CN103827307A - 产自重组产油微生物的定制油 - Google Patents

产自重组产油微生物的定制油 Download PDF

Info

Publication number
CN103827307A
CN103827307A CN201280007593.3A CN201280007593A CN103827307A CN 103827307 A CN103827307 A CN 103827307A CN 201280007593 A CN201280007593 A CN 201280007593A CN 103827307 A CN103827307 A CN 103827307A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acp
acyl
cell
desaturase
fatty acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280007593.3A
Other languages
English (en)
Inventor
S·富兰克林
A·索曼奇
J·维
G·鲁登科
J·莫瑟利
W·莱基特斯基
X·赵
R·巴特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirbyn Biotech Corp
Original Assignee
Solazyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Solazyme Inc filed Critical Solazyme Inc
Priority to CN201910164460.0A priority Critical patent/CN110066836A/zh
Publication of CN103827307A publication Critical patent/CN103827307A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C10L2200/0476—Biodiesel, i.e. defined lower alkyl esters of fatty acids first generation biodiesel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/26—Composting, fermenting or anaerobic digestion fuel components or materials from which fuels are prepared
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/30—Pressing, compressing or compacting
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Liquid Carbonaceous Fuels (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)
  • Solid Fuels And Fuel-Associated Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

在此提供了用于在重组微生物中产生油、燃料、油脂化学品以及其他化合物的方法和组合物，包括含油微生物以及这样的微生物的低成本培养方法。包含编码例如脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、酮脂酰-ACP合成酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酸羟化酶、去饱和酶、脂肪醛脱羧酶、和/或酰基载体蛋白的外源基因的微藻细胞在制造运输燃料（如可再生柴油、生物柴油、以及可再生喷气燃料）、以及油脂化学品（如功能性流体、表面活性剂、肥皂以及润滑剂）中是有用的。

Description

产自重组产油微生物的定制油
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年2月2日提交的美国临时专利申请号61/438,969；2011年4月18日提交的美国临时专利申请号61/476,691；2011年5月10日提交的美国临时专利申请号61/484,458；以及2011年10月18日提交的美国临时专利申请号61/548,616的权益。出于所有目的将这些申请的每一篇通过引用以其全文结合在此。
序列表引用
本申请包括在详细说明的最后所显示的序列表。
发明领域
本发明涉及从微生物制成的油、燃料、以及油脂化学品的生产。具体地说，本披露涉及含油微藻、培养它们用于生产有用的化合物（包括脂质、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇以及链烷）的方法、以及用于在基因上改变它们以提高生产效率以及改变由它们产生的油的类型和组成的方法和试剂。
发明背景
化石燃料是用于有机物质的埋藏的可燃地质沉积物的一般术语，其从腐败的植物和动物形成，这些有机物质已经通过在地壳中暴露于热和压力经过数百万年而转化成原油、煤炭、天然气或重油。化石燃料是有限的不可再生资源。全球经济对能源的增加的需求也对烃的成本施加了日益增长的压力。除了能源之外，许多工业，包括塑料和化学品制造商，严重依赖于作为其生产工艺原料的烃的可获得性。针对目前供应源的节约成本的替代物会有助于缓和对于能源和这些原材料成本的上升的压力。
PCT公开号2008/151149描述了用于培养微藻以生产油的方法和材料，并且具体示例了从微藻原始小球藻所产生的油生产柴油燃料。对于改进的用于生产针对燃料、化学品、食物以及其他用途的油的方法仍然存在着需要，尤其是生产具有较短链长以及较高饱和度并且无色素的油、具有较高产率以及效率的方法。本发明满足了这种需要。
聚氨酯是一种包含氨基甲酸酯（氨基甲酸乙酯）键的化合物。典型地，聚氨酯是一种有机单元聚合物。该聚合物是通过一种包含异氰酸酯部分的第一有机单元（C(O)N-R1-NC(O)）与一种包含羟基基团的第二有机单元（HO-R2-OH）的反应而制备的。聚氨酯可以表示为-[C(O)NH-R1-NHC(O)-O-R2-O]m-，其中下标m是一个数字，表示该在聚合物中包含的单体的数目。R1以及R2可以是相同的或不同的，但典型地是不同的。聚氨酯用于许多不同的应用，包括柔性材料和刚性材料两者。聚氨酯用于鞋、汽车、飞机、套管、垫圈、胶粘剂、地毯、斯潘德克斯弹纤维、电子产品外壳等等。
发明概述
本发明的说明性实施例提供了产生改变的甘油酯谱的产油细胞以及从这些细胞生产的产品。产油细胞的实例包括具有II型脂质生物合成途径的微生物细胞。实施例还以使用这些细胞可获得的天然油为特征。实施例包括表达编码例如脂肪酰基-ACP硫酯酶等蛋白质的外源基因的重组细胞。本发明还提供了从这样的细胞制造脂质和油基产品（包括燃料，例如生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料、食用油以及化学品）的方法。
在一个第一方面，本发明提供了一种具有至少为3%C8:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该脂质谱是至少12%C8:0。在一些实施例中，这种细胞是一种重组细胞。在一些情况下，这种重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C8的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该外源基因编码湿地萼距花酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，该细胞是一种无绿藻细胞。在一些情况下，这种细胞属于微藻属或选自在表1中鉴定的微藻种类。
在一个第二方面，本发明提供了一种具有至少为4%C10:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该脂质谱是至少18%C10:0。在一些情况下，该脂质谱是至少20%C10:0。在一些情况下，该微藻细胞的脂质成分进一步包含C12:0。在一些情况下，C10:0与C12:0的比率是至少3:1。在一些情况下，该微藻细胞的脂质成分进一步包含C14:0。在一些情况下，C10:0与C14:0的比率是至少10:1。在一些实施例中，这种细胞是一种重组细胞。在一些情况下，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C10的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该外源基因编码来自选自下组的种类的脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白，该组由萼距花和美洲榆组成。在一些实施例中，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自选自下组的种类，该组由萼距花和美洲榆组成。在一些情况下，该脂肪酰基-ACP硫酯酶基因选自下组，该组由以下各项组成：来自萼距花和美洲榆的脂肪酰基-ACP硫酯酶基因，其对于链长C10的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。
在一些情况下，这种细胞是一种无绿藻细胞。在一些实施例中，这种细胞属于微藻属或选自在表1中鉴定的微藻种类。
在一个第三方面，本发明提供了一种具有至少为13%C12:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，这种细胞是一种重组细胞。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自选自下组的种类，该组由加州月桂和樟树组成。在一些情况下，该脂肪酰基-ACP硫酯酶基因选自下组，该组由以下各项组成：来自加州月桂和樟树的脂肪酰基-ACP硫酯酶基因，其对于链长C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，这种细胞是一种无绿藻细胞。
在一个第四方面，本发明提供了一种具有至少为10%C14:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该脂质谱是至少35%C14:0。在一些情况下，该微藻细胞的脂质成分进一步包含C12:0。在一些情况下，C14:0与C12:0的比率是至少3:1。在一些情况下，这种细胞是一种重组细胞。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自选自下组的种类，该组由樟树和美洲榆组成。在一些情况下，该脂肪酰基-ACP硫酯酶基因选自下组，该组由以下各项组成：来自樟树和美洲榆的脂肪酰基-ACP硫酯酶基因，其具有针对链长C14的脂肪酰基-ACP底物的水解活性。在一些情况下，这种细胞是一种无绿藻细胞。在一些实施例中，这种细胞属于微藻属或选自在表1中鉴定的微藻种类。
在一个第五方面，本发明提供了一种具有至少为15%C16:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该脂质谱是至少39%C16:0。在一些情况下，该脂质谱是至少67%C16:0。在一些情况下，这种细胞是一种重组细胞。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自一个选自萼距花和美洲榆的种类。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自选自下组的种类，该组由萼距花和美洲榆组成，其对于链长C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，这种细胞是一种无绿藻细胞。在一些实施例中，该微藻细胞进一步包含一种内源去饱和酶基因，其中该内源去饱和酶基因已经突变以编码一种无活性的或比非突变去饱和酶活性低的去饱和酶，或者其中所述内源去饱和酶已经从该微藻细胞基因组中缺失。
在一个第六方面，本发明提供了一种具有至少为60%饱和脂肪酸的脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为85%饱和脂肪酸的脂质谱。在一些情况下，这种细胞是一种重组细胞。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C10-C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，这种细胞是一种无绿藻细胞。
在一个第七方面，本发明提供了一种具有至少为19%C18:0脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该脂质谱是至少27%C18:0。在一些情况下，这种细胞是一种重组细胞。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C18的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白来自一个选自甘蓝型油菜的种类。在一些实施例中，这种重组细胞包含编码来自甘蓝型油菜的脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白对于链长C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。
在一个第八方面，本发明提供了一种包含编码选自下组的脂肪酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源基因的微藻细胞，该组由以下各项组成：萼距花、加州月桂、樟树、湿地萼距花、披针叶萼距花（Cuphea lanceolata）、德国鸢尾（Iris germanica）、肉豆蔻（Myristica fragrans）、山竹（Garcinia mangostana）、油棕（Elaeis guiniensis）、甘蓝型油菜、蓖麻（Ricinus communis）以及美洲榆。
在一个第九方面，本发明提供了一种包含表达构建体的微藻细胞，其中该表达构建体下调一种选自下组的方法的内源基因的表达，该组由以下各项组成：该内源基因已经突变以编码一种无活性的或比非突变基因产物活性低的基因产物，该内源基因已经从该微藻细胞基因组中缺失，以及通过RNA诱导机制。在一些情况下，该方法是RNA诱导机制，如RNAi、反义和/或dsRNA。在一些情况下，该内源基因是一种去饱和酶基因。在一些实施例中，该去饱和酶基因是Δ12脂肪酸去饱和酶基因。在一些情况下，这种细胞是一种无绿藻细胞。
在一个第十方面，本发明提供了一种如任何以上方面所述的微藻细胞，其中该微藻细胞是使用水苏糖、棉子糖或蜜二糖作为碳源而培养的。
在一个第十一方面，本发明提供了一种具有不多于2%18:2脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，本发明提供了一种具有不多于7%18:2的脂质谱的微藻细胞。
在一个第十二方面，本发明提供了一种制造脂质的方法。在一个实施例中，该方法包括(a)培养如以上所讨论的一种微藻细胞直到这种细胞具有按干重计至少20%的脂质；以及(b)从水溶性生物质组分中分离该脂质。
在一个第十三方面，本发明提供了另一种制造脂质的方法。在一个实施例中，该方法包括(a)培养一种含有编码两种不同酰基-ACP硫酯酶的两种不同外源基因的微藻细胞，以及(b)从水溶性生物质组分中分离该脂质。在一些情况下，这些外源基因中的至少一种编码选自下组的脂肪酰基-ACP硫酯酶，该组由在表4中鉴定的硫酯酶组成。
在一个第十四方面，本发明提供了一种制造油基产品的方法。在一个实施例中，该方法包括(a)培养如以上所讨论的一种微藻细胞直到这种细胞具有按干重计至少10%的脂质；(b)从这种微藻细胞中分离该脂质；(c)使该脂质经历至少一种选自下组的化学反应，该组由以下各项组成：皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶水解；催化水解；加压热水水解；催化水解反应，其中该脂质被裂解为甘油和脂肪酸；胺化反应，以产生脂族氮化合物；臭氧分解反应，以产生一元酸和二元酸；甘油三酯裂解反应，选自由酶裂解和压力裂解组成的组；继水解反应之后的缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或与其同时的脱氧反应和/或缩合反应；脱气反应；选自下组的脱氧反应，该组由以下各项组成：氢解反应、氢化、连续的氢化-氢解反应、连续的氢解-氢化反应、以及组合的氢化-氢解反应；继脱氧反应之后的缩合反应；酯化反应；酯交换反应（interestification reaction）；酯交换反应（transesterification reaction）；羟化反应；以及继羟化反应之后的缩合反应；以及(d)任选地将该反应的产物与其他组分分离，由此产生一种油基产品。
在一些情况下，该油基产品选自肥皂或一种燃料产品。在一些实施例中，该油基产品是一种选自下组的燃料产品，该组由以下各项组成：生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料。在一些情况下，该燃料产品是生物柴油，具有以下一种或多种属性：(i)0.025-0.3mcg/g，优选0.05-0.244mcg/g总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g番茄红素；(iii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g β胡萝卜素；(iv)0.025-0.3mcg/g，优选0.045-0.268mcg/g叶绿素A；(v)35-175mcg/g，优选38.3-164mcg/g γ生育酚；(vi)少于0.25%菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β谷固醇；(vii)225-350mcg/g，优选249.6-325.3mcg/g总生育三烯酚；(viii)0.0025-0.05mcg/g，优选0.003-0.039mcg/g叶黄素；或(ix)50-300mcg/g，优选60.8-261.7mcg/g生育酚。在一些情况下，该燃料产品是具有至少20℃、40℃或60℃的T10-T90的可再生柴油。在一些情况下，该燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
在一个第十五方面，本发明提供了一种甘油三酯油，该甘油三酯油包括(a)一种具有至少1%-5%、优选至少3%的C8:0，至少2.5%、优选至少4%的C10:0，至少10%、优选至少13%的C12:0，至少10%的C14:0、和/或至少60%的饱和脂肪酸的脂质谱；以及(b)以下一种或多种属性：(i)0.025-0.3mcg/g，优选0.05-0.244mcg/g总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g番茄红素；(iii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g β胡萝卜素；(iv)0.025-0.3mcg/g，优选0.045-0.268mcg/g叶绿素A；(v)35-175mcg/g，优选38.3-164mcg/g γ生育酚；(vi)少于0.25%菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β谷固醇；(vii)225-350mcg/g，优选249.6-325.3mcg/g总生育三烯酚；(viii)0.0025-0.05mcg/g，优选0.003-0.039mcg/g叶黄素；或(ix)50-300mcg/g，优选60.8-261.7mcg/g生育酚。
在一个第十六方面，本发明提供了一种从微藻分离的甘油三酯油，该甘油三酯油具有至少5:1的C8:C10脂肪酸比率。在一些实施例中，甘油三酯油分离自微藻细胞（例如，无绿藻属的微藻细胞），其中该微藻细胞包含一种外源基因。在一个相关方面，本发明提供了一种从微藻分离的具有至少60%饱和脂肪酸的甘油三酯油。
在另一个相关方面，本发明提供了一种从微藻分离的具有大约2:1的C16:14脂肪酸比率的脂质谱的甘油三酯油。在另一个相关方面，本发明提供了一种由微藻细胞产生的甘油三酯油，其中该微藻细胞包含一种外源基因。在一些情况下，该微藻属于无绿藻属。
在另一个相关方面，本发明提供了一种从微藻分离的甘油三酯油，该甘油三酯油具有大约3:1的C12:14脂肪酸比率的脂质谱。在另一个相关方面，本发明提供了一种由微藻细胞产生的甘油三酯油，其中该微藻细胞包含一种外源基因。在一些情况下，该微藻属于无绿藻属。
在一个第十七方面，本发明提供了一种甘油三酯油，该甘油三酯油包括(a)一种具有少于1%的<C12；在1%-10%之间，优选2%-7%的C14:0；在20%-35%之间，优选23%-30%的C16:0；在5%-20%之间，优选7%-15%的C18:0；在35%-60%之间，优选40%-55%的C18:1；以及在1%-20%之间，优选2%-15%的C18:2脂肪酸的脂质谱；以及(b)以下一种或多种属性：(i)0.025-0.3mcg/g，优选0.05-0.244mcg/g总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g番茄红素；(iii)少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g β胡萝卜素；(iv)0.025-0.3mcg/g，优选0.045-0.268mcg/g叶绿素A；(v)35-175mcg/g，优选38.3-164mcg/g γ生育酚；(vi)少于0.25%菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β谷固醇；(vii)225-350mcg/g，优选249.6-325.3mcg/g总生育三烯酚；(viii)0.0025-0.05mcg/g，优选0.003-0.039mcg/g叶黄素；或(ix)50-300mcg/g，优选60.8-261.7mcg/g生育酚。
在一些情况下，该甘油三酯油是分离自包含一种或多种外源基因的微生物。在一些实施例中，该一种或多种外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，该脂肪酰基-ACP硫酯酶对于链长C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施例中，该微生物进一步包含表达构建体，其中该表达构建体下调一种选自下组的方法的内源基因的表达，该组由以下各项组成：该内源基因已经突变以编码一种无活性的或比非突变基因产物活性低的基因产物，该内源基因已经从该微藻细胞基因组中缺失，以及通过RNA诱导机制。在一些实施例中，该内源基因编码一种去饱和酶。在一些情况下，该去饱和酶是一种硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）或一种脂肪酸去饱和酶（FAD）。
在一个第十八方面，本发明提供了生产具有一种具有低于1%的<C12、在2%-7%之间的C14:0、在23%-30%之间的C16:0、在7%-15%之间的C18:0、在40%-55%之间的C18:1、以及在2%-15%之间的C18:2脂肪酸的脂质谱的甘油三酯油的方法，其中该甘油三酯油分离自包含一种或多种外源基因的微生物。在一些情况下，该甘油三酯油包含一种具有3%-5%C14:0、25%-27%C16:0、10%-15%C18:0；以及40%-45%C18:1的脂质谱。在一些实施例中，该一种或多种外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，该脂肪酰基-ACP硫酯酶对于链长C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。
在一个第十九方面，本发明提供了一种产生蓖麻油酸的微生物细胞。在一些情况下，该微生物细胞是一种微藻细胞。在一些情况下，该微生物细胞和该微藻细胞包含一种编码脂肪酸羟化酶的外源基因。在一些实施例中，该脂肪酸羟化酶是一种油酸12-羟化酶。在一些情况下，该脂肪酸羟化酶来自蓖麻。在一些情况下，该微生物细胞属于无绿藻属，例如像Prototheca moriformis。
在一个第二十方面，本发明提供了一种包含编码α半乳糖苷酶的外源基因的微藻细胞。在一些情况下，该微藻细胞包含编码α半乳糖苷酶的外源基因，其中该α半乳糖苷酶是分泌的。在一些实施例中，该编码α半乳糖苷酶的外源基因来自一个选自下组的属，该组由以下各项组成：酵母菌属、曲霉属以及瓜儿豆属。
在一个第二十一方面，本发明提供了一种产生脂质组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在一种固定碳源的存在下、在异养条件下培养一种微藻细胞，其中该微藻细胞包含一种编码α半乳糖苷酶的外源基因并且该固定碳源选自下组，该组由以下各项组成：棉子糖、水苏糖以及蜜二糖；(b)将该脂质与非脂质组分分离；由此产生一种脂质组合物。在一些情况下，该微藻细胞属于无绿藻属。
在一个第二十二方面，本发明提供了一种包含编码THIC酶的外源基因的微藻细胞。在一些情况下，该THIC酶来自一个选自下组的属，该组由以下各项组成：胶球藻属、拟南芥属、以及集胞藻属。
在另一方面，本发明提供了一种在不存在硫胺素下培养微藻细胞的方法，该方法包括表达一种编码THIC酶的外源基因。在一些情况下，该THIC酶来自一个选自下组的属，该组由以下各项组成：胶球藻属、拟南芥属、以及集胞藻属。
在其他方面，本发明提供了一种如在此所述的微藻细胞，其中所述微藻细胞进一步包含另一个选自下组的外源基因，该组由以下各项组成：蔗糖转化酶、α半乳糖苷酶、以及THIC酶。
本发明的另一个方面提供了一种分离自微生物细胞的羟化油。在一个方面，该羟化油分离自一种微生物细胞，其中该微生物细胞是一种微藻细胞（例如，无绿藻属的微藻细胞）。在一个另外的方面，该羟化油分离自Prototheca moriformis细胞。在一个实施例中，该羟化油是一种羟化甘油三酯。该羟化甘油三酯在化学上可以是与蓖麻油类似或相同的。
本发明的一个另外的方面是羟化脂肪酸。该羟化脂肪酸的一个实施例是蓖麻油酸。
在又另一个方面，该微生物羟化油或羟化脂肪酸被进一步被羟化。当蓖麻油酸被羟化时，提供了一种含有两个羟基基团的脂肪酸。
本发明的又另一个方面提供了一种通过使一种羟化油和/或一种羟化脂肪酸与一种含有异氰酸酯部分的化合物进行反应以形成一种聚氨酯而制备的组合物。
本发明的另一个方面提供了一种具有至少为20%C18:2脂质谱的微藻细胞。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为30%C18:2的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为40%C18:2的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为50%C18:2的脂质谱。
本发明的另一个方面提供了一种制造脂质的方法，该方法包括：(a)在培养基中培养微藻细胞并监测糖浓度；(b)当培养基的糖浓度达到低于大约每升1克时，以大约每升每小时2克至大约每升每小时10克之间的连续速率将一种第一糖溶液添加至培养基，持续大约2至大约24小时；(c)将一种第二糖溶液添加至培养基以维持培养基每升大约15克至大约20克的糖浓度；以及(d)将该脂质与该微藻生物质分离。在一些情况下，该第一糖溶液是以大约每升每小时4克蔗糖至大约每升每小时6克蔗糖的速率添加至培养基。在一些情况下，该第一糖溶液是以大约每升每小时5.25克蔗糖的速率添加至该培养基。在一些情况下，该糖是蔗糖或葡萄糖。
本发明的另一个方面提供了一种具有至少为10%C18:3的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为20%C18:3的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为30%C18:3的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为40%C18:3的脂质谱。在一些情况下，该微藻细胞具有至少为50%C18:3的脂质谱。
本发明的另一个方面提供了一种产生包括亚油酸或亚麻酸的甘油三酯的微生物，其中该微生物包含一种编码β-酮脂酰-ACP合成酶II（KAS II）的重组核酸。在一些情况下，该微生物进一步包含一种编码硬脂酰ACP去饱和酶（SAD）的重组核酸。在一些情况下，该微生物进一步包含一种编码油酸特异性硫酯酶的重组核酸。在一些情况下，该微生物进一步包含一种编码脂肪酸去饱和酶（FAD）的重组核酸。在一些情况下，该微生物进一步包含一种编码甘油酯去饱和酶的重组核酸。
在以上讨论的工程化微生物中，该KAS II酶可以包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178以及SEQ ID NO:179。在一些情况下，该SAD酶可以包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:196、SEQID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、以及SEQ ID NO:201。在一些情况下，该油酸特异性硫酯酶可以包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ IDNO:204、SEQ ID NO:205、以及SEQ ID NO:206。在一些情况下，该FAD酶可以包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184以及SEQ ID NO:185。在一些情况下，该FAD酶是一种Δ12FAD酶，该Δ12FAD酶包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、以及SEQ ID NO:212。在一些情况下，该FAD酶是一种Δ15FAD酶，该Δ15FAD酶包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、以及SEQ ID NO:221。在一些情况下，该甘油酯去饱和酶是一种ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶。
以上讨论的工程化微生物中的任何之一可以进一步包含一种编码蔗糖利用途径酶的重组核酸。在一些情况下，该蔗糖利用途径酶是一种蔗糖转化酶。
在以上讨论的工程化微生物的任何之一中，该微生物可以进一步被工程化以增加亚油酸或亚麻酸相对于其他脂肪酸的比例。
在以上讨论的工程化微生物的任何之一中，该微生物可以进一步被工程化以过表达对C18底物特异或优先的硫酯酶。
在以上讨论的工程化微生物的任何之一中，该微生物可以进一步被工程化以减少对C8-C16底物特异或优先的硫酯酶的表达。
在以上讨论的工程化微生物的任何之一中，该微生物可以是一种微藻细胞。在一些情况下，该微藻细胞属于无绿藻属。在一些情况下，该微藻细胞是Protothecamoriformis细胞。
本发明的另一个方面提供了一种由以上讨论的工程化微生物中的任何之一所产生的油。
本发明的另一个方面提供了通过将一种或多种重组核酸引入这些微生物来产生以上讨论的工程化微生物以生产包含亚油酸或亚麻酸的甘油三酯的方法。
本发明的另一个方面提供了一种用于生产包含三酰甘油酯的天然油或产自该天然油的产品的方法，其中该方法包括(i)培养一种重组微生物细胞，这种细胞包含可操作的重组核酸以(a)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且任选地其中这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因的两个拷贝的表达；或(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(c)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I或β-酮脂酰-ACP合成酶II的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(d)减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；以及(ii)从这种细胞中回收该天然油，并且任选地进一步对该天然油进行加工以生产食物、燃料或化学产品，其中该天然油由于这些重组核酸而具有改变的脂肪酸谱。
在一些情况下，该微生物通过II型脂肪酸生物合成途径来合成脂肪酸。在一些情况下，该微生物是一种微藻。在一些情况下，该微藻是一种专性异养生物。在一些情况下，该微藻是无绿藻属或小球藻属的一个种类。在一些情况下，该微藻是魏氏无绿藻（Prototheca wickerhamii）、雍滞无绿藻（Prototheca stagnora）、Protothecaportoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻（Prototheca zopfii）。在一些情况下，该微藻是凯氏小球藻（Chlorella kessleri）、Chlorella luteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻（Chlorella vulgaris）。在一些情况下，这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。在一些情况下，该培养是异养的。在一些情况下，该脂肪酸去饱和酶是ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶、或Δ12脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。在一些情况下，将这种细胞进行培养以便包含按干细胞重量计在至少50%、至少60%、至少70%、或50%至90%之间的甘油三酯。在一些情况下，该油包含少于500、50、或5ppm的着色分子。在一些情况下，这些重组核酸被稳定地整合。在一些情况下，这些重组核酸被稳定地整合到该微生物的染色体中。在一些情况下，这种细胞进一步包含至少一种选择标记。
在一些情况下，这种细胞包含可操作的重组核酸以通过反义、RNAi、或dsRNA的表达来减少或消除一种酶的表达，这些反义、RNAi、或dsRNA靶向编码该酶的基因的转录本。在一些情况下，由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达的减少或消除是由于用一种或多种编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因对这一种或多种基因的中断或替换。在一些情况下，这种重组细胞进一步包含一种编码油酸12-羟化酶的外源基因，以便合成蓖麻油酸。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由KASII基因编码的β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达，并且表达编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。在一些情况下，这种细胞产生一种具有特征在于具有至少40%、50%、60%、70%、或80%C16脂肪酸的脂肪酸谱的油。在一些情况下，这种细胞产生一种具有特征在于具有至少50%-75%C16:0的脂肪酸谱的油。在一些情况下，这种细胞产生一种具有特征进一步在于具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱的油。在一些情况下，该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因产生一种活性酰基-ACP硫酯酶，该活性酰基-ACP硫酯酶在C8-C16脂肪酰基链的水解中具有比这种细胞的天然酰基-ACP硫酯酶更强的活性。在一些情况下，该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因中断该KASII基因。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I的一种或多种基因编码的酶的表达。
在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于由于这些重组核酸而更短的平均脂肪酸链长的脂肪酸谱。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由至少一种FAD基因编码的脂肪酸去饱和酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因的产物。在一些情况下，核酸是可操作的以减少或消除由脂肪酸去饱和酶基因的多个拷贝编码的脂肪酸去饱和酶的表达。在一些情况下，该硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因被重组进入该脂肪酸去饱和酶基因的编码区之内的一个基因座。在一些情况下，所产生的油具备一种具有升高的油酸的脂肪酸谱。在一些情况下，油酸构成这些脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶II的β-酮脂酰-ACP合成酶II外源基因的产物。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种由于这些重组核酸所致的C18:1脂肪酸升高和C16脂肪酸降低的脂肪酸谱。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以通过RNA干扰来减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达。在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于C18:0脂肪酸增加的脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种具有至少50%、60%、70%、80%、或90%C18:0的脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种具有至少50%-75%C18:0脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征另外地在于一种具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱。在一些情况下，这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的基因的两个拷贝的表达。在一些情况下，这些核酸是可操作的以表达编码活性ω-3脂肪酸去饱和酶和/或ω-6油酸去饱和酶的脂肪酸去饱和酶外源基因的产物。在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于水平提高的亚油酸、亚麻酸、或两者的脂肪酸谱。在一些情况下，该油的脂肪酸谱的特征在于具有至少10%、20%、30%、40%、或50%的亚油酸、亚麻酸、或两者。在一些情况下，该油的进一步的加工包括精炼、漂白、脱臭、复分解、酯交换（transesterification）、氢化、水解、氢化、脱氧、加氢裂解、异构化、羟基化、酯交换（interesterification）、酰胺化、磺化、以及硫化中的一种或多种。在一些情况下，该油被加工以产生食用油、脂肪酸、脂肪醇、润滑剂、肥皂、脂肪酸酯、脂肪酸乙氧基化物、脂肪胺、烷基氯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、磺化油、硫化油、柴油燃料、喷气燃料、汽油、燃料混合原料（fuel blendstoc）、燃料添加剂、润滑添加剂、或涂层。
本发明的另一个方面提供了通过以上讨论的方法而可获得的天然油。
本发明的另一个方面提供了一种从以上讨论的天然油制成的产品。在一些情况下，该产品包括食用油、脂肪酸、脂肪醇、润滑剂、肥皂、脂肪酸酯、脂肪酸乙氧基化物、脂肪胺、烷基氯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、磺化油、硫化油、柴油燃料、喷气燃料、汽油、燃料混合原料、燃料添加剂、化学添加剂、或涂层。
本发明的另一个方面提供了一种重组细胞，这种重组细胞包含可操作的重组核酸以(a)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且任选地其中这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因的两个拷贝的表达；或(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(c)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I或β-酮脂酰-ACP合成酶II的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(d)减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
在一些情况下，该微生物通过II型脂肪酸生物合成途径来合成脂肪酸。在一些情况下，该微生物是一种微藻。在一些情况下，该微藻是一种专性异养生物。在一些情况下，该微藻是无绿藻属或小球藻属的一个种类。在一些情况下，该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。在一些情况下，该微藻是凯氏小球藻、Chlorella luteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。在一些情况下，该细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。在一些情况下，该细胞能够异养生长。在一些情况下，该脂肪酸去饱和酶是ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶、或Δ12脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。在一些情况下，这种细胞能够进行培养以便包含按干细胞重量计在至少50%、至少60%、至少70%、或50%至90%之间的甘油三酯。在一些情况下，这些重组核酸被稳定地整合。在一些情况下，这些重组核酸被稳定地整合到该微生物的染色体中。在一些情况下，这种细胞进一步包含至少一种选择标记。在一些情况下，这种细胞包含可操作的重组核酸以通过反义、RNAi或dsRNA的表达来减少或消除一种酶的表达，这些反义、RNAi或dsRNA靶向编码该酶的基因的转录本。在一些情况下，由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达的减少或消除是由于用一种或多种编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因对这一种或多种基因的中断或替换。
在一些情况下，这种重组细胞进一步包含一种编码油酸12-羟化酶的外源基因，以合成蓖麻油酸。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由KASII基因编码的β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达，并且表达编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。在一些情况下，这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少40%、50%、60%、70%、或80%C16脂肪酸的脂肪酸谱的油。在一些情况下，这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少50%-75%C16:0的脂肪酸谱的油。在一些情况下，这种细胞产生一种具有其特征进一步地在于具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱的油。在一些情况下，该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因产生一种活性酰基-ACP硫酯酶，该活性酰基-ACP硫酯酶在C8-C16脂肪酰基链的水解中具有比该细胞的天然酰基-ACP硫酯酶更强的活性。在一些情况下，该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因中断该KASII基因。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I的一种或多种基因编码的酶的表达。在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于由于这些重组核酸而更短的平均脂肪酸链长的脂肪酸谱。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由至少一种FAD基因编码的脂肪酸去饱和酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因的产物。在一些情况下，这些核酸是可操作的以减少或消除由脂肪酸去饱和酶基因的多个拷贝编码的脂肪酸去饱和酶的表达。在一些情况下，该硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因是被重组进入该脂肪酸去饱和酶基因的编码区之内的一个基因座。
