CN107624135A - 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含突变FAD2基因、FAD2核酸序列和蛋白质的芸苔属植物，以及用于产生并鉴定所述植物和等位基因的方法，所述方法可以用于在种子油中具有提高的C18:1水平的植物。本发明还涉及组合突变FAD2等位基因与突变FAD3等位基因以在种子油中增加C18:1的水平和降低C18:3的水平。

Description

具有修饰的种子油组成的芸苔属植物

技术领域

本发明涉及农学领域。提供调节欧洲油菜种子中脂肪酸组成的方法和手段，例如通过修饰FAD2基因，增加欧洲油菜种子中不饱和脂肪酸水平，以及通过修饰FAD2和FAD3基因增加油酸水平和降低亚麻酸水平。

发明背景

许多植物物种在它们的种子中贮藏三酰甘油(TAG)作为碳储备。这些 TAG是植物生活早期阶段期间支持幼苗发展的能量和碳原料主要来源。来自大豆(Glycine max)、芸苔(Brassica)(欧洲油菜(Brassica napus)或芜青(B. rapa))、向日葵(Helianthus annuus)和许多其他油料作物的植物油还是用于人类膳食或工业应用的油的重要来源，所述工业应用包括但不限于生物燃料、生物润滑剂、尼龙前体和洗涤剂原料。就食品或非食品产业中的油用途而言，植物油的多不饱和脂肪酸的程度和/或量是特征性和决定性属性。更具体地，植物油的特征性属性和用途主要由TAG中其脂酰基组成决定。

大部分植物油主要由棕榈酸酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1cisΔ⁹)、亚油酸(18:2cisΔ^9,12)、和α-亚麻酸(18:3cisΔ^9,12,15或C18:3)组成。棕榈酸和硬脂酸分别地是具有16碳长度和18碳长度的饱和脂肪酸。油酸、亚油酸和亚麻酸是具有18碳长度的分别含有一个、两个和三个双键的不饱和脂肪酸。油酸称作单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸称作多不饱和脂肪酸。已经寻求对脂肪酸组成的修饰至少一个世纪，以提供最佳油产品用于人类营养用途和化学用途(例如，油料化学)(Gunstone,1998,Prog Lipid Res 37:277；Broun等人,1999,Annu Rev Nutr 19:107；Jaworski等人,2003, Curr Opin Plant Biol 6:178)。特别地，多不饱和脂肪酸(18:2和18:3)已经受到密切关注，因为它们是影响营养价值和油稳定性的主要因素。然而，尽管这两种脂肪酸为人和动物提供必需养分，但是它们增加油不稳定性，因为它们包含可能在加工和储存期间轻易氧化的多个双键。

18:1去饱和成18:2是合成多不饱和脂肪酸的关键步骤。在贮藏脂质生物合成期间，已知这种反应由脂肪酸去饱和酶FAD2(一种位于内质网(ER) 上的膜结合酶，其具有δ-12脂肪酸去饱和酶活性)催化(Browse和 Somerville，1991,Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol 42:467)。FAD2 底物18:1必须在作为植物细胞的主要膜磷脂的磷脂酰胆碱(PC)的sn-2位置上酯化(Miquel和Browse,1992,J Biol Chem 267:1502；Okuley等人,1994,Plant Cell 6:147)。因此，不令人惊讶，下调FAD2(和FAD3)基因已经变成一项优选策略以避免需要氢化植物油和同时产生不希望的反式脂肪酸。例如，大豆具有种子特异性和组成型FAD2去饱和酶，从而对种子特异性同工型的基因沉默已经允许产生高油酸酯栽培品种(油中>88％ 18:1)，其中膜不饱和度和植物性能大多不受影响。

关于FAD2基因的沉默有几个报道，以提高油酸的水平。Stoutjesdijk 等人，2000(Biotech Soc Trans 28：938)公开了携带具有高达89％的油酸水平的Δ12-去饱和酶(FAD2)共抑制构建体的欧洲油菜植物。Chen等人，2006(J Plant Physiol Mol Biol 32：665)报道了欧洲油菜中种子特异性FAD2基因沉默，这导致转基因植物种子中的油酸含量为83.9％。他们进一步报告说，高油酸的转基因植物正常生长，没有不利的农艺性状。Peng 等人，2010，Plant Cell Rep 29：317公开了欧洲油菜植物，其中FAD2和脂肪酸延长酶1(FAE1)基因同时沉默，达到高达85％的油酸水平。WO1994 /011516报道了欧洲油菜中FAD2基因的基因沉默，这导致油酸水平高达 85％。WO2013/112523。

还有几种描述为增加水平的油酸的突变芸苔属植物：WO97/21340和 WO98/56239公开了具有增加的油酸水平的芸苔属品系，其包含FAD2蛋白质中的氨基酸取代；WO2006/079567描述了一种包含FAD2基因中的核苷酸缺失的高油酸欧洲油菜品系，导致过早的翻译终止，而WO2013/ 049356也描述了一种高油酸欧洲油菜品系，其包含FAD2基因中的过早翻译终止密码子，这产生截短的蛋白质；WO2007138444，WO2007/099459， WO2007/107590和WO2008/084107描述了具有高水平油酸的芸苔属品系中的FAD2基因中的几个突变。

Wells等人，2014(Mol Breeding 33：349)和WO2012/117256描述了具有低于通常的多不饱和脂肪酸含量的油籽油菜(oilseed rape)栽培种，其在四个直系同源FAD2基因座中的三个处具有无功能等位基因。剩余的功能性FAD2拷贝中导致氨基酸取代或过早终止密码子的其它突变导致约 6％的多不饱和脂肪酸含量和约84％的油酸含量。

然而显而易见，卡诺拉油菜和其他油籽植物仅具有组成型FAD2酶。因此，在卡诺拉油菜和其他这类组成型FAD2作物中，沉默或下调FAD2 不仅改变种子中贮藏三酰甘油(TAG)的脂肪酸组成，还改变细胞膜的脂肪酸组成。例如，拟南芥属(Arabidopsis)突变体fad2中的缺陷性FAD2改变种子以及营养组织的脂肪酸组成，并严重破坏植物生长(Browse和Somerville，上文)。产生油中最高18:1水平的FAD2突变和沉默还减少营养组织和种子组织中的膜不饱和度，产生萌发和生长低劣的植物。因此，仅部分下调FAD2表达是可能的，在商业栽培品种如Nexera/Natreon(Dow AgroSciences)和Clear Valley 75(Cargill)的油中产生大约70-75％18:1。

本发明的目的是提供用于生产具有高水平油酸的植物的芸苔属FAD2 等位基因，同时保持正常的农艺发育，并且任选地将FAD2等位基因与 FAD3等位基因组合以产生具有高水平油酸以及低水平的亚麻酸的植物。

发明概述

本发明的第一个实施方案是提供包含FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1 和FAD2-C2基因的欧洲油菜植物，或其细胞、部分、种子或后代，其中所述植物包含FAD2-A1的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2 等位基因，并且其中所述FAD2-C1基因的fad2等位基因编码功能性FAD2 蛋白。在另一个实施方案中，所述欧洲油菜植物的FAD2-C1基因的fad2 等位基因是野生型等位基因。在另一个实施方案中，所述欧洲油菜植物的 FAD2-A2基因的fad2等位基因是敲除fad2等位基因。在另一个实施方案中，所述FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因是编码蛋白质的fad2等位基因，其中在对应于SEQ ID NO:6的位置109的位置处的His被另一氨基酸取代，并且其中所述FAD2-C2等位基因的所述敲除fad2等位基因是在对应于SEQID NO:15的位置190的位置处编码Trp的密码子中包含终止密码子突变的fad2等位基因，而在另一个实施方案中，所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的序列，其中位置2371处的C被T取代；并且所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的序列，其中第2327位的G被A取代。还在另一个实施方案中，根据本发明的欧洲油菜植物，或其其细胞、部分、种子或后代可来自或可获得自种子，所述种子选自：包含HIOL101的种子，所述种子已经在NCIMB以登录号NCIMB 42376保藏；以及包含HIOL109的种子，所述种子已经在 NCIMB以登录号NCIMB42375保藏。在本发明的另一方面，所述欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代对于任一个敲除fad2等位基因是纯合的。

在另一个实施方案中，根据本发明的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代还至少包含至少一种FAD3基因的敲除fad3等位基因，例如五种FAD3基因的敲除fad3等位基因。在另一个实施方案中，所述FAD3 基因选自：a)FAD3-A1基因，其包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少 90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:39的序列具有至少90％的序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:38的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；b)FAD3-A2基因，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:42的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；c)FAD3-A3基因，其包含与SEQ ID NO:43 的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:44的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；d)FAD3-C1基因，其包含与SEQ ID NO:46的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:48 的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:47 的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和e)FAD3-C2基因，其包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:51的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:50的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，所述fad3等位基因是a)所述FAD3-A1基因的突变体等位基因包含在对应于SEQ ID NO:37的位置2405处的位置上的G至A的取代；b)所述FAD3-A2基因的突变等位基因在对应于SEQ IDNO:40的位置3934的位置处包含G至A取代；c)所述FAD3-A3基因的突变等位基因在对应于SEQ ID NO:43的位置2847的位置处包含G至A取代；d)所述FAD3-C1 基因的突变等位基因包含在对应于SEQ ID NO:46的位置2702的位置处的 G至A取代；和e)所述FAD3-C2基因的突变等位基因包含在对应于SEQ ID NO:49的位置3909的位置处的G至A取代。

在另一方面，根据本发明的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代具有种子油中C18:1的增加水平，例如在种子油中的C18:1水平约73％至约75％，并保持正常的农艺发育。在另一方面，根据本发明的包含突变体fad2等位基因和突变体fad3等位基因的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代在种子油中具有增加的C18:1水平和降低的C18:3水平。还提供了根据本发明的来自种子的油。

本发明的另一方面提供了在保持正常农艺发育的同时提高种子油中 C18:1水平的方法，所述方法包括将FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因引入到欧洲油菜植物中，并选择包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的欧洲油菜植物，其进一步含有FAD2-C1基因，其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白。在另一个实施方案中，通过所述方法产生的芸苔属植物包含FAD2-A2基因的敲除fad2等位基因。

本发明的另一方面提供了在种子油中提高C18:1水平并降低C18:3水平同时保持正常农艺发育的方法，所述方法包括将FAD2-A1基因的敲除 fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，FAD3-A1基因的敲除fad3等位基因，FAD3-A2基因的敲除fad3等位基因，FAD3-A3基因的敲除fad3等位基因，FAD3-C1基因的敲除fad3等位基因，和FAD3-C2 基因的敲除fad3等位基因引入到欧洲油菜植物中，并选择欧洲油菜植物，所述植物包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因，和所述 FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因、所述FAD3-A1基因的所述敲除 fad3等位基因、所述FAD3-A2基因的所述敲除fad3等位基因、所述 FAD3-A3基因的所述敲除fad3等位基因，所述FAD3-C1基因的所述敲除 fad3等位基因，和所述FAD3-C2基因的所述敲除fad3等位基因，其还含有FAD2-C1基因(其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白)，以及FAD2-A2 基因(其fad2等位基因是敲除fad2等位基因)。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法包括选择包含所述FAD2-A1 基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的欧洲油菜植物的步骤，其是通过分析来自所述植物的基因组DNA 中至少一个分子标记的存在，其中至少一个分子标记与所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因连接，并且其中至少一个分子标记与所述 FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因连接，并且任选地，其中至少一个分子标记与所述FAD2-A2基因或所述FAD2-C1基因的一个或多个fad2 等位基因连接，或与所述FAD3-A1基因、所述FAD3-A2基因、所述 FAD3-A3基因、所述FAD3-C1基因，或FAD3-C2基因的一个或多个fad3 等位基因连接。

在另一个实施方案中，提供了确定生物样品中存在或不存在敲除fad2 等位基因的方法，其包括提供来自所述生物样品的基因组DNA，并分析所述DNA的至少一种分子标记的存在，其中所述至少一种分子标记连接到所述敲除fad2等位基因。另一个实施方案提供了用于检测芸苔属DNA样品中的敲除fad2等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个PCR 引物对，其能够扩增与所述敲除fad2等位基因连接的DNA标记。另一个实施方案提供了确定植物或其细胞、部分、种子或后代中敲除fad2等位基因的接合状态的方法，包括确定在所述植物、或其细胞、部分、种子或后代的基因组DNA中敲除和/或相应的野生型FAD2特异性区域的存在。

在另一个实施方案中，提供了在单独欧洲油菜植物中将FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因与FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因组合的方法，所述方法包括a)产生和/或鉴定两种或更多种植物，每种植物包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因；b)将包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因的第一植物与包含一种或多种其它选择的敲除 fad2等位基因的第二植物杂交；c)从杂交收集种子，并且任选地鉴定包含 FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因的植物；以及任选地d)重复步骤b)和c)，直到获得包含FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一个敲除fad2等位基因的植物。在另一个实施方案中，步骤d)中获得的所述植物包含FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2 基因的至少一种敲除fad2等位基因，包含FAD2-C1基因(其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白)，并且包含FAD2-A2基因(其fad2等位基因是敲除fad2等位基因)。

在本发明的另一方面，提供了FAD2基因的敲除fad2等位基因，其中敲除fad2等位基因是天然FAD2基因的突变形式，其中天然FAD2基因选自：(a)FAD2-A1基因，其包含与SEQID NO:4的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和(b)FAD2-C2基因，其包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少 90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ IDNO:15的序列具有至少 90％序列同一性的蛋白质，例如敲除fad2等位基因，其是所述FAD2-A1 基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:4的位置2371的位置上包含C至T的取代；或其是FAD2-C2基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:52的位置2327的位置处包含G至A的取代。

在另一个实施方案中，提供了用于生产油的方法，其包括从根据本发明的植物中收获种子，并从所述种子中提取油。

在又一个实施方案中，提供了生产食物或饲料(例如油，膳食(meal)，谷物，淀粉，面粉或蛋白质)或工业产品(例如生物燃料，纤维，工业化学品，药物或营养食品)的方法，包括获得根据本发明的植物或其部分，以及从植物或其部分制备食品，饲料或工业产品。

另一个实施方案提供了根据本发明的敲除fad2等位基因在维持正常农艺发育的同时提高欧洲油菜植物的种子油中C18:1的水平的用途。另一个实施方案提供了产生欧洲油菜植物的方法，所述植物在种子油中包含提高的C18:1水平并保持正常的农艺发育，所述方法包括播种根据本发明的种子和从所述种子生长植物。

附图简述

图1.拟南芥和芸苔属FAD2蛋白序列的比对。框表示保守结构域：TM＝跨膜或膜相关结构域；HIS＝组氨酸盒；ER＝ER检索基序。在本发明的突变体fad2等位基因中密码子突变的氨基酸用粗体，下划线大写字母表示。

图2.欧洲油菜FAD2基因的相对表达。菱形：BnFAD2-A1；正方形： BnFAD2-C1；三角形：BnFAD2-A2；叉：BnFAD2-C2。1：根，2周龄植物；2：子叶，播种后10天(DAS)；3：茎15DAS；4：茎，33DAS；5：幼叶，33DAS；6：顶生分生组织+最小叶，33DAS；7：小花芽，42DAS；8：大花芽，42DAS>5mm；9：开花，52DAS；10：荚果(pod)，14-20DAF；11：荚果，21-25DAF；12：种子，14-20DAF；13：种子，21-25DAF；14：种子，26-30DAF；15：种子，31-35DAF；16：种子，42DAF；17：种子，49 DAF。

一般定义

如本文所用的“FAD2基因”或“FAD2等位基因”是包含与拟南芥 (Arabidopsisthaliana)FAD2基因的编码序列具有至少60％序列同一性的序列的基因或等位基因，登录号为At3G12120，如SEQ ID NO:2，nts 177-1328所示。

FAD2基因或FAD2等位基因可以但不需要编码功能性FAD2蛋白。可以例如通过Okuley等人，1994，Plant Cell 6：147所述的拟南芥 (Arabidopsis)fad2-1突变体的互补或通过如Peyou-Ndi等人，Arch Biochem Biophys 376：399所述的酵母中的表达和活性分析来测试FAD2蛋白的功能。“FAD2基因”或“FAD2等位基因”包括但不限于BnFAD2-A1、BnFAD2-A2、BnFAD2-C1、BnFAD2-C2、BrFAD1-1、BrFAD2-2、BoFAD2-1 和BoFAD2-2基因或等位基因。本文所用的“敲除fad2基因”或“敲除fad2 等位基因”是编码没有功能的FAD2蛋白或者编码具有降低的活性的FAD2 蛋白的fad2基因或fad2等位基因。所述“敲除fad2基因”可编码具有降低的功能性的FAD2蛋白，或可为编码无功能性FAD2蛋白的完全敲除 fad2基因。所述“敲除fad2基因”或“敲除fad2等位基因”可以是突变体fad2等位基因或突变体fad2基因，其可以编码无功能性FAD2蛋白，或可编码具有降低的活性的突变FAD2蛋白。基因或等位基因也可以称为灭活基因或等位基因。敲除fad2基因或等位基因可以是野生型FAD2基因，即编码无功能FAD2蛋白或编码具有降低的活性的FAD2蛋白的野生型 FAD2基因，或者可以是突变fad2基因或等位基因。

