、別の種において見出される相同遺伝子又はタンパク質を指し、遺伝子又はタンパク質と同じ機能を有するが、しかし、（通常）、遺伝子を保有する種が分岐した（即ち、遺伝子が種分化により共通の祖先から進化した）時点から、配列において分岐する。セイヨウアブラナＦＡＴＢ遺伝子のオルソログは、このように、配列比較（例、全配列にわたる、又は、特定のドメインにわたるパーセント配列同一性に基づく）及び／又は機能解析の両方に基づき、他の植物種（例、セイヨウカラシナなど）において同定できる。
「品種」は本明細書においてＵＰＯＶ条約に準拠して使用され、公知の最低ランクの単一植物分類群内での植物のグループ化を指し、グループ化は所与の表現型又は遺伝子型の組み合わせに起因する特性の発現により定義でき、前記特性の少なくとも１つの発現により任意の他の植物グループ化から区別でき、不変に（安定的に）繁殖するためのその適性に関して単位として見なされる。
「含む」という用語は、記載した部分、工程、又は成分の存在を特定することとして解釈すべきであるが、しかし、１つ又は複数の追加の部分、工程、又は成分の存在を除外しない。特定の形質を含む植物は、このように、追加の形質を含みうる。
単数形の単語（例、植物又は根）に言及する場合、複数形も本明細書において含まれる（例、複数個の植物、複数個の根）ことが理解される。このように、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈が１つ及び唯一の要素であることを明確に必要としない場合、１を超える要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、このように、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
本発明の目的のために、２つの関連するヌクレオチド又はアミノ酸配列の「配列同一性」は、パーセントで表し、比較する位置の数により割る、同一の残基（×１００）を有する最適に整列した２つの配列における位置の数を指す。ギャップ、即ち、残基が一方の配列において存在するが、しかし、他方においては存在しない場合のアラインメントにおける位置は、非同一残基を伴う位置と見なされる。２つの配列の「最適なアラインメント」が、The European Molecular Biology Open Software Suite（EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277；例、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）において、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドについて）／１０（タンパク質について）及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドについて）／０．５（タンパク質について））を使用して、Needleman and Wunschのグローバル・アラインメント・アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3): 443-53）に従って、全長にわたり２つの配列を整列することにより見出される。ヌクレオチドについて、使用するデフォルト・スコアリング・マトリックス（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）はＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質について、デフォルト・スコアリング・マトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
本明細書において使用する「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」は、上に定義する通りに最適に整列させた場合、特定の最小パーセントの配列同一性（以下にさらに定義する）を共有する配列を指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を使用して、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定できる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、定めたイオン強度及びｐＨで特的の配列について熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０%が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（定められたイオン強度及びｐＨ下での）温度である。典型的には、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モル、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件を選択する。塩濃度を低下させ、及び／又は、温度を増大させることによりストリンジェンシーを増大させる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、６３℃の０．２×ＳＳＣで２０分間での少なくとも１回の洗浄を含む条件、又は相当する条件である。
「高ストリンジェンシーな条件」を、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０M ＮａＣｌ、０．３M ＮａＣｌ−クエン酸、ｐＨ ７．０を含む）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００× Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは２% Ｆｉｃｏｌｌ、２%ポリビニル・ピロリドン、２%ウシ血清アルブミンを含む）、０．５%ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び非特異的競争者として２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）を含む水溶液中での６５℃でのハイブリダイゼーションにより提供できる。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシーな洗浄をいくつかの工程において行うことができ、ハイブリダイゼーション温度での０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中での最終洗浄（約３０分）を伴う。
「中程度のストリンジェンシーな条件」は、上記の溶液中で、しかし、約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。中程度のストリンジェンシーな洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション温度で行うことができる。
「低ストリンジェンシー」は、約５０〜５２℃での上記の溶液中でのハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。低ストリンジェンシーな洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション温度で行うことができる。Sambrook et al. (1989) 及び Sambrook and Russell (2001) も参照のこと。
詳細な説明
本発明者らにより、本質的に、二倍体祖先からのその由来に起因する本質的に２つの二倍体ゲノム（Ａ及びＣゲノム）を含む異質四倍体（複二倍体）の種であるセイヨウアブラナ（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）が、そのゲノム中に合計６つのＦＡＴＢ遺伝子座及びＦＡＴＢ遺伝子を、Ａゲノム上に３つの遺伝子（本明細書において「ＦＡＴＢ−Ａ１」、「ＦＡＴＢ−Ａ２」、及び「ＦＡＴＢ−Ａ３」と呼ぶ）及びＣゲノム上に３つの遺伝子（本明細書において「ＦＡＴＢ−Ｃ１」、「ＦＡＴＢ−Ｃ２」、及び「ＦＡＴＢ−Ｃ３」と呼ぶ）を含むことが見出された。ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子はＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子と「相同」であると言われ、ＦＡＴＢ−Ａ２はＦＡＴＢ−Ｃ２と相同であり、ＦＡＴＢ−Ａ３はＦＡＴＢ−Ｃ３と相同である、即ち、「Ａ遺伝子」はＡゲノム上に見出され、二倍体祖先ブラッシカ・ラパ（ＡＡ）に由来し、「Ｃ遺伝子」はセイヨウアブラナのＣゲノム上に見出され、二倍体祖先ブラッシカ・オレラケア（ＣＣ）に由来する。
任意の二倍体ゲノムにおいてと同様に、２つの「対立遺伝子」がゲノム中の各ＦＡＴＢ遺伝子座に各ＦＡＴＢ遺伝子について存在しうる（１つの対立遺伝子が１つの染色体上に、他方が相同染色体上に見出される遺伝子配列である）。これらの２つの対立遺伝子のヌクレオチド配列は、任意の所与の植物において同一（ホモ接合）又は異なる（ヘテロ接合）でありうるが、各ＦＡＴＢ遺伝子について存在する異なる可能な対立遺伝子の数は、種全体において２よりずっと大きくなりうる。
これらの６つのＦＡＴＢ遺伝子のわずか１つ又は２つにおいて、突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子の野生型等価物によりコード化される機能的ＦＡＴＢタンパク質の量において有意な低減を起こす突然変異を含む植物が、植物の種子油中の飽和脂肪酸のパーセント（重量%）を有意に低減するために十分ではないことがさらに見出された。（ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される）３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子が、低又は無飽和種子油を産生する植物を得るために、植物中に含まれる必要があると考えられる。
このように、本発明の一実施態様において、３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含む植物を本明細書において提供し、それにより、突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子がこれらの突然変異対立遺伝子の野生型等価物によりコード化される型の機能的ＦＡＴＢタンパク質の量を有意に低減させ、ひいては、植物細胞において、具体的には発生中の種子において、インビボで産生される機能的ＦＡＴＢタンパク質の量を全体的に有意に低減させる。
十分なコピーの特定のｆａｔＢ対立遺伝子を十分なコピーの特定の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子と１つの植物において組み合わせることにより、作られる機能的なＦＡＴＢタンパク質の量及び／又は型を微調整することが可能になり、次に、色素体からの遊離飽和脂肪酸（の量及び／又は型）の排出、ひいては、産生される種子油の脂肪酸組成に影響を及ぼす。絶対量及び相対量の６つのＦＡＴＢタンパク質の各々は、このように、植物の生育及び発生のために十分なＦＡＴＢタンパク質を産生する植物を提供するように調整でき、所望の量及び／型の脂肪酸がこれらの植物の種子油中に作られ、保存される。このように、本発明の一実施態様において、ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択され、十分に機能的なＦＡＴＢタンパク質をコード化する、少なくとも１つの機能的に発現されたＦＡＴＢ対立遺伝子を含み、残りの対立遺伝子が突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子でありうる、植物及び植物部分を提供する。
このように、本発明の一局面において、（６つのＦＡＴＢ遺伝子の）ｎテュープル（ｎ−ｔｕｐｌｅ）突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含む植物又は植物部分を提供し、それにより、ｎ≦１２、好ましくはｎ≦１１（例、ｎ＝１０、９、又は８）、少なくとも１つの対立遺伝子が機能的ＦＡＴＢタンパク質を産生する。
本発明のさらなる局面において、ホモ接合ＦＡＴＢ三重突然変異−（ｎ＝６、即ち、６つのＦＡＴＢ遺伝子から選択される３つの遺伝子の突然変異対立遺伝子についてホモ接合）、ホモ接合ＦＡＴＢ四重突然変異−（ｎ＝８）、及び／又はホモ接合ＦＡＴＢ五重突然変異−（ｎ＝１０）植物又は植物部分を提供し、それにより、突然変異対立遺伝子は、遺伝子ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される。
このように、本発明の一実施態様において、ホモ接合ＦＡＴＢ三重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
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本発明の別の実施態様において、ホモ接合ＦＡＴＢ四重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
本発明のさらに別の実施態様において、ホモ接合ＦＡＴＢ五重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
本発明のさらなる局面において、ホモ接合ＦＡＴＢ三重（ｎ＝６）、四重（ｎ＝８）、及び／又は五重（ｎ＝１０）突然変異植物又は植物部分は、さらなる突然変異対立遺伝子を含み、突然変異植物又は植物部分は追加の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（即ち、それぞれｎ＝７、ｎ＝９、及びｎ＝１１）についてヘテロ接合であり、突然変異対立遺伝子は残りの野生型ＦＡＴＢ遺伝子（即ち、ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢＡ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、又はＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子）から選択される。
このように、本発明のさらなる実施態様において、１つのさらなる突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むホモ接合ＦＡＴＢ三重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
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本発明のさらに別の実施態様において、１つのさらなる突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むホモ接合ＦＡＴＢ四重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
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本発明のさらなる実施態様において、１つのさらなる突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むホモ接合ＦＡＴＢ五重突然変異植物を本明細書において提供し、植物の遺伝子型を以下のように記載できる：
Figure 0005677839
アブラナ属種からの野生型及び突然変異のＦＡＴＢ遺伝子／対立遺伝子の核酸配列、ならびに野生型及び突然変異のＦＡＴＢタンパク質を本明細書においてさらに提供する。
アブラナ属植物、ならびにそのゲノム中に野生型及び突然変異のＦＡＴＢ対立遺伝子の特定の組み合わせを含むアブラナ属植物及び植物部分において突然変異及び野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子を生成及び組み合わせる方法も提供し、それにより、これらの植物は低飽和物又は無飽和物を伴う種子油を産生し、それにより、植物は好ましくは正常に生育し、正常な表現型を有する。突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を他の植物に移入するためのこれらの植物の使用も本発明の実施態様であり、記載する植物のいずれかの植物産物と同様である。また、ＦＡＴＢ遺伝子及び／又は対立遺伝子を組み合わせる、又は、検出するためのマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ：ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のためのキット及び方法を提供する。本発明の実施態様の各々を本明細書において以下に詳細に記載する。
本明細書の核酸配列
機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化する野生型（ＦＡＴＢ）核酸配列、及びアブラナ属種からの、特にセイヨウアブラナから、しかし、またアブラナ属作物種からのＦＡＴＢ遺伝子の（１つ又は複数の突然変異、好ましくはコード化されるＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性を有意に低減する、又は、産生されるＦＡＴＢタンパク質がなくなる）突然変異（ｆａｔＢ）核酸配列の両方を提供する。例えば、Ａ及び／又はＣゲノムを含むアブラナ属種は、本発明の単一の植物において同定でき、組み合わせることができるＦＡＴＢ−Ａ又はＦＡＴＢ−Ｃ遺伝子の異なる対立遺伝子を含むことができる。また、突然変異誘発方法を使用して、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子において突然変異を生成し、それにより、本発明の使用ための突然変異対立遺伝子を生成する。特定のＦＡＴＢ対立遺伝子は、好ましくは、交配及び選択によりセイヨウアブラナ植物において組み合わせ、一実施態様において、ＦＡＴＢ及び／又はｆａｔＢ核酸配列を、セイヨウアブラナと交配でき、又は、「合成」セイヨウアブラナ植物を作るために使用できるアブラナ属植物内で（即ち、内因性に）提供する。異なるアブラナ属種の間でのハイブリダイゼーションが当技術分野において記載され、例えば、Snowdon（2007, Chromosome research 15: 85-95）において参照される。種間ハイブリダイゼーションは、例えば、セイヨウアブラナ（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからアビシニアガラシ（ＢＢＣＣ）中のＣゲノムへ、又はさらに、例えば、セイヨウアブラナ（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからセイヨウカラシナ（ＡＡＢＢ）中のＢゲノムへ、（それらのＣ及びＢゲノムの間の非正統的組換えの散発性の事象により）遺伝子を移入するために、例えば、使用できる。「再合成」又は「合成」セイヨウアブラナ系統を、元の祖先であるブラッシカ・オレラケア（ＣＣ）とブラッシカ・ラパ（ＡＡ）とを交配することにより産生できる。種間、及びまた属間の不適合性バリアーは、アブラナ属作物種とそれらの関連種の間の交配において、例えば、胚救出技術又はプロトプラスト融合（例、上のSnowdonを参照のこと）により、上手く克服できる。
しかし、単離ＦＡＴＢ及びｆａｔＢ核酸配列（例、クローニングにより植物から単離した、又は、ＤＮＡ合成により合成的に作った）、ならびに、その変異体及びこれらのいずれかのフラグメントも本明細書において提供し、なぜなら、これらは、いずれの配列が植物又は植物部分において内因性に存在するのか、配列が機能的タンパク質又は機能性が有意に低減した、もしくは、機能が無いタンパク質をコード化するのか否かを（例、組み換え宿主細胞中での発現により、及び、酵素アッセイにより）決定するために、及び、１つのアブラナ属植物から別のアブラナ属植物への特定の対立遺伝子の選択及び移入のために使用でき、機能的及び突然変異対立遺伝子の所望の組み合わせを有する植物を生成する。
ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３の核酸配列がセイヨウアブラナ冬アブラナ（ＷＯＳＲ）及び春アブラナ（ＳＯＳＲ）から単離されている。配列表において描写した通りである。野生型ＦＡＴＢ配列を描写し、これらの配列、及びこれらと本質的に類似の配列の突然変異ｆａｔＢ配列が、野生型ＦＡＴＢ配列を参照して、本明細書において以下に、及び、実施例において記載する。ゲノムＦＡＴＢタンパク質コード化ＤＮＡ、及び対応するプレｍＲＮＡは、４つのイントロン（５’末端から開始してイントロン１〜４と番号付ける）により中断される５つのエクソン（５’末端から開始してエクソン１〜５と番号付ける）を含む。ｃＤＮＡ及び対応するプロセッシングされたｍＲＮＡ（即ち、スプライスされたＲＮＡ）において、配列表において描写する通りに、イントロンを除去し、エクソンを連結する。エクソン配列は進化的により保存されており、従って、イントロン配列よりも可変性は低い。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ１核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ１変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１４（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１３（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ２核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ２変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号４（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１６（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号３（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１５（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ３核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ３変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号６（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１８（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号５（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１７（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ１核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ１変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号８（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２０（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号７（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１９（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ２核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ２変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１０（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２２（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号９（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２１（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ３核酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ３変異体核酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１２（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２４（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列、又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１１（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、及び／又は、イントロン１〜４を伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２３（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
このように、本発明は、変異体及びそのフラグメント（以下でさらに定義する）を含む、野生型の機能的ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質をコード化する核酸配列、ならびに、これらのいずれかの突然変異核酸配列の両方を提供し、それにより、核酸配列における突然変異が、好ましくは、野生型タンパク質と比較し、挿入、欠失、又は置換された１つ又は複数のアミノ酸がもたらされる。好ましくは、核酸配列中の突然変異は１つ又は複数のアミノ酸の変化をもたらし（即ち、野生型アミノ酸配列との関連で、１つ又は複数のアミノ酸が挿入、欠失、及び／又は置換される）、それにより、ＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性が有意に低減される。突然変異ＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性における有意な低減は、野生型タンパク質の活性と比較し、少なくとも３０%、少なくとも４０%、５０%又はそれ以上、少なくとも９０%又は１００%（生物学的活性なし）の酵素活性における（即ち、アシルＡＣＰ−チオエステラーゼ活性における）低減を指す。