在一些情况下，所产生的油具备一种具有升高的油酸的脂肪酸谱。在一些情况下，油酸构成这些脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶II的β-酮脂酰-ACP合成酶II外源基因的产物。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种由于这些重组核酸所致的C18:1脂肪酸升高和C16脂肪酸降低的脂肪酸谱。在一些情况下，这种重组细胞包含可操作的核酸以通过RNA干扰来减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达。在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于C18:0脂肪酸增加的脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种具有至少50%、60%、70%、80%、或90%C18:0的脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征在于一种具有至少50%-75%C18:0的脂肪酸谱。在一些情况下，所产生的油的特征另外地在于一种具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱。在一些情况下，这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的基因的两个拷贝的表达。在一些情况下，这些核酸是可操作的以表达编码活性ω-3脂肪酸去饱和酶和/或ω-6油酸去饱和酶的脂肪酸去饱和酶外源基因的产物。在一些情况下，所产生的油具有一种其特征在于水平提高的亚油酸、亚麻酸、或两者的脂肪酸谱。在一些情况下，该油的脂肪酸谱的特征在于具有至少10%、20%、30%、40%、或50%的亚油酸、亚麻酸、或两者。
本发明的另一个方面提供了一种从以上讨论的细胞所产生的天然油或含油产品。
本发明的另一方面提供了一种用于生产包含三酰甘油酯（包括蓖麻油酸）的天然油或产自该天然油的产品的方法，该方法包括培养一种重组微生物细胞，这种细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物，以便合成该蓖麻油酸。
在一些情况下，该微生物具有II型脂肪酸生物合成途径。在一些情况下，该微生物是一种微藻。在一些情况下，该微藻是一种专性异养生物。在一些情况下，该微藻是无绿藻属的一个种类。在一些情况下，该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。在一些情况下，该微藻是凯氏小球藻、Chlorella luteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。在一些情况下，这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。在一些情况下，该培养是异养。在一些情况下，这种细胞在缺乏重组核酸的情况下产生至少40%、50%、60%、70%、80%、或90%的油酸，这些重组核酸可操作以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物。在一些情况下，这种细胞进一步包含可操作的重组核酸以增强油酸的产生，从而提高油酸12-羟化酶的底物水平。在一些情况下，这种细胞包含可操作的重组核酸以(a)表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的外源基因的产物并且减少或消除由编码脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达；或(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I的外源基因的产物并且表达编码活性酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
本发明的另一个方面提供了根据以上讨论的任何方法所生产的产品。
本发明的另一个方面提供了一种微生物细胞，这种微生物细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物，以便合成蓖麻油酸。
在一些情况下，该微生物具有II型脂肪酸生物合成途径。在一些情况下，该微生物是一种微藻。在一些情况下，该微藻是一种专性异养生物。在一些情况下，该微藻是无绿藻属的一个种类。在一些情况下，该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。在一些情况下，该微藻是凯氏小球藻、Chlorella luteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。在一些情况下，这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。在一些情况下，该细胞能够异养生长。在一些情况下，细胞在缺乏重组核酸的情况下产生至少40%、50%、60%、70%、80%、或90%的油酸，这些重组核酸可操作以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物。在一些情况下，这种细胞进一步包含可操作的重组核酸以增强油酸的产生，以便提高油酸12-羟化酶的底物水平。在一些情况下，该细胞包含可操作的重组核酸以(a)表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的外源基因的产物并且减少或消除由编码脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达；或(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I的外源基因的产物并且表达编码活性酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
本发明的另一个方面提供了一种包含如以上讨论的油的食品。
本发明的这些以及其他方面与实施例描述于附图（紧随其后是简要说明）、以下对本发明的详细描述中，并且在以下实例中进行了示例。上文讨论和贯穿本申请的任何或所有特征可以在本发明的多种实施例中组合。
附图简要说明
图1显示了产自无绿藻属甘油三酯油的可再生柴油的色谱图。
图2显示了与蓖麻油酸标准品和野生型对照相比较的代表性阳性转基因克隆的GC保留时间。
图3显示了具有或不具有靶向基因破坏的Prototheca moriformis FADc等位基因的PstI限制酶切图谱，如在实例18中所描述。
图4显示了在实例18中所描述的Southern印迹的结果。
发明的详细说明
本发明的说明性实施例的特征是产生改变的甘油酯谱的产油细胞以及从这些细胞生产的产品。产油细胞的实例包括具有II型脂质生物合成途径的微生物细胞。实施例包括重组细胞，这些重组细胞表达一种或多种编码例如脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸去饱和酶、酮脂酰合成酶的蛋白质的外源基因并且任选地具有编码拥有类似活性的蛋白质的内源基因的一种或多种敲低。结果，一些实施例的特征在于之前从未获得的天然油。本发明还提供了从这样的细胞制造脂质和油基产品（包括燃料，例如生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料、食用油以及化学品）的方法。
根据本发明的实施例所生产的油可以除其他应用之外用在运输燃料、油脂化学品、和/或食品以及化妆品工业中。例如，脂质的酯交换可以产生作为生物柴油有用的长链脂肪酸酯。可以调节其他酶促和化学过程以产生脂肪酸、醛、醇、链烷、和烯。在一些应用中，产生了可再生柴油、喷气燃料、或其他烃化合物。本发明还提供了培养微藻的方法，该微藻用于增加生产力以及增加脂质产率，和/或用于更节约成本地生产在此所述的组合物。
本发明的一个实施例提供了一种用于生产包含三酰甘油酯的天然油或用于生产产自该天然油的产品的方法。该天然油可以是一种非植物油或非种子油。该方法包括培养一种重组微生物细胞以生产一种定制油；即，由于在这种细胞中的这些重组核酸的存在而导致具有改变的脂肪酸谱的一种油。然后该天然油可以进一步被加工以生产一种食品、燃料、或化学产品。在这种细胞中的这些重组核酸是可操作的以(a)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的一种或多种基因编码的酶的表达。任选地该细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因的两个拷贝（例如，二倍体生物中的两个等位基因）的表达；或(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(c)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I或β-酮脂酰-ACP合成酶II的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或(d)减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
在编码一种或多种脂肪酸去饱和酶的重组核酸存在于这种细胞中的情况下，该核酸可以编码ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶、或Δ12脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。
在这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除一种酶的表达的情况下，这可以通过反义、RNAi、或dsRNA（这些反义、RNAi或dsRNA靶向编码该酶的基因的转录本）的表达而发生，或者通过其他适合的手段而发生，包括定向突变、完全缺失、或部分缺失。因此，由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达的减少或消除可以是由于用一种或多种编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因对这一种或多种基因的中断或替换。
优选地，这些重组核酸是被稳定地整合到这种细胞中；例如，进入细胞的染色体中，或游离基因中。可以使用一种选择标记来辅助选择具有稳定整合的核酸的细胞，选择标记如在此所述的蔗糖转化酶、抗生素抗性基因、或硫胺素营养缺陷型互补。
优选地，该微生物可以是通过II型脂肪酸生物合成途径来合成脂肪酸的一种微生物。例如，该微生物可以是微藻，但还可以是使用基因工程技术向其引入了二型遗传机制的通常拥有I型脂肪酸生物合成途径的微生物（例如，一种产油酵母）。该微生物可以是异养生物，并且在一个具体实施例中，可以是专性异养生物。在使用微藻的情况下，该微藻可以是无绿藻属或小球藻属的一个种类。说明性的种类包括魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、祖菲无绿藻、凯氏小球藻、Chlorella luteoviridis、原始小球藻、以及普通小球藻。为了能够使用蔗糖原料，例如甘蔗汁以及在此所述的其他原料，这种重组细胞可以包括包含蔗糖转化酶基因的重组核酸以表达活性蔗糖转化酶。蔗糖转化酶可以由该微生物分泌到培养基。
培养可以是异养的；例如在使用固定碳源例如葡萄糖或蔗糖的生物反应器中进行。该培养可以是持续的直到该细胞达到按干细胞重量计的至少50%、至少60%、至少70%、或50%至90%的甘油三酯。这需要使用限制氮的培养，如下文所述。
由这种细胞所产生的油可以从这种细胞中提取。在一个实施例中，该油包含少于500、50、或5ppm的着色分子。任选地，分析该油的脂肪酸谱，例如通过LC-MS。该油可以具有实例19，表60-63中的油的特性中的一种或多种。
在一个具体实施例中，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由KASII基因编码的β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达，并且表达编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。结果，这种细胞可以产生具有一种其特征在于具有至少40%、50%、60%、或70%C16脂肪酸（例如，棕榈酸）的脂肪酸谱的油。因此，该油可以具有朝向较短链长移动的脂肪酸分布。在脂肪酸分布方面的移动的特征可以在于减少的平均脂肪酸长度或该分布的其他统计特征。例如，为了计算平均脂肪酸长度，将构成这些甘油三酯的每一可检测的脂肪酸的百分数乘以该脂肪酸中的碳数目并且将乘积的和除以100。该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因可以产生一种活性酰基-ACP硫酯酶，该酰基-ACP硫酯酶在C8-C16脂肪酰基链的水解中具有比该细胞中的天然酰基-ACP硫酯酶更强的活性。该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因可以中断该KASII基因。以这种方式，该酰基-ACP硫酯酶的插入还可以一步消除β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达。参见实例15和16。
在另一个具体实施例中，这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I的一种或多种基因编码的酶的表达。结果，所产生的油具有一种其特征在于与缺乏这些重组核酸的可比细胞相比更短的脂肪酸链长分布的脂肪酸谱。这可以表示为减少的平均脂肪酸链长。这种重组细胞可以包括可操作的核酸以减少或消除由至少一种FAD基因编码的脂肪酸去饱和酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因的产物。任选地，这些核酸是可操作的以减少或消除由脂肪酸去饱和酶基因的多个拷贝（例如，等位基因）编码的脂肪酸去饱和酶的表达。在一个具体实施例中，该硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因被重组进入该脂肪酸去饱和酶基因的编码区之内的一个基因座。结果，所产生的油可以具有与由缺乏这些核酸的可比细胞所产生的油相比的水平提高的油酸。油酸构成脂肪酸谱中的脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。参见实例10。
在另一个具体实例中，这种重组细胞包含可操作的核酸以表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶II的β-酮脂酰-ACP合成酶II外源基因的产物。结果，所产生的油的特征可以在于一种由于这些重组核酸所致的C18:1脂肪酸升高和C16脂肪酸降低的脂肪酸谱。参见实例13，其中KASII基因的过表达将C18脂肪酸的百分比从未经转化的细胞中的大约68%增加至大约84%。在相关实施例中，该增加大于70%（从75%到85%，或从70%到90%）。
在另一个具体实施例中，这种重组细胞包含可操作的核酸以通过RNA干扰来减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达。结果，所产生的油可以具有一种其特征在于18:0脂肪酸增加的脂肪酸谱。这些18:0脂肪酸可以是该谱中的脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。参见实例12。
在另一个具体实施例中，该细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的基因的两个拷贝（例如，两个等位基因）的表达。参见实例14，其中内源KASI等位基因在无绿藻属中被敲除。结果，观察到由于内源KASI的破坏而式总C14脂肪酸的百分比增加了大约35%至400%并且C16脂肪酸的百分比增加了大约30%至50%。
在另一个具体实施例中，这种细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性ω-3脂肪酸去饱和酶和/或ω-6油酸去饱和酶的脂肪酸去饱和酶外源基因的产物。结果，可以由这种细胞产生水平提高的亚油酸、亚麻酸、或两者，并且其在该细胞脂质的脂肪酸谱中是可检测的。例如，这种细胞可以具有至少10%、20%、30%、40%、或50%的亚油酸、亚麻酸、或两者。例如，可以如在实例11中表达重组Δ15去饱和酶。结果，C18:3脂肪酸（即，亚麻酸）可以增加从大约2倍至17倍，或更多。
在另一个实施例中，培养了重组微生物细胞。这种细胞包括重组核酸（操作这些重组核酸以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物）以便合成蓖麻油酸。这个基因可以存在于任何前述实施例中。参见实例7。12-羟化酶的一个优选底物是油酸。因此，在一个优选实施例中，可以通过在该细胞中包含操作以增加油酸产生的重组核酸而获得蓖麻油酸的更高产率。在没有限制的情况下，该细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的外源基因的产物并且减少或消除由编码脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达；或表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I的外源基因的产物并且表达编码活性酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
按照本发明的任何实施例，该油可以被提取并且进一步通过以下项的一种或多种进行加工：精炼、漂白、脱臭、复分解、酯交换（transesterification）、氢化、水解、氢化、脱氧、加氢裂解、异构化、羟基化、酯交换（interesterification）、酰胺化、磺化、以及硫化。该油可以被加工例如以产生食用油、脂肪酸、脂肪醇、润滑剂、肥皂、脂肪酸酯、脂肪酸乙氧基化物、脂肪胺、烷基氯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、磺化油、或硫化油、柴油、喷气发动机汽油、或混合原料（blendstock）或添加剂、润滑剂、或涂料。
在此提及的任何实施例作为食品或食用油可以是有用的。可以将整个生物结合到食品中。该生物可以是完整的、部分溶解的、大部分溶解的或完全溶解的。用于制备以及在食品中使用产油生物的方法传授于WO2011/150411、WO2010/12093、WO2011130578、以及WO2011/130576中。可替代地，从该生物提取的并且任选地纯化的油可以用作食用油，包括用作预制食品（如涂抹食品、酱汁、甜食以及冰冻甜食）中的食用油成分。在一个具体实施例中，该产油细胞或食用油包含50%-70%C18:0和20%-40%18:1（例如，油酸）。在另一个具体实施例中，这种产油细胞或食用油包含50%-70%C16:0和20%-40%18:1（例如，油酸）。
为了方便读者，将本发明的详细说明分成多个部分。第I部分提供了在此所使用的术语的定义。第II部分提供了在本发明方法中有用的培养条件的说明。第III部分提供了基因工程方法和材料的说明。第IV部分提供了允许蔗糖利用的基因工程的说明。第V部分提供了改变脂质生物合成的基因工程的说明。第VI部分描述了用于制造燃料和化学品的方法。第VII部分披露了本发明的实例和实施例。本发明的详细说明之后为实例，这些实例展示了本发明的各个方面和实施例。
I.定义
除非另有定义，在此所使用的所有技术与科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如在此所使用的，除非另外指明，以下术语具有归属于它们的含义。
“在微藻中有活性”指在微藻中有功能的核酸。例如，已经用来驱动抗生素抗性基因以便对转基因微藻赋予抗生素抗性的启动子在微藻中有活性。
“面积百分比”是指使用其中样品内每种脂肪酸在检测之前转化成脂肪酸甲酯（FAME）的FAME GC/FID检测方法观察到的峰面积。例如，与任何其他脂肪酸如C14:1相比，观察到没有不饱和的14碳原子脂肪酸（C14:0）的独立峰。每种种类FAME的峰面积与其在混合物中的组成百分比组成成正比并且基于样品中存在的所有峰的总和而被计算（即[特定峰下的面积/所有测量峰的总面积]X100）。当提到本发明的油和细胞的脂质谱时，“至少4%C8-C14”表示细胞中或提取的甘油脂组合物中至少4%的总脂肪酸具有包括8、10、12或14个碳原子的链长。
“无菌的”是没有被其他活生物污染的生物培养物。
“生物柴油”是适合用作柴油发动机中的燃料的以生物方式产生的脂肪酸烷基酯。
“生物质”是通过细胞的生长和/或增殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或胞内内容物以及细胞外物质，包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器”是其中培养（任选地以悬浮方式培养）细胞的密闭罩或部分密闭罩。
“纤维素材料”是包含纤维素以及任选地半纤维素的生物材料。像这样它可以被消化为糖，如葡萄糖和木糖，并且任选地可以包含另外的化合物如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料的来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木屑、锯屑和柳枝稷。
“共培养”及其变体如“共培养”和“共发酵”是指在同一个生物反应器中培养两种或更多种类型的细胞。两种或更多种类型的细胞可以两者都是微生物，如微藻，或可以是与一种不同的细胞类型一起培养的微藻细胞。
在此使用的“着色分子”或“产生颜色的杂质”是指将颜色赋予给所提取的油的任何化合物。“着色分子”或“产生颜色的杂质”包括例如叶绿素a、叶绿素b、番茄红素、生育酚、菜油甾醇、生育三烯酚以及类胡萝卜素，如β胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、虾青素。这些分子优选地以不超过500ppm、不超过250ppm、不超过100ppm、不超过75ppm、或不超过25ppm的浓度存在于该微生物生物质或所提取的油中。在其他实施例中，存在于该微生物生物质或所提取的油中的叶绿素的量少于500mg/kg、少于100mg/kg、少于10mg/kg、少于1mg.kg、少于0.5mg/kg、少于0.1mg/kg、少于0.05mg/kg、或少于0.01mg/kg。
“培养”（cultivated）及其变体如“培养”（cultured）和“发酵”是指通过使用选择和/或受控的条件有意地促进一个或多个细胞生长（在细胞大小、细胞内容物、和/或细胞活性方面增加）和/或增殖（增加细胞数）。生长和增殖的组合可以称作“繁殖”。选择和/或受控的条件的实例包括使用确定成分培养基（具有已知特征如pH、离子强度、和碳源）、指定的温度、氧张力、二氧化碳水平、以及在生物反应器中的生长。“培养”不是指微生物在自然界中或以别的方式在没有人类干预下的生长或增殖；例如，最终变成化石以产生地质原油的生物的自然生长不是培养。
“去饱和酶”是指在脂质合成途径中负责将双键（不饱和）引入三酰甘油酯分子的脂肪酸链的酶。实例包括但不限于硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）和脂肪酸去饱和酶（FAD），也称为脂肪酰基去饱和酶。
“表达载体”或“表在构建体”或“质粒”或“重组DNA构建体”是用于将一种核酸引入宿主细胞的载体。该核酸可以是已经通过人类干预（包括通过重组手段或直接化学合成）产生的一种核酸，其带有允许特定核酸的转录和/或翻译的一系列指定核酸元件。该表达载体可以是质粒的一部分、病毒、或核酸片段、或其他适合的载体。典型地，表达载体包含与启动子可操作地连接的待转录核酸。
“外源基因”是指令已经导入到细胞中（例如通过转化/转染）的RNA和/或蛋白质的表达的核酸，并且还被称为“转基因”。包含外源基因的细胞可以被称为重组细胞，可以向其中导入另外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的种类（因此是异源的），或来自相同的种类（因此是同源的）。因此，外源基因可以包括相对于该基因的内源拷贝占据细胞基因组中不同位置或在不同控制之下的同源基因。外源基因可以在细胞中以一个拷贝以上存在。外源基因可以在细胞中作为基因组（核或质粒）中的插入片段或作为游离型分子而维持。
“外源提供的”是指提供到细胞培养物的培养基的分子。
取决于上下文，“脂肪酸”应当表示游离脂肪酸、脂肪酸盐、或甘油脂中的脂肪酰基部分。
“固定碳源”是在环境温度和压力以固体或液体形式在培养基中存在的含碳分子，典型地是有机分子，它可以由其中所培养的微生物利用。因此，二氧化碳不是固定碳源。
如涉及培养条件时，“异养的”是在基本上不存在光下，同时利用或代谢固定碳源的培养。
“匀浆”是已经被物理破坏的生物质。
“氢:碳比”是分子中基于原子对原子的氢原子对碳原子的比率。这个比率可以用来指代烃分子中碳原子和氢原子的数目。例如，具有最高比率的烃是甲烷CH4（4:1）。
“诱导型启动子”是响应于特定刺激介导可操作地连接的基因的转录的启动子。这样的启动子的实例是在改变pH或氮水平的条件下被诱导的启动子序列。
“处于可操作连接”是在两个核酸序列（如控制序列（典型地是启动子）和连接的序列（典型地是编码蛋白质的序列，也称作编码序列））之间的功能性连接。如果一种启动子可以介导外源基因的转录，则该启动子与该基因处于可操作连接。
“脂质修饰酶”指改变脂质的共价结构或以别的方式可以导致细胞中的改变的脂肪酸谱的酶。脂质修饰酶的实例包括脂肪酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、去饱和酶，包括硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）和脂肪酰基去饱和酶（FAD）、以及脂肪醛脱羧酶。
“脂质途径酶”是在脂质代谢（即，脂质合成、修饰或降解）中发挥作用的任何酶和以化学方式修饰脂质的任何蛋白质以及载体蛋白。
“脂质谱”或“甘油脂谱”是指就链长和/或饱和模式而言，细胞或衍生自细胞的油中的脂肪酸的分布。在这个背景下，饱和模式可以包括饱和酸相对于不饱和酸的量度或者细胞的多种脂肪酸中的双键的分布位置的更为详细的分析。
“溶解”（lysis）是破坏生物生物的质膜和任选地细胞壁足以释放至少一些细胞内内容物，这通常是通过损害细胞完整性的机械、化学、病毒或渗透机制。
“溶解（Lysing）”是进行溶解（lysis）的过程。
“微藻”是微生物生物，其含有叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用，或能够进行光合作用的原核微生物生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括在细胞分裂之后不久与姐妹细胞分开的单细胞生物，如衣藻（Chlamydomonas），以及微生物，例如像，团藻（Volvox），它是两种不同细胞类型的简单多细胞光合生物。微藻包括细胞，如小球藻、杜氏藻（Dunaliella）和无绿藻属。微藻还包括展现出细胞-细胞粘附的其他微生物光合生物，如阿格门氏藻（Agmenellum）、鱼腥藻（Anabaena）和桑葚藻（Pyrobotry）。“微藻”还包括专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些甲藻藻类和无绿藻种类。
如在此在脂肪酸的背景下所使用的“中链”是指C10-C16脂肪酸。如在这个背景下所使用的“短链”是指C6-C10脂肪酸，而“长链”是指C17或更长的脂肪酸。这些界限并非旨在精确地限定，除非另外说明。
“天然油”应当表示主要从生物获得的甘油三酯油，其中该油未经历与另外的天然油或合成油掺合或分提以实质上改变该甘油三酯的脂肪酸谱。在此，术语“分提”表示以相对于由生物所产生的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用什么方法完成。天然油包括如从生物获得的油，其中该油已经经历最低限度的不实质性改变其甘油三酯谱的加工，包括精炼、漂白和/或脱胶。天然油还可以是“非酯交换的天然油”，表示该天然油未经历一种其中脂肪酸在其酰基连接中被重分布到甘油的加工并且基本上保持如从生物中回收时的相同构型。
关于两种蛋白质或基因的“天然共表达”表示这些蛋白质或它们的基因在它们从其衍生的组织或生物中天然地共表达，例如，由于编码这两种蛋白质的基因处于共同调节序列的控制之下或它们响应于相同的刺激而表达。
“渗透压休克”是渗透压急剧下降后细胞在溶液中破裂。有时诱导渗透压休克以便使这样的细胞的细胞组分释放到溶液中。
“多糖降解酶”是能够催化任何多糖水解或糖化的任何酶。例如，纤维素酶催化纤维素的水解。
“多糖”或“聚糖”是由糖苷键连接在一起的单糖构成的糖。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。纤维素可以通过酶解聚以产生单糖如木糖和葡萄糖，以及较大的二糖和寡糖。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。如在此所使用的，启动子包括转录起始位点附近必需的核酸序列，如，在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑元件，它们可以距转录起始位点多达几千碱基对而定位。
“重组体”是因导入外源核酸或改变天然核酸而已经被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因而，例如，重组细胞可以表达没有发现于天然（非重组）形式的细胞内部的基因，或以与非重组细胞表达这些基因不同的方式表达天然基因。重组细胞可以但不限于包括编码基因产物或抑制元件（如降低细胞中的活性基因产物的水平的突变、敲除、反义、干扰RNA（RNAi）或dsRNA）的重组核酸。“重组核酸”是最初在体外形成（通常，通过操作核酸，例如，使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶和核酸内切酶）的核酸或另外地处于通常未发现于自然界中的形式。可以产生重组核酸，例如，以便将两个或更多个核酸安排为可操作连接。因此，出于本发明的目的，分离核酸或通过连接通常在自然界中不接合的DNA分子在体外形成的表达载体均被认为是重组体。出于本发明的目的，一旦产生重组核酸并将其导入宿主细胞或生物中，这种核酸可以利用宿主细胞的体内细胞机器（cellular machinery）进行复制；然而一旦以重组的方式产生，虽然这样的核酸随后在细胞内复制，其仍将被认为是重组体。同样，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达重组核酸产生的蛋白质。
“可再生柴油”是从天然油产生的链烷（如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0）的混合物；例如通过脂质的氢化和脱氧。
“糖化”是将生物质（通常为纤维素生物质或木质纤维素生物质）转化成单体糖（如葡萄糖和木糖）的过程。“糖化”或“解聚”的纤维素材料或生物质是指已经通过糖化作用转化成单体糖的纤维素材料或生物质。
“糠醛种类”是2-呋喃甲醛或保留相同基本结构特征的衍生物。
根据在此的实施例（并且不必讨论现有技术），关于用来产生一个的重组株系的株系转化，“稳定的”或“稳定地整合的”应当表示这些重组核酸被该株系的细胞保留至少10代。例如，在重组株系具有一个使培养能够在一种选择压力存在下进行的选择标记的情况下，这些重组核酸在该选择压力不存在下在培养10代之后被保留。
“蔗糖利用基因”是在表达时辅助细胞利用蔗糖作为能源的能力的基因。由蔗糖利用基因编码的蛋白质在此称为“蔗糖利用酶”并且包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、和己糖激酶如葡萄糖激酶和果糖激酶。
II.培养
本发明总体上涉及微生物并且尤其是具有II型脂肪酸生物合成途径的产油微生物（如产生甘油三酯的微藻）的培养。在一个实施例中，这些微生物是专性异养生物。这些微生物可以是基于例如在下文披露的基因工程方法的重组微生物。为了方便读者，将这个部分细分成多个小节。小节1描述了微生物的种类和株系。小节2描述了用于培养的生物反应器。小节3描述了用于培养的培养基。小节4描述了根据本发明的说明性培养方法的油的生产。
1.微生物种类与株系
虽然以下呈现的说明性实施例适用于众多微生物，无绿藻属是用于在脂质生产中使用的优选微生物。重要的是，在此描述的以无绿藻属作为实例的基因工程方法适用于其他微生物（例如，Chlorella sorokiniana、普通小球藻、椭圆小球藻（Chlorellaellipsoidea）、凯氏小球藻、杜氏盐藻（Dunaliella tertiolecta）、强壮团藻（Volvoxcarteri）、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）、极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体（Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex）、绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）、盐生杜氏藻（Dunaliella salina）、胸状盘藻（Goniumpectorale）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、角毛藻属、梭形筒柱藻（Cylindrotheca fusiformis）、前沟藻种类（Amphidinium sp.）、Symbiodiniummicroadriacticum、微拟球藻属（Nannochloropsis）、隐秘小环藻（Cyclotellacryptica）、腐生舟形藻（Navicula saprophila）、或假微型海链藻（Thalassiosirapseudonana））。
从专性异养微藻（如无绿藻属）获得的脂质或油通常可以是低色素的（例如，低至叶绿素以及某些类胡萝卜素的不可检测水平，例如少于500ppm、50ppm或5ppm的着色分子、产生颜色的杂质、或者叶绿素与类胡萝卜素浓度的总计）并且在任何情况下含有比来自其他微藻的脂质少得多的色素。而且，相对于从其他微生物产生脂质，由本发明提供的重组无绿藻细胞可以用来以更高的产量和效率并且以降低的成本产生脂质。用于在本发明的方法中使用的说明性无绿藻株包括另外，这种微藻异养生长并且可以作为魏氏无绿藻（Prototheca wickerhamii）、雍滞无绿藻（Protothecastagnora）（包括UTEX327）、Prototheca portoricensis（Protothecaportoricensis）、Prototheca moriformis（Prototheca moriformis）（包括UTEX株1441、1435）、以及祖菲无绿藻（Prototheca zopfii）而被基因工程化。无绿藻种类是专性异养生物。
除了产生适合的脂质或烃用于生产油、燃料和油脂化学品之外，影响选择用于在本发明的实施例中使用的微生物的考虑事项包括：(1)作为细胞重量百分比的高脂质含量；(2)易于生长；(3)易于进行基因工程；和(4)易于进行生物质加工。在特定的实施例中，野生型或基因工程化的微生物产生了含有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少70%或更多脂质的细胞。在其他特定的实施例中，野生型或基因工程化的微生物产生了含有在40%与80%之间或50%与90%之间的甘油三酯的细胞。优选的生物以异养方式（在不存在光时依赖糖）生长。
可以用来实施本发明的藻类的实例包括，但不限于在表1中列出的以下藻类。
表1.藻类的实例。
Figure BDA00003613748600341
Figure BDA00003613748600351
Figure BDA00003613748600361
Figure BDA00003613748600371
2.生物反应器
出于实施基因操作和生产烃（例如，脂质、脂肪酸、醛、醇和链烷）两者的目的而培养微生物。前一类型的培养按小规模实施并且至少起初在起始微生物可以生长的条件下进行。出于烃生产目的的培养通常按大规模（例如，10,000L、40,000L、100,000L或更大的生物反应器）在生物反应器中实施。典型地按本发明的方法在生物反应器内的液体培养基中培养微藻（包括无绿藻种类）。典型地，该生物反应器不允许光进入。
生物反应器或发酵罐用来培养微藻细胞经过其生理周期的多个阶段。生物反应器为用于异养生长和增殖方法提供许多优点。为了产生生物质，微藻优选在液体（如在悬浮培养物中）中大量发酵。生物反应器（如钢发酵罐）可以容纳十分大的培养体积（本发明的各种实施例中使用40,000升和更大容量的生物反应器）。生物反应器典型地也允许控制培养条件如温度、pH、氧张力、和二氧化碳水平。例如，生物反应器典型地是可配置的，例如，使用与管路连接的端口以允许气体组分（如氧或氮）鼓泡穿过液体培养物。也可以使用生物反应器更轻易地操纵其他培养参数，如培养基的pH、微量元素的一致性和浓度、以及其他培养基组分。
配备多种装置（如旋转叶片和叶轮、摆动机构、搅拌棒、加压气体输注装置）的生物反应器可以用来混合培养物。混合可以是连续或间歇的。例如，在一些实施例中，为繁殖细胞，不维持气体进入和培养基进入的湍流态直到已经实现所希望的所述细胞数目增加。
生物反应器端口可以用来将气体、固体、半固体、和液体导入或提取到含有微藻的生物反应器腔室中。虽然许多生物反应器具有一个以上的端口（例如，一个用于培养基进入，并且另一个用于采样），仅一种物质进入或离开端口是不必要的。例如，一个端口可以用来使培养基流入生物反应器并且稍后用于采样、气体进入、气体离开或其他目的。优选地，采样端口可以反复使用，而不改变或损害培养物的无菌性质。采样端口可以配置有允许样品流停止和开始或提供连续采样手段的阀门或其他装置。生物反应器典型地具有允许接种培养物的至少一个端口，并且这种端口也可以用于其他目的，如培养基或气体进入。
生物反应器端口允许操纵微藻培养物的气体含量。为了举例说明，生物反应器的部分体积可以是气体，而不是液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵送入生物反应器。可以被有益地泵送入生物反应器的气体包括空气、氧、空气/CO2混合物、稀有气体（如氩气）、和其他气体。生物反应器可以被配备为使得用户能够控制气体进入生物反应器的速率。如上文指出，增加进入生物反应器的气体流量可以用来增进培养物的混合。
增加的气体流量也影响培养物的浊度。可以通过安置气体进口低于含水培养基液位实现紊流，从而进入生物反应器的气体鼓泡至培养物表面。一个或多个气体出口允许气体逃逸，从而防止生物反应器中的压力累积。优选地，气体出口通向防止污染微生物进入生物反应器的“单向”阀门。
3.培养基
微藻培养基典型地含有多种组分，如固定氮源、固定碳源、微量元素、任选地用于pH维持的缓冲剂、和磷酸盐（典型地作为磷酸盐提供）。其他组分可以包括盐，如氯化钠，尤其对于海水微藻而言。氮源包括有机和无机氮源，例如包括而不限于分子氮、硝酸盐、硝酸盐、氨（纯氨或盐形式，如(NH4)2SO4和NH4OH）、蛋白质、大豆粕、玉米浆、以及酵母提取物。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰、和钼，例如处于对应的形式：ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O。
根据本发明的方法使用的微生物发现于世界各处的各个地点和环境。由于它们与其他种类的隔离和因此产生的进化趋异，可能难以预测用于最佳生长和产生脂质和/或烃组分的特定生长培养基。在一些情况下，微生物的某些菌株可能在特定生长培养上不能生长，原因在于存在某种抑制性组分或不存在特定微生物菌株需要的某种必需营养需求。
固体和液体生长培养基通常可从广泛来源获得，并且可以找到制备适合于多种微生物株系的特定培养基的说明书，例如在www.utex.org/在线获得，该站点由奥斯汀的德克萨斯大学（1University Station A6700，奥斯汀，德克萨斯，78712-0183），为其藻类培养物保藏中心（UTEX）维护。例如，多种淡水和咸水培养基包括在通过引用结合在此的PCT公开号2008/151149中描述的那些。
在一个具体的实例中，月示培养基（Proteose Medium）适于无菌培养，并且可以通过添加1g月示蛋白胨至1升Bristol培养基来制备1L体积的培养基（pH约6.8）。Bristol培养基包含在水溶液中的2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4、和1.43mM NaCl。对于1.5%琼脂培养基，可以将15g琼脂添加至1L的这种溶液。将溶液盖好并高压灭菌，并且然后在使用之前贮存在冷藏温度。另一个实例是无绿藻分离培养基（PIM），其包含10g/L邻苯二甲酸氢钾（KHP）、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、0.2g/L磷酸二氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L5-氟胞嘧啶，pH在5.0至5.2的范围内（参见Pore,1973,App.Microbiology,26:648-649）。可以通过咨询以上鉴定的URL或通过咨询维持微生物培养物的其他机构（如SAG、CCAP、或CCALA）而容易地确定供本发明的方法使用的其他适合的培养基。SAG是指在哥廷根大学的藻类培养物保藏中心（哥廷根，德国），CCAP是指苏格兰海洋科学协会管理的藻类和原虫培养物保藏中心（苏格兰，英国），并且CCALA是指在植物研究所（Institute of Botany）的藻类实验室培养物保藏中心（
Figure BDA00003613748600401
捷克共和国）。另外，美国专利号5,900,370描述了适合于无绿藻种类异养发酵的培养基制品和条件。
为了生产油，固定碳源的选择是重要的，因为固定碳源的成本必须充分低从而使油生产是经济的。因此，虽然适合的碳源可以包括例如乙酸盐、弗罗里多苷、果糖、半乳糖、葡糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、鼠李糖、棉子糖、水苏糖、蔗糖和/或木糖，包含这些化合物的原料的选择是本发明实施例的方法的一个重要方面。根据本发明的方法有用的适合的原料包括例如黑液、玉米淀粉、解聚的纤维素材料、乳清、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甘蔗、水稻、和小麦。碳源也可以作为混合物如蔗糖和解聚甜菜浆的混合物而被提供。一种或多种碳源可以按一种或多种外源提供的固定碳源的至少大约50μM、至少大约100μM、至少大约500μM、至少大约5mM、至少大约50mM、以及至少大约500mM的浓度而供应。高度浓缩的碳源作为用于发酵的原料是优选的。例如，在一些实施例中，在培养步骤之前向补料分批培养中添加原料的至少300g/L、至少400g/L、至少500g/L、或至少600g/L或更高的葡萄糖水平，其中当细胞生长并且积累脂质时，高度浓缩的固定碳源随时间推移而被供应给细胞。在其他实施例中，在培养之前向补料分批培养中添加至少500g/L、至少600g/L、至少700g/L、至少800g/L蔗糖水平的蔗糖或更多，其中当细胞生长并且积累脂质时，高度浓缩的固定碳源随时间推移而被供应给细胞。高度浓缩的固定碳源（如蔗糖）的非限制性实例包括稠甘蔗汁、甘蔗汁、甜菜汁和糖蜜。为了本发明的目的，特别感兴趣的碳源包括纤维素（处于解聚形式）、甘油、蔗糖、和高粱，下文更详细地讨论每种碳源。
根据本发明，可以使用解聚的纤维素生物质作为原料培养微生物。纤维素生物质（例如，秸秆，如玉米秸秆）是便宜并且可以容易地获得的；然而，已经发现此类原料抑制酵母生长，并且酵母不能利用从纤维素材料中产生的5-碳糖（例如，来自半纤维素的木糖）。相反，至少一些微藻可以在加工的纤维素材料上生长。纤维素材料通常包括大约40%-60%的纤维素、大约20%-40%的半纤维素、以及10%-30%的木质素。