如本文所用，“完全敲除”或“无效”fad2等位基因是指这样的fad2 等位基因，其编码与功能性FAD2蛋白(例如SEQ ID NO:6的野生型 BnFAD2-A1蛋白，或SEQ ID NO:9的野生型BnFAD2-C1蛋白)相比没有生物活性的FAD2蛋白，或如Peyou-Ndi等，Arch BiochemBiophys 376： 399所述在酵母测定中没有可检测的生物学活性的FAD2蛋白，或者完全不编码蛋白质。这种“完全敲除fad2等位基因”是例如野生型fad2等位基因，其在其核酸序列中包含一个或多个突变，例如一个或多个无义或错义突变。特别地，这种完全敲除的fad2等位基因是野生型fad2等位基因，其包含优选导致产生缺少至少一个功能结构域(例如三个组氨酸盒中的至少一个，或五个跨膜或膜相关结构域(TM结构域)中的至少一个、或ER 检索基序)的FAD2蛋白的突变，使得FAD2蛋白的生物活性被完全消除，或者由此所述一个或多个突变优选导致不生产FAD2蛋白。

如本文所用的“功能性FAD2基因”或“功能性FAD2等位基因”是编码功能性FAD2蛋白的FAD2基因或FAD2等位基因。

本文所用的“突变fad2基因”或“突变fad2等位基因”是指在天然群体或育种群体中在植物中未发现但是通过人类干预如诱变或基因靶向产生的任何fad2基因或fad2等位基因。突变fad2等位基因包括敲除fad2 等位基因和功能性FAD2等位基因。突变fad2等位基因也可以称为“诱导的突变fad2等位基因”。

功能性FAD2蛋白是这样的FAD2蛋白，其具有至少10％，或至少 15％，或至少20％，或至少25％，或至少30％，或至少50％，或至少80％由例如Peyou-Ndi等人，Arch BiochemBiophys 376：399所述的酵母中测试的参考欧洲油菜FAD2-A1或FAD2-C1基因编码的蛋白质的活性，其中参考欧洲油菜FAD2-A1和FAD2-C1基因分别编码具有SEQ ID No.6和 SEQ IDNo.9所示氨基酸序列的蛋白质。功能性FAD2蛋白可以是具有“完整功能”的FAD2蛋白，其可以是参考欧洲油菜FAD2-A1和FAD2-C1蛋白的100％功能。功能性FAD2蛋白也可以是功能降低的FAD2蛋白。然而，功能性FAD2蛋白的活性不能完全消除。例如，如Peyou-Ndi等人， ArchBiochem Biophys 376：399所述，功能性FAD2蛋白在酵母测定中具有可检测的FAD2活性。

如本文所用的FAD2蛋白的“生物活性”是油酸(C18:1)的δ-12去饱和以形成亚油酸(C18:2)。FAD2蛋白的生物活性可以例如由Peyou-Ndi 等人，Arch Biochem Biophys 376：399所述的酵母测定法中测定。

具有降低功能性的突变FAD2蛋白是由突变fad2基因编码的FAD2 蛋白，其与由野生型FAD2基因编码的相应的野生型FAD2蛋白相比，具有降低的活性或生物活性的降低，但未完全消除。所述活性可以以至少 10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或在至少80％，或至少90％，或至少93％，或至少95％被降低，但其中活性未被完全消除。例如，如Peyou-Ndi等人，Arch Biochem Biophys 376：399所述的酵母测定中，具有降低功能的突变FAD2蛋白具有可检测的FAD2活性。FAD2蛋白的生物活性的显著降低在本文中指的是δ-12脂肪酸去饱和酶活性的降低，使得与表达相应野生型FAD2蛋白的植物相比，植物中C18:1的水平增加。

术语“核酸序列”(或核酸分子)指处于单链或双链形式的DNA或RNA 分子，尤其编码本发明蛋白质或蛋白质片段的DNA。“内源核酸序列”指植物细胞内部的核酸序列，例如在芸苔属细胞的核基因组内部存在的FAD2 基因的内源等位基因。“分离的核酸序列”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌或植物宿主细胞)中的核酸序列。

术语“基因”意指与调节区(例如启动子)有效连接的包含下述区域(转录的区域)的DNA序列，其中所述区域在细胞中转录成RNA分子(例如转录成包含内含子序列的前mRNA，所述前mRNA随后剪接成成熟mRNA，或直接转录成无内含子序列的mRNA)。基因可以因而包含几个有效连接的序列，如启动子、包含例如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。“内源基因”用来区分“外来基因”、“转基因”或“嵌合基因”，并且指来自某个植物属、物种或品种的植物的基因，所述基因没有通过转化过程引入该植物中(即它不是“转基因”)，而是它正常情况下存在于这个属、物种或品种的植物中，或所述基因通过正常育种技术或通过体细胞杂交(例如通过原生质体融合法)从该基因正常情况下存在于其中的另一个植物属、物种或品种的植物引入该植物中。类似地，基因的“内源等位基因”没有通过植物转化法被引入植物或植物组织中，但是例如通过植物诱变和/或选择来产生或通过筛选天然植物群体来获得。

“基因的表达”或“基因表达”指这样的过程，其中与适宜调节区、尤其启动子有效连接的DNA区域被转录成RNA分子。该RNA分子随后在细胞内部(通过转录后过程)进一步加工，例如通过RNA剪接和翻译起始以及翻译成氨基酸链(多肽)并且由翻译终止密码子终止翻译。术语“功能性表达”在本文中用来表示产生有功能的蛋白质；术语“未功能性表达”用来表示产生功能(生物活性)显著减少或无功能(生物活性)的蛋白质或表示没有产生蛋白质(进一步见下文)。

术语“蛋白质”或“多肽”互换地使用并指由氨基酸的链组成的分子，而不指具体作用模式、大小、三维结构或起源。FAD2蛋白的“片段”或“部分”因此仍可以称作“蛋白质”。“分离的蛋白质”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌性或植物宿主细胞)中的蛋白质。“氨基酸”是蛋白质和酶的主要构件。它们根据遗传密码通过转移RNA并入蛋白质，而信使RNA被核糖体解码。在蛋白质的最终装配期间和之后，氨基酸含量指示了蛋白质或酶的空间和生化特性。氨基酸主链决定了蛋白质的一级序列，但侧链的性质决定了蛋白质的性质。本文使用的“类似氨基酸”是指具有相似氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性，非极性或实际中性侧链的氨基酸。本文所用的“非相似氨基酸”是指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸不相似。极性侧链通常倾向于存在于蛋白质的表面上，在该处它们可以与细胞中发现的水性环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸倾向于位于蛋白质的中心内，在该处它们可与相似的非极性相邻物相互作用 (“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的实例是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(全部是亲水的，除了半胱氨酸是疏水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的实例是丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸和色氨酸(都是疏水的，除了甘氨酸是中性的)。

如本文中所用，术语“等位基因”意指基因在特定基因座的任意一个或多个可变形式。在生物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上。

如本文中所用，术语“同源染色体”意指这样的染色体，它们含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同的基因，但可能含有这些基因的不同等位基因。同源染色体是减数分裂期间配对的染色体。代表某生物的全部生物学特征的“非同源染色体”形成一个组，并且细胞中的组数目称作倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每条同源染色体从不同的亲本继承。在双二倍体物种中，实质上存在两组二倍体基因组，因而这两个基因组的染色体称作“同源染色体”(并且类似地，这两个基因组的基因座或基因称作同源基因座或基因)。二倍体或双二倍体植物物种可以在特定基因座处包含巨大数目的不同等位基因。

如本文中所用，术语“杂合”意指当两个不同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。相反，如本文中所用，术语“纯合”意指两个相同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。

如本文所用，术语“基因座”(复数形式：基因座(loci))意指染色体上其中存在例如基因或遗传标记的特定位置或位点。例如，“FAD2-A1基因座”和“FAD2-A2基因座”是指在其中发现了FAD2-A1基因(和两个FAD2-A1 等位基因)或FAD2-A2基因(和两个FAD2-A2等位基因)的A基因组的染色体上的位置，例如BnFAD2-A1基因座、BnFAD2-A2基因座、BrFAD2-1基因座和BnFAD2-2基因座的A基因组染色体上的位置，而“FAD2-C1 基因座”和“FAD2-C2基因座”是指其中发现了FAD2-C1基因(和两个 FAD2-C1等位基因)或BnFAD2-C2基因(和两个FAD2-C2等位基因) 的C基因组的染色体上的位置，例如BnFAD2-C1基因座、BnFAD2-C2 基因座、BoFAD2-1基因座和BoFAD2-2基因座的C基因组染色体上的位置。

如本文中所用，“野生型”(也书写为“野生型(wildtype)”或“野生型 (wild-type)”)指植物或基因如其在自然界中最常出现的典型形式。“野生型植物”指在天然群体中或育种群体中的植物。“野生型等位基因”指在野生型植物中存在的基因的等位基因。

本文所用的“突变体”是指与天然群体中的这种植物或基因不同的植物或基因的形式，其通过人类干预产生，例如，通过诱变，并且“突变等位基因”是指在天然群体或育种群体中的植物中未发现但通过人类干预如诱变或基因靶向产生的等位基因。

无论何时提到本发明的“植物”或“多个植物”时，除非另外说明，否则应当理解本文中还包括植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、分开的部分如根、叶、花、花粉等)、植物的仍保留亲本的区别特征(尤其提高的 C18:1的水平)的子代、如通过自交或杂交获得的种子，例如(通过两个近交亲本系杂交获得的)杂交种子、杂交植物和来自其的植物部分。

如本文所用，“产生繁殖材料”指本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子的任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、(芽)嫁接、微繁殖，匍匐茎或长匐茎、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、striking或插条、双鳞片(twin-scaling))、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如单性生殖、体细胞杂交)。

“分子测定”(或测试)在本文中指的是在一个或多个FAD2基因座 (例如在FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1或FAD2-C2基因座的一个或两个)处指示(直接或间接)一种或多种特定FAD2等位基因的存在或不存在的测定。在一个实施方案中，其允许确定特定(野生型或突变体)FAD2 等位基因在任何单个植物中的基因座处是纯合的还是杂合的。如本文中所用，“诱变”指这样的过程，其中植物细胞(例如，多个芸苔属种子或其他部分，如花粉等)接受一种技术，所述技术在所述细胞的DNA中引起突变，如接触诱变剂如化学物质(如甲磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝脲(ENU)等)或电离辐射(中子(如在快中子诱变法等中)、α射线、伽玛射线(如钴60源所提供)、X-射线、紫外辐射等)，T-DNA插入诱变(Azpiroz-Leehan等人(1997)Trends Genet 13:152-156)、转座子诱变(McKenzie等人(2002)Theor Appl Genet 105:23-33)或组织培养诱变(诱导体细胞克隆变异)或这些技术中两者或更多者的组合作用。因此，可以通过上文方法之一完成一种或多种FAD2 等位基因的所需诱变。尽管通过辐射产生的突变经常是巨大缺失或其他严重损伤如易位或复杂重排，通过化学诱变原产生的突变经常是更离散的损伤如点突变。例如，EMS使鸟嘌呤碱基烷基化，这导致碱基错配：烷基化的鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，从而主要产生G/C至A/T转换。诱变后，使用已知技术从处理的细胞再生芸苔属植物。例如，可以根据常规培育方法种植所得的芸苔属种子并且在自我授粉后，在该植物上形成种子。备选地，可以提取双单倍体小植物以立即形成纯合植物，例如，如Coventry 等人(1988,Manual for Microspore Culture Technique for Brassicanapus. Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication 0489.Univ.of Guelph, Guelph,Ontario,Canada)所描述。可以收获因这种自我授粉在当前或后续世代中形成的额外种子并对其筛选突变fad2等位基因的存在。已知几项技术筛选特定突变等位基因，例如,Deleteagene^TM(缺失-一个-基因；Li等人, 2001,Plant J 27：235-242)使用聚合酶链反应(PCR)测定法来筛选通过快中子诱变法产生的缺失突变体，TILLING(基因组中定向诱导的局部损伤； McCallum等人,2000,Nat Biotechnol 18:455-457)鉴定EMS诱导的点突变等。在下文实施例中描述筛选特定突变fad2等位基因的存在的额外技术。

术语“基因靶向”在本文中指使用机理如同源重组、错配修复或位点定向诱变的定向基因修饰。该方法可以用来在植物细胞中替换、插入和缺失内源序列或先前引入的序列。用于基因靶向的方法可以在例如WO 2006/105946或WO 2009/002150中找到。基因靶向可以用来产生突变fad2 等位基因，如敲除的fad2等位基因。

本文所用的术语“非天然存在的”或“栽培的”在用于植物时是指具有被人修饰的基因组的植物。例如，转基因植物是含有外源核酸分子并且因此已经被人遗传修饰的非天然存在的植物，所述外源核酸分子例如包含转录区的嵌合基因，所述转录区当转录时产生能够降低内源基因(如FAD2 基因)表达的生物活性RNA分子。此外，还将这样的植物认为是非天然植物，所述植物包含内源基因的突变，例如，由于暴露于诱变剂而在内源FAD2基因中(例如在调节元件或编码序列中)的突变，因为所述植物已经被人遗传修饰。此外，特定物种(例如欧洲油菜)的植物(其在内源基因中(例如在内源性FAD2基因中)含有突变(所述突变在自然中不会在该特定植物物种中出现)，是由于，例如，与该植物的相同或另一物种(例如芥菜(Brassica juncea)或芜青(Brassica rapa))的植物的定向育种过程(例如标记辅助育种和选择或渐渗)也被认为是非天然存在的植物。相反，仅包含自发或天然存在的突变的植物，即未被人遗传修饰的植物，不是如本文所定义的“非天然存在的植物”，因此不包括在本发明内。本领域技术人员理解，虽然非天然存在的植物通常具有与天然存在的植物相比改变的核苷酸序列，但是非天然存在的植物也可以由人进行遗传修饰而不改变其核苷酸序列，例如，通过修饰其甲基化模式。

基因或蛋白质的术语“直向同源物”在本文中是指在另一种物种中发现的同源基因或蛋白质，其具有与所述基因或蛋白质相同的功能，但是在具有该基因的物种分叉的时间点在序列上(通常)偏离(即通过物种形成从共同祖先进化的基因)。因此，基于两个序列比较(例如，基于整个序列上的百分比序列同一性或在特定结构域上的百分比序列同一性)，和/ 或功能分析，可以在其它植物物种(例如芥菜等)中鉴定欧洲油菜FAD2 基因的直向同源物。

“品种”在本文中遵照UPOV公约使用，并且指在最低已知阶元的单一植物学分类单位内部的植物群，所述植物群可以通过因给定基因型或基因型组合所致的特征的表达定义，可以因至少一个所述特征的表达而与任何其他植物群区分并且就其以不变稳定)的繁殖的适宜性而言视为一个单位。

术语“包含”将解读为指明存在所述的部分、步骤或组分，但不排除存在一个或多个额外部分、步骤或部分。包含某个性状的植物因而可以包含额外的性状。

可以理解当提及单数形式的某个词汇(例如植物或根)时，复数形式(例如多株植物、多个根)也包括在本文中。因而，借助非限定冠词“a”或“an”对某要素的提及不排除存在多于一个该要素的可能性，除非上下文清楚地要求应当存在一个要素且仅存在一个所述要素。非限定冠词“a”或“an”因而通常意指“至少一个”。

出于本发明目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分数)指两条经最优比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x 100)除以比较的位置的数目。空位(即，比对中在一个序列中存在某残基而在另一个序列中不存在该残基的位置)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The European MolecularBiology Open Software Suite)(EMBOSS,Rice等人,2000,Trends in Genetics 16(6):276-277；例如参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的 Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970,J Mol Biol 48(3):443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且对于蛋白质，默认计分矩阵是EBLOSUM 62。

如本文中所用，“基本上相同”或“基本上相似”指当如上文所定义最佳比对时，共有至少某个最小百分数的(如下文进一步定义的)序列同一性的序列。

“严格杂交条件”可以用来鉴定与给定的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。严格条件具有序列依赖性并且会在不同环境中不同。通常，选择严格条件为在确定的离子强度和pH下，低于特定序列的热解链温度(T_m) 约5℃。T_m是(在确定的离子强度和pH下)这样的温度，在所述温度，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。一般，将选择其中盐浓度是在pH7约 0.02摩尔并且温度是至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度增加了严格性。用于RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的 Northern印迹)例如是包括至少一次在63℃于0.2X SSC中20分钟洗涤或等同条件洗涤的那些条件。

可以例如通过以下方式提供“高严格性条件”：在65℃于含有6x SSC (20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)、5x Denhardt(100x Denhardt含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特异性竞争物的20μg/ml变性载体 DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)的水溶液中杂交。在杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度于0.2-0.1× SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。

“中等严格性条件”指与上述溶液中但是在约60-62℃杂交等同的条件。中等严格性洗涤可以在杂交温度于1x SSC，0.1％SDS中进行。

“低严格性”指与上述溶液中在约50-52℃杂交等同的条件。低严格性洗涤可以在杂交温度于2x SSC，0.1％SDS中进行。还参见Sambrook等人(1989)和Sambrook和Russell(2001)。