内因性の核酸配列及び単離された核酸配列の両方を本明細書において提供する。プライマー又はプローブとしての使用のために、及び、本発明の別の局面のキットの構成要素として、上に定義するＦＡＴＢ配列及びＦＡＴＢ変異体核酸配列のフラグメントも提供する。ＦＡＴＢ又はｆａｔＢ核酸配列もしくはその変異体（定義する）の「フラグメント」は、ＦＡＴＢ又はｆａｔＢ配列の（又は変異体配列の）少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、１０００の連続ヌクレオチドなどの様々な長さでありうる。
機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化する核酸配列
配列表において描写する核酸配列は、セイヨウアブラナからの野生型の機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化する。このように、これらの配列は、それらが単離されたＷＯＳＲ及びＳＯＳＲ植物に内因性である。他のアブラナ属作物の種、品種、育種系統、又は野生系統種を、同じＦＡＴＢタンパク質又はその変異体をコード化する、他のＦＡＴＢ対立遺伝子についてスクリーニングできる。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用したサザンブロット）又はＰＣＲベースの技術を使用して、様々なセイヨウアブラナの品種、系統、又は系統種などの他のアブラナ属植物に内因性であるＦＡＴＢ対立遺伝子を同定し、しかし、また、セイヨウカラシナ（特にＡゲノム上のＦＡＴＢ対立遺伝子）、アビシニアガラシ（特にＣゲノム上のＦＡＴＢ対立遺伝子）ならびにブラッシカ・ラパ（Ａゲノム）及びブラッシカ・オレラケア（Ｃゲノム）植物及び組織を、他の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子についてスクリーニングできる。そのような植物又は植物組織をＦＡＴＢ対立遺伝子の存在についてスクリーニングするために、配列表において提供するＦＡＴＢ核酸配列、又はこれらのいずれかの変異体もしくはフラグメントを使用できる。例えば、全配列又はフラグメントをプローブ又はプライマーとして使用できる。例えば、特異的又は縮重プライマーを使用して、植物又は植物組織のゲノムＤＮＡからＦＡＴＢタンパク質をコード化する核酸配列を増幅できる。これらのＦＡＴＢ核酸配列を単離し、標準的な分子生物学的技術を使用してシークエンシングできる。バイオインフォマティクス分析を次に使用して、対立遺伝子を特性付けし、例えば、配列がいずれのＦＡＴＢ対立遺伝子に対応するのか、いずれのＦＡＴＢタンパク質又はタンパク質変異体が配列によりコード化されるのかを決定できる。
機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化する核酸配列を、当技術分野において公知の組み換えＤＮＡ技術、例えば、宿主細胞（例、大腸菌などの細菌）において核酸分子を発現させ、結果として得られるタンパク質又は細胞のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性及び／又は基質特異性を分析することにより、分析できる。例えば、大腸菌における組み換え発現後の脂肪酸アシル−ＡＣＰ加水分解が、Doermann et al.（2000, Plant Physiology 123: 637-643）及びDoermann et al.（1995, Arch Biochem Biophys 316: 612-618）により、Yuan et al.（1995, PNAS Vol 92: 10639-10643）により、Salas and Ohlrogge（2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403: 25-34）により、及びMayer and Shanklin（2007, BMC Plant Biology 7(1): 1-11）により記載される。また、粗植物組織ホモジネートを使用した脂肪酸アシル−ＡＣＰ加水分化についてのアッセイが、Eccleston and Ohlrogge（Ｃ１２：０−及びＣ１８：１−ＡＣＰ加水分解について；1998, Plant Cell 10: 613-622）により、Salas and Ohlrogge（2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403: 25-34）により、及びBonaventure et al.（Ｃ１６：０−ＡＣＰ及びＣ１８：１−ＡＣＰ加水分解について；2003, Plant Cell 15: 1020-1033）により記載されている。
また、ＦＡＴＢ核酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）は、本質的に類似の配列について核酸データベースをスクリーニングすることにより、コンピュータ内で同定されうることが理解される。同様に、核酸配列を化学的に合成できる。本発明の核酸分子のフラグメントも提供し、以下でさらに記載する。フラグメントとして、成熟タンパク質のみをコード化する核酸配列、又はエクソン及び／又はイントロン配列の全て又は部分を含むより小さなフラグメントなどが挙げられる。
突然変異ＦＡＴＢタンパク質をコード化する核酸配列
野生型核酸配列と比べて１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換を含む核酸配列は、本発明の別の実施態様であり、そのような突然変異核酸分子のフラグメントも同様である。そのような突然変異核酸配列（ｆａｔＢ配列と呼ぶ）は、以下にさらに記載する、様々な公知の方法を使用して生成及び／又は同定できる。この場合も、そのような核酸分子は、内因性の形態及び単離の形態の両方で提供する。一実施態様において、突然変異は、コード化されるＦＡＴＢタンパク質のアミノ酸配列において１つ又は複数の変化（欠失、挿入、及び／又は置換）をもたらす（即ち、それは「サイレント突然変異」ではない）。別の実施態様において、核酸配列中の突然変異は、野生型タンパク質と比べ、コード化されるＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性を有意に低減する、又は、完全に消失する。
核酸分子は、このように、以下のような１つ又は複数の突然変異を含みうる：
（ａ）アミノ酸の別のアミノ酸についての置換をもたらす核酸配列における変化である「ミスセンス突然変異」；
（ｂ）成熟前の終止コドンの導入、ひいては、翻訳の終結（切断タンパク質をもたらす）をもたらす核酸配列における変化である「ノンセンス突然変異」又は「終止コドン突然変異」；植物遺伝子は翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡ中のＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡ中のＵＡＡ）、及び「ＴＡＧ」（ＲＮＡ中のＵＡＧ）を含む；このように、（リーディングフレーム中で）翻訳される成熟ｍＲＮＡ中にあるべきこれらのコドンの１つをもたらす任意のヌクレオチド置換、挿入、欠失によって翻訳が終結する；
（ｃ）核酸のコード配列において加えた１つ又は複数のコドンに起因する、１つ又は複数のアミノ酸の「挿入突然変異」；
（ｄ）核酸のコード配列において欠失させた１つ又は複数のコドンに起因する、１つ又は複数のアミノ酸の「欠失突然変異」；
（ｅ）突然変異の下流の異なるフレームにおいて翻訳される核酸をもたらす、「フレームシフト突然変異」。フレームシフト突然変異は、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、又は重複などの様々な原因を有しうるが、しかし、プレｍＲＮＡスプライシング（スプライス部位突然変異）に影響を及ぼす突然変異もフレームシフトをもたらしうる；
（ｆ）野生型とは異なるアミノ酸配列のタンパク質をもたらす、プレｍＲＮＡ配列の正確なスプライシングを変化又は消失させる、「スプライス部位突然変異」。例えば、１つ又は複数のエクソンがＲＮＡスプライシング中にスキップされ、スキップされたエクソンによりコード化されるアミノ酸を欠くタンパク質をもたらす。あるいは、リーディングフレームは、不正確なスプライシングを通じて変化されうる、又は、１つ又は複数のイントロンが保持されうる、又は、選択的スプライシングのドナー又はアクセプターが生成されうる、又は、スプライシングが代替位置（例、イントロン内）で開始されうる、又は、代替ポリアデニル化シグナルが生成されうる。正確なプレｍＲＮＡスプライシングは複雑なプロセスであり、ＦＡＴＢをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列における様々な突然変異により影響を受けうる。植物などの高等真核生物において、主なスプライソソームは、５’スプライス部位（ドナー部位）のＧＵ及び３’スプライス部位（アクセプター部位）のＡＧを含むイントロンをスプライシングする。このＧＵ−ＡＧルール（又はＧＴ−ＡＧルール；Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp885-920, ISBN 0198577788を参照のこと）は、核内の真核生物遺伝子のスプライス部位の約９９%において従われ、５’及び３’スプライス部位にＧＣ−ＡＧ及びＡＵ−ＡＣなどの他のジヌクレオチドを含むイントロンがそれぞれわずか約１%及び０．１%を占める。
既に言及した通り、核酸配列における突然変異は、好ましくは、インビボで酵素活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらすことが望まれる。基本的に、野生型タンパク質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、酵素活性を有意に低減する、又は、無くならせうる。しかし、触媒ドメインなどの機能的ドメインの有意な部分が欠ける切断タンパク質をもたらす突然変異などのタンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＦＡＴＢタンパク質の機能を低減させる可能性が高いことが理解される。
本明細書において記載するアブラナ属のＦＡＴＢタンパク質は、約４１２〜４２４アミノ酸の長さであり、多くの構造的（及び機能的）ドメインを含む。これらには以下が含まれる：約６０のアミノ酸、それに続く約１８のアミノ酸の疎水性領域のＮ末端色素体標的ペプチド（ヘリカル膜貫通アンカーを形成すると提案されている）。全体で大まかに約９０のアミノ酸のＮ末端部分には、成熟ＦＡＴＢタンパク質（Ｎ末端アミノ酸ＬＰＤＷＳＭで開始する）を構成するものが続く。それは、リンカー領域により分離されたヘリックス／４本鎖シートドメイン（「ＨＥＥＥＥ」又は「４ＨＢＴ」ドメイン、また「ホットドッグモチーフ（ｈｏｔ ｄｏｇ ｍｏｔｉｆ）」）のタンデムリピートを含む(Mayer and Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627)。第１の（Ｎ末端）ヘリックス／４本鎖シートドメイン（エクソン１の部分、エクソン２及び３の全体、ならびにエクソン４の部分によりコード化される）は、基質特異性に影響を及ぼすと考えられるアミノ酸残基、特に２つの保存メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、保存リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、保存バリン（Ｖａｌ又はＶ）、及び保存セリン（Ｓｅｒ又はＳ）を含み（Mayer and Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1): 1-11）、第２の（Ｃ末端）ヘリックス／４本鎖シートドメイン（エクソン５により大部分がコード化される）は、触媒アミノ酸残基、特に保存アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、保存ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基、及び保存システイン（Ｃｙｓ又はＣ）のパパイン様触媒三連構造を含む。触媒三連構造は、タンパク質のエクソン５によりコード化される、第２のヘリックス／４本鎖シートドメイン内に位置する。第２のＨＥＥＥＥドメインは、基質特異性、特に保存トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）に影響を及ぼすと考えられるさらなるアミノ酸残基を含む（Mayer and Shanklin, 2007、上記）。
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このように、一実施態様において、上記の突然変異の型のいずれか１つ又は複数を含む核酸配列を提供する。別の実施態様において、１つ又は複数の欠失突然変異、１つ又は複数の終止コドン（ナンセンス）突然変異、及び／又は１つ又は複数のスプライス部位突然変異を含むｆａｔＢ配列を提供する。上の突然変異核酸配列のいずれかをそれ自体で（単離の形態で）提供し、そのような配列を内因的に含む植物及び植物部分も同様である。
本発明において使用するＦＡＴＢ対立遺伝子における欠失突然変異は、ＦＡＴＢ対立遺伝子における突然変異であり、それにより、少なくとも１つ、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれ以上の塩基が、対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子から欠失しており、ここで、欠失は、インビボで活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質に転写及び翻訳される突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子をもたらす。欠失はフレームシフトを招きうる、及び／又は、それは中途終止コドンを導入しうる、又は、コード配列の１つのアミノ酸もしくは複数のアミノ酸（例、大部分）の除去、などを招きうる。欠失が、有意に低減した生物学的活性を有する突然変異タンパク質をもたらす、厳密な基礎となる分子基盤は、重要ではない。特定のＦＡＴＢ対立遺伝子が完全に欠失した植物及び植物部分、即ち、１つ又は複数のＦＡＴＢ対立遺伝子を欠く植物及び植物部分も本明細書において提供する。
本明細書において使用するＦＡＴＢ対立遺伝子におけるナンセンス突然変異は、ＦＡＴＢ対立遺伝子における突然変異であり、ここで、１つ又は複数の翻訳終止コドンがコードＤＮＡ及び対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の対応するｍＲＮＡ配列中に導入される。翻訳終止コドンはＴＧＡ（ｍＲＮＡ中のＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、及びＴＡＧ（ＶＡＧ）である。このように、コード配列（エクソン配列）中にインフレームの終止コドンの生成をもたらす任意の突然変異（欠失、挿入、又は置換）は、翻訳の終結及びアミノ酸鎖の切断をもたらす。一実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、ＦＡＴＢ対立遺伝子であり、インフレーム終止コドンが、ＣＡＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＧＡ、又はＣＧＡからＴＧＡの突然変異などの単一ヌクレオチド置換によりＦＡＴＢコドン配列中に導入される。別の実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、ＦＡＴＢ対立遺伝子であり、インフレーム終止コドンが、ＣＡＧからＴＡＡ、ＴＧＧからＴＡＡ、ＣＧＧからＴＡＧ又はＴＧＡ、ＣＧＡからＴＡＡの突然変異などの二重ヌクレオチド置換によりＦＡＴＢコドン配列中に導入される。さらに別の実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、ＦＡＴＢ対立遺伝子であり、インフレーム終止コドンが、ＣＧＧからＴＡＡの突然変異などの三重ヌクレオチド置換によりＦＡＴＢコドン配列中に導入される。切断タンパク質は、突然変異の下流のコードＤＮＡによりコード化されるアミノ酸（即ち、ＦＡＴＢタンパク質のＣ末端部分）を欠き、突然変異の上流のコードＤＮＡによりコード化されるアミノ酸（即ち、ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分）を保持する。一実施態様において、ナンセンス突然変異は、触媒三連構造の保存Ｃｙｓ残基の前のどこかに存在し、少なくとも保存Ｃｙｓ残基を欠き、切断タンパク質の有意に低減した活性をもたらす。突然変異タンパク質が野生型タンパク質と比較して切断が多くなるほど、それは酵素活性を欠く可能性がより高くなる。このように、別の実施態様において、３５０未満のアミノ酸（保存Ｃｙｓを欠く）、３１５未満のアミノ酸（パパイン様触媒三連構造からの全て３つの保存アミノ酸を欠く）、３００未満のアミノ酸（第２の４ＨＢＴドメインを欠く）、２６２未満のアミノ酸（保存Ｓｅｒを欠く）、２２９未満のアミノ酸（第２の保存Ｍｅｔを欠く）、１９８未満のアミノ酸（保存Ｖａｌを欠く）、１７４未満のアミノ酸（保存Ｌｙｓを欠く）、１６２未満のアミノ酸（第１の保存Ｍｅｔを欠く）、又はさらに少ない長さのアミノ酸の切断タンパク質をもたらすナンセンス突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を提供する。さらに別の実施態様において、ナンセンス突然変異は、エクソン５、エクソン４及び５、エクソン３〜５、又はさらに多く、などのタンパク質に翻訳されない１つ又は複数のエクソンをもたらす。
本明細書において以下の表に、本明細書において提供するセイヨウアブラナ配列における起こりうるナンセンス突然変異の範囲を記載する。
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明らかに、突然変異は上の表において示すものに限定されず、類似の終止突然変異が配列表において描写し、上の表において参照されるもの以外のｆａｔＢ対立遺伝子において存在しうることが理解される。
本明細書において使用するＦＡＴＢ対立遺伝子におけるスプライス部位突然変異は、ＦＡＴＢ対立遺伝子における突然変異であり、ここで、対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子における突然変異が、プレｍＲＮＡの異常スプライシングをもたらし、活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらす。突然変異は、コンセンサススプライス部位配列中でありうる。例えば、以下の表はコンセンサス配列を記載し、−突然変異が起こった場合−正確なスプライシングに影響を及ぼす可能性が高い。ＧＴ−ＡＧスプライス部位は、通常、イントロンの（エクソン中の）５’末端上の２つの高度に保存されたヌクレオチドなどの他の保存ヌクレオチドを有し、しばしば５’−ＡＧ−３’である。ＧＴジヌクレオチドの３’側に（このように、イントロンにおいて）、テトラヌクレオチド５’−ＡＡＧＴ−３’について高度の保存を見出すことができる。これは、８ヌクレオチドがドナー部位で高度に保存されているとして同定できることを意味する。
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＾スプライス部位を描写する；Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ（しかし、しばしばＧ）；ｎ＝複数のヌクレオチド；太字＝イントロン配列中のコンセンサスジヌクレオチド。Ｐｕ＝プリン塩基；Ｐｙ＝ピリミジン塩基。
スプライス部位及びコンセンサス配列が当技術分野において記載され、NetPLAntgene、BDGP又はGenio、est2genome、FgeneSHなどのエクソン及びスプライス部位配列を同定するためのコンピュータプログラムを利用可能である。ゲノム配列又はプレｍＲＮＡ配列と翻訳されたタンパク質との比較を使用して、スプライス部位及び異常スプライシングを決定又は検証できる。
プレｍＲＮＡスプライシングを変化させ、それにより生物学的活性が有意に低減したタンパク質をもたらす任意の突然変異（１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換）が、本明細書において包含される。一実施態様において、スプライス部位突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、スプライシングの変化が、ＦＡＴＢ転写ＤＮＡ領域において、上の太字で描写されるコンセンサスジヌクレオチドの１つ又は複数のヌクレオチド置換の導入により起こる、ＦＡＴＢ対立遺伝子である。例えば、＾ＧＵは、例えば、ドナースプライス部位において＾ＡＵに突然変異しうる、及び／又は、ＡＧ＾はアクセプタースプライス部位配列においてＡＡ＾に突然変異しうる。別の実施態様において、スプライス部位突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、スプライシングの変化が、ＦＡＴＢ転写ＤＮＡ領域において、エクソン配列における保存ヌクレオチド中の１つ又は複数のヌクレオチド置換の導入により起こる、ＦＡＴＢ対立遺伝子である。以下の表は、ＦＡＴＢ遺伝子において、特にカノニカルイントロン（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｉｎｔｒｏｎ）の保存ジヌクレオチド及びエクソン中のこれらのジヌクレオチドに直接隣接するヌクレオチドにおいて、起こりうるスプライス部位突然変異を示す（シンボル「［」及び「］」は、エクソン−イントロン及びイントロン−エクソンの境界ならびにスプライス部位を示す；下線を引いたヌクレオチドは突然変異している）。
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本発明のアミノ酸配列
アブラナ属種、特にセイヨウアブラナ、しかし、また、他のアブラナ属作物種からの野生型（機能的）ＦＡＴＢアミノ酸配列及び突然変異ＦＡＴＢアミノ酸配列（１つ又は複数の突然変異、好ましくはＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性を有意に低減する、又は、無にする突然変異を含む）の両方を提供する。例えば、Ａ及び／又はＣゲノムを含むアブラナ属種は、異なるＦＡＴＢ−Ａ又はＦＡＴＢ−Ｃアミノ酸をコード化しうる。また、突然変異誘発方法を使用して、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子において突然変異を生成でき、それにより、さらなる突然変異ＦＡＴＢタンパク質をコード化できる突然変異対立遺伝子を生成する。一実施態様において、野生型及び／又は突然変異ＦＡＴＢアミノ酸配列を、アブラナ属植物内において（即ち、内因的に）提供する。しかし、（例、植物から単離した、又は、合成的に作った）単離ＦＡＴＢアミノ酸配列、ならびに、その変異体及びこれらのいずれかのフラグメントも本明細書において提供する。
ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質のアミノ酸配列が、セイヨウアブラナ冬アブラナ（ＷＯＳＲ）及び春アブラナ（ＳＯＳＲ）から単離されており、配列表に描写する通りである。野生型ＦＡＴＢ配列を描写し、これらの配列、及びこれらと本質的に類似する配列の突然変異ＦＡＴＢ配列を、野生型ＦＡＴＢ配列を参照して、本明細書において以下に記載する。
上記の通り、本明細書において記載するアブラナ属のＦＡＴＢタンパク質は約４１２〜４２４アミノ酸長であり、多くの構造的ドメイン及び機能的ドメインを含む。ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分の配列は、成熟ＦＡＴＢタンパク質の配列よりも進化的な保存が低い。成熟ＦＡＴＢタンパク質の配列は、従って、前駆体タンパク質の配列よりも可変性が低い。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ１アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１４（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ２アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ２変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号４（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１６（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ａ３アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ａ３変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号６（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１８（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ａ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ１アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号８（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２０（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ１）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ２アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１０（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２２（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ２）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
