KR101787776B1 - Ａａｄ-１ 이벤트 ｄａｓ-４０２７８-９, 관련 트랜스제닉 옥수수 식물주, 및 그의 이벤트-특이적 확인 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부분적으로는 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 옥수수 세포의 게놈 내에서 특수한 부위로 삽입된, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 식물 내의 신규한 aad-1 형질전환 이벤트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 비롯한 다른 형질과 "집적될" 수 있다. 추가로, 본 발명은 샘플 (예를 들어 옥수수 알곡의)에서 대상 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석을 제공한다. 분석은 옥수수 게놈 내로 삽입된 재조합 구성체의 DNA 서열, 및 게놈 서열 측면에 위치하는 삽입 부위를 기초로 할 수 있다. 분석 수행에 유용한 키트 및 조건도 제공된다.

Description

ＡＡＤ-１ 이벤트 ＤＡＳ-４０２７８-９, 관련 트랜스제닉 옥수수 식물주, 및 그의 이벤트-특이적 확인{AAD-1 EVENT DAS-40278-9, RELATED TRANSGENIC CORN LINES, AND EVENT-SPECIFIC IDENTIFICATION THEREOF}
aad-1 유전자 (원래 스핑고비움 헤르비시도보란스 (Sphingobium herbicidovorans)로부터 동정됨)는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD-1) 단백질을 코딩한다. 이 형질 (trait)은 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (통상적으로 "fop" 제초제로 칭함, 예를 들어 퀴잘로폽 (quizalofop)) 제초제에 대한 내성을 부여하고, 식물 형질전환 동안 및 종묘장에서 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 식물에서 제초제 내성을 위한 aad-1 유전자 자체는 WO 2005/107437에서 최초로 개시되었다 (또한 US 2009-0093366 참조).
식물 내에서 이종성 또는 외래 유전자의 발현은 외래 유전자가 염색체 내에 삽입된 부위에 의해 영향을 받는다. 이것은 예를 들어, 염색질 구조 (예를 들어, 이질염색질) 또는 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서 (enhancer))의 근접성 때문일 수 있다 (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). 동일한 종류의 트랜스제닉 (transgenic) 식물 (또는 다른 유기체) 내의 동일한 유전자는 상이한 이벤트 (event) 사이에서 발현 수준의 큰 변동을 보일 수 있다. 공간적 또는 시간적 발현 패턴에도 차이가 존재할 수 있다. 예를 들어, 다양한 식물 조직에서 도입유전자 (transgene)의 상대적인 발현의 차이는 도입된 유전자 구성체에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴에 대응하지 않을 수 있다.
따라서, 매우 많은 이벤트가 종종 생성되고, 도입된 관심있는 유전자를 제시된 목적을 위해 만족스러운 수준으로 발현하는 이벤트를 확인하기 위해 스크리닝된다. 상업적인 목적을 위해, 수백 내지 수천 가지 상이한 이벤트를 생산하고 이들 이벤트를 요구되는 도입유전자 발현 수준 및 패턴을 갖는 단일 이벤트에 대해 스크리닝하는 것이 통상적이다. 도입유전자 발현의 요구되는 수준 및/또는 패턴을 갖는 이벤트는 통상적인 육종 방법을 이용하여 유성 이계 교배에 의해 도입유전자를 다른 유전적 배경 내로 유전자 이입 (introgression)하기에 유용하다. 상기 교배의 자손체는 원래의 형질전환체의 도입유전자 발현 특성을 유지한다. 상기 전략은 지역적 성장 조건에 매우 적합한 많은 변종에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 보장하기 위해 사용된다.
미국 특허 출원 공개 20020120964 A1 및 20040009504 A1은 면화 이벤트 PV-GHGT07(1445), 및 그의 검출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. WO 02/100163은 면화 이벤트 MONI5985, 및 그의 검출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. WO 2004/011601은 옥수수 이벤트 MON863 식물, 및 그의 검출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. WO 2004/072235는 면화 이벤트 MON 88913, 및 그의 검출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
WO 2006/098952는 옥수수 이벤트 3272에 관한 것이다. WO 2007/142840은 옥수수 이벤트 MIR162에 관한 것이다.
미국 특허 7,179,965는 cry1F 이벤트 및 cry1Ac 이벤트를 갖는 면화에 관한 것이다.
본원에 개시된 특이적 이벤트를 갖는 AAD-1 옥수수는 이전에 개시되지 않았다.
발명의 개요
본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)에 기탁 번호 PTA-10244로 기탁된 종자를 갖는 DAS-40278-9로 지정된 AAD-1 옥수수 이벤트 및 그로부터 유래된 자손체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 식물 및 종자 및 자손체의 자손체 식물, 종자 및 알곡 또는 재생가능 부분, 및 이로 제조된 식품 또는 사료를 포함한다. 본 발명은 또한 꽃가루, 배주 (ovule), 꽃, 새싹, 뿌리 및 잎을 포함하고 이로 제한되지 않는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 식물 부분, 및 영양 세포, 꽃가루 세포 및 난 (egg) 세포의 핵을 포함한다. 본 발명은 추가로 페녹시 옥신 및/또는 아릴옥시알카노에이트 제초제에 대한 내성을 갖는 옥수수 식물, 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 신규한 유전자 조성물, 및 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 포함하는 옥수수 식물의 작물학적 성과의 측면에 관한 것이다.
본 발명은 부분적으로는 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 옥수수 세포의 게놈 내의 특수한 부위 내로 삽입된, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 식물 내의 신규한 aad-1 형질전환 이벤트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 비롯한 다른 형질과 "집적될 (stacked)" 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기재된 단일 이벤트를 갖는 식물을 포함한다.
추가의 형질은 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 트랜스제닉 식물의 식물 육종, 재-형질전환, 또는 상동성 재조합을 통한 표적화된 통합을 통한 새로운 형질의 부가를 통해 식물 게놈 내로 집적될 수 있다.
다른 실시양태는 예를 들어, pat 유전자 발현 카세트를 비롯한, 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 절제를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 시에, 변형된 이벤트는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열이 옥수수 이벤트 DAS-40278-9와 집적되는 특이적 염색체 부위에서 재-표적화될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2008 DAS 옥수수 연관 지도 상에서 약 20 cM에서 SSR 마커 UMC1265 (서열 30 및 서열 31 참조)와 MMC0111 (서열 32 및 서열 33 참조) 사이의 약 20 cM에서 염색체 2 상에 위치하는 옥수수 염색체 표적 부위를 포함하고, 여기서 표적 부위는 이종성 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 29 내에 또는 서열 29에 의해 규정된 위치를 포함하는 옥수수 염색체 표적 부위, 및 당업자에 의해 인식되는 본원에 기재된 그의 잔기를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2008 DAS 옥수수 연관 지도 상에서 약 20 cM에서 SSR 마커 UMC1265 (서열 30 및 서열 31 참조)와 MMC0111 (서열 32 및 서열 33 참조) 사이의 약 20 cM에서 염색체 2 상의 위치에 이종성 핵산을 삽입하는 것을 포함하는, 트랜스제닉 옥수수 식물의 제조 방법을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 삽입된 이종성 핵산은 서열 29에 관하여 본원에서 규정되는 5' 측면 서열 (flanking sequence)의 전부 또는 일부가 5' 측면에 위치하고, 서열 29에 관하여 본원에서 규정되는 5' 측면 서열의 전부 또는 일부가 3' 측면에 위치한다.
추가로, 본 발명은 (예를 들어, 옥수수 알곡의) 샘플 내에서 대상 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석을 제공한다. 분석은 옥수수 게놈 내로 삽입된 재조합 구성체의 DNA 서열, 및 삽입 부위의 측면에 위치하는 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 또한, 분석 수행에 유용한 키트 및 조건을 제공한다.
따라서, 본 발명은 부분적으로는 전체 AAD-1 삽입체의 DNA 서열, 및 (트랜스제닉 옥수수 식물주 내에서) 그의 경계 영역의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이들 서열은 특유한 것이다. 이들 삽입체 및 경계 서열을 기초로 하여, 이벤트-특이적 프라이머를 생성하였다. PCR 분석은 이들 이벤트가 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트를 사용하여 생성된 PCR 앰플리콘 (amplicon)의 분석에 의해 확인될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 본 발명의 이벤트를 포함하는 옥수수 식물주를 특유하게 확인할 수 있다.
도 1은 pDAS1740의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 2는 DAS-40278-9에 대한 삽입체의 성분 (pDAS1740)을 보여준다.
도 3은 DAS-40278-9에 대한 제한 지도 및 삽입체의 성분 (pDAS1740)을 보여준다.
도 4는 DAS-40278-9에 대한 DNA 삽입체 및 경계에 대한 앰플리콘, 프라이머, 및 클로닝 전략을 보여준다.
도 5는 DAS-40278-9에 대한 삽입체 및 경계에 대한 프라이머 위치를 보여준다.
도 6은 DAS-40278-9에 대한 연결 영역 및 삽입을 보여준다.
도 7은 실시예 7에 언급된 육종 도식이다.
서열의 간단한 설명
서열 1-28은 본원에 기재된 바와 같은 프라이머이다.
서열 29는 본 발명의 이벤트 DAS-40278-9에 대한 삽입체 및 측면 서열을 제공한다.
서열 30-33은 실시예 4에 기재된 측면에 위치하는 마커에 대한 프라이머이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로는 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 옥수수 세포의 게놈 내의 특수한 부위 내로 삽입된, 본원에 기재된 대상 aad-1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 식물 (maize)의 신규한 형질전환 이벤트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 다른 형질 (예를 들어, 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 코딩하는 유전자(들))과 "집적될" 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 절제된 후, 추가의 폴리뉴클레오티드 서열로 재-표적화될 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기재된 단일 이벤트를 갖는 식물을 포함한다.
추가로, 본 발명은 샘플 내에서 대상 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석을 제공한다. 본 발명의 측면은 본원에 예시 또는 제안된 임의의 진단 핵산 분자, 특히 전적으로 또는 부분적으로 대상 측면 서열에 기초로 한 것을 설계 및/또는 생산하는 방법을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 부분적으로 트랜스제닉 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 (pDAS1740-278로도 공지됨), 이들 이벤트를 포함하는 식물주, 및 상기 삽입체의 DNA 서열 및/또는 그의 경계 영역의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 본 발명의 식물주는 본원에 개시되고 제안된 서열을 사용하여 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제초제-내성 옥수수 식물주, 및 그의 확인에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로 유성 교배의 자손체가 관심있는 이벤트를 함유하는지 여부를 결정하기 위한 대상 이벤트의 존재 검출에 관한 것이다. 또한, 이벤트의 검출 방법은, 예를 들어 시판전 승인을 요구하는 규제에 부합하고 예를 들어 재조합 작물 식물로부터 유래된 식품을 표지하기 위해 포함되고 유용하다. 임의의 잘 공지된 핵산 검출 방법, 예를 들어 핵산 프로브를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 DNA 혼성화에 의해 대상 이벤트의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 이벤트-특이적 PCR 분석은 예를 들어 문헌 [Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999)]에 논의되어 있다. 이것은 삽입체와 측면 DNA 사이의 연결에 걸치는 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의한 글리포세이트 내성 대두 이벤트 40-3-2의 확인에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 1개의 프라이머는 삽입체로부터의 서열을 포함하고, 제2 프라이머는 측면 DNA로부터의 서열을 포함하였다.
옥수수를 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD-1) 단백질을 코딩하는 스핑고비움 헤르비시도보란스로부터의 aad-1 유전자의 삽입에 의해 변형시켰다. 이 형질은 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (통상적으로 "fop" 제초제로 칭함, 예를 들어 퀴잘로폽) 제초제에 대한 내성을 부여하고, 식물 형질전환 동안 및 종묘장에서 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 플라스미드 pDAS1740로부터의 DNA 단편을 사용한 옥수수의 형질전환은 육종을 통해 수행하여, 이벤트 DAS-40278-9를 생산하였다.
5 세대로부터 유래된 20개의 개별 옥수수 식물 및 이벤트 DAS-40278-9의 세대당 4개의 식물로부터 추출된 게놈 DNA 샘플을 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 분자 특성 결정을 위해 선택하였다. AAD-1 단백질 발현을 AAD-1 특이적 신속 시험 스트립 (strip) 키트를 사용하여 시험하였다. AAD-1 단백질 발현에 대해 양성으로 시험된 식물만을 후속 분자 특성 결정을 위해 선택하였다. 서던 (Southern) 혼성화로 aad-1 유전자가 AAD-1 단백질 발현에 대해 양성으로 시험된 옥수수 식물 내에 존재함을 확인하였고, aad-1 유전자는 aad-1 유전자 프로브와 혼성화될 때 이들 식물 내에 단일 무손상 카피로서 삽입되었다.
AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9에서 삽입된 DNA의 분자 특성 결정을 또한 본원에 기재한다. 이벤트는 플라스미드 pDAS1740의 Fsp I 단편을 사용한 Whiskers 형질전환을 통해 생산하였다. 삽입된 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고 이벤트 DAS-40278-9 내의 aad-1 유전자의 삽입체/카피수를 결정하기 위해 서던 블롯 분석을 이용하였다. 옥수수 게놈 내로 삽입된 aad-1 도입유전자의 통합 및 완전성을 입증하기 위해 데이타를 생성하였다. 비코딩 영역 (코딩 영역을 조절하도록 설계된), 예를 들어 프로모터 및 터미네이터, 매트릭스 부착 영역 RB7 Mar v3 및 RB7 Mar v4의 통합의 특성 결정, 및 세대를 통한 도입유전자 삽입체의 안정성을 평가하였다. 삽입된 DNA의 안정성은 식물의 5개의 구분되는 세대에 걸쳐 입증되었다. 추가로, 암피실린 저항성 유전자 (Apr) 영역을 포함한 형질전환 플라스미드 백본 서열의 부재는 플라스미드 pDAS1740의 제한 부위 (Fsp I)의 측면에 위치하는 거의 전체 백본 영역을 덮는 프로브에 의해 입증되었다. 삽입의 상세한 물리적 지도는 이벤트 DAS-40278-9의 이들 서던 블롯 분석에 기초하여 작성하였다.
AAD-1 단백질의 수준을 옥수수 조직 내에서 결정하였다. 추가로, 동질유전자형의 비-형질전환된 옥수수 식물주와 트랜스제닉 옥수수 식물주 DAS-40278-9 (비분사한, 2,4-D를 분사한, 퀴잘로폽을 분사한, 및 2,4-D 및 퀴잘로폽을 분사한)의 동등성을 조사하기 위해 옥수수 풀사료 (forage) 및 알곡에 대해 조성 분석을 수행하였다. 동질유전자형 비-형질전환된 옥수수 식물주의 작물학적 특성을 또한 DAS-40278-9 옥수수와 비교하였다.
비-트랜스제닉 대조군 및 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-1 (AAD-1)을 함유하는 하이브리드 옥수수 식물주의 재배지 (field) 발현, 영양분 조성, 및 작물학적 시험을 동일한 해에 미국 아이오와주, 일리노이주 (2개의 부위), 인디애나주, 네브라스카주 및 캐나다 온타리오주에 위치한 6개의 부위에서 수행하였다. 잎, 꽃가루, 뿌리, 풀사료, 전체 식물, 및 알곡 내의 AAD-1 단백질에 대한 발현 수준, 작물학 결정의 결과, 및 대조군 및 DAS-40278-9 AAD-1 옥수수로부터의 풀사료 및 알곡 샘플의 조성 분석을 본원에서 요약한다.
가용형의 추출가능한 AAD-1 단백질은 옥수수 잎, 꽃가루, 뿌리, 풀사료, 전체 식물, 및 알곡에서 정량적 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다. 뿌리 및 꽃가루 조직에서 우수한 평균 발현 값이 관찰되었고, 이를 본원에서 보다 상세히 논의한다. 발현 값은 모든 분사한 처리제에 대해 및 2,4-D 및 퀴잘로폽 제초제를 분사한 및 비분사한 구획지 (plot)에 대해 유사하였다.
대조군에 대한 DAS-40278-9 AAD-1 옥수수 (제초제 처리를 하거나 하지 않은)의 동등성을 조사하기 위해 일반성분, 무기질, 아미노산, 지방산, 비타민, 반-영양성분 (anti-nutrient), 및 2차 대사산물을 포함한 조성 분석을 수행하였다. DAS-40278-9 AAD-1 조성물 샘플에 대한 결과는 모두 대조 식물주 및/또는 통상적인 옥수수를 기초로 할 때 (생물학상 및 작물학상), 대조 및 DAS-40278-9 AAD-1 옥수수 구획지로부터 수집된 작물학적 데이타의 분석만큼 우수하거나 이보다 더 우수하였다.
상기 배경 섹션에서 언급한 바와 같이, 식물 게놈 내로 도입유전자의 도입 및 통합은 몇몇 무작위 이벤트 (따라서, 발현되는 제시된 삽입에 대한 명칭 "이벤트")를 수반한다. 즉, 많은 형질전환 기술, 예를 들어 아그로박테리움 (Agrobacterium) 형질전환, "유전자 총 (gene gun)" 및 WHISKERS에서, 게놈 내에서 도입유전자가 삽입될 위치는 예측가능하지 않다. 따라서, 삽입체의 양 측면 상에서 측면 식물 게놈 DNA를 확인하는 것은 제시된 삽입 이벤트를 갖는 식물을 확인하기 위해 중요할 수 있다. 예를 들어, PCR 프라이머는 삽입체 및 숙주 게놈의 연결 영역을 가로질러 PCR 앰플리콘을 생성하도록 설계될 수 있다. 상기 PCR 앰플리콘은 특유한 또는 구분되는 종류의 삽입 이벤트를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
"이벤트"는 원래 무작위 이벤트이므로, 본원의 개시내용의 일부로서, 이벤트를 포함하는 옥수수 식물주의 적어도 2500개의 종자를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, 미국 20110 버지니아주 매나싸스 유니버시티 불리바드 10801)에 기탁하고 제한 없이 공개적으로 이용가능하도록 하였다 (그러나, 특허권이 적용됨). 기탁물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10244로서 지정되었다 (옐로우 덴트 (Yellow Dent) 옥수수 하이브리드 종자 (제아 메이즈 (Zea Mays L.)): DAS-40278-9; 다우 애그로사이언스 엘엘씨 (Dow AgroSciences LLC)를 대신하여 기탁됨; ATTC의 종자/식물주(들)의 수령일자: 2009년 7월 10일; 생존력 확인 2009년 8월 17일). 상기 기탁은 특허 절차의 목적을 위한 종자 기탁에 대한 부다페스트 조약 (Budapest Treaty)에 따라 그의 조건 하에 이루어지고 유지될 것이다. 기탁물은 30년 동안 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안 또는 특허의 존속기간 동안 어느 쪽이든 더 긴 기간 동안 공공 기탁기관인 ATCC 기탁기관에서 제한 없이 유지될 것이고, 이 기간 동안 생존불가능해지면 교체될 것이다.
기탁된 종자는 본 발명의 일부이다. 명백하게, 옥수수 식물은 이들 종자로부터 성장할 수 있고, 이 식물은 본 발명의 일부이다. 또한, 본 발명은 이들 식물 및 그의 자손체를 검출하기 위해 유용한 이들 옥수수 식물 내에 포함된 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 검출 방법 및 키트는 시험의 궁극적인 목적에 따라 임의의 1, 2, 또는 심지어 3개의 모든 상기 이벤트의 확인에 관한 것일 수 있다.
정의 및 실시예는 본 발명의 설명을 돕고 당업자가 본 발명을 실시하도록 안내하기 위해 본원에 제공된다. 달리 주지하지 않으면, 용어는 당업자에 의한 통상적인 관용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR $ 1.822에 제시된 DNA 염기에 대한 명칭을 사용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자손체"는 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 포함하는 모 식물의 임의의 세대의 자손체를 나타낸다.
트랜스제닉 "이벤트"는 이종성 DNA, 즉, 관심있는 도입유전자를 포함하는 핵산 구성체를 사용한 식물 세포의 형질전환, 도입유전자의 식물 게놈 내로의 삽입에 의한 식물 집단의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선택에 의해 생성된다. 용어 "이벤트"는 이종성 DNA를 포함하는 원래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손체를 의미한다. 용어 "이벤트"는 또한 형질전환체 및 게놈/도입유전자 DNA를 포함하는 또 다른 변종 사이의 유성 이계 교배에 의해 생산된 자손체를 나타낸다. 반복친 (recurrent parent)에 대한 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 모체로부터의 삽입된 도입유전자 DNA 및 측면에 위치하는 게놈 DNA (게놈/도입유전자 DNA)는 동일한 염색체 위치에서 교배 자손체에 존재한다. 용어 "이벤트"는 또한 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 모 식물주 (예를 들어, 원래의 형질전환체 및 그의 자손체) 및 삽입된 DNA를 함유하지 않는 모 식물주의 유성 교배의 결과로서 관심있는 도입유전자를 포함하는 삽입된 DNA를 수용하는 자손체로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접한 측면에 위치하는 게놈 서열을 포함하는 원래의 형질전환체 및 그의 자손체로부터의 DNA를 나타낸다.
"연결 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점의 측면에 위치하는 옥수수 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 걸쳐지고, 여기서, 식물의 유전 물질 내의 하나의 또는 다른 연결 서열의 확인 또는 검출은 이벤트에 대한 진단으로 충분하다. 본원에 기재된 옥수수 이벤트 및 유사한 길이의 측면 DNA 내의 삽입체에 걸쳐지는 DNA 서열이 포함된다. 상기 진단 서열의 구체적인 예를 본원에 제공하지만; 삽입체의 연결, 또는 삽입체와 게놈 서열의 연결에 겹쳐지는 다른 서열이 또한 진단 기준이 되고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 그러한 측면 서열, 연결 서열 및 삽입체 서열의 확인에 관한 것이다. 관련 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따르면, 삽입된 DNA 및 그의 경계를 가로질러 걸쳐지는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석 방법은 특허 받은 해당 트랜스제닉 옥수수 식물주로부터 유래된 상업화된 트랜스제닉 옥수수 변종 또는 식물주를 검출 또는 확인하기 위해 사용될 수 있다.
각각의 이들 삽입체의 전체 서열을 각각의 측면 서열의 일부와 함께 본원에서 서열 29로서 제공한다. 서열 29 (총 8557개 염기쌍)에 관하여 상기 이벤트에 대한 삽입체 및 측면 서열의 좌표를 아래에 제시한다. 이것은 예를 들어 실시예 3.8에서 보다 상세히 논의한다.
Figure 112012021282282-pct00001
상기 삽입 이벤트 및 그의 추가의 성분을 도 1 및 2에 추가로 예시한다. 이들 서열 (특히 측면 서열)은 특유한 것이다. 이들 삽입체 및 경계 서열을 기초로 하여, 이벤트-특이적 프라이머를 생성하였다. PCR 분석은 이들 옥수수 식물주가 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트를 사용하여 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 상이한 옥수수 유전자형 내에서 확인될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 이들 옥수수 식물주를 특유하게 확인할 수 있다. 여기서 확인된 서열은 특유한 것이다. 예를 들어, GENBANK 데이타베이스에 대한 BLAST 탐색에 의해, 클로닝된 경계 서열과 데이타베이스 내의 서열 사이에 임의의 유의한 상동성이 밝혀지지 않았다.