纤维素材料包括来自草本和木质能源作物以及农业作物的残余物，即，植物部分，主要是茎和叶，它们不随主要食物或纤维产物一起从田间去除。实例包括农业废弃物如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维（包括茎、叶、玉米皮、和玉米芯）、麦秸、稻草、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮；林业废弃物如硬木和软木间伐材（thinnings）、和来自木材操作的硬木和软木残余物；木材废弃物如锯木厂废弃物（木屑、锯屑）和纸浆厂废弃物；城市废弃物如市政固体废弃物的纸部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃物如市政碎草（grass clipping）；和木结构废弃物。另外的纤维素材料包括专用的纤维素作物如柳枝稷、杂交杨木、和芒草、纤维甘蔗、和纤维高粱。从这些材料产生的五碳糖包括木糖。
可以处理纤维素材料以增加微生物能够藉此利用包含在这些材料内的糖的效率。本发明的实施例提供了用于在酸爆炸之后处理纤维素材料的方法，从而这些材料适合用于微生物（例如，微藻和产油酵母）的异养培养。如上文讨论，木质纤维素生物质由多种部分组成，这些部分包括纤维素（β-1,4连接的葡萄糖（六碳糖）的结晶聚合物）、半纤维素（更松散结合的聚合物，主要地由木糖（五碳糖）并且较少程度地由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖组成）、木质素（芥子醇及其衍生物组成的复杂芳香族聚合物）、以及果胶（是α-1,4连接的多聚半乳糖醛酸的直链）。因为纤维素和半纤维素的聚合结构，在它们中的糖（例如，单体葡萄糖和木糖）不是呈可以被许多微生物有效利用（代谢）的形式。对于这些微生物，进一步加工纤维素生物质以产生构成聚合物的单体糖对于确保有效利用纤维素材料作为原料（碳源）可能是十分有益的。
细胞或纤维素生物质经受一个称作“爆炸”的过程，其中所述生物质用稀硫酸（或其他酸）在升高的温度和压力下处理。这个过程将生物质调理，使得生物质可以有效地经受纤维素部分和半纤维素部分的酶促水解，变成葡萄糖和木糖单体。所生成的单体糖被称作纤维素糖。纤维素糖可以随后被微生物利用以产生多种代谢物（例如，脂质）。酸爆炸步骤导致半纤维素部分部分水解为组成单糖。这些糖可以随进一步处理从生物质完全释放。在一些实施例中，进一步处理是包括用热水洗涤爆裂材料的水热处理（去除污染物，例如盐）。这个步骤对纤维素乙醇发酵不是必要的，原因在于在这类工艺中使用更加稀释的糖浓度。在其他实施例中，进一步处理是另外的酸处理。在再另外的实施例中，进一步处理是爆裂材料的酶促水解。这些处理也可以按任何组合方式使用。处理的类型可以影响释放的糖的类型（例如，五碳糖与六碳糖）和它们在这种过程中释放的阶段。因此，可以产生不同的糖流，无论它们是主要为五碳还是六碳。因此可以将这些富集的五碳流或六碳流导向到具有不同碳利用能力的特定微生物。
本发明的方法可以涉及发酵至比典型地在乙醇发酵中实现的更高的细胞密度。由于用于异养纤维素油生产的培养物的密度更高，固定碳源（例如，源自纤维素材料的糖流）优选地处于浓缩形式。解聚纤维素材料的葡萄糖水平在培养步骤之前优选至少300g/升、至少400g/升、至少500g/升或至少600g/升，所述培养步骤任选地是在细胞生长并且积累脂质时将这种材料随时间推移而被供应给细胞的补料分批培养。因此，为了在生产木质纤维素油期间产生和维持很高的细胞密度，可以将碳原料以高度浓缩的形式输送至异养培养物中。然而，在进料流中不是产油微生物的底物并且不被其代谢的任何组分将在生物反应器中积累，如果这种组分有毒或抑制所希望的终产物的产生，这可能导致问题。虽然木质素和木质素衍生的副产物、碳水化合物衍生的副产物如糠醛与羟甲基糠醛、以及源自纤维素材料的产生的盐（在爆炸过程和后续中和过程中均存在）、甚至未代谢的戊糖/己糖可能在乙醇发酵中带来问题，在这些物质的浓度在初始原料中高的过程中，这些影响被显著放大。为了实现针对六碳糖（它们可以在本发明所述的木质纤维素油的大规模生产中使用）的300g/L范围（或更高）的糖浓度，这些有毒材料的浓度可以比典型地存在于纤维素生物质的乙醇发酵中的浓度高20倍。
纤维素材料的爆炸加工处理利用显著量的硫酸、热和压力，从而释放碳水化合物副产物，即糠醛和羟甲基糠醛。在半纤维素水解期间通过木糖脱水成糠醛和水，产生糠醛和羟甲基糠醛。在本发明的一些实施例中，将这些副产物（例如，糠醛和羟甲基糠醛）在导入生物反应器之前从糖化的木质纤维素材料中去除。在本发明的某些实施例中，用于去除碳水化合物的副产物的方法是爆裂纤维素材料的水热处理。另外，本发明提供了其中能够耐受化合物如糠醛或羟甲基糠醛的株系被用于木质纤维素油生产的方法。在另一个实施例中，本发明还提供了多种方法和微生物，这些微生物不仅能够耐受发酵培养基中的糠醛，而且实际上能够在木质纤维素油生产期间代谢这些副产物。
爆炸过程还产生显著水平的盐。例如，当爆裂的纤维素生物质以10:1的水:固形物（干重）比率再悬浮时，用于爆炸的典型条件可以导致超过5mS/cm的电导率。在本发明的某些实施例中，稀释的爆裂的生物质经受酶促糖化，并且将所生成的上清液浓缩直至25倍以便用于生物反应器中。浓缩糖流中的盐水平（如由电导率量度的）可以不可接受地高（高达1.5M Na+当量）。当中和用于后续酶促糖化过程的爆裂的材料时，也产生另外的盐。本发明的实施例提供了用于去除这些盐的方法，从而可以将生成的浓缩纤维素糖流用于产生木质纤维素油的异养过程中。在一些实施例中，去除这些盐的方法为用树脂（例如，但不限于，DOWEX Marathon MR3）去离子化。在某些实施例中，用树脂去离子化的步骤在糖浓缩之前或在糖化之前的生物质的pH调节和水热处理或前述步骤的任何组合之前进行；在其他实施例中，在这些加工过程中的一个或多个之后实施该步骤。在其他实施例中，爆炸过程本身被改变，从而避免以不可接受高的水平产生盐。例如，纤维素生物质的硫酸（或其他酸）爆炸过程的替代方案是机械制浆以使纤维素生物质易于接受酶促水解（糖化）。在再另外的实施例中，使用抵抗高水平盐的天然微生物菌株或抵抗高水平盐的基因工程菌株。
如下实施制备爆裂纤维素生物质的方法的优选实施例，其中爆裂纤维素生物质用于利用产油微生物生产异养木质纤维素油。第一个步骤包括将再悬浮的爆裂纤维素生物质的pH调节至5.0-5.3范围，随后将纤维素生物质洗涤3次。可以通过多种手段完成这个洗涤步骤，包括使用脱盐和离子交换树脂、反渗透、水热处理（如上文所述）、或仅在去离子水中反复再悬浮和离心。这个洗涤步骤产生其电导率在100-300μS/cm之间的纤维素流以及显著量的糠醛和羟甲基糠醛的去除。可以保存来自这个洗涤步骤的滗析液以浓缩从半纤维素部分释放的五碳糖。第二个步骤包括酶促糖化洗涤的纤维素生物质。在一个优选实施例中，使用Accellerase(Genencor)。第三个步骤包括通过离心或滗析和漂洗糖化的生物质回收糖。所生成的生物质（固体）是一种能量密集、富含木质素的组分，它可以用作燃料或送到废弃点。收集在离心/滗析和淋洗过程中回收的糖流。第四个步骤包括微过滤以去除染固形物，同时回收渗透物。第五个步骤包括可以使用真空蒸发器完成的浓缩步骤。这个步骤可以任选地包括添加消泡剂如P’2000(Sigma/Fluka)，由于所生成的糖原料的蛋白质含量，有时它是必要的。
在本发明方法的另一个实施例中，碳源是甘油，包括来自生物柴油酯交换的酸化和未酸化的甘油副产物。在一个实施例中，碳源包括甘油和至少一种其他碳源。在一些情况下，将所有甘油和至少一种其他固定碳源在发酵开始时提供给微生物。在一些情况下，将甘油和至少一种其他固定碳源以预定比率同时提供给微生物。在一些情况下，将甘油和至少一种其他固定碳源在发酵过程期间以预定的速率供应给微生物。
一些微藻在甘油存在下经历比葡萄糖存在下更快的细胞裂解（参见PCT公开号2008/151149）。在这些情况下，其中首先将甘油供应给细胞以快速增加细胞密度并且然后供应葡萄糖以积累脂质的两阶段生长过程可以提高产生脂质的效率。当返回该生产工艺时，酯交换法的甘油副产物的使用可以提供显著的经济优势。还提供了其他的进料方法，如甘油和葡萄糖的混合物。供应这类混合物还获得相同的经济益处。另外，本发明提供了向微藻供应替代性糖（如与甘油不同地组合的蔗糖）的方法。
在本发明方法的另一个实施例中，碳源是转化糖。转化糖与蔗糖相比较不易结晶并且因此可以为储存和补料分批发酵提供优点，其中在异养培养微生物（包括微藻）的情况下，对于浓缩碳源存在着需要。在一个实施例中，该碳源是转化糖，在该培养步骤（其任选地是补料分批培养）之前优选处于浓缩形式，优选至少800g/升、至少900g/升、至少1000g/升或至少1100g/升。当细胞生长并且积累脂质时，优选地处于浓缩形式的转化糖随时间推移被供应给细胞。
在本发明方法的另一个实施例中，碳源是蔗糖，包括含有蔗糖的复杂原料，如来自甘蔗加工的稠甘蔗汁。由于用于异养油生产的培养物的密度更高，固定碳源（例如，蔗糖、葡萄糖，等等）在培养步骤之前优选处于浓缩形式，优选至少500g/升、至少600g/升、至少700g/升或至少800g/升的固定碳源，所述培养步骤任选地是在细胞生长并且积累脂质时将这种材料随时间推移供应给细胞的补料分批培养。在一些情况下，碳源是在培养步骤之前处于稠甘蔗汁形式的蔗糖，优选处于浓缩形式，优选至少60%固形物或大约770g/升糖、至少70%固形物或大约925g/升糖、或至少80%固形物或大约1125g/升糖，所述培养步骤任选地是补料分批培养。当细胞生长并且积累脂质时，浓缩的稠甘蔗汁随时间推移被供应给细胞。
在一个实施例中，培养基进一步包括至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，蔗糖利用酶是蔗糖转化酶。蔗糖转化酶是由外源蔗糖转化酶基因编码的可分泌性蔗糖转化酶，所述外源蔗糖转化酶基因由微生物群体表达。该可分泌性蔗糖转化酶可以由这些微生物分泌到培养基中以将培养基中的蔗糖转变为被微生物利用的葡萄糖和果糖。如以下所述，该蔗糖转化酶可以是重组体，由此赋予微生物使用纯的或复杂的蔗糖原料作为固定碳源用于生长或油生产的能力。在一些情况下，如下文第IV部分中更详细地描述，该微生物已经被基因工程化以表达蔗糖利用酶，如蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡萄糖激酶、或果糖激酶。
含有蔗糖的复杂原料包括来自甘蔗加工的废弃糖蜜；这种低价值的甘蔗加工废弃产物的使用在生产烃和其他油中能够提供显著的成本节约。在本发明的方法中有用的另一种含有蔗糖的复杂原料是高粱，包括高粱饴和纯高粱。高粱饴是从甜高粱秆的汁中产生的。其糖谱主要由葡萄糖（右旋糖）、果糖和蔗糖组成。
4.油生产
为了根据本发明的方法生产油，优选的是在黑暗下培养细胞，例如，当使用不允许光冲击培养物的极大（40,000升和更大）发酵罐时，情况就是如此。可以在含有固定碳源的培养基中并且在没有光的情况下使异养生物种类生长和增殖用于产生油；这种生长称作异养生长。
作为实例，将产生脂质的微藻细胞的接种物导入培养基中；在细胞开始增殖之前存在一个延迟期（延滞期）。在延迟期后，增殖速率稳定增加并且进入对数期或指数期。指数期之后转而是增殖减慢，这是由于营养素（如氮）减少、有毒物质增加、以及群体感应机制的缘故。在这种减慢之后，增殖停止，并且细胞进入静止阶段或稳定生长状态，这取决于提供给细胞的特定环境。为了获得富含脂质的生物质，典型地正好在指数期结束之后收获培养物，可以通过允许氮或另一种关键营养素（除了碳之外）变得耗尽，从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成脂质（并且具体地是甘油三酯）而提前终止该阶段。可以操纵培养条件参数来优化总油生产量、所产生的脂质种类的组合、和/或特定油的产生。
.借助于在此披露的细胞的脂质生产可以发生在对数期或其后（包括静止期），在静止期中营养素被供应或仍然是可获得的，以允许在不存在细胞分裂下的脂质产生的继续。
优选地，使用在此所述和/或本领域已知的条件培养的微生物包含按干重计至少大约20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、或80%-90%的甘油三酯。可以调节工艺条件以增加适于特定用途的脂质的产量和/或降低生产成本。例如，在某些实施例中，在限制性浓度的一种或多种营养素（例如像，氮、磷、或硫）存在同时提供过量的固定碳能量如葡萄糖的情况下培养微藻。氮限制倾向于增加微生物脂质产量（每克干细胞重产生的脂质的量的度量），超过其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量。在特定的实施例中，脂质产量的增加是至少大约：10%、50%、100%、200%、或500%。可以将微生物在限制量的营养素存在的情况下培养持续总培养期的一部分或持续整个时期。在特定的实施例中，在总培养期期间，营养素浓度在限制性浓度与非限制性浓度之间循环至少2次。可以通过继续培养持续增加的时间段同时提供过量的碳但是限制氮或没有氮而增加细胞的脂质含量。
在另一个实施例中，通过在脂质途径酶（例如，脂肪酸合成酶的辅酶或辅基）的一种或多种辅因子存在的情况下培养产生脂质的微生物（例如，微藻）而增加脂质产量。通常，辅因子的浓度足以增加微生物脂质（例如，脂肪酸）产量，其超过在辅因子不存在情况下的微生物脂质产量。在一个特定的实施例中，通过在培养物中包含微生物（例如，微藻）将辅因子提供给培养物，其中该微生物含有编码这种辅因子的外源基因。可替代地，可以通过包括含有外源基因的微生物（例如，微藻）将辅因子提供给培养物，其中该外源基因编码参与这种辅因子的合成的蛋白质。在某些实施例中，适合的辅因子包括脂质途径酶所需要的任何维生素（例如像，生物素或泛酸盐）。编码适合用于本发明的方法中的辅因子或参与这类辅因子的合成的基因是熟知的，并且可以使用构建体和如上文描述的那些技术将这些基因导入微生物中（例如，微藻）。
在此所述的生物反应器、培养条件、以及异养生长和增殖方法的具体实例可以按任何适合的方式组合以提高微生物生长和脂质和/或蛋白质产生的效率。
使用本领域内已知的不同的培养方法已经产生了具有按干重计高百分比的油/脂质积累的微藻生物质（参见PCT公开号2008/151149）。通过在此所述的培养方法产生的并且根据本发明使用的微藻生物质包含按干重计至少10%的微藻油。在一些实施例中，微藻生物质包含按干重计至少25%、50%、60%、70%或至少80%的微藻油。在一些实施例中，微藻生物质含有按干重计10%-90%的微藻油、25%-75%的微藻油、40%-75%的微藻油、75%-85%或50%-70%的微藻油。
在此所述的或从用于本发明的方法和组合物中的生物质中提取的生物质微藻油可以包含具有一条或多条不同的脂肪酸酯侧链的甘油脂。甘油脂是由与一个、二个或三个脂肪酸分子酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度并且具有不同的饱和度。如下文第IV部分中更详细地描述的，可以通过培养条件或通过脂质途径工程操纵脂肪酸分子（和微藻油)的长度特征和饱和特征来改变在本发明的实施例的微藻油中的脂肪酸分子的特性或比例。特性与比例的具体修饰包括改变微生物甘油三酯的脂肪酸分布，如改变链长谱、饱和谱、以及脂肪酸的羟化。如此产生的油可以包含天然油。可替代地，可以在单一藻种类中通过将源自两个或更多个微藻种类的生物质或藻油混合，或通过将本发明的藻油与源自其他来源的油（如大豆油、菜籽油、卡诺拉油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废弃植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪、牛脂、猪脂、微藻油、巨藻油、微生物油、正萼距花油、亚麻油、花生油、精选白脂膏、猪油、亚麻荠（Camelina sativa）油、芥子油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏花油、海草（help）油、咖啡油、亚麻油、榛果油、大戟油、南瓜子油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、米糠油、油桐树油、可可油、干椰子肉油、鸦片罂粟油、蓖麻油、山核桃油、霍霍巴油、澳洲坚果油、巴西坚果油、鳄梨油、石油、或任何前述油的馏分）混合而制备微藻油的特定共混物。
也可以通过组合来自至少两个不同微藻种类的生物质或油而操纵油的组成，即，甘油脂的脂肪酸组分的特性和比例。在一些实施例中，至少两个不同的微藻种类具有不同的甘油脂谱。不同的微藻种类可以如在此所述那样一起或分开培养，优选地在异养条件下培养，以便产生对应的油。不同的微藻种类可以在细胞的甘油脂中含有不同百分比的不同脂肪酸组分。
通常，无绿藻株具有极少或不具有链长C8-C14的脂肪酸。例如，Protothecamoriformis（UTEX1435）、Prototheca krugani（UTEX329）、雍滞无绿藻（UTEX1442）以及祖菲无绿藻（UTEX1438）不含有（或含有不可检测量的）C8脂肪酸、0-0.01%的C10脂肪酸、0.03%-2.1%的C12脂肪酸以及1.0%-1.7%的C14脂肪酸。
在一些情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C8或C8-10的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少1.5%、至少3.0%、至少10%、至少12%或更多的链长C8的脂肪酸。在其他情况下，这些含有编码脂肪酰基ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少5.0%、至少10.0%、至少24%、至少29%或更多的链长C10的脂肪酸。在其他情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少5%、至少15%、至少34%、至少50%或更多的链长C12的脂肪酸。在其他情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少2.0%、至少7%、至少10%、至少15%、至少30%、至少43%或更多的链长C14的脂肪酸。在其他情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C16的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少30%、至少40%、至少66%或更多的链长C16的脂肪酸。仍然在其他情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C18并且尤其是C18:0的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少5%、至少10%、至少26%、至少40%或更多的C18:0脂肪酸水平。在任何这些实例中，该微生物可以是一种微藻，如无绿藻属。
在非限制性的实例中，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C8的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的微生物株系具有1%-20%、优选1.8%-13%的链长C8的脂肪酸。在其他非限制性的实例中，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的微生物株系具有1%-40%、优选1.91%-30%的链长C10的脂肪酸。在其他非限制性的实例中，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的微生物株系具有10%-60%、优选13.55%-55%的链长C12的脂肪酸。在其他非限制性的实例中，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的微生物株系具有1%-50%、优选2.59%-43.27%的链长C14的脂肪酸。在其他非限制性的实例中，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于碳链长度变化的脂肪酰基-ACP底物具有广谱特异性）的微生物株系具有高达70%的链长C16的脂肪酸。在其他情况下，含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C16的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的微生物株系具有高达75%、优选高达67.42%的链长C16的脂肪酸。在一些情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C8与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有1%-790%、或大约2%-80%的(C8-C14)脂肪酸。在一些情况下，这些含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶（该硫酯酶对于链长C12与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性）的转基因的微生物株系具有至少50%或60%的(C12-C14)脂肪酸。在一些情况下，由于具有特定链长的所希望的脂肪酸的增加，在恒定的并且高的选择性压力下保持这些转基因微生物株系以保留外源基因是有利的。还可以通过使用同源重组载体以及在此披露的方法将外源基因插入这些细胞的核染色体中来出现高水平的外源基因保留。含有整合到核染色体中的外源基因的重组细胞是本发明的目的。在任何这些实例中，该微生物可以是一种微藻，如无绿藻属。
任选地，该微生物油还可以包含由微藻产生或从培养基中结合到微藻油中的其他组分。这些其他组分可以按不同的量存在，这取决于用于培养微藻的培养条件、微藻的种类、用来从生物质回收微藻油的提取方法和可能影响微藻油组成的其他因素。此类组分的非限制性实例包括以油的0.025-0.3mcg/g，优选从0.05至0.244微克/克存在的类胡萝卜素；以油的0.025-0.3mcg/g，优选从0.045至0.268微克/克存在的叶绿素A；少于油的0.03mcg/g，优选少于0.025微克/克的总叶绿素；以油的35-175mcg/g，优选从38.3-164微克/克存在的γ-生育酚；以油的50-300mcg/g，优选从60.8至261.7微克/克存在的总生育酚；少于0.5%，优选少于0.25%的菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β谷固醇；少于油的300微克/克的总生育三烯酚；以及以油的225-350mcg/g，优选从249.6微克/克至325.3微克/克存在的总生育三烯酚。
其他组分可以包括而不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素（例如，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素，等等）、叶黄素（xanthophyll）（例如，叶黄素（lutein）、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质）、以及各种有机或无机化合物。在一些情况下，从无绿藻种类提取的油包含每克油0.001至0.05微克之间，优选0.003至0.039微克之间的叶黄素，每克油少于0.005微克、优选少于0.003微克的番茄红素；以及每克油少于0.005微克的、优选少于0.003微克的β胡萝卜素。
III.基因工程方法和材料
本发明提供了用于对在本发明的方法中有用的无绿藻细胞以及重组宿主细胞进行基因修饰的方法和材料，这些细胞包括但不限于重组Prototheca moriformis、祖菲无绿藻、Prototheca krugani、和雍滞无绿藻宿主细胞。为了方便读者，将这些方法和材料的描述内容分成多个小节。在小节1中，描述了转化方法。在小节2中，描述了使用同源重组的基因工程方法。在小节3中，描述了表达载体和组件。
1.工程化方法-转化
可以通过任何适合的技术转化细胞，所述技术例如包括生物射弹（biolistics）、电穿孔（参见Maruyama等人（2004），Biotechnology Techniques8:821-826）、玻璃珠转化（glass bead transformation）和碳化硅晶须转化（silicon carbide whiskertransformation）。另一种可以使用的方法涉及形成原生质体和使用CaCl2和聚乙二醇（PEG）以将重组DNA导入微藻细胞中（参见Kim等人（2002），Mar.Biotechnol.4:63-73，其报道了这种椭圆小球藻（Chorella ellipsoidea）转化方法的用途）。微藻的共转化可以用来将两种不同的载体分子同时导入细胞中（参见例如Protist2004Dec;155(4):381-93）。
生物射弹法（参见例如，Sanford,Trends In Biotech（《生物技术趋势》）.（1988）6:299302，美国专利号4,945,050）；电穿孔（Fromm等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci（《美国科学院院刊》）（美国）.（1985）82:58245828）、使用激光束、显微注射或能够将DNA导入微藻中的任何其他方法也可以用于转化无绿藻细胞。
2.工程化方法-同源重组
同源重组是互补DNA序列对齐和交换同源区的能力。将含有与被靶向的基因组序列（“模板”）同源的序列的转基因DNA（“供体”）导入生物中并且然后在相应的基因组同源序列的位点处经历重组到基因组中。
对于在分子遗传水平可以进行的事项而言，在宿主生物中实施同源重组的能力具有许多实际意义，并且在生成能够产生定制油的产油微生物中是有用的。就其本质而言，同源重组是一个精确的基因打靶事件；因此，用相同的靶向序列产生的大部分转基因系就表型而言将是基本上相同的，从而迫使筛选少得多的转化事件。同源重组还将基因插入事件靶向到宿主染色体中，潜在地产生优良的遗传稳定性，甚至在没有遗传选择的情况下也是如此。由于不同的染色体基因座将可能影响基因表达（甚至从异源启动子/UTR），同源重组可以是一种在陌生基因组环境中查找基因座并评定这些环境对基因表达影响的方法。
一个利用同源重组的特别有用的基因工程方法是共同选择（co-opt）特异性宿主调节元件如启动子/UTR以高度特异性方式驱动异源基因表达。例如，用编码选择性标记的异源基因消融或敲除去饱和酶基因/基因家族可能被期望增加宿主细胞中产生的饱和脂肪酸的总百分比。实例6描述了同源重组靶向构建体和在Protothecamoriformis中产生的这类去饱和酶基因消融或敲除的工作实例。减少内源基因表达的另一种方法是使用RNA诱导的基因表达下调或沉默，包括但不限于RNAi或反义方法、以及dsRNA方法。反义法、RNAi法、dsRNA法是本领域熟知的并且包括导入当表达为mRNA时会导致发夹RNA形成的表达构建体或含有靶基因的一部分的表达构建体，其中所述部分会以反义方向转录。所有三种方法均导致减少的靶基因表达。实例6还描述了通过RNAi或反义方法下调内源Prototheca moriformisΔ12去饱和酶基因（FADc）的表达构建体和工作实例。
由于同源重组是一个精确的基因打靶事件，它可以用来精确地修饰在感兴趣的基因或区域内的任何核苷酸，只要已经鉴定足够的侧翼区即可。因此，可以使用同源重组作为修饰影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列的手段。它还可以用来修饰蛋白质编码区以调节酶活性如底物特异性、亲和力、和Km，并且从而实现所希望的宿主细胞代谢变化。同源重组提供了强有力的操纵宿主基因组的手段，导致基因打靶、基因转换、基因缺失、基因重复、和基因倒位以及交换基因表达调节元件如启动子、增强子和3′UTR。
可以通过使用靶向构建体实现同源重组，所述靶向构建体含有“靶向”宿主细胞内源基因组内的感兴趣的基因或区域的内源序列片段。这样的靶向序列可以位于感兴趣的基因或区域的5′、感兴趣的基因/区域的3′或甚至位于感兴趣的基因/区域的侧翼。可以将这样的靶向构建体作为具有另外的载体骨架的超螺旋质粒DNA、不具有载体骨架的PCR产物或作为线性化分子转化到宿主细胞中。在一些情况下，可能有利的是，首先用限制性酶暴露转基因DNA（供体DNA）内部的同源序列。这个步骤可以增加重组效率并且减少不希望的事件的发生。增加重组效率的其他方法包括使用PCR产生转化用转基因DNA，其含有与正在被靶向的基因组序列同源的线性末端。
出于非限制性说明的目的，用于同源重组的供体DNA序列的区域包括在Prototheca moriformis中的DNA的KE858区域。KE858是一个1.3kb的基因组片段，它包含蛋白质的编码区的一部分，其中所述蛋白质与转移RNA（tRNA）蛋白质家族共享同源性。Southern印迹已经显示KE858序列在Prototheca moriformis（UTEX1435）基因组中以单拷贝存在。已经在PCT申请号PCT/US2009/066142中描述了这个区域和使用这个区域进行同源重组打靶的实例。另一种有用的供体DNA区域是在此表示为“6S”的基因组序列（在SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84的供体序列）。注意该6S序列不是6S rRNA序列。这个序列在Prototheca moriformis中的同源重组中的用途描述于以下实例中。
3.载体和载体组件
就在此的披露内容而言，可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备用于根据本发明的微生物的转化的载体。载体典型地含有一种或多种基因，其中每种基因指令所希望的产物（基因产物）的表达并与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列调节基因表达或将该基因产物靶向到重组细胞中的特定位置。为了方便读者，将这个小节分成多个小节。小节A描述了典型地包含在载体上的控制序列以及由本发明提供的新颖的控制序列。小节B描述了典型地包含在载体中的基因以及新颖的密码子优化方法和由本发明提供的使用它们所制备的基因。
A.控制序列
控制序列是调节编码序列表达或指导基因产物至细胞内或细胞外特定位置的核酸。调节表达的控制序列例如包括调节编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一个控制序列是位于编码序列末端的编码多聚腺苷化信号的3′非翻译序列。将基因产物导向至特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些，这些信号肽将它们连接到其上的蛋白质导向至细胞内或细胞外的特定位置。
因此，用于在微藻中表达外源基因的示例性载体设计含有所希望的基因产物（例如，选择标记、脂质途径修饰酶、或蔗糖利用酶）的编码序列，该编码序列与微藻中有活性的启动子可操作地连接。可替代地，如果这种载体不含与感兴趣的编码序列可操作地连接的启动子，则可以将该编码序列转化到细胞中，使得它在载体整合时变成与内源启动子可操作地连接。已经证明无启动子的转化方法在微藻（参见例如Plant Journal 14:4，（1998），第441-447页）中有效。
许多启动子在微藻中有活性，包括相对于正在转化的藻类为内源的启动子，以及相对于正在转化的藻类不是内源的启动子（即，来自其他藻类的启动子、来自高等植物的启动子、以及来自某些植物病毒或藻类病毒的启动子）。PCT公开号2008/151149和其中引用的参考文献中描述了在微藻中有活性的说明性外源和/或内源启动子（以及在微藻中有功能的抗生素抗性基因）。
用来表达外源基因的启动子可以是与这个基因天然连接的启动子或可以是异源启动子。一些启动子在一个以上的微藻种类类中是有活性的。其他启动子是种类特异性的。说明性的启动子包括在下文实例中使用的启动子，如来自莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）β-微管蛋白的启动子，和已经显示在多个微藻种类中有活性的病毒启动子，如花椰菜花叶病毒（CMV）和小球藻病毒（参见例如PlantCell Rep（《植物细胞报告》）.2005Mar;23(10-11):727-35；J Microbiol（《微生物学杂志》）.2005Aug;43(4):361-5；Mar Biotechnol（《海洋生物技术》）(NY).2002Jan;4(1):63-73）。适用于在无绿藻中表达外源基因的另一种启动子是Chlorellasorokiniana谷氨酸脱氢酶启动子/5′UTR。任选地，使用含有启动子的这些序列的至少10、20、30、40、50、或60个或更多个核苷酸。在本申请的序列表中列出了用于无绿藻中表达外源基因的说明性启动子，如小球藻HUP1基因的启动子（SEQ IDNO:1）和椭圆小球藻硝酸盐还原酶启动子（SEQ ID NO:2）。小球藻病毒启动子也可以用来在无绿藻中表达基因，如美国专利6,395,965的SEQ ID NOs:1-7。另外的在无绿藻中有活性的启动子可以例如在Biochem Biophys Res Commun.（《生物化学与生物物理学研究通讯》）1994Oct14;204(1):187-94；Plant Mol Biol（《植物分子生物学》）.1994Oct;26(1):85-93；Virology（《病毒学》）.2004Aug15;326(1):150-9；和Virology（《病毒学》）.2004Jan5;318(1):214-23中找到。其他有用的启动子详细描述于以下实例中。
启动子通常可以表征为组成型或诱导型。组成型启动子通常具有在所有时间（或在细胞生活周期中的某些时间）以相同水平驱动表达的活性或功能。相反，诱导型启动子仅仅在响应于刺激时有活性（或变得无活性）或显著上调或下调。两种类型的启动子均用于本发明的方法中。用于本发明中的诱导型启动子包括这些启动子，它们介导可操作地连接的基因响应于刺激（如外源提供的小分子（例如，葡萄糖，如在SEQ ID NO:1中）、温度（热或冷）、培养基中氮的缺乏，等等）的转录。适合的启动子可以激活基本上沉默的基因的转录或上调、优选地显著上调以低水平转录的可操作地连接的基因的转录。以下实例描述了在无绿藻细胞中有用的另外的诱导型启动子。
包含终止区控制序列是任选的，并且如果使用，则选择主要在于方便，因为终止区是相对可互换的。终止区可以相对于转录起始区（启动子）是天然的，可以相对于感兴趣的DNA序列是天然的，或可以是从另一个来源可获得的。参见例如，Chen和Orozco，Nucleic Acids Res.（1988）16:8411。
本发明还提供了控制序列和重组基因以及含有它们的载体，它们被提供为将感兴趣的基因产物导向特定的细胞区室，如叶绿体、质体、线粒体、或内质网。另外，本发明的实施例包括控制序列和重组基因以及含有它们的载体，它们被提供为蛋白质在细胞外部分泌。
可以使用质体靶向信号，将无绿藻的核基因组中表达的蛋白质靶向到质体。相对于小球藻为内源的质体靶向序列是已知的，如在小球藻核基因组中编码被靶向至质体的蛋白质的基因；参见例如GenBank登录号AY646197和AF499684，并且在一个实施例中，这样的控制序列用于本发明的载体中将蛋白质表达靶向到无绿藻质体。
以下实例描述了藻质体靶向序列将异源蛋白质靶向到宿主细胞中的正确区室的用途。使用Prototheca moriformis和原始小球藻细胞产生cDNA文库，并且在PCT申请号PCT/US2009/066142中描述了这些文库。
在本发明的另一个实施例中，将在无绿藻属中的多肽的表达靶向到内质网。在表达载体中包含适当的滞留或分选信号确保蛋白质留在内质网（ER）中并且不顺流进入高尔基体。例如，来自Wageningen UR-Plant Research International（瓦赫宁根UR-国际植物研究所）的IMPACTVECTOR1.3载体包含熟知的KDEL滞留或分选信号。用这种载体，ER滞留具有实用优点，因为已经报道它提高表达水平5倍或更多。这种现象的主要原因似乎是相比于在细胞质中存在的负责表达的蛋白质的翻译后降解的蛋白酶，ER含有较低浓度和/或不同的蛋白酶。在绿色微藻中有功能的ER滞留信号是已知的。例如，参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005Apr26;102(17):6225-30。
在本发明的另一个实施例中，将在细胞外部分泌的多肽靶向到培养基中。根据本发明的方法可以在无绿藻属中使用的在小球藻中有活性的分泌信号的实例参见Hawkins等人，Current Microbiology（《当代微生物学》）第38卷（1999），第335-341页。
B.基因和密码子优化
典型地，基因包括启动子、编码序列、和终止控制序列。当通过重组DNA技术装配时，基因可以称作表达盒并且可以在侧翼具有方便插入载体中的限制性酶切位点，所述载体被用来将重组基因导入宿主细胞中。这个表达盒可以在侧翼具有来自基因组或其他核酸靶的DNA序列，以便促进表达盒通过同源重组稳定整合到基因组中。可替代地，载体及其表达盒可以保持未整合（例如，游离基因），在这种情况下，载体典型地包含能够提供异源载体DNA复制的复制起点。
在载体上存在的常见基因是编码蛋白质的基因，所述蛋白质的表达允许含有这种蛋白质的重组细胞区别于不表达这种蛋白质的细胞。这种基因以及其相应的基因产物称作选择标记（selectable marker）或选择标记（selection marker）。在对于转化无绿藻属有用的转基因构建体中可以使用广泛的多种选择标记中的任一种。适合的选择标记的实例包括G418抗性基因、硝酸盐还原酶基因（参见Dawson等人（1997），Current Microbiology（《当代微生物学》）35:356-362）、潮霉素磷酸转移酶基因（HPT；参见Kim等人(2002),Mar.Biotechnol（《海洋生物技术》）.4:63-73）、新霉素磷酸转移酶基因和赋予腐草霉素抗性的ble基因（Huang等人（2007），Appl.Microbiol.Biotechnol（《应用微生物学与生物技术》）.72:197-205）。确定微藻对抗生素敏感性的方法是熟知的。例如，Mol Gen Genet（《分子基因遗传学》），1996Oct16;252(5):572-9，如在此所述的蔗糖转化酶、以及也如在此所述的硫胺素营养缺陷型互补。
不是基于抗生素的其他选择标记也可以在用于转化微藻（通常，包括无绿藻种类）的转基因构建体中使用。也可以使用赋予利用某些碳源的能力的基因作为选择标记，所述碳源以前是不能由该微藻利用的。以实例说明，Prototheca moriformis株典型地在蔗糖上不良地生长（如果生长的话）。使用含有蔗糖转化酶基因的构建体可以赋予阳性转化子在作为底物的蔗糖上生长的能力。有关将蔗糖利用作为选择标记连同其他选择标记的另外的细节在以下部分IV中讨论。
出于本发明的目的，用来制备本发明的重组宿主细胞的表达载体将包括至少2个并且经常是3个基因，如果这些基因之一是选择标记的话。例如，可以通过用本发明的载体转化产生本发明的基因工程化无绿藻属，其中除了选择标记之外，所述载体还包含一个或多个外源基因，例如像，蔗糖转化酶基因或酰基ACP-硫酯酶基因。一个或两个基因可以使用诱导型启动子表达，这允许控制这些基因表达的相对定时以增强脂质生产和转化成脂肪酸酯。两个或更多个外源基因的表达可以在相同的诱导型启动子控制之下或者在不同的诱导型（或组成型）启动子控制之下。在后一种情况下，可以诱导第一外源基因表达持续第一时间段（在此期间，可以诱导或可以不诱导第二外源基因的表达），并且可以诱导第二外源基因表达持续第二时间段（在此期间，可以诱导或可以不诱导第一外源基因的表达）。
在其他实施例中，两个或更多个外源基因（除了任何选择标记之外）是脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基辅酶A/醛还原酶，它们的组合作用产生醇产物。进一步提供的是外源基因的其他组合，包括而不限于，脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂脂肪酰基辅酶A还原酶，以产生醛。在一个实施例中，载体提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂脂肪酰基辅酶A还原酶和脂肪醛脱羧酶的组合，以产生链烷。在这些实施例的每一个中，可以使用诱导型启动子表达一个或多个外源基因。
表达两个或更多个外源基因的本发明的其他说明性载体包含编码蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶两者的那些载体以及编码选择标记和分泌型蔗糖转化酶的那些载体。由于使用甘蔗（和甘蔗衍生糖）作为碳源的工程化能力，用任一类型载体转化的重组无绿藻属以较低的制造成本产生脂质。上文描述的两种外源基因的插入可以与通过定向和/或随机诱变破坏多糖生物合成相组合，这甚至使更多的碳流转向进入脂质生产。单独和组合地，营养型转换、改变脂质产生的工程化、以及用外源酶处理改变了由微生物产生的脂质组成。这种改变可以是以下方面的变化：所产生脂质的量、所产生的一种或多种烃种类相对于其他脂质的量、和/或在微生物中产生的脂质种类的类型。例如，可以将微藻工程化以产生更高量和/或百分比的TAG（三酰甘油酯）。
为了最佳表达重组蛋白，采用这样的编码序列是有益的：这些编码序列用优选被有待转化的宿主细胞使用的密码子产生mRNA。因此，转基因的正确表达可能需要转基因的密码子使用匹配于其中正在表达这种转基因的生物的特定密码子偏倚。作为这种作用基础的精确机制是多样的，但是包括将可获得的氨基酰tRNA池与细胞中正在合成的蛋白质正确平衡，当满足这种需要时，这伴随转基因信使RNA（mRNA）的更高效翻译。当转基因中的密码子使用时未优化时，可获得的tRNA池并不足以允许异源mRNA的高效翻译，从而导致核糖体失速和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
本发明提供了用于在无绿藻中成功表达重组蛋白的密码子优化的核酸。通过研究从Prototheca moriformis分离的cDNA序列分析了无绿藻种类中的密码子使用。这项分析代表对超过24,000个密码子的查询，并且在下表2中显示结果。
表2.在无绿藻株中优选的密码子使用
Figure BDA00003613748600601
Figure BDA00003613748600611
在其他实施例中，参考除了无绿藻株之外的微藻株系，已经将重组载体中的基因进行密码子优化。例如，在美国专利号7,135,290中描述了再编码用于在微藻中表达的基因的方法。另外的用于密码子优化的信息是可获得的，例如，在GenBank的密码子使用数据库处获得。
关于具有密码子优化的基因的实施例，这些密码子优化的基因优选被优化以增加该优化的基因的基因产物的表达至少10%并且更优选至少20%、40%、60%、80%、100%或200%。
虽然本发明的方法和材料允许将任何外源基因导入无绿藻中，涉及蔗糖利用和脂质途径修饰的基因是特别感兴趣的，如在以下部分中所讨论的。
IV.选择标记
1.蔗糖利用
在一个实施例中，本发明的重组细胞进一步包含一个或多个外源蔗糖利用基因。在各种实施例中，一种或多种基因编码选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：果糖激酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、蔗糖转化酶、蔗糖转运蛋白。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达允许无绿藻将蔗糖从培养基转运至细胞中并且水解蔗糖以产生葡萄糖和果糖。任选地，在内源己糖激酶活性不足以导致果糖最大磷酸化的情况下，也可以表达果糖激酶。适合的蔗糖转运蛋白的实例是Genbank登录号CAD91334、CAB92307、和CAA53390。适合的果糖激酶的实例是Genbank登录号P26984、P26420和CAA43322。
在一个实施例中，本发明提供了一种分泌蔗糖转化酶的宿主细胞。蔗糖转化酶的分泌避免需要表达可以将蔗糖转运至细胞中的转运蛋白。这是因为分泌型转化酶催化一分子蔗糖转化成一分子葡萄糖和一分子果糖，两者均可以被本发明提供的微生物转运和利用。例如，带有分泌信号（如SEQ ID NO:4的分泌信号（来自酵母）、SEQID NO:5（来自高等植物）、SEQ ID NO:6（真核共有分泌信号）和SEQ ID NO:7（来自高等植物和真核共有信号序列的组合）的蔗糖转化酶（如SEQ ID NO:3）的表达在细胞外产生转化酶活性。这种蛋白质的表达（如通过在此披露的基因工程方法学能够实现）允许已经能够利用细胞外葡萄糖作为能源的细胞利用蔗糖作为细胞外能源。
在含有蔗糖的培养基中表达转化酶的无绿藻种类是用于生产油的优选微藻种类。这种充分有活性的蛋白质的表达及其细胞外靶向允许所得到的宿主细胞在蔗糖上生长，而它们未转化的对应物则不能。因此，本发明的实施例提供了具有一种密码子优化的转化酶基因的重组微藻（包括无绿藻属）细胞，该转化酶基因包括但不限于酵母转化酶基因，其整合到它们的基因组中，使得该转化酶基因被表达为通过转化酶活性和蔗糖水解进行评定。将转化酶基因用作重组细胞中的选择标记，因为这类细胞能够在蔗糖上生长，而它们未转化的对应物则不能；并且使用转化酶选择重组宿主细胞的方法是藻类分子遗传学的强有力选择标记。