本発明の「ＦＡＴＢ−Ｃ３アミノ酸配列」又は「ＦＡＴＢ−Ｃ３変異体アミノ酸配列」は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号１２（ＷＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、及び／又は、輸送ペプチドを伴う、又は、伴わず整列した場合に配列番号２４（ＳＯＳＲ ＦＡＴＢ−Ｃ３）と、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、また、配列表において提供するＦＡＴＢ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼べる。
このように、本発明は、その変異体及びそのフラグメント（以下にさらに定義する）を含む、野生型の機能的ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質のアミノ酸配列、ならびに、これらのいずれかの突然変異アミノ酸配列の両方を提供し、それにより、アミノ酸配列の突然変異が、好ましくは、ＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性を有意に低減する。突然変異ＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性の有意な低減は、野生型タンパク質の活性と比較し、少なくとも３０%、少なくとも４０%、５０%又はそれ以上、少なくとも９０%又は１００%（生物学的活性なし）の酵素活性における（即ち、アシルＡＣＰ−チオエステラーゼ活性における）低減を指す。
内因性アミノ酸配列及び単離アミノ酸配列の両方を本明細書において提供する。ＦＡＴＢアミノ酸配列の「フラグメント」又はその変異体（定義する）は、ＦＡＴＢ配列の（又は変異体配列の）少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、４００の連続アミノ酸などの様々な長さでよい。
機能的ＦＡＴＢタンパク質のアミノ酸配列
配列表において描写するアミノ酸配列は、セイヨウアブラナからの野生型の機能的ＦＡＴＢタンパク質である。このように、これらの配列は、それらが単離されたＷＯＳＲ及びＳＯＳＲ植物に内因性である。他のアブラナ属作物の種、品種、育種系統、又は野生系統種を、上記の、同じアミノ酸配列を伴う他の機能的ＦＡＴＢタンパク質又はその変異体についてスクリーニングできる。
また、ＦＡＴＢアミノ酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）は、本質的に類似の配列についてアミノ酸データベースをスクリーニングすることにより、コンピュータ内で同定されうることが理解される。本発明のアミノ酸分子のフラグメントも提供する。フラグメントとして、成熟タンパク質のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列の全て又は部分を含むより小さなフラグメントなどが挙げられる。
突然変異ＦＡＴＢタンパク質のアミノ酸配列
野生型アミノ酸配列と比べて１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換を含むアミノ酸配列は、本発明の別の実施態様であり、そのような突然変異アミノ酸分子のフラグメントも同様である。そのような突然変異アミノ酸配列は、以下にさらに記載する、様々な公知の方法を使用して生成及び／又は同定できる。この場合も、そのようなアミノ酸分子は、内因性の形態及び単離の形態の両方で提供する。
別の実施態様において、アミノ酸配列中の突然変異は、野生型タンパク質と比べ、ＦＡＴＢタンパク質の生物学的活性を有意に低減する、又は、完全に消失する。上記の通り、基本的に、野生型タンパク質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、酵素活性を有意に低減（又は、無に）しうる。しかし、タンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＦＡＴＢタンパク質の機能を低減させる可能性が高いことが理解され、触媒ドメインもしくは基質特異性（上記を参照のこと）に関与するアミノ酸などの機能的ドメインの有意な部分が欠ける切断タンパク質をもたらす突然変異、又は、触媒機能を有する、もしくは、基質特異性に関与する保存アミノ酸残基が置換された突然変異などである。
このように、一実施態様において、１つ又は複数の欠失又は挿入突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢタンパク質を提供し、それにより、欠失又は挿入は、インビボで活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらす。そのような突然変異ＦＡＴＢタンパク質は、野生型ＦＡＴＢタンパク質と比較して、少なくとも１、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００又はそれ以上のアミノ酸が欠失又は挿入したＦＡＴＢタンパク質であり、ここで、欠失又は挿入はインビボで活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらす。
別の実施態様において、切断された突然変異ＦＡＴＢタンパク質を提供し、それにより、切断はインビボで活性が有意に低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらす。そのような切断ＦＡＴＢタンパク質は、対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＣ末端部分において機能的ドメインを欠き、対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分を保持するＦＡＴＢタンパク質である。このように、一実施態様において、パパイン様触媒三連構造（上記）の保存Ｃｙｓ残基まで、しかし、それを含まない対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分を含む切断ＦＡＴＢタンパク質を提供する。野生型タンパク質と比較してより多く切断される突然変異タンパク質ほど、それが酵素活性を欠く可能性がより高くなる。このように、別の実施態様において、パパイン様触媒三連構造（上記）の保存Ｈｉｓ又はＡｓｎ残基まで、しかし、それを含まない対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分を含む切断ＦＡＴＢタンパク質を提供する。さらに別の実施態様において、基質特異性（上記）に関与する保存Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｒｐ残基まで、しかし、それを含まない対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分を含む切断ＦＡＴＢタンパク質を提供する。さらに別の実施態様において、第２の４ＨＢＴドメインの部分もしくは全てを欠く、又は、第１の４ＨＢＴドメイン（上記）の部分もしくは全て、又はさらに多くのアミノ酸を欠く対応する野生型（成熟）ＦＡＴＢタンパク質のＮ末端部分を含む切断ＦＡＴＢタンパク質を提供する。
さらに別の実施態様において、１つ又は複数の置換突然変異を含む突然変異ＦＡＴＢタンパク質を提供し、それにより、置換は、インビボで有意に活性が低減した、又は、無い突然変異タンパク質をもたらす。そのような突然変異ＦＡＴＢタンパク質は、触媒機能を有する、又は、基質特異性（例えば、上記のもの）に関与する保存アミノ酸残基を置換したＦＡＴＢタンパク質である。このように、一実施態様において、パパイン様触媒三連構造の保存Ａｓｎ、Ｈｉｓ、及びＣｙｓ残基などの触媒機能を有する保存アミノ酸残基の置換を含む突然変異ＦＡＴＢタンパク質を提供する。別の実施態様において、保存Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｒｐ残基などの基質特異性に関与する保存アミノ酸残基の置換を含む突然変異ＦＡＴＢタンパク質を提供する。
本発明の方法
突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を、当技術分野において慣習的である一連の方法を使用して、例えば、ｆａｔＢゲノム又はｃＤＮＡの部分又は全てを増幅するためのＰＣＲベースの方法を使用して、生成（例えば、突然変異誘発により誘発する）及び／又は同定できる。
本明細書において使用する「突然変異誘発」という用語は、植物細胞（例、複数個のアブラナ属種子又は花粉などの他の部分）を細胞のＤＮＡにおいて突然変異を誘発する技術にかけるプロセスを指し、例えば、化学物質（エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）もしくは電離放射線（中性子（高速中性子突然変異誘発など）、アルファ線、ガンマ線（コバルト６０源により供給されるものなど）、Ｘ線、ＵＶ照射など）、又はこれらの２つ又はそれ以上の組み合わせなどの突然変異誘発物質への接触である。このように、１つ又は複数のＦＡＴＢ対立遺伝子の所望の突然変異誘発は、１つ又は複数の植物組織とエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素などとの接触によるなどの化学的手段の使用により、Ｘ線など、又は、コバルト６０源により供給されるようなガンマ線照射の物理的手段の使用により達成できる。
突然変異誘発後、アブラナ属植物を処置種子から生育させ、又は、公知の技術を使用して処置細胞から再生する。例えば、結果として得られるアブラナ属種子を従来の生育手順に従って植えてよく、自家受粉後、種子が植物で形成される。あるいは、倍加半数体の小植物を処置した小胞子又は花粉の細胞から抽出し、迅速にホモ接合植物を形成できる。現世代、又は、次世代においてそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収集し、当技術分野において慣習的である技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術（ｆａｔＢ対立遺伝子の増幅）又はハイブリダイゼーションベースの技術、例えば、サザンブロット解析、及び／又はｆａｔＢ対立遺伝子の直接シークエンシングを使用して、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在についてスクリーニングできる。突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において点突然変異の存在についてスクリーニングするために（いわゆる一塩基多型又はＳＮＰ）、当技術分野において慣習的なＳＮＰ検出方法、例えば、オリゴライゲーションベースの技術、単一塩基伸長ベースの技術、又は、ＴＩＬＬＩＮＧなどの制限酵素部位における違いに基づく技術を使用できる。
上記の通り、特定の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の突然変異誘発（自然発生並びに誘導）は、結果として得られる突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換ヌクレオチド（以後、「突然変異領域」と呼ぶ）の存在をもたらす。突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子は、このように、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子において１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換ヌクレオチドの位置及び配置により特徴づけることができる。１つ又は複数のヌクレオチドがそれぞれ挿入、欠失、又は置換した野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子中の部位は、「突然変異領域」とも呼ぶ。本明細書において使用する「５’又は３’隣接領域又は配列」は、１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換ヌクレオチドを含むＤＮＡとは異なる少なくとも２０bp、好ましくは少なくとも５０bp、少なくとも７５０bp、少なくとも１５００bp、及び５０００bpまでの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子中のＤＮＡ領域又は配列、好ましくは、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において（又は対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子において）突然変異領域のすぐ上流に連続して（５’隣接領域又は配列）、又は、すぐ下流に連続して（３’隣接領域又は配列）位置する突然変異（又は対応する野生型）ＦＡＴＢ対立遺伝子からのＤＮＡを指す。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子又は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む植物もしくは植物材料、又は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む植物材料を含む産物を同定するために開発されたツールは、突然変異領域を含むゲノム領域の特定の制限酵素マップ、分子マーカー、あるいは隣接領域及び／又は突然変異領域の配列など、対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子のゲノム特性と比較して、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の特定のゲノム特性に基づく。
ひとたび特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子がシークエンシングされれば、分子生物学的技術によりサンプルの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）中の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’隣接、３’隣接、及び／又は突然変異領域内の配列を特異的に認識するプライマー及びプローブを開発できる。例えば、生物学的サンプル（植物のサンプル、植物材料、又は植物材料を含む産物など）中の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を同定するためのＰＣＲ方法を開発できる。そのようなＰＣＲは少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく：１つは突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域内の配列をそれぞれ認識する；又は、１つは突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の突然変異領域内の配列をそれぞれ認識する；又は、１つは突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列（以下でさらに記載する）をそれぞれ認識する。
プライマーは、好ましくは、最適化したＰＣＲ条件下で、５’又は３’隣接領域内の配列、突然変異領域内の配列、又は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’又は５’隣接及び突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列を「特異的に認識する」１５と３５の間のヌクレオチドの配列を有し、特定のフラグメント（「突然変異ＦＡＴＢ特異的フラグメント」又は識別アンプリコン）を、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む核酸サンプルから増幅する。これは、最適なＰＣＲ条件下で、標的突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子のみを増幅し、植物ゲノム中の他の配列をしない。
本発明に適したＰＣＲプライマーは以下でよい：
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’隣接配列から選択される少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換させた１つ又は複数のヌクレオチドの５’に隣接する配列、例えば、上記の欠失、ナンセンス、又はスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列、あるいは、上の表において示す潜在的な終止コドン又はスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列）を、それらの３’末端（５’隣接配列を認識するプライマー）に含む、長さが１７ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド；又は
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’隣接配列から選択される少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換させた１つ又は複数のヌクレオチドの３’に隣接する配列の相補体、例えば、上記の欠失、ナンセンス、又はスプライス部位突然変異の３’に隣接する配列の相補体、あるいは、上の表において示す潜在的な終止コドン又はスプライス部位突然変異の３’に隣接する配列の相補体）を、それらの３’末端（３’隣接配列を認識するプライマー）に含む、長さが１７ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド；又は
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の突然変異領域の配列から選択される少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０のヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明のＦＡＴＢ遺伝子において挿入又は置換させたヌクレオチドの配列、あるいはその相補体）を、それらの３’末端（突然変異配列を認識するプライマー）に含む、長さが１７ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド。
プライマーは、無論、言及した１７連続ヌクレオチドより長くなりうる、例えば、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ヌクレオチド長又はさらに長くなりうる。プライマーは、全体的に、隣接する突然変異配列の言及するヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうる。しかし、それらの５’末端の（即ち、３’に位置する１７連続ヌクレオチドの外側の）プライマーのヌクレオチド配列は、それほど重要ではない。このように、プライマーの５’配列は、適宜、隣接する、又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうるが、しかし、いくつかの（例、１、２、５、１０）ミスマッチを含みうる。プライマーの５’配列は、さらに、全体的に、例えば、制限酵素認識部位を表すヌクレオチド配列などの隣接又は突然変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からなりうる。そのような無関係の配列又はミスマッチを伴う隣接ＤＮＡ配列は、好ましくは、１００より長くなく、より好ましくは５０又はさらに２５ヌクレオチドより長くない必要がある。
さらに、適したプライマーは、言及した３’に位置するヌクレオチドが突然変異領域又は隣接領域のいずれにももっぱら由来しないという条件で、それらの３’末端に、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、もしくは置換された１つ又は複数のヌクレオチドの５’に隣接する配列と、挿入もしくは置換した１つ又は複数の配列、又は、欠失した１つもしくは複数のヌクレオチドの３’に隣接する配列の間の連結領域、例えば、上記の本発明のＦＡＴＢ遺伝子における欠失、ナンセンスもしくはスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列と、ナンセンスもしくはスプライス部位突然変異の配列、又は、欠失突然変異の３’に隣接する配列の間の連結領域、あるいは、上の表において示す潜在的な終止コドン又はスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列と、潜在的な終止コドン又はスプライス部位突然変異の配列の間の連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含みうる、又はそれからなりうる。
適切に選択したＰＣＲプライマー対が、また、互いに相補的な配列を含まないはずであることも、当業者にはすぐに明らかになりうる。
本発明の目的のための、「配列番号Ｘにおいて表わされるヌクレオチド配列の相補体」は、ヌクレオチドを、シャルガフ則（Ａ⇔Ｔ；Ｇ⇔Ｃ）に従ってそれらの相補ヌクレオチドを通じて置換すること、及び、５’から３’の方向で、即ち、表したヌクレオチド配列の反対方向で配列を読むことにより、表したヌクレオチド配列から誘導されうるヌクレオチド配列である。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定に適したプライマーの例が、実施例において記載される。
本明細書において使用する「位置Ｘから位置Ｙまでの配列番号Ｚのヌクレオチド配列」は、両方のヌクレオチドエンドポイントを含むヌクレオチド配列を示す。
好ましくは、増幅フラグメントは、５０と１０００ヌクレオチドの間の長さ、例えば、５０と５００ヌクレオチドの間の長さ、又は、１００と３５０ヌクレオチドの間の長さを有する。特異的プライマーは、ミスマッチによって依然として最適化したＰＣＲ条件下でこれらのプライマーで特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の特異的同定を可能にするという条件で、５’又は３’隣接領域内の配列と８０〜１００%同一である配列、突然変異領域内の配列、又は、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’又は５’隣接と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列を有しうる。許容可能なミスマッチの範囲は、しかし、実験的に容易に決定でき、当業者に公知である。
「突然変異ＦＡＴＢ特異的フラグメント」の検出及び／又は同定は、様々な方法、例えば、ゲル又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定を介して、又は、蛍光ベースの検出方法を介して起こりうる。突然変異ＦＡＴＢ特異的フラグメントは、また、直接的にシークエンシングしてよい。増幅ＤＮＡフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も、当技術分野において公知である。
標準的ＰＣＲプロトコールが、「PCR Applications Manual」（Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999）及び他の参考文献など、当技術分野において記載さる。特異的プライマーの配列を含む、ＰＣＲのための最適条件が、各特異的突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子のための「ＰＣＲ同定プロトコール」において特定される。ＰＣＲ同定プロトコールにおける多くのパラメーターを特定の実験室条件に調節させる必要がありうる、及び、同様の結果を得るために若干修飾できる。例えば、ＤＮＡの調製のための異なる方法の使用は、例えば、使用するプライマーの量、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２濃度、又はアニーリング条件の調節を必要としうる。同様に、他のプライマーの選択は、ＰＣＲ同定プロトコールのための他の最適条件を指示しうる。これらの調節は、しかし、当業者に明らかであり、上で引用したものなどの現行のＰＣＲ適用マニュアルにおいてさらに詳述する。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を同定するためのＰＣＲ同定プロトコールの例を、実施例において記載する。
あるいは、特異的プライマーを使用して、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を同定するための「特異的プローブ」として使用できる突然変異ＦＡＴＢ特異的フラグメントを増幅できる。核酸中でプローブとその対応するフラグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、生物学的サンプルの核酸とプローブを接触させることで、核酸／プローブのハイブリッドの形成をもたらす。このハイブリッドの形成を検出でき（例、核酸又はプローブの標識）、ここで、このハイブリッドの形成は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在を示す。（固相担体上又は溶液中のいずれかでの）特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づくそのような同定方法が、当技術分野において記載されている。特異的プローブは、好ましくは、最適化した条件下で、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内及び／又は突然変異領域内の領域（以下、「ＦＡＴＢ突然変異特異的領域」と呼ぶ）に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、２０と１０００bpの間、５０と６００bpの間、１００から５００bpの間、１５０から３５０bpの間の配列を含み、特定領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０%、好ましくは８０と８５%の間、より好ましくは８５と９０%の間、特に好ましくは９０と９５%の間、最も好ましくは９５と１００%の間で同一（又は相補的）である。好ましくは、特異的プローブは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の特定領域と同一（又は相補的）である約１５から約１００の連続ヌクレオチドの配列を含む。