发明详述

本发明基于芜青(Brassica rapa)中和甘蓝(Brassica oleracea)中2种 FAD2基因的鉴定及欧洲油菜中4种FAD2基因的鉴定，和芸苔属FAD2 基因产物在脂肪酸去饱和中的作用的鉴定。

本发明的第一个实施方案是提供包含FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1 和FAD2-C2基因的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述植物包括FAD2-A1的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2 等位基因，并且其中所述FAD2-C1基因的fad2等位基因编码功能性FAD2 蛋白。在另一个实施方案中，所述欧洲油菜植物的FAD2-C1基因的fad2 等位基因是野生型等位基因。在另一个实施方案中，所述欧洲油菜植物的 FAD2-A2基因的fad2等位基因是敲除fad2等位基因。在另一个实施方案中，所述FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因是编码蛋白质的fad2等位基因，其中在对应于SEQ ID NO:6的位置109的位置处的His被另一氨基酸取代，并且其中所述FAD2-C2等位基因的所述敲除fad2等位基因是在对应于SEQID NO:15的位置190的位置处编码Trp的密码子中包含终止密码子突变的fad2等位基因，而在另一个实施方案中，所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的序列，其中位置2371处的C被T取代；并且所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的序列，其中第2327位的G被A取代。还在另一个实施方案中，根据本发明的欧洲油菜植物，或其细胞、部分、种子或后代可来自或可获得自种子，所述种子选自：包含HIOL101的种子，所述种子已经在NCIMB以登录号NCIMB 42376保藏；以及包含HIOL109的种子，所述种子已经在 NCIMB以登录号NCIMB42375保藏。在本发明的另一方面，所述欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代对于任一个敲除fad2等位基因是纯合的。

在另一个实施方案中，根据本发明的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代还至少包含至少一种FAD3基因的敲除fad3等位基因，例如五种FAD3基因的敲除fad3等位基因。在另一个实施方案中，所述FAD3 基因选自：a)FAD3-A1基因，其包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少 90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:39的序列具有至少90％的序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:38的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；b)FAD3-A2基因，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:42的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；c)FAD3-A3基因，其包含与SEQ ID NO:43 的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:44的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；d)FAD3-C1基因，其包含与SEQ ID NO:46的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:48 的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:47 的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和e)FAD3-C2基因，其包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:51的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:50的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，所述fad3等位基因是a)所述FAD3-A1基因的突变体等位基因包含在对应于SEQ ID NO:37的位置2405处的位置上的G至A的取代；b)所述FAD3-A2基因的突变等位基因在对应于SEQ IDNO:40的位置3934的位置处包含G至A取代；c)所述FAD3-A3基因的突变等位基因在对应于SEQ ID NO:43的位置2847的位置处包含G至A取代；d)所述FAD3-C1 基因的突变等位基因包含在对应于SEQ ID NO:46的位置2702的位置处的 G至A取代；和e)所述FAD3-C2基因的突变等位基因包含在对应于SEQ ID NO:49的位置3909的位置处的G至A取代。

如本文所用的芸苔属植物可以是欧洲油菜(AACC，2n＝38)，芥菜 (Brassicajuncea)(AABB，2n＝36)，Brassica carinata(BBCC，2n＝34)，芜青(Brassica rapa)(同义词芸苔(B.campestris))AA，2n＝20)，甘蓝(Brassica oleracea)(CC，2n＝18)或黑芥(Brassica nigra)(BB，2n＝16)。所述芸苔属植物可以是作为作物种植的作物植物物种。

本发明的核酸序列

提供了编码有功能的FAD2蛋白的野生型FAD2核酸序列和来自芸苔属、尤其来自欧洲油菜、芜青和甘蓝的FAD2基因的突变fad2核酸序列(包含一个或多个突变，优选地导致编码的FAD2蛋白的生物活性没有或显著减少或导致不产生FAD2蛋白的突变)。

然而，本文中也提供分离的FAD2和fad2核酸序列(例如通过克隆从植物分离或通过DNA合成法合成产生)以及其变体和任意的这些序列的片段，因为这些序列可以用来确定哪个序列内源存在于植物或植物部分中、该序列是否编码有功能、无功能的蛋白质或不编码蛋白质(例如，通过如下文所述的重组宿主细胞中的表达确定)和用于选择特定等位基因并将其从一个植物转移至另一个植物中，旨在产生具有所需功能性等位基因和突变等位基因组合的植物。

已经从欧洲油菜分离FAD2-A1、FAD2-C1、FAD2-A2和FAD2-C2的核酸序列，已经从甘蓝分离以及从芜青分离FAD2-1和FAD2-2的核酸序列，如序列表中所述。描述了野生型FAD2序列，同时参照野生型FAD2 序列，下文和实施例中描述了这些序列的和基本上与这些序列相似的序列的突变fad2序列。来自欧洲油菜、甘蓝和芜青的编码FAD2蛋白的基因组 DNA包含任何内含子。在序列表中还描述了不包含内含子的芸苔属FAD2 基因的编码序列或cDNA序列。

如本文所用，“欧洲油菜FAD2-A1基因”、“BnFAD2-A1基因”、“欧洲油菜FAD2-A1等位基因”、“BnFAD2-A1等位基因”或“来自欧洲油菜的 FAD2-A1”或其变体核酸序列指与SEQ IDNo.4具有至少90％、或至少 95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“欧洲油菜FAD2-C1基因”、“BnFAD2-C1基因”、欧洲油菜FAD2-C1等位基因”、“BnFAD2-C1等位基因”或“来自欧洲油菜的 FAD2-C1”或其变体核酸序列指与SEQ IDNo.7具有至少90％、或至少 95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“欧洲油菜FAD2-A2基因”、“BnFAD2-A2基因”、“欧洲油菜FAD2-A2等位基因”、“BnFAD2-A2等位基因”或“来自欧洲油菜的 FAD2-A2”或其变体核酸序列指与SEQ IDNo.10具有至少90％、或至少 95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“欧洲油菜FAD2-C2基因”、“BnFAD2-C2基因”、“欧洲油菜FAD2-C2等位基因”、“BnFAD2-C2等位基因”或“来自欧洲油菜的 FAD2-C2”或其变体核酸序列指与SEQ IDNo.13具有至少90％、或至少 95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“芜青FAD2-1基因”、“BrFAD2-1基因”、“芜青FAD2-1 等位基因”、“BrFAD2-1等位基因”或“来自芜青的FAD2-1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.16具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“芜青FAD2-2基因”、“BrFAD2-2基因”、“芜青FAD2-2 等位基因”、“BrFAD2-2等位基因”或“来自芜青的FAD2-2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.19具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“甘蓝FAD2-1基因”、“BoFAD2-1基因”、“甘蓝FAD2-1 等位基因”、“BoFAD2-1等位基因”或“来自甘蓝的FAD2-1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.22具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

如本文所用，“甘蓝FAD2-2基因”、“BoFAD2-2基因”、甘蓝FAD2-2 等位基因”、“BoFAD2-2等位基因”或“来自甘蓝的FAD2-2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.25具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。

“FAD2-A1基因”或“FAD2-A1等位基因”可以是BnFAD2-A1基因或等位基因，或可以是BrFAD2-1基因或等位基因。

“FAD2-C1基因”或“FAD2-C1等位基因”可以是BnFAD2-C1基因或等位基因，或可以是BoFAD2-1基因或等位基因。

“FAD2-A2基因”或“FAD2-A2等位基因”可以是BnFAD2-A2基因或等位基因，或可以是BrFAD2-2基因或等位基因。

“FAD2-C2基因”或“FAD2-C2等位基因”可以是BnFAD2-C2基因或等位基因，或可以是BoFAD2-2基因或等位基因。

因此，本发明提供了编码野生型有功能的FAD2蛋白的核酸序列，包括其变体和片段(如下文进一步定义)，以及这些核酸序列中任何的突变核酸序列，其中与野生型FAD2蛋白相比，所述核酸序列中的突变优选地导致插入、缺失或取代一个或多个氨基酸。优选地，核酸序列中的突变产生一个或多个氨基酸改变(即相对于野生型氨基酸序列，插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸)，从而FAD2蛋白的生物活性显著减少或完全消除。

可以例如通过Peyou-Ndi等人，Arch Biochem Biophys 376：399所述的酵母中的表达和活性分析来测试FAD2蛋白的功能。

本文中提供了内源核酸序列和分离的核酸序列。根据本发明另一个方面，还提供了上文所定义的FAD2序列和FAD2变体核酸序列的片段，用作引物或探针和用作试剂盒的组分(进一步参见下文)。FAD2或fad2核酸序列或(如定义的)其变体的“片段”可以具有多种长度，如FAD2或fad2序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600个连续核苷酸。

编码野生型FAD2蛋白的野生型核酸序列

序列表中所述的核酸序列编码来自欧洲油菜、来自芜青和来自甘蓝的野生型FAD2蛋白。因而，这些序列对于从中分离它们的芸苔属植物是内源的。

可以对其他芸苔属作物物种、变种、繁育系或野生群(wild accession) 筛选编码相同FAD2蛋白或其变体的其他FAD2等位基因。例如，核酸杂交技术(例如DNA印迹分析，使用例如严格杂交条件)或基于核酸扩增的技术如PCR技术可以用来鉴定对于其他芸苔属植物(如多种欧洲油菜、芜青或甘蓝变种、品系或群)内源的FAD2等位基因。为了对此类植物、植物器官或组织筛选FAD2等位基因的存在，可以使用序列表中提供的FAD2核酸序列或这些核酸序列中任意序列的变体或片段。例如，可以使用完整序列或片段作为探针或引物。例如，特异性或简并性引物可以用来从植物、植物器官或组织的基因组DNA扩增编码FAD2蛋白的核酸序列。可以使用标准分子生物学技术分离这些FAD2核酸序列并测序。生物信息学分析随后可以用来表征等位基因，例如以确定哪个FAD2等位基因对应于该序列和哪种FAD2蛋白或蛋白质变体由该序列编码。

另外，应当理解可以通过对核酸数据库筛选基本上相似的序列，以计算机方式鉴定FAD2核酸序列及其变体(或这些核酸序列中任意序列的片段)。类似地，核酸序列可以化学合成。也提供了下文进一步描述的本发明核酸分子的片段。

野生型FAD2核酸序列可以包括如本文所述的敲除FAD2核酸序列，例如分别为SEQID NO:10和19的完全敲除BnFAD2-A2和BrFAD2-2核酸序列，所述序列在编码序列中含有导致136个氨基酸的截短蛋白(分别为SEQ ID NO:12和21)的缺失，所述截短蛋白缺少五个TM结构域，三个组氨酸盒和ER检索基序(参见图1)，以及例如本文描述的SEQ ID NO:25的敲除BoFAD2-2核酸序列，所述序列在对应于BnFAD2-C2基因 (SEQ ID NO:13)的位置2608的位置处(即BoFAD2-2基因的位置2726 之后的位置)包含1nt缺失的缺失，所述缺失导致移码突变，导致290个氨基酸的截短蛋白(SEQ ID NO:27)，其缺少第三组氨酸盒和ER检索基序(参见图1)。因此，FAD2-A2基因的敲除fad2等位基因可以是 FAD2-A2基因的野生型FAD2等位基因。

编码突变FAD2蛋白的核酸序列

相对于野生型核酸序列包含一个或多个核苷酸缺失、插入或取代的核酸序列是本发明的另一个实施方案，而这类突变核酸分子的片段也是本发明的另一个实施方案。如下文进一步描述，使用多种已知方法，可以产生和/或鉴定此类突变核酸序列(称作fad2序列)。再次，此类核酸分子以内源形式和以分离的形式提供。在一个实施方案中，突变导致编码的FAD2蛋白的氨基酸序列中的一个或多个改变(缺失、插入和/或取代)(即，它不是“沉默突变”)。在另一个实施方案中，与野生型蛋白相比，核酸序列中的突变导致所编码的FAD2蛋白的显著减少或彻底消除的生物活性。

基本上，导致相对于野生型FAD2蛋白包含至少一个氨基酸插入，缺失和/或取代的FAD2蛋白的野生型FAD2核酸序列中的任何突变可导致显著降低的生物活性或无生物活性。然而，应当理解，FAD2蛋白中的某些突变更可能导致FAD2蛋白的生物学活性的完全消除，例如其中缺少显著部分的保守结构域例如一个或多个组氨酸盒的突变，或其中这些结构域内的某些关键氨基酸残基缺乏或被取代(优选被非相似或非保守氨基酸取代)的突变，而其他突变例如在组氨酸盒外或在TM结构域内的氨基酸取代结构域更可能导致FAD2蛋白的生物活性的降低，而不完全消除编码的 FAD2蛋白的生物学活性。

保守的第一，第二和第三组氨酸盒分别位于对应于SEQ ID NO:3的拟南芥FAD2蛋白的位置105-109、141-145和314-319的位置。保守的第一、第二、第三、第四和第五TM结构域分别位于对应于SEQ ID NO:3的拟南芥FAD2蛋白的位置56-76、117-137、179-199、225-245和252-272的位置。保守的ER检索基序位于对应于SEQ ID NO:3的拟南芥FAD2蛋白的位置379-383的位置。

拟南芥FAD2核酸(SEQ ID NO:1和2)和氨基酸(SEQ ID NO:3) 序列与本发明的芸苔属FAD2序列的最佳比对允许在这些芸苔属序列中确定相应的保守结构域和氨基酸的位置。

因此，保守的第一组氨酸盒位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、 24和27的位置105-109的位置；保守的第二组氨酸盒位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、24和27的位置141-145的位置；保守的第三组氨酸盒位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18和24的位置316-320的位置；保守的第一TM结构域位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、24和27的位置56-76的位置；保守的第二TM结构域位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、 18、24和27的位置117-137的位置；保守的第三TM结构域位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、24和27的位置179-199的位置；保守的第四TM结构域位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、24和27的位置226-246的位置；保守的第五TM结构域位于对应于SEQ ID NO:6、9、15、18、24和 27的位置253-273的位置；并且ER检索基序位于对应于SEQ ID NO:6、9、 15、18和24的位置380-384的位置。

本发明描述了敲除fad2等位基因，其可以是完全敲除等位基因，特别是例如，编码FAD2蛋白的HIOL101等位基因，所述蛋白中第一组氨酸盒的位置5处(即对应于SEQ ID NO:3的位置109的位置)的保守组氨酸 (His，H)被酪氨酸取代；编码FAD2蛋白的HIOL103等位基因，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:3的位置100的位置处的氨基酸后被截短并且缺失三个组氨酸盒，第二、第三、第四和第五TM结构域，和ER检索基序；在对应于SEQ ID NO:10的位置2057的位置包含终止密码子突变的HIOL111等位基因，和HIOL109等位基因，其编码FAD2蛋白，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:3的位置189的位置处的氨基酸后被截短，并且缺乏第三组氨酸盒，第三TM结构域的部分，以及完全的第四和第五TM结构域，以及ER检索基序。

因此，敲除fad2等位基因可以是编码其中至少一个保守组氨酸盒完全或部分缺失的FAD2蛋白的完全敲除fad2等位基因，例如编码其中至少第三组氨酸框被删除的截短的FAD2蛋白的fad2等位基因。这种fad2等位基因的实例是在编码第三组氨酸盒的第一个氨基酸的密码子(即对应于 SEQ ID NO:3的氨基酸315或SEQ ID NO:6、9或15的氨基酸316的氨基酸)的上游含有终止密码子突变的fad2等位基因，例如在对应于SEQ ID NO:4的位置2992或SEQ ID NO:7的位置3866或SEQ ID NO:13的位置 2704的位置的密码子上游含有终止密码子突变的fad2等位基因。完全敲除fad2等位基因也可以是编码FAD2蛋白的fad2等位基因，所述蛋白中至少一个保守的组氨酸盒中的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代，例如编码FAD2蛋白的fad2等位基因，所述蛋白中位于对应于SEQ ID NO:3 的位置105、106、107、108、109、141、142、143、144、145、315、316、 317、318或319，或对应于SEQ ID NO:6、9、15、18或24的位置105、 106、107、108、109、141、142、143、144、145、316、317、318、319 或320的位置的一个或多个氨基酸被取代，优选被非保守氨基酸取代。

完全敲除fad2等位基因也可以是不产生FAD2蛋白的等位基因(例如在启动子区域中具有缺失或突变的fad2等位基因不产生FAD2mRNA以及不产生FAD2蛋白)，或者其中FAD2编码序列(部分)被删除的等位基因。

敲除的FAD2基因因此可以包含一个或多个突变，如：

(a)“错义突变”，它是核酸序列中导致一个氨基酸取代另一个氨基酸的改变；

(b)“无义突变”或“终止密码子突变”，它是在核酸序列中导致早熟终止密码子的引入并因而翻译终止(产生截短的蛋白质)的改变；植物基因含有翻译终止密码子“TGA”(RNA中是UGA)、“TAA”(RNA中是UAA)和“TAG”(RNA中是UAG)；因而导致这些密码子之一处于正在翻译的成熟 mRNA中(可读框中)的任何核苷酸取代、插入、缺失将终止翻译；