본 발명의 검출 기술은 자손체에 관심있는 하나 이상의 추가의 형질을 부여하기 위한 노력으로 관심있는 이벤트를 포함하는 모 식물을 또 다른 식물주와 교배한 후에, 어떤 자손체 식물이 제시된 이벤트를 포함하는지 결정할 때 식물 육종과 함께 특히 유용하다. 이들 PCR 분석 방법은 옥수수 육종 프로그램 및 특히 상업화된 트랜스제닉 옥수수 종자에 대한 품질 관리에 유리하다. 이들 트랜스제닉 옥수수 식물주를 위한 PCR 검출 키트가 또한 현재 제조되고 사용될 수 있다. 이것은 또한 제품 등록 및 제품 관리에 유리할 수 있다.
추가로, 측면에 위치하는 옥수수/게놈 서열은 각각의 삽입체의 게놈 위치를 특이적으로 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 정보는 각각의 이벤트에 특이적인 분자 마커 시스템을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 가속 육종 전략 및 연관 데이타 확립을 위해 사용될 수 있다.
또한, 측면 서열 정보는 도입유전자 통합 과정, 게놈 통합 부위 특성, 이벤트 분류 (sorting), 도입유전자의 안정성 및 그의 측면 서열, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵화 (silencing), 도입유전자 메틸화 패턴, 위치 효과 및 잠재적인 발현-관련 요소, 예를 들어 MARS [매트릭스 부착 영역] 등에 관련된)을 연구하고 특성 결정을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
모든 본 발명의 개시내용에 비추어, 본 발명이 ATCC 기탁 번호 PTA-10244 하에 이용가능한 종자를 포함함이 분명하다. 또한, 본 발명은 ATCC에 기탁 번호 PTA-10244 하에 기탁된 종자로부터 성장한 제초제-저항성 옥수수 식물을 포함한다. 본 발명은 상기 식물의 일부분, 예를 들어 상기 식물에 의해 생산된 잎, 조직 샘플, 종자, 꽃가루 등을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 후손 및/또는 자손체 식물, 바람직하게는 제초제-저항성 옥수수 식물을 포함하고, 상기 식물은 본원에 기재된 바와 같은 검출가능한 야생형 게놈 DNA/삽입체 DNA 연결 서열을 포함하는 게놈을갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "옥수수"는 옥수수 (제아 메이즈)를 의미하고, 옥수수와 교배될 수 있는 그의 모든 변종을 포함한다.
본 발명은 적어도 하나의 모 식물로서 본 발명의 식물을 사용하여 교배하는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 하나 또는 두개의 모 식물로서 본원에 예시된 임의의 식물을 갖는 F1 하이브리드 식물을 포함한다. 또한, 본 발명에는 본 발명의 상기 F1 하이브리드에 의해 생산되는 종자가 포함된다. 본 발명은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어 동계교배 (in-bred) 모) 식물과 교배하고 생성되는 하이브리드 종자를 수확함으로써 F1 하이브리드 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 모계 (female parent) 또는 부계 (male parent) 식물인 예시된 식물을 포함한다. 생성되는 식물의 특징은 모 식물의 신중한 고려에 의해 개선될 수 있다.
제초제-내성 옥수수 식물은 본원에서 언급되는 임의의 하나의 종자로부터 성장한 옥수수 식물로 구성되는 제1 모 옥수수 식물 및 제2 모 옥수수 식물을 먼저 유성 교배하여 다수의 제1 자손체 식물을 생산한 후, 제초제에 저항성인 (또는 적어도 하나의 본 발명의 이벤트를 갖는) 제1 자손체 식물을 선택하고; 제1 자손체 식물을 자가수정시켜 다수의 제2 자손체 식물을 생산하고; 이어서 제초제에 저항성인 (또는 적어도 하나의 본 발명의 이벤트를 갖는) 제2 자손체 식물을 선택함으로써 육종될 수 있다. 이들 단계는 제1 자손체 식물 또는 제2 자손체 식물의 제2 모 옥수수 식물 또는 제3 모 옥수수 식물에 대한 역교배를 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 본 발명의 옥수수 종자를 포함하는 옥수수 작물, 또는 그의 자손체를 심을 수 있다.
또한, 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 2개의 독립적으로 분리되는 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 자손체를 생산하기 위해 교배될 수 있음이 이해되어야 한다. 적절한 자손체의 자가수정은 2개의 첨가된 외인성 유전자에 대해 동형접합성인 식물을 생산할 수 있다. 모 식물에 대한 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이계 교배도 영양 번식으로서 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법은 당업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 간단하게 유전되고 고도로 유전가능한 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동형접합성 품종 또는 동계교배 식물주 내로 전달하기 위해 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 1회친 (donor parent)으로 불린다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 품종)의 특질 및 1회친으로부터 전달되는 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후에, 1회친의 표현형을 갖는 개체 선택되어 반복친에 대해 반복적으로 교배 (역교배)된다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 품종)의 특질 및 1회친으로부터 전달되는 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다.
본 발명의 DNA 분자는 마커 활용 육종 (MAB) 방법에서 분자 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 분자는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 유전적으로 연관된 작물학상 유용한 형질을 확인하는 방법 (예를 들어, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)에 사용될 수 있다. 제초제-저항성 형질은 MAB 방법을 사용하여 본 발명의 옥수수 식물 (또는 그의 자손체 및 임의의 다른 옥수수 품종 또는 변종)과의 교배의 자손체에서 추적될 수 있다. DNA 분자는 상기 형질에 대한 마커이고, 본 발명의 적어도 하나의 옥수수 식물주 또는 그의 자손체가 모 식물 또는 조상인 옥수수 식물에서 제초제-저항성 형질(들)을 추적하기 위해 당업계에 잘 공지되어 있는 MAB 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 대상 이벤트를 갖는 임의의 옥수수 변종을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 식물을 사용한 육종을 포함하는 제초제-내성 옥수수 식물의 생산 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 2개의 식물, 또는 본 발명의 하나의 식물 및 임의의 다른 식물을 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트에 대해 상기 자손체를 분석함으로써 상기 교배의 자손체를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 다른 바람직한 형질, 예를 들어 작물학적 형질, 예를 들어 다양한 실시예에서 본원에서 시험되는 형질을 포함하는 식물을 사용한 육종 주기를 통해 대상 이벤트를 추적하기 위해 사용될 수 있다. 대상 이벤트 및 목적하는 형질을 포함하는 식물은 검출, 확인, 선택되고, 예를 들어 추가 라운드의 육종에 신속하게 사용될 수 있다. 또한, 대상 이벤트/형질은 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가의 제초제 내성 형질과 육종을 통해 조합되고, 본 발명에 따라 추적될 수 있다. 후자의 바람직한 한 실시양태는 제초제 디캄바에 대한 저항성을 코딩하는 유전자와 조합된 대상 이벤트를 포함하는 식물이다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 세균 EPSPS, GOX, GAT), 글루포시네이트 저항성 (예를 들어, Pat, bar), 아세토락테이트 합성효소 (ALS)-억제성 제초제 저항성 (예를 들어, 이미다졸리논 [예를 들어 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 다른 화학물질 [Csr1, SurA 등]), 브로모자이닐 저항성 (예를 들어, Bxn), HPPD (4-히드록실페닐-피루베이트-디옥시게나제) 효소의 억제제에 대한 저항성, 파이토엔 탈포화효소 (phytoene desaturase, PDS)의 억제제에 대한 저항성, 광화학계 (photosystem) II 억제성 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, psbA), 광화학계 I 억제성 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시다제 IX (PPO)-억제성 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, PPO-1), 페닐우레아 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, CYP76B1), 디캄바-분해 효소 (예를 들어, US 20030135879 참조)를 코딩하는 형질과 조합될 수 있고, 잡초 이동을 효과적으로 제어하거나 억제하는 능력 및/또는 상기 언급된 클래스의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공하기 위해 단독으로 또는 다수의 조합으로 집적될 수 있다.
추가의 제초제에 대해서, 몇몇의 추가의 바람직한 ALS (AHAS로도 알려짐) 억제제는 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드 (예를 들어 클로란술람-메틸, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 및 페녹스술람), 피리미디닐티오벤조에이트 (예를 들어 비스피리박 및 피리티오박), 및 플루카르바존을 포함한다. 몇몇의 바람직한 HPPD 억제제는 메소트리온, 이속사플루톨, 및 술코트리온을 포함한다. 몇몇의 바람직한 PPO 억제제는 플루미클로락, 플루미옥사진, 플루펜피르, 피라플루펜, 플루티아세트, 부타페나실, 카르펜트라존, 술펜트라존, 및 디페닐에테르 (예를 들어 아시플루오르펜, 포메사펜, 락토펜 및 옥시플루오르펜)를 포함한다.
추가로, AAD-1은 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 HTC 형질과 집적되어 하나 이상의 추가의 투입 (예를 들어, 곤충-저항성, 진균 저항성, 또는 스트레스 내성 등) 또는 생산 (예를 들어, 수율 증가, 오일 프로필 개선, 섬유 품질 개선 등) 형질과 집적될 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 수의 작물 해충을 탄력적이고 비용 효과적으로 억제하는 능력과 함께 개선된 작물 품질의 완전한 작물 패키지를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
상동성 재조합을 통해 식물 세포의 특이적 염색체 부위 내에 폴리뉴클레오티드 서열을 통합시키기 위한 방법은 관련 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2009/0111188 A1에 기재된 부위 특이적 통합은 염색체 표적 내로의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 매개하기 위한 재조합효소 또는 인테그라제 (integrase)의 사용을 포함한다. 추가로, 국제 특허 출원 WO 2008/021207에는 게놈의 특이적 위치 내로 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 통합시키기 위해 아연 핑거 (zinc finger) 매개-상동성 재조합이 기재되어 있다. 재조합효소, 예를 들어 미국 특허 6720475에 기재된 FLP/FRT 또는 미국 특허 5658772에 기재된 CRE/LOX는 특이적 염색체 부위 내로 폴리뉴클레오티드 서열을 통합시키기 위해 이용될 수 있다. 마지막으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 특이적인 염색체 위치 내로 표적화하기 위한 메가뉴클레아제의 사용은 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에 기재되어 있다.
식물 세포 내로의 부위 특이적 통합을 위한 다른 다양한 방법이 일반적으로 알려져 있고, 적용가능하다 (Kumar et al., Trands in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). 추가로, 몇몇 원핵 및 저등 진핵 유기체에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템은 식물에도 적용될 수 있다. 상기 시스템의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이 (Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), 및 파지 Mu의 Gin/gix 시스템 (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
본 발명의 몇몇의 실시양태에서, 새로운 도입유전자(들)을 존재하는 트랜스제닉 이벤트에 근접하여 통합 또는 집적하는 것이 바람직할 수 있다. 트랜스제닉 이벤트는 특유한 특성, 예를 들어 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정한 발현, 및 우수한 효능의 조합, 예를 들어 제초제 내성 및 여러 환경적 위치 내 및 이들 위치에 걸친 작물의 성과를 기초로 하여 선택된 바람직한 게놈 로커스로 간주될 수 있다. 새로 통합된 도입유전자는 존재하는 형질전환체의 도입유전자 발현 특성을 유지하여야 한다. 또한, 새로 통합된 이벤트의 검출 및 확인을 위한 분석의 개발은 게놈 측면 서열로서 극복될 것이고, 새로 통합된 이벤트의 염색체 위치는 이미 확인되었다. 마지막으로, 존재하는 도입유전자에 연관된 특이적 염색체 위치 내로의 새로운 도입유전자의 통합은 통상적인 육종 방법을 사용하여 유성 이계 교배에 의한 도입유전자의 다른 유전 배경 내로의 유전자 이입을 촉진시킬 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 이벤트로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 절제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 가출원 61/297,628에 기재된 도입유전자 절제는 염색체에 통합된 트랜스제닉 이벤트로부터 유전자 발현 카세트로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용한다. 제거되는 폴리뉴클레오티드 서열은 선택가능 마커일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 제거시에, 변형된 트랜스제닉 이벤트는 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 재표적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 변형된 트랜스제닉 이벤트의 후속적인 재표적화는 선택가능 마커의 재사용 또는 특이적 유전자의 발현에 의한 식물 전사체 (transcriptome)에 대한 의도하지 않은 변화를 극복하는 능력과 같은 잇점을 제공한다.
본 발명은 이종성 핵산의 삽입에 매우 우수한 옥수수 게놈 내의 염색체 2 상의 특수한 부위를 본원에서 개시한다. 또한, 염색체 2 상의 표적화 부위의 위치 확인에 유용한 5' 분자 마커, 3' 분자 마커, 5' 측면 서열, 및 3' 측면 서열도 개시된다. 따라서, 본 발명은 관심있는 이종성 핵산을 상기 미리 확립된 표적 부위 내로 또는 상기 표적 부위 근처에 도입하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 개시된 표적 부위에 또는 상기 부위의 근처에 삽입된 임의의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 종자 및/또는 옥수수 식물을 포함한다. 상기 표적화된 통합을 수행하는 한 방법은 본원에서 예시된 pat 발현 카세트를 절제하고/하거나 그 대신에 상이한 삽입체로 교체하는 것이다. 이와 관련하여, 비제한적인 예를 들어, 표적화된 상동성 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다,
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자, 이벤트 또는 형질 "집적"은 한 트랜스제닉 식물주 내로 요구되는 형질을 조합하는 것이다. 식물 육종가는 각각 요구되는 형질을 갖는 모 식물을 교배시킨 후, 이들 목적하는 형질을 모두 갖는 자손체를 확인함으로써 트랜스제닉 형질을 집적한다. 유전자를 집적하기 위한 다른 방법은 형질전환 동안 2 이상의 유전자를 식물의 세포 핵 내로 동시에 전달하는 것이다. 유전자를 집적하는 다른 방법은 트랜스제닉 식물을 관심있는 또 다른 유전자로 재-형질전환하는 것이다. 예를 들어, 유전자 집적은 2 이상의 상이한 형질, 예를 들어, 2 이상의 상이한 곤충 형질, 곤충 저항성 형질(들) 및 질병 저항성 형질(들), 2 이상의 제초제 저항성 형질, 및/또는 곤충 저항성 형질(들) 및 제초제 저항성 형질(들)을 조합하기 위해 사용될 수 있다. 관심있는 유전자 이외에 선택가능 마커의 사용도 유전자 집적으로 간주될 수 있다.
"상동성 재조합"은, 그를 통해 2개의 뉴클레오티드 서열이 상호작용 (재조합)하여 새로운 재조합 DNA 서열을 형성하는 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 대응하는 부위를 갖는 임의의 쌍의 뉴클레오티드 서열 사이의 반응을 의미한다. 유사한 뉴클레오티드 서열의 부위는 각각 본원에서 "상동성 서열"로 언급된다. 일반적으로, 상동성 재조합의 빈도는 상동성 서열의 길이가 증가함에 따라 증가한다. 따라서, 상동성 재조합은 동일하지 않은 두 뉴클레오티드 서열 사이에서 발생할 수 있지만, 재조합 빈도 (또는 효율)은 2개의 서열 사이의 상이함이 클수록 감소한다. 재조합은 각각의 공여자 및 표적 분자 상의 하나의 상동성 서열을 사용하여 수행되고, 이에 의해 "단일-교차" 재조합 생성물을 생성할 수 있다. 별법으로, 2개의 상동성 서열은 각각의 표적 및 공여자 뉴클레오티드 서열 상에 위치할 수 있다. 공여자 상의 2개의 상동성 서열과 표적 상의 2개의 상동성 서열 사이의 재조합은 "이중-교차" 재조합 생성물을 생성한다. 공여자 분자 상의 상동성 서열이 조작되는 서열 (예를 들어, 관심있는 서열)의 측면에 위치할 경우, 표적 분자와의 이중-교차 재조합은 본래 표적 분자 상의 상동성 서열 사이에 존재하는 DNA 서열을 관심있는 서열이 대체하는 재조합 생성물을 생성할 것이다. 이중-교차 재조합 이벤트를 통한 표적과 공여자 사이의 DNA 서열의 교환은 "서열 교체"로 불린다.
대상 AAD-1 효소는 트랜스제닉 발현에 의해 거의 모든 광엽 및 풀 잡초를 제어하는 제초제의 조합물에 대한 내성을 유도할 수 있다. AAD-1은 예를 들어 다른 제초제 내성 작물 (HTC) 형질 (예를 들어, 글리포세이트 저항성, 글루포시네이트 저항성, 이미다졸리논 저항성, 브로모자이닐 저항성 등), 및 곤충 저항성 형질 (Cry1F, Cry1Ab, Cry34/45 등)과 집적하기 위한 뛰어난 HTC 형질로서 역할을 할 수 있다. 추가로, AAD-1은 제2 유전자 또는 유전자의 군으로 유전공학에 의해 조작된 식물의 1차 형질전환체의 선택을 돕기 위한 선택가능 마커로서 역할을 할 수 있다.
본 발명의 HTC 형질은 다른 HTC 형질 (글리포세이트 내성을 포함하고 이로 제한되지 않음)과 신규한 조합으로 사용될 수 있다. 형질의 이들 조합은 제초제 (예를 들어, 글리포세이트)에 대한 새로 획득된 저항성 또는 고유한 내성 때문에 잡초 (등의) 종의 신규한 제어 방법을 생성한다. 따라서, HTC 형질에 추가로, 트랜스제닉 작물에서 상기 효소에 의해 제초제 내성이 발생한 제초제를 사용하여 잡초를 제어하기 위한 신규한 방법이 본 발명의 범위에 포함된다.
추가로, 전세계적으로 글리포세이트 내성 작물이 널리 재배되고 있다. 다른 글리포세이트 내성 작물과 순환시에, 글리포세이트-저항성 지원 (volunteer) 작물의 제어는 순환 작물에서 자주 어려울 수 있다. 따라서, 작물 내로 개별적으로 집적되거나 형질전환되는 대상체 트랜스제닉 형질의 사용은 다른 HTC 지원 작물을 제어하기 위한 도구를 제공한다.
본 발명의 바람직한 식물, 또는 종자는 본원에서 확인된 바와 같이 삽입체의 양 측면 상의 적어도 20-500개 또는 그 초과의 인접하는 측면 뉴클레오티드와 함께 본원에서 확인된 바와 같은 삽입체 서열을 그의 게놈 내에 포함한다. 달리 지시하지 않으면, 측면 서열에 대한 언급은 서열 29에 관하여 확인된 것을 나타낸다 (상기 표 참조). 다시, 서열 29는 원래의 형질전환체 내에 삽입된 이종성 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접하는 예시적인 측면에 위치하는 게놈 서열을 포함한다. 이들 측면 서열의 전부 또는 일부는 이벤트를 포함하는 모 식물주의 유성 교배의 결과로서 삽입된 DNA를 받은 자손체에게 전달될 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 식물의 재생가능 세포의 조직 배양물을 포함한다. 특히 예시된 변종의 모든 형태학상 및 생리학상 특성을 보일 수 있는, 상기 조직 배양물로부터 재생된 식물이 또한 포함된다. 본 발명의 바람직한 식물은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 모든 생리학상 및 형태학상 특징을 갖는다. 본 발명은 상기 종자 및 관심있는 품질 형질을 갖는 종자의 자손체를 추가로 포함한다.
식물 또는 종자, 또는 그의 일부의 조작 (예를 들어 돌연변이, 추가의 형질감염, 및 추가의 육종)은 "본질적으로 유래된" 변종으로 불리는 것을 생성시킬 수 있다. 국제 식물 신품종 보호 연맹 (International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV))에서는 변종이 보호된 변종으로부터 본질적으로 유래된 것인지를 결정하기 위한 다음 지침을 제공하였다:
[A] 변종은 다음에 해당할 때 또 다른 변종 ("초기 변종")으로부터 본질적으로 유래된 것으로 간주된다:
(i) 초기 변종의 유전자형 또는 유전자형의 조합에 의한 본질적인 특성의 발현을 유지하면서, 변종이 초기 변종으로부터 우세하게 유래되거나, 또는 그 자체가 초기 변종으로부터 우세하게 유래된 변종으로부터 유래되고;
(ii) 변종이 초기 변종과 분명히 구분가능하고;
(iii) 유도체화의 작용에 의한 차이를 제외하고, 변종이 초기 변종의 유전자형 또는 유전자형의 조합에 의한 본질적인 특성의 발현에서 초기 변종과 일치한다.
(UPOV, Sixth Meeting with International Organizations, Geneva, Oct. 30, 1992; 연매의 사무국에 의해 작성된 문서).
본원에서 사용되는 바와 같이, "식물주"는 적어도 하나의 형질에 대해 개체들 사이에서 유전적 변이를 거의 또는 전혀 보이지 않는 식물의 집단이다. 상기 식물주는 수 세대의 자가수분 및 선택, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 단일 모 식물로부터의 영양 번식에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "품종" 및 "변종"은 동의어로서, 상업적인 생산을 위해 사용되는 식물주를 의미한다.
"안정성" 또는 "안정한"은 주어진 성분에 관하여 성분이 세대에 걸쳐, 바람직하게는 적어도 3개의 세대에서 실질적으로 동일한 수준, 예를 들어, 바람직하게는 ±15%, 보다 바람직하게는 ±10%, 가장 바람직하게는 ±5%의 수준에서 유지됨을 의미한다. 안정성은 온도, 위치, 스트레스 및 식재 시간에 의해 영향받을 수 있다. 재배지 조건 하에서 후속 세대의 비교는 성분을 유사한 방식으로 생성하여야 한다.
"상업적 유용성"은 작물이 통상적인 농기구를 사용하여 농부에 의해 생산될 수 있고, 설명된 성분을 함유하는 오일을 통상적인 분쇄 및 추출 장비를 사용하여 종자로부터 추출할 수 있도록 우수한 식물 활력 및 높은 번식력을 갖는 것으로서 규정된다. 상업적으로 유용하기 위해서, 에이커당 생산되는 종자 중량, 오일 함량, 및 총 오일에 의해 측정되는 수율은 동일한 영역에서 성장한 최상급의 형질이 없는 비교가능한 상업적인 카놀라 (canola) 변종의 평균 수율의 15% 내이다.