本発明に適した特異的プローブは以下でよい：
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’隣接配列から選択される少なくとも２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、もしくは置換させた１つ又は複数のヌクレオチドの５’に隣接する配列、例えば、上記の欠失、ナンセンス、もしくはスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列、又は、上の表において示す潜在的な終止コドン又はスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列）、又はそれらと少なくとも８０%の配列同一性を有する配列（５’隣接配列を認識するプローブ）を含む、長さが２０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド；又は
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の３’隣接配列から選択される少なくとも２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、もしくは置換させた１つもしくは複数のヌクレオチドの３’に隣接する配列、例えば、上記の欠失、ナンセンス、もしくはスプライス部位突然変異の３’に隣接する配列、又は、上の表において示す潜在的な終止コドンもしくはスプライス部位突然変異の３’に隣接する配列）、又はそれらと少なくとも８０%の配列同一性を有する配列（３’隣接配列を認識するプローブ）を含む、長さが２０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド；又は
− 特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の突然変異領域の配列から選択される少なくとも２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（即ち、例えば、本発明のＦＡＴＢ遺伝子において挿入又は置換させたヌクレオチドの配列、あるいはその相補体）、又はそれらと少なくとも８０%の配列同一性を有する配列（突然変異配列を認識するプローブ）を含む、長さが２０ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチド。
プローブは、全体的に、隣接する突然変異配列の言及するヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうる。しかし、それらの５’又は３’末端のプローブのヌクレオチド配列は、それほど重要ではない。このように、プローブの５’又は３’配列は、適宜、隣接する、又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうるが、しかし、隣接する、又は、突然変異配列と無関係のヌクレオチド配列からなりうる。そのような無関係の配列は、好ましくは、５０より長くなく、より好ましくは２５より長くなく、又は、さらに２０又は１５ヌクレオチドより長くない必要がある。
さらに、適したプローブは、言及したヌクレオチド配列が突然変異領域又は隣接領域のいずれにももっぱら由来しないという条件で、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（即ち、例えば、本発明の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子において欠失、挿入、もしくは置換された１つもしくは複数のヌクレオチドの５’に隣接する配列と、挿入もしくは置換した１つもしくは複数の配列、又は、欠失した１つもしくは複数のヌクレオチドの３’に隣接する配列の間の連結領域、例えば、上記の本発明のＦＡＴＢ遺伝子における欠失、ナンセンスもしくはスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列と、ナンセンスもしくはスプライス部位突然変異の配列、又は、欠失突然変異の３’に隣接する配列の間の連結領域、あるいは、上の表において示す潜在的な終止コドンもしくはスプライス部位突然変異の５’に隣接する配列と、潜在的な終止コドンもしくはスプライス部位突然変異の配列の間の連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含みうる、又はそれからなりうる。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定に適したプローブの例が、実施例において記載される。
「突然変異ＦＡＴＢ特異的領域」の検出及び／又は同定は、様々な方法、例えば、ゲル電気泳動後のサイズ推定を介して、又は、蛍光ベースの検出方法を介して起こりうる。特異的プローブにハイブリダイズする「突然変異ＦＡＴＢ特異的領域」の検出のための他の配列特異的方法も、当技術分野において公知である。
あるいは、１つ又は複数の突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含む植物又は植物部分を、迅速中性子突然変異誘発により生成した欠失突然変異についてスクリーニングするためのＰＣＲを使用する「Delete-a-gene（商標）」方法（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2: 254-258により概説）、ヘテロ二本鎖解析による塩基対変化を検出するための変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を使用したＥＭＳ誘発点突然変異を同定するＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）方法（McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455、及びMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442）など、他の方法を使用して生成及び同定できる。言及した通り、ＴＩＬＬＩＮＧでは、突然変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する（例、突然変異−野生型ヘテロ二本鎖のＣｅｌ １切断を使用、及び、シークエンシングゲルシステムを使用した検出）。このように、１つ又は複数の組織において１つ又は複数の突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含む植物、種子、及び組織を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧの使用、ならびに、そのような植物を生成及び同定するための方法が、本明細書において包含される。このように、一実施態様において、本発明の方法は、植物種子を突然変異誘発し（例、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体又はＤＮＡのプール、目的領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、突然変異植物の同定、突然変異ＰＣＲ産物のシークエンシングの工程を含む。他の突然変異誘発及び選択の方法を同様に使用して、そのような突然変異植物を生成できることが理解される。
ｆａｔＢ対立遺伝子において突然変異を誘発する代わりに、天然（自然発生）突然変異対立遺伝子を、当技術分野において公知の方法により同定できる。例えば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧを使用して（Henikoff et al., 2004, Plant Physiology 135(2): 630-6）、天然突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子の存在について複数個の植物又は植物部分をスクリーニングできる。上の突然変異誘発技術について、好ましくは、Ａ及び／又はＣゲノムを含むアブラナ属種をスクリーニングし、同定したｆａｔＢ対立遺伝子を、続いて、交配（種間又は種内交配）及び選択により、セイヨウアブラナなどの他のアブラナ属種中に導入できる。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧにおいて、育種系統又は関連種中の天然多型を、上記のＴＩＬＬＩＮＧ方法論によりスクリーニングし、植物の個体又はプールを、ｆａｔＢ標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成、及びハイスループット分析のために使用する。これは、続いて、所望の突然変異対立遺伝子を組み入れるための育種プログラムにおいて使用できる必要な突然変異を有する個々の植物を選択することにより追跡調査できる。
同定した突然変異対立遺伝子を、次に、シークエンシングし、配列を野生型対立遺伝子と比較して、突然変異を同定できる。場合により、同種又は異種の宿主における発現及び酵素アッセイにおいて機能性について突然変異ＦＡＴＢタンパク質をテストすることにより機能性をテストできる。このアプローチを使用して、複数個の突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子（これらの１つ又は複数を含むアブラナ属植物）を同定できる。所望の突然変異対立遺伝子を、以下にさらに記載する交配及び選択の方法により、所望の野生型対立遺伝子と組み合わせることができる。最後に、所望の数の突然変異ｆａｔＢ及び所望の数の野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む単一の植物を生成する。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の検出のためのＰＣＲプライマー又は特異的プローブとして適したオリゴヌクレオチドを使用して、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するための方法を開発することもできる。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、ＰＣＲベースのアッセイを開発して、突然変異及び／又は対応する野生型ＦＡＴＢ特異的対立遺伝子の存在を決定できる。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、プライマー間に位置する突然変異領域を有するように、デザインできる。これらのプライマーは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このプライマーの組によって、突然変異体、ならびに、対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅が可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、及び、その１つが突然変異領域を特異的に認識するように、デザインできる。これらのプライマーは、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域及び突然変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このプライマーの組は、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子中の突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異ＦＡＴＢ遺伝子、ならびに、野生型ＦＡＴＢ遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、及び、その１つが５’又は３’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識するように、デザインできる。これらのプライマーは、５’又は３’隣接領域及び野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このプライマーの組は、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子中の突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異ＦＡＴＢ遺伝子、ならびに、野生型ＦＡＴＢ遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を、突然変異及び野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子を特異的に認識する代替プライマーの組を使用することにより決定できる。
植物が突然変異ＦＡＴＢ遺伝子又は対応する野生型ＦＡＴＢ遺伝子についてホモ接合である場合、上記の診断ＰＣＲアッセイは、突然変異又は野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子のいずれかについて、典型的な、好ましくは長さが典型的な単一のＰＣＲ産物を生じる。植物が突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子についてヘミ接合である場合、２つの特異的ＰＣＲ産物が出現し、突然変異及び野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子の両方の増幅を反映する。
野生型及び突然変異のＦＡＴＢ特異的ＰＣＲ産物の同定は、例えば、ゲル又はキャピラリー電気泳動後（例、野生型及び突然変異のＦＡＴＢ対立遺伝子から増幅されたフラグメント間のサイズ差をもたらす多くの挿入又は欠失されたヌクレオチドを含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子について、前記フラグメントがゲル上で可視的に分離できる）のサイズ評価により；突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の診断ＰＣＲ増幅が、場合により、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の診断ＰＣＲ増幅から別々に実施できる、ゲル又はキャピラリー電気泳動後の２つの異なるフラグメントの有無を評価することにより；増幅フラグメントの直接シークエンシングにより；又は、蛍光ベースの検出方法により起こりうる。特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合性を決定するのに適したプライマーの例が、実施例において記載される。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、ハイブリダイゼーションベースのアッセイを開発して、突然変異及び／又は対応する野生型ＦＡＴＢ特異的対立遺伝子の存在を決定できる。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を認識する２つの特異的プローブを、各々がＦＡＴＢ野生型対立遺伝子内の配列を特異的に認識し、突然変異領域がプローブにより認識される配列間に位置するように、デザインできる。これらのプローブは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプローブでよい。これらのプローブの１つ、好ましくは両方の使用によって、突然変異体、ならびに、対応する野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の同時診断ハイブリダイゼーションが可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を認識する２つのプローブを、それらの１つが突然変異領域の上流又は下流、好ましくは突然変異領域の上流のＦＡＴＢ野生型対立遺伝子内の配列を特異的に認識し、及び、それらの１つが突然変異領域を特異的に認識するように、デザインできる。これらのプローブは、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域、及び、突然変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプローブでよい。これらのプローブの１つ、好ましくは両方の使用によって、場合により、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子中の突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブと一緒に、突然変異体の、及び、野生型ＦＡＴＢ遺伝子の診断ハイブリダイゼーションを可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子を認識する特異的プローブを、プローブが野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域の間の連結領域、好ましくは５’隣接領域、及び、突然変異領域の配列を特異的に認識するようにデザインできる。このプローブは、場合により、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域の間の連結領域、好ましくは５’隣接領域、及び、突然変異領域を特異的に認識する第２のプローブと一緒に、突然変異体の、及び、野生型ＦＡＴＢ遺伝子の診断ハイブリダイゼーションを可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を、突然変異及び野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子を特異的に認識する代替プライマーの組を使用することにより決定できる。
植物が突然変異ＦＡＴＢ遺伝子又は対応する野生型ＦＡＴＢ遺伝子についてホモ接合である場合、上記の診断ハイブリダイゼーションアッセイは、突然変異又は野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子のいずれかについて、典型的な、好ましくは長さが典型的な、１つ又は複数のハイブリダイズＤＮＡ（制限）フラグメントなど、単一の特異的ハイブリダイゼーション産物を生じる。植物が突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子についてヘミ接合である場合、２つの特異的ハイブリダイゼーション産物が出現し、突然変異及び野生型のＦＡＴＢ対立遺伝子の両方のハイブリダイゼーションを反映する。
野生型及び突然変異のＦＡＴＢ特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、例えば、ゲル又はキャピラリー電気泳動後（例、フラグメントがゲル上で可視的に分離できるような、野生型及び突然変異のＦＡＴＢ対立遺伝子からのハイブリダイズＤＮＡ（制限）フラグメント間のサイズ差をもたらす多くの挿入又は欠失されたヌクレオチドを含む突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子について）のサイズ評価により；突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の診断ハイブリダイゼーションが、場合により、野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の診断ハイブリダイゼーションと別々に実施できる、ゲル又はキャピラリー電気泳動後の２つの異なる特異的ハイブリダイゼーション産物の有無を評価することにより；ハイブリダイズＤＮＡ（制限）フラグメントの直接シークエンシングにより；又は、蛍光ベースの検出方法により生じる。
特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合性を決定するのに適したプローブの例が、実施例において記載される。
さらに、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの増幅方法とは異なる特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子に特異的な検出方法を、本明細書において提供する特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子に特異的な配列の情報を使用して開発することもできる。そのような代替検出方法として、Invader（商標）技術（例、米国特許第５，９８５，５５７号「Invasive Cleavage of Nucleic Acids」に記載、第６，００１，５６７「Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage」、参照により本明細書に組み入れられる）の別名でも知られる特定の核酸構造の侵襲的切断に基づく線形シグナル増幅検出方法、TaqmanなどのＲＴ−ＰＣＲベースの検出方法、又はSNPlexなどの他の検出方法が挙げられる。
本発明のキット
本明細書において使用する「キット」は、本発明の方法を実施する、特に、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定、又は特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む植物材料の接合状態の決定の目的のための試薬一式を指す。特に、本発明のキットの好ましい実施態様は、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定のための、上記の少なくとも２つの特異的プライマー、又は接合状態の決定のための少なくとも２つ又は３つの特異的プライマーを含む。場合により、キットは、ＰＣＲ同定プロトコールにおける本明細書において記載する任意の他の試薬をさらに含みうる。あるいは、本発明の別の実施態様によると、キットは、生物学的サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズして、上記の本明細書における特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在を同定する、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定のための、少なくとも１つの特異的プローブ、又は、接合状態の決定のための少なくとも２つ又は３つの特異的プローブを含みうる。場合により、キットは、特異的プローブを使用した、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の同定のための任意の他の試薬（限定はされないが、ハイブリダイゼーションバッファー、標識など）をさらに含みうる。
本発明のキットを使用でき、そして、その構成要素を、品質管理（例、種子ロットの純度）、限定はされないが、食物又は飼料産物など、植物材料又は植物材料を含む、もしくは、それに由来する材料における特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の有無の検出の目的のために、特異的に調節できる。
本明細書において使用する「プライマー」という用語は、ＰＣＲなどの鋳型依存性のプロセスにおける新生核酸の合成を刺激できる任意の核酸を包含する。典型的に、プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、しかし、より長い配列を利用できる。プライマーは二本鎖の形態で提供できるが、一本鎖の形態が好ましい。プローブはプライマーとして使用できるが、しかし、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するようにデザインされ、増幅プロセスにおいて使用する必要はない。
特異的プライマーに言及する際に本明細書において使用する「認識する」という用語は、特異的プライマーが方法において示す条件（ＰＣＲ同定プロトコールの条件など）下で特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子中の核酸配列に特異的にハイブリダイズするとの事実を指し、ここで、特異性は陽性及び陰性コントロールの存在により決定される。
特異的プローブに言及する際に本明細書において使用する「ハイブリダイズする」という用語は、プローブが標準的ストリンジェンシー条件下で特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の核酸配列において特定の領域に結合するとの事実を指す。本明細書において使用する標準的ストリンジェンシー条件は、本明細書において記載するハイブリダイゼーションのための条件、又は、Sambrook et al., 1989（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）により記載される従来のハイブリダイズ条件を指し、例えば、以下の工程を含みうる：１）植物ゲノムＤＮＡフラグメント又はＢＡＣライブラリーをフィルター上に固定すること、２）フィルターを、６５℃の６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５% ＳＤＳ、及び２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ中で１〜２時間プレハイブリダイズすること、３）標識したハイブリダイゼーションプローブを添加すること、４）１６〜２４時間インキュベートすること、５）フィルターを６８℃の６×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中で３０分間１回洗浄すること、６）フィルターを６８℃の２×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中で３回（３０ml中で３０分間２回及び５００ml中で１０分間１回）洗浄すること、及び、７）フィルターを−７０℃でＸ線フィルムに４〜４８時間暴露すること。