(c)一个或多个氨基酸的“插入突变”，这归因于该核酸的编码序列中已经添加一个或多个密码子；

(d)一个或多个氨基酸的“缺失突变”，这归因于该核酸的编码序列中缺失一个或多个密码子；

(e)“移码突变”，其导致核酸序列在该突变下游的一个不同框中翻译。移码突变可能具有多种原因，如插入、缺失或重复一个或多个核苷酸；

(f)剪接位点突变，导致改变的剪接，这导致改变的mRNA加工并可因此导致编码的蛋白质改变或不产生蛋白质。

因而，在一个实施方案中，提供了包含一个或多个任何类型的上文所述突变的核酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含一个或多个终止密码子(无义)突变、一个或多个错义突变、一个或多个移码突变和/或一个或多个剪接位点突变的fad2序列。提供任一个上述突变核酸序列本身(处于分离的形式)，同样也提供了内源包含此类序列的植物和植物部分。在下文的表中，描述了包含一种或多种突变的fad2等位基因。

如本文所用，FAD2等位基因中的无义突变是FAD2等位基因中的突变，其中将一个或多个翻译终止密码子引入编码DNA和相应野生型FAD2 等位基因的相应mRNA序列。翻译终止密码子是TGA(mRNA中的UGA)， TAA(UAA)和TAG(UAG)。因此，导致在编码序列中产生符合读框的终止密码子的任何突变(缺失，插入或取代)将导致氨基酸链的翻译的终止和截短。在一个实施方案中，提供了敲除FAD2等位基因，其包括无义突变，其中通过单核苷酸取代将FAD2密码子序列中引入符合读框的终止密码子，例如CAG到TAG、TGG到TAG、TGG到TGA，或CAA到TAA的突变。在另一个实施方案中，提供了敲除FAD2等位基因，其包括无义突变，其中通过双重核苷酸取代在FAD2密码子序列中引入符合读框的终止密码子，例如例如CAG至TAA、TGG至TAA、或CGG至TAG或TGA的突变。在另一个实施方案中，提供了敲除FAD2等位基因，其包括无义突变，其中通过将诸如CGG突变到TAA的三核苷酸取代在 FAD2密码子序列中引入符合读框的终止密码子。截短的蛋白质缺乏由突变下游的编码DNA编码的氨基酸(即FAD2蛋白的C末端部分)，并保持由突变上游的编码DNA编码的氨基酸(即FAD2蛋白的N末端部分)。

BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-C2、BoFAD2-1和BrFAD2-基因中的一系列可能的EMS终止密码子突变分别显示在表1a-e中。

表1a：BnFAD2-A1中的可能的终止密码子突变

表1b：BnFAD2-C1中的可能的终止密码子突变

表1c：BnFAD2-C2中的可能的终止密码子突变

表1d：BrFAD2-1中的可能的终止密码子突变

表1e：BoFAD2-1中的可能的终止密码子突变

显然，突变不限于上表中所示的那些，并且可以理解，，类似的终止突变可以存在于除序列表中所述和上表中提到的那些之外的fad2等位基因中。

终止密码子突变和导致氨基酸取代的突变均可以导致功能减少或无可检测活性的蛋白质。

如本文所用，FAD2等位基因中的错义突变是FAD2等位基因中的任何突变(缺失，插入或取代)，藉此一个或多个密码子在相应野生型FAD2 等位基因的编码DNA和相应的mRNA序列中改变，所述突变导致野生型 FAD2蛋白中的一个或多个氨基酸被取代为在突变FAD2蛋白中的一个或多个其它氨基酸。在一个实施方案中，提供了完全敲除突变FAD2等位基因，其包括错义突变，所述错义突变导致SEQ ID NO:6(或与其基本相似的序列)中FAD2蛋白的109位组氨酸(His)残基的取代，特别是被酪氨酸(Tyr)残基取代，例如HIOL101等位基因(表2a)。

在另一个实施方案中，欧洲油菜中所述敲除的fad2基因选自包含以下突变的核酸：

-在SEQ ID No.4的第2371位置处C至T突变；

-在SEQ ID No.7的第3223位置处G至A突变；

-在SEQ ID No.10的第2057位置处C至T突变；

-在SEQ ID No.13的第2327位置处G至A突变。

来自如本文所述的A基因组的野生型和突变FAD2核酸序列如 BnFAD2-A1、BnFAD2-A2、BrFAD2-1和BrFAD2-2也适合用于包含A基因组的其他芸苔属物种，如芥菜(Brassicajuncea)中。

来自如本文所述的C基因组的野生型和突变FAD2核酸序列如 BnFAD2-C1、BnFAD2-C2、BoFAD2-1和BoFAD2-2也适合用于包含C 基因组的其他芸苔属物种，如埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)中。

本发明的氨基酸序列

提供来自十字花科、特别来自芸苔属物种、尤其来自欧洲油菜、芜青和甘蓝的野生型FAD2氨基酸序列和突变FAD2氨基酸序列(包含一个或多个突变，优选地导致FAD2蛋白的生物活性显著减少或无生物活性的突变)。另外，诱变方法可以用来在野生型FAD2等位基因中产生突变，因而产生可以编码其他突变FAD2蛋白的突变等位基因。在一个实施方案中，野生型和/或突变FAD2氨基酸序列在芸苔属植物内部(即内源地)提供。然而，本文中也提供分离的FAD2氨基酸序列(例如从植物分离或合成方式产生)以及其变体和这些序列中任一序列的片段。

已经分离来自欧洲油菜的FAD2-A1、FAD2-C1、FAD2-A2和FAD2-C2 蛋白、来自芜青的FAD2-1和FAD2-2蛋白和来自甘蓝的FAD2-1和FAD2-2 蛋白的氨基酸序列，如序列表中所述。描述了野生型FAD2序列，同时参考野生型FAD2序列，下文描述了这些序列的和基本上与这些序列相似的序列的突变FAD2序列。

根据本发明的“欧洲油菜FAD2-A1氨基酸序列”或“BnFAD2-A1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:6具有至少95％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“欧洲油菜FAD2-C1氨基酸序列”或“BnFAD2-C1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:9具有至少95％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“欧洲油菜FAD2-A2氨基酸序列”或“BnFAD2-A2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:12具有至少95％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“欧洲油菜FAD2-C2氨基酸序列”或“BnFAD2-C2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:15具有至少95％、98％、 99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“芜青FAD2-1氨基酸序列”或“BrFAD2-1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:18具有至少95％、98％、99％或 100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“芜青FAD2-2氨基酸序列”或“BrFAD2-2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:21具有至少95％、98％、99％或 100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“甘蓝FAD2-1氨基酸序列”或“BoFAD2-1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:24具有至少95％、98％、99％或 100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“甘蓝FAD2-2氨基酸序列”或“BoFAD2-2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:27具有至少95％、98％、99％或 100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的FAD2序列“基本上相似”或“基本上相同”。

“FAD2-A1蛋白”可以是BnFAD2-A1蛋白，或可以是BrFAD2-1蛋白。

“FAD2-C1蛋白”可以是BnFAD2-C1蛋白，或可以是BoFAD2-1蛋白。

“FAD2-A2蛋白”可以是BnFAD2-A2蛋白，或可以是BrFAD2-2蛋白。

“FAD2-C2蛋白”可以是BnFAD2-C2蛋白，或可以是BoFAD2-2蛋白。

因此，本发明提供了野生型蛋白的氨基酸序列，包括其变体和片段(如下文进一步定义)，以及这些氨基酸序列中任一序列的突变氨基酸序列，因而与相应野生型FAD2蛋白的生物活性相比，氨基酸序列中的突变优选地导致FAD2蛋白的生物活性显著减少或完全消除。

本文中提供了内源氨基酸序列和分离的氨基酸序列。还提供是上文定义的FAD2氨基酸序列和FAD2变体氨基酸序列的片段。FAD2氨基酸序列或其变体(如定义)的“片段”可以具有多种长度，如FAD2序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、150、175、180个连续氨基酸。

野生型FAD2蛋白的氨基酸序列

序列表中所述的氨基酸序列是来自欧洲油菜的野生型FAD2蛋白。因而，这些序列对于从中分离它们的欧洲油菜植物是内源的。如上所述，可以对其他芸苔属植物、变种、繁育系或野生群筛选具有相同氨基酸序列的其他有功能的FAD2蛋白或其变体。

另外，应当理解可以通过对氨基酸数据库筛选基本上相似的序列，以计算机方式鉴定FAD2核酸序列及其变体(或这些氨基酸序列中任意序列的片段)。也提供本发明氨基酸分子的片段。

野生型FAD2氨基酸序列可以包含非功能性FAD2蛋白的氨基酸序列，例如如本文所述的分别的SEQ ID NO:12和21的BnFAD2-A2和 BrFAD2-2氨基酸序列是136个氨基酸的截短的蛋白质，其缺少五个TM 结构域、三个组氨酸盒和ER检索基序(参见图1)，以及如本文所述的 SEQ ID NO:27的BoFAD2-2氨基酸序列，其是290个氨基酸的截短的蛋白质，其缺少第三组氨酸盒和ER检索基序(参见图1)。

突变FAD2蛋白的氨基酸序列

相对于野生型氨基酸序列包含一个或多个氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列是本发明的另一个实施方案，而这类突变氨基酸分子的片段也是本发明的另一个实施方案。如上所述，使用多种已知方法，可以产生和 /或鉴定此类突变氨基酸序列。再次，此类氨基酸分子以内源形式和以分离的形式提供。

在一个实施方案中，相对于野生型蛋白，氨基酸序列中的突变导致 FAD2蛋白的显著减少或彻底消除的生物活性。基本上如上所述，产生相对于野生型蛋白而言包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代的蛋白质的任何突变可以导致明显减少的生物活性或无生物活性。

因此，在一个实施方案中，提供了包含一个或多个缺失突变或插入突变的突变FAD2蛋白，因而所述缺失或插入产生具有明显减少的活性或没有活性的突变蛋白。此类突变FAD2蛋白是其中与野生型FAD2蛋白相比，缺失、插入或取代至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150 个、至少200个、至少250个或更多个氨基酸的FAD2蛋白，因而所述缺失或插入产生具有明显减少的活性或没有活性的突变蛋白。

在另一个实施方案中，提供了截短的突变FAD2蛋白，因而所述的截短产生具有显著减少的活性或没有活性的突变蛋白。具有显著减少或无活性的截短的FAD2蛋白可以是截短的FAD2蛋白，其至少缺乏第三组氨酸盒，例如在对应于SEQ ID NO:3的位置315的位置处截短的FAD2蛋白，或对应于SEQ ID NO:6、9、15、18或24的位置316的位置处截短的FAD2 蛋白，或在对应于SEQ ID NO:3的位置315的位置的上游的任何位置处截短的FAD2蛋白，或在对应于SEQ ID NO:6、9、15、18或24的位置 316的位置处截短的FAD2蛋白。

因此在又一个实施方案中，提供了包含一个或多个取代突变的突变 FAD2蛋白，因而所述取代产生具有显著减少的活性或没有活性的突变蛋白。具有一个或多个具有显著减少活性或无活性的取代突变的FAD2蛋白可以是FAD2蛋白，其中至少一个保守组氨酸盒中的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代，例如编码FAD2蛋白的fad2等位基因所述蛋白中在对应于SEQ ID NO:3的位置105、106、107、108、109、141、142、143、 144、145、315、316、317、318或319的位置的一个或多个氨基酸，或对应于SEQ ID NO:6、9、15、18或24的位置105、106、107、108、109、 141、142、143、144、145、316、317、318、319或320的位置的一个或多个氨基酸被取代，优选用非保守氨基酸取代。

保守氨基酸取代的实例是：

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile,Val
Arg	Lys	Lys	Arg,Gln
				Asn	Gln,His	Met	Leu,Ile
Asp	Glu	Phe	Met,Leu,Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr,Gly
Cys	Ser	Thr	Ser,Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp,Phe
				His	Asn,Gln	Val	Ile,Leu
Ile	Leu,Val

非保守氨基酸因此是除了保守氨基酸之外的氨基酸。在又一个实施方案中，来自欧洲油菜的所述突变FAD2蛋白选自包含以下突变的蛋白质：

-在SEQ ID No.6的第109位置处H至Y的取代；

-在SEQ ID No.9的第100位置处氨基酸后截短；

-在SEQ ID NO:15的第100位置处氨基酸后截短。

FAD3序列

FAD3-A1、FAD3-A2、FAD3-A3、FAD3-C1和FAD3-C2的核酸和氨基酸序列已经在WO2011/060946中描述(通过引用并入本文)。

根据本发明的“FAD3-A1核酸序列”或“FAD3-A1变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO:38具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列或与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-A2核酸序列”或“FAD3-A2变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO:41具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列或与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-A3核酸序列”或“FAD3-A3变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO:44具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列或与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-C1核酸序列”或“FAD3-C1变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO:47具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列或与SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-C2核酸序列”或“FAD3-C2变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO:50具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列或与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-A1氨基酸序列”或“FAD3-A1变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO:38具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-A2氨基酸序列”或“FAD3-A2变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO:41具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-A3氨基酸序列”或“FAD3-A3变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO:44具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-C1氨基酸序列”或“FAD3-C1变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO:47具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本上相似”或“基本上相同”。

根据本发明的“FAD3-C2氨基酸序列”或“FAD3-C2变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO:50具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与序列表中提供的FAD3序列“基本上相似”或“基本上相同”。

如本文所用，“敲除fad3等位基因”是指导致在体内细胞中明显减少或无功能FAD3表达的突变等位基因，即显著降低量的功能性FAD3蛋白或无功能FAD3蛋白。

敲除fad3等位基因的实例描述在WO2011/060946(通过引用并入本文)中，并且包括例如敲除fad2等位基因，其包含在对应于SEQ ID NO:37 的位置2405的位置处G至A取代；在对应于SEQ ID NO:40的位置3934 的位置处的G至A取代；在对应于SEQ ID NO:43的位置2847的位置处的 G至A取代；在对应于SEQ ID NO:46的位置2702的位置处的G至A取代；或在对应于SEQ ID NO:49的位置3909的位置处的G至A取代。

在另一方面，根据本发明的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代在种子油中具有增加的C18:1水平，例如在种子油中的C18:1水平约 73％至约75％，并保持正常的农艺发育。在另一方面，根据本发明的包含突变fad2等位基因和突变fad3等位基因的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代在种子油中具有增加的C18:1水平和降低的C18:3水平。还提供了根据本发明的种子的油。

本发明的另一方面提供了一种在保持正常农艺发育的同时提高种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括将FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因引入到欧洲油菜植物中，并选择包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的欧洲油菜植物，其进一步含有FAD2-C1基因，其中fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白。在另一个实施方案中，通过所述方法产生的芸苔属植物包含FAD2-A2基因的敲除fad2等位基因。

本发明的另一方面提供了一种在种子油中提高C18:1水平并降低 C18:3水平同时保持正常农艺发育的方法，所述方法包括将FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，和FAD3-A1 基因的敲除fad3等位基因、FAD3-A2基因的敲除fad3等位基因、FAD3-A3 基因的敲除fad3等位基因、FAD3-C1基因的敲除fad3等位基因，和 FAD3-C2基因的敲除fad3等位基因引入到欧洲油菜植物中，并选择包含欧洲油菜植物，所述欧洲油菜植物包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2 等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因，所述FAD3-A1 基因的所述敲除fad3等位基因、所述FAD3-A2基因的所述敲除fad3等位基因、所述FAD3-A3基因的所述敲除fad3等位基因、所述FAD3-C1基因的所述敲除fad3等位基因，和所述FAD3-C2基因的所述敲除fad3等位基因，其还含有FAD2-C1基因(其中fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白)，以及FAD2-A2基因(其中fad2等位基因是敲除fad2等位基因)。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法包括针对至少一个分子标记的存在通过分析基因组DNA从所述植物中来选择包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的欧洲油菜植物的步骤，其中至少一个分子标记与所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因连接，并且其中至少一个分子标记与所述FAD2-C2 基因的所述敲除fad2等位基因连接，并且任选地，其中至少一个分子标记与所述FAD2-A2基因或所述FAD2-C1基因的一个或多个fad2等位基因连接，或与所述FAD3-A1基因、所述FAD3-A2基因、所述FAD3-A3基因、所述FAD3-C1基因，或FAD3-C2基因的一个或多个fad3等位基因连接。

如本文所用的“C18:1”，也称作“油酸”、“顺式-9-十八烯酸”、“18:1”、“18:1(n-9)”、“9c-18:1”或“18:1cisΔ⁹“，指单不饱和ω-9脂肪酸，IUPAC 名称为(9Z)-十八碳-9-烯酸。

种子油中渐增的C18:1水平或增加的C18:1水平可以是C18:1水平增加至少2％、或至少5％、或至少8％、或至少10％、或至少12％。所述增加是相对于如对照植物中所获得的C18:1水平的增加。

在约73％至约75％之间的C18:1水平可以例如为70至78％之间或在 71至77％之间或72至76％之间或73％至75％之间的C18:1水平。

“C18:3”，也称为“亚麻酸(lonilenic acid)”或α-亚麻酸“。

如本文所用，“降低的C18:3”水平是指与对照植物相比，植物种子油中存在的总α-亚麻酸(C18:3)的量显着减少。包括降低的C18:3水平的所述植物的C18:3种子油含量降低至总种子油的11％wt，10％wt，9％ wt，8％wt，7.0％wt，6.0％wt，5.0％wt，4.0wt％，3.0wt％，2.5wt％，2.0wt％， 1.5wt％，1.0wt％，0.5wt％以下。