"작물학상 엘리트 (elite)"는 식물주가 대상 이벤트(들)에 의한 곤충 저항성 이외에 바람직한 작물학적 특성, 예를 들어 수율, 성숙도, 질병 저항성 등을 갖는다는 것을 의미한다. 본 발명의 이벤트를 포함하는 식물에서 하기 실시예에 제시된 바와 같이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 얻은 작물학적 형질은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 임의의 모든 이들 작물학적 특성 및 데이타 점이 상기 식물을 규정하기 위해 사용되는 특성 범위의 한 지점으로서 또는 상기 범위의 하나의 한계 또는 두 한계 모두에서 상기 식물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
당업자가 본원에 비추어 이해할 수 있는 바와 같이, 예를 들어, 검출 키트의 바람직한 실시양태는 "연결 서열" 또는 "전이 (transition) 서열" (옥수수 게놈 측면 서열이 삽입체 서열을 만나는 경우)에 대해 작용하고/하거나 이들을 포함하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 하나 또는 2개의 연결 서열 (삽입체가 측면 서열을 만나는 경우)을 확인하기 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머, 및/또는 앰플리콘을 포함한다. 한 통상적인 설계는 측면에 위치하는 영역에서 혼성화하는 하나의 프라이머, 및 삽입체에서 혼성화하는 하나의 프라이머를 갖는 것이다. 상기 프라이머는 종종 각각 적어도 약 ~15 잔기 길이를 갖는다. 상기 배열에서, 프라이머는 본 발명의 이벤트의 존재를 나타내는 검출가능한 앰플리콘을 생성/증폭하기 위해 사용될 수 있다. 이들 프라이머는 상기 표시된 연결 서열에 걸치는 (및 포함하는) 앰플리콘을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
측면 서열에서 "접촉하는 (touching down)" 프라이머(들)은 일반적으로 약 200개의 염기를 넘어서 또는 연결을 넘어서 혼성화하도록 설계되지 않는다. 따라서, 전형적인 측면에 위치하는 프라이머는 삽입체의 개시부로부터 측면 서열 내로의 200개 염기 내의 어느 한 가닥의 적어도 15개의 잔기를 포함하도록 설계될 것이다. 즉, 서열 29의 잔기 ~1674-1873 및/또는 ~6690-6890 내의 적절한 크기의 서열을 포함하는 프라이머는 본 발명의 범위 내에 있다. 삽입체 프라이머는 이와 유사하게 삽입체 상의 임의의 부위에서 설계될 수 있지만, 잔기 ~1874-2074 및 ~6489-6689는 예를 들어 상기 프라이머 설계를 위해 비-배타적으로 사용될 수 있다.
또한, 당업자는 프라이머 및 프로브가 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건의 범위 하에서 서열 29 (또는 보체)의 세그먼트, 및 그의 보체에 혼성화하도록 설계될 수 있음을 알 것이고, 여기서 프라이머 또는 프로브는 예시된 서열에 완전히 상보성인 것은 아니다. 즉, 어느 정도의 미스매치 (mismatch)가 허용될 수 있다. 약 20개의 뉴클레오티드 프라이머에 대해, 예를 들어, 일반적으로 1 또는 2개 정도의 뉴클레오티드는 미스매치된 염기가 내부에 또는 앰플리콘에 대향하는 프라이머의 말단 상에 존재할 경우 대향 가닥에 결합할 필요는 없다. 다양한 적절한 혼성화 조건을 아래에 제공한다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. 펩티드 핵산 (PNA) 프로브, 및 DNA 및 RNA 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 사실은 상기 프로브 및 프라이머가 본 발명의 이벤트의 존재를 판단하는 근거가 된다 (특유하게 확인하고 구분할 수 있다)는 점이다.
예를 들어 작은 서열결정 오류를 야기할 수 있는 PCR 증폭의 오류가 발생할 수 있음을 알아야 한다. 즉, 달리 나타내지 않으면, 본원에 기재된 서열은 옥수수 게놈 DNA로부터 긴 앰플리콘을 생성한 후, 앰플리콘을 클로닝하고 서열결정함으로써 결정될 수 있다. 게놈 DNA로부터 서열결정을 위한 충분한 앰플리콘을 생성하기 위해 필요한 많은 라운드의 증폭을 고려할 때, 상기 방식으로 생성되고 결정된 서열에서 근소한 차이 및 작은 불일치를 발견하는 것은 드물지 않은 것이다. 당업자는 이들 종류의 통상적인 서열결정 오류 또는 불일치에 의해 필요한 임의의 조정이 본 발명의 범위 내에 있음을 인식하고 주목하여야 한다.
또한, 예를 들어 이벤트 생성 동안 서열이 삽입될 때 몇몇의 게놈 서열이 삭제되는 것은 드물지 않음을 유의하여야 한다. 따라서, 몇몇의 차이는 또한 예를 들어 대상 측면 서열과 GENBANK에 제시된 게놈 서열 사이에서 나타날 수 있다.
이들 차이(들) 중 일부를 아래 실시예 섹션에서 논의한다. 프로브 및 프라이머에 대한 조정이 이에 따라서 이루어질 수 있다.
각각의 "삽입체"의 성분은 도 1 및 2에 예시되고, 아래 실시예에서 보다 상세히 논의한다. 이들 성분의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 식물 및 종자 등에서 옥수수 식물로부터의 도입유전자/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에서 제공되는 대상 도입유전자/게놈 삽입 영역 연결 서열 (서열 29의 잔기 1873-1874 및 6689-6690 사이), 그의 세그먼트, 및 예시된 서열의 보체 및 그의 임의의 세그먼트를 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 삽입 영역 연결 서열은 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA와 삽입 부위의 측면에 위치하는 옥수수 세포로부터의 DNA 사이의 연결에 걸친다. 상기 서열은 제시된 이벤트에 대한 판단 근거가 된다.
이들 삽입체 및 경계 서열을 기초로 하여, 이벤트-특이적 프라이머를 생성할 수 있다. PCR 분석은 본 발명의 옥수수 식물주가 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트를 사용하여 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 상이한 옥수수 유전형 내에서 확인될 수 있음을 입증하였다. 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 이들 옥수수 식물주를 특유하게 확인할 수 있다. 따라서, 상기 프라이머쌍으로부터 유래된 PCR 앰플리콘은 특유한 것이고, 이를 사용하여 이들 옥수수 식물주를 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신규한 도입유전자/게놈 삽입 영역의 인접하는 단편을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 측면이다. 도입유전자 삽입체 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및 3개의 상기 언급된 옥수수 식물 중의 하나 이상으로부터의 옥수수 게놈 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 이들 옥수수 식물에 대한 판단 근거가 되는 앰플리콘 생성물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열을 포함하는 DNA 서열이 포함된다.
관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열 (예를 들어 서열 29 및 그의 세그먼트)의 도입유전자 부분의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 인접하는 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 또는 그의 보체, 및 상기 서열로부터의 유사한 길이의 측면에 위치하는 옥수수 DNA 서열, 또는 그의 보체에 관한 것이다. 상기 서열은 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급되는 임의의 옥수수 이벤트에 대한 판단 근거가 된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 DNA 프라이머 및 상동성 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 언급되는 옥수수 이벤트에 대응하는 DNA의 존재를 샘플에서 검출하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 적어도 하나의 이들 옥수수 이벤트로부터의 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 상기 이벤트(들)에 대한 판단 근거가 되는 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키고; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하고; (c) 앰플리콘을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 검출 방법은 적어도 하나의 상기 이벤트에 대응하는 DNA의 존재를 샘플에서 검출하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 엄격한 혼성화 조건 하에 적어도 하나의 상기 옥수수 이벤트로부터의 DNA와 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에 대조 옥수수 식물 (관심있는 DNA의 이벤트가 아님)과는 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키고; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하고; (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 것을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 aad-1 이벤트를 포함하는 옥수수 식물을 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1 모 옥수수 식물주 (상기 식물주의 식물에 상기 제초제 저항성 형질을 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함함) 및 제2 모 옥수수 식물주 (상기 제초제 내성 형질이 결여됨)를 유성 교배하여 다수의 자손체 식물을 생산하고; (b) 분자 마커의 사용에 의해 자손체 식물을 선택하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 곤충 내성 형질을 포함하는 순종 (true-breeding) 옥수수 식물을 생산하기 위해 자손체 식물을 제2 모 옥수수 식물주에 역교배하는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 3가지 이벤트 중의 임의의 하나 (또는 그 초과)와의 교배의 자손체의 접합성 (zygosity)을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 옥수수 DNA를 포함하는 샘플을 본 발명의 프라이머 세트와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 적어도 하나의 상기 옥수수 이벤트로부터의 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 적어도 하나의 상기 옥수수 이벤트에 대한 판단 근거가 되는 제1 앰플리콘을 생산한다. 상기 방법은 핵산 증폭 반응을 수행하여 제1 앰플리콘을 생산하고; 제1 앰플리콘을 검출하고; 옥수수 DNA를 포함하는 샘플을 상기 프라이머 세트와 접촉시키고 (상기 프라이머 세트는 옥수수 식물로부터의 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 옥수수 게놈 영역에 상동성인 천연 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생산함); 핵산 증폭 반응을 수행하여 제2 앰플리콘을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 이 방법은 제2 앰플리콘을 검출하고, 샘플 내의 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 두 앰플리콘의 존재는 샘플이 도입유전자 삽입체에 대해 이형접합성임을 나타낸다.
DNA 검출 키트는 본원에 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 키트는 샘플에서 대상 옥수수 이벤트 DNA의 확인을 위해 유용하고, 상기 DNA를 함유하는 옥수수 식물의 육종 방법에 적용될 수 있다. 키트는 예를 들어 본원에 개시된 앰플리콘에 상동성이거나 상보성인 DNA 서열 또는 대상 이벤트의 도입유전자 유전 요소에 함유된 DNA에 상동성이거나 상보성인 DNA 서열을 함유한다. 이들 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서, 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 또한, 키트는 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 함유할 수 있다.
"프로브"는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예를 들어, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제, 또는 효소)가 부착되는 단리된 핵산 분자이다. 그러한 프로브는 표적 핵산의 가닥에, 본 발명의 경우에 상기 옥수수 이벤트 중의 하나로부터의 게놈 DNA의 가닥에 (옥수수 식물로부터 유래한 것인지 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래한 것인지 상관없이) 상보성이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 표적 DNA 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 폴리아미드 및 다른 프로브 물질도 포함한다.
"프라이머"는 프라이머 및 표적 DNA 가닥 사이에 하이브리드를 형성하기 위해 핵산 혼성화에 의해 상보성 표적 DNA 가닥에 어닐링된 후, 중합효소, 예를 들어, DNA 중합효소에 의해 표적 DNA 가닥을 따라 연장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 발명의 프라이머쌍은 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 통상적인 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 그의 용도를 나타낸다.
프로브 및 프라이머는 일반적으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500개 폴리뉴클레오티드 또는 그 초과의 길이이다. 상기 프로브 및 프라이머는 높은 엄격성 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 유사성을 갖지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 보유하는 프로브가 통상적인 방법에 의해 설계될 수 있다.
프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법은 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재되어 있다. PCR-프라이머쌍은 예를 들어 해당 목적을 위해 의도되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 공지의 서열로부터 유래될 수 있다.
측면 DNA 및 본원에 개시된 삽입체 서열을 기초로 한 프라이머 및 프로브는 통상적인 방법, 예를 들어 상기 서열의 재-클로닝 및 서열결정에 의해 개시된 서열을 확인하기 (필요한 경우에 교정하기) 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플에서 트랜스제닉 이벤트로부터의 DNA의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 환경 하에서 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 2개의 분자가 역평행 (anti-parallel) 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 경우 서로 특이적으로 혼성화할 수 있다고 언급된다. 핵산 분자는 완전한 상보성을 보일 경우 또 다른 핵산 분자의 "보체"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 분자는 분자 중의 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보성일 때 "완전한 상보성"을 보인다고 언급된다. 2개의 분자는 이들이 적어도 통상적인 "낮은-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있다면 "최소 상보성"인 것으로 언급된다. 이와 유사하게, 분자는 이들이 통상적인 "높은-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있다면 "상보성"인 것으로 언급된다. 통상적인 엄격성 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다. 분자가 이중 가닥 구조를 형성하는 능력을 완전히 방해하지 않는다면, 완전한 상보성에서 벗어난 경우도 허용될 수 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 작용하기 위해서, 이는 사용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열에서 단지 충분히 상보성일 필요가 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 상동성인 서열은 고엄격성 조건 하에서 비교되는 핵산 서열의 보체에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열이다. 용어 "엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55] (또한, 문헌 [Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 and 9.56-9.58] 참조)에 논의되어 있는 특이적 혼성화 절차에 의해 표적 핵산에 (즉, 관심있는 특정 핵산 서열에) 대한 핵산 프로브의 혼성화에 관하여 기능적으로 규정된다. 따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 DNA 단편의 상보성 스트레치와 이중체 분자를 선택적으로 형성하는 능력을 위해 사용될 수 있다.
고려되는 용도에 따라, 프로브의 표적 서열에 대한 다양한 정도의 선택성을 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택성을 필요로 하는 용도에 대해, 일반적으로 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건을 사용할 것이고, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 것과 같은 비교적 저염 및/또는 고온 조건을 선택할 것이다. 예를 들어, 엄격한 조건은 고-엄격성 세척 버퍼 (0.2X SSC, 0.1% SDS, 65℃)로 혼성화 필터를 적어도 2회 세척하는 것을 포함할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건, 예를 들어, 6.0X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) (약 45℃), 이어서 2.0X SSC 세척 (50℃)은 당업자에게 알려져 있다 (6.3.1-6.3.6). 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 약 2.0X SSC (50℃)의 저엄격성부터 약 0.2X SSC (50℃)의 고엄격성에 이르기까지 선택할 수 있다. 추가로, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22℃의 저 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격성 조건으로 승온될 수 있다. 온도와 염 둘 모두가 변할 수 있거나, 또는 다른 변수는 변경되면서 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 상기 선택 조건은 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치 (간혹 있다 하더라도)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 미국 특허 4,965,188 및 5,176,995의 교시내용에는 혼성화 분석 방법이 예시되어 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 높은 엄격성 조건 하에 그의 보체 및 단편을 포함하여 본원에 예시 또는 제안된 하나 이상의 프라이머 (또는 앰플리콘 또는 다른 서열)에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 서열 3-14에 제시된 핵산 서열, 또는 그의 보체 및/또는 단편을 갖는다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 상기 핵산 서열과 80% 내지 100% 또는 90% 내지 100% 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 상기 서열과 95% 내지 100% 서열 동일성을 공유한다. 상기 서열은 유전적 교배의 자손체를 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 당업자에게 공지된 임의의 많은 방법에 의해 검출될 수 있고, 이들은 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그, 및 화학발광 태그를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
특정 증폭 프라이머쌍을 사용한 표적 핵산 서열의 증폭 (예를 들어, PCR에 의해)에 대해, "엄격한 조건"은 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 보체)을 갖는 프라이머가 결합하는 표적 핵산 서열에만 프라이머쌍이 혼성화하여, 바람직하게는 특유한 증폭 생성물, 즉, 앰플리콘을 생성하도록 하는 조건이다.
용어 "(표적 서열)에 특이적인"은 프로브 또는 프라이머가 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열을 포함하는 샘플에서 표적 서열에만 혼성화함을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 나타낸다. 예를 들어, 유성 교배에 의해 얻은 옥수수 식물이 본 발명의 옥수수 식물로부터의 트랜스제닉 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지를 결정하기 위해, 옥수수 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를 이벤트 DNA의 존재에 대한 판단 근거가 되는 앰플리콘을 생산하기 위해 삽입된 이종성 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 측면 서열로부터 유래된 프라이머, 및 삽입된 이종성 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머쌍을 사용하는 핵산 증폭 방법에 적용할 수 있다. 앰플리콘은 또한 이벤트에 대한 판단 근거가 되는 서열 및 길이를 갖는다. 앰플리콘은 프라이머쌍 + 하나의 뉴클레오티드 염기쌍의 조합된 길이, 및/또는 프라이머쌍 + 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 염기쌍 (±상기 나열된 임의의 증분)의 조합된 길이의 범위일 수 있다. 별법으로, 프라이머쌍은 전체 삽입체 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘을 생산하도록 삽입된 DNA의 양 측면 상의 측면 서열로부터 유래될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 일정 거리에 위치할 수 있다. 상기 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기쌍 내지 약 2만개의 뉴클레오티드 염기쌍의 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 구체적으로 배제한다.
핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 수행할 수 있다. 다양한 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있고, 특히 미국 특허 4,683,195 및 미국 특허 4,683,202에 기재되어 있다. 22 kb 이하의 게놈 DNA를 증폭하기 위한 PCR 증폭 방법이 개발되었다. 이들 방법 및 당업계에 공지된 다른 DNA 증폭 방법이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 이종성 도입유전자 DNA 삽입체의 서열 또는 대상 옥수수 이벤트로부터의 측면에 위치하는 게놈 서열은 본원에서 제공되는 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터의 상기 서열을 증폭한 후, PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 서열결정에 의해 확인될 수 있다 (및 필요한 경우 교정될 수 있다).
이들 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 많은 기술에 의해 검출할 수 있다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드를 사용한 염색이 DNA 앰플리콘을 검출하는 잘 공지된 통상적인 방법이다. 또 다른 상기 방법은 유전자 비트 (Genetic Bit) 분석으로서, 여기서 DNA 올리고뉴클레오티드는 인접한 측면에 위치하는 게놈 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 모두에 중복되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드를 미세웰 플레이트의 웰 내에 고정시킨다. 관심있는 영역의 PCR (삽입된 서열에 하나의 프라이머를, 인접한 측면에 위치하는 게놈 서열에 하나의 프라이머를 사용) 후에, 단일-가닥 PCR 생성물은 고정시킨 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고, DNA 중합효소 및 예상된 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 사용한 단일 염기 연장 반응을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반 방법에 의해 실시될 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장에 의한 삽입체/측면 서열의 존재를 나타낸다.
또 다른 방법은 문헌 [Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)]에 기재된 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서, 인접한 게놈 DNA 및 삽입체 DNA 연결과 중복되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심있는 영역으로부터의 단일-가닥 PCR (삽입된 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 위치하는 게놈 서열에 하나의 프라이머) 생성물에 혼성화하고, DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이팅된다. DNTP를 개별적으로 첨가하고, 혼입은 측정되는 광 신호를 생성한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중 염기 연장에 의한 도입유전자 삽입체/측면 서열의 존재를 나타낸다.
형광 편광은 본 발명의 앰플리콘을 검출하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 상기 방법에 따라, 게놈 측면에 위치하는 및 삽입된 DNA 연결과 중복되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심있는 영역으로부터의 단일-가닥 PCR (삽입된 DNA에 하나의 프라이머 및 측면에 위치하는 게놈 DNA 서열에 하나의 프라이머) 생성물에 혼성화하고, DNA 중합효소 및 형광-표지된 ddNTP의 존재 하에 인큐베이팅된다. 단일 염기 연장은 ddNTP를 혼입시킨다. 혼입은 형광기를 사용하여 편광의 변화로서 측정할 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장에 의한 도입유전자 삽입체/측면 서열의 존재를 나타낸다.
TAQMAN (PE 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티))은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량하는 방법이다. 간단히 설명하면, 게놈 측면에 위치하는 및 삽입체 DNA 연결과 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 위치하는 게놈 서열에 하나의 프라이머)를 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환시킨다. 특이적 증폭 동안, Taq DNA 중합효소는 FRET 프로브 상의 켄칭 (quenching) 모이어티로부터 형광 모이어티를 제거 및 방출한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 측면에 위치하는/도입유전자 삽입체 서열의 존재를 나타낸다.
분자 비콘 (Beacon)은 서열 검출에 유용한 것으로 문헌에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 측면에 위치하는 게놈 및 삽입체 DNA 연결과 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브의 특유한 구조는 형광 및 켄칭 모이어티를 매우 근접한 상태로 유지하는 2차 구조를 함유하도록 만든다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 위치하는 게놈 서열에 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 후에, FRET 프로브의 표적 서열에 대한 혼성화는 프로브 2차 구조를 제거하고 형광 및 켄칭 모이어티를 공간적으로 분리한다. 형광 신호가 생성된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 측면에 위치하는 게놈/도입유전자 삽입체 서열의 존재를 나타낸다.
삽입에 매우 우수한 옥수수 게놈 내의 위치를 개시한 본 발명은 또한 상기 게놈 위치 근처에 적어도 하나의 비-aad1 삽입체를 포함하는 옥수수 종자 및/또는 옥수수 식물을 또한 포함한다. 한 방법은 본원에서 예시된 aad-1 삽입체를 상이한 삽입체로 교체하는 것이다. 이와 관련하여, 예를 들어 표적화된 상동성 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 종류의 기술은 예를 들어 WO 03/080809 A2 및 상응하는 미국 특허 출원 공개 (US 20030232410)의 주제이다. 따라서, 본 발명은 본원에서 확인된 측면 서열 (예를 들어, 서열 29의 잔기 1-1873 및 6690-8557)의 모든 또는 인식가능한 부분이 측면에 위치하는 이종성 삽입체 (aad-1의 다중 카피 대신에 또는 이와 함께)를 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다.
본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공개는 본 명세서의 명백한 교시내용과 모순되지 않는 정도로 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다음 실시예는 본 발명의 실시를 위한 절차를 예시하고 본 발명의 바람직한 특정 실시양태를 예시하기 위한 것이다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 생각되지 않아야 한다. 당업자는 다음 실시예에 개시된 기술이 그의 실시를 위한 바람직한 방식을 예시하기 위해 사용되는 특정 방법을 제시함을 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 본원의 개시내용에 비추어 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 계속 얻으면서 이들 구체적인 실시양태에 많은 변화를 줄 수 있음을 이해할 것이다. 달리 지시하지 않으면, 모든 비율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합 비율은 달리 언급되지 않으면 부피 기준이다.
달리 지시하지 않으면 다음 약어를 사용한다.
AAD-1 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제-1
bp 염기쌍
℃ 섭씨 온도
DNA 데옥시리보핵산
DIG 디곡시게닌
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
kb 킬로염기
㎍ 마이크로그램
μL 마이크로리터
mL 밀리리터
M 몰 질량
OLP 겹치는 프로브
PCR 중합효소 연쇄 반응
PTU 식물 전사 단위
SDS 나트륨 도데실 술페이트
SOP 표준 작동 절차
SSC 염화나트륨 및 시트르산나트륨의 혼합물을 함유하는 버퍼 용액
(pH 7.0)
TBE Tris 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 버퍼 용액
(pH 8.3)
V 볼트
실시예
실시예 1. AAD1 이벤트 pDAS1740 -278의 형질전환 및 선택
AAD1 이벤트, pDAS1740-278를 옥수수 식물주 Hi-II의 WHISKER-매개된 형질전환에 의해 생산하였다. 사용된 형질전환 방법은 미국 특허 출원 # 20090093366에 기재되어 있다. 플라스미드 pDAS1740 (pDAB3812로도 칭함) (도 1)의 Fsp I 단편을 옥수수 식물주 내로 형질전환시켰다. 상기 플라스미드 구성체는 RB7 MARv3::제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 v2//AAD1 v3//제아 메이즈 PER5 3'UTR::RB 7 MARv4 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하는 식물 발현 카세트를 함유한다.
많은 이벤트가 생산되었다. 생존하고 건강한 할록시폽 (haloxyfop)-저항성 캘러스 (callus) 조직을 생산하는 이벤트를 추정 형질전환 이벤트를 나타내는 특유한 확인 코드에 지정하고, 새로운 선택 배지로 계속하여 옮겼다. 식물을 각각의 특유한 이벤트로부터 유래된 조직으로부터 재생시키고 온실로 옮겼다.