本明細書において使用する「生物学的サンプル」は、植物、植物材料、又は植物材料を含む産物のサンプルである。「植物」という用語は、任意の成熟段階にあるアブラナ属植物組織、ならびに、限定はされないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物、又はプロトプラストを含む、任意のそのような植物から採取する、又は、由来する任意の細胞、組織、又は器官を包含することを意図する。本明細書において使用する「植物材料」は、植物から得られる、又は、由来する材料を指す。植物材料を含む産物は、植物材料を使用して産生される、又は、植物材料により汚染されうる食物、飼料、又は他の産物に関する。本発明との関連において、そのような生物学的サンプルは、サンプル中の核酸の存在を意味する、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子に特異的な核酸の存在についてテストされることが理解される。このように、生物学的サンプルにおいて特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を同定するための、本明細書において言及する方法は、特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む核酸の生物学的サンプルにおける同定に関する。
本発明は、また、１つのアブラナ属植物中の１つ又は複数の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の、別のアブラナ属植物への移入、１つの植物における特定のＦＡＴＢ対立遺伝子の組み合わせ、１つ又は複数の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む植物、これらの植物から得られる子孫及び植物細胞、又はこれらの植物に由来する植物材料に関する。
このように、一実施態様において、１つのアブラナ属植物から別のアブラナ属植物に突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を移入するための方法を提供し、以下の工程を含む：
（ａ）上記の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むアブラナ属植物を第２のアブラナ属植物と交配すること、
（ｂ）交配からＦ１雑種種子を回収すること、
（ｃ）場合により、１つ又は複数の世代（Ｘ）のために、Ｆ１種子に由来するＦ１植物を戻し交配し、交配からのＢＣｘ種子を回収し、そして、上記の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む、ＢＣｘ種子に由来する各世代のＳＣｘ植物において同定すること、
（ｄ）場合により、ホモ接合植物を得るためにＦ１又はＢＣ１植物の処置済み小胞子又は花粉細胞からの倍加半数体植物を抽出すること、
（ｅ）Ｆ１又はＢＣｘ種子に由来する、Ｆ１又はＢＣｘ植物を自家受粉すること、
（ｆ）自家受粉からのＦ１ Ｓ１又はＢＣｘ Ｓ１種子を回収すること、
（ｇ）上記の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む、Ｆ１ Ｓ１又はＢＣｘ Ｓ１種子に由来する、Ｆ１ Ｓ１又はＢＣｘ Ｓ１植物を同定すること。
本発明の別の実施態様において、１つのアブラナ属植物において少なくとも２つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を組み合わせるための方法を提供し、以下の工程を含む：
（ａ）上記の通りに、１つのアブラナ属植物から別のアブラナ属植物に突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を移入すること、
（ｂ）所望の数の及び／又は型の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子が第２の植物において組み合わさるまで工程（ａ）を繰り返すこと。
本発明のさらに別の実施態様において、本明細書における３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子を含むアブラナ属植物を作るための方法を提供し、以下の工程を含む：
（ａ）上記の通りに、１つのアブラナ属植物において少なくとも３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の少なくとも３つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を組み合わせること、
（ｂ）場合により、上記の通りに、１つ又は複数の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定することにより、１つ又は複数の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合である、植物又はその部分を同定すること、
（ｃ）場合により、機能的ＦＡＴＢタンパク質の量が有意に低減した、植物又はその部分を同定すること、
（ｄ）場合により、脂肪酸組成が、対応する野生型アブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成と比較して有意に変化している、種子油を産生する植物を同定すること、
（ｅ）場合により、そのような植物を生育すること、そして、ヒトの消費のためにそのような植物からの種子油を単離すること。
本発明の植物種子油
本発明のアブラナ属植物、特に本明細書において提供するセイヨウアブラナの種子、しかし、また、他のアブラナ属脂肪種子に由来する「低ｓａｔ」及び「無ｓａｔ」油の両方を提供する。例えば、カラシナ及びブラッシカ・ラパなどの突然変異ＦＡＴＢ−Ａ及び／又はＦＡＴＢ−Ｃ遺伝子を含むアブラナ属種子油種である。
６つのＦＡＴＢ遺伝子のわずか１つ又は２つにおける、突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子の野生型等価物によりコード化される機能的ＦＡＴＢタンパク質の量の有意な低減を起こす突然変異を含むセイヨウアブラナ植物は、植物の種子油中の飽和脂肪酸のパーセント（重量%）を有意に低減するのに十分ではないことが見出された。低又は無飽和種子油を産生する植物を得るために、３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子（ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢＣ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される）の少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子が、植物中に含まれる必要があると考えられる。
このように、本発明の一局面において、３つの異なるＦＡＴＢ遺伝子の少なくとも３つの突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子（ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢＣ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される）を含むアブラナ属植物の種子に由来する「低ｓａｔ」又は「無ｓａｔ」種子油を提供し、ここで、突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子は、これらの突然変異対立遺伝子の野生型等価物によりコード化される型の機能的ＦＡＴＢタンパク質の量の有意な低減、ひいては、植物細胞、特に発生中の種子において、インビボで産生される機能的ＦＡＴＢタンパク質の全体的に有意に低減した量をもたらす。
本発明のさらなる局面において、ホモ接合ＦＡＴＢ三重突然変異、ホモ接合ＦＡＴＢ四重突然変異、及び／又はホモ接合ＦＡＴＢ五重突然変異アブラナ属植物の種子に由来する「低ｓａｔ」又は「無ｓａｔ」種子油を提供し、ここで、突然変異対立遺伝子が遺伝子ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される。
本発明のさらなる局面において、ホモ接合ＦＡＴＢ三重突然変異、ホモ接合ＦＡＴＢ四重突然変異、及び／又はホモ接合ＦＡＴＢ五重突然変異アブラナ属植物の種子に由来する「低ｓａｔ」又は「無ｓａｔ」種子油を提供し、それらはさらなる突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含み、突然変異植物又は植物部分は追加の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子についてヘテロ接合であり、及び、突然変異対立遺伝子は遺伝子ＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３から選択される。
１つの植物において十分なコピー数の特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を、十分なコピー数の特定の突然変異ｆａｔＢ対立遺伝子と組み合わせることにより、作られる機能的ＦＡＴＢタンパク質の量及び／又は型を微調整することが可能になり、次に、色素体からの遊離飽和脂肪酸の排出（量及び／又は型）に、ひいては、産生される種子油の脂肪酸組成に影響を及ぼす。
このように、本発明の別の実施態様において、本発明の少なくとも１つの特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子及び本発明の少なくとも１つの特定の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含む、アブラナ属植物の種子に由来する、特定の量及び／又は型の飽和脂肪酸を含む種子油を提供し、ここで、突然変異及び野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子の特定の組み合わせが、植物細胞、特に発生中の種子において、インビボで産生される特定の量及び／又は型の機能的ＦＡＴＢタンパク質をもたらす。
食物適用、特に、ヒトの健康上の利益が想定される食物適用における本発明の種子油の使用も本発明に含まれる。本発明の油は主にヒトの食事のための油として有用であり（食物適用）、それらは動物の食事における有用性も有しうる（飼料適用）。特定の修飾した相対量及び／又は組成の本発明の飽和脂肪酸を伴う種子油、特に、本発明の７%より有意に少ない飽和脂肪酸を含む種子油を、他の植物油、特に、背景の項において言及するものなどの７%より有意に多い飽和脂肪酸を含む植物油と混合して、後者における飽和脂肪酸のレベルを低下させ、ひいては、限定はされないが、バイオディーゼルの産生のためなど、それを特定の適用により適するようにするためなどの他の適用も本発明に含まれる。
配列
配列表は、野生型ＦＡＴＢ配列のゲノムＦＡＴＢタンパク質コードＤＮＡを描写する。これらの配列は４つのイントロンにより中断された５つのエクソンを含む。ｃＤＮＡ及び対応するプロセシングされたｍＲＮＡ（即ち、スプライスされたＲＮＡ）において、イントロンを除去し、エクソンを連結する。このように、例えば、冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子のｃＤＮＡは、１−５０４、５９０−７２３、７９８−９１１、９８１−１１５２、及び１２４３−１５６０の位置からの配列番号１の配列を有する。
ＦＡＴＢ遺伝子
配列番号１：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質。
配列番号３：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ２タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号４：配列番号３によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ２タンパク質。
配列番号５：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ３タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号６：配列番号５によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ３タンパク質。
配列番号７：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ１タンパク質。
配列番号９：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ２タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号９によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ２タンパク質。
配列番号１１：冬アブラナ（ＷＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号１１によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質。
配列番号１３：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号１３によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ１タンパク質。
配列番号１５：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ２タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号１６：配列番号１５によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ２タンパク質。
配列番号１７：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ａ３タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号１８：配列番号１７によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ａ３タンパク質。
配列番号１９：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号２０：配列番号１９によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ１タンパク質。
配列番号２１：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ２タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号２２：配列番号２１によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ２タンパク質。
配列番号２３：春アブラナ（ＳＯＳＲ）セイヨウアブラナからの野生型ＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質をコード化するＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子（イントロンを伴う）のＤＮＡ。
配列番号２４：配列番号２３によりコード化される野生型ＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質。
配列番号７９：シロイヌナズナからの野生型ＦＡＴＢ１タンパク質をコード化するＦＡＴＢ１遺伝子のＤＮＡ。
配列番号８０：配列番号７９によりコード化される野生型ＦＡＴＢ１タンパク質。
プライマー及びプローブ
配列番号２５：５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ。
配列番号２６：オリゴヌクレオチドプライマーＫＶＡ０５−１４。
配列番号２７：オリゴヌクレオチドプライマーＫＶＡ０５−１５。
配列番号２８：３’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ。
配列番号２９：オリゴヌクレオチドプライマーＫＶＡ０５−１６。
配列番号３０：オリゴヌクレオチドプライマーＫＶＡ０５−１７。
配列番号３１：ＦＡＴＢ−Ａ１（配列番号１３）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号３２：ＦＡＴＢ−Ａ１（配列番号１３）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号３３：ＦＡＴＢ−Ａ２（配列番号１５）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号３４：ＦＡＴＢ−Ａ２（配列番号１５）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号３５：ＦＡＴＢ−Ａ３（配列番号１７）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号３６：ＦＡＴＢ−Ａ３（配列番号１７）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号３７：ＦＡＴＢ−Ｃ１（配列番号１９）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号３８：ＦＡＴＢ−Ｃ１（配列番号１９）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号３９：ＦＡＴＢ−Ｃ２（配列番号２１）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号４０：ＦＡＴＢ−Ｃ２（配列番号２１）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４１：ＦＡＴＢ−Ｃ３（配列番号２３）の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号４２：ＦＡＴＢ−Ｃ３（配列番号２３）の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４３：ＦＡＴＢ−Ａ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４４：ＦＡＴＢ−Ａ２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号４５：ＦＡＴＢ−Ａ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４６：ＦＡＴＢ−Ａ３の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４７：ＦＡＴＢ−Ｃ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４８：ＦＡＴＢ−Ｃ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号４９：ＦＡＴＢ−Ｃ３の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号５０：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号５１：ＦＡＴＢ−Ａ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号５２：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５及び−Ａ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号５３：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号５４：ＦＡＴＢ−Ａ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号５５：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６及び−Ａ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号５６：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号５７：ＦＡＴＢ−Ａ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号５８：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５及び−Ａ２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号５９：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号６０：ＦＡＴＢ−Ａ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号６１：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１及び−Ａ２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号６２：ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号６３：ＦＡＴＢ−Ａ３の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号６４：ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１及び−Ａ３の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号６５：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号６６：ＦＡＴＢ−Ｃ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号６７：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５、−Ｃ１−ＥＭＳ０４、及び−Ｃ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号６８：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号６９：ＦＡＴＢ−Ｃ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７０：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７１：ＦＡＴＢ−Ｃ２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７２：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２及び−Ｃ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号７３：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７４：ＦＡＴＢ−Ｃ２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７５：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３及び−Ｃ２の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号７６：ＦＡＴＢ−Ｃ３−ＥＭＳ０２の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７７：ＦＡＴＢ−Ｃ３の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号７８：ＦＡＴＢ−Ｃ３−ＥＭＳ０２及び−Ｃ３の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号８１：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８２：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８３：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８４：ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８５：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８６：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８７：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８８：ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号８９：ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９０：ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９１：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９２：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９３：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９４：ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９５：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９６：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９７：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９８：ＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号９９：ＦＡＴＢ−Ｃ３−ＥＭＳ０２の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号１００：ＦＡＴＢ−Ｃ３−ＥＭＳ０２の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号１０１：ＥＮＤＯ１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号１０２：ＥＮＤＯ１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