可以如本文所述测量种子油中的C18:1和C18:3水平，例如使用实施例4和5中所述的方法。

本文使用的“对照植物”通常是具有野生型水平的FAD2和/或FAD3 的相同物种的植物。本文所用的“野生型FAD2水平”是指自然界中最常见的植物中的FAD2蛋白的典型水平，其中FAD2基因是野生型FAD2基因。本文所用的“野生型FAD3水平”是指自然界中最常见的植物中的FAD3 蛋白的典型水平，其中FAD3基因是野生型FAD3基因。

本文使用的“保持正常农艺发育”是指具有与对照植物没有显著差异的农学参数。“保持正常的农艺发育”可以例如保持产量，或具有与对照植物没有显著差异的产量。保持正常的农艺发育也可以具有与对照植物没有显著差异的活力分数。“保持正常的农艺发育”也可以是与对照植物没有显著差异的建立、活力、开花开始、开花结束、植物高度、成熟度或蛋白质含量或其任何组合的分数。农艺参数可以例如如实施例5和6中所述来确定。

引入敲除fad2等位基因的方法可以包括步骤：用诱变化学物质或电离辐射处理种子或植物材料的步骤；鉴定具有突变的fad2基因的植物，其中所述FAD2基因在突变之前编码与SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18或SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的多肽 SEQ ID NO:18或SEQ ID No.24；以及选择与FAD2基因未突变的植物相比，在种子中具有增加的C18:1水平的植物。

所述FAD2基因在突变之前可以是例如与SEQ ID No:4、SEQ ID No.7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID No.22具有至少90％的序列同一性，或至少95％序列同一性，或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的FAD2基因，或者可以是cDNA与SEQ IDNo.5、SEQ ID No.8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性，或至少95％的序列同一性，或至少98％的序列同一性或具有 100％的序列同一性的FAD2基因。

引入FAD2的所述敲除等位基因也可以通过如下来发生：将来自一个植物的敲除FAD2等位基因引入到另一个植物中，例如通过将包含所述敲除FAD2等位基因的植物与不包含所述敲除FAD2等位基因的植物杂交，以及鉴定包含所述敲除FAD2等位基因的后代植物，任选地使用一种或多种分子标记物。

可以将所述敲除的fad2等位基因引入包含其中FAD2等位基因编码功能性FAD2蛋白的FAD2-C1基因的欧洲油菜植物。或者，所述敲除fad2 等位基因和编码功能性FAD2蛋白的所述FAD2-C1基因的所述FAD2等位基因都可以被引入欧洲油菜植物。

在另一个实施方案中，提供一种在生物样品中确定敲除fad2等位基因存在或不存在的方法，所述方法包括提供来自所述生物样品的基因组DNA 并且对所述DNA分析至少一种分子标记物的存在，其中至少一种分子标记物与所述敲除fad2等位基因连接。

可以通过从所述生物样品分离基因组DNA，提供所述基因组DNA。分离基因组DNA涉及从如组织的分离部分(例如叶的部分)分离包含基因组DNA的生物样品。从所述生物样品分离基因组DNA可以，但是不需要包括纯化来自所述样品的基因组DNA。

另一个实施方案，提供一种用于检测芸苔属DNA样品中敲除fad2等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个PCR引物对，所述PCR 引物对能够扩增与所述敲除fad2等位基因连接的DNA标记。

另一个实施方案提供一种确定植物或其细胞、部分、种子或后代中敲除fad2等位基因的接合性状态的方法，所述方法包括确定所述植物或其细胞、部分、种子或后代的基因组DNA中敲除和/或相应野生型FAD2特异性区域的存在。

所述敲除的FAD2等位基因可以被从一个植物转移至另一个植物，其包括步骤：(a)鉴定包含至少一种敲除的fad2等位基因的第一植物；(b) 将第一植物与不包含该至少一种敲除的fad2等位基因的第二植物杂交并从杂交收集F1杂交种子；(c)任选地，鉴定包含至少一种敲除的fad2等位基因的F1植物；(d)将包含至少一种敲除的fad2等位基因的F1植物与不包含至少一种敲除的fad2等位基因的第二植物回交至少一个世代(x)并且从杂交收集BCx种子；和(e)在每个世代中通过对所述BCx植物的基因组 DNA分析至少一种分子标记物的存在，鉴定包含至少一种敲除的fad2等位基因的BCx植物，其中至少一种分子标记与所述敲除的fad2等位基因连接。

与所述FAD2基因的敲除等位基因连接的分子标记或所述突变FAD2 等位基因可以包含如下文所述的特异性检测所述FAD2基因的所述敲除等位基因的一种或更多种引物或探针。

本发明的方法

提供了方法，其用于产生和选择包含FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1 和FAD2-C2基因的欧洲油菜种子植物以及其细胞、部分、种子和后代，其具有种子中的增加的C18:1水平，FAD2-A1的敲除fad2等位基因和 FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，并且其中所述FAD2-C1基因的fad2 等位基因编码功能性FAD2蛋白，以及所述方法用于在具有种子中增加的 C18:1水平的植物或植物部分中区分敲除突变fad2等位基因和野生型 FAD2等位基因的存在。因此，提供了这样的方法(例如诱变和/或标记物辅助选择)，所述方法用于产生和/或鉴定敲除fad2等位基因或包含这种 fad2等位基因的种子植物或植物部分并用于在单一种子植物中组合合适数目的敲除fad2等位基因和/或不同类型的敲除fad2等位基因以改变植物种子中C18:1的水平，同时保持正常的农艺发育。

可以使用一系列在本领域为常规的方法，例如使用扩增部分或全部 fad2基因组或cDNA的基于核酸扩增的方法，产生(例如通过诱变法诱导) 和/或鉴定突变fad2等位基因。

诱变后，使用已知技术从处理的种子长出或从处理的细胞再生出植物。例如，可以根据常规培育方法种植诱变的种子并且在自花授粉后，在该植物上形成种子。备选地，可以从处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体小植物以立即形成纯合植物，例如，如Coventry等人(1988,Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus.Dep.CropSci.Techn. Bull.OAC Publication 0489.Univ.of Guelph,Guelph,Ontario,Canada)所描述。可以在当前或后续世代收获因这种自花授粉形成的额外种子并且使用本领域常用的技术，例如基于核酸扩增的技术，如基于聚合酶链反应 (PCR)的技术(扩增fad2等位基因)或基于杂交的技术，例如DNA印迹分析、 BAC文库筛选等和/或对fad2等位基因直接测序，筛选突变FAD2等位基因的存在。为了筛选突变FAD2等位基因中点突变(所谓单核苷酸多态性或 SNP)的存在，可以使用本领域常规的SNP检测方法，例如基于寡核苷酸连接(oligoligation)的技术、基于单碱基延伸的技术或基于限制性位点中差异的技术，如TILLING。

如上所述，对特定野生FAD2等位基因的(自发的以及诱导的)诱变导致在所得的突变FAD2等位基因中存在一个或多个缺失、插入或取代的核苷酸(在下文称作“突变区域”)。突变FAD2等位基因可以因而由野生型 FAD2等位基因中一个或多个缺失、插入或取代的核苷酸的位置和构型表征。野生型FAD2等位基因中已经分别插入、缺失或取代一个或多个核苷酸的位点在本文中也称作“突变区或序列”。如本文中所用，“5’或3’侧翼区或序列”指在突变(或相应野生型)FAD2等位基因中至少20bp、优选至少 50bp、至少750bp、至少1500bp和直至5000bp DNA的DNA区域或序列，所述DNA区域或序列不同于含有所述一个或多个缺失、插入或取代核苷酸的DNA，优选地不同于来自所述突变(或相应野生型)FAD2等位基因的DNA，所述DNA紧邻所述突变FAD2等位基因(或在相应的野生型 FAD2等位基因)中突变区上游并且与之连续存在(5’侧翼区或序列”)或者紧邻突变区下游并且与之连续存在(3’侧翼区或序列”)。如本文所用，“连接区”指在突变(或相应野生型)FAD2等位基因中突变区和5’或3’侧翼区彼此连接的DNA区域。“跨越突变区和5’或3’侧翼区之间连接区的序列”因此包含突变序列以及与之连续存在的侧翼序列。

为鉴定特定突变FAD2等位基因或包含特定突变FAD2等位基因的植物或植物材料或包含植物材料(其包含特定突变FAD2等位基因)的产品所开发的工具是基于特定突变FAD2等位基因与相应野生型FAD2等位基因的基因组特征相比的特定基因组特征，如包含突变区的基因组区的特异性限制图谱、包含如下文描述的引物和/或探针的分子标记物或侧翼区和/或突变区的序列。

一旦已经将特定突变FAD2等位基因测序，则可以借助分子生物学技术开发分子标记物，如引物和探针，所述分子标记物特异性识别在样品的核酸(DNA或RNA)中突变FAD2等位基因的5’侧翼区、3’侧翼区和/或突变区内的序列。例如，可以开发扩增方法以鉴定生物样品(如植物样品、植物材料样品或包含植物材料的产品的样品)中的突变FAD2等位基因。这种扩增基于至少两种“特异性引物”，分别为：识别突变FAD2等位基因的5’或3’侧翼区域内序列的一种引物和识别突变FAD2等位基因的3’或5’侧翼区域内序列的另一种引物；或识别突变FAD2等位基因的5’或3’侧翼区域内序列的一种引物和识别突变FAD2等位基因的突变区内序列的另一种引物；或识别突变FAD2等位基因的5’或3’侧翼区内序列的一种引物和识别下述序列的另一种引物，所述序列跨越特定突变FAD2等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间的连接区(如下文进一步描述)。

所述引物优选地具有15个至35个核苷酸的序列，所述核苷酸在优化的扩增条件下“特异性识别”5’或3’侧翼区内的序列、突变区内的序列或跨越特定突变FAD2等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间连接区内的序列，因而从包含特定突变FAD2等位基因的核酸样品中扩增特异性片段(“突变FAD2特异性片段”或区分性扩增子)。这意味在优化的扩增条件下仅扩增所靶向的突变FAD2等位基因并且不扩增植物基因组中的其他序列。

适用于本发明的PCR引物可以是以下引物：

-长度范围从17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变 FAD2等位基因的5’或3’侧翼序列中的至少17个连续核苷酸、优选地 20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如在本发明的突变FAD2等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列，如在上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变 5’或3'侧翼的序列或在上表中所示的终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'侧翼的序列或其互补序列)(识别5’侧翼序列的引物)；

-长度范围从17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变 FAD2等位基因的突变区的序列中至少17个连续核苷酸、优选地20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列(即，例如在本发明FAD2 基因中所插入或取代的核苷酸的序列或其互补序列)(识别突变序列的引物)。

引物当然可以比提到的17个连续核苷酸更长，并且可以长例如18、 19、20、21、30、35、50、75、100、150、200nt或甚至更长。所述引物可以完全由选自侧翼序列和突变序列的所提及核苷酸序列中的核苷酸序列组成。然而，引物在其5’端(即位于3’的17个连续核苷酸外侧的)核苷酸序列是较不重要的。因而，所述引物的5’序列可以根据需要由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但是可以含有几个(例如1、2、5、10 个)错配。所述引物的5’序列甚至可以完全由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列(例如代表限制酶识别位点的核苷酸序列)组成。这类不相关序列或带错配的侧翼DNA序列应当优选地不长于100个、更优选地不长于50个或甚至25个核苷酸。

另外，合适的引物可以包含下述核苷酸序列或由其组成，所述的核苷酸序列跨越侧翼序列和突变序列之间的连接区(即，例如，在本发明的突变FAD2等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列和所插入或取代的一个或多个核苷酸的序列或分别在缺失的一个或多个核苷酸3’或5’旁侧侧翼的序列之间的连接区，如在本发明的FAD2基因中上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变3’或5'侧翼的序列和无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变的序列之间的连接区、或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或 3'侧翼的序列和潜在终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区(分别)，条件是所述核苷酸序列不仅仅从突变区或侧翼区衍生。

技术人员也将马上明白：恰当选择的PCR引物对还应当不包含彼此互补的序列。

出于本发明的目的，“SEQ ID No:X中所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列”是可以通过以下方式从所代表的核苷酸序列衍生的核苷酸序列：将所述核苷酸根据Chargaff’法则替换为其互补性核苷酸并以 5’至3’方向(即以所代表的核苷酸序列的相反方向)读取该序列。

在实施例中描述了合适鉴定特定突变FAD2等位基因的引物的例子。

如本文中所用，“SEQ ID No.Z从位置X至位置Y的核苷酸序列”指包括两个核苷酸终点在内的核苷酸序列。

优选地，扩增的片段具有50个至1000个核苷酸的长度，如，50个至 500个核苷酸的长度或50至350个核苷酸的长度。特异性引物可以具有这种序列，所述序列与特定突变FAD2等位基因的5’或3’侧翼区内的序列、与突变区内的序列、与跨越其3’或5’侧翼区和突变区之间连接区的序列有 80％至100％同一性，条件是错配仍允许用这些引物在优化的扩增条件下特异性鉴定特定突变FAD2等位基因。但是，可允许错配的范围可以通过实验轻易确定并且是本领域技术人员已知的。

可以按多种方式进行“突变FAD2特异性片段”的检测和/或鉴定，例如，通过凝胶电泳或毛细管电泳后的大小评估或通过基于荧光的检测方法。也可以对突变FAD2特异性片段直接测序。用于检测扩增的DNA片段的其他序列特异性方法也是本领域已知的。

本领域中描述了标准核酸扩增方案，如PCR方案，如在'PCR Applications Manual"(Roche Molecular Biochemicals,第2版,1999)和其他参考文献中描述。在每种特定突变FAD2等位基因的“PCR鉴定方案”中详述用于扩增的最适条件(包括特异性引物的序列)。然而，可以理解PCR 鉴定方案中的许多参数可能需要针对具体实验室条件调整并且可以作出轻微修改以获得相似的结果。例如，用于制备DNA的不同方法的使用可能需要调整，例如所用的引物的量、聚合酶、MgCl₂浓度或退火条件。类似地，其他引物的选择可以决定用于PCR鉴定方案的其他最适条件。但是，对本领域技术人员而言，这些调整将显而易见并且在目前的PCR应用手册(如上文引用的那本手册)中进一步详述。

备选地，特异性引物可以用来扩增突变FAD2特异性片段，所述片段可以用作鉴定生物学样品中特定突变体FAD2等位基因的“特异性探针”。生物样品的核酸与探针在允许该探针与核酸中相应片段杂交的条件下的接触导致核酸/探针杂交分子的形成。可以检测这种杂交分子的形成(例如标记所述核酸或探针)，因而这种杂交分子的形成指示存在特定突变FAD2 等位基因。本领域中已经描述这类基于与特异性探针(在固相载体上或在溶液中)杂交的鉴定方法。特异性探针优选地是在优化条件下与特定突变 FAD2等位基因的5’或3’侧翼区内部和/或其突变区内部的区域(下文称作“突变FAD2特异性区域”)特异性杂交的序列。优选地，所述特异性探针包含长度在10和1000bp之间、50和600bp之间、100和500bp之间、150 和350bp之间的序列，所述序列与特定区域的核苷酸序列有至少80％、优选地80％至85％、更选地85％至90％、尤其优选地90％至95％、最优选地95％至100％同一(或互补)。优选地，该特异性探针将包含与特定突变FAD2等位基因的特定区域相同(或互补)的约13个至约100个连续核苷酸的序列。

适用于本发明的特异探针可以是以下探针：

-长度范围从13nt至约1000nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变 FAD2等位基因的5’或3’侧翼序列中的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如在本发明的突变FAD2等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列，如在上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变5’或3'侧翼的序列或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'侧翼的序列)，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别5’侧翼序列的探针)；或

-长度范围从13nt至约1000nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变 FAD2等位基因的突变序列中至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列(即，例如在本发明FAD2基因中插入或取代的核苷酸的序列，或其互补序列)，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别突变序列的探针)。

所述探针可以完全由选自侧翼序列和突变序列的所提及核苷酸序列中的核苷酸序列组成。然而，探针在其5'或3'端的核苷酸序列较不重要。因而，所述探针的5'或3'序列可以根据需要由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但是可以由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列组成。这类不相关的序列应当优选地不长于50个、更优选地不长于25个或甚至不长于20个或15个核苷酸。

另外，合适的探针可以包含下述核苷酸序列或由其组成，所述的核苷酸序列跨越侧翼序列和突变序列之间的连接区(即，例如，在本发明的突变 FAD2等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸的5’或3'侧翼的序列和插入或取代的一个或多个核苷酸的序列或缺失的一个或多个核苷酸分别3’或5’侧翼的序列之间的连接区，如在本发明的FAD2基因中上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变5’或3'侧翼的序列和所述无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变的序列之间的连接区、或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3' 侧翼的序列分别与所述潜在终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区)，条件是提到的核苷酸序列不仅仅从突变区或侧翼区衍生。

在实施例中描述了适合于鉴定特定突变fad2等位基因的特异性探针的实例。

可以按多种方式检测和/或鉴定与特异性探针杂交的“突变FAD2特异性区域”，例如，通过凝胶电泳后大小评估或通过基于荧光的检测方法。用于检测与特异性探针杂交的“突变FAD2特异性区域”的其他序列特异性方法也是本领域已知的。