서던 블롯, DNA 경계 확인, 및 게놈 마커 활용 확인에 의해 AAD-1 도입유전자의 존재를 입증하기 위해 분자 분석을 위한 잎 샘플을 취하였다. 양성 T0 식물을 동계교배 식물주로 수분시켜 T1 종자를 얻었다. 이벤트 pDAS1470-278-9 (DAS-40278-9)의 T1 식물을 선택하고, 자가수분시키고, 5개의 세대에 대해 특성 결정하였다. 한편, T1 식물을 역교배시키고 몇몇 세대에 대한 마커-활용 선택을 통해 엘리트 생식질 (germplasm) (XHH13) 내로 유전자 이입시켰다. 상기 이벤트는 독립적인 형질전환된 단리물로부터 생성되었다. 이벤트를 그의 특유한 특성, 예를 들어 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 (Mendelian) 분리 법칙 및 안정한 발현, 및 넓은 유전자형 배경에서 다수의 환경적 위치를 가로질러 제초제 내성 및 작물의 성과를 비롯한 효능의 우월한 조합에 기초하여 선택하였다. 다음 실시예는 이벤트 pDAS-1740-278-9를 특성 결정하기 위해 사용된 데이타를 포함한다.
실시예 2. 서던 블롯을 통한 pDAS1740 -278-9 이벤트 특성 결정
삽입된 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고 이벤트 pDAS-1740-278-9 (DAS-40278-9) 내의 aad-1 유전자의 삽입체/카피수를 결정하기 위해 서던 블롯 분석을 이용하였다. 옥수수 게놈 내로 삽입된 aad-1 도입유전자의 통합 및 완전성을 입증하기 위해 데이타를 생성하였다.
서던 블롯 데이타는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내의 pDAS1740/Fsp I 단편 삽입체가 플라스미드 pDAS1740으로부터 aad-1 PTU의 단일의 무손상 카피의 간단한 통합으로서 발생하였음을 제안한다. 상세한 서던 블롯 분석은 유전자, 프로모터, 터미네이터, 및 플라스미드 영역 내에 함유된 다른 조절 요소에 특이적인 프로브, 및 플라스미드 내에 위치하는 절단 부위를 갖고 플라스미드 내부의 혼성화 단편 또는 플라스미드와 옥수수 게놈 DNA의 연결에 걸치는 단편 (경계 단편)을 생산하는 서술적인 제한 효소를 사용하여 수행하였다. 제한 효소 및 프로브의 조합을 위한 서던 혼성화로부터 나타낸 분자량은 이벤트에 대해 특유하고, 그의 확인 패턴을 확립하였다. 이들 분석은 또한 플라스미드 단편이 aad-1 PTU의 재배열 없이 옥수수 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 보여주었다. 동일한 혼성화 단편이 트랜스제닉 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 5개의 구분된 세대 내에서 관찰되었고, 이것은 세대에 걸친 aad-1 PTU 삽입의 유전의 안정성을 나타낸다. 플라스미드 pDAS1740 상에서 제한 부위 Fsp I의 외부에 위치하는 3개의 백본 프로브의 혼합물과의 혼성화는 임의의 특이적 DNA/유전자 단편을 검출하지 않았고, 이것은 암피실린 저항성 유전자의 부재, 및 트랜스제닉 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 플라스미드 pDAS1740의 Fsp I 제한 부위에 바로 인접한 다른 벡터 백본 영역의 부재를 나타낸다. aad-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내의 삽입체의 예시된 지도를 도 2-3에 제시한다.
실시예 2.1 옥수수 잎 샘플 수집 및 게놈 DNA ( gDNA ) 단리
gDNA를 aad-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 개별 식물의 잎으로부터 제조하였다. aad-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 보유하는 개별 식물로부터 수거한 잎 조직으로부터 gDNA를 추출하였다. 이벤트 DAS-40278-9의 5개의 구분된 세대로부터의 트랜스제닉 옥수수 종자를 사용하였다. 이벤트 DAS-40278-9에 대해 세대당 4개 식물로부터 유래한 20개의 개별 옥수수 식물을 선택하였다. 추가로, aad-1 유전자가 부재하는 물질 식물주를 대표하는 유전적 배경을 함유하는 통상적인 옥수수 식물인 XHH13으로부터 gDNA를 단리하였다.
gDNA를 단리하기 전에, 제조자의 권장 절차에 따라 신속 시험 스트립 키트 (아메리칸 바이오노스티카 (American Bionostica, 미국 뉴저지주 스웨데스버러))를 사용하여 aad-1 단백질 발현을 시험하기 위해 각각의 식물로부터 잎 펀치 (punche)를 취하였다. 각각의 잎 펀치 샘플에는 각각 aad-1의 존재 또는 부재에 대해 + 또는 -의 스코어가 제공된다. 이벤트 DAS-40278-9의 5개의 세대로부터 양성 식물만을 추가로 특성 결정하였다.
옥수수 잎 샘플을 이벤트 DAS-40278-9 및 통상적인 대조군 XHH13의 개별 식물로부터 수집하였다. 잎 샘플을 액체 질소 내에서 급속 냉동시키고 사용시까지 약 -80℃에서 저장하였다.
개별 게놈 DNA를 표준 CTAB 방법에 따라 동결된 옥수수 잎 조직으로부터 추출하였다. 필요한 경우에, 게놈 DNA의 일부를 제조자 권장 절차에 따라 퀴아젠 (Qiagen) Genomic-Tip (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 이용하여 추가로 정제하였다. 추출 후에, DNA를 피코 그린 (Pico Green) 시약 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))를 사용하여 형광분광법으로 정량하였다. 이어서, DNA를 피코 그린 분석으로부터의 값을 확인하고 DNA 품질을 결정하기 위해 아가로스 겔 상에서 시각화하였다.
실시예 2.2 DNA 소화 및 분리
DNA의 분자 특성 결정을 위해, 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 DNA 샘플 및 통상적인 대조군으로부터의 게놈 DNA 9 마이크로그램 (9 ㎍)을 DNA 1 ㎍당 약 5 내지 11 단위의 선택된 제한 효소 및 각각의 DNA 샘플에 대해 상응하는 반응 버퍼 를 첨가함으로써 소화시켰다. 각각의 샘플을 약 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 제한 효소 EcoR I, Nco I, Sac I, Fse I, 및 Hind III을 소화를 위해 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 입스위치)). 양성 혼성화 대조 샘플은 플라스미드 DNA인 pDAS1740 (pDAB3812)을 통상적인 대조군으로부터의 게놈 DNA와, 옥수수 게놈 당 1 카피의 도입유전자에 대략 동등한 비로 조합함으로써 제조하고, 시험 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 이용하여 소화시켰다. 통상적인 옥수수 대조군 (XHH13)으로부터의 DNA를 시험 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 이용하여 소화시켜, 음성 대조군으로서 사용하였다.
소화시킨 DNA 샘플을 Quick-Precip (엣지 바이오시스템즈 (Edge BioSystems, 미국 매릴랜드주 게이터스버그)으로 침전시키고, 1x Blue Juice (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내에 재현탁시켜 겔 로딩을 위한 목적하는 부피를 달성하였다. 이어서, DNA 샘플 및 분자 크기 마커를 1x TBE 버퍼 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific, 미국 펜실배니아주 피츠버그))를 사용하여 55-65 볼트에서 약 18-22시간 동안 0.8% 아가로스 겔을 통해 전기영동시켜 단편 분리를 달성하였다. 겔을 에티듐 브로마이드 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 염색하고, DNA를 자외광 (UV) 하에 시각화하였다.
실시예 2.3 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석을 본질적으로 문헌 [Memelink, et al. (1994) Southern, Northern, and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1-23]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, DNA 단편의 전기영동 분리 및 시각화 후에, 겔을 0.25N HCl (피셔 사이언티픽, 미국 펜실배니아주 피츠버그)로 약 15분 동안 탈퓨린화한 후, 변성 용액 (AccuGENE, 시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스))에 약 30분 동안, 이어서 중화 용액 (AccuGENE, 시그마 (미국 미주리주 세인트루이스))에 적어도 30분 동안 노출시켰다. 서던 전달은 10x SSC (시그마 (미국 미주리주 세인트루이스))를 사용하는 위킹 (wicking) 시스템을 이용하여 나일론 막 (로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)) 상으로 철야 수행하였다. 전달 후에, 막을 2x SSC 용액 내에서 세척하고, DNA을 UV 가교결합에 의해 막에 결합시켰다. 상기 과정은 혼성화를 위해 준비된 서던 블롯 막을 생성시켰다.
실시예 2.4 DNA 프로브 표지 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 단편은 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다. 연구를 위해 사용된 프로브는 유전자 요소에 특이적인 프라이머 및 플라스미드 pDAS1740으로부터의 다른 영역에 의해 생성된 단편으로부터 디곡시게닌 (DIG) 표지된 뉴클레오티드, [DIG-11]-dUTP의 PCR-기반 통합에 의해 생성하였다. PCR 합성에 의한 DNA 프로브의 생성은 제조자의 권장 절차에 따라 PCR DIG 프로브 합성 키트 (로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 수행하였다. 연구에 사용된 프로브의 목록을 표 1에 기재한다.
Figure 112012021282282-pct00002
표지된 프로브를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하여 그들의 품질 및 양을 결정하였다. 이어서, 요구되는 양의 표지된 프로브를 DIG 이지 힙 용액 (Easy Hyb Solution) (로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)에 대해 설명된 절차를 이용하여 특이적 단편의 검출을 위해 나일론 막 상의 표적 DNA에 대한 혼성화를 위해 사용하였다. 간단히 설명하면, DNA가 고정된 나일론 막 블롯을 2xSSC 내에 잠깐 동안 세척하고, 혼성화 병 내에서 약 50℃에서 최소 30분 동안 혼성화 오븐 내에서 20-25 mL의 예비가온한 DIG 이지 힙 용액으로 예비혼성화시켰다. 이어서, 예비혼성화 용액을 따라 내고, 물 내에서 5분 동안 비등시켜 예비변성시킨 요구되는 양의 특이적 프로브를 함유하는 20 mL의 예비가온한 DIG 이지 힙 용액으로 교체하였다. 이어서, 혼성화 단계를 혼성화 오븐 내에서 약 40-60℃에서 철야 수행하였다.
실시예 2.5 검출
프로브 혼성화의 끝에, 프로브를 함유하는 DIG 이지 힙 용액을 깨끗한 튜브로 따라 내고 -20℃에서 저장하였다. 이들 프로브는 제조자의 권장 절차에 따라 2-3회 재사용할 수 있다. 막 블롯을 잠깐 동안 세정하고, 깨끗한 플라스틱 용기 내에서 저엄격성 세척 버퍼 (2xSSC, 0.1%SDS)로 약 5분 동안 실온에서 2회 세척한 후, 고엄격성 세척 버퍼 (0.1xSSC, 0.1% SDS)로 각각 15분 동안 약 65℃에서 2회 세척하였다. 이어서, 막 블롯을 다른 깨끗한 플라스틱 용기에 옮기고 DIG 세척 및 차단 버퍼 세트 (로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터의 1x 세척 버퍼로 약 2분 동안 잠깐 동안 세척하고, 1x 차단 버퍼 내에서 최소 30분 동안 차단한 후, 항-DIG-AP (알칼리성 포스파타제) 항체 (1:5,000 희석, 로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)와 함께 1x 차단 버퍼 내에서 최소 30분 동안 인큐베이팅하였다. 1x세척 버퍼로 2-3회 세척 후에, 특이적 DNA 프로브는 막 블롯에 결합되어 유지되고, DIG-표지된 DNA 표준물은 제조자의 권장사항에 따라 CDP-Star 화학발광 핵산 검출 시스템 (로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하여 시각화하였다. 혼성화 단편을 검출하기 위해 및 분자 크기 표준물을 시각화하기 위해, 블롯을 화학발광 필름 (로슈 다이아그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)에 하나 이상의 시점 동안 노출시켰다. 이어서, 필름을 All-Pro 100 Plus 필름 현상제 (코니카 (Konica) SRX-101)로 발색시키고, 보고를 위해 영상을 스캐닝하였다. 검출된 밴드의 수 및 크기를 각각의 프로브에 대해 문서화하였다. 상기한 바와 같은 DIG 검출 후 가시적인 DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II (MWM DIG II)를 서던 블롯 상에서 혼성화 단편 크기를 결정하기 위해 사용하였다.
실시예 2.6 프로브 스트리핑 ( stripping )
서던 혼성화 데이타를 얻은 후 DNA 프로브를 막 블롯으로부터 스트리핑 제거하였고, 막 블롯은 제조자의 권장 절차에 따라 상이한 DNA 프로브를 사용한 혼성화를 위해 재사용할 수 있다 (DIG Application Manual for Filter Hybridization, (2003). 로슈 다이아그노스틱스). 간단히 설명하면, 신호 검출 및 필름 노출 후에, 막 블롯을 Milli-Q 물로 완전히 세정한 후, 스트리핑 버퍼 (0.2N NaOH, 0.1% SDS) 내에서 약 15분 동안 실온에서 또는 37℃에서 2회 세척하였다. 이어서, 막 블롯을 2xSSC 내에서 잠깐 동안 세척하였고, 또 다른 DNA 프로브를 사용한 예비혼성화 및 혼성화를 위해 준비되었다. 다음 혼성화로 진행하기 전에 모든 DNA 프로브가 스트리핑 제거되었는지 보장하기 위해, 막 블롯을 새로운 화학발광 필름에 노출시켰다. 재노출시킨 필름을 기록을 위해 연구 화일 내에 이전의 혼성화 데이타 패키지와 함께 유지하였다.
실시예 2.7 서던 블롯 결과
pDAS1740/Fsp I 단편의 공지의 제한 효소 부위에 기반한 특정 소화 및 프로브를 사용하여 예상 및 관찰된 단편 크기를 표 2에 제공한다. 이들 소화 및 혼성화로부터 2가지 종류의 단편을 확인하였다: 내부 단편 (여기서, 공지의 효소 부위는 프로브 영역의 측면에 위치하고, pDAS1740/Fsp I 단편 내에 완전히 포함된다) 및 경계 단편 (여기서, 공지의 효소 부위는 프로브 영역의 하나의 말단부에 위치하고, 제2 부위는 옥수수 게놈 내에 예상된다). 대부분의 경우에 DNA 단편 통합 부위는 각각의 이벤트에 대해 특유하기 때문에, 경계 단편 크기는 이벤트마다 상이하다. 경계 단편은 통합된 DNA에 상대적으로 제한 효소 부위를 위치시키기 위한 및 DNA 삽입의 수를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 본 연구에서 완료한 서던 블롯 분석에 기반하여, 플라스미드 pDAS1740/Fsp I로부터의 무손상 aad-1 PTU의 단일 카피가 삽입체 지도 (도 2-3)에 상세히 제시된 바와 같이 이벤트 DAS-40278-9의 옥수수 게놈 내로 삽입된 것으로 결론지었다.
Figure 112012021282282-pct00003
Figure 112012021282282-pct00004
이벤트 DAS-40278-9 내에 aad-1 유전자 삽입체를 특성 결정하기 위해, 플라스미드 pDAS1740 내에 특유한 제한 부위를 갖는 제한 효소, EcoR I, Nco I, Sac I, Fse I/Hind III을 선택하였다. >3382 bp, >2764 bp, >4389 bp의 경계 단편이 각각 EcoR I, Nco I, 및 Sac I 소화 후에 aad-1 유전자 프로브와 혼성화하는 것으로 예상되었다 (표 2). EcoR I, Nco I, 및 Sac I을 사용할 때 각각 ~12000 bp, ~4000 bp 및 ~16000 bp의 단일 aad-1 혼성화 밴드가 관찰되었고, 이것은 이벤트 DAS-40278-9의 옥수수 게놈 내에 단일 부위의 aad-1 유전자 삽입을 나타낸다. aad-1 식물 전사 유닛 (PTU, 프로모터/유전자/터미네이터)를 함유하는 3361 bp의 단편을 방출시키기 위해, Fse I 및 Hind III을 사용한 이중 소화를 선택하였다 (표 2). 예측된 3361 bp 단편은 Fse I/Hind III 소화 후에 aad-1 유전자 프로브를 사용하여 관찰되었다. DAS-40278-9 샘플의 4개의 모든 효소/효소 조합 소화 후 aad-1 유전자 프로브 혼성화를 이용하여 얻어진 결과는 플라스미드 pDAS1740으로부터 단일 카피의 무손상 aad-1 PTU가 이벤트 DAS-40278-9의 옥수수 게놈 내로 삽입되었음을 나타냈다.
이벤트 DAS-40278-9 내의 aad-1에 대한 프로모터 (ZmUbi1) 영역을 특성 결정하기 위해, 제한 효소 Nco I, Sac I 및 Fse I/Hind III을 선택하였다. Nco I 및 Sac I 소화는 ZmUbi1 프로모터 영역에 특이적인 DNA 프로브에 혼성화될 때 각각 >3472 bp 및 >4389 bp의 경계 영역 단편을 생성시키는 것으로 예상된다 (표 2). Nco I 소화 후 ZmUbi1 프로모터 프로브를 사용하여 ~6300 bp 및 ~3600 bp의 2개의 혼성화 밴드가 검출되었다. 그러나, ~3600 bp 밴드는 통상적인 대조군을 비롯한 모든 샘플 레인을 가로질러 존재하였고, 이것은 ~3600 bp 밴드가 옥수수 내인성 ubi 유전자에 대한 옥수수-유래된 유비퀴틴 프로모터 (ZmUbi1) 프로브의 상동성 결합으로부터 생성된 비-특이적 신호 밴드임을 제안한다. 반대로, ~6300 bp 신호 밴드는 시험된 DAS-40278-9 샘플에서 검출되지만 통상적인 대조군에서 검출되지 않았고, 이것은 ~6300 bp 밴드가 플라스미드 pDAS1740으로부터 ZmUbi1 프로모터 프로브에 특이적임을 나타내고, 따라서 표 2에 표시된 예상된 Nco I/ZmUbi1 밴드이다. 유사하게, Sac I 소화 후 ZmUbi1 프로모터 프로브를 사용하여 ~3800 bp 및 ~16000 bp의 2개의 혼성화 밴드가 검출되었다. ~3800 bp 밴드는 통상적인 대조군을 비롯한 모든 샘플 레인에서 나타났고, 따라서 옥수수 내인성 ubi 유전자에 대한 ZmUbi1 프로모터 프로브의 비-특이적 혼성화로서 간주된다. DAS-40278-9 샘플에만 존재하는 ~16000 bp 혼성화 밴드는 예상된 Sac I/ZmUbi1 밴드로 간주된다. Fse I/Hind III을 사용한 이중 소화는 ZmUbi1 프로모터 프로브에 혼성화하는 3361 bp의 aad-1 PTU 단편을 방출하는 것으로 예상된다 (표 2). 상기 3361 bp 밴드 및 ~6400 bp의 비-특이적 혼성화 밴드는 Fse I/Hind III 소화 후 ZmUbi1 프로모터 프로브에 의해 검출되었다. ~6400 bp 밴드는 옥수수 내인성 ubi 유전자에 대한 ZmUbi1 프로모터 프로브의 비-특이적 결합으로 간주되고, 이것은 상기 밴드가 통상적인 대조군을 비롯한 모든 샘플 레인 내에 존재하기 때문이다. 추가로, ~6400 bp에 매우 근접한 또 다른 밴드는 통상적인 대조군 BC3S1, 및 몇몇 BC3S2 샘플에서 관찰되었다. ~6400 bp에 매우 근접한 상기 추가의 밴드는 또한 비-특이적인 것으로 간주되고, 이것은 통상적인 대조군 XHH13 샘플 레인 내에 존재하고 XHH13의 유전적 배경과 매우 연관될 것 같기 때문이다.
이벤트 DAS-40278-9에서 aad-1에 대한 터미네이터 (ZmPer5) 영역을 특성 결정하기 위해, 동일한 제한 효소/효소 조합, Nco I, Sac I 및 Fse I/Hind III을 선택하였다. Nco I 소화는 ZmPer5 터미네이터 영역에 특이적으로 DNA 프로브에 혼성화될 때 >2764 bp의 경계 영역 단편을 생성하는 것으로 예상된다 (표 2). ~4000 bp 및 ~3900 bp의 2개의 혼성화 밴드는 Nco I 소화 후 ZmPer5 터미네이터 프로브를 사용하여 검출되었다. ~3900 bp 밴드는 통상적인 대조군을 비롯한 모든 샘플을 가로질러 존재하였고, 이것은 ~3900 bp 밴드가 아마도 옥수수 내인성 per 유전자에 대한 옥수수-유래된 퍼옥시다제 유전자 터미네이터 (ZmPer5) 프로브의 상동성 결합 때문에 비-특이적 신호 밴드임을 제안한다. 반대로, ~4000 bp 신호 밴드는 시험된 DAS-40278-9 샘플에서 검출되지만 통상적인 대조군에서 검출되지 않았고, 이것은 ~4000 bp 밴드가 플라스미드 pDAS1740으로부터 ZmPer5 터미네이터 프로브에 특이적임을 나타내고, 따라서 표 2에 나타낸 예상된 Nco I/ZmPer5 밴드이다. >1847 bp 경계 단편은 Sac I 소화 후 ZmPer5 터미네이터 프로브에 혼성화되는 것으로 예상된다. ~1900 bp 및 ~9000 bp의 2개의 혼성화 밴드가 Sac I 후 ZmPer5 터미네이터 프로브를 사용하여 검출되었다. ~9000 bp 밴드는 통상적인 대조군을 비롯한 모든 샘플 레인에서 나타났고, 따라서 옥수수 내인성 per 유전자에 대한 ZmPer5 터미네이터 프로브의 비-특이적 혼성화로서 간주되었다. DAS-40278-9 샘플 내에만 존재한 ~1900 bp 혼성화 밴드는 예상된 Sac I/ZmPer5 밴드로 간주된다. Fse I/Hind III을 사용한 이중 소화는 ZmPer5 터미네이터 프로브에 혼성화하는 3361 bp의 aad-1 PTU 단편을 방출하는 것으로 예상된다 (표 2). 상기 3361 bp 밴드 및 ~2100 bp의 추가의 비-특이적 혼성화 밴드는 Fse I/Hind III 소화 후 ZmPer5 터미네이터 프로브에 의해 검출되었다. 추가의 ~2100 bp 밴드는 옥수수 내인성 유전자에 대한 ZmPer5 터미네이터 프로브의 비-특이적 결합이고, 이것은 상기 밴드가 음성 대조군을 비롯한 모든 샘플 레인 내에 존재하기 때문이다. DAS-40278-9 샘플의 이들 소화 후 ZmUbi1 프로모터 및 ZmPer5 터미네이터 프로브 혼성화를 사용하여 얻어진 결과는 플라스미드 pDAS1740로부터 단일 카피의 무손상 aad-1 PTU가 이벤트 DAS-40278-9의 옥수수 게놈 내로 삽입되었음을 추가로 확인하였다.
AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9에서 pDAS1740/Fsp I 단편으로부터 나머지 성분을 특성 결정하기 위해 제한 효소 Nco I 및 Sac I을 선택하였다 (표 2). 성분 RB7 Mar v3 및 RB7 Mar v4의 DNA 서열은 99.7% 초과의 동일성을 갖고, 따라서 RB7 Mar v3 또는 RB7 Mar v4에 특이적인 DNA 프로브는 RB7 Mar의 두 버전을 함유하는 DNA 단편에 혼성화하는 것으로 예상되었다. >2764 bp 및 >3472 bp의 2개의 경계 단편은 Nco I 소화 후 RB7 Mar v4 및 RB7 Mar v3 프로브와 혼성화하는 것으로 예상되었다 (표 2). ~4000 bp 및 ~6300 bp의 2개의 혼성화 밴드는 DAS-40278-9 샘플에서 Nco I 소화 후 RB7 Mar v4 또는 RB7 Mar v3 프로브를 사용하여 관찰되었다. 유사하게, Sac I 소화 후 RB7 Mar v4 및 RB7 Mar v3 프로브를 사용하여 >1847 bp 및 >4389 bp의 2개의 경계 단편이 예측되었다 (표 2). Sac I 소화 후 RB7 Mar v4 또는 RB7 Mar v3 프로브를 사용하여 DAS-40278-9 샘플에서 ~1900 bp 및 ~16000 bp의 혼성화 밴드가 검출되었다.
함께 살펴보면, 이들 요소 프로브를 사용하여 얻어진 서던 혼성화 결과는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내에 삽입된 DNA가 삽입체의 5' 및 3' 말단에서 각각 매트릭스 부착 영역 RB7 Mar v3 및 RB7 Mar v4와 함께 무손상 aad-1 PTU를 함유함을 나타냈다.
실시예 2.8 백본 서열의 부재
플라스미드 pDAS1740의 거의 전체 Fsp I 백본 영역 (플라스미드 pDAS1740에서 4867-7143 bp)을 덮는 3개의 DNA 단편의 등몰 비 조합물 (표 1)을 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 특성 결정하기 위해 백본 프로브로서 사용하였다. 이벤트 DAS-40278-9를 생성하기 위해 플라스미드 pDAS1740/Fsp I 단편을 사용하였고, 따라서, 임의의 제한 효소 소화 후 백본 프로브 조합물 (표 2)을 사용하여 특이적 혼성화 신호는 예상되지 않았다. 모든 DAS-40278-9 샘플에서 Nco I 또는 Sac I 소화 후 백본 프로브를 사용하여 특이적 혼성화 신호가 검출되지 않은 것으로 확인되었다. 양성 대조군 레인은 예상된 혼성화 밴드를 함유하였고, 이는 프로브가 샘플 내에 존재한다면 임의의 상동성 DNA 단편에 혼성화할 수 있음을 나타낸다. 데이타는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내의 삽입이 플라스미드 pDAS1740으로부터 Fsp I 영역 외부에 임의의 벡터 백본 서열을 포함하지 않음을 제안하였다.
이벤트 DAS-40278-9의 5개의 구분되는 세대로부터의 잎 샘플을 사용하여, 분자 특성 결정을 위한 서던 블롯 분석을 수행하였다. 삽입된 유전자, aad-1뿐만 아니라 비-코딩 영역, 예를 들어 프로모터, 유전자 발현의 터미네이터, 및 매트릭스 부착 영역을 특성 결정하기 위해, 선택된 제한 효소 소화 및 프로브 조합물을 이용하여 통합 패턴을 조사하였다.
이벤트 DAS-40278-9 내로 삽입된 DNA의 서던 블롯 특성 결정은 aad-1 PTU의 단일 무손상 카피가 이벤트 DAS-40278-9 내로 통합되었음을 나타낸다. 제한 효소 및 프로브의 조합에 대한 서던 혼성화에 의해 나타내지는 분자량은 이벤트에 대해 특유하였고, 그의 확인 패턴을 확립하였다. 혼성화 패턴은 5개의 모든 세대를 가로질러 동일하고, 이것은 삽입체가 옥수수 게놈 내에서 안정함을 나타낸다. 플라스미드 pDAS1740으로부터 pDAS1740/Fsp I 형질전환 단편을 넘은 백본 영역을 덮는 프로브를 사용한 혼성화는 벡터 백본 서열이 이벤트 DAS-40278-9 내로 포함되지 않았음을 확인한다.
실시예 3. 옥수수 이벤트 DAS -40278-9의 삽입체 및 측면 경계 영역에서 DNA 서열의 클로닝 및 특성 결정
삽입된 DNA를 특성 결정하고 게놈 삽입 부위를 설명하기 위해, 이벤트 DAS-40278-9의 삽입체 및 경계 영역의 DNA 서열을 결정하였다. 1873 bp의 5' 측면 경계 서열, 1868 bp의 3' 측면 경계 서열, 및 4816 bp의 DNA 삽입체를 포함하는, 이벤트 DAS-40278-9 게놈 서열의 총 8557 bp가 확인되었다. 4816 bp DNA 삽입체는 무손상 aad-1 발현 카세트, 5' 말단 상에 259 bp 부분 MAR v3, 및 3' 말단 상에 1096 bp 부분 MAR v4를 함유한다. 서열 분석으로 5'-통합 연결에서 21 bp 삽입, 및 옥수수 게놈의 삽입 로커스로부터 2개의 염기쌍 결실을 밝혔다. 1개의 염기쌍 삽입은 옥수수 게놈 및 DAS-40278-9 삽입체 사이의 3'-통합 연결에서 발견되었다. 또한, 단일 염기 변화 (T에서 C로)가 3' UTR의 비-코딩 영역 내의 위치 5212에서 삽입체에서 발견되었다. 이들 변화은 aad-1 발현 카세트의 개방 판독 프레임 조성에 영향을 미치지 않는다.
이벤트 DAS-40278-9 삽입체 및 경계 서열에 기반한 PCR 증폭으로 경계 영역이 옥수수 기원이고, 연결 영역은 DAS-40278-9의 이벤트-특이적 확인을 위해 사용될 수 있음을 확인하였다. 연결 영역에 걸치는 서열의 분석은 이벤트 DAS-40278-9 내에 DNA 삽입으로부터 신규한 개방 판독 프레임 (ORF>=200 코돈)이 생성되지 않았고, 또한 게놈 개방 판독 프레임이 천연 옥수수 게놈 내에서 DAS-40278-9 통합에 의해 차단되지 않았음을 나타낸다. 종합하면, AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 삽입체 및 경계 서열의 특성 결정은 단일 무손상 카피의 aad-1 발현 카세트가 천연 옥수수 게놈 내로 통합되었음을 나타낸다.
실시예 3.1. 게놈 DNA 추출 및 정량
변형된 CTAB 방법을 이용하여 동결건조된 또는 새로 연마한 잎 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. DNA 샘플을 1x TE (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA) (플루카 (Fluka), 시그마 (미국 미주리주 세인트루이스))에 용해시키고, 제조자의 지시에 따라 피코 그린 방법으로 정량하였다 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진)). PCR 분석을 위해, DNA 샘플을 분자 생물학 등급 물 (5 PRIME, 미국 매릴랜드주 게이터스버그)로 희석시켜 10-100 ng/μL의 농도로 하였다.
실시예 3.2. PCR 프라이머
표 3은 이벤트 DAS-40278-9의 DNA 삽입체 및 측면 경계 영역을 클로닝하기 위해 사용된 프라이머 서열을 나열하고, 여기서 위치 및 설명은 도 4에 표식하였다. 표 4는 삽입체 및 경계 서열을 확인하기 위해 사용된 프라이머 서열을 나열한다. 프라이머 위치를 각각 도 4 및 5에 표식하였다. 모든 프라이머는 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크. (Integrated DNA Technologies, Inc., 미국 아이오와주 코랄빌)에서 합성되었다. 프라이머를 물 (5 PRIME, 미국 매릴랜드주 게이터스버그)로 100 μM의 농도로 용해시켜 원액 용액으로 하고, 물로 10 μM의 농도로 희석시켜 작업 용액으로 하였다.
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Figure 112012021282282-pct00006
Figure 112012021282282-pct00007
Figure 112012021282282-pct00008
실시예 3.3. 게놈 워킹 ( walking )
옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 5' 및 3' 측면 경계 서열을 클로닝하기 위해 게놈 워커 (Genome Walker)™ 유니버설 키트 (클론테크 래보래토리스, 인크 (Clontech Laboratories, Inc, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하였다. 제조자의 지시에 따라, AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터의 약 2.5 ㎍의 게놈 DNA를 EcoR V, Stu I (둘 모두 키트에 제공되어 있음) 또는 Sca I (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치)로 철야 소화시켰다. 소화시킨 DNA를 DNA 클린 & 컨센트레이터 (Clean & Concentrator)™-25 (자이모 리서치 (ZYMO Research, 미국 캘리포니아주 오랜지))를 사용하여 정제한 후, 게놈 워커™ 어댑터 (adaptor)에 라이게이팅하여 게놈 워커™ 라이브러리를 제작하였다. 각각의 게놈 워크™ 라이브러리를 키트에 제공된 어댑터 프라이머 AP1, 및 각각의 구성체-특이적 프라이머 5End3812_A 및 3End3812_C를 사용한 1차 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 사용하였다. 이어서, 1차 PCR 반응물의 1:25 희석액의 1 마이크로리터를 네스티드 (nested) 어댑터 프라이머 AP2 및 각각의 네스티드 구성체-특이적 프라이머 5End3812_B 및 3End3812_D를 사용한 2차 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. TaKaRa LA Taq™ HS (다카라 바이오 인크. (Takara Bio Inc), 일본 시가)를 PCR 증폭에 사용하였다. 50 μL PCR 반응액에서, 1 μL의 DNA 주형, 8 μL의 2.5 mM dNTP 혼합물, 0.2 μM의 각각의 프라이머, 2.5 단위의 TaKaRa LA Taq™ HS DNA 중합효소, 5 ㎕의 10 x LA PCR 버퍼 II (Mg2 + 첨가), 및 1.5 μL의 25 mM MgCl2를 사용하였다. 구체적인 PCR 조건을 표 5에 제시한다.
Figure 112012021282282-pct00009
실시예 3.4. 통상적인 PCR
옥수수 이벤트 DAS-40278-9에서 DNA 삽입체 및 경계 서열을 클로닝하고 확인하기 위해 표준 PCR을 사용하였다. TaKaRa LA Taq™ (다카라 바이오 인크., 일본 시가), HotStarTaq DNA 중합효소 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아), Expand High Fidelity PCR 시스템 (로슈 다이아그노스틱스, 인크., 미국 인디애나주 인디애나폴리스), 또는 Easy-A® High-Fidelity PCR 클로닝 엔자임 (Cloning Enzyme) & 매스터 믹스 (Master Mix) (스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 호야))를 제조자의 권장 절차에 따라 통상적인 PCR 증폭을 위해 사용하였다. 구체적인 PCR 조건 및 앰플리콘 설명을 표 6에 나열한다.
Figure 112012021282282-pct00010
실시예 3.5 PCR 생성물 검출, 정제, PCR 생성물의 서브- 클로닝 및 서열결정
PCR 생성물을 제조자의 지시에 따라 1.2% 또는 2% E-겔 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 사용하여 전기영동에 의해 조사하였다. 단편 크기는 DNA 마커와 비교하여 추정하였다. 필요한 경우에, PCR 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 에티듐 브로마이드로 염색된 1x TBE 내의 1% 아가로스 겔로부터 단편을 절제함으로써 정제하였다.
PCR 단편을 제조자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 (Cloning)® 서열결정 키트 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 pCR®4-TOPO® 내로 서브클로닝하였다. 구체적으로, 2 내지 5 마이크로리터의 TOPO® 클로닝 반응물을 제조자의 지시에 따라 원 샷 (One Shot) 화학적 수용성 (competent) TOP10 세포 내로 형질전환시켰다. 클로닝된 단편은 플라스미드 DNA의 미니제제 (퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (QIAprep Spin Miniprep Kit), 퀴아젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드), 이어서 EcoR I을 사용한 제한 소화 또는 키트에 제공된 T3 및 T7 프라이머를 사용한 직접적인 콜로니 PCR에 의해 확인되었다. 이어서, 선택된 콜로니의 플라스미드 DNA 또는 글리세롤 스톡 (stock)을 서열결정을 위해 사용하였다.
서브-클로닝 후에, 예상된 DNA 단편의 클로닝 여부를 확인하기 위해 추정 표적 PCR 생성물을 초기에 서열결정하였다. 적절한 DNA 서열을 함유하는 콜로니를 완전한 DNA 서열을 결정하기 위한 프라이머 워킹을 위해 선택하였다. 서열결정은 코제닉스 (Cogenics, 미국 텍사스주 휴스턴)에 의해 수행되었다.
삽입체 및 경계 서열의 최종 조립은 Sequencher 소프트웨어 (버전 4.8, 진 코즈 코퍼레이션 (Gene Codes Corporation, 미국 미시건주 앤 아버))를 사용하여 달성하였다. 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 삽입체 및 경계 서열의 해석은 벡터 NTI (버전 10 및 11, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 수행하였다.
상동성 검색은 GenBank 데이타베이스에 대해 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였다. 전체 삽입체 및 측면 경계 서열에서 ORF (>= 200 코돈)을 확인하기 위해 벡터 NTI (버전 11, 인비트로겐)를 사용한 개방 판독 프레임 (ORF) 분석을 수행하였다.
실시예 3.6. 5' 말단 경계 서열
도입유전자의 5' 말단에 대한 특이적 네스티드 프라이머 세트를 사용하여 각각의 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 게놈 워커™ 라이브러리로부터 DNA 단편을 증폭하였다. 약 800 bp의 PCR 생성물이 이벤트 DAS-40278-9 EcoR V 및 Stu I 게놈 워커™ 라이브러리 모두로부터 관찰되었다. Sca I 게놈 워커™ 라이브러리는 약 2 kb의 생성물을 생성하였다. 단편을 pCR®4-TOPO® 내로 클로닝하고, 삽입체가 예상된 서열을 함유하는지 확인하기 위한 말단 서열결정을 위해 각각의 라이브러리로부터 6개의 콜로니를 무작위로 선발하였다. 삽입체의 프라이머 워킹에 의한 완전한 서열결정은 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 Stu I, EcoR V, 및 Sca I 게놈 워커™ 라이브러리로부터 증폭된 단편이 각각 793, 822, 및 2132 bp임을 보여주었다. Stu I 및 EcoR V 게놈 워커™ 라이브러리로부터 생성된 DNA 단편은 Sca I 게놈 워커™ 라이브러리로부터 생성된 DNA 단편에 100% 일치하였고, 이는 이들 DNA 단편이 도입유전자 삽입체의 5' 영역으로부터 증폭됨을 시사하였다. 생성되는 1873 bp 옥수수 게놈 서열의 BLAST 탐색은 옥수수 BAC 클론의 서열에 대한 높은 유사성을 나타내었다. 또한, 삽입 연결의 서열 분석은 그의 5' 말단 영역에서 MAR v3의 917 bp가 플라스미드 pDAS1740/Fsp I 단편에 비해 말단절단되어, aad-1 발현 카세트의 5' 영역에 259 bp의 부분 MAR v3을 생성시킴을 보여주었다.
실시예 3.7.3' 말단 경계 서열
도입유전자의 3' 말단에 대한 특이적 네스티드 프라이머 세트를 사용하여 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 Stu I 게놈 워커™ 라이브러리로부터 크기가 약 3 kb인 DNA 단편을 증폭하였다. DNA 단편을 pCR®4-TOPO® 내로 클로닝하고, 예상된 서열의 삽입을 확인하기 위해 10개의 콜로니를 무작위로 선발하였다. 예상된 삽입체를 갖는 3개의 클론을 완전히 서열결정하여 2997 bp의 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편의 서열 분석은 부분적인 MAR v4 요소 (그의 5' 영역의 70 bp 상실) 및 1867 bp 옥수수 게놈 서열을 보여주었다. BLAST 탐색은 1867 bp 게놈 DNA 서열이 5' 경계 서열을 사용하여 확인된 동일한 옥수수 BAC 클론 내의 서열에 대해 100% 일치함을 보여주었다.
실시예 3.8. DNA 삽입체 및 연결 서열
DNA 삽입체 및 연결 영역을 이전에 설명된 PCR 기반 방법을 사용하여 옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터 클로닝하였다. 5개의 프라이머쌍을 5' 및 3' 측면 경계 서열 및 예상된 도입유전자 서열을 기초로 하여 설계하였다. 총 5개의 겹치는 DNA 단편 (1767 bp의 앰플리콘 1, 1703 bp의 앰플리콘 2, 1700 bp의 앰플리콘 3, 1984 bp의 앰플리콘 4, 및 1484 bp의 앰플리콘 5)을 클로닝하고 서열결정하였다 (도 4). 전체 삽입체 및 측면 경계 서열을 5가지의 단편 중에서 겹치는 서열을 기초로 하여 조립하였다. 최종 서열을 통해, pDAS1740/Fsp I로부터 유래된 4816 bp의 DNA 삽입체, 1873 bp의 5' 측면 경계 서열, 및 1868 bp의 3' 측면 경계 서열의 존재를 확인할 수 있다. 4816 bp의 DNA 삽입체는 무손상 aad-1 발현 카세트, 5' 말단 상의 259 bp의 부분 MAR v3, 및 3' 말단 상의 1096 bp의 부분 MAR v4를 함유한다 (서열 29).
각각의 프라이머쌍에 대한 적어도 2개의 클론이 DNA 삽입체 및 그의 경계 서열에 대한 완전한 서열 정보를 얻기 위한 프라이머 워킹에 사용되었다. 서열 분석은 옥수수 게놈 DNA와 pDAS1740/Fsp I로부터의 통합된 부분 MAR v3 사이의 5'-통합 연결에 21 bp의 삽입을 보여주었다. BLAST 탐색 및 벡터 NTI 분석 결과는 21 bp의 삽입체 DNA가 임의의 식물 종 DNA 또는 pDAS1740 플라스미드 DNA에 대한 상동성을 나타내지 않음을 보여주었다. 단일 염기쌍 삽입은 옥수수 게놈 DNA와 pDAS1740/Fsp I로부터의 부분 MAR v4 사이의 3'-통합 연결에서 발견되었다. DNA 통합은 또한 옥수수 게놈의 삽입 로커스에서 2개의 염기쌍 결실을 야기하였다 (도 6). 또한, 5212 bp의 위치에서 하나의 뉴클레오티드 차이 (T에서 C로의)가 DNA 삽입체의 비-번역된 3' UTR 영역에서 관찰되었다 (서열 29). 그러나, 이들 변화는 aad-1 발현에 중요하거나 또는 DAS-40278-9의 삽입체 내의 연결에 걸쳐 임의의 새로운 ORF (>= 200 코돈)을 생성하는 것으로 보이지 않는다.
실시예 3.9. 옥수수 게놈 서열의 확인
옥수수 게놈에서 이벤트 DAS-40278-9 도입유전자의 삽입 부위를 확인하기 위해서, PCR 증폭을 상이한 프라이머쌍을 사용하여 수행하였다 (도 4). 이벤트 DAS-40278-9 및 다른 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 옥수수 식물주로부터의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였다. 2개의 aad-1 특이적 프라이머, 즉 AI5End01 및 AI5End02, 및 5' 말단 경계 서열에 따라 설계된 2개의 프라이머, 즉 1F5End01 및 1F5End02를 사용하여 5' 말단 경계 서열까지 aad-1 유전자에 걸치는 DNA 단편을 증폭하였다. 유사하게, 3' 말단 경계 서열까지 aad-1 유전자에 걸치는 DNA 단편을 증폭하기 위해서, 3' 말단 경계 서열로부터 유래한 1F3End05 프라이머 및 aad-1 특이적 AI3End01 프라이머를 사용하였다. 예상된 크기를 갖는 DNA 단편은 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 게놈 DNA로부터만 증폭되었고, 각각의 프라이머쌍은 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 측면 경계에 위치한 하나의 프라이머 및 하나의 aad-1 특이적 프라이머로 구성된다. 대조군 DNA 샘플은 동일한 프라이머쌍을 사용하여 PCR 생성물을 생성하지 않았고, 이것은 클로닝된 5' 및 3' 말단 경계 서열이 실제로 각각 삽입된 aad-1 유전자 구성체의 상류 및 하류 서열임을 나타낸다. 1F5End01 및 AI5End01의 프라이머쌍이 PCR 증폭을 위해 사용될 때 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9, AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40474 및 비-트랜스제닉 옥수수 식물주 XHH13을 포함하는 모든 옥수수 샘플에서 크기가 약 8 kb인 희미한 밴드가 관찰되었음이 주목된다. 관찰된 희미한 밴드 (제조된 겔 상의)는 상기 프라이머쌍을 사용한 옥수수 게놈의 비특이적 증폭의 결과일 수 있다.
옥수수 게놈 내의 DNA 삽입을 추가로 확인하기 위해서, 5' 말단 경계 서열에 위치하는 2개의 프라이머, 즉 1F5End03 및 1F5End04, 및 3' 말단 경계 서열에 위치하는 2개의 프라이머, 즉 1F3End03 및 1F3End04를 사용하여 삽입 로커스에 걸치는 DNA 단편을 증폭하였다. 1F5End03/1F3End03의 프라이머쌍 또는 1F5End04/1F3End04의 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭은 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 게놈 DNA로부터 약 8 kb의 예상된 크기를 갖는 단편을 생성하였다. 이와 대조적으로, AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40474-7 또는 비-트랜스제닉 옥수수 식물주 XHH13의 게놈 DNA로부터 어떠한 PCR 생성물도 생성되지 않았다. AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 및 이벤트 DAS-40474-7이 HiII의 형질전환, 이어서 본래의 트랜스제닉 이벤트와 옥수수 식물주 XHH13과의 역교배에 의해 생성됨을 고려할 때, 각각의 이들 2개의 이벤트에서 대부분의 게놈은 이론적으로 옥수수 식물주 XHH13으로부터 유래한 것이다. aad-1 도입유전자에 근접한 측면 경계 서열만이 본래의 게놈 DNA로부터 운반되어 AAD-1 이벤트 유전자 이입 과정 동안 보존되고, 게놈 서열의 다른 영역은 XHH13의 게놈 서열로 교체될 수 있을 가능성이 아주 높다. 따라서, 1F5End03/1F3End03의 프라이머쌍 또는 1F5End04/1F3End04의 프라이머쌍을 사용하여 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40474-7 및 XHH13의 게놈 DNA로부터 단편이 증폭되지 않았음은 놀라운 사실이 아니다. 약 3.1 및 3.3 kb 단편은 옥수수 식물주 HiII 및 B73의 게놈 DNA에서 각각 1F5End03/1F3End03 및 1F5End04/1F3End04의 프라이머쌍을 사용하여 증폭되었지만, 옥수수 식물주 A188에서는 그렇지 않았다. 이 결과는 경계 서열이 옥수수 식물주 B73의 게놈으로부터 유래되었음을 나타낸다.