実施例において特記なき場合、全ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAのＶｏｌｕｍｅｓ １と２、ならびに、Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)のＶｏｌｕｍｅｓ ＩとＩＩにおいて記載される標準プロトコールに従って行う。植物分子操作のための標準的な材料及び方法は、R. D. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)において記載され、BIOS Scientific Publications Ltd.(UK)及びBlackwell Scientific Publications, UKにより共同出版されている。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料及び方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びMcPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyにおいて見出すことができる。ＡＦＬＰ分析のための標準的手順は、Vos et al. （1995, NAR 23: 4407-4414）において記載され、欧州特許出願第５３４８５８号において公開されている。
実施例
実施例１−セイヨウアブラナにおけるＦＡＴＢ遺伝子の数の決定及びＦＡＴＢ遺伝子のＤＮＡ配列の単離
セイヨウアブラナにおけるＦＡＴＢ遺伝子の数及び異なるＦＡＴＢ遺伝子の配列を決定するために、異なるセイヨウアブラナ品種のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを以下の通りにスクリーニングした：
１．１． ＦＡＴＢ配列を含むＢＡＣクローンの単離
異なるセイヨウアブラナ品種のＦＡＴＢ配列を含むＢＡＣクローンを含む大腸菌コロニーを同定するために、高密度ナイロンフィルター上で個々の２重のクローンとして整列させた、優良セイヨウアブラナ春アブラナ系統（以下、「ＳＯＳＲと呼ぶ」）及び優良セイヨウアブラナ冬アブラナ品種Ｅｘｐｒｅｓｓ（以下、「ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ」と呼ぶ）（平均クローンサイズは１２０bｐ超）のＢＡＣライブラリーを標準的サザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした：
− アブラナ属ＦＡＴＢ遺伝子を検出するためのプローブの調製のためのＤＮＡ鋳型を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製した：
− 鋳型：
（ａ）シロイヌナズナ栽培品種コロンビア（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｖ．Ｃｏｌｏｍｂｉａ）からのＦＡＴＢ１遺伝子（Ａｔ１ｇ０８５１０）の５’部分の４８７ ｂｐフラグメント（配列番号２５）を含むｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）ベクター（ｐＫＶＡ４８）
（ｂ）シロイヌナズナ栽培品種コロンビアからのＦＡＴＢ１遺伝子の３’部分の３５２ ｂｐフラグメント（配列番号２８）を含むｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）ベクター（ｐＫＶＡ４９）
− プライマー：
（ａ）フォワードプライマー：５’−ＧＡＡＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡＣＣ−３’ （ＫＶＡ０５−１４ − 配列番号２６）
リバースプライマー：５’−ＴＴＡＴＧＣ−ＡＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＡＣＣ−３’ （ＫＶＡ０５−１５ − 配列番号２７）
（ｂ）フォワードプライマー：５’−ＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡ−３’ （ＫＶＡ０５−１６ − 配列番号２９）
リバースプライマー：５’−ＴＡＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＴＣＴ−３’ （ＫＶＡ０５−１７ − 配列番号３０）
− ＰＣＲミック：
２０μl １０×ＰＣＲバッファー、２μl ｄＮＴＰｓ（２５mM）、１μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）、１６８μl Ｈ２Ｏ、及び
− ４μl ＫＶＡ０５−１４（１０μM）、４μl ＫＶＡ０５−１５（１０μM）、１ μl ｐＫＶＡ４８（２０pg/μl）、
− ４μl ＫＶＡ０５−１６（１０μM）、４ μl ＫＶＡ０５−１７（１０μM）、１μl ｐＫＶＡ４９（２０pg/μl）、４×５０μlに分ける。
− 熱サイクルプロファイル：９４℃で４分間；５×［９４℃で１分間（変性）及び５０℃で１分間（アニーリング）及び７２℃で２分間（伸長）］；２５×［９４℃で４０秒間（変性）及び５０℃で４０秒間（アニーリング）及び７２℃で１分間（伸長）］；７２℃で５分間；１０℃に冷却。
− これによって以下が生成される：
（ａ）ベクターｐＫＶＡ４８に含まれるシロイヌナズナＦＡＴＢ１遺伝子の４８７bpフラグメント（配列番号２５「５’ ＡｔＦＡＴＢ１プローブ」）
（ｂ）ベクターｐＫＶＡ４９に含まれるシロイヌナズナＦＡＴＢ１遺伝子の３５２bpフラグメント（配列番号２８「３’ ＡｔＦＡＴＢ１プローブ」）
− ＤＮＡフラグメントを精製し、４７８bpのＤＮＡフラグメント（「５’ ＡｔＦＡＴＢ１プローブ」）を（例、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ及びReady-To-Go DNA Labeling Beads − Amersham Bioscience（登録商標）を使用して）標準的手順に従って標識し、ナイロンメンブレン上のＤＮＡにハイブリダイズするために使用した。あるいは、３５２bpのＤＮＡフラグメント（「３’ ＡｔＦＡＴＢ１プローブ」）を標識して、ナイロンメンブレン上のＤＮＡにハイブリダイズするために使用できる。
− プレハイブリダイゼーションは、以下の３０mlのハイブリダイゼーションバッファー中で、６５℃で２時間実施した：６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０M ＮａＣｌ、０．３M Ｎａクエン酸（ｐＨ７．０）を含む）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは２% Ｆｉｃｏｌｌ、２%ポリビニル・ピロリドン、２%ウシ血清アルブミン）、０．５% ＳＤＳ、及び２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０−３０００ヌクレオチド）。
− ハイブリダイゼーションは以下の条件下で実施した：
− 標識プローブを９５℃で５分間加熱し、氷上で５分間冷却することにより変性させ、１５mlのハイブリダイゼーションバッファーに添加した（プレハイブリダイゼーション用と同じバッファー）。
− ハイブリダイゼーションを６５℃で一晩実施した。
− ブロットをハイブリダイゼーションチューブ中で、６５℃で３０分間３回（０．１% ＳＤＳを伴う３０mlの６×ＳＳＣで１回、そして、０．１% ＳＤＳを伴う３０mlの２×ＳＳＣで２回）、そして、ボックス中で、０．１% ＳＤＳを伴う５００mlの２×ＳＳＣで、６５℃で１０分間１回洗浄した。
− Kodak X-OMAT ARフィルムを、７０℃で４時間、放射活性のあるブロットに暴露した。
− 陽性シグナルに基づき、ＦＡＴＢ配列を含むＢＡＣクローンを含む７２の大腸菌コロニーを、ＷＯＳＲ ＥｘｐｒｅｓｓからのＢＡＣライブラリー（陽性の総数：１１４）をスクリーニングすることにより、４０を、第２のＢＡＣライブラリースクリーニングにおいてＳＯＳＲからのＢＡＣライブラリー（陽性の総数：１３５）をスクリーニングすることにより取得した（以下、「陽性コロニー」と呼ぶ）。
１．２． 全長ＦＡＴＢ配列を含むＢＡＣクローンの単離
ＦＡＴＢ配列の１つの全長ゲノム配列を伴うＢＡＣクローンを含む陽性コロニーを同定するために、サザンブロット解析を、陽性コロニーから単離したＢＡＣクローンＤＮＡ及びセイヨウアブラナから単離したゲノムＤＮＡで実施した：
− ＢＡＣクローンＤＮＡは、当技術分野において記載されるアルカリ溶解を通じて、２５μg/mlクロラムフェニコールを含む１００ml（ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ用）又は２５ml（ＳＯＳＲ用）のＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地中で増殖させた陽性コロニーから単離した。
− ゲノムＤＮＡを、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）方法（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19: 11-15）に従って、セイヨウアブラナ冬アブラナ品種Ｄａｒｍｏｒ（以下「ＷＯＳＲ Ｄａｒｍｏｒ」と呼ぶ）の葉組織から単離した。
− 各調製物のＤＮＡ濃度を、エチジウムブロマイド（ICN Biochemicals（登録商標））を含む１% ＴＢＥ（Invitrogen（登録商標））アガロースゲル（Roche（登録商標））上で、１μlの各サンプルのバンド強度を２５ng/μlラムダＤＮＡ（Life Technologies（登録商標））を含む１、２、４、８、及び２０μlの溶液のバンド強度と比較することにより評価した。
− １００−２００ng（ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ用）又は１０ng（ＳＯＳＲ用）のＢＡＣクローンＤＮＡ及びＷＯＳＲ Ｄａｒｍｏｒから単離した１．７μgのゲノムＤＮＡを、製造業者により提案される条件を適用して、最終反応容積２０μl中で制限酵素ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。消化の時間及び／又は制限酵素の量を調節して、非特異的分解のないゲノムＤＮＡサンプルの完全消化を確実にする。
− 消化後、ＲＮａｓｅを含む２μlの添加色素（１２．５ml １%キシレンシアノールＦＦ；１２．５ml １%ブロモフェノール・ブルー水溶性指示薬；２５mlグリセロール；１００μl ０．５M ＥＤＴＡ ｐＨ８；１μl ＲＮａｓｅ（１０mg/ml））を、消化したＤＮＡサンプルに加えて、サンプルは３７℃で３０分間インキュベートした。
− サンプルを１% ＴＡＥアガロースゲルに添加した。
− ＰｓｔＩで消化したPhage Lambda DNA（Fermentas（登録商標））（２９のフラグメント（bp）を生成する：
Figure 0005677839
−イタリックのフラグメントは標準的な電気泳動において目に見えない）（ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ用）又は１kbp DNA Ladder（Life Technologies）（ＳＯＳＲ用）がサイズスタンダードとして含まれた。
− 電気泳動後、ＤＮＡサンプル（消化したＢＡＣクローン及びゲノムＤＮＡ）を、乾燥アルカリキャピラリーブロッティングにより、ナイロンメンブレン（Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech（登録商標））にトランスファーする。
− 消化したＢＡＣクローン及びゲノムＤＮＡを伴うナイロンメンブレンを、ゲノムＤＮＡについてＫｏｄａｋ ＸＯＭＡＴ ＡＲフィルムを放射活性のあるブロットに−７０℃で２日間暴露させたことを除き、ＢＡＣライブラリースクリーニングのための上記の標準的なサザンブロット手順によりスクリーニングした。
− 同定した陽性コロニーのＢＡＣクローンＤＮＡ及びセイヨウアブラナＷＯＳＲ Ｄａｒｍｏｒから単離したゲノムＤＮＡの制限酵素ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶでの消化後に得られるハイブリダイゼーションパターンの間の比較、及び、５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ（配列番号２５）（表１４を参照のこと）とのハイブリダイゼーション、及び、特定の制限酵素パターンを呈するＢＡＣクローンの数に基づき、ＢＡＣクローンを６グループにグループ分けし、６グループの各々について、全長ＦＡＴＢ配列を含むＢＡＣクローンを選択した（ＦＡＴＢ１から６と名付けた）。
− 選択された陽性コロニーのＢＡＣクローンに含まれるＦＡＴＢ配列を、標準的なシークエンシング技術（Agowa）により決定した。
Figure 0005677839
６つの別々のグループのＢＡＣクローンの存在を、同定した陽性コロニーのＢＡＣクローンＤＮＡ及びセイヨウアブラナＷＯＳＲ Ｄａｒｍｏｒから単離したゲノムＤＮＡについてのＡＦＬＰ解析により確認した（Vos et al., 1995, Nucleic Acids Research 23 (21): 4407-4414）。
実施例２−セイヨウアブラナからのＦＡＴＢ遺伝子配列の特性付け
シークエンシング後、ＦＡＴＢ配列のコード領域を、配列表において描写する通りに、FgeneSH（Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA）及びest2genome（Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16 (6): 276-277；Mott, 1997, Comput.Applic.13: 477-478）で決定した。
ブラッシカ・ラパ（ＡＡ）及びブラッシカ・オレラケア（ＣＣ）から単離した部分的ＦＡＴＢ配列を伴う異なるＦＡＴＢ配列のアラインメントは、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、及びＦＡＴＢ３配列がＡゲノムに、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、及びＦＡＴＢ６配列がＣゲノムに由来する。
イントロン配列を伴う、又は、伴わない異なるＦＡＴＢコード領域及びＦＡＴＢアミノ酸配列のマルチウェイ・アラインメント（Align Plus program - Scientific & Educational Software, USA；以下のデフォルトパラメーターを使用して：ミスマッチペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、伸長ギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１；ヌクレオチドについて、使用するデフォルト・スコアリング・マトリックスは標準線形であり、タンパク質については、デフォルト・スコアリング・マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である）は、ＦＡＴＢ１及びＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ２及びＦＡＴＢ５、ならびにＦＡＴＢ３及びＦＡＴＢ６が、他のＦＡＴＢ遺伝子よりも互いにより関連していることを示し、それらが相同遺伝子であることを示す。
これらの分析に基づき、配列ＦＡＴＢ１〜ＦＡＴＢ６はＦＡＴＢ−Ａ１、ＦＡＴＢ−Ａ２、ＦＡＴＢ−Ａ３、ＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ｃ３にそれぞれ名前を変更し、この命名は明細書を通じて使用する。ＷＯＳＲ及びＳＯＳＲセイヨウアブラナ遺伝子のタンパク質及び核酸配列の両方を本明細書において提供する。
ＷＯＳＲ配列
ゲノム配列、即ち、ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓのイントロン配列を含む、ＦＡＴＢ−Ａ１からＦＡＴＢ−Ａ３及びＦＡＴＢ−Ｃ１からＦＡＴＢ−Ｃ３のタンパク質コード領域をそれぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１において表わす。コード化されるこれらの核酸配列により、ＦＡＴＢ−Ａ１からＦＡＴＢ−Ａ３及びＦＡＴＢ−Ｃ１からＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質配列をそれぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２において描写する。
ＳＯＳＲ配列
ゲノム配列、即ち、ＳＯＳＲのイントロン配列を含む、ＦＡＴＢ−Ａ１からＦＡＴＢ−Ａ３及びＦＡＴＢ−Ｃ１からＦＡＴＢ−Ｃ３のタンパク質コード領域をそれぞれ配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、及び配列番号２３において表わす。コード化されるこれらの核酸配列により、ＦＡＴＢ−Ａ１からＦＡＴＢ−Ａ３及びＦＡＴＢ−Ｃ１からＦＡＴＢ−Ｃ３タンパク質配列をそれぞれ配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号２４において描写する。
表１５は、イントロンを伴う、及び、伴わない、ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（表１５ａ）及びＳＯＳＲ（表１５ｂ）の異なるＦＡＴＢコード領域の間のパーセント（ヌクレオチド）配列同一性を示し、相同なＦＡＴＢ−Ａ１とＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ａ２とＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ａ３とＦＡＴＢ−Ｃ３の間のより高度の関連性（下線を引いた値を参照のこと）を示し、異なるＦＡＴＢ遺伝子がイントロン配列においてよりエクソンにおいてより保存されていることを示す。
Figure 0005677839
Figure 0005677839
以下の表１６は、ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｗ）及びＳＯＳＲ（Ｓ）から得られる異なるＦＡＴＢコード領域（イントロン配列を伴う／伴わない）の間のパーセント（ヌクレオチド）配列同一性を示し、相同なＦＡＴＢ−Ａ１とＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ａ２とＦＡＴ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ａ３とＦＡＴＢ−Ｃ３の間のより高度な関連性が、異なるセイヨウアブラナ品種又は育種系統の間で保存され（下線を引いた値を参照のこと）、即ち、相同なＦＡＴＢ−Ａ１とＦＡＴＢ−Ｃ１の間、例えば、異なる品種からの配列の間での配列同一性のパーセントが、同じ品種のこれらのＦＡＴＢ遺伝子と他のＦＡＴＢ遺伝子の間のパーセント配列同一性よりも高い。
また、同じ遺伝子のＷＯＳＲとＳＯＳＲ対立遺伝子の間の高いパーセント配列同一性が存在することが分かり（例、ＷＯＳＲからのＦＡＴＢ−Ａ１及びＳＯＳＲからのＦＡＴＢ−Ａ１；太字の値を参照のこと）、セイヨウアブラナ品種及び育種系統がそれらのゲノム中に密接に関連したＦＡＴＢ対立遺伝子を有することを示す。
Figure 0005677839
表１７ａ及び１７ｂは、ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（表１７ａ）及びＳＯＳＲ（表１７ｂ）の異なるＦＡＴＢアミノ酸配列の間のパーセント（アミノ酸）配列同一性を示す。
Figure 0005677839
Figure 0005677839
表１８は、ＷＯＳＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｗ）及びＳＯＳＲ（Ｓ）の異なるＦＡＴＢアミノ酸配列の間のパーセント（アミノ酸）配列同一性を示す。パーセント配列同一性は、ＦＡＴＢ−Ａ１とＦＡＴＢ−Ｃ１、ＦＡＴＢ−Ａ２とＦＡＴＢ−Ｃ２、及びＦＡＴＢ−Ａ３とＦＡＴＢ−Ｃ３が相同遺伝子であること（下線を引いた値を参照のこと）、及び、これらのホモログの間のより高度の関連性が異なる品種の間で保存されていることを示す。
また、同じＦＡＴＢ遺伝子のＷＯＳＲ及びＳＯＳＲタンパク質の間の高いパーセント配列同一性が存在することが分かり（例、ＷＯＳＲからのＦＡＴＢ−Ａ１及びＳＯＳＲからのＦＡＴＢ−Ａ１；太字の値を参照のこと）、セイヨウアブラナ品種及び育種系統がそれらのゲノム中に密接に関連したＦＡＴＢ対立遺伝子を有し、同じ、又は、高度に類似したタンパク質をコード化することを示す。
Figure 0005677839
実施例３−アブラナ属ＦＡＴＢ遺伝子の発現
異なる組織中の異なるＦＡＴＢ遺伝子の発現を解析するために、各ＦＡＴＢ遺伝子に特異的な半定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、様々なアブラナ属植物組織から単離した全ＲＮＡで実施した：
鋳型：
− 製造業者の指示に従って、RNeasy Plant Minikit（Qiagen）による、葉、根、未開花の花芽及び頂部、子葉、種子を伴う、及び、伴わない開花後１１日目の鞘及びこれらの鞘の種子、開花後２１及び３４日目の鞘の種子及びセイヨウアブラナＳＯＳＲのカルスから単離された、一連の増加量、即ち、０．１ng、１ng、１０ng、及び１００ngの全ＲＮＡ。
− ＣＴＡＢ方法（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19: 11-15）に従って、セイヨウアブラナＳＯＳＲの葉組織から単離された、一連の増加量、即ち、０．１ng、１ng、及び１０ngのゲノムＤＮＡ。
標的ＦＡＴＢ遺伝子から増幅されたフラグメントのプライマー及び長さ：
− ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（配列番号１３）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＣＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号３１）
リバース：５’−ＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号３２）
→ＦＡＴＢ−Ａ１ ＲＮＡ鋳型についての９５７bp及び
→ＦＡＴＢ−Ａ１ゲノムＤＮＡ鋳型についての１２７５bp
− ＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子（配列番号１５）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号３３）
リバース：５’−ＧＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号３４）→ＦＡＴＢ−Ａ２ ＲＮＡ鋳型についての９５６bp及び
→ＦＡＴＢ−Ａ２ゲノムＤＮＡ鋳型についての１３４０bp
− ＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子（配列番号１７）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣ−３’（配列番号３５）
リバース：５’−ＣＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣ−３’（配列番号３６）→ＦＡＴＢ−Ａ３ ＲＮＡ鋳型についての９００bp及び
→ＦＡＴＢ−Ａ３ゲノムＤＮＡ鋳型についての１３６７bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子（配列番号１９）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号３７）
リバース：５’−ＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧ−３’（配列番号３８／６７）
→ＦＡＴＢ−Ｃ１ ＲＮＡ鋳型についての９２６bp及び
→ＦＡＴＢ−Ｃ１ゲノムＤＮＡ鋳型についての１２５９bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子（配列番号２１）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣ−３’（配列番号３９）
リバース：５’−ＧＣＡＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４０）→ＦＡＴＢ−Ｃ２ ＲＮＡ鋳型についての５００bp及び
→ＦＡＴＢ−Ｃ２ゲノムＤＮＡ鋳型についての９３７bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子（配列番号２３）の発現を決定するため：
フォワード：５’−ＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号４１）
リバース：５’−ＣＧＡＡＣＡＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号４２）→ＦＡＴＢ−Ｃ３ ＲＮＡ鋳型についての５８２bp及び
→ＦＡＴＢ−Ｃ３ゲノムＤＮＡ鋳型についての１１５１bp
ＰＣＲミックス：
− ＲＮＡ（Platinum（登録商標） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を伴うSuperscript（商標）III One-Step RT-PCR Systemで調製）でのＲＴ−ＰＣＲ用：１２．５μl ２×反応ミックス、１μl Superscript（商標）III／Platinum（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９．５μl Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ、１μl ＲＮＡ（０．１ng/μl、１ng/μl、１０ng/μl、及び１００ng/μl）、０．５μlフォワードプライマー（２０μM）、０．５μlリバースプライマー（２０μM））＝全容積２５μl；