备选地，可以使用其他方法，如使用PCR筛选通过快中子诱变法产生的缺失突变体的“Deleteagene^TM法”(Li和Zhang,2002,Funct Integr Genomics 2:254-258综述)、通过使用检测碱基对改变的变性高效液相色谱 (DHPLC)借助异源双链体分析鉴定EMS诱导的点突变的TILLING法(定向诱导的基因组中局部损伤)(McCallum等人,2000,Nat Biotech 18:455和 McCallum等人2000,Plant Physiol.123,439-442)等，产生并鉴定包含一种或多种突变fad2等位基因的植物或植物部分。如所提及，TILLING使用针对突变的高通量筛选法(例如使用Cel 1切割突变-野生型DNA异源双链体并使用测序凝胶系统检测)。因此，本文中涵盖使用TILLING鉴定包含一种或多种突变fad2等位基因的植物或植物部分和用于产生并鉴定这类植物、植物器官、组织和种子的方法。因而在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：诱变植物种子(例如EMS诱变)、汇集植物个体或DNA、 PCR扩增目的区域、异源双链体形成和高通量检测、鉴定突变植物、突变 PCR产物的测序。可以理解，其他诱变方法和选择方法可以同等地用来产生此类突变植物。

可以通过本领域已知的方法鉴定天然(自发)突变等位基因，而不是在 FAD2等位基因中诱导突变。例如，ECOTILLING可以用来(Henikoff等人2004,Plant Physiology 135(2):630-6)对多个植物或植物部分筛选天然突变fad2等位基因的存在。就上述的诱变技术而言，优选地筛选包含A和/ 或C基因组的芸苔属物种，从而鉴定的fad2等位基因可以随后通过杂交(种间或种内杂交)和选择引入其他芸苔属物种如欧洲油菜。在ECOTILLING 中，通过上文所述的TILLING方法学筛选繁育系或相关物种中的天然多态性，其中将植物个体或汇集物用于PCR扩增fad2靶、异源双链体形成和高通量分析。随后可以选择具有所需突变的单个植物，其中所述植物随后可以用于育种计划中以掺入想要的突变等位基因。

鉴定的突变等位基因可以随后进行测序并且序列可以与野生型等位基因比较以鉴定突变。任选地可以如上文所示检验功能。使用这种方法，可以鉴定多个突变fad2等位基因(和包含这些等位基因中一个或多个等位基因的芸苔属植物)。想要的突变等位基因可以随后通过如下文进一步描述的杂交方法和选择方法与想要的野生型等位基因组合。最后，产生了包含想要数目的突变fad2和想要数目的野生型FAD2等位基因的单株植物。

适合作为PCR引物或特异性探针用于检测特定突变FAD2等位基因的寡核苷酸也可以用来开发多种方法以确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态。

为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以开发基于核酸扩增的测定法以确定突变FAD2特异性等位基因和/或相应野生型FAD2特异性等位基因的存在。

为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型FAD2等位基因的两条引物，从而它们彼此相对并具有位于所述引物之间的突变区。这些引物可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的引物。这套引物允许同时诊断性地扩增该突变体以及相应的野生型 FAD2等位基因。

备选地，为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型FAD2等位基因的两种引物，从而它们彼此相对并且其中一者特异性识别突变区。这些引物可以是分别特异性识别野生型 FAD2等位基因的5’或3’侧翼区及突变区序列的引物。这套引物，连同特异性识别突变FAD2等位基因中突变区序列的第三引物一起，允许同时诊断性扩增突变FAD2基因以及野生型FAD2基因。

备选地，为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型FAD2等位基因的两种引物，从而它们彼此相对并且其中一者特异性识别5’或3’侧翼区和突变区之间的连接区。这些引物可以是分别特异性识别5’或3’侧翼序列和野生型FAD2等位基因的突变区和3’或5’侧翼区之间连接区的引物。这套引物，连同分别识别突变FAD2等位基因的突变区和3’或5’侧翼区之间连接区的第三引物，允许同时诊断性地扩增突变FAD2基因以及野生型FAD2基因。

备选地，可以通过使用特异性识别突变及野生型FAD2等位基因的备选性引物组，确定某个特定突变FAD2等位基因的接合性状态。

如果该植物对突变FAD2基因或相应野生型FAD2基因为纯合，则上文所述的诊断性扩增测定法将产生对突变或野生型FAD2等位基因为典型、优选在长度方面为典型的单一扩增产物。如果该植物对这种突变FAD2 等位基因为杂合，则两种特异性扩增产物将出现，反映了突变及野生型 FAD2等位基因的同时扩增。

可以通过以下方式鉴定野生型及突变FAD2特异性扩增产物，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，针对包含许多插入或缺失的核苷酸的突变FAD2等位基因，其中所述插入或缺失的核苷酸在扩增自野生型及突变FAD2等位基因的片段之间造成大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视地分开)；通过凝胶电泳或毛细管电泳后评价这两个不同片段的存在或不存在，因而诊断性扩增突变FAD2等位基因可以任选地与诊断性扩增野生型FAD2等位基因分别进行；或通过扩增片段的直接测序或通过基于荧光的检测方法。

在实施例中描述了合适确定特定突变FAD2等位基因接合性的引物的例子。

备选地，为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以开发基于杂交的测定法以确定突变FAD2特异性等位基因和/或相应野生型 FAD2特异性等位基因的存在。

为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以按如此方式设计识别野生型FAD2等位基因的两个特异性探针，从而每个探针特异性识别FAD2野生型等位基因内部的序列并且突变区位于探针识别的序列之间。这些探针可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的探针。使用这些探针之一、优选地使用这两个探针允许同时诊断性杂交突变FAD2等位基因以及相应的野生型FAD2等位基因。

备选地，为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以按如此方式设计识别野生型FAD2等位基因的两个特异性探针，从而这两个探针之一特异性识别FAD2野生型等位基因内部突变区上游或下游的序列、优选地突变区上游的序列并且这两个探针之一特异性识别突变区。这些探针可以是分别特异性识别野生型FAD2等位基因的5’或3’侧翼区(优选地 5'侧翼区)序列和突变区序列的探针。使用这些探针之一、优选地使用这两个探针，任选地连同特异性识别突变FAD2等位基因中突变区序列的第三探针一起，允许断性杂交突变体和野生型FAD2基因。

备选地，为了确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态，可以如此设计识别野生型FAD2等位基因的特异性探针，从而所述探针特异性识别野生型FAD2等位基因的5’或3’侧翼区(优选地5'侧翼区)和突变区之间的连接区。这种探针，任选地连同特异性识别突变FAD2等位基因的5’或3’侧翼区(优选地5'侧翼区)和突变区之间连接区的第二探针，允许诊断性地杂交所述突变体以及野生型FAD2基因。

备选地，可以通过使用特异性识别突变及野生型FAD2等位基因的备选性探针组，确定特定突变FAD2等位基因的接合性状态。

如果该植物对突变FAD2基因或相应野生型FAD2基因为纯合，则上文所述的诊断性杂交测定法将产生对突变FAD2等位基因或野生型FAD2 等位基因为典型、优选地在长度方面为典型的单一特异性杂交产物，如一个或多个杂交DNA(限制性)片段。如果该植物对这种突变FAD2等位基因为杂合，则两种特异性杂交产物将出现，反映突变及野生型FAD2等位基因均杂交。

可以通过以下方式鉴定野生型及突变FAD2特异性杂交产物，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，针对包含许多插入或缺失的核苷酸的突变FAD2等位基因，其中所述插入或缺失的核苷酸在来自野生型及突变FAD2等位基因的DNA(限制性)片段之间造成大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视地分开)；通过凝胶电泳或毛细管电泳后评价这两个不同特异性杂交产物的存在或不存在，因而诊断性杂交突变FAD2等位基因可以任选地与诊断性杂交野生型FAD2等位基因分别进行；通过杂交 DNA(限制性)片段的直接测序；或通过基于荧光的检测方法。

另外，还可以使用本文中提供的特定突变FAD2等位基因的具体序列信息，开发专用于特定突变FAD2等位基因的检测方法，所述检测方法不同于基于PCR或基于杂交的扩增方法。这类备选性检测方法包括基于侵入性切割特定核酸结构的线性信号扩增检测方法，也称作Invader^TM技术 (如在通过引用方式并入本文的例如美国专利5,985,557“核酸的侵入性切割”、美国专利6,001,567“通过入侵者指导的切割作用检测核酸序列”中描述)、基于RT-PCR的检测方法(如Taqman)或其他检测方法，如SNPlex。简而言之，在Invader^TM技术中，靶突变序列可以例如与包含突变序列的核苷酸序列的经标记的第一核酸寡核苷酸或跨越5'侧翼区和突变区之间连接区的序列杂交并且与包含紧邻突变序列下游并与之毗邻的3'侧翼序列的第二核酸寡核苷酸杂交，其中第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过这种杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶进行选择性探针切割，靶序列保持完整。随后检测切割的经标记探针，可能借助导致进一步信号放大的中间步骤检测。

如本文中所用，“试剂盒”指一组试剂，所述试剂的目的在于实施本发明的方法、更具体地鉴定生物样品中的特定突变FAD2等位基因或确定包含特定突变FAD2等位基因的植物材料的接合性状态。更具体地，本发明试剂盒的优选实施方案包含如上所述的用于鉴定特定突变FAD2等位基因的至少两种特异性引物或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性引物。任选地，该试剂盒可以还包含PCR鉴定方案中本文所述的任何其他试剂。备选地，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可以包含用于鉴定特定突变FAD2等位基因的至少一种特异性探针，所述特异性探针与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定如上文所述的特定突变FAD2等位基因在其中的存在，或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性探针。任选地，该试剂盒还可以包含使用所述特异性探针鉴定生物样品中特定突变FAD2等位基因的任何其他试剂(如但不限于杂交缓冲液、标记物)。

本发明的试剂盒可以用于以下目的，并且其组分可以针对以下目的专门调整：质量控制(例如，种子批的纯度)、检测特定突变FAD2等位基因在植物材料或者包含或衍生自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在。

如本文中所用的术语“引物”包括能够在模板依赖的过程如PCR中引发新生核酸合成的任意核酸。一般而言，引物是10个至30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长序列。引物可以按双链形式提供，不过优选单链形式。探针可以作为引物使用，不过将探针设计为与靶DNA或RNA 结合并且不需要用于扩增过程中。

当谈及特异性引物时，如本文中所用的术语“识别”指以下事实：特异性引物在本发明方法中所述的条件(如PCR鉴定方案条件)下与特定突变 FAD2等位基因中的核酸序列特异性杂交，因而特异性由阳性对照和阴性对照的存在决定。

当谈及特异性探针时，如本文中所用的术语“杂交”指以下事实：该探针在标准严格性条件下与特定突变FAD2等位基因的核酸序列中的特定区域结合。如本文中所用，标准严格性条件指用于本文中所述的杂交的条件或指如Sambrook等人,1989 1989(MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbour Laboratory Press,NY)所述的常规杂交条件，所述常规杂交条件例如可以包括以下步骤：1)将植物基因组DNA 片段或BAC文库DNA固定在滤膜上，2)将所述滤膜在65℃于6×SSC、 5×Denhardt试剂、0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA中预杂交1至2 小时，3)添加已经标记的杂交探针，4)温育16至24小时，5)将滤膜在68℃于6×SSC,0.1％SDS中洗涤1次30分钟，6)将滤膜在68℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤3次(在30ml中持续30分钟洗涤2次和在500ml中持续10分钟洗涤1次)，以及7)使该滤膜在-70℃暴露于X射线膜(X-ray film)4 至48小时。

如本文中所用，“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”意在包括处于任何成熟阶段的植物组织以及取自或衍生自任意这种植物的任何细胞、组织或器官，包括而不限于任何种子、叶、茎、花、根、单个细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文中所用，“植物材料”指从植物获得或衍生的材料。包含植物材料的产品涉及使用植物材料产生或可以被植物材料污染的食品、饲料或其他产品。在本发明的上下文中，可以理解对此类生物学样品检测对特定突变 FAD2等位基因特异的核酸的存在，所述存在暗示样品中存在核酸。因而本文中提及的用于鉴定生物样品中特定突变FAD2等位基因的方法涉及鉴定生物样品中包含所述特定突变FAD2等位基因的核酸。

在另一个实施方案中，提供了在单独欧洲油菜植物中将FAD2-A1基因的至少一个敲除fad2等位基因与FAD2-C2基因的至少一个敲除fad2等位基因组合的方法，所述方法包括a)产生和/或鉴定两种或更多种植物，每种植物包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因；b)将包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因的第一植物与包含一种或多种其它选择的敲除 fad2等位基因的第二植物杂交；c)从杂交收集种子，并且任选地鉴定包含 FAD2-A1基因的至少一个敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一个敲除fad2等位基因的植物；以及任选地d)重复步骤b)和c)，直到获得包含至少一个FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一个敲除fad2等位基因的植物。在另一个实施方案中，步骤d)中获得的所述植物包含至少一个FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和至少一个 FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，包含FAD2-C1基因(其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白)，并且包含FAD2-A2基因(其fad2等位基因是敲除fad2等位基因)。

可以通过如下来增加芸苔属植物种子中C18:1的水平：产生和/或选择包含FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1和FAD2-C2基因的欧洲油菜植物，其中所述植物包含FAD2-A1和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，并且其中所述FAD2-C1基因的fad2等位基因编码如上所述的功能性FAD2 蛋白，以及选择在种子中具有增加的C18:1水平的植物，同时保持正常的农艺发育。

可以通过如下制备具有增加的C18:1的水平同时保持正常的农艺发育的包含4个FAD2基因的杂交欧洲油菜植物或种子：产生和/或鉴定以杂合状态包含FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因、FAD2-C2基因的敲除等位基因、和编码功能性蛋白的FAD2-C1基因的FAD2等位基因的第一植物，以及以纯合状态包含FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因、FAD2-C2基因的敲除等位基因，和编码功能性蛋白质的FAD2-C1基因的FAD2等位基因的第二植物，杂交第一和第二植物，并且从包含所述fad2等位基因的杂交物中收集F1杂种种子。

根据本发明的敲除fad2等位基因可以根据标准育种技术组合。

例如，敲除fad2等位基因可以通过以下从一株芸苔属植物转移到另一株：a)如上所述的产生和/或鉴定包含一个或多个选择的敲除fad2等位基因的第一植物，或如上所述通过在一株植物中组合一个或多个选择的敲除 fad2等位基因来产生第一植物(其中第一植物对于一个或多个敲除fad2 等位基因是纯合的或杂合的)，b)将包含一个或多个敲除fad2等位基因的第一植物与不包含一个或多个敲除fad2等位基因的第二植物杂交，从杂交物收集F1种子(其中如果第一植物对于敲除fad2等位基因是纯合的，则种子对于该敲除fad2等位基因是杂合的，并且其中如果第一植物对于敲除fad2等位基因是杂合的，则对于该敲除fad2等位基因，一半种子是杂合的，且一半种子是不成对的，即不包含敲除fad2等位基因)，以及任选地鉴定F1植物，其包含一个或多个选择的敲除fad2等位基因，如上所述，c)使包含一个或多个选择的敲除fad2等位基因的F1植物与不包含一个或多个选择的敲除fad2等位基因的第二植物回交一个或多个世代(x)，从杂交物中收集BCx种子，以及在每个世代中鉴定包含一个或多个选择的敲除fad2等位基因的BCx植物，如上所述，d)任选地，通过实施下列步骤之一产生对于一个或多个选择的敲除fad2等位基因为纯合的BCx植物：

-如上所述的从包含一个或多个所需的敲除fad2等位基因的BCx植物的经处理的小孢子或花粉细胞中提取双重单倍体植物，

-将包含一个或多个所需的敲除fad2等位基因的BCx植物自交一个或多个世代(y)，从自交收集BCx Sy种子，并鉴定BCx Sy植物，其对于一个或多个所需的敲除fad2等位基因是纯合的，如上所述。

第一和第二种芸苔属植物可以是欧洲油菜植物。或者，第一植物可以是欧洲油菜植物，且第二植物可以是欧洲油菜繁育系。如本文所使用的，“繁育系”是优选的纯合植物品系，其通过用于产生杂交后代的优选基因型和/或表型与其它植物品系区分开。

在本发明的另一方面，提供了FAD2基因的敲除fad2等位基因，其中敲除fad2等位基因是天然FAD2基因的突变形式，其中天然FAD2基因选自：(a)FAD2-A1基因，其包含与SEQID NO:4的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和(b)FAD2-C2基因，其包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少 90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ IDNO:15的序列具有至少 90％序列同一性的蛋白质，例如敲除fad2等位基因，其是所述FAD2-A1 基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:4的位置2371的位置上包含C至T的取代；或其是FAD2-C2基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:52的位置2327的位置处包含G至A的取代。

在另一个实施方案中，提供了用于生产油的方法，其包括从根据本发明的植物(即包含本发明的敲除FAD2基因的植物)中收获种子，并从所述种子中提取油。

在又一个实施方案中，提供了生产食物或饲料(例如油，膳食(meal)，谷物，淀粉，面粉或蛋白质)或工业产品(例如生物燃料，纤维，工业化学品，药物或营养食品)的方法，包括获得根据本发明的植物或其部分，以及从植物或其部分制备食品，饲料或工业产品。