蔗糖转化酶在无绿藻中的成功表达也表明了本发明的另一个方面，因为它证明异源（重组）蛋白可以在藻细胞中表达并且成功地以完全活性和功能性形式运送至细胞外并且进入培养基。因此，本发明的实施例提供了用于在微藻中表达广泛和多样类型的异源蛋白质并且将它们分泌于宿主细胞外部的方法和试剂。这种蛋白质包括例如工业用酶，例如像，脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、乳糖酶、异构酶、以及转化酶，以及治疗性蛋白，例如像生长因子、细胞因子、包含两轻链与两重链的全长抗体、Fab、scFv（单链可变片段）、新型骆驼抗体（camellid-type antibody）、抗体片段、抗体片段融合物、抗体-受体融合物、胰岛素、干扰素、以及胰岛素样生长因子。
蔗糖转化酶在无绿藻中的成功表达还表明了本发明的另一个方面，因为它提供了用于在藻类中使用真菌转运肽引导在无绿藻中的蛋白质分泌的方法和试剂；以及用于确定一种肽在无绿藻细胞中作为转运肽是否起作用以及其起作用的能力的方法和试剂。本发明的这些方法和试剂可以用作工具与平台来鉴定其他的可以成功地将蛋白质运输到细胞之外的转运肽，并且酵母转化酶在这些方法中具有很好的效用。如在这一实例中证明的，内源酵母转化酶转运肽的去除以及其被其他转运肽（相对于宿主藻类是内源的或来自其他来源（真核的、原核的以及病毒的））的替换可以鉴定任何感兴趣的肽在引导蛋白质从细胞流出中是否可以作为转运肽起作用。
适合的蔗糖转化酶的实例包括Genbank登录号CAB95010、NP_012104和CAA06839鉴定的那些。下文表3中列出了适合的转化酶的非限制性实例。下文序列表中包括每种列出的转化酶的氨基酸序列。在一些情况下，适合用于本发明的方法和载体中的外源蔗糖利用基因编码与选自表3的蔗糖转化酶具有至少40%、50%、60%、75%、或90%或更高的氨基酸一致性的蔗糖转化酶。
表3.蔗糖转化酶
Figure BDA00003613748600641
转化酶由无绿藻分泌至培养基也能够使细胞在来自甘蔗加工的废弃糖蜜上生长，如同它们在纯试剂级的葡萄糖上生长那样；这种低价值的甘蔗加工废弃产物的使用可以在脂质和其他油的生产中提供显著的成本节省。因此，本发明提供了含有无绿藻属微生物群体的微生物培养物，以及包含(i)蔗糖和(ii)蔗糖转化酶的培养基。在各种实施例中，培养物中的蔗糖来自高粱、甜菜、甘蔗、糖蜜、或解聚的纤维素材料（它可以任选地含有木质素）。在另一个方面，本发明的这些方法与试剂显著增加了可以被重组微藻或其他微生物利用的原料的数目和类型。虽然此处例举的微生物被改变使得它们可以利用蔗糖，可以应用本发明的方法和试剂，使得原料如纤维素材料是可以被本发明的具有分泌纤维素酶、果胶酶、异构酶等等的能力的工程化宿主微生物利用的，从而酶促反应的分解产物不再是仅仅简单地被耐受，而是被宿主用作碳源。这种实例描述在下文以及在微生物实例中，这些微生物被工程化以表达分泌型α-半乳糖苷酶，从而赋予水解寡糖中的α-半乳糖苷键（如那些包含在棉子糖和水苏糖中的那些）的能力，棉子糖和水苏糖是发现于农业废弃物流中的两种寡糖。
2.α-半乳糖苷酶表达
如上所述，虽然蔗糖转化酶的表达赋予无绿藻细胞更有效地利用蔗糖作为碳源的能力（通过该酶水解二糖蔗糖中的果糖与葡萄糖分子之间的α-连接），其他的水解寡糖中的其他类型的α-连接的酶可以赋予无绿藻细胞利用其他碳源的能力。这些酶的表达（以及所得到的利用无绿藻属和其他微藻细胞通常不能利用的碳源的能力）可以通过允许能够在这些碳源上生长的阳性克隆的选择而作为用于这些转基因无绿藻细胞的选择标记。
在一个实施例中，本发明的重组无绿藻细胞进一步含有一种或多种编码多糖降解酶的外源基因。在各种实施例中，这些编码多糖降解酶的一种或多种基因是编码分泌型α-半乳糖苷酶的基因。无绿藻细胞中的外源分泌型α-半乳糖苷酶的表达赋予这样的转化株系在含D-半乳糖苷键（如在半乳糖与葡萄糖单糖单元之间的α-连接）的糖（碳源）上生长的能力。表达外源分泌型α-半乳糖苷酶的无绿藻株将能够利用二糖，如蜜二糖（由α-D-半乳糖-葡萄糖组成的二糖）。
糖，如棉子糖（由α-连接的半乳糖-葡萄糖-果糖构成的三糖）和水苏糖（由两个α-连接的D-半乳糖单元接着α-连接的葡萄糖与果糖构成的四糖），在农业废弃物流（如甜菜浆（棉子糖）以及大豆粕（水苏糖））中以相当大比例存在。这样的农业残余物代表了大量未使用的碳源，可以用于通过能够利用它们的微生物（包括无绿藻属）而转变成油。
无绿藻株不能够以任何显著的量利用寡糖或根本不能利用寡糖，如棉子糖和水苏糖。在棉子糖和水苏糖的情况下，尽管表达蔗糖转化酶的转基因株系（如上所述）具有水解在蔗糖的α-半乳糖苷衍生物中的果糖与葡萄糖之间的α-连接的能力，但是该寡糖的剩余部分仍未得以利用，因为蔗糖转化酶不会切割这种糖中的其余α-连接并且所产生的二糖是不可利用的。在另一个实施例中，本发明的重组无绿藻细胞包含编码蔗糖转化酶的外源基因以及编码α-半乳糖苷酶的外源基因两者。因此，表达蔗糖转化酶和α-半乳糖苷酶两者的株系将能够完全水解寡糖，如棉子糖和水苏糖，使这些组分单体能够消耗。另外，α-半乳糖苷酶编码基因可以被用作一种用于转化的选择标记。含有该外源α-半乳糖苷酶基因的克隆将具有在蜜二糖上生长的能力。适合的用于在无绿藻株中使用的α-半乳糖苷酶基因的实例包括来自卡尔酵母（Saccharomyces carlbergensis）的MEL1基因、来自黑曲霉的AglC基因。有趣的是，已经发现不是所有α-半乳糖苷酶基因都在无绿藻种类中具有功能，即使这些基因根据无绿藻株中的偏好密码子使用而被优化。以下实例显示了当用密码子优化的来自卡尔酵母（S.carlbergensis的）MEL1基因以及来自黑曲霉（A.niger）的AglC基因但不是来自高等植物Cyamopsis tetragonobola（瓜儿豆）的α-半乳糖苷酶编码基因转化时转基因无绿藻细胞在蜜二糖上生长的能力。
3.硫胺素营养缺陷型互补
包括Prototheca moriformis的无绿藻株已知是硫胺素营养缺陷的（参见，例如，Ciferri,O.(1956)Nature（《自然》）,v.178,pp.1475-1476），这意味着这些株系在营养培养基中需要硫胺素用于生长。硫胺素营养缺陷可以是突变或硫胺素生物合成途径中的酶表达缺乏的结果。表达硫胺素生物合成途径中缺失的一种或多种酶的补偿的转基因株系然后可以不需要添加的硫胺素而生长，因此降低了营养培养基的成本，还致使所得到的微藻生物质更合乎需要地用作动物饲料。带有硫胺素生物合成途径酶的补偿还可以用作一种选择标记，因为该转基因赋予在不含硫胺素的平板/培养基上生长的能力。
在一个实施例中，本发明的重组无绿藻细胞进一步含有一个或多个编码胺素生物合成途径酶的外源基因。在另一个实施例中，本发明的重组无绿藻细胞包含编码来自藻类、植物或蓝藻来源的羟甲基嘧啶磷酸合成酶（hydroxymethylpyrimidinephosphate synthase）的外源基因。仍然在其他实施例中，该羟甲基嘧啶磷酸合成酶由THIC基因编码。仍然在其他实施例中，该THIC基因是胶球藻属（Coccomyxa）C-169THIC、拟南芥（Arabidopsis thaliana）THIC、或集胞藻种类（Synechocystis sp.）PCC6803thiC。以下实例详述了具有恢复的硫胺素原养型的Prototheca moriformisUTEX1435的工程化。
V.脂质途径工程化
除了改变微藻或其他微生物利用原料如含蔗糖原料的能力之外，本发明还提供了已经被修饰以改变所产生脂质的特性和/或比例的重组微藻或其他微生物。可以进一步或可替代地修饰这个途径以改变通过酶促加工脂肪酸途径中的脂质和中间体所产生的各种脂质分子的特性和/或比例。在各种实施例中，相对于其未转化的对应物，本发明的重组无绿藻细胞具有优化的每单位体积和/或每单位时间的脂质产量、碳链长度（例如，用于可再生柴油生产或用于需要脂质原料的工业化学品应用）、减少的或增加的双键数目和/或位置（任选地至零）、脂肪酸的羟化、以及增加的特定脂质种类或不同脂质群体的氢:碳比。
在特定的实施例中，已经上调或下调控制针对脂肪酸合成的在代谢中的分支点的一种或多种关键酶来改进脂质产生。可以例如，通过用表达构建体转化细胞实现上调，其中编码感兴趣的酶的基因被表达，例如，使用增加转录的强启动子和/或增强子元件。这样的构建体可以包含选择标记，使得转化子可以经受选择，这可以导致基因保持，以及可能地扩增构建体并且增加所编码的酶的表达水平。适合于根据本发明的方法上调的酶的实例包括在将丙酮酸转化成乙酰辅酶A中发挥作用的丙酮酸脱氢酶（例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号NP_415392；AAA53047；Q1XDM1和CAF05587）。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加乙酰辅酶A的产生，并且从而增加脂肪酸合成。乙酰辅酶A羧化酶催化脂肪酸合成中的初始步骤。因此，可以上调这种酶以增加脂肪酸的产生（例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号BAA94752；AAA75528；AAA81471；YP_537052；YP_536879；NP_045833和BAA57908）。也可以通过上调酰基载体蛋白（ACP）来增加脂肪酸产生，酰基载体蛋白在脂肪酸合成过程中携带正在增长的酰基链（例如，一些自微藻，包括Genbank登录号A0T0F8；P51280；NP_849041；YP_874433）。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。这种酶的上调可以增加脂肪酸产生（例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号AAA74319；AAA33122；AAA37647；P44857；和ABO94442）。
基因的上调和/或下调可以适用于控制脂肪酸生物合成途径的基因表达的全面调节子（global regulator）。因此，在适当的情况下，可以上调或下调脂肪酸合成的一种或多种全面调节子以分别抑制或增强多个脂肪酸合成基因的表达并且最终增加脂质产生。实例包括固醇调节元件结合蛋白（SREBP），如SREBP-1a和SREBP-1c（例如，参见Genbank登录号NP_035610和Q9WTN3）。
本发明还提供了已经被修饰以含有一个或多个外源基因的重组无绿藻细胞，其中所述外源基因编码脂质修饰酶如，例如像，脂肪酰基-ACP硫酯酶（参见表4）、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶（参见表6）、脂肪酰基辅酶A还原酶（参见表7）、脂肪醛脱羧酶（参见表8）、脂肪醛还原酶、去饱和酶（如硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酰基去饱和酶）和鲨烯合酶（参见GenBank登录号AF205791）。虽然脂肪酰基-ACP硫酯酶典型地不是直接地化学修饰这些脂质，根据本发明的实施例对它们的操作可以改变细胞的脂肪酸谱，尤其是在链长以及双键分布方面。在一些实施例中，将编码脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白的基因转化到无绿藻或其他微藻或微生物细胞中，任选地连同编码其他脂质修饰酶的一种或多种基因一起转化。在其他实施例中，ACP和脂肪酰基-ACP硫酯酶可以具有当这两种酶在本发明的微生物和方法中一起使用时赋予优势的相互亲和力，无论它们是否在特定组织或生物中天然共表达。因此，本发明的实施例考虑了这些酶的天然共表达对以及共享彼此相互作用的亲和力以促进从ACP切下特定长度碳链的那些酶。
仍然在其他实施例中，将编码去饱和酶的外源基因连同编码其他脂质修饰酶的一种或多种基因一起转化到微藻或其他微生物细胞中，以便提供关于脂质饱和的修饰。在其他实施例中，内源去饱和酶基因在微藻或其他微生物细胞中过表达（例如，通过导入另外的基因拷贝）。硬脂酰-ACP去饱和酶（参见，例如，GenBank登录号AAF15308；ABM45911；和AAY86086）例如催化硬脂酰-ACP转化成油酰-ACP。上调这种基因可以增加由细胞产生的单不饱和脂肪酸比例；而下调可以降低单不饱和物的比例。出于说明性目的，硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD）负责从C18:0前体合成C18:1脂肪酸。另一个去饱和酶家族是脂肪酰基去饱和酶（FAD），包括Δ12脂肪酸去饱和酶（Δ12FAD）。这些去饱和酶也提供关于脂质饱和的修饰。出于说明性目的，Δ12脂肪酸去饱和酶负责从C18:1前体合成C18:2脂肪酸。同样，可以控制一种或多种甘油脂去饱和酶（如ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6-油酸去饱和酶）的表达以改变不饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率。在一些实施例中，可以参考所希望的碳链长度来选择去饱和酶，使得去饱和酶能够在指定碳长度的底物或具有指定范围内碳长度的底物内产生位置特异性修饰。在另一个实施例中，如果所希望的脂肪酸谱是单不饱和物（如C16:1和/或C18:1）增加，则SAD的过表达或异源性SAD的表达可以与脂肪酰基去饱和酶（FAD）或另一种去饱和酶基因的沉默或失活（例如，通过突变、RNAi、反义、敲除内源去饱和酶基因，等等）偶联。
在其他实施例中，该微藻以及其他微藻细胞已经被修饰而具有突变的内源去饱和酶基因，其中该突变致使该基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，该突变的内源去饱和酶基因是脂肪酸去饱和酶（FAD）。在一些情况下，该突变的内源去饱和酶基因是硬脂酰酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）。以下实例6描述了无绿藻属中的硬脂酰-ACP去饱和酶以及Δ12脂肪酸去饱和酶的靶向消融或敲除。实例6还描述了RNAi或反义构建体用来减少内源去饱和酶基因的表达的用途。
在一些情况下，可能有利的是将一种或多种基因工程技术进行配对以获得产生所希望的脂质谱的转基因细胞。在一个实施例中，微藻或其他微藻细胞包含突变的内源去饱和酶基因以及一个或多个外源基因。在一个非限制性实例中，具有突变的内源去饱和酶基因的微藻或其他微藻细胞还可以表达外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因和/或蔗糖转化酶基因。以下实例6描述了含有内源SAD的靶向消融或敲除并且还表达樟树C14偏好型硫酯酶（C14-preferring thioesterase）和蔗糖转化酶的转基因无绿藻细胞。在这种情况下，这种转基因无绿藻细胞产生一种与发现于动物脂中的脂质谱非常接近的脂质谱。动物脂典型地是衍生自炼制的牛脂或羊脂，在室温是固体并且利用于食品、化妆品、以及化学品工业中的多种应用中。动物脂的脂肪酸谱是：4%C14:0；26%C16:0；3%C16:1；14%C18:0；41%C18:1；3%C18:2；以及1%C18:3。如在以下实例6中所显示的，具有内源SAD的靶向消融或敲除并且表达樟树C14偏好型硫酯酶的转基因无绿藻细胞的克隆具有这样的脂质谱：少于1%的C12以及更短碳链长度的脂肪酸；2.74%至6.13%的C14:0；23.07%至25.69%的C16:0；7.02%至11.08%的C18:0；42.03%至51.21%的C18:1；以及9.37%至13.45%的C18:2（以面积百分数表示）。在一些情况下，这些转基因无绿藻细胞具有这样的脂质谱：3%-5%C14:0；25%-27%C16:0；10%-15%C18:0；以及40%-45%C18:1。
在特定的实施例中，本发明的微生物经基因工程化以表达选自以下的一种或多种外源基因：酰基-ACP硫酯酶、酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、或天然共表达的酰基载体蛋白。上文描述了适合的关于表达脂肪酶基因的表达方法，除了其他方法之外，包括诱导型表达和区室化表达。脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂质合成过程中从酰基载体蛋白（ACP）切下脂肪酸。通过进一步酶促加工，切下的脂肪酸然后与辅酶组合以产生酰基辅酶A分子。这种酰基辅酶A是产生醛的脂肪酰基辅酶A还原酶以及产生醇的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶的酶活性的底物。如上文通过脂肪酰基辅酶A还原酶的作用所产生的醛是产生醇的脂肪醛还原酶或产生链烷或烯的脂肪醛脱羧酶的进一步酶活性的底物。
在一些实施例中，通过在此所述的方法产生的脂肪酸、甘油酯或相应的伯醇、醛、链烷或烯含有8、10、12或14个碳原子。用于生产柴油、生物柴油、可再生柴油或喷气燃料、或用于工业应用的相应的伯醇、醛、链烷以及烯的优选脂肪酸含有8至14个碳原子。在某些实施例中，以上脂肪酸、以及其他相应的烃分子是饱和的（没有碳碳双键或三键）；单不饱和的（单个双键）；多不饱和的（两个或更多个双键）；是直链（不是环状的）或支链的。对于燃料生产而言，较大的饱和度是优选的。
上文直接描述的酶具有用于水解含有特定碳原子数的底物的优先特异性。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可以优先从ACP切下具有12个碳原子的脂肪酸。在一些实施例中，ACP和长度特异性硫酯酶可以彼此具有亲和力，从而使它们作为组合特别有用（例如，外源ACP和硫酯酶基因可以在它们自其衍生的特定组织或生物中天然共表达）。因此，在不同实施例中，本发明的重组无绿藻细胞可以含有编码蛋白质的外源基因，所述蛋白质就底物中所含碳原子的数目而言具有用于催化酶活性（例如，从ACP切下脂肪酸、将酰基辅酶A还原成醛或醇、或将醛转化成链烷）的特异性。在各种实施例中，酶特异性可以针对具有从8个至34个碳原子，优选地从8个至18个碳原子，并且更优选从8至14个碳原子的底物。优选特异性是针对具有较少（即，12）而不是较多（即18）碳原子的底物。
适合于供本发明的微生物和方法使用的其他脂肪酰基-ACP硫酯酶包括而不限于在表4中列出的那些。
表4.脂肪酰基-ACP硫酯酶和GenBank登录号
Figure BDA00003613748600721
以下实例描述了来自萼距花、加州月桂、樟树、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、山竹、油棕、甘蓝型油菜、蓖麻以及美洲榆的异源脂肪酰基-ACP硫酯酶在无绿藻种类中的成功靶向和表达。另外地，证实了在表达这些异源脂肪酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞中的脂肪酸谱的改变。如在这些实例中所显示的，这些异源硫酯酶在无绿藻属中的表达产生了一种转基因微藻，该转基因微藻能够产生具有真正独特的脂肪酸谱的油/脂质，这样的油/脂质目前从商业种子作物是不可获得的，即使通过将数种种子作物油掺混。表5显示了常见商业种子油的脂肪酸谱。下文的所有商业种子油数据均从美国药典食品和化学品代码，第7版（2010-2011）编纂。动物脂数据来自美国国家研究委员会：动物产品的脂肪含量和组成（1976）（National Research Council:Fat Content and Composition of Animal Products）。
表5.商业种子油的脂质谱
Figure BDA00003613748600732
Figure BDA00003613748600741
Figure BDA00003613748600751
作为实例，这些常见种子油没有一种含有高量的C8或C10脂肪酸，其中椰子油和棕榈仁油是最大的来源，但是两者具有大约1:1（C8:C10脂肪酸）的比率。如在这些实例中所显示的，用湿地萼距花C:8偏好型硫酯酶转化的无绿藻属能够不仅达到超过12%的C8脂肪酸水平，而且C8:C10脂肪酸的比率为大约5:1。在脂肪酸水平方面的改变对于生产含有用于多种商业应用的定制脂肪酸谱的油是有用的。另外地，在不同脂肪酸链长之间的比率的改变在未曾经历进一步的高成本的化学过程（如酯化、蒸馏、分提、以及再酯化）的油中在某种程度上是不曾在商业上可得的。作为另一个实例，棕榈油是含C16:0脂肪酸最高（32%-47%）的油，但是棕榈油具有极少的C14:0脂肪酸。含有美洲榆硫酯酶的无绿藻属达到了大约33%-38%的C16:0脂肪酸以及大约10%-16%的C14:0脂肪酸（大约2:1的C16:0与C14:0的比率）。通过掺混商业水平的现有的油实现这个脂肪酸谱在商业上不切实际的，因为这些高16:0脂肪酸的种子油通常不含有很多14:0脂肪酸。
以下实例还描述了至少两种脂肪酰基-ACP硫酯酶在一个克隆中的成功靶向和表达。证实在了这些克隆中的脂肪酸谱的改变并且这些改变取决于哪两种硫酯酶在一个克隆中共表达，这些脂肪酸谱以不同方式受到影响。作为一个实例，根据以上表5，椰子油合棕榈仁油两者都具有大致3:1的C12:C14比率。如在以下实例中所描述的，含有两个异源硫酯酶基因的无绿藻转化子能够产生大致5:1比率的C12:C14脂肪酸水平。这种C12:C14脂肪酸比率曾经在商业上是不切实际的（即，通过将种子油掺混）。
由转基因微藻产生的油的另一个新颖的方面是脂肪酸的饱和度。棕榈油目前是饱和油的最大来源，具有52%比48%的总饱和物比不饱和物。如在以下实例中所显示的，具有来自美洲榆和樟树的异源硫酯酶的无绿藻属在其产生的油中达到了超过60%的总饱和物水平。还在以下实例中显示，具有来自美洲榆的异源硫酯酶的无绿藻属在其产生的油中达到了超过86%的总饱和物水平。
适合于供本发明的微生物和方法使用的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶包括而不限于在表6中列出的那些。
表6.通过GenBank登录号列出的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶
Figure BDA00003613748600761
适合于供本发明的微生物和方法使用的脂肪酰基辅酶A还原酶包括而不限于在表7中列出的那些。
表7.通过GenBank登录号列出的脂肪酰基辅酶A还原酶
Figure BDA00003613748600771
适合于供本发明的微生物和方法使用的脂肪醛脱羧酶包括而不限于在表8中列出的那些。
表8.通过GenBank登录号列出的脂肪醛脱羧酶
Figure BDA00003613748600772
天然共表达的脂肪酰基-ACP硫酯酶以及酰基载体蛋白的组合适合于供本发明的微生物和方法使用。
烃或脂质修饰酶的另外的实例包括多种氨基酸序列，这些氨基酸序列包含于、引用于或编码自包含于或引用于任何以下美国专利中的核酸序列中：6,610,527、6,451,576、6,429,014、6,342,380、6,265,639、6,194,185、6,114,160、6,083,731、6,043,072、5,994,114、5,891,697、5,871,988、6,265,639，并且进一步描述于以下GenBank登录号中：AAO18435、ZP_00513891、Q38710、AAK60613、AAK60610、AAK60611、NP_113747、CAB75874、AAK60612、AAF20201、BAA11024、AF205791以及CAA03710。
在脂质生物合成途径中的其他酶也适合供本发明的微生物和方法使用。例如，酮脂酰-ACP合成酶（Kas）与一些以上列出的酶在脂质生物合成途径中共同起作用。存在不同类别的Kas酶：Kas I参与在不断增长的酰基ACP链与丙二酰-ACP之间的连续缩合步骤。Kas II典型地参与引导从C16:0-ACP到掺入丙二酰-ACP的C18:0-ACP的最终缩合步骤。像这样，在主要合成C16-C18:0脂肪酸（以及它们的不饱和衍生物）的高等植物以及一些微藻种类/株系中，Kas II酶与FatA基因的产物（酰基-ACP硫酯酶）相互作用。
酰基-ACP在脂肪酸生物合成过程中从ACP释放增长的脂肪酸链，并且在大多数植物种类中，这是由FatA基因家族成员实施的，其中所述FatA基因家族成员的作用是在C16:0至C18:0阶段终止延伸。在合成较短链脂肪酸的种类（如萼距花、油棕、肉豆蔻或月桂）中，由FatB基因编码的不同组的酰基-ACP硫酯酶实施这个终止步骤。在Kas II酶与酰基-Acp硫酯酶之间的相互作用对于脂肪酸链延长的正确终止是重要的。结果，在已经进化出能够生物合成较短链脂质的FatB基因的高等植物种类（以及微藻种类）中，存在着相应的另外类别的Kas基因（称作Kas IV基因）的共进化。Kas IV基因负责特定大小范围的脂肪酸（在长度上为4-14个碳）的链长延伸。
用于供本发明的微生物和方法使用的其他适合的酶包括与表4、6-8中列出的蛋白质之一具有至少70%氨基酸一致性并且展现出相应的所希望的酶活性（例如，从酰基载体蛋白切下脂肪酸、将酰基辅酶A还原成醛或醇、或将醛转化成链烷）的那些酶。在另外的实施例中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%一致性的序列中，特此将所有序列通过引用进行结合，如同本文完全阐述。
通过选择有待表达的外源基因的所希望的组合，人们可以定制由微生物产生的产物，然后可以从含水生物质提取这种产物。例如，这种微生物可以含有以下各项中的一种或多种：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因；以及任选地，(ii)天然共表达的酰基载体蛋白或另外地对脂肪酰基-ACP硫酯酶具有亲和力的酰基载体蛋白（或相反地）；以及任选地，(iii)编码脂肪酰基辅酶A/醛还原酶或脂肪酰基辅酶A还原酶的外源基因；以及任选地，(iv)编码脂肪醛还原酶或脂肪醛脱羧酶的外源基因。这种微生物还可以包含以下各项中的一种或多种：外源硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、β-酮脂酰-ACP合成酶I（例如，由KASI基因编码的）、β-酮脂酰-ACP合成酶II（例如，由KASII基因编码的）、或油酸-12羟化酶。这种微生物在此处所述的培养条件下合成连接至ACP的脂肪酸并且脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP切下脂肪酸，从而通过进一步的酶促加工而产生脂肪酰基辅酶A分子。当存在时，脂肪酰基辅酶A/醛还原酶催化酰基辅酶A还原为醇。同样，脂肪酰基辅酶A还原酶当存在时催化酰基辅酶A还原为醛。在其中一种编码脂肪酰基辅酶A还原酶的外源基因存在并且被表达以产生醛产物的那些实施例中，由第三外源基因编码的脂肪醛还原酶催化醛还原为醇。同样，脂肪醛脱羧酶当存在时催化醛转变为链烷或烯。
在另一个实施例中，这种微生物可以含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因；(ii)任选地，天然共表达的酰基载体蛋白或对脂肪酸酰基-ACP硫酯酶具有亲和力的酰基载体蛋白；(iii)突变的内源去饱和酶基因，其中所述突变使得去饱和酶基因或去饱和酶蛋白质无活性，如去饱和酶敲除或去饱和酶抑制元件如靶向RNAi、反义或dsRNA构建体；(iv)内源硬脂酰酰基载体蛋白去饱和酶过表达或异源SAD表达；和(v)前述情况的任何组合。
编码这类酶（如脂肪酰基ACP硫酯酶）的基因可以从已经已知展现出显著脂质生产的细胞如原始小球藻获得。可以将已经已知在脂质产生中发挥作用的基因，例如，编码使双键饱和的酶的基因，单独地转化到受体细胞中。然而，为了实施本发明，没有必要做出关于需要何种基因的先验假设。在PCT公开号2008/151149中描述了用于鉴定可以改变（改进）微藻中的脂质产生的基因的方法。
因此，本发明提供了已经被基因工程化从而与相同种类的野生型细胞相比以改变的水平表达脂质途径酶的无绿藻细胞。在一些情况下，当两种细胞均在相同条件下生长时，与野生型细胞相比，这种细胞产生更多的脂质。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以更高水平或更低水平表达脂质途径酶。在一些情况下，脂质途径酶选自下组，该组由以下各项组成：丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白、以及甘油-3磷酸酰基转移酶。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以更低的水平表达脂质途径酶。在细胞以较低水平表达脂质途径酶的至少一个实施例中，脂质途径酶包括柠檬酸合酶。
在一些实施例中，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以改变的水平表达脂肪酸合成的全面调节子，由此与野生型细胞相比，多个脂肪酸合成基因的表达水平被改变。在一些情况下，脂质途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶以及甘油脂去饱和酶。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为表达较低水平的脂质途径酶或根本不表达特定的脂质途径酶（即，其中脂质途径酶已经被敲除或替换为外源基因，或者表达已经使用RNAi或反义方法而被降低）。在另一个实施例下，脂质途径酶是去饱和酶基因的异源表达，包括但不限于硬脂酰-ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶（FAD）。实例6描述了来自油橄榄的异源硬脂酰-ACP在Prototheca moriformis遗传背景中的表达。
在其他实施例中，本发明是针对含有一种或多种外源基因的产油微生物，其中所述外源基因编码选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、去饱和酶、以及酰基载体蛋白。在另一个实施例中，内源去饱和酶基因在含有一个或多个以上外源基因的微生物中过表达。在一个实施例中，外源基因与一个启动子可操作地连接，所述启动子是响应于刺激可诱导或可抑制的。在一些情况下，这种刺激选自下组，该组由以下各项组成：外源提供的小分子、热、冷、以及在培养基中限制氮或无氮。在一些情况下，外源基因在细胞区室中表达。在一些实施例中，细胞区室选自叶绿体、质体和线粒体。在一些实施例中，微生物是Protothecamoriformis、Prototheca krugani、雍滞无绿藻或祖菲无绿藻。
在一个实施例中，外源基因编码脂肪酸酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，由外源基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白（ACP）切下8至18碳脂肪酸。在一些情况下，由外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下10至14碳脂肪酸。在一个实施例中，由外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下12碳脂肪酸。
在一个实施例中，外源基因编码脂肪酰基辅酶A/醛还原酶。在一些情况下，由外源基因编码的还原酶催化8至18碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的伯醇。在一些情况下，由外源基因编码的还原酶催化10至14碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的伯醇。在一个实施例中，由外源基因编码的还原酶催化12碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的十二醇。
本发明还提供了含有两种外源基因的重组无绿藻或其他细胞，其中第一外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶并且第二外源基因编码选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、以及酰基载体蛋白。在一个实施例中，这两个外源基因各自与一个启动子可操作地连接，所述启动子是响应于刺激可诱导的。在一些情况下，每个启动子是响应于相同刺激（如在培养基中限制氮或无氮）可诱导的。培养基中限制氮或完全缺乏氮在一些微生物如无绿藻种类中刺激油产生，并且可以用作诱导油产生至高水平的触发物。当与在此披露的基因工程方法组合使用时，作为干细胞重量百分比的脂质可以被推向高水平，如至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或在75%至90%之间；在此披露的方法为细胞提供了这些水平的脂质，其中该脂质是至少4%C8-C14、至少0.3%C8、至少2%C10、至少2%C12、以及至少2%C14。在一些实施例中这些细胞具有按干细胞重计超过25%的脂质并且含有至少为10%C8-C14、至少20%C8-C14、至少30%C8-C14、10%-30%C8-C14以及20%-30%C8-C14的脂质。
在此披露的这些新颖的油与其他天然产生的中链脂肪酸含量高的油（如棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油）不同。例如，在棕榈油和棕榈仁油中的污染物（如类胡萝卜素）水平远远高于本发明的油中的污染物水平。棕榈油和棕榈仁油特别地含有α与β胡萝卜素和番茄红素，其量远远高于本发明的油中的α与β胡萝卜素和番茄红素。另外，在棕榈油和棕榈仁油中发现了超过20种的类胡萝卜素，而这些实例证明本发明的油含有很少的类胡萝卜素种类并且水平很低。另外，在棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油中的维生素E化合物（如生育三烯酚）的水平远远高于在本发明的油中的水平。
在一个实施例中，由该第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下8至18碳脂肪酸。在一些实施例中，该第二外源基因编码一种脂肪酰基辅酶A/醛还原酶，该脂肪酰基辅酶A/醛还原酶催化8-18碳脂肪酰基辅酶A还原为一种相应的伯醇。在一些情况下，由该第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下10-14碳脂肪酸，并且由该第二外源基因编码的还原酶催化10-14碳脂肪酰基辅酶A还原为相应的伯醇，其中该硫酯酶和该还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实施例中，由该第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下12碳脂肪酸，并且由该第二外源基因编码的还原酶催化12碳脂肪酰基辅酶A还原为十二醇。在一些实施例中，该第二外源基因编码一种脂肪酰基辅酶A还原酶，该脂肪酰基辅酶A还原酶催化8-18碳脂肪酰基辅酶A还原为一种相应的醛。在一些实施例中，该第二外源基因编码一种与脂肪酰基-ACP硫酯酶天然共表达的酰基载体蛋白。
在一些实施例中，该第二外源基因编码一种脂肪酰基辅酶A还原酶，并且该微生物进一步包含一种编码脂肪醛脱羧酶的第三外源基因。在一些情况下，由该第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下8-18碳脂肪酸，由该第二外源基因编码的还原酶催化8-18碳脂肪酰基辅酶A还原为相应的脂肪醛，并且由该第三外源基因编码的脱羧酶催化8-18碳脂肪醛转变为相应的链烷，其中该硫酯酶、该还原酶、以及该脱羧酶作用于相同的碳链长度。
在一些实施例中，该第二外源基因编码一种酰基载体蛋白，并且该微生物进一步含有一种编码选自下组的蛋白质的第三外源基因，该组由以下各项组成：脂肪酰基辅酶A还原酶和脂肪酰基辅酶A/醛还原酶。在一些情况下，该第三外源基因编码一种脂肪酰基辅酶A还原酶，并且该微生物进一步含有一种编码脂肪醛脱羧酶的第四外源基因。
本发明还提供了用于生产醇的方法，这些方法包括将重组无绿藻细胞群体在培养基中培养，其中这些细胞含有(i)一种编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，以及(ii)一种编码脂肪酰基辅酶A/醛还原酶的第二外源基因，并且这些细胞合成连接至酰基载体蛋白（ACP）的脂肪酸，该脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP切下该脂肪酸以通过进一步的加工而产生脂肪酰基辅酶A，并且该脂肪酰基辅酶A/醛还原酶催化该酰基辅酶A还原为醇。
本发明还提供了在无绿藻细胞中产生脂质分子的方法。在一个实施例中，该方法包括将无绿藻细胞群体在培养基中培养，其中这些细胞含有(i)一种编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，以及(ii)一种编码脂肪酰基辅酶A还原酶的第二外源基因，并且这些微生物合成连接至酰基载体蛋白（ACP）的脂肪酸，该脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP切下该脂肪酸以通过进一步的加工而产生脂肪酰基辅酶A，并且该脂肪酰基辅酶A还原酶催化该酰基辅酶A还原为醛。
本发明还提供了在无绿藻细胞中产生具有特定碳链长度的脂肪酸分子的方法。在一个实施例中，该方法包括将产生脂质的无绿藻细胞群体在培养基中培养，其中这些微生物含有编码一种脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因，该脂肪酰基-ACP硫酯酶具有针对某一碳链长度（如8、10、12或14个碳原子）的特异性的或优先的活性，并且其中这些微生物合成连接至酰基载体蛋白（ACP）的脂肪酸并且当该脂肪酸已经被合成到特定碳链长度时该硫酯酶催化从ACP切下该脂肪酸。
在上文所述的各种实施例中，无绿藻细胞可以含有至少一个编码脂质途径酶的外源基因或抑制基因产物表达的抑制元件（如RNA干扰元件）。在一些情况下，该脂质途径酶选自下组，该组由以下各项组成：硬脂酰-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白、以及甘油-3磷酸酰基转移酶。在其他情况下，无绿藻细胞含有选自下组的脂质修饰酶，该组由以下各项组成：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、和/或酰基载体蛋白。
本发明还提供了以一种含有异源基因的微生物细胞，该异源基因编码一种产生羟化脂肪酸的羟化酶。这种微生物细胞可以包含II型脂肪酸合成途径。例如，这种微生物细胞可以是一种微藻细胞。在一些实施例中，这种微藻细胞选自在以上表1中列出的微藻细胞。在其他实施例中，这种微藻细胞属于无绿藻属。仍然在其他实施例中，这种微藻细胞是Prototheca moriformis。羟化酶是将羟基基团（-OH）添加至底物上的酶类。脂肪酸羟化酶是在一些高等植物中发现的天然存在的酶。在高等植物中发现的天然存在的羟化酶的一个非限制性实例是负责油酸的产生的来自蓖麻的油酸12-羟化酶。实例7描述了在无绿藻细胞中的羟化酶的异源表达的一个实例，具体地是蓖麻油酸12-羟化酶在Prototheca moriformis细胞中的表达。
VI.燃料和化学品生产
为了根据本发明的方法生产燃料，通过任何方便的手段收获或以别的方式收集由本发明的细胞产生的脂质。可以通过全细胞提取分离脂质。首先破坏细胞，并且然后可以例如通过使用如上文所述的离心从细胞团中分离细胞内脂质和细胞膜/细胞壁结合的脂质以及细胞外烃。在一些实施例中，在溶解微生物细胞之后提取产生在微生物中的细胞内脂质。一旦被提取，将这些脂质进一步精炼以便生产油、燃料、或油脂化学品。
在完成培养之后，从发酵液中分离微生物。任选地，通过离心实现分离以产生浓缩膏。离心并不从这些微生物中去除显著量的细胞内水分并且并不是一个干燥步骤。这种生物质可以然后任选地用洗涤液（例如，蒸馏水）洗涤以除去发酵液和碎片。任选地，也可以在破坏细胞之前干燥（烘干、冻干，等等）洗涤的微生物生物质。可替代地，当发酵结束时，可以在不与一些或所有发酵液分开的情况下溶解细胞。例如，当溶解细胞时，细胞可以处于小于1:1v:v细胞对胞外液体的比率。
可以溶解含有脂质的微生物以产生溶解产物。如在此详述，可以通过任何方便的手段实现溶解微生物（也称为细胞溶解）的步骤，所述手段包括热诱导的溶解、添加碱、添加酸、使用酶如蛋白酶和多糖降解酶（如淀粉酶）、使用超声波、机械溶解、使用渗透压休克、用溶解病毒感染和/或表达一个或多个溶解基因。进行溶解以释放已经由微生物产生的细胞内分子。这些用于溶解微生物的方法的每一种可以作为单一方法或以组合方式同时或依次地使用。可以通过显微镜分析来观察细胞破坏的程度。使用一种或多种在此所述的方法，典型地观察到超过70%的细胞破碎。优选地，细胞破裂超过80%、更优选超过90%并且最优选大约100%。
在特定的实施例中，在生长之后溶解微生物，例如以便增加用于提取或进一步加工的细胞脂质和/或烃的暴露。可以调节脂肪酶表达（例如，通过诱导型启动子）或细胞溶解的定时，以便优化脂质和/或烃的产生。下文描述众多溶解技术。这些技术可以单独或组合地使用。
在本发明的一个实施例中，溶解微生物的步骤包括加热含有该微生物的细胞悬液。在这个实施例中，加热含有该微生物的发酵液（或从发酵液中分离的微生物悬液）直到微生物（即微生物的细胞壁和细胞膜）降解或分解。典型地，应用的温度是至少50℃。更高的温度，如至少30℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、至少130℃或更高用于更高效的细胞溶解。可以通过煮沸微生物通过热处理来溶解细胞。可替代地，可以在高压釜中进行热处理（不沸腾）。可以将热处理的溶解产物冷却，用于进一步处理。也可以通过蒸汽处理，即，通过添加加压蒸汽进行细胞破碎。例如在美国专利号6,750,048中描述了用于细胞破碎的微藻蒸汽处理。在一些实施例中，可以通过将蒸汽鼓泡到发酵罐中并且将培养液维持在所希望的温度持续小于大约90分钟、优选小于大约60分钟、并且更优选小于大约30分钟而实现蒸汽处理。
在本发明的另一个实施例中，溶解微生物的步骤包括将碱添加至含有微生物的细胞悬液。该碱应当强到足以水解所使用的微生物的蛋白质化合物的至少一部分。用于增溶蛋白质的碱是化学领域已知的。用于本发明方法的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，及其混合物。优选的碱是KOH。例如在美国专利号6,750,048中描述了用于破碎细胞的微藻碱处理。
在本发明的另一个实施例中，溶解微生物的步骤包括将酸添加至含有微生物的细胞悬液。可以使用浓度为10mN-500mN或优选40nM-160nM的酸实现酸溶解。优选在室温以上（例如，在40°-160°，并且优选是50°-130°的温度）进行酸溶解。对于中等温度（例如，室温至100℃，并且尤其是室温至65°），酸处理可以有用地与超声处理或其他细胞破碎方法结合。
在本发明的另一个实施例中，溶解微生物的步骤包括通过使用酶溶解微生物。用于溶解微生物的优选酶是蛋白酶和多糖降解酶，如半纤维素酶（例如，来自黑曲霉（Aspergillus niger）的半纤维素酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO，#H2125）；果胶酶（例如，来自根霉种类（Rhizopus sp.）的果胶酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO，#P2401）；Mannaway4.0L（Novozymes）；纤维素酶（例如，来自绿色木霉（Trichoderma viride）的纤维素酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO，#C9422）；以及崩溃酶（例如，来自担子菌纲种类（Basidiomycetes sp.）的崩溃酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO，#D9515）。
在本发明的其他实施例中，使用酶完成溶解，所述酶例如是纤维素酶如多糖降解酶，其任选地来自小球藻或小球藻病毒，或蛋白酶，如灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、在Degradation of Polylactide byCommercial Proteases（通过商业蛋白酶降解聚乳酸），Oda Y等人，Journal ofPolymers and the Environment（《聚合物与环境杂志》），第8卷，第1期，2000年1月，第29-32页（4）中所列出的蛋白酶、Alcalase2.4FG（Novozymes）、以及Flavourzyme100L（Novozymes）。也可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任何组合，包括前述蛋白酶和多糖降解酶的任何组合。
在另一个实施例中，可以使用螺旋榨机进行溶解。在这个过程中，以高压迫使生物质穿过螺杆型装置，溶解细胞并引起细胞内脂质释放并且与细胞中的蛋白质和纤维（和其他组分）分开。