측면 경계 서열의 유효성을 보장하기 위해 B73/HiII로부터 옥수수 게놈 DNA의 추가의 클로닝을 수행하였다. B73/HiII 게놈 DNA의 특이적 위치 내로 통합된 삽입체 DNA 영역을 입증하기 위해 PCR 증폭된 단편을 서열결정하였다. 프라이머는 얻은 서열을 기초로 하여 설계하였다. 프라이머 세트 Amp 1F/Amp 5R을 사용하여 삽입체 DNA가 없는 천연 B73/HiII 게놈으로부터 5'에서 3'으로의 연결에 걸치는 2212 bp 단편을 증폭하였다. 서열 분석은 도입유전자 삽입 로커스에 천연 B73 게놈으로부터 2개의 염기쌍 결실이 존재함을 보여주었다. 클로닝된 천연 B73 게놈 단편으로부터의 DNA 서열의 분석을 통해 3'-통합 연결 영역의 하류에 위치하는 하나의 ORF (>= 200 코돈)를 확인하였다. 추가로, AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9가 통합된 본래의 로커스에 걸쳐 다른 ORF가 존재하지 않는다. BLAST 탐색은 또한 이벤트 DAS40278-9로부터 5' 말단 및 3' 말단 경계 서열이 모두 동일한 옥수수 BAC 클론 상에 나란히 위치함을 확인하였다.
AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 5'-통합 연결의 특유성을 감안하여, 상기 삽입체-대-식물 게놈 연결을 증폭하기 위해 2개의 특이적 PCR 프라이머쌍, 즉 1F5EndT1F/1F5EndT1R 및 Corn278-F/Corn278-R을 설계하였다. 예측된 바와 같이, 목적하는 DNA 단편은 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 게놈 DNA에서만 생성되었고, 임의의 다른 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 옥수수 식물주에서는 생성되지 않았다. 따라서, 이들 2개의 프라이머쌍은 AAD-1 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 이벤트-특이적 식별자 (identifier)로서 사용될 수 있다.
실시예 4. DAS -40278-9의 측면에 위치하는 SSR 마커의 게놈 특성 결정
게놈 삽입 부위를 특성결정하고 설명하기 위해, 삽입체에 근접하여 위치하는 마커 서열을 결정하였다. 일군의 다형성 SSR 마커를 사용하여 도입유전자 위치를 확인하고 지도를 작성하였다. 이벤트 pDAS1740-278은 2008 DAS 옥수수 연관 지도 상에서 약 20 cM에서 SSR 마커 UMC1265와 MMC0111 사이의 약 20 cM에서 염색체 2 상에 위치한다. 표 6은 도입유전자 pDAS1740-278에 매우 근접하여 위치하는 것으로 밝혀진 이들 2개의 마커에 대한 프라이머 정보를 요약한 것이다.
[표 6]
Figure 112012021282282-pct00011
실시예 4.1. gDNA 단리
gDNA를 DNEasy 96 식물 시험 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 잎 펀치 (leaf punch)로부터 추출하였다. 자동화를 위해 프로토콜을 변형하였다. 단리된 gDNA는 몰레큘라 프로브스, 인크. (미국 오레곤주 유진)로부터 피코그린 (PicoGreen)® 염료를 사용하여 정량하였다. gDNA의 농도를 멸균 탈이온수를 사용하여 모든 샘플에 대해 5 ng/㎕로 희석하였다.
실시예 4.2. 마커를 사용한 gDNA 의 스크리닝
희석시킨 gDNA의 유전자형을 간단한 서열 반복체 (SSR) 마커의 하위세트를 사용하여 결정하였다. SSR 마커는 6-FAM, HEX/VIC, 또는 NED (각각 청색, 초록색 및 황색) 형광 태그로 표지된 전방향 프라이머를 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)에서 합성하였다. 마커를 PCR후 다중화 (multiplexing) 및 분석을 용이하게 하기 위해 그의 형광 태그 및 앰플리콘 크기를 기초로 하여 군 또는 패널로 나누었다.
PCR을 384-웰 분석 플레이트에서 수행하였고, 여기서 각각의 반응물은 5 ng의 게놈 DNA, 1.25X PCR 버퍼 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아), 0.20 μM의 각각의 전방향 및 역방향 프라이머, 1.25 mM MgCl2, 0.015 mM의 각각의 dNTP, 및 0.3 단위의 HotStart Taq DNA 중합효소 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 함유하였다. 증폭은 384-이중 헤드 모듈 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)이 구비된 Gene Amp PCR 시스템 9700에서 수행하였다. 증폭 프로그램은 다음과 같았다: (1) 95℃에서 12분 동안 Taq의 초기 활성화; (2) 94℃에서 30 sec; (3) 55℃에서 30 sec; (4) 72℃에서 30 sec; (5) 40 사이클 동안 단계 2-4의 반복; 및 (6) 72℃에서 30 min 최종 연장. 각각의 SSR 마커 패널에 대한 PCR 생성물은 동일한 식물로부터의 2 ㎕의 각각의 PCR 생성물을 멸균 탈이온수에 60 ㎕의 총 부피로 첨가함으로써 함께 다중화하였다. 다중화된 PCR 생성물 중에서, 0.5 ㎕를 1:100 비율의 GeneScan 500 염기쌍 LIZ 크기 표준물 및 ABI HiDi 포름아미드 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로 이루어지는 5 ㎕의 로딩 버퍼가 담긴 384-웰 로딩 플레이트 내에 넣었다. 이어서, 샘플을 36분의 총 전개 시간에서 제조자의 권장사항을 이용하여 모세관 전기영동을 위해 ABI Prism 3730xl DNA 분석기 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 상에 로딩하였다. 마커 데이타는 ABI Prism 3730xl 자동 서열결정기 데이타 수집 소프트웨어 버전 4.0에 의해 수집하고, 대립유전자 특성 결정 및 단편 크기 표지를 위해 GeneMapper 4.0 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 통해 추출하였다.
실시예 4.3 SSR 마커 결과
도입유전자에 가장 근접한 것으로 확인된 측면에 위치하는 마커에 대한 프라이머 데이타를 표 6에 제시한다. 2개의 가장 근접한 연관된 마커인 UMC1265 및 MMC0111은 염색체 2 상의 도입유전자 삽입체로부터 약 20 cM 떨어진 위치에 존재한다.
실시예 5. 이벤트 DAS -40278-9에서 aad -1 단백질의 특성 결정
트랜스제닉 옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터 유래된 재조합 aad-1 단백질의 생화학적 특성을 결정하였다. 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE, 쿠마지 블루로 염색 및 당단백질 검출 방법), 웨스턴 블롯 (Western blot), 면역진단 시험 스트립 분석, 매트릭스 활용 레이저 탈착/이온화 비행시간형 (time-of-flight) 질량 분광기 (MALDI-TOF MS) 및 이중 MS에 의한 단백질 서열결정 분석을 사용하여 단백질의 생화학적 특성을 결정하였다.
실시예 5.1. 면역진단 스트립 분석
DAS-40278-9의 잎 조직 내의 aad-1 단백질의 존재는 아메리칸 바이오노스티카로부터 상업적으로 제조된 면역진단 시험 스트립을 사용하여 확인하였다. 스트립은 조야한 잎 추출물을 시험함으로써 트랜스제닉 식물과 비트랜스제닉 식물을 식별할 수 있다 (데이타를 제시하지 않음). 비-트랜스제닉 추출물 (XHH13)은 검출가능한 양의 면역반응성 단백질을 함유하지 않았다. 상기 결과를 또한 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.
aad-1 단백질의 발현에 대해 시험하기 위해, 면역진단 스트립 분석을 수행하였다. 개별적으로 표지한 1.5 mL 마이크로원심분리관의 스냅캡 (snap-cap) 뚜껑 사이에 조직을 으깸으로써 XHH13 (대조 식물) 및 이벤트 DAS-40278-9에 대한 각각의 식물로부터 4개의 잎 펀치를 수거하였다. 실험실에 도착한 즉시, 0.5 mL의 aad-1 추출 버퍼 (아메리칸 바이오노스티카, 미국 뉴저지주 스웨데스버러)를 각각의 관에 첨가하고, 1회용 막자를 사용하여 조직을 균질화한 후, 샘플을 ~10초 동안 교반하였다. 균질화 후에, 시험 스트립을 관에 넣고, ~5분 동안 전개시켰다. 식물 추출물 내의 aad-1 단백질의 존재 또는 부재는 면역진단 스트립 상의 시험선의 발생 (또는 미발생)을 기초로 하여 확인하였다. aad-1 단백질의 발현이 트랜스제닉 이벤트에 대해 확인된 후, 옥수수 줄기 조직을 수거하여 동결건조하고, 약 -80℃에서 사용시까지 저장하였다.
실시예 5.2. 옥수수로부터 aad -1 단백질의 정제
면역-정제된, 옥수수-유래된 aad-1 단백질 (분자량: ~33 kDa) 또는 옥수수 줄기 조직으로부터의 조야한 수성 추출물을 준비하였다. 모든 잎 및 줄기 조직을 다음과 같이 수거하고 실험실로 옮겼다: 잎을 가위로 식물로부터 자르고, 천 가방에 넣고, 사용을 위해 약 -20℃에서 보관하였다. 이와 별개로, 줄기를 지면 바로 위에서 자르고, 천 가방에 넣고, 약 -80℃에서 ~6시간 동안 즉시 동결시켰다. 이어서, 줄기를 물을 제거하기 위해 5일 동안 동결건조기 내에 두었다. 조직이 완전히 건조된 후, 드라이 아이스로 미분말로 연마하고, 필요시까지 약 -80℃에서 보관하였다.
~30 g의 동결건조된 조직을 냉각된 1000 mL 유리 블렌더 내로 계량투입하고 500 mL의 추출 버퍼를 첨가함으로써, 옥수수-유래된 aad-1 단백질을 포스페이트-기반 버퍼 (버퍼 성분에 대해서는 표 7을 참조한다)에서 동결건조된 줄기 조직으로부터 추출하였다. 조직을 60초 동안 블렌딩하고, 샘플을 20분 동안 30,000 x g에서 원심분리함으로써 가용형 단백질을 수거하였다. 펠렛을 설명된 바와 같이 재-추출하고, 상등액을 합하고 0.45 μ 필터를 통해 여과하였다. 여과된 상등액을 스트러티직 바이오설루션 인크. (Strategic Biosolution Inc.)에 의해 제조된 모노클로날 항체 (MAb 473F1 85.1; 단백질 A 정제; Lot #: 609.03C-2-4; 6.5 mg/mL (총 ~35.2 mg)) (미국 메인주 윈드햄)가 접합되고; CNBr-활성화된 세파로스 4B (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 미국 뉴저지주 피스카타웨이))에 접합된 항-aad-1 면역친화도 컬럼 상에 약 +4℃에서 로딩하였다. 비-결합된 단백질을 수집하고, 컬럼을 예비 냉각된 20 mM 중탄산암모늄 버퍼 (pH 8.0)로 강하게 세척하였다. 결합된 단백질을 3.5 M NaSCN, (시그마 (미국 미주리주 세인트루이스)), 50 mM Tris (시그마 (미국 미주리주 세인트루이스)) pH 8.0 버퍼로 용출시켰다. 7개의 5 mL 분획을 수거하고, 분획 번호 2->7을 10 mM Tris, pH 8.0 버퍼에 대해 약 +4℃에서 철야 투석하였다. 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 조사하고, 나머지 샘플은 후속 분석을 위해 사용될 때까지 약 +4℃에서 저장하였다.
Figure 112012021282282-pct00012
면역친화도 컬럼에 결합된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 검사하였고, 결과는 용출된 분획이 약 33 kDa의 분자량의 aad-1 단백질을 함유함을 보여주었다. 또한, 웨스턴 블롯을 또한 수행하였고, aad-1 단백질에 대해 양성이었다. 옥수수-유래된 aad-1 단백질을 ~30 g의 동결건조된 줄기 물질로부터 단리하였다.
실시예 5.3. SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯
이벤트 DAS-40278-9 및 XHH13 줄기로부터의 동결건조된 조직 (~100 mg)을 2-mL 마이크로원심분리관에 칭량하여 넣고, 10% 식물 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)을 함유하는 ~1 mL의 PBST (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)로 추출하였다. 추출은 4개의 작은 볼 베어링을 넣고 샘플을 1분 동안 제노-연마 (Geno-Grinding)함으로써 촉진되었다. 연마 후에, 샘플을 5분 동안 20,000 x g에서 원심분리하고, 상등액을 5x 램리 (Laemmli) 샘플 버퍼 (2% SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 0.2 mg/mL 브로모페놀 블루, 새로 첨가한 10% 2-머캅토에탄올 함유 50% (w/w) 글리세롤)와 4:1로 혼합하고, 5분 동안 ~100℃에서 가열하였다. 잠깐 동안 원심분리한 후, 45 μL의 상등액을 크라이테리온 셀 (Criterion Cell) 겔 모듈이 구비된 바이오-라드 크라이테리온 SDS-PAGE 겔 (바이오-라드 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘레스)) 상에 직접 로딩하였다. 미생물-유래된 aad-1의 양성 참조 표준물을 1 mg/mL로 PBST (pH 7.4) 내에 재현탁시키고, PBST로 추가로 희석하였다. 이어서, 샘플을 5% 2-머캅토에탄올 함유 바이오-라드 램리 버퍼와 혼합하고, 앞에서 설명한 바와 같이 처리하였다. 전기영동은 염료가 겔의 끝에 도달할 때까지 150 - 200 V의 전압에서 Tris/글리신/SDS 버퍼 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)로 수행하였다. 분리 후에, 겔을 1/2로 자르고, 한 조각을 피어스 (Pierce) 겔코드 블루 (GelCode Blue) 단백질 염색으로 염색하고, 다른 조각은 100 볼트의 일정한 전압 하에서 60분 동안 미니 트랜스 (trans-blot) 전기영동 전달 세포 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 니트로셀룰로스 막 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)에 전기 블로팅하였다. 전달 버퍼는 20% 메탄올 및 Tris/글리신 버퍼 (바이오-라드)를 함유하였다. 면역검출을 위해, 막을 aad-1 특이적 폴리클로날 토끼 항체 (스트러티직 바이오설루션 인크., 미국 델라웨어주 뉴어크, 단백질 A 정제된 토끼 폴리클로날 항체 Lot #: DAS F1 197-15 1, 1.6 mg/mL)로 프로빙하였다. 염소 항-토끼 IgG (H+L) 및 알칼리성 포스파타제 (피어스 케미컬 (Pierce Chemical, 미국 일리노이주 록포드))의 접합체를 2차 항체로서 사용하였다. SigmaFast BCIP/NBT 기질을 면역반응성 단백질 밴드의 발색 및 시각화를 위해 사용하였다. 반응을 중지시키기 위해 막을 물로 강하게 세척하고, 결과 기록을 디지털 스캐너 (휴렛 패카드 (Hewlett Packard, 미국 캘리포니아주 팔로 알토))로 캡쳐하였다.
피. 플루오레센스 (P. fluorescens)-생산 aad-1에서, 쿠마지 (Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 시각화된 주요 단백질 밴드는 약 33 kDa이었다. 예상한 바와 같이, 상응하는 옥수수-유래된 aad-1 단백질 (이벤트 DAS-40278-9)은 미생물-발현 단백질과 크기가 동일하였다. 예상대로, 식물 정제된 분획은 aad-1 단백질 이외에 소량의 비-면역반응성 불순물을 함유하였다. 동시-정제된 단백질은 컬럼 매트릭스와의 약한 상호작용 또는 거친 용출 조건 하에서 컬럼으로부터 모노클로날 항체의 삼출에 의해 컬럼 상에 유지될 가능성이 있었다. 다른 연구자들은 또한 시안-브로마이드 활성화된 세파로스 4B 면역흡착제에 대한 펩티드 및 아미노산의 비-특이적 흡착을 보고하였다 ([Kennedy and Barnes, 1983]; [Holroyde et al., 1976]; [Podlaski and Stern, 2008]).
슈도모나스 (Pseudomonas)-유래 aad-1 단백질은 폴리클로날 항체 웨스턴 블롯 분석에 의해 예상된 크기의 양성 신호를 보여주었다. 또한, 이것은 DAS-40278-9 트랜스제닉 옥수수 줄기 추출물에서도 관찰되었다. aad-1 웨스턴 블롯 분석에서, 어떠한 면역반응성 단백질도 대조군 XHH13 추출물에서 관찰되지 않았고, 어떠한 다른 크기 단백질 (응집체 또는 분해 생성물)도 트랜스제닉 샘플에서 관찰되지 않았다.
실시예 5.4. 번역후 글리코실화의 검출
면역친화도 크로마토그래피-정제된, 옥수수-유래된 aad-1 단백질 (분획 #3)을 5x 램리 버퍼와 4:1로 혼합하였다. 미생물-유래된 aad-1, 대두 트립신 억제제, 소 혈청 알부민 및 양고추냉이 페록시다제를 Milli-Q 물로 식물-유래된 aad-1의 근접한 농도로 희석하고, 바이오-라드 램리 버퍼와 혼합하였다. 이어서, 단백질을 ~95℃에서 5분 동안 가열하고, 20000xg에서 2분 동안 원심분리하여 청정화된 상등액을 얻었다. 생성되는 상등액을 직접 바이오-라드 크라이테리온 겔에 적용하고, 170 V에서 ~60분 동안 이동시킨 것을 제외하고는 본질적으로 상기한 바와 같이 XT MES 이동 버퍼 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 겔을 1/2로 자르고, 한 조각을 제조자의 프로토콜에 따라 총 단백질에 대해 겔코드 블루 염색으로 염색하였다. 염색이 완료된 후, 겔의 영구적인 가시적인 기록을 얻기 위해 겔을 분자 동역학 (Molecular Dynamics) 농도계로 스캐닝하였다. 겔의 다른 절반을 당단백질을 시각화하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 겔코드 당단백질 염색 키트 (피어스 케미컬, 미국 일리노이주 록포드)로 염색하였다. 당단백질 (검출 한계가 밴드당 0.625 ng으로 매우 낮음)은 연분홍색 배경 상에 심홍색 밴드로서 시각화되었다. 당단백질 염색이 완료된 후, 겔을 겔의 영구적인 가시적인 기록을 얻기 위해 휴렛 패카드 디지털 스캐너로 스캐닝하였다. 글리코실화 염색 영상을 캡쳐한 후, 비-글리코실화된 단백질의 존재를 확인하기 위해 겔을 겔코드 블루로 염색하였다. 결과는 옥수수- 및 미생물-유래된 aad-1 단백질 둘 모두가 검출가능한 공유연결된 탄수화물을 갖지 않음을 보여주었다. 또한, 상기 결과는 펩티드 질량 핑거프린팅 (mass fingerprinting)에 의해 확인되었다.
실시예 5.5. 옥수수- 및 슈도모나스- 유래된 aad -1의 질량 분광 펩티드 질량 핑거프린팅 및 서열결정
슈도모나스- 및 옥수수-유래된 aad-1의 질량 분광 분석을 수행하였다. 트랜스제닉 옥수수 줄기 (이벤트 DAS-40278-9)로부터 유래된 aad-1 단백질을 트립신에 의한 용액내 (in-solution) 소화에 적용한 후, MALDI-TOF MS 및 ESI-LC/MS를 수행하였다. 검출된 펩티드의 질량은 옥수수-유래된 aad-1 단백질의 서열 내의 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 기초로 하여 추정된 것과 비교하였다. 이론적인 절단은 프로테오메트릭스 (Proteometrics LLC)의 단백질 분석 Worksheet (PAWS) 프리웨어를 사용하여 가상 환경에서 (in silico) 생성되었다. aad-1 단백질은 일단 변성되면 프로테아제에 의해 쉽게 소화되고, 많은 펩티드 피크를 생성할 것이다.
트랜스제닉-옥수수-유래된 aad-1 단백질 (이벤트 DAS-40278-9)의 트립신 소화에서, 검출된 펩티드 단편은 단지 단백질의 C-말단부의 하나의 작은 트립신 분해 단편인 F248 내지 R253 및 하나의 짧은 (2개의 아미노산) 펩티드 단편이 결여된 거의 전체의 단백질 서열을 포함하였다. 이 분석을 통해, 옥수수-유래된 단백질 아미노산 서열이 미생물-유래된 aad-1 단백질의 서열과 일치함이 확인되었다. 이들 분석 결과는 옥수수-유래된 aad-1 단백질의 아미노산 서열이 피. 플루오레센스-발현 단백질과 동등함을 나타낸다.
실시예 5.5.1. 트립신 분해 펩티드 단편 서열결정
펩티드 질량 핑거프린팅에 추가로, 옥수수-유래된 aad-1 단백질 (옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터 정제된 면역친화도)의 N- 및 C-말단의 아미노산 잔기의 서열을 결정하고, 미생물-유래된 단백질의 서열과 비교하였다. 미생물- 및 옥수수-유래된 단백질의 처음 11개의 잔기에 대한 단백질 서열을 연속 질량 분광기에 의해 얻었다 (표 8). 두 단백질에 대한 아미노산 서열은 A' H A A L S P L S Q R" (서열 30)이었고, 이것은 N-말단 메티오닌이 아미노펩티다제에 의해 제거되었음을 보여준다 (표 8). N-말단 aad-1 단백질 서열은 M' A H A A L S P L S Q R'2 (서열 31)로 예상되었다. 이들 결과는 옥수수 및 피. 플루오레센스에서 번역 동안 또는 번역 후에, N-말단 메티오닌이 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)에 의해 절단됨을 시사한다. MAP는 단백질 상의 제2 잔기가 작을 때, 예를 들어 Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro, 및 Val일 때 메티오닐 잔기를 신속하게 절단한다 (Walsh, 2006). 메티오닌 제거 이외에, aad-1 단백질의 N-말단 펩티드의 작은 부분은 N-말단 메티오닌이 절단된 후에 아세틸화되는 것으로 밝혀졌다 (표 8). 상기 결과는 약 80-90%의 N-말단 잔기가 변형되기 때문에 진핵생물 (식물) 발현 단백질에서 자주 얻어진다 (Polevoda and Sherman, 2003). 또한, N-말단에 세린 및 알라닌을 갖는 단백질이 가장 빈번하게 아세틸화되는 것으로 밝혀졌다 (Polevoda and Sherman, 2002). 2개의 동시번역 과정, 즉 N-말단 메티오닌 잔기의 절단 및 N-말단 아세틸화는 가장 흔한 변형이고, 대부분 (~85%)의 진핵생물 단백질에서 발생한다 (Polevoda and Sherman, 2002). 그러나, N-말단 아세틸화와 연관된 생물학적 유의성을 보이는 예는 드물다 (Polevoda and Sherman, 2000).