另一个实施方案提供了根据本发明的敲除fad2等位基因在维持正常农艺发育的同时提高欧洲油菜植物的种子油中C18:1的水平的用途。另一个实施方案提供了产生欧洲油菜植物的方法，所述植物在种子油中包含提高的C18:1水平并保持正常的农艺发育，所述方法包括播种根据本发明的种子和从所述种子生长植物。

根据本发明的植物，例如包含根据本发明的敲除FAD2基因的植物，可进一步用于产生种子，例如具有增加的C18:1水平的种子，或者产生具有增加的C18:1水平的种子油。

本发明植物可以另外含有赋予除草剂抗性的内源基因或转基因，如赋予草铵膦(glufosinate ammonium)(或)抗性的bar 或pat基因[EP0 242 236和EP 0 242 246通过引用的方式并入]；或者任何修饰的EPSPS基因，如来自玉米的2m EPSPS基因[通过引用方式并入的 EP 0 508 909和EP 0 507 698]，或者赋予草甘膦(Roundup)抗性的草甘膦乙酰转移酶、或草甘膦氧化还原酶，或者赋予溴苯腈抗性的溴苯腈腈水解酶，或赋予针对磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、三唑并嘧啶类或嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸类的抗性的任何修饰的AHAS基因，如目前作为卡诺拉油菜销售的耐受咪唑啉酮的菜籽油菜突变体PM1和PM2。另外，本发明的植物可以另外含有内源基因或转基因，所述内源基因或转基因赋予增加的含油量或改进的油组成，如12:0ACP 硫酯酶增加以获得高月桂酸酯，其赋予授粉控制，如在花药特异性启动子控制下的barnase以获得雄性不育，或在花药特异性启动子控制下的 barstar以引起恢复的雄性不育，或如Ogura胞质雄性不育和能育性的核恢复子。

本发明的植物和种子可以用化学化合物进一步处理，如选自以下名单的化学化合物：

除草剂：烯草酮(Clethodim)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、氯甲草 (Diclofop)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦 (Glufosinate)、草甘膦、吡草胺(Metazachlor)、喹草酸(Quinmerac)、喹禾灵(Quizalofop)、醌肟草(Tepraloxydim)、氟乐灵(Trifluralin)。

杀真菌剂/PGR：腈嘧菌酯(Azoxystrobin)、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4- 四氢-1,4-亚甲基萘-5-基]-3-(二氟甲基)-1-曱基-1H-吡唑-4-甲酰胺 (Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺(Boscalid)、多菌灵(Carbendazim)、萎锈灵(Carboxin)、氯化矮壮素(Chlormequat-chloride)、盾壳霉(Coniothryrium minitans)、环丙唑醇(Cyproconazole)、环丙嘧啶 (Cyprodinil)、醚唑(Difenoconazole)、烯酰吗啉(Dimethomorph)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氧唑菌(Epoxiconazole)、唑酮菌(Famoxadone)、氟啶胺(Fluazinam)、咯菌腈(Fludioxonil)、氟吡菌胺(Fluopicolide)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)、氟喹唑(Fluquinconazole)、氟硅唑(Flusilazole)、Fluthianil、粉唑醇(Flutriafol)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异菌脲(Iprodione)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、精甲霜灵 (Mefenoxam)、缩节胺(Mepiquat-chloride)、甲霜灵(Metalaxyl)、叶菌唑 (Metconazole)、叉氨苯酰胺(Metominostrobin)、多效唑(Paclobutrazole)、戊苯吡菌胺(Penflufen)、吡噻菌胺(Penthiopyrad)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、丙氯灵(Prochloraz)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、氟唑环菌胺(Sedaxane)、戊唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基托布津(Thiophanate-methyl)、塞仑(Thiram)、三唑醇(Triadimenol)、布洛芬(Trifloxystrobin)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株I-1582、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)、短小芽孢杆菌菌株GB34。

杀虫剂：啶虫脒(Acetamiprid)、涕灭威(Aldicarb)、印楝素 (Azadirachtin)、虫螨威(carbofuran)、氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole) (Rynaxypyr)、可尼丁(clothianidin)、氰虫酰胺(Cyantraniliprole) (Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯((beta-)Cyfluthrin)、γ-氯氟氰菊酯 (γ-Cyhalothrin)、λ-氟氯氰菊酯(λ-Cyhalothrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、乐果(Dimethoate)、呋虫胺(Dinetofuran)、乙虫腈(Ethiprole)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氟噻虫砜(Fluensulfone)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、Flupyradifurone、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、Imicyafos、吡虫啉(imidacloprid)、氰氟虫腙 (Metaflumizone)、甲硫威(Methiocarb)、吡蚜酮(Pymetrozine)、吡氟喹腙 (Pyrifluquinazon)、乙基多杀菌素(Spinetoram)、艾克敌(Spinosad)、螺虫乙酯(Spirotetramate)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、噻虫啉(Thiacloprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-曱基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H- 四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株 I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株 QST713、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)F52。

在一些实施方案中，本发明的植物细胞，即包含敲除fad2基因的植物细胞，以及根据本发明的方法产生的植物细胞可以是非繁殖的细胞。

根据本发明获得的植物可以在常规育种方案中用来产生具有相同特征的更多植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入本发明的特征。获得的植物还可以用于产生繁殖材料。本发明的植物还可以用来产生配子、种子(包括碾碎的种子和种籽饼)、种子油、合子或体细胞胚、后代，或用来产生食品或饲料、如油、膳食、谷物、淀粉、面粉或蛋白质或工业品，如生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养食品，或用来产生通过本发明方法获得的植物的杂种。

本文中提及或援引的全部专利、专利申请和出版物或公开披露(包括互联网上的出版物)通过引用的方式完整并入。

名为“BCS15-2004-WO1_ST25.txt”的文件中所含的序列表含有51个序列SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:51并且在此通过电子提交方式提交并且通过引用的方式并入本文，所述序列表为198千字节(大小如Microsoft 中所测量)。

在说明书和实施例中参考以下序列：

序列

SEQ ID No.1:来自拟南芥的FAD2的基因组DNA序列

SEQ ID No.2:来自拟南芥的FAD2的cDNA序列

SEQ ID No.3:来自拟南芥的FAD2的蛋白质序列

SEQ ID No.4:来自欧洲油菜的FAD2-A1的基因组DNA序列

SEQ ID No.5:来自欧洲油菜的FAD2-A1的cDNA序列

SEQ ID No.6:来自欧洲油菜的FAD2-A1的蛋白质序列

SEQ ID No.7:来自欧洲油菜的FAD2-C1的基因组DNA序列

SEQ ID No.8:来自欧洲油菜的FAD2-C1的cDNA序列

SEQ ID No.9:来自欧洲油菜的FAD2-C1的蛋白质序列

SEQ ID No.10:来自欧洲油菜的FAD2-A2的基因组DNA序列

SEQ ID No.11:来自欧洲油菜的FAD2-A2的cDNA序列

SEQ ID No.12:来自欧洲油菜的FAD2-A2的蛋白质序列

SEQ ID No.13:来自欧洲油菜的FAD2-C2的基因组DNA序列

SEQ ID No.14:来自欧洲油菜的FAD2-C2的cDNA序列

SEQ ID No.15:来自欧洲油菜的FAD2-C2的蛋白质序列

SEQ ID No.16:来自芜青的FAD2-1的基因组DNA序列

SEQ ID No.17:来自芜青的FAD2-1的cDNA序列

SEQ ID No.18:来自芜青的FAD2-1的蛋白质序列

SEQ ID No.19:来自芜青的FAD2-2的基因组DNA序列

SEQ ID No.20:来自芜青的FAD2-2的cDNA序列

SEQ ID No.21:来自芜青的FAD2-2的蛋白质序列

SEQ ID No.22:来自甘蓝的FAD2-1的基因组DNA序列

SEQ ID No.23:来自甘蓝的FAD2-1的cDNA序列

SEQ ID No.24:来自甘蓝的FAD2-1的蛋白质序列

SEQ ID No.25:来自甘蓝的FAD2-2的基因组DNA序列

SEQ ID No.26:来自甘蓝的FAD2-2的cDNA序列

SEQ ID No.27:来自甘蓝的FAD2-2的蛋白质序列

SEQ ID No.28:FAM引物HIOL101

SEQ ID No.29:VIC引物HIOL101

SEQ ID No.30:反向引物HIOL101

SEQ ID No.31:FAM引物HIOL103

SEQ ID No.32:VIC引物HIOL103

SEQ ID No.33:反向引物HIOL103

SEQ ID No.34:FAM引物HIOL109

SEQ ID No.35:VIC引物HIOL109

SEQ ID No.36:反向引物HIOL109

SEQ ID No.37:来自欧洲油菜的FAD3-A1的基因组DNA序列

SEQ ID No.38:来自欧洲油菜的FAD3-A1的蛋白质序列

SEQ ID No.39:来自欧洲油菜的FAD3-A1的cDNA序列

SEQ ID No.40:来自欧洲油菜的FAD3-A2的基因组DNA序列

SEQ ID No.41:来自欧洲油菜的FAD3-A2的蛋白质序列

SEQ ID No.42:来自欧洲油菜的FAD3-A2的cDNA序列

SEQ ID No.43:来自欧洲油菜的FAD3-A3的基因组DNA序列

SEQ ID No.44:来自欧洲油菜的FAD3-A3的蛋白质序列

SEQ ID No.45:来自欧洲油菜的FAD3-A3的cDNA序列

SEQ ID No.46:来自欧洲油菜的FAD3-C1的基因组DNA序列

SEQ ID No.47:来自欧洲油菜的FAD3-C1的蛋白质序列

SEQ ID No.48:来自欧洲油菜的FAD3-C1的cDNA序列

SEQ ID No.49:来自欧洲油菜的FAD3-C2的基因组DNA序列

SEQ ID No.50:来自欧洲油菜的FAD3-C2的蛋白质序列

SEQ ID No.51:来自欧洲油菜的FAD3-C2的cDNA序列

实施例

除非在实施例中另外指出，否则全部重组DNA技术按照Sambrook 和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY中、Ausubel等人(1994)Current Protocols in MolecularBiology,Current Protocols,USA第1和第2卷中和 Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax,第2版, Academic Press(UK)的第1和第2卷中所述的标准方案实施。在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications,UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)(R.D.D.Croy)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press中并在McPherson等人 (2000)PCR-Basics:From Background toBench,第1版,德国Springer Verlag中找到。在Vos等人(1995,NAR 23:4407-4414)和在公开的EP专利申请EP 534858中描述了AFLP分析的标准流程。

实施例1–分离芸苔属植物FAD2基因的DNA序列

使用拟南芥(A.thaliana)FAD2基因序列(At3G12120)的TBLASTN同源检索作为查询对象用于BLAST同源性检索芜青序列和甘蓝序列的自有数据库中。BLAST分析导致鉴定芜青的2个FAD2基因同源物(BrFAD2-1 (SEQ ID No.16)、BrFAD2-2(SEQ ID No.19)以及甘蓝的2个FAD2基因同源物(BoFAD2-1(SEQ ID No.22)、BoFAD2-2(SEQ ID No.25))。使用FgeneSH软件预测与这些序列相对应的cDNA，并且所述cDNA分别在 SEQ ID No.17、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.23和SEQ ID No.26中描述。使用芜青BrFAD2基因序列对含有欧洲油菜mRNA序列的自有数据库的 BLAST同源性检索导致鉴定欧洲油菜cDNA序列BnFAD2-A1(SEQID No.5)和BnFAD2-A2(SEQ ID No.11)。基于基因结构预测，使用Fgenesh 软件或mRNA衍生的测序读出丰度，鉴定相应的编码序列。类似地，使用甘蓝BoFAD2基因序列作为查询对象对含有欧洲油菜mRNA序列的自有数据库的BLAST同源性检索导致鉴定以下cDNA序列：BnFAD2-C1(SEQ ID No.8)和BnFAD2-C2(SEQ ID No.14)。遵循上文提到的基因结构预测方法，获得相应的编码序列。

为了获取欧洲油菜FAD2基因序列，筛选BAC文库。对阳性文库克隆进行标准GS-FLX测序并使用454装配软件Newbler进行从头重叠群装配后，鉴定了BnFAD2-A1(SEQ IDNo.4)、BnFAD2-A2(SEQ ID No.10)、 BnFAD2-C1(SEQ ID No.7)和BnFAD2-C2(SEQ IDNo.13)的基因序列。

欧洲油菜BnFAD2-A1、BnFAD2-C1和BnFAD2-C2基因，芜青 BrFAD2-1基因和甘蓝BoFAD2-1基因编码384个氨基酸的FAD2蛋白(分别为SEQ ID NO:6、9、15、18和24)。

甘蓝BoFAD2-2基因在对应于BnFAD2-C2基因(SEQ ID NO:13)的位置2608的位置(即，BoFAD2-2基因(SEQ ID NO:25)的位置2726之后的位置)包含1nt缺失，导致移码突变，导致290个氨基酸的截短蛋白 (SEQ ID NO:27)。

欧洲油菜BnFAD2-A2和芜青BrFAD2-2基因在对应于BnFAD2-C2 基因(SEQ ID NO:13)的2036-2042位的位置处含有缺失的核苷酸，导致编码中的移码和过早终止密码子，产生136个氨基酸的截短蛋白(SEQ ID NO:12(BnFAD2-A2蛋白)和SEQ ID NO:21(BrFAD2-2蛋白))。因此BnFAD2-A2和BrFAD2-2基因代表非功能性假基因。

如本文所述的由芸苔属FAD2基因编码的蛋白质的比对示于图1中。

实施例2–欧洲油菜FAD2基因的表达分析

通过分析对多种组织和发育阶段获得的Illuminam RNAseq衍生的转录组数据库，测定芸苔属物种FAD2基因的相对基因表达水平。考虑每个数据库的用于测序深度(数据库中靶读数/百万读数)和用于靶基因长度(数据库中每千碱基读数/百万读数[RPKM；Mortazavi A,Williams BA, McCue K,Schaeffer L,Wold B:Mapping and quantifyingmammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nature Methods(2008),5(7):621-628]的归一化步骤，计算基因表达水平。

图2中显示表达分析的结果。从这张图中可以见到BnFAD2-A1和 BnFAD2-C1具有最高表达水平，并且表达在种子中最高。

实施例3–欧洲油菜突变fad2等位基因的产生和分离

产生实施例1中鉴定的来自欧洲油菜的FAD2基因中的突变并且如下鉴定：

-将来自良种春油菜繁育系的30,000粒种子(M0种子)在湿滤纸上去离子水或蒸馏水中预吸胀2小时。使一半种子暴露于0.8％EMS并且使另一半种子暴露于1％EMS(Sigma：M0880)并温育4小时。

-将诱变的种子(M1种子)淋洗3次并且在通风柜中干燥过夜。将 30,000个M1植株在土壤中种植并自交以产生M2种子。对每个M1独立植株，收获M2种子。

-两次种植从不同M1植株衍生的4800个M2植株并且根据CTAB 方法从每个独立M2植株的叶样品制备DNA样品(Doyle和Doyle，11987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15)。

-通过采用标准测序技术直接测序并且使用NovoSNP软件分析序列中点突变的存在，对DNA样品筛选FAD2基因中点突变的存在，其中所述点突变造成在FAD2基因的蛋白质编码区中引入终止密码子或氨基酸取代。

-从而鉴定以下突变fad2等位基因：

表2a:Bn FAD2-A1中的突变

表2b:BnFAD2-C1中的突变

表2c:BnFAD2-A2中的突变

表2d:BnFAD2-C2中的突变

脚注^*：包含了HIOL101突变的突变BnFAD2-A1等位基因的种子或包含了HIOL109突变的突变BnFAD2-C2的种子已经在2015年2月26日分别按登录号NCIMB 42376和NCIMB42375保藏于NCIMB(NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,苏格兰,英国)。

实施例4-在温室中生长的包含BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2和BnFAD2-C2敲 除等位基因的欧洲油菜的种子中的油组成

将包含突变体BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2和BnFAD2-C2 等位基因的芸苔属植物杂交。自交后，在基于分子标记的植物选择的基础上，获得来自针对BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2和BnFAD2-C2 突变及其组合纯合的植物，或野生型分离子(即不包含将影响FAD2蛋白正常功能的任何突变FAD2等位基因)的种子(见下文)。

通过从种子中提取脂肪酰并通过如WO09/007091中所述的毛细管气 -液层析分析其在种子油中的相对水平来测定在温室中生长的上述芸苔属植物的种子油的脂肪酸组成。

在具有突变BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2和BnFAD2-C2 等位基因及其组合的芸苔属品系的种子中，以及野生型分离子中，自在温室中种植的植物测定脂肪酸组成。野生型检查是指不经EMS处理的参考型欧洲油菜基因型。

表3显示，FAD2-A1和FAD2-C1突变体对种子中C18:1水平具有最大的作用，FAD2-C2突变体的添加甚至进一步提高了C18:1的水平。 FAD2-A2突变体不能进一步有利于增加种子中C18:1的水平。

实施例5-来自在田间生长的欧洲油菜的种子中的油组合物，所述欧洲油菜包含 BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2和BnFAD2-C2敲除等位基因