在本发明的另一个实施例中，通过使用超声波（即，超声处理）进行溶解微生物的步骤。因此，也可以用高频声波溶解细胞。可以电子地产生声波并且将其通过金属尖端传输至适当浓缩的细胞悬液。这种超声处理（或超声波处理）基于在细胞悬液中产生空腔而破坏细胞完整性。
在本发明的另一个实施例中，通过使用机械溶解进行溶解微生物的步骤。可以将细胞机械地溶解并且任选地均质化以促进烃（例如，脂质）收集。例如，压力破碎仪可以用来泵送含有细胞的浆料穿过限流孔阀（restricted orifice valve）。施加高压（高达1500巴），随后穿过出口喷嘴瞬间膨胀。通过三种不同的机制完成细胞破碎：冲击在阀门上、在孔口中的高液体剪切和释放时压力骤降，从而引起细胞爆裂。这种方法释放细胞内分子。可替代地，可以使用球磨机。在球磨机中，在悬浮液中将细胞与小磨粒（例如珠子）一起搅动。细胞因剪切力、在珠子之间的碾磨以及与珠子碰撞而破裂。珠子破坏细胞以释放细胞内容物。也可以通过剪切力破坏细胞，如使用共混（例如用高速或瓦林混碎机（Waring blender）作为实例）、弗氏压碎器、或在薄弱细胞壁的情况下甚至离心来破坏细胞。
在本发明的另一个实施例中，通过应用渗透压休克进行溶解微生物的步骤。
在本发明的另一个实施例中，溶解微生物的步骤包括用溶解病毒感染微生物。已知多种病毒溶解适合用于本发明中的微生物，并且针对特定的微生物选择和使用特定的溶解病毒是在本领域的技术水平范围之内的。例如，草履虫小球藻病毒（PBCV-1）是一组巨大的形成蚀斑的二十面体双链DNA病毒的原型（藻DNA病毒科（Phycodnaviridae），绿藻病毒属（Chlorovirus）），这些病毒在某些单细胞真核小球藻样绿藻中复制并将其溶解。因此，可以通过用适合的小球藻病毒感染培养物溶解任何易感性微藻。用小球藻病毒感染小球藻种类的方法是已知的。参见例如Adv.Virus Res（《病毒研究进展》）.2006;66:293-336；Virology（《病毒学》）,1999Apr25;257(1):15-23；Virology（《病毒学》）,2004Jan5;318(1):214-23；NucleicAcids Symp.Ser（《核酸研讨会论文集丛刊》）.2000;(44):161-2；J.Virol（《病毒杂志》）.2006Mar;80(5):2437-44；以及Annu.Rev.Microbiol（《微生物学年度评论》）.1999;53:447-94。
在本发明的另一个实施例中，溶解微生物的步骤包括自溶。在这个实施例中，一种根据本发明的微生物经基因工程化以产生溶解蛋白，这种蛋白将溶解这种微生物。这种溶解基因可以使用诱导型启动子表达，使得可以首先使细胞在发酵罐中生长至所希望的密度，随后诱导启动子以表达溶解基因来溶解细胞。在一个实施例中，溶解基因编码多糖降解酶。在某些其他实施例中，溶解基因来自溶解病毒的基因。因此，例如，来自小球藻属病毒的溶解基因可以在藻细胞中表达；参见Virology（《病毒学》）260,308-315(1999)；FEMS Microbiology Letters（《FEMS微生物通讯》）180(1999)45-53；Virology（《病毒学》）263,376-387(1999)；和Virology（《病毒学》）230,361-368（1997）。优选地使用由刺激（如存在小分子、光、热和其他刺激）诱导的诱导型启动子，如微藻中有活性的启动子完成溶解基因的表达。
多种方法可用于从通过以上方法产生的细胞溶解产物中分离脂质。例如，脂质和脂质衍生物如脂肪醛、脂肪醇和烃（如链烷）可以用疏水性溶剂如己烷提取（参见Frenz等人1989，Enzyme Microb.Technol.（《酶与微生物技术》），11:717）。脂质和脂质衍生物也可以使用液化（参见例如Sawayama等人1999,Biomass andBioenergy（《生物质与生物能源》）17:33-39和Inoue等人1993,Biomass Bioenergy（《生物质与生物能源》）6(4):269-274）；油液化（参见例如Minowa等人1995，Fuel（《燃料》）74(12):1735-1738）；和超临界CO2提取（参见例如Mendes等人2003,Inorganica Chimica Acta（《无机化学学报》）356:328-334）提取。Miao和Wu描述了从原始小球藻培养物回收微藻脂质的方案，其中将细胞通过离心收获、用蒸馏水洗涤并且通过冷冻干燥法干燥。在研钵中粉碎所得到的细胞粉末并且然后将其用正己烷提取。Miao和Wu,Biosource Technology（《生物资源技术》）（2006）97:841-846。
因此，可以用有机溶剂提取回收由本发明的微生物产生的脂质、脂质衍生物和烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。典型地，将有机溶剂直接添加至溶解产物，而不事先分离溶解产物组分。在一个实施例中，将通过上文所述的一种或多种方法产生的溶解产物与有机溶剂接触足以允许脂质和/或烃组分与有机溶剂形成溶液的一段时间。在一些情况下，可以然后进一步精炼溶液以回收特定的所希望的脂质或烃组分。己烷提取法是本领域熟知的。
可以通过使用一种或多种酶（包括脂肪酶）修饰如在此所述的细胞产生的脂质和脂质衍生物，如脂肪醛、脂肪醇、以及烃（如链烷），如上所述。当烃处于细胞的细胞外环境中时，可以将一种或多种酶在酶修饰烃或从烃前体中完成其合成的条件下添加至这个环境。可替代地，在添加一种或多种催化剂（例如酶）之前，可以从细胞物质中部分或完全地分离烃。这样的催化剂是外源添加的，并且它们的活性在细胞外部或在体外发生。
因此，如在此所述的在体内由细胞产生或在体外酶促修饰的脂质和烃可以任选地通过常规手段进一步加工。加工可以包括“裂解”以减小烃分子的大小，并且因此增加烃分子的氢：碳比。催化裂解和热裂解方法常规地用于烃和甘油三酯油加工中。催化方法涉及使用催化剂，如固体酸催化剂。这种催化剂可以是二氧化硅-氧化铝或沸石，这引起碳-碳键的异裂断裂或非对称断裂，产生碳正离子和氢负离子（hydrideanion）。这些活性中间体然后经历重排或与另一种烃发生氢负离子转移。反应可以因此再生这些中间体以导致自增殖链机制（self-propagating chain mechanism）。也可以加工烃以减少其中的碳-碳双键或三键的数目，任选地减少至零。也可以加工烃以除去或消除其中的环或环状结构。也可以加工烃以增加氢：碳比。这可以包括加氢（“氢化”）和/或烃“裂解”成更小的烃。
热方法包括使用升高的温度和压力来减小烃的大小。可以使用大约800℃的升高的温度以及大约700kPa的升高的压力。这些条件产生“轻质（light）”烃，这是一个有时用来指富氢烃分子的术语（与光子通量区别），同时还通过缩合产生更重质的氢相对耗尽的烃分子。该方法论提供了均裂断裂或对称断裂并且产生烯，其可以是任选地如以上所述酶促饱和的。
在工厂中用于烃加工和炼油的催化方法和热方法是标准的。因此可以通过常规手段收集并且加工或精炼由在此所述的细胞产生的烃。参见Hillen等人（Biotechnology and Bioengineering（《生物技术与生物工程》），Vol.XXIV:193-205(1982)）关于微藻产生的烃的加氢裂解的报道。在可替代的实施例中，将该馏分用另一种催化剂处理，如有机化合物、热、和/或无机化合物。为了将脂质加工为生物柴油，在这一节中如以下描述使用酯交换方法。
通过本发明的方法产生的烃在多种工业应用中是有用的。例如，生产直链烷基苯磺酸盐（LAS）（一种在几乎所有类型的去污剂以及清洁用品中使用的阴离子表面活性剂）利用了通常包括10-14个碳原子链的烃。参见，例如，美国专利号6,946,430、5,506,201、6,692,730、6,268,517、6,020,509、6,140,302、5,080,848、以及5,567,359。表面活性剂，例如LAS，可以用在个人护理组合物和去污剂的制造中，如描述于美国专利号5,942,479、6,086,903、5,833,999、6,468,955、以及6,407,044中的那些。
日益增长的兴趣指向生物起源的烃组分在燃料（如生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料）中的用途，因为可以替代衍生自化石燃料的起始材料的可再生生物起始材料是可获得的，并且其使用是令人希望的。对用于从生物材料生产烃组分的方法存在迫切需要。本发明通过以下满足了这一需要：提供了使用通过在此描述的方法产生的脂质作为生物材料生产生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料的方法，从而生产生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料。
传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出物。它们具有宽至370°到780℉的沸程，适合在压燃式发动机中燃烧，如柴油发动机车辆。根据该沸程，连同可允许范围的其他燃料特性，如十六烷值、浊点、闪点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、灰分含量、铜片腐蚀、以及碳渣，美国试验与材料协会（American Society of Testing andMaterials）（ASTM）建立了柴油的等级。技术上，衍生自生物质或以别的方式符合适当的ASTM规范的任何烃馏出物材料可以定义为柴油燃料（ASTM D975）、喷气燃料（ASTM D1655），或如果它是脂肪酸甲酯则定义为生物柴油（ASTMD6751）。
在提取之后，可以使从在此描述的微生物生物质回收的脂质和/或烃组分经受化学处理以制造在柴油车辆或喷气发动机中使用的燃料。
生物柴油是一种颜色在金色与深棕色之间变化的液体，这取决于生产原料。它与水几乎不混溶，具有高沸点和低蒸汽压。生物柴油是指供在柴油发动机车辆中使用的等同柴油的加工燃料。生物柴油是可生物降解的并且是无毒的生物柴油胜过常规柴油燃料的一个另外的益处是较低的发动机磨损。典型地，生物柴油包含C14-C18烷基酯。多种方法将生物质或如在此描述地产生并分离的脂质转变为柴油燃料。生产生物柴油的一个优选方法是借助于如在此描述的脂质的酯交换反应。用于用作生物柴油的一种优选烷基酯是甲酯或乙酯。
在大多数现有的柴油发动机车辆中，通过在此描述的方法生产的生物柴油可以单独使用或以任何浓度与常规柴油燃料掺混使用。当与常规柴油燃料（石化柴油）掺混使用时，生物柴油可以从大约0.1%至大约99.9%存在。世界上许多地方使用被称为“B”因子的系统来说明生物柴油在任何燃料混合物中的量。例如，含有20%生物柴油的燃料被标识为B20。纯生物柴油被称为B100。
生物柴油还可以在家用或商用锅炉中用作加热燃料。现有的燃油锅炉可能含有橡胶部件并且可能需要转变以便靠生物柴油来运行。转变方法通常相对简单，包括将橡胶部件更换为合成部件，因为生物柴油是一种强溶剂。由于其强溶解能力，燃烧的生物柴油将增加锅炉的效率。生物柴油可以在柴油的配制品中用作添加剂以增加纯的超低硫柴油（ULSD）燃料的润滑性，超低硫柴油是有利的，因为它几乎不具有含硫量。生物柴油是一种比石化柴油更好的溶剂并且可以用来分解先前靠石化柴油运行的车辆的燃料管线中的残渣沉积物。
生物柴油可以通过包含在富油生物质中的甘油三酯的酯交换来生产。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产生物柴油的方法。在一个优选实施例中，用于生产生物柴油的方法包括以下步骤：(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)溶解含脂质微生物以产生一种溶解产物，(c)从该溶解的微生物分离脂质，并且(d)将该脂质组合物酯交换，由此产生了生物柴油。用于微生物生长、溶解微生物以产生溶解产物、在包含有机溶剂的介质中处理该溶解产物以形成异质混合物以及将该处理的溶解产物分离为脂质组合物的方法已经描述于上文并且也可以在生产生物柴油的方法中使用。
生物柴油的脂质谱通常与原料油的脂质谱高度类似。可以使通过这些方法提供的其他油以及本发明的组合物经受酯交换以产生具有多种脂质谱的生物柴油，这些脂质谱包括(a)至少4%C8-C14；(b)至少0.3%C8；(c)至少2%C10；(d)至少2%C12；以及(3)至少30%C8-C14。
脂质组合物可以经受酯交换以产生作为生物柴油有用的长链脂肪酸酯。优选的酯交换反应概述于下文并且包括碱催化的酯交换和使用重组脂肪酶的酯交换。在碱催化的酯交换方法中，在碱性催化剂（典型地是氢氧化钾）的存在下使三酰甘油酯与醇（如甲醇或乙醇）反应。这一反应形成甲酯或乙酯以及作为副产物的丙三醇（甘油）。
动物或植物油典型地是由甘油三酯构成的，甘油三酯是游离脂肪酸与三元醇甘油的酯。在酯交换中，用一种短链醇（如甲醇或乙醇）来替代三酰甘油酯（TAG）中的甘油。典型的反应方案如下：
Figure BDA00003613748600931
在这一反应中，用碱使醇去质子化以使其成为一种更强的亲核体。通常，使用非常过量（高达50倍）的乙醇或甲醇。通常，这一反应将极慢地进行或不进行。可以使用热，以及酸或碱来帮助该反应更快地进行。该酸或碱不被该酯交换反应消耗，因此它们不是反应物而是催化剂。使用碱催化技术已经生产了几乎所有的生物柴油，因为它仅要求低温低压并且产生了超过98%的转换率（其条件是起始油水分低并且不含脂肪酸）。
如以上所讨论，还已经使用一种酶（如脂肪酶）代替碱来进行酯交换。可以在例如室温至80℃之间的温度、以及大于1:1（优选大约3:1）的TAG与低级醇的摩尔比下进行脂肪酶催化的酯交换。适合在酯交换中使用的脂肪酶包括但不限于在表9中列出的那些。对于酯交换有用的脂肪酶的其他实例发现于例如美国专利号4,798,793、4,940,845、5,156,963、5,342,768、5,776,741以及WO89/01032中。这样的脂质肪酶包括但不限于由以下微生物产生的脂肪酶：根霉属、曲霉属、假丝酵母属、毛霉属、假单胞菌属、根毛霉属、假丝酵母属以及腐质霉属，以及胰脂肪酶。
表9.适合供酯交换中使用的脂肪酶。
Figure BDA00003613748600932
使用脂肪酶用于生产适合于生物柴油的脂肪酸酯的一个挑战是：脂肪酶的价格比强碱法所使用的氢氧化钠（NaOH）的价格高得多。已经通过使用可以再循环的固定化脂肪酶来解决这一挑战。然而，在循环持续一个最小的循环数之后必须维持固定化脂肪酶的活性，以允许基于脂肪酶的方法在生产成本方面与强碱法相竞争。固定化脂肪酶会遭受典型地在酯交换中使用的低级醇的毒害。美国专利号6,398,707（2002年6月4日颁布给Wu等人）描述了用于增强固定化脂肪酶活性以及再生具有降低活性的固定化脂肪酶的方法。一些适合的方法包括将固定化脂肪酶在具有不少于3的碳原子数目的醇中浸渍持续一段时间，优选从0.5-48小时，并且更优选从0.5-1.5小时。一些适合的方法包括将失活的固定化脂肪酶用具有不少于3的碳原子数目的醇进行洗涤并且然后将该失活的固定化脂肪酶浸渍在植物油中持续0.5-48小时。
在特定实施例中，在产生重组脂肪酶作用于其上的脂质的相同微生物中表达该重组脂肪酶。适合的重组脂肪酶包括在表9中列出的那些和/或具有在以上表9中列出的GenBank登录号的那些，或一种与在以上表9中列出的脂肪酶之一具有至少70%氨基酸一致性并且展现出脂肪酶活性的多肽。在另外的实施例中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、或者至少大约99%一致性的序列中，特此将所有序列通过引用进行结合，如同本文完全阐述。编码脂肪酶和选择性标记的DNA优选是密码子优化的cDNA。再编码用于在微藻种类中表达的基因的方法描述于美国专利7,135,290中。
针对生物柴油的国际通用标准是EN 14214。ASTM D6751是在美国和加拿大引用的最通用的生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214而在英国要求遵循BS EN14214。确定这些产品是否符合这些标准的基本工业测试典型地包括气相色谱、HPLC以及其他。符合质量标准的生物柴油是完全无毒的，具有大于50mL/kg的毒性度（LD50）。
虽然符合ASTM标准的生物柴油必须是无毒的，但是可以存在倾向于作为沉积物从溶液中结晶和/或沉淀和沉降的污染物。当在较低温度下使用柴油时，沉积物形成尤其是个问题。沉积物或沉淀物可以引起问题，如降低燃料流动、阻塞燃料线管、阻塞过滤器等。具体涉及去除生物柴油中的这些污染物和沉积物以便产生更高质量产品的方法是本领域熟知的。这样的方法的实例包括但不限于对油进行预处理以去除污染物（例如磷酸酯和游离脂肪酸）（例如脱胶、碱炼和二氧化硅吸附剂过滤）和冷过滤。冷过滤是一种特别研发以去除在生产之后存在于生物柴油中的任何微粒和沉积物的方法。这种方法冷却生物柴油并且过滤出当这种燃料在较低温度使用时可能形成的任何沉积物或沉淀物。这样一种方法在本领域内是熟知的并且描述于美国专利申请公开号2007-0175091中。适合的方法可以包括将生物柴油冷却至低于大约38℃的温度，使得杂质和污染物作为在生物柴油液体中的微粒沉淀出来。然后可以将硅藻土或其他过滤材料添加至冷却的生物柴油以形成浆料，然后可以将这种浆料通过压力叶（pressure leaf）滤机或其他类型的过滤器过滤以去除微粒。然后可以将过滤的生物柴油通过增泽过滤器（polish filter）以去除任何剩余的沉积物和硅藻土，从而产生最终的生物柴油产品。
实例9描述了使用来自Prototheca moriformis的甘油三酯油生产生物柴油。根据ASTM D6751 A1方法的冷浸过滤性（Cold Soak Filterability），在实例9中生产的生物柴油是300ml体积120秒。这种测试包括过滤300ml的B100，冷却至40℉持续16小时，允许加温至室温，并且在真空下使用0.7微米的具有不锈钢支撑的玻璃纤维过滤器进行过滤。可以对本发明的油进行酯交换以产生具有少于120秒、少于100秒、以及少于90秒的冷浸时间的生物柴油。
如果将在特别冷的温度中使用生物柴油，还可以使用后续过程。这样的过程包括冬化和分提。两种过程都被设计为通过降低浊点（生物柴油开始结晶的温度）来改进燃料的冷流和冬季性能。存在着冬化生物柴油的若干途径。一种途径是将生物柴油与石化柴油掺混。另一种途径是使用能够降低生物柴油的浊点的添加剂。另一种途径是通过在添加剂中混合并且允许饱和物结晶并且然后过滤出晶体而不加选择地去除饱和的甲酯。分提选择性地将甲酯分离成单独的组分或馏分，从而允许去除或者包含特定的甲酯。分提方法包括尿素分提、溶剂分提和热蒸馏。
由本发明的方法提供的另一种有价值的燃料是可再生柴油，其包含链烷，如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0以及C18:0并且因此是与生物柴油是可区别的。高质量的可再生柴油符合ASTM D975标准。由本发明的方法产生的脂质可以用作生产可再生柴油的原料。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产可再生柴油的方法。可以通过至少三个过程来生产可再生柴油：氢热处理（氢化处理）、加氢处理、以及间接液化。这些方法产生非酯馏出物。在这些过程期间，如在此描述所产生和分离的三酰甘油酯被转化成链烷。
在一个实施例中，用于生产可再生柴油的方法包括(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)将微生物溶解以产生溶解产物，(c)从该溶解的微生物分离脂质，以及(d)将该脂质脱氧和氢化处理以产生链烷，由此产生可再生柴油。适合于制造可再生柴油的脂质可以通过使用有机溶剂（如己烷）从微生物生物质提取，或通过其他方法（如描述于美国专利5,928,696中的那些）而获得。一些适合的方法可以包括机械压制和离心。
在一些方法中，首先将微生物脂质裂解连同将其氢化处理以分别降低碳链长度度和减少饱和双键。然后将该材料异构化，也连同将其氢化处理。然后通过蒸馏去除石脑油（naptha）部分，随后另外地蒸馏以蒸发并且蒸馏柴油燃料中的所希望的组分以符合ASTM D975标准，同时留下比所希望的组分更重的组分以便符合D975标准。化学修饰油（包括甘油三酯油）的氢化处理、加氢裂解、脱氧以及异构化方法在本领域内是熟知的。参见例如欧洲专利申请EP1741768(A1)、EP1741767(A1)、EP1682466(A1)、EP1640437(A1)、EP1681337(A1)、EP1795576(A1)、以及美国专利7,238,277、6,630,066、6,596,155、6,977,322、7,041,866、6,217,746、5,885,440、6,881,873。
在用于生产可再生柴油的方法的一个实施例中，产生链烷的脂质处理是通过脂质组合物的氢化处理来进行的。在氢热处理中，典型地，生物质是在升高的温度和压力下在水中发生反应以形成油和残留固体。转化温度典型地是300°到660℉，伴随足以保持水主要为液态的压力，100到170标准大气压（atm）。反应时间是近似15分钟至30分钟。在反应完成之后，从水中分离有机物。由此产生了适合于柴油的馏出物。
在制造可再生柴油的一些方法中，处理甘油三酯的第一步骤是加氢处理以使双键饱和，接着是在氢和催化剂存在下在升高的温度进行脱氧。在一些方法中，氢化和脱氧在同一个反应中发生。在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后任选地进行异构化，同样是在氢和催化剂的存在下进行。优选通过蒸馏去除石脑油组分。例如，参见美国专利5,475,160（甘油三酯的氢化）；5,091,116（脱氧、氢化以及脱气）；6,391,815（氢化）；以及5,888,947（异构化）。
一种适合的用于甘油三酯的氢化的方法包括制备铜、锌、镁以及镧盐的水溶液以及另外的碱金属溶液，或优选碳酸铵溶液。这两种溶液可以被加热至大约20℃至大约85℃的温度并且以使得沉淀容器中的pH维持在5.5与7.5之间的速率一起计量进入该沉淀容器，以便形成一种催化剂。另外的水可以最初用于该沉淀容器中或者与该盐溶液和沉淀溶液同时添加。然后将得到的沉淀物充分洗涤、干燥、在大约300℃煅烧并且在从大约100℃至大约400℃的温度范围在氢中进行活化。然后可以在反应器中在上述催化剂的存在下使一种或多种甘油三酯与氢接触并反应。该反应器可以是滴流床反应器、固定床气固反应器、填充的鼓泡塔反应器、连续搅拌槽反应器、浆液反应器、或在本领域内已知的任何其他适合的反应器类型。该过程可以分批或以连续方式进行。反应温度典型地是处于从大约170℃至大约250℃的范围，同时反应压力典型地是处于从大约300psig至大约2000psig的范围。而且，在本发明的该过程中的氢与甘油三酯的摩尔比典型地是处于从大约20:1至大约700:1的范围。该过程典型地是在范围从大约0.1hr-1至大约5hr-1的重量时空速度（WHSV）下进行。本领域的普通技术人员将认识到，反应所需要的时间期限将根据所使用的温度、氢与甘油三酯的摩尔比、以及氢分压而变化。通过这样的氢化过程产生的产物包括脂肪醇、甘油、痕量的石蜡以及未反应的甘油三酯。典型地通过常规手段将这些产物分离，例如像蒸馏、萃取、过滤、结晶，等等。
石油精炼厂使用加氢处理以便通过用氢处理进料来去除杂质。加氢处理转化温度典型地是300°至700℉。压力典型地是40至100个大气压。反应时间典型地是近似10分钟至60分钟。采用固体催化剂来增加某些反应速率、改进对于某些产物的选择性、以及优化氢消耗。
适合的用于油的脱氧的方法包括将一种油加热至大约350℉至大约550℉范围的温度并且在至少范围从大气压至大气压以上的压力下使该加热的油连续地与氮接触持续至少大约5分钟。
适合的用于异构化的方法包括使用碱异构化以及本领域内已知的其他油异构化。
氢化处理和加氢处理最终导致甘油三酯进料的分子量的减小。甘油三酯分子在加氢处理条件下被还原为四个烃分子：一个丙烷分子以三个较重的烃分子，典型地在C8至C18的范围。
因此，在一个实施例中，对本发明的脂质组合物进行的一种或多种化学反应的产物是包含ASTM D975可再生柴油的链烷混合物。通过微生物生产烃由Metzger等人Appl Microbiol Biotechnol（《应用微生物学与生物技术》）（2005）66:486-496以及A Look Back at the U.S.Department of Energy’s Aquatic Species Program:Biodieselfrom Algae（美国能源部水生生物计划回顾：来自藻类的生物柴油），NREL/TP-580-24190,John Sheehan,Terri Dunahay,John Benemann以及Paul Roessler（1998）综述。
根据T10-T90（分别是在10%与90%蒸馏体积处的温度）描述柴油燃料的蒸馏特性。从Prototheca moriformis甘油三酯油生产可再生柴油并且将其描述于实例9中。在实例9中产生的材料的T10-T90是57.9℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤），使用根据在此披露的方法生产的甘油三酯油来产生具有其他T10-T90范围（如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃以及65℃）的可再生柴油组合物。
在实例9中产生的材料的T10是242.1℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他T10值（如在180与295之间、在190与270之间、在210与250之间、在225与245之间、以及至少290的T10）的可再生柴油组合物。
在实例9中产生的材料的T90是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他T90值（如在280与380之间、在290与360之间、在300与350之间、在310与340之间、以及至少290的T90）的可再生柴油组合物。
在实例9中产生的材料的FBP是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他FBP值（如在290与400之间、在300与385之间、在310与370之间、在315与360之间、以及至少300的FBP）的可再生柴油组合物。
可以使通过本发明的方法和组合物提供的其他油经受氢化处理、异构化以及其他共价修饰的组合，这些油包括具有多种脂质谱的油，这些脂质谱包括(a)至少4%C8-C14；(b)至少0.3%C8；(c)至少2%C10；(d)至少2%C12；以及(3)至少30%C8-C14。
可以通过两步法从任何形式的生物质生产传统的超低硫柴油。首先，将该生物质转化为一种合成气，合成气是一种富含氢和一氧化碳的气体混合物。然后，将该合成气催化转化为液体。典型地，使用费歇尔-托罗普希（Fischer-Tropsch）（FT）合成来完成液体的产生。这一技术适用于煤、天然气、以及重油。因此，在用于生产可再生柴油的方法的又另一个优选实施例中，产生链烷的脂质组合物处理是通过对该脂质组合物进行间接液化来进行的。
本发明还提供了生产喷气燃料的方法。喷气燃料是澄明至稻草色的。最常见的燃料是一种基于无铅/石蜡油的、被分类为飞机A-1（Aeroplane A-1）的燃料，其按照一套国际标准化的规范生产。喷气燃料是大量的不同的烃的混合物，这些烃可能多达一千种或更多。它们的大小范围（分子量或碳数）受到对产品的要求的限制，例如凝固点或烟点。煤油型（Kerosone-type）飞机燃料（包括喷气A（Jet A）以及喷气A-1（Jet A-1））具有在大于8与16碳数之间的碳数分布。宽馏分以及石脑油类型的飞机燃料（包括喷气B（Jet B））典型地具有在大约5与15个碳之间的碳数分布。
两种飞机燃料（喷气A和喷气B）可以含有一些添加剂。有用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电剂、腐蚀抑制剂、以及燃料系统结冰抑制剂（FSII）。抗氧化剂预防胶质化并且通常基于烷基化苯酚，例如AO-30、AO-31、或AO-37。抗静电剂消散静电并且预防发电花。Stadis450是一个实例，其具有二壬基萘磺酸（DINNSA）作为活性成分。腐蚀抑制剂（例如DCI-4A）用于民用和军用燃料并且DCI-6A用于军用燃料。FSII剂包括例如Di-EGME。
在本发明的一个实施例中，喷气燃料是通过将藻类燃料与现有喷气燃料掺混而生产的。由本发明的方法产生的这些脂质可以用作生产喷气燃料的原料。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产喷气燃料的方法。同此提供了两种用于从这些通过本发明的方法产生的脂质来生产喷气燃料的方法：流化催化裂解（FCC）、以及加氢脱氧（HDO）。
流化催化裂解（FCC）是一种用来从重质粗馏分生产烯烃尤其是丙烯的方法。通过本发明的方法生产的脂质可以转化为烯烃。该过程包括使脂质流动通过FCC区并且收集由烯烃组成的产物流，其作为喷气燃料是有用的。将所产生的脂质在裂解条件下与裂解催化剂相接触以提供作为喷气燃料有用的包含烯烃和烃的产物流。
在一个实施例中，用于生产喷气燃料的方法包括(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)将该含脂质微生物溶解以产生溶解产物，(c)从该溶解产物分离脂质，并且(d)处理该脂质组合物，由此产生喷气燃料。在用于生产喷气燃料的方法的一个实施例中，可以使该脂质组合物流动通过一个流体催化裂解区，在一个实施例中，其包括使该脂质组合物在裂解条件下与裂解催化剂相接触以提供一种包含C2-C5烯烃的产物流。
在这种方法的某些实施例中，可能令人希望的是去除任何可能存在于该脂质组合物中的污染物。因此，在使该脂质组合物流动通过液体催化裂解区之前，将该脂质组合物进行处理。预处理可以涉及使该脂质组合物与一种离子交换树脂相接触。该离子交换树脂是一种酸性离子交换树脂，如AmberlystTM-15，并且可以在反应器中用作该脂质组合物流动通过（向上流动或向下流动）的床。其他预处理可以包括通过使该脂质组合物与酸（如硫酸、乙酸、硝酸、或盐酸）相接触而进行的温和酸洗。接触通常是在环境温度和大气压用稀释酸溶液来完成的。
任选地使预处理的脂质组合物流到FCC区，在此这些含烃组分被裂解为烯烃。催化裂解是通过使该脂质组合物在反应区内与由精细分散的微粒材料组成的催化剂相接触来完成的。与加氢裂解相反，该反应是催化裂解并且是在不添加氢或无氢消耗下进行的。随着该裂解反应的进行，大量的焦炭沉积在催化剂上。通过在一个再生区内燃烧来自该催化剂的焦炭在高温下再生该催化剂。含焦炭的催化剂（在此称为“积炭催化剂”）被从反应区连续地输送至再生区以进行再生并且被来自再生区的基本上无焦炭的再生催化剂替代。不同气体流对这些催化剂微粒的流化允许催化剂在反应区与再生区之间输送。用于在流化的催化剂流中裂解烃（如在此描述的脂质组合物中的那些）、在反应区与再生区之间输送催化剂、以及在再生器中燃烧焦炭的方法对于FCC过程领域内的技术人员是熟知的。示例性的FCC应用以及对于裂解脂质组合物以产生C2-C5烯烃有用的催化剂描述于美国专利号6,538,169、7,288,685中，通过引用以全文将其结合。
适合的FCC催化剂通常包括至少至少两种组分，它们可以在或可以不在相同基质上。在一些实施例中，两种组分都可以循环遍及整个反应容器。第一组分通常包括在流化催化裂解领域内使用的任何熟知催化剂，如活性无定形粘土型催化剂和/或高活性结晶分子筛。分子筛催化剂可以是比无定形催化剂更优选的，这是因为它们的相对于所希望的产物的大大改进的选择性。在一些优选的实施例中，沸石可以用作FCC过程中的分子筛。优选地，该第一催化剂组分包括大孔沸石，如Y型沸石、活性氧化铝材料、粘合剂材料，包括二氧化硅或氧化铝以及惰性填料（如高岭土）。
在一个实施例中，裂解本发明的脂质组合物发生在FCC区的提升管段（risersection）或可替代地提升器部分（lift section）。通过一个喷嘴将脂质组合物引入该提升管，导致脂质组合物的迅速蒸发。在接触催化剂之前，脂质组合物一般将具有大约149℃至大约316℃（300℉至600℉）的温度。催化剂从掺混容器流到提升管，在此它与脂质组合物接触大约2秒或更少的时间。
然后将掺混的催化剂和反应的脂质组合物蒸气通过一个出口从提升管的顶部释放并且分离成包含烯烃的裂解产物蒸气流以及一批覆盖有大量焦炭并且通常被称为“积炭催化剂”的催化剂颗粒。在最小化脂质组合物与催化剂的接触时间的努力中（可以促进所希望的产物另外转化为不希望的其他产物），可以使用任何分离器安排（如涡旋臂安排）以从产物流中迅速去除积炭催化剂。该分离器，例如涡旋臂分离器，被定位在一个腔的上部分，该腔具有一个位于该腔的下部分的汽提区（strippingzone）。通过该涡旋臂安排分离的催化剂落下到该汽提区中。包括裂解的烃（包括低碳烯烃）的裂解产物蒸气流和某一催化剂经由一个管道从该腔排出，该管道与旋风分离器连通。这些旋风分离器从该产物蒸气流去除剩余的催化剂颗粒以将颗粒浓度降低至极低水平。然后该产物蒸气流从分离容器的顶部排出。通过这些旋风分离器分离的催化剂返回到分离容器并且然后到达汽提区。汽提区通过与流的逆流接触将来自催化剂表面的吸附的烃去除。
低的烃分压起作用以有利于低碳烯烃的产生。因此，提升管压力被设置在大约172至241kPa（25至35磅/平方英寸(绝对压力）），具有大约35至172kPa（5至25磅/平方英寸(绝对压力））的烃分压，具有优选的大约69至138kPa（10至20磅/平方英寸(绝对压力））的烃分压。这种相对低的烃分压是通过使用流作为稀释剂达到这种程度而实现的：该稀释剂是脂质组合物的10wt%至55wt%并且优选是脂质组合物的大约15wt%。其他稀释剂，如干气，可以用来达到等同的烃分压。
在提升管出口的裂解流的温度将是大约510℃至621℃（950℉至1150℉）。然而，566℃（1050℉）以上的提升管出口温度产生更多的干气和更多的烯烃。然而，566℃（1050℉）以上的提升管出口温度产生更少的乙烯和丙烯。因此，在大约566℃至大约630℃的优选温度、在大约138kPa至大约240kPa（20至35磅/平方英寸(绝对压力））的优选压力下运行FCC过程是优选的。用于该过程的其他条件是催化剂与脂质组合物的比率，其可以从大约5至大约20并且优选是从大约10至大约15而变化。
在用于生产喷气燃料的方法的一个实施例中，脂质组合物被引入FCC反应器的提升器部分。提升器部分的温度会非常热并且范围是从大约700℃（1292℉）至大约760℃（1400℉），具有大约100至大约150的催化剂与脂质组合物比率。预期的是，将脂质组合物引入提升器部分将产生大量的丙烯和乙烯。
在使用脂质组合物或如在此描述所产生的脂质而生产喷气燃料的方法的另一个实施例中，该脂质组合物或脂质的结构是通过一种被称为加氢脱氧（HDO）的过程而破坏的。HDO表示借助于氢来去除氧，即，在破坏该材料的结构时氧被去除。烯属双键被氢化并且任何硫或氮化合物被去除。硫去除被称作加氢脱硫（HDS）。原料（脂质组合物或脂质）的预处理和纯化有助于催化剂的使用寿命。
通常在HDO/HDS步骤中，将氢与原料（脂质组合物或脂质）混合并且然后使该混合物作为并向流、或者作为单相或两相原料通过催化剂床。在HDO/MDS步骤之后，将产物馏分分离并且传送到一个分开的异构化反应器。用于生物起始材料的异构化反应器作为一种并流反应器（co-current reactor）描述于文献（FI 100 248）中。
用于通过氢化烃进料（例如，在此处的脂质组合物或脂质）而生产燃料的方法还可以通过以下来进行：使该脂质组合物或脂质作为与氢气的并流通过一个第一氢化区，并且其后通过使氢气作为相对于烃流出物的逆流经过一个第二氢化区而使该烃流出物进一步在该第二氢化区中氢化。示例性的HDO应用以及对于裂解脂质组合物以产生C2-C5烯烃有用的催化剂描述于美国专利号7,232,935中，通过引用以其全文进行结合。
典型地，在加氢脱氧步骤中，生物学组分（如在此处的脂质组合物或脂质）的结构被分解，氧、氮、磷以及硫化合物、以及作为气体的轻烃被去除，并且烯属键被氢化。在该过程的第二个步骤中，即，在所谓的异构化步骤中，进行异构化以便支化烃链并且改进石蜡在低温下的性能。
在该裂解过程的第一个步骤中，即HDO步骤，将氢气以及在此处的有待氢化的脂质组合物和脂质作为并流或逆流传送到HDO催化剂床系统，所述催化剂床系统包括一个或多个催化剂床，优选是1-3个催化剂床。该HDO步骤典型地是以并流方式运行的。在HDO催化剂床系统包括两个或更多个催化剂床的情况下，可以利用逆流原理对这些床中的一个或多个进行操作。在该HDO步骤中，压力在20巴与150巴之间、优选在50巴与100巴之间变化，并且温度是在200℃与500℃之间、优选在300℃-400℃的范围内变化。在该HDO步骤中，可以使用已知的、含有来自周期系统的VII族和/或VIB族金属的氢化催化剂。优选地，这些氢化催化剂是负载有Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo的催化剂，载体是氧化铝和/或二氧化硅。典型地，使用NiMo/Al2O3和CoMo/Al2O3催化剂。
在该HDO步骤之前，可以任选地通过在较温和的条件下预氢化来处理在此处的脂质组合物和脂质，由此避免这些双键的副反应。这样的预氢化是在预氢化催化剂的存在下、在50℃-400℃的温度以及在1-200巴的氢压（优选在150℃与250℃之间的温度以及在10巴与100巴之间的氢压）进行的。该催化剂可以含有来自周期系统的VIII族和/或VIB族金属。优选地，该预氢化催化剂是负载有Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo的催化剂，载体是氧化铝和/或二氧化硅。
将来自该HDO步骤的含有氢的气体流进行冷却并且然后从其中去除一氧化碳、二氧化碳、氮、磷以及硫化合物、气态轻烃以及其他杂质。在压缩之后，将经纯化的氢或再循环的氢返回至该第一催化剂床和/或这些催化剂床之间以补偿退出的气流。从凝聚的液体中去除水。将该液体传送到该第一催化剂床或这些催化剂床之间。
在该HDO步骤之后，使产物经受异构化步骤。对于该过程而言重要的是在烃与异构化催化剂接触之前尽可能完全去除杂质。该异构化步骤包括一个任选的汽提步骤，其中可以通过用水蒸气或适合的气体（如轻烃、氮或氢）进行汽提而纯化来自该HDO步骤的反应产物。该任选的汽提步骤是以逆流方式在异构化催化剂上游的一个单元中进行的，其中气体与液体彼此接触，或者在利用逆流原理的分开的汽提单元中的实际异构化反应器之前进行。
在该汽提步骤之后，将氢气以及在此处的氢化脂质组合物或脂质、以及任选地n-石蜡混合物传送到包括一个或多个催化剂床的反应性异构化单元。该异构化步骤的这些催化剂床可以按并流或逆流方式进行操作。
对于该过程而言重要的是逆流原理在该异构化步骤中适用。在该异构化步骤中，这是通过以逆流方式进行该任选的汽提步骤或该异构化反应步骤或两者来完成的。在该异构化步骤中，压力在20-150巴范围内、优选是在20-100巴范围内变化，温度是在200℃与500℃之间、优选是在300℃与400℃之间变化。在该异构化步骤中，可以使用在本领域内已知的异构化催化剂。适合的异构化催化剂含有分子筛和/或来自VII族的金属和/或载体。优选地，该异构化催化剂含有SAPO-11或SAPO41或ZSM-22或ZSM-23或镁碱沸石以及Pt、Pd或Ni以及Al2O3或SiO2。典型的异构化催化剂是例如Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、Pt/ZSM-23/Al2O3以及Pt/SAPO-11/SiO2。该异构化步骤和该HDO步骤可以在同一个压力容器中或在分开的压力容器中进行。任选的预氢化可以在分开的压力容器中或在同一个压力容器中进行，如同HDO和异构化步骤。
因此，在一个实施例中，一种或多种化学反应的产物是包含HRJ-5的链烷混合物。在另一个实施例中，一种或多种化学反应的产物是包含ASTM D1655喷气燃料的链烷混合物。在一些实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有低于10ppm的含硫量。在其他实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有低于205℃的蒸馏曲线的T10值。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有低于300℃的终沸点（FBP）。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有至少38℃的闪点。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有在775K/M3与840K/M3之间的密度。在又另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有至少42.8MJ/K的燃烧热。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有至少13.4质量%的氢含量。在另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有在260℃的热稳定性，如通过定量重量分析JFTOT在低于3mm的Hg所测试的。在又另一个实施例中，符合ASTM1655喷气燃料的规范的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。
因此，本发明披露了多种方法，其中进行微藻脂质的化学修饰以产生在多种工业和其他应用中有用的产物。用于修饰由在此披露的方法产生的油的方法的实例包括但不限于，油的水解、油的加氢处理和油的酯化。微藻脂质的其他化学修饰包括而不限于包括而不限于环氧化、氧化、水解、硫酸盐化、磺化、乙氧基化、丙氧基化、酰胺化和皂化。微藻油的修饰产生基础油脂化学品，这些油脂化学品可以进一步修饰为针对所希望的功能而选择的衍生油脂化学品。以与关于燃料生产方法的以上描述类似的方式，也可以对从在此描述的微生物培养物中产生的油进行这些化学修饰。基础油脂化学品的实例包括但不限于肥皂、脂肪酸、脂肪酯、脂肪醇、脂族氮化合物、脂肪酸甲酯、以及甘油。衍生油脂化学品的实例包括但不限于脂肪腈、酯类、二聚酸、季铵化合物、表面活性剂、脂肪酸烷醇酰胺、脂肪醇硫酸酯、树脂、乳化剂、脂肪醇、烯烃、钻井泥浆、多元醇、聚氨酯、聚丙烯酸酯、橡胶、蜡烛、化妆品、金属皂、肥皂、α-磺化甲酯、脂肪醇硫酸酯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇醚硫酸盐、咪唑啉、表面活性剂、去污剂、酯类、季铵化合物、臭氧分解产物、脂肪胺、脂肪酸烷醇酰胺、乙氧基硫酸盐、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯（包括中链甘油三酯）、润滑剂、液压流体、润滑脂、介电流体、脱模剂、金属加工液、传热流体、其他功能性流体、工业化学品（例如，清洁剂、纺织加工助剂、增塑剂、稳定剂、添加剂）、表面涂层、涂料（paint）以及清漆（lacquer）、电气布线绝缘材料、以及较高级链烷。
来自通过本发明的方法产生的甘油酯的脂肪酸组分的水解产生游离脂肪酸，这些脂肪酸可以被衍生化以产生其他有用的化学品。水解在水和催化剂（可以是酸或碱）的存在下发生。这些释放的游离脂肪酸可以被衍生化以产生多种产物，如在以下文献中报道的：美国专利号5,304,664（高度硫酸化的脂肪酸）、7,262,158（清洁组合物）、7,115,173（织物柔软剂组合物）、6,342,208（用于处理皮肤的乳剂）、7,264,886（拒水组合物）、6,924,333（涂料添加剂）、6,596,768（脂质富集的反刍动物原料）、以及6,380,410（用于去污剂和清洁剂的表面活性剂）。
关于水解，在本发明的一个实施例中，甘油三酯油任选地首先在一种液体介质（如水或氢氧化钠）中水解以获得甘油和肥皂。存在着各种适合的甘油三酯水解方法，包括但不限于皂化、酸水解、碱水解、酶水解（在此称为裂解）、以及使用加压热水的水解。本领域内的技术人员将认识到，为了产生油脂化学品，甘油三酯油不需要水解；相反，这种油可以通过其他已知的过程直接转化为所希望的油脂化学品。例如，甘油三酯油可以通过酯化直接转化为脂肪酸甲酯。
在一些实施例中，由在此披露的方法产生的油的催化水解通过将该油裂解为甘油和脂肪酸而发生。如以上所讨论的，然后可以通过一些其他修饰进一步加工这些脂肪酸以获得衍生油脂化学品。例如，在一个实施例中，这些脂肪酸可以经历胺化反应以产生脂族氮化合物。在另一个实施例中，这些脂肪酸可以经历臭氧分解以产生一元酸或二元酸。
在其他实施例中，水解可以经由在此产生的油的裂解而发生，从而产生油脂化学品。在本发明的一些优选实施例中，甘油三酯油可以在其他过程之前裂解。本领域的技术人员将认识到，存在着许多适合的甘油三酯裂解方法，包括但不限于酶裂解以及加压裂解。
通常，酶促的油裂解方法使用酶（脂肪酶）作为作用于水/油混合物的生物催化剂。然后酶裂解将油或脂肪分别裂解为甘油或游离脂肪酸。然后甘油迁移至水相中，而有机相富集有游离脂肪酸。
这些酶裂解反应通常在有机相与水相之间的相界处发生，其中酶仅存在于相界处。然后遇到相界的甘油三酯促成或参与裂解反应。随着反应进行，与游离脂肪酸相比，仍然化学键合为甘油酯的脂肪酸的占有密度或浓度在相界处减少，使得反应减慢。在某些实施例中，酶裂解可以在室温发生。本领域的普通技术人员将知道适合的用于将油裂解为所希望的脂肪酸的条件。