Figure 112012021282282-pct00013
N-아세틸화에 추가로, 옥수수-유래된 aad-1 단백질의 정제 동안 나타난 약한 N-말단 절단이 또한 존재하였다 (표 8). 이들 "거친-말단"은 옥수수-유래된 단백질로부터 아미노산 A2, H3 및 A4 (상이한 형태 및 양의)의 상실을 유발하였다. 상기 절단은 조야한 잎 추출물의 웨스턴 블롯 프로브가 미생물-유래된 aad-1 단백질과 동일한 MW에 분명한 단일 밴드를 함유하기 때문에 aad-1 단백질의 정제 동안 발생하는 것으로 생각된다. 웨스턴 블로팅된 샘플에 대한 추출 버퍼는 세린, 시스테인, 아스파르트산, 및 메탈로프로테아제, 및 아미노펩티다제의 억제에 대한 넓은 특이성을 갖는 프로테아제 억제제의 혼합물을 함유하는 과량의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하였다.
옥수수- 및 미생물-유래된 aad-1 단백질의 C-말단 서열은 상기한 바와 같이 결정하고, 예상된 아미노산 서열과 비교하였다 (표 9). 결과는 측정된 서열이 예상된 서열과 동일하고, 옥수수- 및 미생물-유래된 aad-1 단백질이 모두 동일하고 C-말단에서 변경되지 않았음을 나타내었다.
Figure 112012021282282-pct00014
실시예 6. 이벤트 DAS -40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수 식물주의 재배지 발현, 영양분 조성 분석 및 작물학적 특징
본 연구의 목적은 옥수수 조직 내에서 발견된 AAD-1 단백질의 수준을 결정하기 위한 것이다. 추가로, 동질유전자형 비-형질전환된 옥수수 식물주와 트랜스제닉 옥수수 식물주 DAS-40278-9 (비분사한, 2,4-D를 분사한, 퀴잘로폽을 분사한, 및 2,4-D 및 퀴잘로폽을 분사한) 사이의 동등성을 조사하기 위해 옥수수 풀사료 및 알곡에 대해 조성 분석을 수행하였다. 동질유전자형 비-형질전환된 옥수수 식물주의 작물학적 특성을 또한 DAS-40278-9 옥수수에 비교하였다. 재배지 발현, 조성물, 및 작물학적 시험을 미국 및 캐나다의 주요 옥수수 생산 지역 내에 위치한 6곳의 시험 부위에서 수행하였다. 이들 부위는 다양한 작물학적 실행 및 환경적 조건의 지역을 대표한다. 시험지는 미국 아이오와주, 일리노이주 (2개의 부위), 인디애나주, 네브라스카주 및 캐나다 온타리오주에 위치하였다.
대조군, 비분사된 AAD-1, AAD-1 + 퀴잘로폽, AAD-1 + 2,4-D 및 AAD-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 샘플에 대한 모든 부위 평균 값은 옥수수에 대한 문헌 범위 내의 값이엇따. 비분사된 AAD-1, AAD-1 + 퀴잘로폽, AAD-1 + 2,4-D 또는 AAD-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 및 대조군에서 제한된 수의 유의한 차이가 관찰되었지만, 차이가 작고 결과가 상업적인 옥수수에 대해 발견되는 범위 내이기 때문에 생물학상 유의한 것으로 간주되지 않았다. 조성 결과 그래프는 비분사된 AAD-1, AAD-1 + 퀴잘로폽, AAD-1 + 2,4-D 또는 AAD-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 및 대조군 옥수수 식물주 사이에 임의의 생물학상 유의한 처리와 관련된 조성 차이를 나타내지 않는다. 결론적으로, 비분사된 AAD-1, AAD-1 + 퀴잘로폽, AAD-1 + 2,4-D 및 AAD-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 조성 결과를 통해, 통상적인 옥수수 식물주에 대한 AAD-1 (이벤트 DAS 40278-9) 옥수수의 동등성을 확인할 수 있다.
실시예 6.1. 시험된 옥수수 식물주
DAS-40278-9 이벤트를 함유하는 하이브리드 종자 및 시험 물질 식물주와 동일한 유전적 배경의 통상적인 하이브리드 종자이지만 DAS-40278-9 이벤트를 함유하지 않는 대조 식물을 표 10에 나열한다.
Figure 112012021282282-pct00015
상기 기재된 옥수수 식물을 미국 및 캐나다의 주요 옥수수 재배 지역 내의 위치에서 성장시켰다. 6개의 재배 시험지 (미국 아이오와주 리치랜드; 일리노이주 칼릴; 일리노이주 와이오밍; 인디애나주 록빌; 네브라스카주 요크; 및 캐나다 온타리오주 브랜치톤 (IA, IL1, IL2, IN, NE 및 ON으로 언급됨))는 옥수수에 대한 다양한 작물학적 실행 및 환경적 조건의 지역을 대표한다.
시험 및 대조군 옥수수 종자를 각각의 열 내의 종자 간격을 약 10 인치 (25 cm)로 하여 열당 약 24개 종자의 파종률로 식재하였다. 각각의 부위에서, 각각의 처리에 대한 4개의 반복 시험 구획지를 확립하였고, 각각의 구획지는 2-25 ft 열로 구성되었다. 구획지는 각각의 부위에서 특유하게 무작위로 선발하는 무작위 완전 블록 (RCB) 설계로 배열되었다. 각각의 옥수수 구획지에는 유사한 성숙도의 비-트랜스제닉 옥수수 하이브리드의 2개의 열이 인접하였다. 전체 시험 부위는 유사한 상대 성숙도의 비-트랜스제닉 옥수수 하이브리드의 최소 12개의 열 (또는 30 ft)로 둘러싸였다.
적절한 곤충, 잡초, 및 질병 억제 방법을 작물학상 허용되는 작물을 생산하기 위해 적용하였다. 강우량 및 관개와 함께 매달 최대 및 최소 온도를 부위에 대해 평균하였다. 이들 범위는 일반적으로 옥수수 생산에서 존재하는 것이다.
실시예 6.2. 제초제 적용
제초제 처리는 약 20 갤런/에이커 (187 L/ha)의 분사 부피로 적용하였다. 이들 적용은 최대 표지율의 상업적인 적용을 재현하도록 설계되었다. 표 11은 사용된 제초제를 나열한다.
Figure 112012021282282-pct00016
2,4-D (위다르 64)를 시험체 4 및 5에 3회의 표면 살포 적용으로서 적용하였다 (재배 시기 동안 총 3 lb ae/A). 개별적인 적용은 발아전 및 약 V4 및 V8-V8.5 시기에 이루어졌다. 개별적인 표적 적용 속도는 위다르 64에 대해 1.0 lb ae/A, 또는 1120 g ae/ha이었다. 실제 적용 속도는 1096 - 1231 g ae/A이었다.
퀴잘로폽 (어슈어 II)을 시험체 3 및 5에 1회의 표면 살포 적용으로서 적용하였다. 적용 시점은 약 V6 성장 시기이었다. 표적 적용 속도는 어슈어 II에 대해 0.0825 lb ai/A, 또는 92 g ai/ha이었다. 실제 적용 속도는 90.8 - 103 g ai/ha이었다.
실시예 6.3. 작물학적 데이타 수집 및 결과
작물학적 특성을 각각의 위치에서 블록 2, 3, 및 4 내의 모든 시험체에 대해 기록하였다. 표 12는 측정된 다음 특성을 나열한다.
Figure 112012021282282-pct00017
대조군, aad-1 비분사된, aad-1 + 2,4-D, aad-1 + 퀴잘로폽, 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 시험체로부터 수집한 작물학적 데이타의 분석을 수행하였다. 부위 전역 (across-site) 분석에서, 전체 위치 요약 분석에서의 초기 집단 (V1 및 V4), 활력, 최종 집단, 작물 손상, 개화기까지의 시간, 꽃가루 비산까지의 시간, 줄기 쓰러짐, 뿌리 쓰러짐, 질병 발생률, 곤충 손상, 성숙까지의 일수, 식물 높이, 및 꽃가루 변이성 (형태 및 색상) 값에 대한 통계상 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (표 13). 녹색 지속 및 이삭 높이의 경우, 대조군과 aad-1 + 퀴잘로폽 시험에 사이에서 유의한 페어드 (paired) t-검정이 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 잘못 선별될 비율 (FDR) 조정된 p-값이 수반되지 않았다 (표 13).
Figure 112012021282282-pct00018
Figure 112012021282282-pct00019
Figure 112012021282282-pct00020
실시예 6.4. 샘플 수집
발현 및 조성 분석을 위한 샘플을 표 14에 나열한 바와 같이 수집하였다.
Figure 112012021282282-pct00021
실시예 6.5. 옥수수 샘플에서 aad -1 단백질의 결정
옥수수 샘플을 aad-1 단백질의 양에 대해 분석하였다. 추출가능한 가용형 aad-1 단백질을 비콘 어낼리티컬 시스템, 인크. (Beacon Analytical System, Inc., 미국 메인주 포틀랜드)로부터 구입한 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA) 키트를 사용하여 정량한다.
옥수수 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 거친 연마, 동결건조 및 Geno/Grinder (써티프렙 (Certiprep, 미국 뉴저지주 메투첸))를 사용한 미세연마 (필요한 경우에)에 의해 발현 분석을 위해 준비하였다. 추가의 제제가 꽃가루에 대해 필요하지 않았다. 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 세제 Tween-20 (PBST)을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액으로 aad-1 단백질을 옥수수 조직으로부터 추출하였다. 꽃가루에 대해, 단백질을 1 mg/mL의 아스코르브산나트륨을 함유하는 0.5% PBST/BSA 버퍼 및 2% 프로테아제 억제제 칵테일로 추출하였다. 식물 조직 및 꽃가루 추출물을 원심분리하고; 수성 상등액을 모으고, 필요한 경우에 적절한 버퍼로 희석하고, 샌드위치 방식으로 aad-1 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트는 다음 단계를 사용하였다. 희석된 샘플의 분취액 및 비오티닐화된 항-aad-1 모노클로날 항체를 고정시킨 항-aad-1 모노클로날 항체로 코팅된 미량역가 플레이트의 웰에서 인큐베이팅하였다. 이들 항체는 웰 내의 aad-1 단백질에 결합하고, 가용형 항체와 고정시킨 항체 사이에 결합된 aad-1 단백질과 "샌드위치"를 형성한다. 이어서, 결합되지 않은 샘플 및 접합체는 PBST로 세척함으로써 플레이트로부터 제거하였다. 과량의 스트렙타비딘-효소 (알칼리성 포스파타제) 접합체를 인큐베이팅을 위해 웰에 첨가하였다. 인큐베이팅 기간 종료시에, 결합되지 않은 시약은 세척에 의해 플레이트로부터 제거하였다. 후속적인 효소 기질의 첨가는 착색 생성물을 생성하였다. aad-1이 항체 샌드위치에 결합되기 때문에, 발색 수준은 샘플 내의 aad-1의 농도와 관련된다 (즉, 잔기 농도가 낮을수록 보다 적은 발색이 나타난다). 몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices) V-max 또는 스펙트라 맥스 (Spectra Max) 190 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 교정 곡선을 작성하고, 미지 샘플 내의 aad-1 농도를 플레이트 판독기에 적합한 Soft-MAX Pro™ 소프트웨어를 사용하여 다항 회귀 방정식으로부터 계산하였다. 샘플을 이중 웰에서 분석하고, 이중 웰의 평균 농도를 기록하였다.
다양한 옥수수 매트릭스 내의 aad-1 단백질 농도의 요약 (부위에 걸쳐 평균함)을 표 15에 제시한다. aad-1 평균 단백질 농도는 R1기 뿌리 내의 2.87 ng/mg 건조 중량 내지 꽃가루 내의 127 ng/mg의 범위이었다. 비분사된 및 분사된 구획지에 대한 발현 결과는 유사하였다. aad-1 단백질은 인디애나주 부위로부터의 하나의 대조군 뿌리 샘플을 제외하고 임의의 대조군 샘플에서 검출되지 않았다.
Figure 112012021282282-pct00022
실시예 6.6. 조성 분석
옥수수 풀사료 및 알곡의 샘플을 다양한 시험을 사용하여 영양분 함량에 대해 분석하였다. 풀사료에 대해 수행된 분석은 회분, 총 지방, 수분, 단백질, 탄수화물, 조섬유, 산성 세제 불용성 섬유, 중성 세제 불용성 섬유, 칼슘 및 인을 포함하였다. 알곡에 대해 수행된 분석은 일반성분 (회분, 총 지방, 수분, 단백질, 탄수화물, 조섬유, 산성 세제 불용성 섬유), 중성 세제 불용성 섬유 (NDF), 무기질, 아미노산, 지방산, 비타민, 2차 대사산물 및 반-영양성분을 포함하였다. 옥수수 풀사료 및 알곡에 대한 영양분 분석 결과를 문헌에 보고된 값과 비교하였다 ([Watson, 1982 (4)]; [Watson, 1984 (5)]; [ILSI Crop Composition Database, 2006 (6)]; [OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize, 2002 (7)]; 및 [Codex Alimentarius Commission 2001 (8)] 참조).
실시예 6.6.1. 풀사료의 일반성분, 섬유 및 무기질 분석
대조군, 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 시험체로부터의 옥수수 풀사료 샘플에서 단백질, 지방, 회분, 수분, 탄수화물, ADF, NDF, 칼슘 및 인의 분석을 수행하였다. 모든 위치에 대한 결과의 요약을 표 16에 제시한다. 부위 전역 및 개별 부위 분석에서, 모든 일반성분, 섬유 및 무기질 평균 값은 문헌의 범위 내이었다. 대조군과 트랜스제닉 시험체 사이의 부위 전역 분석에서 수분, ADF, NDF, 칼슘 및 인에 대한 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 단백질 및 회분의 경우, 유의한 페어드 t-검정이 비분사된 AAD-1 (단백질), aad-1 + 퀴잘로폽 (단백질), 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 (회분)에 대해 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값이 수반되지 않았다. 지방의 경우, 유의한 페어드 t-검정과 조정된 p-값 둘 모두가 대조군에 비해 aad-1 + 퀴잘로폽에 대해 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과가 관찰되지 않았다. 탄수화물의 경우, 통계상 유의한 전체적인 처리 효과, 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값이 aad-1 + 퀴잘로폽 및 대조군 사이에서 관찰되었다. 또한, 탄수화물에 대해, 비분사된 aad-1 시험체에 대한 유의한 페어드 t-검정이 관찰되었지만, 유의한 FDR 조정된 p-값은 보이지 않았다. 이들 차이는 이들 분석물에 대한 모든 부위 전역 결과가 옥수수에 대해 보고된 문헌 범위 내이고, 대조군과의 차이가 작기 때문에 (<23%), 생물학상 유의한 차이가 아니다.
Figure 112012021282282-pct00023
실시예 6.6.2. 알곡의 일반성분 및 섬유 분석
모든 위치에 걸쳐 옥수수 알곡 내의 일반성분 (단백질, 지방, 회분, 수분, 콜레스테롤 및 탄수화물) 및 섬유 (ADF, NDF 및 총 식이 섬유)에 대한 결과의 요약을 표 17에 제시한다. 일반성분 및 섬유에 대한 모든 결과는 문헌 범위 내에 포함되고, 부위 전역 분석에서 지방, 회분, NDF 및 총 식이 섬유에 대해 대조군과 트랜스제닉 시험체 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 수분에 대해, 유의한 전체적인 처리 효과가 관찰되었지만, 유의한 페어드 t-검정 또는 FDR 조정된 p-값이 수반되지 않았다. ADF에 대해, 유의한 페어드 t-검정이 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽에 대해 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값은 관찰되지 않았다. 단백질 및 탄수화물 모두에서, 유의한 페어-검정, 조정된 p-값 및 전체적인 처리 효과가 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽에 대해 관찰되었다. 이들 차이는 작고 (<12%), 모든 값은 문헌 범위 내에 해당하기 때문에, 차이는 생물학상 유의한 것으로 간주되지 않는다.
Figure 112012021282282-pct00024
실시예 6.6.3 알곡의 무기질 분석
무기질 칼슘, 크롬, 구리, 요오드, 철, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 나트륨, 및 아연에 대한 옥수수 알곡 샘플의 분석을 수행하였다. 모든 위치에 걸친 결과의 요약을 표 18에 제시한다. 모든 결과는 보고된 문헌 범위 내에 포함된다. 부위 전역 분석에서, 칼슘, 구리, 철, 및 칼륨에 대해 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 크롬, 요오드, 셀레늄 및 나트륨에 대한 평균 결과는 방법의 정량 한계 미만이었다. 마그네슘 및 인의 경우, 비분사된 aad-1 및 aad-1 + 퀴잘로폽 시험체에 대해 유의한 페어드 t-검정이 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값이 수반되지 않았다. 망간 및 몰리브덴의 경우, 유의한 페어드 t-검정이 비분사된 aad-1에 대해 관찰되었지만, 유의한 FDR 조정된 p-값 및 전체적인 처리 효과는 관찰되지 않았다. aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 시험체에서, 아연에 대한 유의한 페어드 t-검정이 관찰되었지만, 유의한 FDR 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과는 존재하지 않았다. 추가로, 대조군으로부터의 이들 차이는 작았고 (< 13%), 모든 값은 이용가능한 문헌 범위 내에 포함되었다.
Figure 112012021282282-pct00025
실시예 6.6.4 알곡의 아미노산 분석
옥수수 샘플을 대조군, 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수에서 아미노산 함량에 대해 분석하고, 모든 위치에 대한 및 개별적인 재배지 부위에 의한 결과의 요약을 표 19에 제시한다. 모든 아미노산의 수준은 보고된 문헌 범위 내에 포함되고, 부위 전역 분석에서 유의한 차이는 아르기닌, 라이신, 및 티로신에 대해 관찰되지 않았다. 부위 전역 분석에서 몇몇 아미노산에 대해 유의한 차이가 관찰되었다. 이들 경우에, 대조군의 아미노산 함량은 aad-1 트랜스제닉 식물주보다 더 낮았고, 이것은 aad-1 식물주에 비해 대조군 알곡 내의 전체적으로 보다 낮은 단백질 함량에 관련될 수 있다. 비분사된 aad-1 시험체의 경우, 유의한 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값과 함께 유의한 전체적인 처리 효과가 아르기닌, 글리신, 라이신, 트립토판 및 티로신을 제외한 모든 아미노산에 대해 관찰되었다. aad-1 + 퀴잘로폽 시험체의 경우, 유의한 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값과 함께 유의한 전체적인 처리 효과가 아르기닌, 시스테인, 글리신, 라이신, 트립토판 및 티로신을 제외한 모든 아미노산에 대해 관찰되었다. aad-1 + 2,4-D 시험체의 경우에는, 유의한 페어드 t-검정 (및 유의한 FDR 조정된 p-값)과 함께 유의한 전체적인 처리 효과가 아르기닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 라이신, 티로신 및 발린을 제외한 모든 아미노산에 대해 관찰되었다. aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 시험체에서는, 유의한 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값과 함께 유의한 전체적인 처리 효과가 아르기닌, 글리신, 라이신, 세린, 트립토판 및 티로신을 제외한 모든 아미노산에 대해 관찰되었다. 아미노산에 대해 많은 차이가 관찰되었지만, 차이는 작고 (< 15%), 모든 부위에 걸쳐 관찰되지는 않았고, 모든 평균 값은 보고된 문헌 범위 내에 포함되었다.
Figure 112012021282282-pct00026
Figure 112012021282282-pct00027
실시예 6.6.5. 알곡의 지방산 분석
지방산에 대한 옥수수 알곡 샘플의 분석을 수행하였다. 모든 위치에 걸친 결과의 요약을 표 20에 제시한다. 이들 지방산에 대해 분석된 대조군, 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 알곡 샘플에 대한 모든 결과는 공개된 문헌 범위 내에 포함된다. 카프릴산 (8:0), 카프르산 (10:0), 라우르산 (12:0), 미리스트산 (14:0), 미리스톨레산 (14:1), 펜타데칸산 (15:0), 펜타데센산 (15:1), 헵타데칸 (17:0), 헵타데센산 (17:1), 감마 리놀렌산 (18:3), 에이코사디엔산 (20:2), 에이코사트리엔산 (20:3), 및 아라키돈산 (20:4)에 대한 결과는 방법 정량 한계 (LOQ) 미만이었다. 부위 전역 분석에서, 16:0 팔미트산, 16:1 팔미톨레산, 18:0 스테아르산, 18:2 리놀레산, 18:3 리놀렌산, 및 20:0 아라키드산에 대해 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 18:1 올레산 및 20:1 에이코센산에 대해, 유의한 페어드 t-검정이 비분사된 aad-1 (18:1) 및 aad-1 + 2,4-D (18:1 및 20:1) 시험체에 대해 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값이 수반되지 않았다. 22:0 베헨산의 경우, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽에 대한 유의한 전체적인 처리 효과 및 유의한 페어드 t-검정이 관찰되었지만, 유의한 FDR 조정된 p-값은 존재하지 않았다.
Figure 112012021282282-pct00028
Figure 112012021282282-pct00029
실시예 6.6.6. 알곡의 비타민 분석
대조군, 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 시험체로부터의 옥수수 알곡 샘플 내의 비타민 A, B1, B2, B5, B6, B12, C, D, E, 니아신, 및 엽산의 수준을 결정하였다. 모든 위치에 걸친 결과의 요약을 표 21에 제시한다. 비타민 B12, D 및 E는 사용된 분석 방법에 의해 정량될 수 없었다. 비타민에 대해 보고된 모든 평균 결과는 이용가능한 보고된 문헌 값과 유사하였다. 보고된 문헌 범위가 없는 비타민에 대한 결과 (비타민 B5 및 C)는 얻은 대조군 값과 유사하였다 (대조군과 <22% 차이). 부위 전역 분석에서, 비타민 B1, C 및 니아신을 제외하고 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 비타민 B1에 대한 유의한 페어드 t-검정은 대조군과 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 사이에서 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값은 수반되지 않았다. 비타민 C의 경우, aad-1 + 퀴잘로폽 및 aad-1 + 2,4-D에 대한 유의한 전체적인 처리 효과가 유의한 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값과 함께 관찰되었다. 유사하게, 니아신의 경우, aad-1 + 퀴잘로폽 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽에 대한 유의한 전체적인 처리 효과가 유의한 페어드 t-검정 및 FDR 조정된 p-값과 함께 관찰되었다. 또한, aad-1 + 2,4-D에 대한 유의한 페어드 t-검정이 aad-1 + 2,4-D 시험체에서 니아신에 대해 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값이 수반되지 않았다. 부위에 걸쳐 차이가 관찰되지 않았고 값이 문헌 범위 (이용가능한 경우)에 포함되었기 때문에, 그 차이는 생물학상 유의한 것으로 간주되지 않는다.