如上所述，在具有突变BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、BnFAD2-A2或 BnFAD2-C2等位基因及其组合的芸苔属品系的种子中，以及在不包含任何突变BnFAD2等位基因的野生型分离子中，自田间生长的植物测定了脂肪酸组成和植物性能参数。在两个不同地理区域的三个位置测试突变基因型。

如上所述测定种子油中的脂肪酸组成。在一个地理区域的三个位置，确定以下植物性能参数：尺度为1-9的4-5叶阶段的活力(VIG)，其中1 ＝差，5＝平均值，9＝有力；开花-开始(DTF)：10％开花的阶段(播种后的天数)；饱和脂肪酸总水平(FASAT)；占整个种子的百分比的种子中含油量(OIL)；占整个种子的百分比的种子中蛋白质含量(PROT)；种子中的芥子油苷含量(GLU)，以μmoles/克种子。通过GC分析获得种子质量参数。对于统计分析，运行ANOVA测试。突变品系与对应的无效分离子之间的对比进行显着性检验。野生型检查是指不经EMS处理的参考型欧洲油菜基因型。

表4显示了地理区域A中三个位置的具有BnFAD2突变等位基因的不同组合的植物的植物性能参数，表5显示了两个不同地理区域A和B的田间中具有不同组合的BnFAD2突变等位基因的植物种子油中的脂肪酸组成。

从表5a和5b可以看出，类似于温室，同样在田间，A1和C1突变的组合导致种子油中最高水平的C18:1。C2突变的添加进一步增加了种子油中C18:1的水平，但是A2突变的添加对种子油中C18:1水平的增加只有很小的贡献，或根本没有贡献。

然而，从表4可以观察到，A1和C1突变的组合导致植物的农艺性能显著降低：活力水平从野生型分离子的水平6.5显著降低至包含A1和C1 突变的突变植物的1.3和2.3之间。此外，至开花的天数(DTF)增加，油含量降低，蛋白质含量增加，且含有A1和C1突变的植物的芥子油苷水平增加。

不显示这种降低的农艺性能的具有高水平的C18:1的植物是包含A1 和C2突变的植物。

总之，这些结果表明，BnFAD2-A1基因和BnFAD2-C2基因的突变 FAD2等位基因的组合导致在植物中具有高水平的油酸而没有农艺损失。更具体地，这种突变的组合可以导致约73％至几乎75％的油酸水平而没有农艺损失。

实施例6-来自欧洲油菜的种子中的油组成，所述欧洲油菜包含突变FAD2和突变 FAD3等位基因

将包含本文所述的BnFAD2-A1基因和BnFAD2-C2基因的突变FAD2 等位基因的植物与如WO2011/060946(通过引用并入本文)中所述的突变 FAD3等位基因组合。因此，将包含突变BnFAD2-A1、BnFAD2-C2、 BnFAD3-A1、BnFAD3-A2、BnFAD3-A3、BnFAD3-C1和BnFAD3-C2等位基因的芸苔属植物杂交。自交后，在基于分子标记的植物选择的基础上，获得来自针对BnFAD2-A1、BnFAD2-C2、BnFAD3-A1、BnFAD3-A2、 BnFAD3-A3、BnFAD3-C1或BnFAD3-C2突变及其组合纯合的植物，或野生型分离子(即不包含将影响FAD2或FAD3蛋白正常功能的任何突变 FAD2或FAD3等位基因)的种子(见下文和WO2011/060946)。

如上所述和在WO2011/060946中，从在温室中生长的植物和在田间生长的植物中测定种子油中脂肪酸的水平。表6显示了在温室中生长的植物的脂肪酸水平，表7显示了在田间生长的植物的脂肪酸水平。

对于田间生长的植物，通过确定以下植物性状参数来确定农艺性能：在2-3叶阶段的建立(EST1)，尺度为1-9，其中1＝非常薄，5＝平均值， 9＝非常厚；活力(VIG1)，在5-6叶阶段，尺度为1-9，其中1＝差，5＝平均值，9＝有力；开花-开始(DTF)：10％开花的阶段(播种后的天数)；开花-结束(EOF)：10％仍开花的阶段(播种后的天数)；植株高度(HICM) 在开花末端阶段，以厘米；成熟度(MAT)，尺度为1-9，其中1＝晚，5＝平均，9＝早；播种后天数中到达成熟的天数(DTM)；成熟阶段成熟时倒伏抗性(LOM)，尺度为1-9，其中1＝0度(平)，5＝45度，9＝90度 (直立)；种子的产量(YLD)，8％水分时每标准地的克数；种子中含油量(OILN)，以整个种子的％；种子中蛋白质含量(PRON)，以整个种子的％；和种子中的芥子油苷含量(GLU)，以μmoles/克种子。农艺参数如表8所示。

这些数据表明，通过将BnFAD2-A1和BnFAD2-C2基因的敲除突变体FAD2等位基因与5个FAD3基因的突变等位基因组合，可以获得种子油，所述种子油具有增加的C18:1水平(达到约73％至约75％)，和降低的C18:3水平。而田间植物的活力水平略有下降，但田间植物的种子产量没有明显变化。

实施例7–突变FAD2等位基因的检测和/或转移至(良种)芸苔属植物品系中

通过以下方法将突变FAD2基因转移至(良种)芸苔属繁育系中：含有突变FAD2基因(供体植物)的植物与(良种)芸苔属品系(良种亲本/回归亲本)或缺少突变FAD2基因的品种杂交。使用以下种质渗入方案(突变FAD2 等位基因缩写成fad2，而野生型称作FAD2)：

BC1杂交：fad2/fad2(供体植物)X FAD2/FAD2(良种亲本)

F1植物：FAD2/fad2

BC2杂交：FAD2/fad2 X FAD2/FAD2(回归亲本)

BC2植物：50％FAD2/fad2和50％FAD2/FAD2

使用针对突变FAD2等位基因(fad2)的分子标记物(例如AFLP、PCR、 Invader^TM、KASP测定法等；还参见下文)，选择50％FAD2/ fad2。

BC3杂交：FAD2/fad2(BC1植物)X FAD2/FAD2(回归亲本)

BC3植物：50％FAD2/fad2和50％FAD2/FAD2

使用针对突变FAD2等位基因(fad2)的分子标记物选择50％ FAD2/fad2。

重复回交直至BC4至BC7。

BC4-7植物：50％FAD2/fad2和50％FAD2/FAD2

使用针对突变FAD2等位基因(fad2)的分子标记选择50％FAD2/ fad2。为减少回交次数(例如直至BC4而非BC7)，可以使用对良种亲本的遗传背景特异的分子标记。

BC4-7 S1杂交：FAD2/fad2 X FAD2/fad2

BC4-7S1植物：25％FAD2/FAD2和50％FAD2/fad2和25％fad2 /fad2

使用针对突变FAD2等位基因(fad2)的分子标记选择含有fad2的植物。使用针对突变和野生型FAD2等位基因的分子标记，选择对突变FAD2等位基因纯合(fad2/fad2)的个体BC4-7S1或BC4-7 S2植物。这些植物随后用于产生种子。

为了选择在FAD2等位基因中包含点突变的植物，可以使用借助本领域已知标准测序技术的直接测序。

备选地，Invader^TM技术(Third Wave Agbio)可以用来区分在FAD2等位基因中包含特异性点突变的植物与不包含该特异性点突变的植物。因此开发区分性Invader^TM探针以基于突变等位基因和野生型等位基因之间的单核苷酸差异，检测实施例3中所鉴定的突变等位基因的存在或不存在及其接合性状态。简而言之，开发了对突变靶FAD2基或相应野生型靶FAD2 基因特异的探针和可以与它们组合使用的“侵入”探针。通常，每个探针组由一个对突变靶基因或野生型靶基因特异的探针(所谓“初始探针”)(其“5’副翼”序列后首个核苷酸与核苷酸差异匹配)和一个对该核苷酸差异上游的核苷酸特异的探针(所谓“oligo”)组成。后一种引物的最末核苷酸可以与突变体中的核苷酸差异匹配，但是也可以使用其他核苷酸作为这个最末核苷酸，只要与靶DNA杂交时，初始探针和oligo仍然能够形成单碱基重叠以产生酶(Third Wave Agbio)识别的特定侵入结构。如制造商(Third Wave Agbio)所述那样进行Invader^TM分析流程和解读。简而言之，5'“副翼”核苷酸序列(flap1用于突变等位基因并且flap2 用于野生型等位基因)在Invader^TM测定法的初始期从初始探针切下并且分别与FRET^TM盒1和盒2中的序列互补，并且不与靶突变序列或野生型序列互补。如果初始探针在初始期中被切割并且flap1-探针和/或flap2-探针在二次期分别与FRET^TM盒1和盒2杂交，则生成分别表示样品存在突变靶FAD2基因或相应野生型靶FAD2基因的信号。

备选地，KASP测定法(KBioscience)可以用来区分在FAD2等位基因中包含特异性点突变的植物与不包含该特异性点突变的植物。开发区分性引物以检测实施例3鉴定的突变等位基因的存在或不存在及其接合性状态。简而言之，开发了对突变靶FAD2基因或相应野生型靶FAD2基因特异的正向引物和可以与它们组合使用的反向引物。在正向引物3'末端的核苷酸对应于在突变等位基因和相应野生型等位基因之间不同的核苷酸。引物可以根据如制造商(KBioscience)所描述的方案，与荧光染料如FAM和 VIC组合使用。

表9中显示检测突变FAD2等位基因的存在或不存在及其接合性状态的引物。

表9：检测突变FAD2等位基因和相应野生型等位基因的正向引物(Fw) 和反向引物(Rv)。FAM探针：野生型等位基因，VIC探针：突变等位基因。

PCT/RO/134表

Claims (31)

1.一种包含FAD2-A1、FAD2-A2、FAD2-C1和FAD2-C2基因的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述植物包括FAD2-A1和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因，并且其中所述FAD2-C1基因的fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白。

2.根据权利要求1所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述FAD2-C1基因的fad2等位基因是野生型等位基因。

3.根据权利要求1或2所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述FAD2-A2基因的fad2等位基因是敲除fad2等位基因。

4.根据前述权利要求中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因是编码蛋白质的fad2等位基因，其中在对应于SEQ ID NO:6的位置109的位置处的His被另一个氨基酸取代，并且其中所述FAD2-C2等位基因的所述敲除fad2等位基因是在编码Trp的密码子中包含终止密码子突变的fad2等位基因，所述Trp在对应于SEQ ID NO:15的位置190的位置。

5.根据前述权利要求中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中

a)所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的序列，其中位置2371处的C被T取代；和

b)所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的序列，其中2327位的G被A取代。

6.根据权利要求5所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其可衍生或可获得自选自以下的种子：

a)包含HIOL101的种子，其已经以登录号NCIMB 42376保藏在NCIMB；和

b)包含HIOL109的种子，其已经以登录号NCIMB 42375保藏在NCIMB。

7.根据前述权利要求中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其对于任一种敲除fad2等位基因是纯合的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，所述植物还至少包含至少一种FAD3基因的敲除fad3等位基因。

9.根据权利要求8所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，所述植物还包含五个FAD3基因的敲除fad3等位基因。

10.根据权利要求8或9所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中所述FAD3基因选自：

a)FAD3-A1基因，其包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:39的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:38的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；

b)FAD3-A2基因，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:42的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；

c)FAD3-A3基因，其包含与SEQ ID NO:43的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:44的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；

d)FAD3-C1基因，其包含与SEQ ID NO:46的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:48的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:47的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和

e)FAD3-C2基因，其包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:51的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:50的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。

11.根据权利要求10所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其中

a)所述FAD3-A1基因的所述突变等位基因在对应于SEQ ID NO:37的位置2405的位置处包含G至A取代；

b)所述FAD3-A2基因的所述突变等位基因在对应于SEQ ID NO:40的位置3934的位置处包含G至A取代；

c)所述FAD3-A3基因的所述突变等位基因在对应于SEQ ID NO:43的位置2847的位置处包含G至A取代；

d)所述FAD3-C1基因的所述突变等位基因在对应于SEQ ID NO:46的位置2702的位置处包含G至A取代；和

e)所述FAD3-C2基因的所述突变等位基因在对应于SEQ ID NO:49的位置3909的位置处包含G至A取代。

12.根据前述权利要求中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其在种子油中具有增加的C18:1水平并保持正常的农艺发育。

13.根据权利要求12所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其在种子油中具有约73％至约75％之间的C18:1水平。

14.根据权利要求8-13中任一项所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或后代，其在种子油中具有增加的C18:1水平和降低的C18:3水平。

15.来自根据前述权利要求中任一项所述的种子的油。

16.一种提高种子油中C18:1水平同时保持正常农艺发育的方法，所述方法包括将FAD2-A1基因的敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的敲除fad2等位基因引入欧洲油菜植物，并且选择包含所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的欧洲油菜植物，其还含有FAD2-C1基因，其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过所述方法产生的欧洲油菜植物包括FAD2-A2基因的敲除fad2等位基因。

18.根据权利要求16或17的方法，用于在种子油中提高C18:1的水平并降低C18:3的水平，同时保持正常的农艺发育，所述方法还包括将FAD3-A1基因的敲除fad3等位基因、FAD3-A2基因的敲除fad3等位基因，FAD3-A3基因的敲除fad3等位基因、FAD3-C1基因的敲除fad3等位基因和FAD3-C2基因的敲除fad3等位基因引入欧洲油菜植物，并且选择欧洲油菜植物，其含有所述FAD3-A1基因的所述敲除fad3等位基因、所述FAD3-A2基因的所述敲除fad3等位基因、所述FAD3-A3基因的所述敲除fad3等位基因，所述FAD3-C1基因的所述敲除fad3等位基因和所述FAD3-C2基因的所述敲除fad3等位基因。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中包括所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因和所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因的所述欧洲油菜植物通过如下选择：分析来自所述植物的基因组DNA中至少一种分子标记的存在，其中至少一种分子标记与所述FAD2-A1基因的所述敲除fad2等位基因连接，并且其中至少一种分子标记与所述FAD2-C2基因的所述敲除fad2等位基因连接，以及任选地，其中至少一个分子标记与所述FAD2-A2基因或所述FAD2-C1基因的一个或多个fad2等位基因连接，或与所述FAD3-A1基因、所述FAD3-A2基因、所述FAD3-A3基因、所述FAD3-C1基因或所述FAD3-C2基因的一个或多个fad3等位基因连接。

20.一种确定生物样品中存在或不存在敲除fad2等位基因的方法，包括提供来自所述生物样品的基因组DNA，以及分析所述DNA的至少一种分子标记的存在，其中所述至少一种分子标记与所述敲除fad2等位基因相关。

21.一种用于检测芸苔属DNA样品中敲除fad2等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个PCR引物对，其能够扩增与所述敲除fad2等位基因相连的DNA标记。

22.一种用于确定植物或其细胞、部分、种子或后代中敲除fad2等位基因的接合状态的方法，包括确定敲除和/或相应野生型FAD2特异性区域在所述植物或其细胞、部分、种子或后代的基因组DNA中的存在。

23.在单独欧洲油菜植物中将FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因与FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因组合的方法，所述方法包括

a)产生和/或鉴定两种或更多种植物，每种植物包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因；

b)将包含一种或多种选择的敲除fad2等位基因的第一植物与包含一种或多种其它选择的敲除fad2等位基因的第二植物杂交；

c)从杂交收集种子，并且任选地鉴定包含FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因的植物；以及任选地

d)重复步骤b)和c)，直到获得包含FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因的植物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤d)中获得的所述植物包含FAD2-A1基因的至少一种敲除fad2等位基因和FAD2-C2基因的至少一种敲除fad2等位基因，包含FAD2-C1基因，其fad2等位基因编码功能性FAD2蛋白)，并且包含FAD2-A2基因，其fad2等位基因是敲除fad2等位基因。

25.FAD2基因的敲除fad2等位基因，其中敲除fad2等位基因是天然FAD2基因的突变形式，其中天然FAD2基因选自：

(a)FAD2-A1基因，其包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质；和

(b)FAD2-C2基因，其包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少90％序列同一性的序列，或具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少90％序列同一性的cDNA序列，或编码与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。

26.权利要求25的敲除fad2等位基因，其选自：

a)所述FAD2-A1基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:4的位置2371的位置上包含C至T的取代；和

b)所述FAD2-C2基因的突变等位基因，其在对应于SEQ ID NO:52的位置2327的位置处包含G至A的取代。

27.生产油的方法，包括从根据权利要求1-14中任一项的植物收获种子并从所述种子中提取油。

28.一种生产食品，饲料或工业产品的方法，包括

(a)获得权利要求1-14中任一项所述的植物或其部分；和

(b)从植物或其部分制备食品，饲料或工业产品。

29.如权利要求28所述的方法，其中

(a)食物或饲料是油、膳食、谷物、淀粉、面粉或蛋白质；或者

(b)工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养食品。

30.权利要求25或26的敲除fad2等位基因的用途，用于在维持正常农艺发育的同时提高欧洲油菜植物的种子油中C18:1的水平。

31.产生欧洲油菜植物的方法，所述植物在种子油中包含提高的C18:1水平并保持正常的农艺发育，所述方法包括播种根据权利要求1-14中任一项的种子和从所述种子生长植物。