作为实例，可以通过增加界面边界表面来加速反应速度。一旦反应完成，则将游离脂肪酸从不含酶的有机相中分离，并且将仍然含有化学键合为甘油酯的脂肪酸的残余物进行反馈或再循环并与有待经受裂解的新鲜油或脂肪混合。以这种方式，然后将再循环的甘油酯经受另外的酶裂解过程。在一些实施例中，以这样一种方式从部分裂解的油或脂肪中提取游离脂肪酸。以那种方式，如果将这些化学键合的脂肪酸（甘油三酯）返回或反馈进入该裂解过程，则酶消耗可以大幅减少。
裂解程度测定为测量的酸值除以理论上可能的酸值的比率，对于一种给定的油或脂肪而言，这可以计算。优选地，酸值是根据通用标准方法通过滴定而测量的。可替代地，可以将含水甘油相的密度当作裂解程度的量度。
在一个实施例中，在此描述的裂解过程还适合于裂解包含在来自这些产生的油的碱精炼过程的所谓的皂料中的甘油单酯、甘油二酯以及甘油三酯。以这种方式，可以将该皂料定量转化，无需事先将中性油皂化为脂肪酸。出于这个目的，优选地在裂解之前通过加入酸来释放化学键合在皂料中的脂肪酸。在某些实施例中，除了用于裂解过程的水和酶之外，使用一种缓冲溶液。
在一个实施例中，还可以使根据本发明的方法所产生的油经受皂化作用（作为一种水解方法）。动物或植物油典型地是由三酰甘油（TAG）构成，三酰甘油是脂肪酸与三元醇（甘油）的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被去除，留下三羧酸阴离子，这些三羧酸阴离子能与碱金属阳离子（如钠或钾）缔合而产生脂肪酸盐。在这种方案中，这些羧酸组分被从甘油部分上切割并且被用基基团替代。在该反应中使用的碱（例如，KOH）的量是由所希望的皂化度决定的。如果目的是例如生产一种含有一些最初存在于TAG组合物中的油类的肥皂产品，则将不足以把所有TAG转化为脂肪酸盐的碱量引入反应混合物中。通常，这种反应是在一种水溶液中进行的并且进展缓慢，但是可以通过加热而加快。可以通过向反应混合物中添加盐（如水溶性碱金属卤化物（例如，NaCl或KCl））来促进脂肪酸盐的沉淀。优选地，该碱是一种碱金属氢氧化物，如NaOH或KOH。可替代地，可以在该反应方案中使用其他碱，如烷醇胺，包括例如三乙醇胺以及氨甲基丙醇。在一些情况下，这些可替代物可以优先地产生一种透明肥皂产品。在一个实施例中，经受皂化的脂质组合物是如在此描述而产生的动物脂模拟物（即，类似于动物脂的脂质组合物）或动物脂模拟物与另一种甘油三酯油的掺混物。
在一些方法中，化学修饰的第一步可以是加氢处理以使双键饱和，接着是在氢和催化剂存在下在升高的温度进行脱氧。在其他方法中，氢化和脱氧可以在同一反应中发生。仍然在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后可以任选地进行异构化，同样在氢和催化剂的存在下进行。最后，如果希望的话，可以去除气体和石脑油。例如，参见美国专利5,475,160（甘油三酯的氢化）、5,091,116（脱氧、氢化以及脱气）、6,391,815（氢化）、以及5,888,947（异构化）。
在本发明的一些实施例中，甘油三酯油被部分或完全脱氧。这些脱氧反应形成所希望的产物，包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、多元醇、酮、以及醛。通常，不受任何特定的理论限制，这些脱氧反应涉及各种不同反应途径的组合，包括但不限于：氢解、氢化、连续的氢化-氢解、连续的氢解-氢化、以及组合的氢化-氢解反应，其导致氧从脂肪酸或脂肪酸酯中至少部分去除以产生可以通过进一步加工而容易地转化为所希望的化学品的反应产物，如脂肪醇。例如，在一个实施例中，可以通过FCC反应将脂肪醇转化为烯烃或通过缩合反应转化为高级链烷。
一种这样的化学修饰是氢化，氢化是将氢加成至甘油酯的或游离脂肪酸的脂肪酸组分中的双键。氢化过程允许液体油转化成半固体或固体脂肪，其更适合于特定应用。
由在此描述的方法产生的油的氢化可以与在此提供的一种或多种方法和/或材料结合进行，如在以下文献中报道：美国专利号7,288,278（食品添加剂或药剂）、5,346,724（润滑产品）、5,475,160（脂肪醇）、5,091,116（食用油）、6,808,737（用于人造黄油或涂抹食品的结构性脂肪）、5,298,637（卡路里降低的脂肪代用品）、6,391,815（氢化催化剂乙基以及硫吸附剂）、5,233,099和5,233,100（脂肪醇）、4,584,139（氢化催化剂）、6,057,375（泡沫抑制剂）、以及7,118,773（可食用乳液涂抹食品）。
本领域的技术人员将认识到可以使用各种方法将碳水化合物氢化。一种适合的方法包括使碳水化合物与氢或与混合有适合的气体或催化剂的氢在氢化反应器中在足以形成氢化产物的条件下接触。氢化催化剂通常可以包括Cu、Re、Ni、Fe、Co、Ru、Pd、Rh、Pt、Os、Ir、以及其合金或任何组合，其可以是单独的或具有促进剂（如W、Mo、Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、B、P、Bi、以及其合金或任何组合）。其他有效的氢化催化材料包括负载型镍或用铼修饰的钌。在一个实施例中，取决于所希望的催化剂的官能度，该氢化催化剂还包括任何一种载体。可以通过本领域的普通技术人员已知的方法来制备这些氢化催化剂。
在一些实施例中，氢化催化剂包括负载型VIII族金属催化剂和金属海绵材料（例如，海绵镍催化剂）。拉尼镍提供了一个适合于在本发明中使用的活化的海绵镍催化剂的实例。在其他实施例中，本发明的氢化反应是使用一种包含镍-铼催化剂或钨修饰的镍催化剂的催化剂来进行的。适合的用于本发明的氢化反应的催化剂的一个实例是碳负载型镍-铼催化剂。
在一个实施例中，适合的拉尼镍催化剂可以通过以下来制备：用水性碱溶液（例如，含有大约25重量%的氢氧化钠）处理按重量计大致等量的镍和铝的合金。铝被水性碱溶液选择性地溶解，产生主要包含镍并带有少量铝的海绵状材料。最初的合金包括一定量的促进剂金属（即，钼或铬），该量使得大约1重量%至2重量%保留在所形成的海绵镍催化剂中。在另一个实施例中，使用浸透适合的载体材料的在水中的亚硝酰硝酸钌(III)、氯化钌(III)溶液来制备该氢化催化剂。然后将该溶液干燥以形成一种具有低于按重量计大约1%的含水量的固体。然后可以将该固体在大气压、在氢气流中、在300℃（非煅烧的）或400℃（煅烧的）、在旋转球炉（rotary ballfurnace）中还原4小时。在冷却并用氮气致使该催化剂具有惰性之后，使氮气中按体积计5%的氧在催化剂上流过持续2小时。
在某些实施例中，描述的催化剂包括一种催化剂载体。该催化剂载体稳定并负载该催化剂。所使用的催化剂载体的类型取决于所选择的催化剂和反应条件。适合的用于本发明的载体包括但不限于碳、二氧化硅、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、二氧化钛、二氧化铈、氧化钒、氮化物、一氮化硼、杂多酸、羟基磷灰石、氧化锌、氧化铬、沸石、碳纳米管、碳富勒烯以及其任何组合。
可以使用本领域已知的那些常规方法来制备在本发明中使用的催化剂。适合的方法可以包括但不限于初期润湿、蒸发浸透、化学气相沉积、喷涂式包衣（wash-coating）、磁控溅射技术，等等。
用于进行氢化反应的条件将根据起始材料的类型和所希望的产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到适当的反应条件。通常，氢化反应是在80℃至250℃、并且优选在90℃至200℃、并且最优选在100℃至150℃的温度下进行的。在一些实施例中，氢化反应是在500KPa至14000KPa的压力下进行的。
在在本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、再循环氢、原位产生的氢、以及其任何组合。如在此使用的，术语“外部氢”是指不是源自生物质反应本身而是从另一种来源加入到系统中的氢。
在本发明的一些实施例中，令人希望的是将起始碳水化合物转化为一种较小的分子，该分子更容易转化为所希望的较高级烃。一种适合的用于这种转化的方法是借助于氢解反应。已知多种方法可以用于进行碳水化合物的氢解。一种适合的方法包括使碳水化合物与氢或与混合有适合的气体或氢解催化剂的氢在氢解反应器中在足以形成包含较小的分子或多元醇的反应产物的条件下接触。在此，术语“较小的分子或多元醇”包括具有较小的分子量的任何分子，这些分子可以包含比起始碳水化合物更少数目的碳原子或氧原子。在一个实施例中，这些反应产物包括包含多元醇和醇的较小的分子。本领域的普通技术人员将能够选择适当的藉此进行氢解反应的方法。
在一些实施例中，可以使用一种氢解催化剂将5和/或6碳糖或糖醇转化为丙二醇、乙二醇、以及甘油。氢解催化剂可以包括Cr、Mo、W、Re、Mn、Cu、Cd、Fe、Co、Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Ir、Os、以及其合金或任何组合，其可以是单独的或具有促进剂（如Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、Bi、B、O、以及其合金或任何组合）。氢解催化剂还可以包括一种含有过渡金属（例如，铬、钼、钨、铼、锰、铜、镉）或VIII族金属（例如，铁、钴、镍、铂、钯、铑、钌、铱、以及锇）的含碳焦化聚合物催化剂（carbonaceous pyropolymer catalyst）。在某些实施例中，氢解催化剂可以包括与碱土金属氧化物结合的或附着至催化活性载体上的任何以上金属。在某些实施例中，在氢解反应中的所描述的催化剂可以包括一种如在以上描述的用于氢化反应的催化剂载体。
用于进行氢解反应的条件将根据起始材料的类型和所希望产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到用来进行该反应的适当条件。通常，氢解反应是在110℃至300℃、并且优选在170℃至220℃、并且最优选在200℃至225℃的温度下进行的。在一些实施例中，氢解反应是在碱性条件下、优选在8至13的pH、并且甚至更优选在10至12的pH下进行的。在一些实施例中，氢解反应是在60KPa与16500KPa之间的范围、并且优选在1700KPa与14000KPa之间的范围、并且甚至更优选在4800KPa与11000KPa之间的范围的压力下进行的。
在本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、再循环氢、原位产生的氢、以及其任何组合。
在一些实施例中，可以在缩合反应器中通过缩合反应将以上讨论的反应产物转化为高级烃。在这样的实施例中，这些反应产物的缩合在一种能够形成高级烃的催化剂的存在下发生。虽然不意图受理论限制，但是认为高级烃的产生通过逐步加成反应而进行，包括碳-碳或碳-氧键的形成。所得到的反应产物包括含有这些部分的任何数目的化合物，如在以下更详细描述。
在某些实施例中，适合的缩合催化剂包括酸催化剂、碱催化剂、或酸/碱催化剂。如在此所使用的，术语“酸/碱催化剂”是指具有酸和碱官能度两者的催化剂。在一些实施例中，缩合催化剂可以包括但不限于沸石、碳化物、氮化物、氧化锆、氧化铝、二氧化硅、铝硅酸盐、磷酸盐、氧化钛、氧化锌、氧化钒、氧化镧、氧化钇、氧化钪、氧化镁、氧化铈、氧化钡、氧化钙、氢氧化物、杂多酸、无机酸、酸改性树脂、碱改性树脂、以及其任何组合。在一些实施例中，缩合催化剂还可以包括一种改性剂。适合的改性剂包括La、Y、Sc、P、B、Bi、Li、Na、K、Rb、Cs、Mg、Ca、Sr、Ba、及其任何组合。在一些实施例中，缩合催化剂还可以包括一种金属。适合的金属包括Cu、Ag、Au、Pt、Ni、Fe、Co、Ru、Zn、Cd、Ga、In、Rh、Pd、Ir、Re、Mn、Cr、Mo、W、Sn、Os、合金、以及其任何组合。
在某些实施例中，在缩合反应中所描述的催化剂可以包括一种如在以上描述的用于氢化反应的催化剂载体。在某些实施例中，缩合催化剂是自负载的。如在此所使用的，术语“自负载”表示该催化剂不需要另一种材料作为载体。在其他实施例中，该缩合催化剂与一种分开的适合于悬浮该催化剂的载体结合使用。在一个实施例中，该缩合催化剂载体是二氧化硅。
缩合反应在其下发生的条件将根据起始材料的类型和所希望的产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到用来进行该反应的适当条件。在一些实施例中，该缩合反应是在对于所提出的反应的热力学是有利的一个温度下进行的。缩合反应的温度将根据特定的起始多元醇或醇而变化。在一些实施例中，缩合反应的温度是在从80℃至500℃、并且优选从125℃至450℃、并且最优选从125℃至250℃的范围内。在一些实施例中，缩合反应是在0KPa与9000KPa之间的范围、并且优选在0KPa与7000KPa之间的范围、并且甚至更优选在0KPa与5000KPa之间的范围的压力下进行的。
由本发明形成的高级链烷包括但不限于具有从4至30个碳原子的支链或直链链烷、具有从4至30个碳原子的支链或直链烯、具有从5至30个碳原子的环烷、具有从5至30个碳原子的环烯、芳基、稠和芳基、醇、以及酮。适合的链烷包括但不限于丁烷、戊烷、戊烯、2-甲基丁烷、己烷、己烯、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2,-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烯、辛烷、辛烯、2,2,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基己烷、2,3,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基戊烷、壬烷、壬烯、癸烷、癸烯、十一烷、十一烯、十二烷、十二烯、十三烷、十三烯、十四烷、十四烯、十五烷、十五烯、壬基癸烷、壬基癸烯、二十烷、二十烯、二十一烷、二十一烯、二十二烷、二十二烯、二十三烷、二十三烯、二十四烷、二十四烯、以及其异构体。这些产物中的一些可以适合用作燃料。
在一些实施例中，这些环烷和环烯是未经取代的。在其他实施例中，这些环烷和环烯是单取代的。仍然在其他实施例中，这些环烷和环烯是多取代的。在包含取代的环烷和环烯的实施例中，这些取代的基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基、以及其任何组合。适合的环烷和环烯包括但不限于环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、甲基-环戊烷、甲基-环戊烯、乙基-环戊烷、乙基-环戊烯、乙基-环己烷、乙基-环己烯、其异构体以及任何组合。
在一些实施例中，所形成的芳基是未取代的。在另一个实施例中，所形成的芳基是单取代的。在包含取代的芳基的实施例中，这些取代的基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基、以及其任何组合。适合的用于本发明的芳基包括但不限于苯、甲苯、二甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、以及其任何组合。
在本发明中产生的醇具有从4至30个碳原子。在一些实施例中，这些醇是环状的。在其他实施例中，这些醇是支链的。在另一个实施例中，这些醇是直链的。适合的用于本发明的醇包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、庚基癸醇、辛基癸醇、壬基癸醇、二十醇、二十一醇（uneicosanol）、二十二醇（doeicosanol）、二十三醇（trieicosanol）、二十四醇（tetraeicosanol）、以及其异构体。
本发明中产生的酮具有从4至30个碳原子。在一个实施例中，这些酮是环状的。在另一个实施例中，这些酮是支链的。在另一个实施例中，这些酮是直链的。适合的用于本发明的酮包括但不限于丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十一烷酮、十二烷酮、十三烷酮、十四烷酮、十五烷酮、十六烷酮、庚基癸酮、辛基癸酮、壬基癸酮、二十烷酮、二十一烷酮（uneicosanone）、二十二烷酮（doeicosanone）、二十三烷酮（trieicosanone）、二十四烷酮（tetraeicosanone）、以及其异构体。
另一种这样的化学修饰是酯交换。天然产生的甘油脂不具有脂肪酸组分的均匀分布。在油的情况下，酯交换是指在不同甘油酯的两个酯之间的酰基的交换。该酯交换程序提供了一种机制，通过该机制可以将甘油酯混合物的脂肪酸组分重排以改变分布模式。酯交换是一种熟知的化学过程，并且通常包括在一种催化剂的存在下（如碱金属或碱金属烷基化物（例如，甲醇钠））将油的混合物加热（至大约200℃）持续一段时间（例如，30分钟）。这个过程可以用来使一种油混合物的脂肪酸组分的分布模式随机化，或者可以指向产生所希望的分布模式。可以对在此提供的材料（如具有至少20%细胞干重的脂质的微生物生物质）进行脂质的这种化学修饰方法。
可以通过将油混合物维持在低于可能出现的一些TAG的熔点以下的温度来进行定向酯交换（其中寻求一种特定的脂肪酸分布模式）。这导致这些TAG的选择性结晶，从而有效地随着它们结晶而将其从反应混合物中去除。例如，该过程可以继续直到油中的大多数脂肪酸已经沉淀。定向酯交换可以用来例如通过用较短链对应物取代较长链脂肪酸来生产一种具有较低卡路里含量的产物。定向酯交换还可以用来生产一种具有脂肪混合物的产物，该产物可以提供在食品添加剂或产品（例如，人造黄油）中寻求的所希望的熔化特性和结构特征，无需借助于氢化，氢化可能产生不需要的反式异构体。
由在此描述的方法产生的油的酯交换可以与一种或多种方法和/或材料结合进行，或产生如在以下文献中报道的产品：美国专利号6,080,853（不易消化的脂肪代用品）、4,288,378（花生酱稳定剂）、5,391,383（食用喷淋油（Edible sprayoil））、6,022,577（用于食品的食用脂肪）、5,434,278（用于食品的食用脂肪）、5,268,192（低卡路里坚果产品）、5,258,197（卡路里降低的食用组合物）、4,335,156（食用脂肪产品）、7,288,278（食品添加剂或药剂）、7,115,760（分提方法）、6,808,737（结构脂肪）、5,888,947（发动机润滑剂）、5,686,131（食用油混合物）、以及4,603,188（固化的氨基甲酸乙酯组合物）。
在根据本发明的一个实施例中，如以上描述的油的酯交换后继之为酯交换的产物与多元醇的反应（如在美国专利号6,465,642中报道）以产生多元醇脂肪酸聚酯。这样一种酯化与分离过程可以包括以下步骤：在肥皂的存在下使一种低级烷基酯与多元醇反应；从产物混合物中去除残余的肥皂；水洗并且干燥产物混合物以去除杂质；漂白产物混合物用于精炼；将至少一部分未反应的低级烷基酯与产物混合物中的多元醇脂肪酸聚酯分离；并且将分离的未反应的低级烷基酯进行再循环。
还可以对具有短链脂肪酸酯的微生物生物质进行酯交换，如在美国专利6,278,006中报道的。通常，可以通过在一种适合的催化剂存在下将一种短链脂肪酸酯添加至一种油并且加热该混合物来进行酯交换。在一些实施例中，该油构成了按重量计该反应混合物的大约5%至大约90%。在一些实施例中，该短链脂肪酸酯构成了按重量计该反应混合物的大约10%至大约50%。催化剂的非限制性实例包括碱催化剂；甲醇钠；酸催化剂，包括无机酸（如硫酸）与酸化粘土，有机酸，如甲磺酸、甲磺酸、以及甲苯磺酸，以及酸性树脂，如Amberlyst15。金属（如钠与镁）、以及金属氢化物也是有用的催化剂。
另一种这样的化学修饰是羟化，其包括将水加成至双键，从而导致饱和以及羟基部分的掺入。该羟化过程提供了一种用于将甘油脂的一种或多种脂肪酸组分转化为羟基脂肪酸的机制。羟化可以例如经由在美国专利号5,576,027中报道的方法来进行。羟化脂肪酸（包括蓖麻油及其衍生物）作为在若干工业应用（包括食品添加剂、表面活性剂、颜料润湿剂、消泡剂、防水添加剂、增塑剂、化妆品乳化和/或除臭剂）以及电子设备、药物、涂料、油墨、胶粘剂、以及润滑剂中的组分是有用的。可以如何进行甘油酯的羟化的一个实例如下：加热脂肪，优选与庚烷结合加热至大约30℃-50℃并且在此温度下保持三十分钟或更长；然后将乙酸添加至该混合物，接着添加硫酸水溶液，再接着以小的增量经过一小时添加过氧化氢水溶液至该混合物；在添加过氧化氢水溶液之后，然后可以将温度增加到至少大约60℃并且搅拌至少六小时；在搅拌之后，允许该混合物沉降并且可以将由该反应形成的下部水层去除，同时用具有大约60℃的温度的热水洗涤由该反应形成的上部庚烷层；然后可以将洗涤的庚烷层用氢氧化钾水溶液中和至大约5至7的pH并且然后在真空下通过蒸馏将其去除；然后可以将反应产物在100℃在真空下干燥并且将干燥的产物在真空条件下进行蒸汽除臭并且在大约50℃至60℃使用硅藻土过滤。
由在此描述的方法产生的微生物油的羟化可以与一种或多种方法和/或材料结合进行，或生产如在以下文献中报道的产品：美国专利号6,590,113（油基涂层和油墨）、4,049,724（羟化过程）、6,113,971（橄榄油脂（Olive oil butter））、4,992,189（润滑剂和润滑油添加剂）、5,576,027（羟化奶）、以及6,869,597（化妆品）。蓖麻油酸的羟化提供了一种多元醇。
羟化甘油酯可以被转化为交内酯。交内酯由其中羟化脂肪酸组分已经被酯化为另一种脂肪酸分子的甘油酯组成。羟化甘油酯至交内酯的转化可以通过以下来进行：加温甘油酯与脂肪酸的混合物并且将该混合物与一种矿物酸接触，如由Isbell等人，JAOCS71(2):169-174（1994）所描述的。交内酯在多种应用中是有用的，包括但不限于在以下文献中报道的那些：美国专利号7,196,124（弹性材料与地板覆盖物）、5,458,795（用于高温应用的稠化油）、5,451,332（用于工业应用的流体）、5,427,704（燃料添加剂）、以及5,380,894（润滑剂、润滑脂、增塑剂以及印刷墨）。
另一种这样的化学修饰链烯烃复分解。在烯烃复分解中，催化剂切断烯（烯烃）中的亚烷基碳并且通过使它们中的每一个与不同的亚烷基碳进行配对而形成新的烯。烯烃复分解反应提供了用于如以下过程的机制：通过乙烯醇分解截断烯上的不饱和脂肪酸烷基链，通过自我复分解经由烯键交联脂肪酸，以及通过与衍生烯烃的交叉复分解在脂肪酸上掺入新的官能团。
结合其他反应，如酯交换和氢化，烯烃复分解可以将不饱和甘油酯转化为不同的终产物。这些产物包括用于蜡的甘油酯低聚物；用于润滑剂的短链甘油酯；用于化学品和聚合物的同-以及异-双功能烷基链；用于生物燃料的短链酯；以及用于喷气燃料的短链烃。可以对三酰甘油和脂肪酸衍生物进行烯烃复分解，例如使用在美国专利号7,119,216、美国专利公开号2010/0160506、以及美国专利公开号2010/0145086中报道的催化剂和方法。
生物油的链烯烃复分解通常包括在其他烯存在（交叉复分解）或不存在（自我复分解）下、在惰性条件下将Ru催化剂溶液以大约10至250ppm的装载量添加至不饱和脂肪酸酯。典型地允许这些反应进行从数小时至数日并且最终产生烯产物的一种分布。如何进行脂肪酸衍生物的烯烃复分解的一个实例如下：将第一代格拉布催化剂（二氯[2(1-甲基乙氧基-α-O)苯基]亚甲基-α-C](三环己基-膦)）在甲苯中的溶液以222ppm的催化剂装载量添加至含有经脱气并干燥的油酸甲酯的容器中。然后将该容器用大约60磅/平方英寸(绝对压力）的乙烯气体进行加压并且在大约30℃或30℃以下维持3小时，由此产生大约50%产率的甲基9-癸烯酸酯。
由在此描述的方法产生的油的烯烃复分解可以与一种或多种方法和/或材料结合进行，或生产如在以下文献中报道的产品：专利申请PCT/US07/081427（α-烯烃脂肪酸）以及美国专利申请号12/281,938（石油膏）、12/281,931（彩弹枪胶囊（paintballgun capsules））、12/653,742（增塑剂和润滑剂）、12/422,096（双功能有机化合物）、以及11/795,052（烛用蜡）。
其他的可以对微生物油进行的化学反应包括使三酰甘油与环丙烷化剂（cyclopropanating agent）反应以增强流动性和/或氧化稳定性，如在美国专利6,051,539中报道；从三酰甘油制造蜡，如在美国专利6,770,104中报道；以及三酰甘油的环氧化，如在“脂肪酸组合物对环氧化的三酰甘油的酰化动力学的影响”（″Theeffect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols″）,Journal of the American Oil Chemists′Society（美国油化学协会杂志），79:1,59-63,(2001)以及Free Radical Biology and Medicine（自由基生物学与医学），37:1,104-114(2004)中报道的。
用于如以上描述的燃料和化学产品的含油微生物生物质的产生导致脱脂生物质粉的产生。脱脂粉是制备藻油的副产物并且作为农场动物（例如，反刍动物、家禽、猪以及水产养殖）的动物饲料是有用的。所得到的粉虽然具有降低的油含量，但仍然含有高品质的蛋白质、碳水化合物、纤维、灰分、残油以及其他适合用于动物饲料的营养素。由于这些细胞大部分被油分离过程溶解，该脱脂粉可以容易地被这些动物消化。脱脂粉可以任选地在动物饲料中与其他成分结合，如谷粒。由于脱脂粉具有粉状一致性（powdery consistency），可以使用可商业获得的挤出机或膨胀器或另一种类型的机器将它压制成小丸。
蓖麻油是一种从蓖麻子中分离的天然存在的油。蓖麻油的水解产生蓖麻油酸。从蓖麻子中生产蓖麻油是困难的，因为蓖麻子含有大量的篦麻毒素。蓖麻毒素是一种在化学武器公约（Chemical Weapons Convention）中列为附表1化合物的极其危险的毒素。因此，在从蓖麻子中生产蓖麻油时必须非常小心。由本发明的一个实施例提供了一种从微藻细胞分离的羟化油。以这种方式，可以生产蓖麻油酸。在一个实施例中，该羟化油是一种羟化甘油三酯。本发明的羟化甘油三酯与蓖麻油可以是在化学上类似的。如在实例7中所显示的，本发明提供了一种羟化微生物油。当通过GC/MS进行分析时，实例7的油显示诸位发明人已经生产出了蓖麻油酸（12-羟基-9-顺式-十八碳烯酸）。
根据本发明的一个实施例的一种脂肪酸是羟化脂肪酸。该羟化脂肪酸的一个实施例是蓖麻油酸。
该微生物羟化油或羟化脂肪酸可以进一步被羟化。当蓖麻油酸被进一步羟化时，提供了一种含有两个羟基基团的脂肪酸（一种多元醇）。
本发明提供了一种通过使一种多元醇（例如，羟化油和/或羟化脂肪酸）与一种含有异氰酸酯部分的化合物反应而制备的组合物。已经使用蓖麻油和异氰酸酯生产了聚氨酯。聚氨酯在我们当今使用的各种产品中普遍存在。聚氨酯存在于汽车、玩具、体育用品、消费电子产品、鞋、床垫、垫子、胶粘剂、建筑材料，等等。目前，由蓖麻油制成的聚氨酯可从巴斯夫公司（BASF）、伊藤制油公司（Itoh Oil）、以及其他公司商购。由羟化大豆油制得的聚氨酯可从嘉吉公司（Cargill）、陶氏化学公司（Dow）、拜耳公司（Bayer）、以及其他公司商购。
在一个实施例中，可以根据本领域已知的方法将由微生物细胞产生的蓖麻油酸进一步加工成油脂化学品，包括蓖麻油酸酯、蓖麻油酸酰胺、聚氨酯、聚氨酯泡沫、或聚氨酯部分。参见，例如，美国专利号6194475、4266617、6403664、以及4058492、以及美国专利申请号20100227151。
已经如上详述的本发明在以下实例中进行了举例说明，这些实例被提供为旨在说明而不是限制要求保护的发明。
VII.实例
实例1：用于培养无绿藻的方法
培养无绿藻株以实现按干细胞重量计高百分比的油。将冷冻的细胞在室温融化，并且将500μl细胞添加至加有2%葡萄糖的4.5ml的培养基（4.2g/L K2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水合物、0.025g/L CaCl22H2O、2g/L酵母提取物），并且在28℃在6孔平板中在搅拌（200转/分钟）下培养7天。通过以14,000转/分钟在预称重的Eppendorf管中将1ml的培养物离心5分钟，确定干细胞重量。弃去培养上清液并且将所得到的细胞沉淀用1ml的去离子水洗涤。将培养物再次离心，弃去上清液，并且将细胞沉淀置于-80℃直到冷冻。然后将样品冻干24小时并且计算干细胞重量。为了确定培养物中的总脂质，移出3ml培养物并且使用Ankom系统（Ankom公司，马其顿，纽约）根据制造商的方案进行分析。将样品用Amkom XT10提取器，根据制造商的操作方案进行溶剂提取。将总脂质确定为在酸水解的干燥样品与溶剂提取的干燥样品之间的质量差。在表10中显示了干细胞重量的油百分比测量值。
表10.按干细胞重量计的油百分比
种类 株 %油
雍滞无绿藻 UTEX327 13.14
Prototheca moriformis UTEX1441 18.02
Prototheca moriformis UTEX1435 27.17
将来自无绿藻属多个株的微藻样品进行基因分型。如下从藻生物质分离基因组DNA。以14,000x g持续5分钟将细胞（大约200mg）从液体培养物中离心出来。然后将细胞再悬浮于无菌蒸馏水中，以14,000x g离心5分钟，并且弃去上清液。将直径约2mm的单个玻璃珠添加至生物质，并且将管置于-80℃持续至少15分钟。移出样品并添加150μl研磨缓冲液（1%Sarkosyl，0.25M蔗糖，50mM NaCl，20mMEDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0，RNA酶A0.5μg/μl）。通过短暂涡旋将沉淀再悬浮，随后添加40μl的5M NaCl。将样品短暂涡旋，随后添加66μl的5%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）并且进行最终短暂涡旋。接下来，将样品在65℃孵育10分钟，此后将它们以14,000x g离心10分钟。将上清液转移至一支新管并且用300μl酚:氯仿:异戊醇（12:12:1）提取一次，随后以14,000x g离心5分钟。将所得到的水相转移至一支含有0.7体积异丙醇（约190μl）的新管，通过倒置进行混合并且在室温孵育30分钟或在4℃孵育过夜。通过以14,000x g离心10分钟回收DNA。然后将所得到的沉淀用70%乙醇洗涤2次，随后用100%乙醇最终洗涤。将沉淀在室温晾干20-30分钟，随后再悬浮于50μl的10mM TrisCl、1mM EDTA（pH8.0）中。
将如上文所述那样制备的5μl总藻DNA按1:50稀释于10mM Tris（pH8.0）中。如下设置PCR反应，终体积20μl。将10μl2x iProof HF主混合物（BIO-RAD）以10mM储存浓度添加至0.4μl引物SZ02613（5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’（SEQ ID NO:9））。这个引物序列范围在GenBank登录号L43357中的位置567-588并且在高等植物和藻类质体基因组中是高度保守的。随后添加至处于10mM储存浓度的0.4μl引物SZ02615（5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’（SEQ ID NO:10））。这个引物序列与Gen Bank登录号L43357中的位置1112-1093互补并且在高等植物和藻质体基因组中是高度保守的。接下来，添加5μl稀释的总DNA和3.2μl dH2O。如下运行PCR反应：98℃，45”；98℃，8”；53℃，12”；72℃，20”，持续35个循环，随后72℃持续1分钟，并且保持在25℃。为了纯化PCR产物，将20μl的10mM Tris（pH8.0）添加至每个反应，随后用40μl酚:氯仿:异戊醇（12:12:1）提取，涡旋并且以14,000xg离心5分钟。将PCR反应物施加至S-400柱（GE Healthcare）并且以3,000x g离心2分钟。将纯化的PCR产物随后TOPO克隆到PCR8/GW/TOPO中，并且在LB/Spec平板上选择阳性克隆。使用M13正向和反向引物，将纯化的质粒DNA按两个方向测序。总共选择十二个无绿藻株对其23S rRNA DNA测序，并且在序列表中列出这些序列。下文包括株的编号和序列表编号的简述。针对来自UTEX1435（SEQ IDNO:15）序列的总趋异（overall divergence）进行序列分析。出现了作为最趋异的两对（UTEX329/UTEX1533和UTEX329/UTEX1440）。在两种情况下，成对比对导致75.0%的成对序列一致性。下文还包括针对UTEX1435的序列一致性百分比：
Figure BDA00003613748601231
使用HPLC分析来自上文列出的株的亚组中的脂质样品的脂质谱。结果显示于表11中。可替代地，可以使用实例11中概述的程序来确定脂质谱。
表11.无绿藻种类中脂质链的多样性
Figure BDA00003613748601232
分析从Prototheca moriformis UTEX1435（通过溶剂提取或使用螺旋榨机）提取的油的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚、其他固醇和生育三烯酚。结果汇总于下表12中。
表12.从Prototheca moriformis（UTEX1435）提取的油中的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚/固醇和生育三烯酚分析
Figure BDA00003613748601241
使用标准植物油加工方法精炼和漂白来自4个独立批次的从Protothecamoriformis提取的油。简而言之，在水平滗析器（horizontal decanter）中澄清从Prototheca moriformis提取的粗制油，其中将固形物与油分离。然后将澄清的油转移至含有柠檬酸和水的罐并且让其沉降大约24小时。在24小时之后，罐中的混合物形成2个分离层。底层由水和胶组成，然后通过滗析移除所述胶，之后将脱胶油转移至漂白罐中。然后将油与另一个剂量的柠檬酸一起加热。然后添加漂白粘土至漂白罐，并且将混合物在真空下进一步加热，以便蒸发掉存在的任何水。然后将混合物泵送通过叶滤机以移除漂白粘土。然后使过滤的油通过最终5μm增泽过滤器（polishingfilter）并且然后收集储存直至使用。然后分析精炼和漂白的（RB）油的类胡萝卜素、叶绿素、固醇、生育三烯酚、和生育酚。在以下表13中汇总了这些分析的结果。“Nd”表示未检测到，并且下文列出检测灵敏度：
检测灵敏度
类胡萝卜素（mcg/g）nd=<0.003mcg/g
叶绿素（mcg/g）nd=<0.03mcg/g
固醇（%）nd=0.25%
生育酚（mcg/g）；nd=3mcg/g
表13.来自精炼和漂白的Prototheca moriformis油的类胡萝卜素、叶绿素、固醇、生育三烯酚和生育酚分析
Figure BDA00003613748601251
Figure BDA00003613748601261
还分析了相同4个批次Prototheca moriformis油的微量元素，并且将结果汇总在以下表14中。
表14.精炼和漂白的Prototheca moriformis油的元素分析
Figure BDA00003613748601271
Figure BDA00003613748601281
实例2：用于生物射弹转化无绿藻的一般方法
根据来自制造商的方案制备Seashell金微载体550纳米。质粒（20μg）与50μl的结合缓冲液和60μl（30mg）的S550d金载体混合并且在冰中孵育1分钟。添加沉淀缓冲液（100μl），并且将混合物在冰中孵育另外1分钟。在涡旋之后，通过在Eppendorf5415C微量离心机中以10,000转/分钟旋转10秒，使DNA包被的颗粒沉淀。将金沉淀物用500μl冷100%乙醇洗涤一次，通过在离心管中短暂旋转沉淀，并且用50μl冰冷的乙醇再悬浮。在短暂（1-2秒）超声处理之后，将10μl DNA包被的颗粒立即转移至载体膜。
将无绿藻株在转动摇床上含有2%葡萄糖的月示培养基（2g/L酵母提取物，2.94mM NaNO3，0.17mM CaCl2·2H2O，0.3mM MgSO4·7H2O，0.4mM K2HPO4，1.28mM KH2PO4，0.43mM NaCl）中培养直到它达到2x106个细胞的细胞密度。收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次并且再悬浮于50μl的培养基中。将1x107个细胞铺展在非选择性月示培养基平板的中心三分之一（center third）。用PDS-1000/He生物射弹粒子递送体系（Bio-Rad）轰击细胞。使用裂碟片（1350psi），并且将平板置于筛选/巨载体组件下方6cm。允许细胞在25℃恢复12-24小时。回收时，将细胞用橡胶抹刀从板上刮下，与100μl培养基混合并且铺展在含有适当抗生素选择的平板上。在25℃孵育7-10天之后，在平板上可见代表转化细胞的集落。将集落挑出并点在选择性（抗生素或碳源）琼脂平板上用于第二轮选择。
实例3：在无绿藻属中的各种硫酯酶的表达
先前已经在PCT申请号PCT/US2009/066412中描述了用于在无绿藻种类中表达异源硫酯酶基因的方法和作用，特此将该专利通过引用进行结合。进一步研究了来自高等植物种类的其他硫酯酶基因/基因产物的作用。这些硫酯酶包括来自以下高等植物的硫酯酶：
在所有情况下，使用生物射弹粒子轰击将以上硫酯酶构建体中的每一个转化到Prototheca moriformis（UTEX1435）中。其他转化方法，包括如在PCT申请号PCT/US2009/066142中所描述的同源重组，也适合用于感兴趣的基因的异源表达。使用在实例2中描述的方法用以上硫酯酶构建体中的每一个进行Prototheca moriformis的（UTEX1435）转化。每一个构建体包含NeoR基因并且使用100μg/ml G418进行阳性克隆选择。所有编码区经密码子优化以反映在Prototheca moriformis UTEX1435（见表2）核基因中固有的密码子偏倚。在序列一致性表中列出了所使用的构建体的氨基酸序列和cDNA序列两者。除非另外说明，用来自Prototheca moriformis Δ12脂肪酸去饱和酶（SEQ ID NO:48）或来自原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶（SEQ IDNO:49）的藻类密码子优化的转运肽替代每一高等植物硫酯酶的转运肽。所有硫酯酶构建体是由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR驱动的。将所选择的阳性克隆的生长和脂质生产与野生型（未转化的）Prototheca moriformis（UTEX1435）进行比较。使野生型与所选择的阳性克隆在2%葡萄糖的G418平板上生长。对于每一构建体的所选择的阳性克隆的脂质谱分析总结在以下表15中（以面积%表示）。
表15.表达不同异源硫酯酶的Prototheca moriformis的脂质谱。
Figure BDA00003613748601301
Figure BDA00003613748601311
这些结果显示所有表达的硫酯酶都在一定水平上影响脂肪酸谱。参看“总饱和物”行，饱和度受这些硫酯酶中的几种的表达的深刻影响，包括来自加州月桂、樟树的那些，并且最显著地来自美洲榆的那些。在总饱和物百分比方面的这些变化是意料之外的，因为来自高等植物的硫酯酶的异源表达可以明显影响不只是脂质链长；它还可以影响由微藻产生的脂质谱的其他属性，即脂肪酸的饱和度。
用湿地萼距花C8硫酯酶、萼距花硫酯酶、加州月桂和樟树硫酯酶转化的选定克隆进一步在变化量的G418（从25mg/L至50mg/L）中以及在变化的温度（从22℃至25℃）下生长并且测定这些克隆的脂质谱。表16总结了含有各硫酯酶的代表性克隆的脂质谱（表示为面积%）。构建了含有美洲榆硫酯酶的一个第二构建体并且使用以上描述的生物射弹方法将其转化到Prototheca moriformis（UTEX1435）中。将这个第二构建体经由同源重组引入细胞中。在无绿藻种类中的同源重组的方法先前描述于PCT申请号PCT/US2009/66142中。所使用的同源DNA来自自Protothecamoriformis UTEX1435的6S基因组DNA（以SEQ ID92和SEQ ID84给出的供体序列）。选择剂是使用来自酿酒酵母的、由莱茵衣藻β微管蛋白启动子驱动的密码子优化的suc2基因在蔗糖上生长的能力。用原始小球藻（UTEX250）硬脂酰ACP去饱和酶转运肽替代天然美洲榆转运肽。这种构建体的cDNA在序列表中作为SEQ IDNO:50列出。在2%蔗糖平板上进行阳性克隆选择并且使产生的用于脂质谱测定的培养物也在含有2%蔗糖的培养基上生长。含有同源重组的异源美洲榆硫酯酶的这个Prototheca moriformis株的代表性脂质谱总结于表16中。
表16.含有异源硫酯酶基因的Prototheca moriformis株的脂质谱。
Figure BDA00003613748601312
Figure BDA00003613748601321
正如以上描述的克隆，与野生型（未转化）Prototheca moriformis相比，所有含有异源硫酯酶基因的转化子显示出在一定水平上受影响的脂肪酸谱，并且饱和脂肪酸的总百分比也被改变。含有通过同源重组引入的美洲榆硫酯酶的Protothecamoriformis在总饱和物方面具有最大的增长。
另外，针对新颖的脂质谱评定了含有外源萼距花、樟树、加州月桂或美洲榆硫酯酶的转基因克隆。当在22℃以2%葡萄糖、25mg/ml G418培养时，含有萼距花硫酯酶的克隆实现了以下脂质谱：5.10%C8:0、18.28%C10:0、0.41%C12:0、1.76%C14:0、16.31%C16:0、1.40%C18:0、40.49%C18:1、以及13.16%C18:2。当在25℃以2%蔗糖培养时，含有樟树硫酯酶的克隆（还含有外源蔗糖转化酶）实现了以下脂质谱：0.04%C10:0、6.01%C12:0、35.98%C14:0、19.42C16:0、1.48%C18:0、25.44%C18:1、以及9.34%C18:2。当在22℃以2%葡萄糖、25-100mg/ml G418培养时，含有加州月桂硫酯酶的克隆实现了以下脂质谱：0%C8:0、0.11%C10:0、34.01%C12:0、5.75%C14:0、14.02%C16:0、1.10%C18:0、28.93%C18:1、以及13.01%C18:2。当在28℃以2%葡萄糖培养时，含有美洲榆硫酯酶的克隆达到了以下脂质谱：1.54%C10:0、0.43%C12:0、7.56%C14:0、39.45%C16:0、2.49%C18:0、38.49%C18:1、以及7.88%C18:2。
还将来自高等植物的另外的硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，并且在如以上说明的序列表中列出密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。这些另外的硫酯酶包括来自肉豆蔻的广谱特异性硫酯酶（C14:0-C18:0）、来自山竹的C16:0偏好型硫酯酶、来自萼距花的C16:0偏好型硫酯酶、来自油棕（Elaeisguiniensis）的C16:0偏好型硫酯酶、来自甘蓝型油菜的C18:0偏好型硫酯酶、以及来自蓖麻的C18:1偏好型硫酯酶。这些表达构建体的详情以及从以上各转基因/转化产生的转基因克隆描述于下文。
使用以上描述的方法将来自肉豆蔻的广谱特异性硫酯酶（C14:0-C18:0）引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。对两种不同的表构建体进行测试，每一种含有不同的质体靶向序列。在两种构建体中，使用酿酒酵母蔗糖转化酶基因suc2作为选择标记，从而赋予阳性转化子利用蔗糖作为唯一碳源在平板上生长的能力。两种表达构建体（pSZ1318和pSZ1317）均含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ ID NO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体的侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出。pSZ1318包含肉豆蔻硫酯酶编码区，其中天然转运肽被来自在Prototheca moriformis Amt03启动子（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR控制下的Prototheca moriformis Δ12 FAD（SEQ ID NO:48）的转运肽替换。具有来自Prototheca moriformis Δ12 FAD的转运肽的、密码子优化的肉豆蔻硫酯酶作为SEQ ID NO:145列出。pSZ1317包含肉豆蔻硫酯酶编码区，其中天然转运肽被来自在Prototheca moriformis Amt03启动子（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR控制下的原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶（SEQ ID NO:49）的转运肽替换。具有来自原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶的转运肽的、密码子优化的肉豆蔻硫酯酶作为SEQ ID NO:158列出。两种表达构建体pSZ1318和pSZ1317均被转化到无绿藻细胞中并且在蔗糖作为唯一碳源的平板上进行选择。从各转化中选择阳性克隆并使其在氮限制条件下在蔗糖作为唯一碳源的培养基上培养用于生产脂质。使用以上描述的直接酯交换方法确定所选择的阳性克隆的亚组的脂质谱并且总结于表17中。