Figure 112012021282282-pct00030
실시예 6.6.7. 알곡의 반-영양성분 및 2차 대사산물 분석
대조군, 비분사된 aad-1, aad-1 + 퀴잘로폽, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽 옥수수 시험체로부터의 옥수수 알곡 샘플 내의 2차 대사산물 (쿠마린산, 페룰산, 푸르푸랄 및 이노시톨) 및 반-영양성분 (피트산, 라피노스, 및 트립신 억제제) 수준을 결정하였다. 모든 위치에 걸친 결과의 요약을 표 22 및 23에 제시한다. 부위 전역 분석에서, 모든 값은 문헌 범위 내에 있었다. aad-1 시험체와 대조군 시험체 결과 사이의 유의한 차이가 이노시톨 및 트립신 억제제에 대한 부위 전역 분석에서 관찰되지 않았다. 푸르푸랄 및 라피노스에 대한 결과는 방법의 정량 한계 미만이었다. 유의한 페어드 t-검정이 쿠마린산 (비분사된 aad-1, aad-1 + 2,4-D 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽), 및 페룰산 (aad-1 + 퀴잘로폽 및 aad-1 + 2,4-D + 퀴잘로폽)에 대해 관찰되었다. 이들 차이는 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값을 수반하지 않았고, 대조군과 유사하였다 (< 10% 차이). 유의한 전체적인 처리 효과, 페어드 t-검정, 및 FDR 조정된 p-값이 피트산 (비분사된 aad-1)에 대해 관찰되었다. 모든 결과는 문헌 범위 내에 포함되었고 대조군과 유사하였기 때문에 (<11% 차이), 이들 차이는 생물학상 유의한 것으로 간주되지 않는다.
Figure 112012021282282-pct00031
Figure 112012021282282-pct00032
실시예 7 - 추가의 작물학상 형질
근동질유전자 (near-isoline) 옥수수 식물주에 비교한 옥수수 식물주 40278의 작물학적 특성을 다양한 환경에 걸쳐 평가하였다. 처리는 총 21개의 위치에 걸쳐서 시험된, 4개의 유전적으로 별개의 하이브리드 및 그의 적절한 근동질유전자 대조군 하이브리드를 포함하였다.
4개의 시험 하이브리드는 99일 내지 113일 상대 성숙도의 중기 내지 후기 성숙 하이브리드이었다. 실험 A는 유전적 배경 동계교배 C x BC3S1 전환에서 이벤트 DAS-40278-9를 시험하였다. 상기 하이브리드는 상대 성숙도가 109일이었고, 16개의 위치에서 시험되었다 (표 24). 실험 B는 하이브리드 배경 동계교배 E x BC3S1 전환, 113일 상대 성숙도 하이브리드를 시험하였다. 상기 하이브리드는 실험 A와 약간 상이한 위치 세트를 사용하여 14개의 위치에서 시험되었다 (표 24). 실험 C 및 D는 각각 하이브리드 배경 BC2S1 전환 x 동계교배 D 및 BC2S1 전환 x 동계교배 F를 시험하였다. 이들 하이브리드는 모두 상대 성숙도가 99일이었고, 동일한 10개의 위치에서 시험되었다.
Figure 112012021282282-pct00033
각각의 시험에 대해, 위치당 2개의 반복시험 및 2개의 열 구획지를 사용하는 무작위 완전 블록 설계를 사용하였다. 열 길이는 20 피트이고, 각각의 열에는 열당 34개의 종자를 파종하였다. 표준 영역 작물학적 실행을 시험 관리에 사용하였다.
다음과 같은 8개의 작물학적 특성에 대한 데이타를 수집하고 분석하였다; 식물 높이, 이삭 높이, 줄기 쓰러짐, 뿌리 쓰러짐, 최종 집단, 알곡 수분, 시험 중량, 및 수율. 파라미터 식물 높이 및 이삭 높이는 하이브리드의 외형에 대한 정보를 제공한다. % 줄기 쓰러짐 및 뿌리 쓰러짐이라는 작물학적 특성은 하이브리드의 수확가능성을 결정한다. 최종 집단수는 종자 품질 및 수율에 영향을 주는 계절적 성장 조건을 평가한다. 수확시 알곡 수분 %는 하이브리드의 성숙도를 규정하고, 수율 (수분에 대해 조정된 부셸 (bushel)/에이커) 및 시험 중량 (15.5% 수분으로 조정된 옥수수 부셸의 중량 (파운드))은 하이브리드의 생식능력을 설명한다.
선형 모델을 사용하여 재배지 부위에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 시험체 및 위치는 고정된 효과로서 모델에 포함되었다. 위치 및 무작위 효과로서 시험체에 의한 위치를 포함하는 혼합 모델을 조사하였지만, 시험체에 의한 위치는 분산의 일부만을 설명하고, 그의 분산 성분은 종종 0과 유의하게 상이하지 않았다. 줄기 및 뿌리 쓰러짐에 대해, 분산을 안정화하기 위해 로그 변환을 사용하였지만, 평균 및 범위는 본래의 척도로 보고한다. 유의한 차이는 95% 신뢰 수준에서 표시된다. 전체적인 처리 효과의 유의성은 t-검정을 사용하여 추정되었다.
이들 작물학적 특성 결정 시험의 결과는 표 2에서 볼 수 있다. 이삭 높이, 줄기 쓰러짐, 뿌리 쓰러짐, 알곡 수분, 시험 중량, 및 수율의 파라미터에 대해, 동질유전자 대조군에 비해 임의의 4개의 40278 하이브리드에서 통계상 유의한 차이는 발견되지 않았다 (p<0.05). 최종 집단수 및 식물 높이는 각각 실험 A 및 B에서 통계상 상이하였지만, 시험된 다른 40278 하이브리드에 비해 유사한 차이가 관찰되지 않았다. 관찰된 몇몇의 변화는 DAS-40278-9 이벤트의 엘리트 동계교배 식물주 내로의 역교배로부터 유지되는 유전적 변이성의 낮은 수준 때문에 발생할 수 있다. 측정된 파라미터에 대한 값의 전체 범위는 모두 전통적인 옥수수 하이브리드에 대해 얻은 값의 범위 내에 포함되고, 잡초 증가라는 결론에 이르지 않을 것이다. 요약하면, 작물학적 특성 결정 데이타는 40278 옥수수는 통상적인 옥수수에 대해 생물학상 동등함을 나타낸다.
Figure 112012021282282-pct00034
Figure 112012021282282-pct00035
실시예 8 - 표적화된 통합을 위한 옥수수 이벤트 DAS -40278-9 삽입 부위의 용도
재배지 조건 하에서 몇 세대에 걸친 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 도입유전자의 일관된 작물의 성과는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 삽입 부위 주위의 이들 확인된 영역이 관심있는 다른 트랜스제닉 유전자의 표적화된 통합을 위한 우수한 게놈 위치를 제공함을 시사한다. 상기 표적화된 통합은 소위 "위치 효과"를 갖는 문제 및 숙주 내로 도입유전자의 통합시에 게놈에서 돌연변이를 생성할 위험을 극복한다. 상기 표적화된 통합의 추가의 잇점은 숙주 게놈 내의 중요한 로커스 내로의 도입유전자의 우연한 삽입에 의해 발생하는 이상을 또한 보이지 않으면서 목적하는 수준의 도입유전자 발현을 보이는 트랜스제닉 식물을 얻기 전에 스크리닝되고 시험되어야 하는 매우 많은 형질전환 이벤트의 감소를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 표적화된 통합은 두 유전자를 갖는 엘리트 식물주의 육종을 보다 효율적으로 만드는 도입유전자 집적을 가능하게 한다.
개시된 교시내용을 이용하여, 당업자는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내의 것과 동일한 염색체 2 상의 삽입 부위로 또는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 내의 삽입 부위에 매우 근접한 부위로 관심있는 폴리핵산을 표적화할 수 있다. 하나의 그러한 방법은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 WO2008/021207에 개시되어 있다.
간단히 설명하면, 삽입 부위의 5' 측면에 위치하는 20 Kb 이하의 게놈 서열 및 삽입 부위의 3' 측면에 위치하는 20 Kb 이하의 게놈 서열 (그의 부분은 서열 29에 관하여 확인된다)은 상동성 재조합을 통해 염색체 2 상의 게놈 위치 내로 삽입되는 것이 의도되는 관심있는 유전자 또는 유전자들의 측면에 위치하기 위해 사용된다. 관심있는 유전자 또는 유전자들은 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 삽입 부위에 정확히 위치할 수 있거나 또는 식물에 대한 유해한 효과를 주지 않으면서 일관된 수준의 도입유전자 발현을 부여하기 위해 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 삽입 부위 주위의 20 Kb 영역 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 관심있는 유전자 또는 유전자들 및 측면 서열을 함유하는 DNA 벡터는 아그로박테리움-매개 형질전환을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 몇몇 방법 중의 하나를 통해 식물 세포 내로 전달될 수 있다. 공여자 DNA 벡터의 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 표적 부위 내로의 삽입은 재조합 향상 유전자의 동시발현 또는 상향조절 또는 내인성 재조합 억제 유전자의 하향조절을 포함하고 이로 제한되지 않는 몇몇 방법 중의 하나에 의해 보다 향상될 수 있다. 또한, 게놈 내의 특이적 서열의 이중 가닥 절단은 상동성 재조합 빈도를 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 따라서 옥수수 이벤트 DAS-40278-9 삽입 부위 및 그의 측면에 위치하는 영역 내로의 삽입은 이들 서열을 절단하기 위한 천연 또는 설계된 서열 특이적 엔도뉴클레아제의 발현에 의해 향상될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본원에 제공된 교시내용을 사용하여, 임의의 이종성 핵산은 실시예 4에서 논의된 5' 분자 마커와 실시예 4에서 논의된 3' 분자 마커 사이에 위치하는 표적 부위에서, 바람직하게는 서열 29, 및/또는 본원에서 논의되는 그의 영역 내에서 옥수수 염색체 2 상에 삽입될 수 있다.
실시예 9 - 옥수수 이벤트 DAS -40278-9로부터 pat 유전자 발현 카세트의 절제
선택가능 마커 유전자 발현 카세트의 제거는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 게놈 로커스 내로의 표적화된 삽입을 위해 유용하다. 옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터 pat 선택가능 마커의 제거는 옥수수의 후속 세대에서 염색체 4 내로의 폴리핵산의 표적화된 통합에서 pat 선택가능 마커의 재-사용을 허용한다.
개시된 교시내용을 이용하여, 당업자는 옥수수 이벤트 DAS-40278-9로부터 관심있는 폴리핵산을 절제할 수 있다. 하나의 그러한 방법은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 61/297,628에 개시되어 있다.
간단히 설명하면, 유전자 발현 카세트의 측면에 위치하는 특이적인 DNA 서열을 인식하고, 결합하고 절단하는 서열 특이적 엔도뉴클레아제, 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제가 설계된다. 아연 핑거 뉴클레아제는 트랜스제닉 아연 핑거 뉴클레아제 발현 카세트를 함유하는 모 식물을 옥수수 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 제2 모 식물과 교배함으로써 식물 세포 내로 전달된다. 생성되는 자손체는 성숙 상태로 성장되고, 글루포시네이트를 함유하는 제초제를 잎에 바름으로써 pat 발현 카세트의 상실에 대해 분석된다. 제초제에 저항성이 아닌 자손체 식물은 분자 수준에서 확인하고, 자가수정시켰다. pat 발현 카세트의 절제 및 제거는 자가수정으로부터 얻은 자손체에서 분자 수준에서 확인된다. 본원에서 제시되는 교시내용을 사용하여, 임의의 이종성 핵산은 실시예 4에서 논의된 5' 분자 마커와 3' 분자 마커 사이에 위치하는 표적 부위에서, 바람직하게는 서열 29, 및/또는 그의 표시된 영역 내에서 옥수수 염색체 2로부터 절제될 수 있다.
실시예 10 - 취성절단 ( brittlesnap )에 대한 저항성
취성절단은 대체로 빠른 성장 기간 동안 성장 조절제 제초제의 적용 후 심한 바람에 의한 옥수수 줄기의 파괴를 나타낸다. 심한 바람으로 인한 손상을 모의시험하기 위해 옥수수를 물리적으로 밀도록 막대를 사용하는 기계적 "푸시 (push)" 시험을 이벤트 DAS-40278-9 함유 하이브리드 옥수수 및 이벤트 DAS-40278-9 비함유 대조 식물에 대해 수행하였다. 4가지의 상이한 지리적 위치에서 처리를 완료하였고, 4회 반복하였다 (3회만 반복한 하나의 시험 제외). 구획지는 8개의 열로 구성되었다 (각각 2개의 하이브리드의 4개의 열, 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 2개의 열 및 이벤트가 없는 2개의 열). 각각의 열의 길이는 20 피트이었다. 옥수수 식물은 V4 발달기로 성장하고, 2,4-D를 함유하는 시판 제초제 (위다르 64, 누팜 인크. (Nufarm Inc., 미국 일리노이주 버 리지))를 1120 g ae/ha, 2240 g ae/ha 및 4480 g ae/ha의 비율로 적용하였다. 제초제 적용 7일 후에, 기계적 푸시 시험을 수행하였다. 취성절단에 대한 기계적 푸시 시험은 바람 손상을 모의시험하기 위해 옥수수의 2개의 열 아래로 4피트 막대를 잡아당기는 것으로 이루어졌다. 막대의 높이 및 이동 속도는 처리 사이의 차이를 제시하기에 충분히 엄격한 시험을 보장하기 위해 비처리 식물에 낮은 수준의 줄기 파괴 (10% 이하)를 제공하도록 설정되었다. 취성절단 처리의 방향성 (directionality)을 기울어진 옥수수에 대해 적용하였다.
2개의 시험 위치는 2,4-D 제초제의 적용 2-3일 후에 심한 바람 및 뇌우를 겪었다. 2일 연속으로, 뇌우가 미국 아이오와주 헉슬리에서 시작되었다. 바람 속도 2 내지 17 m s-1 (고속 33 m s-1)이 재배 구획지의 부위에서 보도되었다. 바람 방향은 변하였다. 제1일에, 뇌우가 미국 미네소타주 레인스보로에서 보고되었다. 고속의 바람이 상기 재배 구획지의 부위에서 보고되었다. 또한, 두 폭풍은 비를 뿌렸다. 비바람이 보고된 취성절단 손상의 원인으로 생각되었다.
기계적 푸시 시험 (및 혹독한 날씨)에 의한 취성절단 손상의 평가는 손상 비율을 가시적으로 평가함으로써 수행하였다. 기계적 취성절단 막대 처리 전에, 식물 기립체를 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수 및 대조군에 대해 계수하였다. 취성절단 막대 처리 수일 후에, 구획 기립체 수를 재평가하였다. 구획지 내의 기울어짐 비율 및 감소된 기립체 비율을 결정하였다 (표 26). 시험으로부터의 데이타는 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수가 미함유 (null) 식물에 비해 2,4-D 적용 후에 감소된 취성절단 경향을 갖는다는 것을 입증하였다.
Figure 112012021282282-pct00036
실시예 11 - 알곡의 단백질 분석
이벤트를 함유하지 않는 대조 식물에 비해 총 단백질 함량이 증가된 알곡이 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수로부터 생산되었다. 비-분사된 및 3개의 상이한 제초제 조합의 제초제-처리를 포함한, 2개의 연속적인 다지역 재배지 시험을 수행하였다. 8개 통계 비교 중 7개에서, DAS-40278-9 이벤트는 유의하게 더 높은 총 단백질 함량을 갖는 알곡을 생산하였다 (표 27). 이 데이타는 개별 아미노산의 분석에 의해 제공된다.
Figure 112012021282282-pct00037
실시예 12 - 추가의 작물학적 시험
근동질유전자 옥수수에 비해 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수의 작물학적 특성을 성장기 동안 다양한 지리적 환경에 걸쳐 다수 재배지 시험으로부터 수집하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이 데이타를 수집하고 작물학적 특성에 대해 분석하였다. 미함유 식물에 비해 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수 식물주에 대한 결과를 표 28에 나열한다. 추가로, 발생의 V3기에 제초제 퀴잘로폽 (280 g ae/ha)을 분사하고 발생의 V6 기에 2,4-D (2,240 g ae/ha)를 분사한 이벤트 DAS-40278-9를 함유하는 하이브리드 옥수수 식물주 및 미함유 식물에 대한 작물학적 특성을 표 29에 기재한다.
Figure 112012021282282-pct00038
Figure 112012021282282-pct00039
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC <120> AAD-1 Event DAS-40278-9, Related Transgenic Corn Lines, and Event-Specific Identification Thereof <130> DAS-P0167 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tgcactgcag gtcgactcta gaggat 26 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gcggtggcca ctattttcag aag 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttgttacggc atatatccaa tagcgg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ccgtggccta ttttcagaag aagttc 26 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 acaaccatat tggctttggc tga 23 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cctgttgtca aaatactcaa ttgtcctt 28 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctccattcag gagacctcgc ttg 23 <210> 8 <211> 23 <212> 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caattaaaaa ttactttgaa gattcaacgt 540 agtgccagtt tggctctagc acatctaacc agaagggcta aggctggctt caacaggaac 600 agccaaatcc gagatcgagc catttgccat ttttgggtag ttagtttaac tttcatatat 660 cttcccatcc ttttttgcct agcctaaatg gctttgatgt tgaagaccat attaatttgc 720 ttcagtggca ctaggacaac catattggct ttggctgacc cgttagagtt agcctaatgg 780 gtggaagggg agggaagggg aggatcgatg gtggcatgag agaggggttg acgatcacga 840 tgatgatgcg agtgaggagg agagggtggc gacgacacag gggagaaagg agagggacgc 900 taggagcgtc aagggcgtgg gggaggggag ggtcggaggg atgaaggatg acctaaatat 960 tattgttgag tgatagaggg ttattcaact atccgacccg tcgattttga tggtatgtta 1020 aatttgtgtg tcatttgttt gatggattta gtaaaggtta tgggtctaga ggtgattttt 1080 gttgggtggg ttttacagag tttaaactag cggattatat agtggtatag aagatatagt 1140 tttattagaa catctccaaa atgtgactcg aaataatacc cccaaaattt aaaatactac 1200 atcattttga taaaaaaggt aaagtagagc actgttggaa cagtttttaa aagttgtgcc 1260 ctatatttta aaatagggta ctgatttaaa atattgttgt gggggataga tatccccggg 1320 tccactagaa ggcgagaagg cctcgcgtgt ggccacgggc 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cacccgtctt caacgatgag 7260 ccaaccatgc aaggggaaga gcctccccag cgtgaggcgc gacgacggag gaatagaagc 7320 cagaacgtgc ggcgacatca cgaggctggg gaacgggatc cggcgcaacc cgtatcccgg 7380 gacgaagctt tagaagtagg aaaaactccc gacgagtggg tacaccgaga aaggcggaac 7440 tctcgccgcc gtgatcgccg acaagcttag gaccgagaac gagagcaagc cgagcaaggt 7500 gcaaggctgc gccgagagaa tgctctcttt gctcggaacc tgtaccccga cttcgctcgt 7560 gcaatgaaca cgccgagtga agtcggaggg gtactggccc agatagctga cggcctcccg 7620 cgaaccctag acacggaagg ctaccggcgg ctgcttactc gagcagttaa tcaccttcta 7680 cccatcacta atcctccaag cgacctacgc catgccatca acagccggcg agacacgcgg 7740 agctccatca acgcttcgcg cgaccgatga cacgaaagtg agatagggaa ccgagaggag 7800 tatgtccgag atcatgccat cctggcatga agtcatgcca cccgagctga gtcggttgcg 7860 gcctcgacca gtgtcccgtt ccagggacga tcaagatgac acacaactgg ctcccctcct 7920 tgggaccgac ctcacgaacg ccgacatgaa gacacgtgcg gagtcttcgc acttactccg 7980 tgtctccggg ccatccagtg gcccctaact tcaaggtctc caacgtcagc aagtatgagc 8040 gcaagcagga cctgggtggc tggttagcca tctacacgat 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Artificial Sequence <220> <223> Primer for Flanking Marker <400> 33 aatctatgtg tgaacagcag c 21

Claims (26)

  1. 서열 29로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물.
  2. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁 번호 PTA-10244로 기탁된 종자에 존재하는,
    서열 29의 잔기 1-1873의 5' 말단 게놈 서열 및 잔기 6690-8557의 3' 말단 게놈 서열 사이에 삽입된 서열 29의 잔기 1874-6689의 삽입체 서열로 구성되는 AAD-1 이벤트 DAS-40278-9를 포함하는 게놈을 포함하는 옥수수 종자.
  3. 서열 29로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 옥수수 종자.
  4. 제2항에 따른 종자를 성장시킴으로써 생산된, 서열 29로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 식물.
  5. 서열 29로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제4항에 따른 옥수수 식물의 자손체 식물.
  6. 서열 29로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1항에 따른 옥수수 식물의 제초제-내성 자손체 식물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 꽃가루, 배주, 꽃, 꼬투리 (boll), 린트 (lint), 새싹, 뿌리, 및 잎으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 서열 29의 뉴클레오티드 서열로 구성된, 제4항에 따른 식물의 일부.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 서열 1-28 및 30-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 서열 29의 잔기 1863 내지 1875, 서열 29의 잔기 6679 내지 6700, 및 그의 보체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 삭제
  15. 옥수수 DNA를 포함하는 샘플 내에서 옥수수 이벤트를 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을 적어도 하나의 제13항에 따른 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  16. 옥수수 DNA를 포함하는 샘플 내에서 옥수수 이벤트를 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을
    a. 서열 29의 핵산 서열의 잔기 1-1873, 서열 29의 핵산 서열의 잔기 6690-8557, 및 그의 보체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 측면 서열에 결합하는 제1 프라이머; 및
    b. 서열 29의 핵산 서열의 잔기 1874-6689 또는 그의 보체를 포함하는 삽입체 서열에 결합하는 제2 프라이머와 접촉시키고;
    상기 샘플을 중합효소 연쇄 반응에 적용하고;
    상기 프라이머 사이에서 생성된 앰플리콘에 대해 분석하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 프라이머가 서열 1-28로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 엄격한 조건 하에 서열 29의 잔기 1863 내지 1875, 서열 29의 잔기 6679 내지 6700, 및 그의 보체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열과 혼성화하고; 상기 방법이 상기 샘플 및 상기 폴리뉴클레오티드를 엄격한 혼성화 조건에 적용하고; 상기 폴리뉴클레오티드의 상기 DNA에 대한 혼성화에 대해 상기 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 따른 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 DNA 검출 키트.
  20. 삭제
  21. 제13항에 규정된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 검출 키트.
  22. 서열 29로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 옥수수 식물을 제2 옥수수 식물과 교배하여 제3 옥수수 식물을 생산하고, 상기 제3 옥수수 식물의 게놈 내의 서열 29의 뉴클레오티드 서열의 존재에 대해 상기 제3 옥수수 식물을 분석하는 것을 포함하는, 옥수수 식물의 육종 방법.
  26. 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 옥수수 식물을 제2 옥수수 식물과 교배하여 제3 옥수수 식물을 생산하고, 상기 제3 옥수수 식물의 게놈 내의 서열 29의 뉴클레오티드 서열의 존재에 대해 상기 제3 옥수수 식물을 분석하는 것을 포함하는, 제초제 내성 형질을 옥수수 식물 내로 유전자 이입하는 방법.
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