− ゲノムＤＮＡでのＰＣＲ用：１２．５μl ２×反応ミックス、０．２μl Platinum（登録商標） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５ U/μl；Invitrogen）、０．５μlフォワードプライマー（２０μM）、０．５μlリバースプライマー（２０μM）、１μl ＤＮＡ（０．１ng/μl、１ng/μl、及び１０ng/μl）、１０．３μl Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ＝全容積２５μl；
熱サイクルプロファイル：５５℃で３０分間（ｃＤＮＡ合成）、９４℃で２分間；３０×［９４℃で１５秒間（変性）及び５７℃で３０秒間（アニーリング）及び６８℃で２分間（伸長）］；６８℃で５分間；１０℃に冷却。
増幅後、５μlの添加色素（２．５ml ０．１%ブロモフェノール・ブルー、２．５ml ０．１%キシレンシアノール、５mlグリセロール、５０μl ０．５M ＥＤＴＡ ｐＨ ８）をＰＣＲサンプルに加え、１５μlのサンプルを、適当な分子量マーカー（１Kb DNA Ladder、GibcoBRL（登録商標） Life Technologies）と共に、エチジウムブロマイドを含む１% ＴＡＥ（１０×（４００mM Ｔｒｉｓ−酢酸 ＋ １００mM ＥＤＴＡ）；Invitrogen（登録商標））アガロース（Roche（登録商標））ゲルに添加した。
ＦＡＴＢ遺伝子特異的プライマーでの、セイヨウアブラナＳＯＳＲの異なる組織からの全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの増幅後に得られるバンドパターンを以下の通りに評価した：− 単一のＲＴ−ＰＣＲ実行及び単一のＲＴ−ＰＣＲミック内でのＲＮＡサンプルからのデータは、一連の増加量のゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡからそれぞれ増幅されるＰＣＲ産物及びＲＴ−ＰＣＲ産物（存在する場合、ＲＴ−ＰＣＲ産物の場合；以下を参照のこと）が、標的ＦＡＴＢ遺伝子について予測されるフラグメント長（上に示す）を示さず、それぞれ増加量の鋳型ＤＮＡ及びＲＮＡに比例する量において増大しなかった場合、許容されなかった。
− 予測されるサイズの特定の標的ＦＡＴＢ遺伝子について一連の増加量の全ＲＮＡから増幅されるＲＴ−ＰＣＲ産物を含まないレーンは、特定の標的ＦＡＴＢ遺伝子が、鋳型ＲＮＡが調製された対応する組織において発現されない、又は、非常に低レベルで発現されることを示す。
− 予測されるサイズの特定の標的ＦＡＴＢ遺伝子について一連の増加量の全ＲＮＡから増幅されるＲＴ−ＰＣＲ産物を含むレーンは、特定の標的ＦＡＴＢ遺伝子が、鋳型ＲＮＡが調製された対応する組織において発現されることを示す。
特定の組織における各ＦＡＴＢ遺伝子の発現レベルを、その特定の組織における他のＦＡＴＢ遺伝子の発現レベルと比べて決定するために、ＦＡＴＢ ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動ゲル上で観察されたバンドの強度（ＤＮＡのエチジウムブロマイド染色に起因し、ＵＶ光の下で観察される）を、一連の増加量のゲノムＤＮＡから増幅されるＦＡＴＢ ＰＣＲ産物の電気泳動ゲル上で観察されるバンドの強度と比較した。
結果
全てのＦＡＴＢ遺伝子が、解析した全ての組織において発現された（＋表１９において）。１１、２１、及び３４日目の鞘の葉及び種子における各ＦＡＴＢ遺伝子の発現レベル（１０ngのＲＮＡに基づく）は、ＦＡＴＢ遺伝子特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物（上で説明する）のバンド強度と同程度のバンド強度を生成するゲノムＤＮＡの量（ng）として表わし、表２０において角括弧の間に示す。
Figure 0005677839
種子中の各ＦＡＴＢ遺伝子の発現の時期（開花後１１、２１、及び３４日目）及びレベル（１０ngのＲＮＡに基づく）は、ＦＡＴＢ遺伝子特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物（上で説明する）のバンド強度と同程度のバンド強度を生成するゲノムＤＮＡの量（ng）として表わし、図１において示す。
実施例４−突然変異アブラナ属ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）の生成及び単離
実施例１において同定したＦＡＴＢ遺伝子中の突然変異は、下に記載する、以下のアプローチを使用して、生成及び同定した。セクション４．１において、１つ又は複数の欠失を含む、即ち、ｆａｔＢ対立遺伝子（「欠失突然変異」）の部分又は全体を欠く、ｆａｔＢ対立遺伝子の生成を記載する。セクション４．２において、終止コドン突然変異（「ナンセンス突然変異体」）及び／又は１つ又は複数のスプライス部位突然変異を含むｆａｔＢ対立遺伝子の生成及び単離を記載する。
４．１ ｆａｔＢ欠失突然変異体の生成及びスクリーニング
− セイヨウアブラナＳＯＳＲからの種子（野生型、「Ｍ０」種子と呼ぶ）を、当技術分野において記載される高速中性子突然変異誘発アプローチを使用して突然変異誘発し、突然変異種子集団を生成する（「Ｍ１」種子と呼ぶ）。
− ６０．０００のＭ１植物を生育し、自家受粉した。結果として得られるＭ２種子を、各々の個々のＭ１植物について収集した。
− 異なるＭ１植物に由来する１０００のＭ２植物を生育し、ＤＮＡサンプルを、ＣＴＡＢ方法（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19: 11-15）に従って各々の個々のＭ２植物の葉サンプルから調製した。Ｍ２植物を自家受粉して、Ｍ３種子を得た。− ＤＮＡサンプルの濃度を、実施例１において記載する通りに、評価した。１．７μgのゲノムＤＮＡを、以下の条件下で、最終反応容積２０μl中で、制限酵素ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶで消化した（New England Biolabs（登録商標）からの酵素及びバッファー）：
− ＡｓｅＩ消化：１７μl ＤＮＡ（１００ng/μl）、１μl ＡｓｅＩ（１０U/μl）、２μl ＮＥＢ３バッファー。
− ＥｃｏＲＶ消化：１７μl ＤＮＡ（１００ng/μl）、１μl ＥｃｏＲＩ（１０U/μl）、２μl ＮＥＢ３バッファー、０．２μl １００×ウシ血清アルブミンを３７℃で一晩、又は、３７℃で４時間インキュベーした。
− 消化後、ＲＮａｓｅを含む２μlの添加色素（１２．５ml １%キシレンシアノールＦＦ；１２．５ml １%ブロモフェノール・ブルー水溶性指示薬；２５ｍｌグリセロール；１００μl ０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８；１μl ＲＮａｓｅ（１０mg/ml））を、消化したＤＮＡサンプルに加えて、サンプルは３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを１% ＴＡＥ（Invitrogen（登録商標））アガロースゲルに添加した。制限酵素ＰｓｔＩで消化したPhage Lambda DNA（Fermentas（登録商標））（２９のフラグメント（ｂｐ）を生成する：
Figure 0005677839
−イタリックのフラグメントは標準的な電気泳動において目に見えない）がサイズスタンダードとして含まれた。
− 電気泳動後、ＤＮＡサンプル（消化したゲノムＤＮＡ）を、乾燥アルカリキャピラリーブロッティングにより、ナイロンメンブレン（Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech（登録商標））にトランスファーする。消化したゲノムＤＮＡを伴うナイロンメンブレンを、ゲノムＤＮＡについて実施例１において記載する通りに、５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ（配列番号２５）での標準的なサザンブロット手順によりスクリーニングした。ゲノムＤＮＡについてKodak XOMAT ARフィルムを放射活性のあるブロットに−７０℃で２日間暴露させた。
結果
Ｍ２アブラナ属植物のゲノムＤＮＡのＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶでの消化及び５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ（配列番号２５）でのハイブリダイゼーション後に得られるハイブリダイゼーションパターンを、野生型アブラナ属ＳＯＳＲ植物のゲノムＤＮＡのＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶでの消化及び５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ（配列番号２５）でのハイブリダイゼーション後に得られるハイブリダイゼーションパターンと比較した（表２１）。ハイブリダイズするＤＮＡフラグメントと異なるＦＡＴＢ遺伝子の間の対応を決定するために、後者のハイブリダイゼーションパターンを、実施例１において同定した、ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、そして、５’ Ａｔ ＦＡＴＢ１プローブ（配列番号２５）にハイブリダイズしたＦＡＴＢ遺伝子の１つの全長配列を伴うＢＡＣクローンＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンと比較した（上の表１４を参照のこと）。
Figure 0005677839
表２１において示すハイブリダイズするＤＮＡフラグメントの１つの非存在は、完全なＦＡＴＢ対立遺伝子が、突然変異誘発された植物において、高速中性子突然変異誘発アプローチで欠失されたことを示す。
このようにして同定したｆａｔＢ欠失を含むホモ接合Ｍ２アブラナ属植物及び欠損したハイブリダイズするＤＮＡフラグメントを表２２において示す。
Figure 0005677839
ホモ接合Ｍ２アブラナ属植物における特定のＦＡＴＢ対立遺伝子の非存在は、以下のＰＣＲアッセイにより確認した：
− 鋳型ＤＮＡ：
− 特定のＦＡＴＢ遺伝子（「ＦＡＴＢｘ」）における欠失、又は、特定のＦＡＴＢ対立遺伝子の欠失を含むように同定したＭ２アブラナ属植物の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
− 陽性コントロール：ＦＡＴＢｘ遺伝子のＢＡＣクローンＤＮＡ（この陽性コントロールの増幅の成功は、ＰＣＲが、特定の標的ＦＡＴＢｘ配列の増幅を可能にする条件下で行われたことを実証する）。
− 陰性コントロール：ＦＡＴＢｘ遺伝子とは異なるＦＡＴＢ遺伝子のＢＡＣクローンＤＮＡ（予測される結果、即ち、特定のＦＡＴＢｘ ＰＣＲ産物の増幅が観察される場合、これは、他のＦＡＴＢ遺伝子の検出可能なバックグラウンドの増幅が存在しないことを示す）。
− 野生型ＤＮＡコントロール：これは、提供される鋳型ＤＮＡが、ＦＡＴＢｘ遺伝子の欠失を伴わないＭ２アブラナ属植物から調製されるゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果、即ち、特定のＦＡＴＢｘ ＰＣＲ産物の増幅のみが観察される場合、これは、ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、例えば、他のＦＡＴＢ遺伝子の検出可能なバックグラウンドの増幅が存在しないことを示す。
− 野生型標的ＦＡＴＢｘ遺伝子から増幅されたフラグメント（「ＦＡＴＢｘ特異的ＰＣＲフラグメント」）のプライマー及び長さ：
− ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子（配列番号１３）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ａ１遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＣＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号３１）
リバース：５’−ＣＡＧＴＣＴＴＡＡＣＡＴＧＧＴＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４３）
→４０３bp
− ＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子（配列番号１５）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ａ２遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧ−３’（配列番号４４）
リバース：５’−ＴＡＴＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４５）
→５１３bp
− ＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子（配列番号１７）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ａ３遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣ−３’（配列番号３５）
リバース：５’−ＴＴＣＴＴＣＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴ−３’（配列番号４６）
→４８７bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子（配列番号１９）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ｃ１遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号３７）
リバース：５’−ＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号４７）
→３６７bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子（配列番号２１）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ｃ２遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣ−３’（配列番号３９）
リバース：５’−ＴＡＡＣＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号４８）
→３９７bp
− ＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子（配列番号２３）における欠失、又は、ＦＡＴＢ−Ｃ３遺伝子の欠失の存在を確認するため：
フォワード：５’−ＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号４１）
リバース：５’−ＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４９）
→１０３５bp
− ＰＣＲミックス：２．５μl １０×ＰＣＲバッファー、０．２５μl ｄＮＴＰｓ（２０μM）、０．５μlフォワードプライマー（１０μM）、０．５μlリバースプライマー（１０μM）、０．２５μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）、２０μl Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ、１μl ＤＮＡ（５０ng/μl）＝全容積２５μl；
− 熱サイクルプロファイル：９４℃で４分間；２５×［９４℃で１分間（変性）及び５７℃で１分間（アニーリング）及び７２℃で２分間（伸長）］；７２℃で５分間；４℃に冷却。
− 増幅後、５μlの添加色素（２．５ml ０．１%ブロモフェノール・ブルー、２．５ml ０．１%キシレンシアノール、５mlグリセロール、５０μl ０．５M ＥＤＴＡ ｐＨ ８）をＰＣＲサンプルに加え、サンプルを、適当な分子量マーカー（１００bp ＤＮＡマーカー、Invitrogen（登録商標））と共に、１% ＴＡＥ（１０×（４００mM Ｔｒｉｓ−酢酸 ＋ １００mM ＥＤＴＡ）；Invitrogen（登録商標））アガロース（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））ゲルに添加した。
− ＦＡＴＢｘ特異的プライマーでの、Ｍ２アブラナ属植物のゲノムＤＮＡの増幅後に得られるバンドパターンを以下の通りに評価した：
− 単一のＰＣＲ実行及び単一のＰＣＲミックス内において、ＦＡＴＢｘ遺伝子においての欠失、又は、ＦＡＴＢｘ遺伝子の欠失突然変異を含むように同定したＭ２アブラナ属植物の葉材料から単離したＤＮＡサンプルからのデータが、以下でない場合、許容すべきではない：
− 陰性コントロールがＰＣＲ増幅について陰性である（フラグメントなし）、
− 陽性コントロールが予測されるＰＣＲ産物（特定のＦＡＴＢｘフラグメント）を示す、
− 野生型ＤＮＡコントロールが予測される結果（特定のＦＡＴＢｘフラグメントのみ）を示す。
− 予測されるサイズの特定のＦＡＴＢｘ遺伝子についてＰＣＲ産物を示さないレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、特定のＦＡＴＢｘ遺伝子においての欠失、又は、特定のＦＡＴＢｘ遺伝子の欠失を含むことを示す。
− 予測されるサイズの特定のＦＡＴＢｘ遺伝子についてＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、ＦＡＴＢｘ遺伝子において、又は、ＦＡＴＢｘ遺伝子の欠失を含まないことを示す。
ホモ接合Ｍ２植物Ｎｏ．ＬＯＳＡ０１８がＦＡＴＢ−Ａ１の欠失を含み、ホモ接合Ｍ２植物Ｎｒｓ．ＬＯＳＡ００２、３、５がＦＡＴＢ−Ａ２の欠失を含み、そして、ホモ接合Ｍ２植物Ｎｒ．ＬＯＳＡ００４がＦＡＴＢ−Ｃ２の欠失を含むことが確認された。
４．２ １つ又は複数の点突然変異を含むＦＡＴＢ対立遺伝子の生成及び単離
− セイヨウアブラナＳＯＳＲからの３０，０００の種子（Ｍ０種子）を、脱イオン水又は蒸留水中の湿ったろ紙上に２時間事前に吸収させた。種子の半分を０．８% ＥＭＳに、半分を１% ＥＭＳ（Sigma：Ｍ０８８０）に暴露させ、４時間インキュベートした。
− 突然変異誘発した種子（Ｍ１種子）を３回リンスし、ドラフト中で一晩乾燥させた。３０，０００のＭ１植物を土壌中で生育させ、自家受粉させて、Ｍ２種子を生成した。Ｍ２種子を、各々の個々のＭ１植物について収集した。
− ２回、異なるＭ１植物に由来する４８００のＭ２植物を生育し、ＤＮＡサンプルを、ＣＴＡＢ方法（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19: 11-15）に従って各々の個々のＭ２植物の葉サンプルから調製した。Ｍ２植物を自家受粉して、Ｍ３種子を得た。
− ＤＮＡサンプルを、終止コドンの導入又はスプライス部位の突然変異を起こすＦＡＴＢ遺伝子中の点突然変異の存在について、標準技術（Agowa）及びNovoSNPソフトウェア（VIB Antwerp）を使用した点突然変異の存在について配列を分析することによりスクリーニングした。
− 以下の突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）をこのように同定した：
Figure 0005677839
（１）ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５、ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４、及びＦＡＴＢ−Ｃ３ＥＭＳ０２を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５８４と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６８で寄託した。
（２）ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６、ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５、及びＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５７２と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６７で寄託した。
（３）ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５、及びＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５５３と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６６で寄託した。
Figure 0005677839
（１）ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５、ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４、及びＦＡＴＢ−Ｃ３ＥＭＳ０２を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５８４と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６８で寄託した。
結論として、上の実施例は、どのようにして突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子が生成及び単離できるかを示す。また、そのような突然変異対立遺伝子を含む植物材料を使用して、以下の実施例において記載する通りに、植物において所望の突然変異体及び／又は野生型対立遺伝子を組み合わせることができる。
実施例５−突然変異アブラナ属ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むアブラナ属植物の同定
実施例５において同定したＦＡＴＢ遺伝子中に突然変異を含むアブラナ属植物を、以下の通りに同定した：
５．１． ＦＡＴＢ対立遺伝子の欠失を含むアブラナ属植物の同定
− ＦＡＴＢ遺伝子の欠失を含むように同定した各ホモ接合Ｍ２植物について、Ｍ３植物を生育し、そして、ＤＮＡサンプルを各々の個々のＭ３植物の葉サンプルから調製した。− 各々の個々のＭ３植物の各ＤＮＡサンプルで、欠失突然変異（実施例４．１において記載する）を含むように同定したＦＡＴＢ遺伝子に特異的なＰＣＲアッセイを実施した。− 同定した突然変異を含むホモ接合Ｍ３植物を自家受粉し、Ｍ４種子を収集した。
５．２． ＦＡＴＢ遺伝子中に点突然変異を含むアブラナ属植物の同定
− Ｍ２植物のＤＮＡサンプルにおいて同定された各突然変異ＦＡＴＢ遺伝子について、ＦＡＴＢ突然変異を含むＭ２植物と同じＭ１植物に由来する５０のＭ２植物を生育し、そして、ＤＮＡサンプルを各々の個々のＭ２植物の葉サンプルから調製した。
− ＤＮＡサンプルを、実施例４．２において上に記載する通りに、同定した点ＦＡＴＢ突然変異の存在についてスクリーニングした。
− 同じ突然変異を含むヘテロ接合及びホモ接合（電気泳動に基づき決定）Ｍ２植物を自家受粉し、Ｍ３種子を収集した。
実施例６−突然変異アブラナ属ｆａｔＢ遺伝子を含むアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の分析
アブラナ属植物の突然変異ＦＡＴＢ遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係を決定するために、突然変異ＦＡＴＢ遺伝子を含むアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成物を、以下の通りに、種子から脂肪酸アシルを抽出し、そして、キャピラリーガス液体クロマトグラフィーにより種子油中のそれらの相対レベルを分析することにより分析した：
− 種子サンプルを乾燥し、重さを量った。０．８gの種子をプラスチックバイアルに入れた。鉄製粉砕ロッドを各バイアルに加えた。このバイアルを次にメチル化溶液（５００mlメタノール中の１０gナトリウムメトキシド）及び０．８ml石油エーテルで満たす。キャップしたバイアルをエーベルバッハシェイカーで３０分間振盪した。１mlの脱イオン水を、再びキャップし、振盪する前に、各バイアルに加えた。バイアルを３５００rpmで５分間遠心分離した。
− 各サンプルからの２５−５０μl石油エーテル層を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）オートサンプラーバイアル中に移した。１００μl ０．４Mリン酸バッファー及び８００μl石油エーテルを、それらを振盪する前に、各バイアルに加えた。サンプルの０．４から０．６μlの石油エーテル層を、分析のためにガスクロマトグラフに注入した。ガスクロマトグラフからのプリントアウトを分析し、そして、各脂肪酸の含量を算出する。
６．１． アブラナ属植物における１つの突然変異アブラナ属ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とそれらのアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係
アブラナ属植物におけるホモ接合及び／又はヘテロ接合状態の１つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係を決定するために、実施例５．１において同定したアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成を上に記載した通りに分析した。
種子油の脂肪酸組成、特に全飽和脂肪酸（即ち、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸のレベル）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）及びステアリン酸（Ｃ１８：０）における有意差は、野生型植物の種子油の脂肪酸組成と比較し、ホモ接合の単一突然変異植物について観察されなかった（表２４を参照のこと）。