表17.肉豆蔻广谱特异性硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601331
Figure BDA00003613748601341
含有肉豆蔻硫酯酶转基因的阳性克隆显示出改变的脂质谱。然而，以上总结的结果显示出意料之外的结果；在高等植物中，肉豆蔻硫酯酶展现出显著的针对C16:0脂肪酰基-ACP的活性（Voelker等人，1997），然而，在无绿藻细胞中，肉豆蔻硫酯酶似乎具有分级为C14:0>C18:0>C16:0的影响并且有更广泛的基础，而不仅仅是针对C16:0。
将来自山竹的C16:0偏好型硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，并且在如以上说明的序列表中列出密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。该表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ IDNO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。山竹编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5′UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下。还将山竹天然转运肽替换为来自原始小球藻硬脂酰去饱和酶（SEQ ID NO:49）的转运肽，并且将带有替换的转运肽的硫酯酶的cDNA序列作为SEQ ID NO:147列出。将整个山竹表达盒称作pSZ1452并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如以上所述的直接酯交换法确定脂质谱。将所选择的克隆的脂质谱汇总在以下表18中。
表18.山竹C16:0偏好型硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601351
结果显示，与野生型比较，具有山竹硫酯酶转基因的转化子具有显著受影响的C16:0脂肪酸水平以及在较小程度上受影响的C14:0和C18:0脂肪酸水平、连同在C18:1脂肪酸水平上的急剧下降。
将来自萼距花的C16:0偏好型硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。建立了两个表达构建体，一个具有天然萼距花C16偏好型硫酯酶转运肽序列，称为pSZ1417，并且第二个称为pSZ1462，其中天然转运肽序列被来自原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶（SEQ ID NO:49）的转运肽替代。将具有该天然转运肽的萼距花硫酯酶的编码序列作为SEQ ID NO:149列出并且将具有该替代转运肽的萼距花硫酯酶的编码序列作为SEQ ID NO:160列出。两种表达构建体均含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ ID NO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。在两种构建体中，萼距花编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5′UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下。将这两个构建体转化到Prototheca moriformis遗传背景中，并且在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如以上所述的直接酯交换法确定脂质谱。将所选择的克隆的脂质谱汇总在下表19中。
表19.萼距花C16:0偏好型硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601361
结果显示，与野生型比较，具有任一种萼距花C16:0偏好型硫酯酶构建体的转化子具有显著受影响的C16:0脂肪酸水平以及在较小程度上受影响的C14:0脂肪酸水平、连同在C18:1脂肪酸水平上的急剧下降。与pSZ1417转化子比较，在这两种构建体中的转运肽的差异可以解释在pSZ1462转化子中的C16:0脂肪酸水平增加。
将来自油棕（Elaeis guiniensis）（非洲油棕）的两种C16:0偏好型硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，这两种C16:0偏好型硫酯酶相应于Genbank登录号AAD422220.2（SEQ ID NO:152）和ABD83939（SEQ ID NO:162）中的氨基酸序列，分别称作油棕棕榈酰基-ACP硫酯酶和油棕棕榈酰基-ACP硫酯酶PATE。在如以上说明的序列表中列出这些密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。这两种硫酯酶共享显著水平的氨基酸一致性（超过94%），但是它们在非洲油棕植物中的对应作用仍不清楚。编码油棕棕榈酰基-ACP硫酯酶的构建体被称作pSZ1437，而编码油棕棕榈酰基-ACP硫酯酶PATE的构建体被称作pSZ1436。两种表达构建体均含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ ID NO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。在两种构建体中，油棕硫酯酶编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5′UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下。将这两种构建体转化到Prototheca moriformis遗传背景中，并且在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如以上所述的直接酯交换法确定脂质谱。将所选择的克隆的脂质谱汇总在以下表20中。
表20.油棕C16:0偏好型硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601371
当与野生型比较时，由pSZ1437编码的油棕C16:0偏好型硫酯酶对于C16:0脂肪酸水平具有显著影响并且对于C14:0脂肪酸水平具有较小程度的影响，并且在C18:1脂肪酸水平上急剧下降。出人意料地，由pSZ1436编码的油棕C16:0偏好型硫酯酶PATE尽管与由pSZ1436编码的硫酯酶具有显著水平的氨基酸一致性，但对于C16:0或C14:0脂肪酸水平具有相对很低的活性。
将来自甘蓝型油菜的C18:0偏好型硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，并且在如以上说明的序列表中列出密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。该表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ ID NO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。该甘蓝型油菜编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5′UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下。将整个甘蓝型油菜表达盒称作pSZ1358并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如以上所述的直接酯交换法确定脂质谱。将所选择的克隆的脂质谱汇总在以下表21中。
表21.甘蓝型油菜C18:0偏好型硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601381
结果显示，与野生型比较，具有甘蓝型油菜C18:0偏好型硫酯酶转基因的转化子具有显著受影响的C18:0脂肪酸水平和在较小程度上受影响的C16:0脂肪酸水平、以及在C18:1脂肪酸水平上的急剧下降。
将来自蓖麻的脂肪酰基-ACP硫酯酶引入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，并且在如以上说明的序列表中列出密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。该表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5′（SEQ IDNO:82）和3′（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。该蓖麻编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5′UTR（SEQ IDNO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下。将蓖麻天然转运肽也替换为来自原始小球藻硬脂酰去饱和酶（SEQ ID NO:49）的转运肽，并且将带有替换的转运肽的硫酯酶的cDNA序列作为SEQ ID NO:155列出。将整个蓖麻表达盒称作pSZ1375并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如以上所述的直接酯交换法确定脂质谱。将所选择的克隆的脂质谱汇总在以下表22中。
表22.蓖麻ACP-硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂质谱。
结果显示，带有蓖麻硫酯酶转基因的转化子具有受影响的C16:0脂肪酸水平以及在较小程度上受影响的C18:0脂肪酸水平。同样，当与野生型水平相比时，存在着C18:1脂肪酸水平的同时增加。
实例4：用多个外源异源硫酯酶基因转化无绿藻属
使用以上披露的方法转化微藻株Prototheca moriformis（UTEX1435）以便在单个克隆中表达多种硫酯酶。在单个克隆中表达多种硫酯酶允许微藻产生具有多种脂肪酸谱的油，这些脂肪酸谱与单独表达任何单一硫酯酶时产生的那些完全不同（如在前述实例中所展示的）。首先利用同源重组用樟树硫酯酶（一种C14偏好型硫酯酶）连同蔗糖转化酶基因、来自酿酒酵母的suc2（选择是在蔗糖上生长的能力）转化Prototheca moriformis（UTEX1435）。用于这种同源重组构建体的DNA来自Prototheca moriformis基因组DNA的KE858区域，如在以上第III节所描述的。这种构建体的相关部分在序列表中作为SEQ ID NO:51列出。在含有蔗糖的平板上筛选阳性克隆。然后用三个盒的其中之一对阳性克隆进行再转化，这三个盒每一个编码对抗生素G418的抗性以及一种另外的硫酯酶：(1)来自萼距花的硫酯酶基因（C8-10偏好型），SEQ ID NO:52；(2)来自加州月桂的硫酯酶基因（C12偏好型），SEQ ID NO:53；或来自美洲榆的硫酯酶基因（广谱；C10-C16偏好型），SEQ ID NO:54。包括在序列表中的是每一构建体的相关部分的序列。在含有蔗糖的、具有50μg/ml G418的培养基上筛选表达两种硫酯酶基因的克隆。选择阳性克隆并且对生长与脂质谱进行测定。表23汇总了代表性阳性克隆的脂质谱（以面积%表示）。
表23.用多个硫酯酶转化的Prototheca moriformis的脂质谱。
Figure BDA00003613748601401
Figure BDA00003613748601411
另外，在22℃使具有樟树与加州月桂硫酯酶的双硫酯酶克隆在含有2%蔗糖的、具有50mg/L G418的培养基中生长。在这些培养条件下从这个株获得的脂肪酸谱是：C8:0(0)、C10:0(0.10)、C12:0(31.03)、C14:0(7.47)、C16:0(15.20)、C18:0(0.90)、C18:1(30.60)、C18:2(12.44)、以及C18:3α(1.38)，具有54.7的总饱和物。
产生了具有两个含有樟树硫酯酶的同源重组构建体（一个靶向6S区域并且另一个靶向KE858区域）的双硫酯酶克隆。代表性阳性克隆具有以下脂肪酸谱：0%C8:0、0.06%C10:0、5.91%C12:0、43.27%C14:0、19.63%C16:0、0.87%C18:0、13.96%C18:1、以及13.78%C18:2，具有69.74%的总饱和物。这个克隆具有超过49%的C12-C14水平，超过野生型细胞中C12-C14水平的37倍。
以上数据显示多种硫酯酶可以成功地在微藻中共表达。多种硫酯酶的共表达导致改变的脂肪酸谱，这些脂肪酸谱不仅与野生型株系显著不同，而且与通过表达这些单独的硫酯酶的任何一种而获得的脂肪酸谱也显著不同。具有重叠的链长特异性的多种硫酯酶的表达可以导致那些特异性脂肪酸的累积增加。
在Prototheca moriformis中表达异源硫酯酶（单独地或组合地）不仅改变宿主株中的脂肪酸/脂质谱，而且当与目前从多种植物作物可获得的油（表5）相比时，这些谱是未发现于其他目前可获得的系统中的真正独特的油的谱。这些转基因株系不仅显示出与未转化的野生型株系的显著差异，而且它们具有与在表5中所显示的任何商业用油显著不同的谱。作为实例，椰子油和棕榈仁油都具有范围从5.5%-17%的C8-C10脂肪酸水平。表达湿地萼距花C8偏好型硫酯酶或萼距花C10偏好型硫酯酶的转基因株系在任何地方分别积累从3.66%至8.65%。这些C8-C10脂肪酸水平类似于椰子油和棕榈仁，然而这些转基因藻株缺乏显著更高的C12:0脂肪酸，并且它们具有极高的C16:0（在转基因株系中为23%，而在椰子油或棕榈仁油中分别为11%-16%）和/或18:1（在转基因株系中为50%-57%，而在椰子油或棕榈仁油中分别为8%-19%）。
通过表达Cuphea wrightii硫酯酶在UTEX1435株中产生富含月桂酸酯和肉豆蔻酸酯的油：Cuphea wrightii的种子已经显示出积累含有超过25%的C10:0和超过65%的C12:0脂肪酸的油。两种FatB硫酯酶，CwFatB1（Gen Bank登录号U56103）和CwFatB2（Gen Bank登录号U56104），已经从Cuphea wrightii克隆（如在Leonard等人，Plant Mol.Biol.（植物分子生物学）34(4):669-79（1997）中所描述的）并且在拟南芥中表达（如在Leonard等人，Plant J.（植物杂志）13(5):621-8（1998）中所描述的）。表达CwFatB1和CwFatB2的拟南芥转基因株系的脂肪酸谱显示出增加的高达16%至25%的C12:0脂肪酸种类（Leonard等人，1998，上文）。在此我们证明了通过在UTEX1435株中表达Cuphea wrightii硫酯酶CwFatB1和CwFatB2而产生富含月桂酸酯和肉豆蔻酸酯的油的能力。在此处描述的实例中，表达CwFatB1和CwFatB2的转基因株系是使用之前描述的转化方法产生的。
CwFatB1和CwFatB2的氨基酸序列显示于下文，其中预测的叶绿体靶向序列加下划线。使用这些一级氨基酸序列来合成用于转化构建体的相应基因。利用如前描述的UTEX1435株的优选密码子使用对这两种基因的核苷酸序列针对在UTEX1435株中表达进行了优化。
CwFatB1(U56103):
MVAAAASSAFFSVPTPGTSPKPGKFGNWPSSLSVPFKPDNGGFVKANASAHPKANG
SAVNLKSGSLETPPRSFINQLPDLSMLLSKITTVFGAAEKQWKRPGMLVEPFGVDRI
FQDGVFFRQSFSIRSYEIGVDRTASIETLMNIFQETSLNHCKSIGLLNDGFGRTPEMC
KRDLIWVVTKIQVEVNRYPTWGDTIEVNTWVSESGKNGMGRDWLISDCRTGEILIR
ATSVWAMMNQNTRRLSKFPYEVRQEIAPHFVDSAPVIEDDRKLHKLDVKTGDSIRD
GLTPRWNDLDVNQHVNNVKYIGWILKSVPIEVFETQELCGVTLEYRRECGRDSVLE
SVTTMDPAKEGDRCVYQHLLRLEDGADITIGRTEWRPKNAGANGAISSGKTSNGNS
VS(SEQ ID NO:186)
CwFatB2(U56104):
MVVAAAASSAFFPVPAPRPTPKPGKFGNWPSSLSQPFKPKSNPNGRFQVKANVSPH
PKANGSAVSLKSGSLNTLEDPPSSPPPRTFLNQLPDWSRLRTAITTVFVAAEKQFTRL
DRKSKRPDMLVDWFGSETIVQDGLVFRERFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQDTSL
NHCKSVGLLNDGFGRTPEMCTRDLIWVLTKMQIVVNRYPTWGDTVEINSWFSQSG
KIGMGREWLISDCNTGEILVRATSAWAMMNQKTRRFSKLPCEVRQEIAPHFVDAPP
VIEDNDRKLHKFDVKTGDSICKGLTPGWNDFDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLE
TQELCSLTLEYRRECGRESVVESVTSMNPSKVGDRSQYQHLLRLEDGADIMKGRTE
WRPKNAGTNRAIST(SEQ ID NO:187)
用C.wrightii硫酯酶转化UTEX1435：在这个实例中，使用UTEX1435株作为向其中引入表达C.wrightii FatB1和FatB2硫酯酶的盒的受体株。这些转化构建体含有允许在蔗糖上选择的盒（酿酒酵母suc2基因）连同这些硫酯酶。使用生物射弹如前所述对细胞进行转化。在含有2%蔗糖的培养基上直接转化细胞。产生转化构建体使得这些硫酯酶的表达受莱因衣藻β-微管蛋白启动子或受内源UTEX1435Amt3启动子驱动。
产生了这些硫酯酶盒的另外的变体，其中天然高等植物转运肽被藻类转运肽替代。在这些构建体中使用的转运肽指定如下：TP1编码一种针对衍生自UTEX250的硬脂酰ACP去饱和酶的转运肽；TP2编码一种针对衍生自UTEX1435的硬脂酰ACP去饱和酶的转运肽；TP3编码一种针对衍生自UTEX1435的Δ12脂肪酸去饱和酶的转运肽；并且TP4编码一种针对衍生自UTEX1435的异戊烯二磷酸合成酶的转运肽。在这个实例中使用的构建体列于以下表24中。
表24.TE构建体。
构建体 说明
构建体1 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB1_nr-6S
构建体2 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB2_nr-6S
构建体3 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB1_nr-6S
构建体4 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB2_nr-6S
构建体5 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB1_nr-6S
构建体6 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB1_nr-6S
构建体7 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB1_nr-6S
构建体8 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB1_nr-6S
构建体9 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB2_nr-6S
构建体10 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB2_nr-6S
构建体11 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB2_nr-6S
构建体12 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB2_nr-6S
表达suc2和C.wrightii FatB1硫酯酶的转化DNA(构建体1)：在以下给出了该转化构建体的序列，6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB1_nr-6S，指定为构建体1。相关的限制性位点以小写字母、粗体以及下划线指示并且分别是：5’-3’SapI、KpnI、AscI、MfeI、BamHI、EcoRI、SpeI、AscI、XhoI、SacI以及SapI。SapI位点界定转化DNA的5′和3′末端。该构建体的在5’和3’侧翼的下划线序列代表来自UTEX1435的基因组DNA，其允许经由同源重组的该转化DNA的靶向整合(6S区域)。在5′至3′方向继续向前，通过小写字母、加框文本指示驱动酿酒酵母suc2基因(编码蔗糖水解活性，由此允许该株在蔗糖上生长)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。suc2的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR由小写字母粗体文本指示，后接间隔区。驱动C.wrightii TE(CwFatB1)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子由加框文本指示。该硫酯酶(CwFatB1)的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体文本指示，同时编码区的其余部分以小写字母斜体指示。该硫酯酶的预测的质体靶向序列位于在序列中的起始子ATG与AscI位点之间。普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR由粗体文本指示。
构建体1：
Figure BDA00003613748601451
gctgatgtccatcaccaggtccatgaggtctgccttgcgccggctgagccactgcttcgtccgggcggccaagaggagcatgagg
gaggactcctggtccagggtcctgacgtggtcgcggctctgggagcgggccagcatcatctggctctgccgcaccgaggccgcct
ccaactggtcctccagcagccgcagtcgccgccgaccctggcagaggaagacaggtgaggggggtatgaattgtacagaacaac
cacgagccttgtctaggcagaatccctaccagtcatggctttacctggatgacggcctgcgaacagctgtccagcgaccctcgctgc
cgccgcttctcccgcacgcttctttccagcaccgtgatggcgcgagccagcgccgcacgctggcgctgcgcttcgccgatctgagg
acagtcggggaactctgatcagtctaaacccccttgcgcgttagtgttgccatcctttgcagaccggtgagagccgacttgttgtgcg
ccaccccccacaccacctcctcccagaccaattctgtcacctttttggcgaaggcatcggcctcggcctgcagagaggacagcagt
Figure BDA00003613748601452
Figure BDA00003613748601461
Figure BDA00003613748601462
cgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctgtcg
cacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcacacacgt
gccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacag
Figure BDA00003613748601463
Figure BDA00003613748601464
Figure BDA00003613748601465
cgataacctccaaagccgctctaattgtggagggggttcgaatttaaaagcttggaatgttggttcgtgcgtctggaacaagcccaga
cttgttgctcactgggaaaaggaccatcagctccaaaaaacttgccgctcaaaccgcgtacctctgctttcgcgcaatctgccctgttg
aaatcgccaccacattcatattgtgacgcttgagcagtctgtaattgcctcagaatgtggaatcatctgccccctgtgcgagcccatgc
caggcatgtcgcgggcgaggacacccgccactcgtacagcagaccattatgctacctcacaatagttcataacagtgaccatatttct
cgaagctccccaacgagcacctccatgctctgagtggccaccccccggccctggtgcttgcggagggcaggtcaaccggcatgg
ggctaccgaaatccccgaccggatcccaccacccccgcgatgggaagaatctctccccgggatgtgggcccaccaccagcacaa
cctgctggcccaggcgagcgtcaaaccataccacacaaatatccttggcatcggccctgaattccttctgccgctctgctacccggtg
Figure BDA00003613748601471
(SEQ ID NO:188)
表达suc2和C.wrightii FatB2硫酯酶的转化DNA（构建体2）：该转化构建体（6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB2_nr-6S，指定为构建体2）是通过利用SpeI和AscI限制性位点（以小写字母、以粗体和下划线指示）用密码子优化的CwFatB2基因替换来自构建体1的CwFatB1基因而产生的。该硫酯酶（CwFatB2）的起始子ATG和终止子TGA以大写字母、粗斜体文本指示，而编码区的其余部分以小写字母斜体指示。该硫酯酶的预测的质体靶向序列位于在序列中的起始子ATG与AscI位点之间。
构建体2（部分）:
Figure BDA00003613748601472
Figure BDA00003613748601481
Figure BDA00003613748601482
(SEQ ID NO:189)
表达suc2和由amt3启动子驱动的C.wrightii FatB1和FatB2硫酯酶的转化DNA（构建体3和4）：这些转化构建体（6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB1_nr-6S，指定为构建体3，以及6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB2_nr-6S，指定为构建体4）是通过用衍生自UTEX1435的、作为EcoRI和SpeI限制性片段的Amt3启动子替换来自构建体1和构建体2的、驱动这些硫酯酶的CrbTub启动子（在下文以小写字母、粗体和下划线指示）而产生的。Amt3启动子区域通过小写字母加框文本指示。
构建体3和4（部分）：
Figure BDA00003613748601483
Figure BDA00003613748601491
Figure BDA00003613748601492
(SEQ ID NO:190)
在藻类转运肽控制下表达C.wrightii FatB1硫酯酶的转化DNA：这些转化构建体（6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB1_nr-6S，指定为构建体5；构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB1_nr-6S，指定为构建体6；构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB1_nr-6S，指定为构建体7以及构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB1_nr-6S，指定为构建体8）是通过用在以下显示为SpeI和AscI限制性片段（用小写字母、粗体和下划线指示）的相应的藻类转运肽替换来自构建体1的CwFatB1的天然转运肽而产生的。所产生的藻类转运肽序列位于在以下序列中的起始子ATG与AscI位点之间。
构建体5-12（部分）：
TP1（UTEX250硬脂酰ACP去饱和酶转运肽序列）
Figure BDA00003613748601493
(SEQ ID NO:191)
TP2（UTEX1435硬脂酰ACP去饱和酶转运肽序列）
Figure BDA00003613748601495
Figure BDA00003613748601496
(SEQ ID NO:192)
TP3（UTEX1435Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽序列）
Figure BDA00003613748601497
Figure BDA00003613748601498
(SEQ ID NO:193)
TP4（UTEX1435异戊烯二磷酸合成酶转运肽序列）
(SEQ ID NO:194)
在藻类转运肽控制下表达C.wrightii FatB2硫酯酶的转化DNA：这些转化构建体（6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB2_nr-6S，指定为构建体9；构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB2_nr-6S，指定为构建体10；构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB2_nr-6S，指定为构建体11以及构建体6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB2_nr-6S，指定为构建体12）是通过用在以上显示为SpeI和AscI限制性片段（用小写字母、粗体和下划线指示）的相应的藻类转运肽替换来自构建体2的CwFatB2的天然转运肽而产生的。该藻类转运肽序列位于在以上序列中的起始子ATG与AscI位点之间。
从表达Cuphea wrightii硫酯酶的株系产生的脂肪酸谱：将用上述构建体转化的株系在允许如前所述的油产生的条件下进行培养。使野生型UTEX1435在葡萄糖上生长，同时使所有由UTEX1435的转化而产生的转基因系在蔗糖上生长。针对各测试的构建体，分析了四个转化子对脂肪酸谱的影响。转基因株系的脂肪酸谱显示于以下表25至28中。
表达CwFatB1和CwFatB2的拟南芥转基因株系（表25）显示出对C16:0脂肪酸积累连同C14:0和C12:0脂肪酸积累显著的影响（来自Leonard等人，1998，上文）。
如从表26中可见，表达CwFatB1（构建体1和构建体3）的、具有天然高等植物转运肽的转基因UTEX1435系显示出主要对C14:0脂肪酸积累的影响以及在较小程度上对C12:0脂肪酸积累的影响。表达CwFatB2（构建体2和构建体4）的、具有天然高等植物转运肽的转基因UTEX1435系显示出对C12:0和C14:0脂肪酸积累的显著影响，其中对C12:0的影响比对C14:0的影响更显著。在这两种启动子（CrbTub（构建体1和构建体2）与Amt3（构建体3和构建体4））之间的比较证明：当用Amt3启动子进行驱动时，表达CwFatB1和CwFatB2的转基因系显示出对C10:0、C12:0、C14:0以及C16:0脂肪酸更显著的影响。
对其中CwFatB1硫酯酶的表达是由四种不同的藻类叶绿体靶向序列（构建体5、6、7以及8）驱动的转基因系的分析显示：任何这些藻类转运肽都比天然高等植物转运肽更高效地将该硫酯酶靶向该质体（将构建体5-8中的C12:0和C14:0水平（表27）与构建体1中的那些（表26）进行比较）。这些转基因系的进一步分析揭示：在这四种藻类转运肽中，TP2（UTEX1435硬脂酰ACP去饱和酶叶绿体靶向序列）和TP3（UTEX1435Δ12脂肪酸去饱和酶叶绿体靶向序列）显示出对C12:0与C14:0积累更大的影响。在将该CwFatB1靶向的UTEX1435中的质体方面这两种转运肽（TP1和TP2）显得更好。
对其中CwFatB2硫酯酶的表达是由四种不同的藻类叶绿体靶向序列（构建体9、10、11以及12）驱动的转基因系的分析显示：这些藻类转运肽中仅有一种产生比天然高等植物转运肽优越的性能，即TP-1，如所见的更显著的对C12:0和C14:0脂肪酸的影响（将构建体9与构建体2进行比较）。
这些C.wrightii硫酯酶在UTEX1435中表达时的影响与在拟南芥属中表达时显著不同。表达CwFatB1和CwFatB2的拟南芥转基因系（表25）显示出对C16:0脂肪酸积累连同C14:0和C12:0脂肪酸积累的显著影响。然而，在UTEX1435中表达的CwFatB1和CwFatB2并不显示相同水平的对C16:0脂肪酸的影响。在所有UTEX1435转基因系中（表达CwFatB1，并且一些表达CwFatB2（构建体10、11、12））的C12:C14的比率与表达这种硫酯酶的拟南芥转基因系类似（表29）。然而，与这些拟南芥转基因系相比较，这些UTEX1435系显示出显著更低的C14:C16比率（表29）。用构建体2、4以及9产生的UTEX1435转基因系中的C12:C14和C14:C16比率与表达相同硫酯酶的拟南芥转基因系显著不同（表29）。因此，CwFatB1和CwFatB2在UTEX1435中的表达产生一种油谱，该油谱与在表达相同硫酯酶的拟南芥属转基因系中产生的油谱显著不同。在这些UTEX1435转基因系中的油谱还与在野生型UTEX1435中的那些截然不同。
最后，由在这个实例中描述的转基因系所产生的修饰的油还与在表达来自加州月桂的C12:0特异性硫酯酶的转基因UTEX1435系中所产生的富含月桂酸酯的油（先前描述）显著不同。
总之，这些数据显示：(1)Cuphea wrightii硫酯酶在UTEX1435中的表达对脂肪酸谱具有显著影响并且产生独特的油；(2)CwFatB1硫酯酶在UTEX1435株中的表达导致富含肉豆蔻酸酯的油的产生；(3)CwFatB2硫酯酶在UTEX1435中的表达导致富含月桂酸酯和肉豆蔻酸酯两者的油的产生；以及(4)就所产生的中链脂肪酸的绝对水平和它们彼此的相对比率两者而言，CwFatB1和FatB2在藻类中的表达所产生的谱与在模式高等植物系统中所产生的那些截然不同。
表25.在UTEX1435、拟南芥野生型（Ath）以及表达CwFatB1（CwFatB1-Ath）和CwFatB2（CwFatB2-Ath）的拟南芥转基因系中的脂肪酸谱（表示为面积%）。
Figure BDA00003613748601521
表26.在表达构建体1、构建体2、构建体3以及构建体4的UTEX1435转基因系中的脂肪酸谱（表示为面积%）。
Figure BDA00003613748601522
表27.在表达构建体5、构建体6、构建体7以及构建体8的UTEX1435转基因系中的脂肪酸谱（表示为面积%）。
Figure BDA00003613748601531
表28.在表达构建体9、构建体10、构建体11以及构建体12的UTEX1435转基因系中的脂肪酸谱（表示为面积%）。
Figure BDA00003613748601532
表29.表达CwFatB1（构建体1、3、5、6、7、8）和CwFatB2（构建体2、4、9、10、11、12）的UTEX1435转基因系中连同表达CwFatB1（CwFatB1-Ath）和CwFatB2（CwFatB2-Ath）的拟南芥转基因系中的C12:C14和C14:C16的比率。
Figure BDA00003613748601541
实例5：内源的氮依赖性无绿藻属启动子的鉴定
A.内源的氮依赖性启动子的鉴定和以及表征。
使用标准技术从Prototheca moriformis（UTEX1435）产生cDNA文库。使这些Prototheca moriformis细胞在氮充满条件下生长48小时。然后将5%接种物（v/v）转移至低氮条件并且每24小时收获这些细胞，持续七天。在培养24小时之后，培养基中的氮供应完全耗尽。使用干冰和异丙醇将收集的样品立即冷冻。接着从这些冷冻的细胞团块样品中分离总RNA并且将各样品的一部分保存以用于RT-PCR研究。使从这些样品收获的总RNA的剩余部分经受polyA选择。然后将来自各条件的等摩尔量的经polyA选择的RNA汇集并且用来在载体pcDNA3.0（Invitrogen公司）中产生cDNA文库。从得到的汇集的cDNA文库随机挑选大致1200个克隆并且使其经受双链测序。从这1200个序列中选择大约68个不同的cDNA并且将其用于设计cDNA特异性引物以供在实时RT-PCR研究中使用。
将从保存的细胞团块样品中分离的RNA作为实时RT-PCR研究中的底物，该研究使用以上产生的cDNA特异性引物集。将这种保存的RNA转化成cDNA并且用作用于针对68个基因特异性引物集的每一个的RT-PCR的底物。阈值循环或CT数目被用来指示所收集的每一RNA样品之中的68个cDNA的每一个的在整个时程的相对转录丰度。将在氮充满与氮耗尽之间的条件下显示出显著增加（大于三倍）的cDNA标记为其表达受氮耗尽上调的潜在基因。如在说明书中所讨论的，氮耗尽/限制在产油微生物中是一个已知的脂肪生成诱导因素。
为了从在氮耗尽/限制过程中其表达上调的cDNA中鉴定假定启动子/5’UTR序列，从在氮充满条件下生长的Prototheca moriformis（UTEX1435）分离总DNA并且然后使用454测序技术（罗氏公司）使其经受测序。使用BLAST将以上根据RT-PCR结果标记为上调的cDNA与由454基因组测序读数产生的装配重叠群进行比较。将cDNA的5’末端映射到特定的重叠群，并且在可能的情况下，使用大于500bp的5’侧翼DNA来推定地鉴定启动子/UTR。接着证实启动子/5’UTR的存在并且使用基因组DNA的PCR扩增将其进行克隆。使用单独的cDNA5’末端来设计3’引物并且使用454重叠群装配（contig assemblies）的5’末端来设计5’基因特异性引物。
作为第一次筛选，将一个假定启动子（从Aat2（铵转运蛋白，SEQ ID NO:63）分离的5’UTR/启动子）克隆到具有原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的樟树C14硫酯酶构建体中，从而替换C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子。这一构建体列作SEQ ID NO:81。为了测试该假定启动子，使用以上描述的方法，将该硫酯酶构建体转化到Prototheca moriformis细胞中，以便在低/无氮条件下通过针对C14/C12脂肪酸增加的筛选来证实实际启动子活性。可以使用相同方法来完成对从该cDNA/基因组筛选中分离的假定的氮调节的启动子的类似测试。
其他的从该cDNA/基因组筛选中分离的假定的氮调节的启动子5’UTR是：
Figure BDA00003613748601551
Figure BDA00003613748601561
增加倍数是指在低氮培养基中在培养24小时之后cDNA丰度的增加倍数。
为了进一步认识这些假定启动子/5’UTR的潜在调节，选择了八个序列用于进一步测试：(1)FatB/A；(2)SulfRed亚硫酸盐还原酶；(3)SugT糖转运蛋白；(4)Amt02-铵转运蛋白02；(5)Aat01-氨基酸转运蛋白01；(6)Aat03-氨基酸转运蛋白03；(7)Aat04-氨基酸转运蛋白04；以及(8)Aat05-氨基酸转运蛋白05。利用Illumina测序阅读对在以下不同时间点从Prototheca moriformis细胞分离的RNA进行了更高分辨率的转录组分析：T0（种子）；从种子接种后20小时；32小时；48小时；62小时；以及114小时。T0（种子）处的培养基是氮充满的，而在20小时和更长的时间点处，培养基含有很少或不含氮。然后将从每一时间点分离的RNA产生的装配的转录重叠群独立地与先前鉴定的八个转录本中的每一个进行序列比对（blasted）。结果汇总在以下表30中。
表30.八个假定启动子/5’UTR的转录组表达谱。
Figure BDA00003613748601562
Figure BDA00003613748601571
根据以上总结的结果，这些转录本中的一些显示出随时间增加的积累，虽然有趣的是亚硫酸盐还原酶mRNA显示出随时间明显减少的mRNA积累。
将这八个假定启动子/5’UTR区域克隆在樟树硫酯酶编码区的上游，该樟树硫酯酶编码区的天然转运肽被去掉并且用来自原始小球藻（UTEX250）硬脂酰ACP去饱和酶的转运肽取代。使用来自6S基因组序列的DNA将每一个假定启动子/5’UTR区域构建体经由同源重组引入到Prototheca moriformis UTEX1435中。同样包含在该构建体中的是来自酿酒酵母的suc2蔗糖转化酶基因，该蔗糖转化酶基因用于在含有蔗糖的培养基/平板上进行阳性克隆选择。针对Aat01的构建体的相关部分的cDNA序列作为SEQ ID NO:67在序列表中列出。对于其他构建体而言，使用了相同的骨架，仅有的变化是该假定启动子/5’UTR序列。产生了另外的控制型转基因株系，其中使用莱茵衣藻β-微管蛋白启动子来驱动樟树硫酯酶基因的表达。这个启动子已经显示出驱动感兴趣的基因的组成型表达，并且因此提供了一种有用的对照，当受到所测试的不同的假定N-调节的启动子/5’UTR驱动时，相对于该对照来测量相同的硫酯酶的信息。
一旦产生这些转基因克隆，则进行三个单独的实验。前两个实验通过经由RT-PCR、脂肪酸谱以及培养物上清液中的氨水平而测量稳态硫酯酶mRNA水平来评定所有八个假定启动子的潜在氮调节能力（nitrogen regulatability）。最初使克隆在28℃在富氮种子培养基（1g/L硝酸铵-15mM作为氨的氮，4g/L酵母提取物）中在搅拌（200rpm）下生长24至48小时，此时将20OD单位（A750）用于接种50ml的低氮培养基（0.2g/L硫酸铵-3mM作为氨的氮，0.2g/L酵母提取物）。每24小时对细胞进行取样，持续6天，并且恰好在转换至低氮条件之前也采集样品。然后使用Trizol试剂（根据生产商建议的方法）将来自每一样品的细胞的一部分用于总RNA提取。氨测定揭示，在低氮培养基的情况下在24小时之后在上清液中的氨水平落到检测限（约100μM）以下。
对于实时RT-PCR而言，针对每一时间点将所有RNA水平标准化到在Prototheca moriformis（UTEX1435）中表达的内部对照RNA的水平。该内部对照RNA（称作cd189）是ARG9基因的产物，该基因编码N-乙酰鸟氨酸转氨酶。在这些实验中用于实时RT-PCR的引物集是：
Figure BDA00003613748601581
还产生了来自每一时间点的每一转化子的脂质谱并且将其与RT-PCR结果进行比较。基于氨水平、RT-PCR结果以及C12-C14脂肪酸水平的变化，可以得出结论：氨基酸转运蛋白01（Aat-01）、氨基酸转运蛋白04（Aat-04）、以及氨基酸转运蛋白02（Amt-02）序列确实含有功能性氮可调节启动子/5’UTR。
根据RT-PCR结果，Aat-01显示出驱动稳态樟树硫酯酶mRNA水平高达比对照（莱茵衣藻β-微管蛋白启动子）高四倍的能力。mRNA水平还与氮限制和C12-C14脂肪酸水平的显著增加相关。这些结果证明，与Aat-01启动子相关联的5’UTR在脂质生物合成下驱动蛋白质合成方面可能比对照莱茵衣藻启动子更有效。类似于Aat-01启动子，Aat-04启动子能够驱动mRNA积累高达比莱茵衣藻对照启动子驱动的mRNA积累高五倍。然而，Aat-04启动子构建体仅仅产生了适度的影响C12-C14脂肪酸水平的能力。这些数据证明，Aat-04启动子显然可受氮耗尽调节，但是与该启动子关联的UTR作为转录增强子可能功能不良。最后，Amt-02启动子与Aat-01启动子类似，因为它能够驱动mRNA积累高达比对照启动子驱动的mRNA积累高三倍。mRNA水平还与氮限制和C12-C14脂肪酸水平的显著增加相关。总之，证明了这些启动子中的所有三个是受氮调节的。
B.铵转运蛋白3（amt03）启动子的进一步表征以及不同硫酯酶的表达。