表２４：ホモ接合状態の１つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（即ち、表２２において示すＦＡＴＢ−ＡＸ−ＦＮＹ又はＦＡＴＢ−ＣＸ−ＦＮＹ対立遺伝子、カラム２において「ａＸ−ｆｎＹ」及び「ｃＸ−ｆｎＹ」と呼ぶ；野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ＡＸ」及び「ＣＸ」と呼ぶ）を含むアブラナ属植物の種子油中の全飽和脂肪酸（即ち、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０脂肪酸；「ｓａｔｓ」）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）及びステアリン酸（Ｃ１８：０）（脂肪酸の総量に基づく重量パーセント）のレベル
Figure 0005677839
６．２． アブラナ属植物における１つから４つの突然変異アブラナ属ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とそれらのアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係
アブラナ属植物におけるホモ接合及び／又はヘテロ接合状態の１つから４つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係を決定するために、実施例５．２において同定したアブラナ属植物、又は突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むその子孫を互いに交配し、そして、個々の子孫アブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成を上に記載の通りに分析した。
表２５及び図８は、平均全飽和脂肪酸レベルが野生型植物において８．２４から１０．５２%、ホモ接合性単一突然変異ＦＡＴＢ植物において６．５３から１２．１２%、ホモ接合性二重突然変異ＦＡＴＢ植物において６．４７から１０．０１%、ホモ接合性三重突然変異ＦＡＴＢ植物において５．６８から８．４３%、及びホモ接合性四重突然変異ＦＡＴＢ植物において５．７２から７．７%に及ぶことを示す。表２５及び図８は、ＦＡＴＢ−Ａ２及びＦＡＴＢ−Ｃ２などの特定のＦＡＴＢ遺伝子における突然変異が、他のＦＡＴＢ遺伝子における突然変異よりも飽和脂肪酸のレベルにより強い影響を有意することをさらに示す。
分析した植物はグリーンハウスにおいて生育した。野外において生育する野生型植物からの種子油の平均全飽和脂肪酸レベルは、典型的に、グリーンハウスで生育させた植物について観察される８．２４から１０．５２%の代わりに、約６．５%と７．５%の間であるため、野外において生育した突然変異植物からの種子油の全飽和脂肪酸レベルがより低いことが予測される。突然変異植物を野外において生育し、種子油の脂肪酸組成を決定する。
表２５：ホモ接合状態の少なくとも１つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（即ち、表２３において示すＦＡＴＢ−ＡＸ−ＥＭＳＹ又はＦＡＴＢ−ＣＸ−ＥＭＳＹ対立遺伝子、カラム１において「ａＸ−ｅｍｓＹ」及び「ｃＸ−ｅｍｓＹ」、及び、カラム２において「ａＸ」及び「ｅＸ」と呼ぶ；野生型ＦＡＴＢ対立遺伝子は「ＡＸ」及び「ＣＸ」と呼ぶ）を含むアブラナ属植物の種子油中の全飽和脂肪酸（即ち、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０脂肪酸；「ｓａｔｓ」）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）及びステアリン酸（Ｃ１８：０）（脂肪酸の総量に基づく重量パーセント）のレベル。
Figure 0005677839
Figure 0005677839
（１）ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５、ＦＡＴＢ−Ａ３−ＥＭＳ０１、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０４、及びＦＡＴＢ−Ｃ３ＥＭＳ０２を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５８４と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６８で寄託した。
（２）ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６、ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０１、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５、及びＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０３を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５７２と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６７で寄託した。
（３）ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５、ＦＡＴＢ−Ｃ１−ＥＭＳ０５、及びＦＡＴＢ−Ｃ２−ＥＭＳ０２を含む種子（０８ＭＢＢＮ０００５５３と命名）を、NCIMB Limited（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK）に、２００８年６月２７日に受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６６で寄託した。
６．３． アブラナ属植物におけるホモ接合及び／又はヘテロ接合状態の５つから６つの突然変異アブラナ属ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とそれらのアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係
アブラナ属植物におけるホモ接合及び／又はヘテロ接合状態の５つから６つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の存在とアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成の間の相関関係を決定するために、実施例５．２において同定したアブラナ属植物、又は突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含むその子孫を互いに交配し、そして、子孫のアブラナ属植物の種子油の脂肪酸組成を上に記載の通りに分析した。
実施例７−（優良）アブラナ属系統への突然変異ＦＡＴＢ遺伝子の移入
突然変異ＦＡＴＢ遺伝子を、以下の方法により、（優良）アブラナ属育種系統中に移入する：
突然変異ＦＡＴＢ遺伝子を含む植物（ドナー植物）を、（優良）アブラナ属系統（優良親／反復（recurrent）親）又は突然変異ＦＡＴＢ遺伝子を欠く品種と交配する。以下の遺伝子移入計画を使用する（突然変異ＦＡＴＢ遺伝子をｆａｔＢと省略し、野生型をＦＡＴＢと描写する）：
初回交配：ｆａｔＢ／ｆａｔＢ（ドナー植物）× ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ（優良親）
Ｆ１植物：ＦＡＴＢ／ｆａｔ
ＢＣ１交配：ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ × ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ（反復親）
ＢＣ１植物：５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ及び５０% ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ
５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢを、例えば、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）についてのＡＦＬＰ又はＰＣＲマーカーを使用して選択する。
ＢＣ２交配：ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ（ＢＣ１植物）× ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ（反復親）
ＢＣ２植物：５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ及び５０% ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ
５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢを、例えば、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）についてのＡＦＬＰ又はＰＣＲマーカーを使用して選択する。
戻し交配を、ＢＣ３からＢＣ６まで反復する。
ＢＣ６植物：５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ及び５０% ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ
５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢを、例えば、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）についてのＡＦＬＰ又はＰＣＲマーカーを使用して選択する。
ＢＣ６ Ｓ１交配：ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ × ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ
ＢＣ６ Ｓ１植物：２５% ＦＡＴＢ／ＦＡＴＢ及び５０% ＦＡＴＢ／ｆａｔＢ及び２５% ｆａｔＢ／ｆａｔＢ
ｆａｔＢを含む植物を、例えば、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子（ｆａｔＢ）についてのＡＦＬＰ又はＰＣＲマーカーを使用して選択する。
突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子についてホモ接合である個々のＢＣ６ Ｓ１植物（ｆａｔＢ／ｆａｔＢ）、例えば、突然変異及び野生型対立遺伝子についてのＡＦＬＰ又はＰＣＲマーカーを使用して選択する。
これらの植物を次に種子の産生のために使用する。
ＦＡＴＢ対立遺伝子の欠失を含む植物を選択するために、実施例４．１において記載するものなどのハイブリダイゼーションアッセイ又はＰＣＲアッセイを使用できる。
ＦＡＴＢ対立遺伝子において点突然変異を含む植物を選択するために、実施例４．２において記載するものなど、当技術分野において公知の標準的シークエンシング技術による直接シークエンシングを使用できる。あるいは、ＰＣＲアッセイを開発して、ＦＡＴＢ対立遺伝子において特定の点突然変異を含む植物を、その特定の点突然変異を含まない植物から識別できる。以下の識別ＰＣＲアッセイをこのように開発し、実施例４．２において同定した突然変異対立遺伝子の有無及び接合状態を検出した（表２３を参照のこと）：
− 鋳型ＤＮＡ：
− ホモ接合又はヘテロ接合突然変異アブラナ属植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ（突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子を含み、以下「ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ」と呼ぶ）。− 野生型ＤＮＡコントロール：野生型アブラナ属植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ（突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の野生型の等価物を含み、以下「ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ」と呼ぶ）。
− 陽性ＤＮＡコントロール：ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸを含むことが知られているホモ接合突然変異アブラナ属植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ。
− 突然変異及び対応する野生型標的ＦＡＴＢ遺伝子から増幅したフラグメントのプライマー及び長さを表２６において示す。各プライマーの組は、突然変異及び野生型標的遺伝子に特異的な１つのプライマー（例、プライマーＬＯＳＡ１０４Ｒ５はＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６及びＦＡＴＢ−Ａ１−ＷＴに特異的である）及びヌクレオチド差に特異的な１つのプライマー（例、プライマーＬＯＳＡ１０５ＭＦ１はＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０６に特異的であり、及び、プライマーＬＯＳＡ１０５ＷＦ１はＦＡＴＢ−Ａ１−ＷＴに特異的である）からなる。通常、後者のプライマーの最後のヌクレオチドは、ヌクレオチド差とマッチするが（表２６の下線を引いたヌクレオチド）、しかし、１つ（又は複数の）追加の標的特異的ヌクレオチドを加えて、プライマーとその標的配列の間のアニーリングを改善しうる（例、プライマーＬＯＳＡ１１２ＭＲ２の太字のヌクレオチドは、ＦＡＴＢ−Ａ２−ＷＴ対立遺伝子に特異的であるプライマーＬＯＳＡ１１２ＷＲ２と比較して、ＦＡＴＢ−Ａ２−ＥＭＳ０５対立遺伝子に特異的である）。
− ＰＣＲミックス：２．５μl １０×ＰＣＲバッファー（１５mM ＭｇＣｌ２）、０．２５μl ｄＮＴＰ’ｓ（２０mM）、１μlフォワードプライマー（１０μM）、１μlリバースプライマー（１０μM）、０．２５μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）、１９．５μl Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ、０．５μl ＤＮＡ（２０−５０ng/μl）＝全容積２５μl；
− 熱サイクルプロファイル：９５℃で４分間；３０×［９５℃で１分間（変性）及び表２６において定めるアニーリング温度で１分間及び７２℃で２分間（伸長）］；７２℃で５分間；４℃に冷却。最適なアニーリング温度は温度勾配ＰＣＲにより決定し、アニーリング温度はMJ Research Thermocycler PTC-200（Biozym）で５７℃から７０℃の間で変動した。野生型ＦＡＴＢ特異的プライマーのための最適なアニーリング温度は、予測されるサイズの明らかなＰＣＲフラグメントが、野生型アブラナ属植物からのＤＮＡサンプルについて検出できる（以下に記載する）が、突然変異アブラナ属植物からのＤＮＡサンプルについてはできない温度である。突然変異ＦＡＴＢ特異的プライマーのための最適なアニーリング温度は、予測されるサイズの明らかなＰＣＲフラグメントが、突然変異アブラナ属植物からのＤＮＡサンプルについて検出できる（以下に記載する）が、野生型アブラナ属植物からのＤＮＡサンプルについてはできない温度である。
− 増幅後、５μlの添加色素（オレンジ色素）を１５μlのＰＣＲサンプルに加え、サンプルを１．５%アガロースゲルに添加した。
− 突然変異アブラナ属植物のゲノムＤＮＡの増幅後に得られるバンドパターンを以下の通りに評価した：
− 単一のＰＣＲ実行及び単一のＰＣＲミックス内において、突然変異アブラナ属植物の葉材料から単離したＤＮＡサンプルからのデータが、以下でない場合、許容すべきではない：
− 野生型ＤＮＡコントロールは、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズのＰＣＲフラグメントを示し、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズのＰＣＲフラグメントを示さない。
− 陽性ＤＮＡコントロールは、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズのＰＣＲフラグメントを示し、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズのＰＣＲフラグメントを示さない。
− ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズの特定のＰＣＲ産物を示さず、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズの特定のＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸについてホモ接合性突然変異であることを示す。
− ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイ及びＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズの特定のＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸについてヘテロ接合性突然変異であることを示す。
− ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズの特定のＰＣＲ産物を示し、ＦＡＴＢ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイについて予測されるサイズの特定のＰＣＲ産物を示さないレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、野生型植物であることを示す。
Figure 0005677839
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あるいは、Invader（商標）技術（Third Wave Agbio）を使用して、ＦＡＴＢ対立遺伝子において特定の点突然変異を含む植物を、特定の点突然変異を含まない植物から識別できる。以下の識別Invader（商標）プローブをこのように開発して、実施例４において同定した突然変異対立遺伝子の有無及び接合状態を検出できる（表２３ａ及びｂを参照のこと）：
− 突然変異（「ｆｌａｐ１」配列を結合することにより識別できる）又は対応する野生型（「ｆｌａｐ２」配列を結合することにより識別できる）標的ＦＡＴＢ遺伝子について特異的なプローブ及びそれらと併用できる「侵入（ｉｎｖａｄｉｎｇ）」プローブを開発する。一般的に、各プローブは、５’ ｆｌａｐ配列後の第１配列がヌクレオチド差（表２７中の下線を引いたヌクレオチド）とマッチする突然変異又は野生型標的遺伝子に特異的な１つのプローブ（いわゆる「一次プローブ」；例、配列番号８２を伴うプローブはＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５に特異的である）及びヌクレオチド差の上流のヌクレオチドに特異的な１つのプローブ（いわゆる「Invader（登録商標）オリゴ」；例、配列番号８１を伴うプローブは、ＦＡＴＢ−Ａ１−ＥＭＳ０５とＦＡＴＢ−Ａ１−ＷＴの間のヌクレオチド差の上流のヌクレオチドに特異的である）からなる。後者のプライマーの最後のヌクレオチドは、突然変異体におけるヌクレオチド差とマッチしうるが、しかし、他のヌクレオチドは、一次プローブ及びInvader（登録商標）オリゴが、標的ＤＮＡとハイブリダイズし、Cleavase（登録商標）酵素（Third Wave Agbio）により認識される特定の侵入構造を生成する場合、依然として単一塩基重複を形成できる限り、この最後のヌクレオチド（表２７において太字のヌクレオチドにより示す）について同様に使用できる。Invader（商標）アッセイ手順及びデータの解釈は、製造業者（Third Wave Agbio）により規定される通りに、実施される。簡単に説明すると、「ｆｌａｐ１」及び「ｆｌａｐ２」として示されるヌクレオチド配列は、Invader（商標）アッセイの一次段階において一次プローブから切断され、FRET（商標）カセット１及び２における配列とそれぞれ相補的であり、標的突然変異又は野生型配列と相補的ではない５’「ｆｌａｐ」の配列を表わす。一次プローブが一次段階において切断され、ｆｌａｐ１プローブ及び／又はｆｌａｐ２プローブが二次段階においてFRET（商標）カセット１及び２とそれぞれハイブリダイズする場合、サンプルにおける突然変異又は対応する野生型標的ＦＡＴＢ遺伝子の存在をそれぞれ示唆するシグナルが生成される。
− あるいは、突然変異標的ＦＡＴＢ遺伝子に特異的なプローブ（表２７において「５’ ｆｌａｐ１−ｘ」と示す）を、内部コントロール遺伝子に特異的なプローブ（表２７において「５’ ｆｌａｐ２−ｘ」と示す；コントロール遺伝子はＥＮＤＯ１と示す）と併用する。一次プローブが一次段階において切断され、ｆｌａｐ１プローブ及び／又はｆｌａｐ２プローブが二次段階においてFRET（商標）カセット１及び２とそれぞれハイブリダイズする場合、サンプルにおける突然変異標的ＦＡＴＢ遺伝子及び内因性コントロール遺伝子の存在をそれぞれ示唆するシグナルが生成される。FRET（商標）カセット２から生成されるシグナルの量と比べたFRET（商標）カセット１から生成されるシグナルの量に基づき、突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子の接合状態を決定できる（ホモ接合ＦＡＴＢ対立遺伝子は、ヘテロ接合ＦＡＴＢ対立遺伝子の２倍の量のシグナルを生成する）。
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Claims (7)

  1. 少なくとも３つの突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子をゲノム中に含み、
    該突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子が、対応する野生型機能的ＦＡＴＢ遺伝子のＤＮＡ領域と比較して１つ又は複数の挿入、欠失、又は置換したヌクレオチドからなる突然変異ＤＮＡ領域を含み、
    該突然変異ＦＡＴＢ対立遺伝子が、機能的ＦＡＴＢタンパク質をコード化しておらず、
    機能的ＦＡＴＢ遺伝子が以下：
    配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１と少なくとも９０%の配列同一性を含む核酸分子；及び
    配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０%の配列同一性を含むアミノ酸配列をコード化する核酸分子
    からなる群より選択される核酸分子を含み、
    種子油中の飽和脂肪酸のレベルが、対応する野生型アブラナ属植物の種子油中の飽和脂肪酸のレベルと比較して有意に低減していることを特徴とする、アブラナ属植物。
  2. 植物が、アブラナ属脂肪種子種である、請求項１記載の植物。
  3. セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、セイヨウカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、又はブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）である、請求項２記載の植物。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項記載の植物の種子から入手可能な種子油。
  5. 以下：
    − ２００８年６月２７日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６８で寄託された、位置３３３におけるｇがａに置換されている配列番号１３の核酸配列、位置８４５におけるｃがｔに置換されている配列番号１７の核酸配列、位置４９８におけるｇがａに置換されている配列番号１９の核酸配列、及び位置５０８におけるｇがａに置換されている配列番号２３の核酸配列を含むアブラナ属種子、
    − ２００８年６月２７日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６７で寄託された、位置３４８におけるｇがａに置換されている配列番号１３の核酸配列、位置４０６におけるｃがｔに置換されている配列番号１５の核酸配列、位置６６８におけるｇがａに置換されている配列番号１９の核酸配列、及び位置３３６におけるｇがａに置換されている配列番号２１の核酸配列を含むアブラナ属種子、及び
    − ２００８年６月２７日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに受入番号ＮＣＩＭＢ ４１５６６で寄託された、位置２８２におけるｇがａに置換されている配列番号１５の核酸配列、位置６６８におけるｇがａに置換されている配列番号１９の核酸配列、位置２３５におけるｃがｔに置換されている配列番号２１の核酸配列を含むアブラナ属種子
    からなる群より選択される種子から生育したアブラナ属植物の繁殖及び／又は育種により得られた、そのゲノム中に位置３３３におけるｇがａに置換されている配列番号１３の核酸配列、位置３４８におけるｇがａに置換されている配列番号１３の核酸配列、位置４０６におけるｃがｔに置換されている配列番号１５の核酸配列、位置２８２におけるｇがａに置換されている配列番号１５の核酸配列、位置８４５におけるｃがｔに置換されている配列番号１７の核酸配列、位置４９８におけるｇがａに置換されている配列番号１９の核酸配列、位置６６８におけるｇがａに置換されている配列番号１９の核酸配列、位置２３５におけるｃがｔに置換されている配列番号２１の核酸配列、位置３３６におけるｇがａに置換されている配列番号２１の核酸配列、又は位置５０８におけるｇがａに置換されている配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のアブラナ属植物。
  6. 請求項１〜３の植物から入手可能な種子。
  7. 請求項１〜３の植物から入手可能な子孫。
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