如上所述，鉴定了称作铵转运蛋白02和03（amt02和amt03）的部分cDNA。连同这两部分cDNA，还鉴定了称作铵转运蛋白01（amt01）的一个第三部分cDNA。将该部分cDNA与假定的翻译的氨基酸序列的比对进行了比较。结果显示在这三个序列中amt01关系较远，而amt02与amt03仅有一个单一氨基酸不同。
启动子/5’UTR最初是通过将这些部分cDNA序列与上述Roche454基因组DNA装配和Illumina转录组装配进行序列比对用计算机模拟而产生的。对显示出与编码amt01、amt02、以及amt03的cDNA一致性的转录重叠群进行了鉴定，然而，这些转录重叠群不能在这三个mRNA之间区分，因为这些重叠群包含所有这三者共享的序列。Roche454基因组DNA装配给出了与amt02和amt03cDNA序列的匹配（hits）并且包含N-端蛋白质序列。进行PCR来克隆5’侧翼区。用来确认克隆amt02和amt03启动子/UTR的PCR引物是：
Amt03正向：5’-GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3’（SEQ ID NO:85）
Amt03反向：5’-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3’（SEQ ID NO:86）
Amt02正向：5’-GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3’（SEQ ID NO:87）
Amt02反向：5’-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG-3’（SEQ ID NO:88）
在两情形中，这些5’与3’引物包含对于预期地克隆进入表达载体有用的限制性酶切位点以验证这些启动子/5’UTR区域的功能。
在通过这一组合的计算机模拟以及基于PCR的方法而克隆的DNA与编码amt02（SEQ ID NO:61）以及amt03（SEQ ID NO:60）的原始cDNA进行了逐对比对。这些比对的结果显示了这些原始cDNA与这些克隆的基因组序列之间的显著不同，这说明铵转运蛋白似乎代表一个多样的基因家族。另外，amt03的基于该组合方法的启动子/5’UTR克隆与原始amt03序列不同，而amt02序列则是一致的。进行了进一步的实验来表征该amt03启动子/UTR序列（SEQ ID NO:89）并且描述于下。
通过克隆这个假定启动子/UTR序列测试了以上鉴定的amt03启动子/UTR序列（SEQ ID NO:89），以便驱动四种不同硫酯酶的表达。该表达盒包含针对基因组的6S基因座的上游和下游同源重组序列（分别是SEQ ID NOs:82和84）。该盒还包含酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶cDNA以便能够在含蔗糖培养基上进行阳性克隆选择。该蔗糖转化酶表达受莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的驱动并且还包含普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR。然后将该amt03启动子/UTR序列克隆在该蔗糖转化酶盒的下游，继之为来自以下四种硫酯酶基因之一的框内硫酯酶cDNA序列：(1)来自樟树的C14硫酯酶；(2)来自加州月桂的C12硫酯酶；(3)来自美洲榆的C10-C16硫酯酶；或(4)来自萼距花的C10硫酯酶并且还包含普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR。该C14樟树硫酯酶、C12加州月桂硫酯酶、C10-C16美洲榆硫酯酶都包含来自原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶的转运肽。该C10萼距花硫酯酶包含来自Prototheca moriformis Δ12脂肪酸去饱和酶（FAD）的转运肽。在所有情况下，对这些序列针对在Protothecamoriformis中表达进行了密码子优化。针对前述的硫酯酶构建体的序列描述于序列表中：
通过如在实例2中描述的进入野生型Prototheca moriformis细胞的生物射弹转化方法产生了转基因系并且在含有蔗糖的平板/培养基上进行选择。然后针对其脂肪酸谱被改变的程度来筛选阳性系。然后另外地分析了用上述四个构建体的每一个进行转化而得到的四个系。系76表达樟树C14硫酯酶，系37表达加州月桂C12硫酯酶，系60表达美洲榆C10-C16硫酯酶，并且系56表达萼距花C10硫酯酶。使每个系在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长48小时并且在14、24、36以及48小时取出细胞样品（种子培养）用于通过直接酯交换到脂肪酸甲酯和随后的借助于GC-FID的分析（以上所述）来确定脂肪酸谱并且用于分离总RNA。在48小时结束时，将这些细胞用来接种不具有氮或具有低水平氮（含有蔗糖作为唯一碳源）的、维持在pH5.0（柠檬酸盐缓冲的，0.05M终浓度）或pH7.0（HEPES缓冲的，0.1M终浓度）的培养基。在12、24、72以及108小时取出培养物样品（脂质产生）用于脂肪酸谱分析和总RNA分离。这些培养物的氨测定揭示，在低氮培养基的情况下在24小时之后氨水平落到检测界限（大约100μM）以下。
对从在以上每一时间点收集的总RNA进行硫酯酶的mRNA水平实时RT-PCR测定并且将所有mRNA水平相对于内部对照RNA（cd189）的水平进行标准化。在实时PCR中使用的引物集显示于下表31：
表31.用于实时PCR的引物集。
Figure BDA00003613748601611
来自种子培养阶段的每一时间点的脂肪酸谱的结果显示出极小的来自硫酯酶的影响。随着脂质产生阶段的开始，这些脂肪酸谱受到显著影响，与维持在pH5.0的培养物比较，对于维持在pH7.0的培养物而言这些增加显著得多。虽然pH在7.0与pH5.0目标脂肪酸积累之间的差异的大小随着每一测试的硫酯酶而变化，但是总体效果是相同的：在pH5.0生长的细胞显示出显著较低水平的目标脂肪酸积累，但是与对照野生型细胞相比较多。
从这些相同的样品分离的RNA的分析与脂肪酸谱数据非常好地相关联，因为培养pH对每一硫酯酶的稳态mRNA水平具有明显影响。将脂肪酸积累数据与mRNA数据一起考虑，由amt03启动子/UTR驱动的硫酯酶基因表达的pH调节在转录水平、mRNA稳定性或两者上被明显介导。另外，观察到加州月桂mRNA的稳态水平与萼距花mRNA的稳态水平相比低四个对数级。这一观察与这样的假设一致：单独的mRNA序列可能在控制表达中起作用。这些数据暗示通过amt03家族转运蛋白的在Prototheca moriformis中的铵摄入与pH直接偶联。
对于从用驱动美洲榆C10-C16硫酯酶表达的构建体amt03启动子/UTR转化Prototheca moriformis细胞而产生的十二个系进行了另外的脂肪酸谱分析。系60，如上所述，是以下分析的一部分。以下表32显示了与野生型对照一起分析的十二个系中的三个的脂质谱。
表32.包含由amt03启动子/UTR驱动的美洲榆TE的转化子的脂肪酸谱。
面积% C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 总饱和物
野生型 0.00 0.01 0.04 1.27 27.20 3.85 58.70 7.18 32.36
系40 2.38 20.61 3.41 28.41 29.92 1.91 8.57 3.74 86.64
系44 1.50 20.16 4.44 31.88 26.66 1.88 6.95 5.42 86.50
系60 0.98 14.56 3.15 27.49 31.76 2.14 12.23 6.36 80.06
如在上表中展示，在株系40的情形中与野生型相比，总饱和物的水平比野生型的总饱和物水平大幅增加了2.6倍多（所分析的来自这十二个株系的总饱和物的范围是从大约63%至超过86%）。另外，当在这些水平表达时，美洲榆硫酯酶显著降低了不饱和物的水平，尤其是C18:1以及C18:2（参见系40和44），在系44的情况下，C18:1水平与野生型相比降低了8倍以上。同样，美洲榆硫酯酶（由amt03启动子驱动）大大增加了中链脂肪酸的水平。系44显示出大于56%的C10:0-C14:0水平（比在野生型株系中所见到的水平大约高42倍）以及大于57%的C8:0-C14:0水平。用Amt03启动子驱动美洲榆硫酯酶表达的构建体转化的另外的株具有代表性的脂质谱：0.23%C8:0、9.64%C10:0、2.62%C12:0、31.52%C14:0、37.63%C16:0、5.34%C18:0、7.05%C18:1、以及5.03%C18:2，具有在86.98%的总饱和物百分比。
从用驱动萼距花C10硫酯酶（SEQ ID NO:94）表达的构建体amt03启动子/UTR（SEQ ID NO:89）转化Prototheca moriformis细胞而产生了另外的脂质谱。选择表达这种构建体的阳性克隆并且使其在pH7.0条件下生长。来自一个阳性克隆的代表性脂质谱是：9.87%C8:0、23.97%C10:0、0.46%C12:0、1.24%C14:0、10.24%C16:0、2.45%C18:0、42.81%C18:1、以及7.32%C18:2。这个克隆具有33.84的C8-C10百分比。
总之，这些数据说明，amt03启动子/UTR、以及其他与其类似的启动子可以用作一种受紧密调节的启动子，这对于表达一种具有潜在毒性的化合物可能是特别有用的并且需要基因表达的严格增强。Prototheca moriformis在宽范围的pH方案（至少pH5.0至7.0）下生长的能力使这种微生物与调节元件如amt03启动子/UTR结合特别有用。另外，以上的脂质谱数据证明amt03启动子/UTR驱动基因表达的令人印象深刻的能力。
实例6：改变微藻Prototheca moriformis中的饱和脂肪酸的水平
A.通过基因敲除途径减少硬脂酰ACP去饱和酶和Δ12脂肪酸去饱和酶表达
作为使用基于生物信息学的方法基于cDNA的基因组筛选（来自Protothecamoriformis（UTEX1435）的基因组DNA的Illumia转录组和Roche454测序）的部分，鉴定到涉及脂肪酸去饱和的特定两组基因：硬脂酰ACP去饱和酶（SAD）和Δ12脂肪酸去饱和酶（Δ12FAD）。硬脂酰ACP去饱和酶酶是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键导入脂肪酰基链中，例如，从C18:0脂肪酸合成C18:1脂肪酸。Δ12脂肪酸去饱和酶也是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键导入已经不饱和的脂肪酸中，例如，从C18:1脂肪酸合成C18:2脂肪酸。使用基于在生物信息学工作期间已经鉴定的两类脂肪酸去饱和酶基因的探针，Southern印迹分析表明每一类去饱和酶基因可能由多个家族成员组成。另外，编码硬脂酰ACP去饱和酶的基因落入两个不同的家族。基于这些结果，设计了三个基因破坏构建体以通过靶向每个去饱和酶酶家族内的更高度保守的编码区潜在地破坏多个基因家族成员。
使用以下序列，设计3个同源重组靶向构建体：(1)Δ12脂肪酸去饱和酶（d12FAD）家族成员的编码序列的高度保守部分和(2)靶向两个不同SAD家族的每个成员的两个构建体，每个构建体具有来自每个家族的编码序列保守区域。这种策略将选择标记基因（赋予水解蔗糖的能力的来自酿酒酵母的suc2蔗糖转化酶盒）嵌入这些高度保守的编码区（靶向多个家族成员）内，而不是经典的基因替换策略，其中同源重组将靶向该靶向基因的侧翼区。
通过生物射弹转化，使用上文描述的方法，将所有构建体导入细胞中，并且将构建体在射击到细胞中之前线性化。在含有蔗糖的平板/培养基上选择转化子，并且使用上述方法测定脂质谱的变化。下文列出了来自三个靶向构建体中的每一个的相关序列。
Figure BDA00003613748601641
Figure BDA00003613748601651
挑出来自用每种构建体转化的代表性阳性克隆，然后确定这些克隆的脂质谱（以面积%表示）并且将其汇总在以下表33中。
表33.去饱和酶敲除的脂质谱。
每种构建体对所希望类别的脂肪酸产生可度量的影响，并且在所有3种情况下，C18:0水平明显增加，尤其随着两个SAD敲除的情况下。进一步比较来自SAD敲除的多个克隆表明，SAD2B敲除系在C18:1脂肪酸方面比随SAD2A敲除系所观察到的C18:1脂肪酸水平具有明显更大的减少。
使用上文描述的方法在Prototheca moriformis背景中产生另外的Δ12脂肪酸去饱和酶（FAD）敲除。为了鉴定Δ12FAD的潜在同源物，使用了以下引物，以便扩增编码假定FAD的基因组区域：
引物15’-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3’  SEQ ID NO:101
引物25’-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3’  SEQ ID NO:102
从使用以上引物的Prototheca moriformis基因组DNA的基因组扩增产生的序列是高度相似的，但是表明多个基因或Δ12FAD等位基因存在于无绿藻属中。
基于这种结果，设计了两个基因破坏构建体以寻求失活一个或多个Δ12FAD基因。该策略会将蔗糖转化酶（来自酿酒酵母的suc2）盒（因此赋予水解蔗糖能力作为选择标记）嵌入高度保守的编码区中，而不是使用经典的基因替换策略。第一构建体，称作pSZ1124，含有在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR侧翼的5’和3’基因组靶向序列（酿酒酵母suc2盒），其中所述莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动酿酒酵母suc2基因的表达。第二构建体，称作pSZ1125，含有在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR侧翼的5’和3’基因组靶向序列，其中所述莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动酿酒酵母suc2基因的表达。构建体的相关序列列出在序列表中：
将pSZ1124和pSZ1125分别导入Prototheca moriformis背景，并且基于水解蔗糖的能力选择阳性克隆。表34汇总了在使用pSZ1124和pSZ1125打靶载体的两个转基因系中所获得的脂质谱（以面积%表示，使用上文描述的方法产生）。
表34.Δ12FAD敲除的脂质谱
Figure BDA00003613748601662
含有FAD2B（pSZ1124）的转基因构建体在脂质谱方面产生十分有趣和出乎意料的结果，在于预期下降的C18:2水平仅下降大约一个面积%。然而，C18:1脂肪酸水平显著地增加，几乎完全以显著下降的C16:0水平为代价。含有FAD2C（pSZ1125）的转基因构建体也产生脂质谱变化：C18:2的水平显著降低，同时C18:1水平相应增加。
牛脂模拟
将从如以上所述的SAD2B敲除实验产生的一个阳性克隆选择为用作进一步引入C14偏好型脂肪酰基-ACP硫酯酶基因的背景。引入樟树C14偏好型硫酯酶的构建体包含针对6S基因组区域的靶向序列（允许转化DNA通过同源重组进行靶向整合）并且该表达构建体包含驱动具有普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的neoR基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，随后是驱动具有原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的、具有一个第二普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的密码子优化的樟树硫酯酶的表达的一个第二莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。该5’6S基因组供体序列在SEQ ID NO:82中列出；该3’6S基因组供体序列在SEQ ID NO:84中列出，并且该樟树硫酯酶的相关表达构建体在SEQ ID NO:83中列出。
使用上述的生物射弹方法进行转化并且允许这些细胞在含有2%蔗糖的平板上恢复24小时。在此时间之后，将这些细胞再悬浮并且重新铺板在含有2%蔗糖和50μg/ml G418的用于选择的平板上。从所产生的阳性克隆中选出九个克隆用于脂质生产和脂质谱分析。将这九个转基因克隆（具有SAD2B KO并且表达樟树C14偏好型硫酯酶）如上述进行培养并且针对脂质谱进行分析。这些结果汇总在以下表35中。动物脂的脂质谱也包括在下表35中（国家研究委员会1976：动物产品的脂肪含量和组成（National Research Council1976:Fat Content and Composition of AnimalProduct））。
表35.硫酯酶转化的克隆的脂质谱。
Figure BDA00003613748601671
Figure BDA00003613748601681
如在表35中所见，这些转基因系的脂质谱与动物脂的脂质谱十分类似。总的来看，这些数据证明了将特定转基因背景（在这种情况下是SAD2B敲除）与C14偏好型硫酯酶（来自樟树）结合来产生可以产生类似于动物脂的脂质谱的转基因藻株的效用。
B.下调无绿藻细胞中Δ12去饱和酶基因（FADc）的RNAi途径
将通过RNAi下调FADc（Δ12去饱和酶基因）基因表达的载体导入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。使用酿酒酵母suc2蔗糖转化酶基因作为选择标记，从而赋予阳性克隆在作为唯一碳源的蔗糖上生长的能力。第一个类型的构建体利用FADc编码区第一外显子的一部分，这个部分以順式方式连接于其第一内含子，后接处于反方向的第一外显子重复单元。当表达为mRNA时，这种类型的构建体理论上导致发夹RNA的形成。产生了这种第一类型的两个构建体，一个构建体由Prototheca moriformis Amt03启动子（SEQ ID NO:89）驱动，称作pSZ1468，并且第二构建体由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子（SEQ ID NO:114）驱动，称作pSZ1469。第二个类型的构建体利用处于反义方向的大FADc外显子2，由Prototheca moriformisAmt03启动子（SEQ ID NO:89）驱动，称作pSZ1470，或者由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子（SEQ ID NO:114）驱动，称作pSZ1471。所有4个构建体具有酿酒酵母suc2蔗糖转化酶盒（SEQ ID NO:159）和针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体的侧翼）。每种RNAi构建体的FADc部分的序列连同每种构建体的相关部分在序列表中列出为：
Figure BDA00003613748601691
将这4个构建体的每一个转化到Prototheca moriformis背景中，并且使用含有蔗糖作为唯一碳源的平板筛选阳性克隆。从每个转化中挑取阳性克隆，并且选择亚组以确定pSZ1468、pSZ1469、pSZ1470和pSZ1471中所含的发夹和反义盒对脂肪酸谱的影响。在产生脂质的条件下使从每个转化中选择的克隆生长，并且使用如上文所述的直接酯交换法确定脂质谱。来自每个转化的代表性脂质谱汇总在以下表36中。野生型1和2细胞是未转化的Prototheca moriformis细胞，它们作为阴性对照与每个转化子进行操作。
表36.含有RNAi构建体以下调Δ12去饱和酶基因（FADc）表达的Protothecamoriformis细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601701
Figure BDA00003613748601711
以上总结的结果显示，发夹构建体pSZ1468和pSZ1469显示出特定的预期表型，即，分别与野生型1和野生型2相比，C18:2脂肪酸水平降低和C18:1脂肪酸水平增加。反义构建体pSZ1470和pSZ1471不导致C18:2脂肪酸水平下降，但是当分别与野生型1和野生型2相比时，反而显示略微增加，和C16:0脂肪酸水平略微下降。
C.外源硬脂酰-ACP去饱和酶的表达
将油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶（GenBank登录号AAB67840.1）导入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下，并且将天然转运肽替换为原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽（SEQ ID NO:49）。密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列（具有替换的转运肽）在序列表中分别作为SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172列出。将整个油橄榄SAD表达盒称作pSZ1377并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如上文所述的直接酯交换法确定脂质谱。所选择的克隆的脂质谱汇总在以下表37中。
表37.油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶转基因Prototheca moriformis细胞的脂质谱。
Figure BDA00003613748601721
以上总结的结果表明，导入异源去饱和酶（在这种情况下来自油橄榄的硬脂酰-ACP去饱和酶）可以导致更高水平的C18:1脂肪酸和C18:0和C16:0脂肪酸水平的同时下降。
实例7：工程化无绿藻属以生产羟化脂肪酸
将蓖麻油酸12-羟化酶（Rc12hydro）（GenBank登录号AAC49010.1）导入到Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。该表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。该蓖麻油酸12-羟化酶编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下。在序列表中分别作为SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174列出密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列。将整个Rc12hydro表达盒称作pSZ1419并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用GC/MS方法针对蓖麻油酸12-羟化酶的产物（即，蓖麻油酸）进行筛选。
用来检测任何在阳性Rc12hydro转基因中的蓖麻油酸的GC/MS方法如下。将阳性克隆和野生型对照的样品进行干燥并且然后悬浮于2.2mL的在10:1（v/v）甲醇-甲苯中的4.5H2SO4中。然后将该混合物在间断声处理和涡旋下在70℃-75℃加热3.5小时。在冷却至室温之后，添加2mL的6%K2CO3（水性）和2mL庚烷，然后将该混合物进行剧烈涡旋并且通过在900rpm离心2分钟来加速各层的分离。将上层移出并且用氮流浓缩至干燥。向得到的油添加500μL干吡啶和500μL BSTFA/1%TMCS（赛默飞世尔公司（Thermo Scientific））。将得到的溶液在70℃-75℃加热1.5小时并且然后用氮流浓缩至干燥。然后将残余物再悬浮于2mL的庚烷中并且进行再浓缩。将样品再悬浮于2mL的庚烷中并且通过GC/MS在Thermo Trace GC Ultra/DSQII系统上以EI模式使用任一蓖麻油酸甲酯TMS的基峰的选择性粒子监测（m/z187）进行分析。将脂肪酸甲酯在Restek Rxi-5Sil MS柱上进行分离（0.25mm ID，30m长，0.5μm膜厚度），使用氦作为载气，流速为1mL/min。将该柱的初始温度保持在130℃持续4分钟，接着是4℃/min的倾斜升温至终温度240℃。通过将保留时间和全扫描质谱与按上述处理的蓖麻油酸真实试样进行比较来证实样品中蓖麻油酸的存在。图2显示了与蓖麻油酸标准品和野生型对照相比较的代表性阳性转基因克隆的GC保留时间。该阳性转基因克隆在RT:33.22/33.23处具有一个可衍生的峰，这与蓖麻油酸标准品中的一个类似峰相应，从而指示可衍生蓖麻油酸存在于该转基因克隆和该阳性对照两者中。在野生型对照样品中完全缺乏这个峰。
实例8：用可替代的选择标记将无绿藻属工程化
A.可分泌的α-半乳糖苷酶在Prototheca moriformis中的表达
先前已经在PCT申请号PCT/US2009/66142中描述了在无绿藻种类中表达异源蔗糖转化酶基因的方法和效果，所述专利特此通过引用进行结合。在这个实例中检测了其他异源多糖降解酶的表达。测试了具有编码α-半乳糖苷酶的以下外源基因之一的Prototheca moriformis UTEX1435在蜜二糖（α-D-gal-glu）上生长的能力：来自卡尔酵母（Saccharomyces carlbergensis）的MEL1基因（相应于NCBI登录号P04824的氨基酸序列）、来自黑曲霉的AglC（相应于NCBI登录号Q9UUZ4的氨基酸序列）、以及来自高等植物Cyamopsis tetragobobola（瓜儿豆）的α-半乳糖苷酶（相应于NCBI登录号P14749的氨基酸序列）。将以上登录号和相应的氨基酸序列特此通过引用进行结合。在所有情况下，根据Prototheca moriformis中的优选密码子使用对基因进行优化。该表达盒的相关部分连同序列表编号列于下文。所有表达盒使用用于稳定基因组整合的5’和3’Clp同源重组靶向序列、莱茵衣藻TUB2启动子/5’UTR、以及普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR。
Figure BDA00003613748601741
利用如在以上实例2中所述的生物射弹转化方法，用含有卡尔酵母MEL1、黑曲霉AlgC、或瓜儿豆α-半乳糖苷酶基因的三个表达盒中的每一个对Protothecamoriformis细胞进行转化。使用含有2%蜜二糖作为唯一碳源的平板来筛选阳性克隆。对于瓜儿豆表达盒转化子而言，平板上没有出现集落。从含有卡尔酵母MEL1转化子和黑曲霉AlgC转化子的平板上挑选阳性克隆。使用靶向黑曲霉AlgC3’UTR和3’Clp同源重组靶向序列的一部分的引物进行PCR来证实转化DNA的整合。
5’引物普通小球藻3’UTR：下游Clp序列（SEQ ID NO:123）
ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
3’引物普通小球藻3’UTR：下游Clp序列（SEQ ID NO:124）
TCCAGGTCCTTTTCGCACT
作为阴性对照，还将来自未转化的Prototheca moriformis细胞的基因组DNA用该引物集进行扩增。从来自这些野生型细胞的基因组DNA未扩增出产物。
对于来自卡尔酵母MEL1转化子和黑曲霉AlgC转化子（如通过PCR所证实的）中的每一个的一些阳性克隆，测试了它们在液体培养基中在作为唯一碳源的密二糖上生长的能力。在以上实例1中所述的条件和基础培养基中、以密二糖作为唯一碳源使这些选择的克隆生长3天。在这一时间期间，所有含有α-半乳糖苷酶编码基因的克隆都健壮生长，而未转化的野生型株系和表达酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶的Prototheca moriformis在该密二糖培养基上都生长不良。这些结果说明α-半乳糖苷酶编码基因可以用作一个用于转化的选择标记。同样，这些数据说明在卡尔酵母MEL1（SEQ ID NO:109）或黑曲霉AlgC（SEQ ID NO:117）中存在的天然信号肽有用于将蛋白质靶向到Prototheca moriformis细胞的周质。
B.无绿藻属中硫胺素营养缺陷的THIC基因补偿
使用外源THIC基因的表达来检测Prototheca moriformis细胞中的硫胺素营养缺陷。植物和藻类中的硫胺素生物合成典型地是在质体中进行的，因此多数参与其产生的核编码蛋白将需要有效地靶向到质体。Prototheca moriformis细胞的DNA测序和转录组测序揭示：除了THIC之外，所有编码硫胺素生物合成酶的基因都存在于基因组中。为了在生物化学水平剖析负责硫胺素营养缺陷的损害，在五种不同方案下对Prototheca moriformis细胞的生长进行了检测。（1）在2μM盐酸硫胺素的存在下；（2）无硫胺素；（3）无硫胺素，但具有2μM羟乙基噻唑（THZ）；（4）无硫胺素，但具有2μM的2-甲基-4-氨基-5-(氨甲基)嘧啶（PYR）；以及（5）无硫胺素，但具有2μM的THZ以及2μM的PYR。在这5种不同条件下的生长实验的结果表明：Prototheca moriformis细胞能够进行从头合成，但如果提供PYR前体则仅产生焦磷酸硫胺素（TPP）。这个结果与以下假设一致：Prototheca moriformis的硫胺素营养缺陷是由于不能从氨基咪唑核糖核苷酸合成羟甲基嘧啶磷酸酯（HMP-P），而这是由THIC酶来转化催化的。
使用如在以上实例2中所述的生物射弹转化方法对Prototheca moriformis细胞进行转化，表达胶球藻属C-169THIC（相应于JGI蛋白ID30481的氨基酸序列，并且特此通过引用而结合）和作为选择性标记的酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶。这种表达构建体包含来自胶球藻属C-169THIC的天然转运肽、到基因组DNA6S区域的上游和下游同源重组靶向序列、莱茵衣藻TUB2启动子/5’UTR区域（SEQ ID NO:104）、以及普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR（SEQ ID NO:115）。酿酒酵母SUC2表达也由莱茵衣藻TUB2启动子/5’UTR区域（SEQ ID NO:114）驱动并且包含普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR（SEQ ID NO:115）。根据Prototheca moriformis中的优选密码子使用来优化基因。相关表达盒序列在序列表中列出并且详述于下文：
在不含硫胺素并且含有蔗糖作为唯一碳源的平板上进行阳性克隆的筛选。利用在胶球藻属C-169THIC基因之内结合的5’引物以及在6S基因座中的转化DNA的下游退火的3’引物通过PCR来证实阳性克隆。还使用Southern印迹测定来确认经PCR证实的阳性克隆。
为了观察野生型Prototheca moriformis细胞的硫胺素营养缺陷，需要首先耗尽细胞的内部硫胺素储备。为了测试在无硫胺素的培养基中的生长，首先使细胞在含有2μM硫胺素的培养基中生长至静止期并且然后将这些细胞在无硫胺素的培养基中稀释至在750nm（OD750）处大约0.05的光密度。然后使这些稀释的细胞在无硫胺素的培养基中再一次生长至静止期（大约2-3天）。这些硫胺素耗尽的细胞被用来在无硫胺素的培养基中接种用于生长研究的培养物。使野生型细胞在具有葡萄糖作为碳源的培养基（具有或不具有硫胺素）中生长并且使具有天然转运肽胶球藻属C-169THIC构建体的阳性克隆具有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。通过监测在750nm处的吸光度来量度生长。这些生长实验的结果表明：与无硫胺素的培养基中的野生型细胞相比较，表达转基因的株系在无硫胺素的培养基中的生长实质性地更为良好。然而，这些转化子未能达到野生型细胞在含有硫胺素的培养基中的生长速率和细胞密度。在无硫胺素的培养基中这些转化子克隆的生长的量与整合的胶球藻属酶的拷贝数之间存在着强的关联（即，该转基因的拷贝数越多，则这些细胞在无硫胺素的培养基中生长越好）。
使用包含胶球藻属THIC、拟南芥THIC基因、以及集胞藻种类PCC6803thiC基因的表达构建体产生了另外的转化子。在胶球藻属和拟南芥THIC基因的情况下，将天然转运肽序列替换为来自原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD）基因的转运肽序列。集胞藻种类是一种蓝藻并且该thiC蛋白不包含天然转运肽序列。在集胞藻种类thiC构建体中，来自原始小球藻SAD基因的转运肽序列与集胞藻种类thiC的N端融合。在所有情况下，对这些序列针对在Prototheca moriformis中表达进行了密码子优化。所有前述三种构建体都包含针对基因组的6S区域的上游和下游同源重组靶向序列（SEQ ID NOs:82和84）、原始小球藻肌动蛋白启动子/5’UTR、以及原始小球藻EF1A基因3’UTR。所有三种构建体都包含由莱茵衣藻TUB2启动子/5’UTR（SEQ ID NO:114）驱动的neoR基因并且包含普通小球藻3’UTR（SEQ ID NO:115），从而赋予通过G418的选择性。拟南芥THIC的氨基酸序列相应于NCBI登录号NP_180524并且集胞藻种类thiC的氨基酸序列相应于NCBI登录号NP_442586，特此将两个序列通过引用而结合。相关表达盒序列在序列表中列出并且详述于下文：
Figure BDA00003613748601781
在含有G418的平板上筛选阳性克隆并且从每一转化挑选一些克隆用于通过PCR进行验证。使用以下引物通过PCR来确认包含胶球藻属C-169（具有原始小球藻转运肽）、拟南芥以及集胞藻种类PCC6803THIC基因的转化DNA分别在基因组6S基因座中的整合：
5’THIC胶球藻属确认引物序列（SEQ ID NO:141）
ACGTCGCGACCCATGCTTCC
3’THIC确认引物序列（SEQ ID NO:142）
GGGTGATCGCCTACAAGA
5’THIC拟南芥确认引物序列（SEQ ID NO:143）
GCGTCATCGCCTACAAGA
5’thiC集胞藻种类确认引物序列（SEQ ID NO:144）
CGATGCTGTGCTACGTGA
在含有G418的培养基中，使用来自每一个这些不同构建体的转化子的经选择的证实的阳性克隆对硫胺素耗尽细胞（如上述）进行了生长实验。所有转化子都能够在无硫胺素的培养基中生长（健壮程度不同）。在无硫胺素培养基中的这些转化子的生长与在含有硫胺素的培养基上的野生型细胞的比较显示出以下有关它们在无硫胺素培养基中支持生长的能力的等级评定：(1)拟南芥转化子；(2)胶球藻属C-169（具有原始小球藻转运肽）转化子；以及(3)集胞藻种类转化子。这些结果说明：虽然拟南芥THIC的单一拷贝能够补偿Prototheca moriformis细胞中的硫胺素营养缺陷，但是需要胶球藻属C-169的多个拷贝（具有天然转运肽序列或来自原始小球藻的转运肽序列）以及集胞藻种类THIC以允许在没有硫胺素的情况下快速生长。考虑到来自不同来源的不同THIC的结果的变异性，任何特定的THIC基因完全补偿无绿藻种类中存在的损害的能力不是可预测的。
对这三个THIC氨基酸序列进行了比对。虽然与来自胶球藻属和拟南芥的THIC相比较来自集胞藻种类的thiC之间存在显著的序列保守（在氨基酸水平上41%的一致性），蓝藻蛋白在N端缺少一个结构域，该结构域在藻类和植物蛋白质中是非常保守的。尽管缺少该结构域（并且推测上导致结构差异），表达集胞藻种类thiC的构建体能够至少部分地恢复Prototheca moriformis细胞中的硫胺素原养型（prototrophic）。
实例9：燃料生产
A.使用螺旋榨机和压榨辅料（press aid）从微藻提取油
利用转鼓式干燥器使含有38%油（以DCW计算）的微藻生物质干燥，导致获得5%-5.5%的水分含量。将这种生物质传送至L250弗氏压碎器（French L250press）中。将30.4kg（67lbs.）生物质传送通过该压碎器，并且没有回收油。传送相同的与不同百分比的作为压榨辅料的柳枝稷组合的干燥微生物生物质通过该压碎器。干燥微生物生物质和20%w/w柳枝稷的组合产生最好的总体油回收百分比。然后使榨饼经受己烷提取并且20%柳枝稷条件下的最终产率是61.6%的总可获得油（以重量计算）。具有超过50%油干细胞重量的生物质不需要使用压榨辅料（如柳枝稷）来释放油。在PCT申请号PCT/US2010/31108中描述了使用螺旋榨机从微藻中提取油的其他方法，所述专利通过引用结合在此。
B.从无绿藻油生产生物柴油
使来自Prototheca moriformis（UTEX1435）的脱胶油（根据上述方法产生）经受酯交换以产生脂肪酸甲酯。结果显示于以下表38中。
该油的脂质谱是：
C10:0 0.02
C12:0 0.06
C14:0 1.81
C14.1 0.07
C16:0 24.53
C16:1 1.22
C18:0 2.34
C18:1 59.21
C18:2 8.91
C18:3 0.28
C20:0 0.23
C20:1 0.10
C20:1 0.08
C21:0 0.02
C22:0 0.06
C24:0 0.10
表38.来自Prototheca moriformis甘油三酯油的生物柴油谱。
Figure BDA00003613748601801
Figure BDA00003613748601811
Figure BDA00003613748601821
该生物柴油的脂质谱与该原料油的脂质谱高度类似。可以使通过这些方法提供的其他油以及本发明的组合物经受酯交换以产生具有多种脂质谱的生物柴油，这些脂质谱包括(a)至少4%C8-C14；(b)至少0.3%C8；(c)至少2%C10；(d)至少2%C12；以及(3)至少30%C8-C14。
根据ASTM D6751 A1方法，生产的生物柴油的冷浸过滤性是300ml体积120秒。这种测试包括过滤300ml的B100，冷却至40℉持续16小时，允许加温至室温，并且在真空下使用0.7微米的具有不锈钢支撑的玻璃纤维过滤器进行过滤。本发明的油可以进行酯交换以产生具有少于120秒、少于100秒、以及少于90秒的冷浸时间的生物柴油。
C.可再生柴油的生产
使来自Prototheca moriformis（UTEX1435）的脱胶油（根据上述方法生产并且具有与在以上这个实例中用来制造生物柴油的油相同的脂质谱）经受酯交换以产生可再生柴油。
首先将该油氢化处理以去除氧和甘油骨架，从而产出n-石蜡。然后使这些n-石蜡经受裂解和异构化。该材料的色谱图显示于图1中。然后使该材料经受冷过滤，这去除了大约5%的C18材料。该冷过滤之后，将总体积材料转到（cut to）闪点并且针对闪点、ASTM D-86蒸馏分布、浊点以及粘度进行评估。闪点是63℃；粘度是2.86cSt（厘沱）；浊点是4℃。ASTM D-86蒸馏值显示于表39中：
表39.ASTM D-86蒸馏值。
以℃的读数：
Figure BDA00003613748601831
所产生的材料的T10-T90是57.9℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤），使用根据在此披露的方法生产的甘油三酯油来产生具有其他T10-T90范围（如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃以及65℃）的可再生柴油组合物。
所产生的材料的T10是242.1℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他T10值（如在180与295之间、在190与270之间、在210与250之间、在225与245之间、以及至少290的T10）的可再生柴油组合物。
所产材料的T90是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他T90值（如在280与380之间、在290与360之间、在300与350之间、在310与340之间、以及至少290的T90）的可再生柴油组合物。
所产生的材料的FBP是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分提方法（如冷过滤）来产生具有其他FBP值（如在290与400之间、在300与385之间、在310与370之间、在315与360之间、以及至少300的FBP）的可再生柴油组合物。
可以使通过本发明的方法和组合物提供的其他油经受氢化处理、异构化以及其他共价修饰的组合，这些油包括具有多种脂质谱的油，这些脂质谱包括(a)至少4%C8-C14；(b)至少0.3%C8；(c)至少2%C10；(d)至少2%C12；以及(3)至少30%C8-C14。
虽然已经结合其具体实施例描述了本发明，应当理解能够进一步修改。本申请旨在涵盖通常遵循本发明原理的本发明的任何变型、用途或适应性改变，并且包括这样的本披露的偏离，如落入本发明所属领域内已知或惯常的实践范围内或和如可能适用于在上文中所述的本质特征的偏离。
实例10：将微生物工程化以生产C18:2和C18:3甘油脂
在藻类和植物中的脂质合成开始于葡萄糖或其他碳源通过质体丙酮酸脱氢酶复合体转化为乙酰CoA。接下来，乙酰CoA羧化酶（ACCase）利用碳酸氢盐作为底物产生3-C化合物，丙二酰CoA。然后β-酮脂酰-ACP（酰基载体蛋白质）合成酶III（KAS III）催化丙二酰CoA与乙酰CoA之间的第一缩合反应以产生4-C化合物。由KAS I催化连续的直到C16:0的2-C加成。由KAS II催化最后的到C18:0的2-C延伸。硫酯酶（TE）终止酰基-ACP的延长。可溶性酶硬脂酰ACP去饱和酶（SAD）对于C18:0-ACP底物具有活性并且在Δ9位置形成双键，从而产生油酸-ACP。将产生的C18:1脂肪酸通过油酸酯或广谱特异性TE的作用从ACP上释放。
所有脂肪酸，一旦在质体中从ACP上释放，则被运输至ER，在此发生脂质（TAG）生物合成。广而言之，在高等植物的ER中有两条脂质生物合成途径，然而这两条途径无疑地在一定程度上共享底物。脂肪酰基CoA独立途径利用展示出非常具有选择性的底物特异性的酰基溶血卵磷脂酰基转移酶（acyllysophosphatidylcholineacyl transferase）在磷脂酰胆碱（P-胆碱）部分之间转移脂肪酰基基团，最终将它们转移至二酰甘油（DAG）。二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）进行最后的转移，将来自酰基CoA底物的脂肪酰基基团转移至DAG，从而产生最终的三酰甘油。另一方面，脂肪酰基CoA依赖途径使用脂肪酰基CoA作为底物通过甘油磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）以及DGAT的作用将脂肪酰基基团分别地转移到甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸（LPA）以及DAG上。
在将微生物工程化以合成包含C18:2和C18:3的TAG中有用的酶包括β-酮脂酰-ACP合成酶II（KAS II）、硬脂酰ACP去饱和酶（SAD）、硫酯酶（包括油酸特异性硫酯酶）、脂肪酸去饱和酶（FAD）以及甘油脂去饱和酶（如ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶）。可以将这些不同的酶单独地或组合地在微生物中过表达以增加C18:2或C18:3或TAG产量。增加KAS II酶活性的表达将碳积累从棕榈酸脂（C16:0）推向硬脂酸脂（C18:0）及以后。一些候选KAS II酶的氨基酸序列显示于以下表40中。披露的KAS II序列来自高等植物种类，这些种类特异性地产生水平提高的油酸、亚油酸或亚麻酸脂肪酸。技术人员将能够鉴定针对KAS II的其他基因，包括但不限于麻疯树（GenBank登录号ABJ90469.2）、大豆（GenBank登录号AAW88762.1）、美洲油棕榈（GenBank登录号ACQ41833.1）、拟南芥（GenBank登录号AAL91174）、葡萄（GenBank登录号CBI27767）、以及陆地棉（GenBank登录号ADK23940.1）。
表40.示例性的KAS II酶。
KAS II酶 SEQ ID NO
蓖麻 SEQ ID NO:175
向日葵 SEQ ID NO:176
甘蓝型油菜 SEQ ID NO:177
大豆 SEQ ID NO:178
P.moriformis SEQ ID NO:179
通过一种或多种脂质途径酶的微生物过表达而实现将水平增加的硬脂酸酯转变为油酸（C18:1），以便用于水平提高的亚油酸和亚麻酸脂肪酸的生产。在使不饱和物水平提高中具有效用的两种另外的酶活性是硬脂酰ACP去饱和酶（SAD）和油酸特异性硫酯酶。首先完成了将水平增加的硬脂酸酯（C18:0）通过这些酶中的一种或两种的作用转化为油酸，用于亚油酸和亚麻酸脂肪酸的形成。
对于用于使油酸水平提高的过表达有用的示例性的SAD酶的氨基酸序列引用于表41中。另外，来自Prototheca moriformis的内源SAD（SEQ ID NO:180）对于增加C18:1水平也是有效的。披露的SAD序列来自高等植物种类，这些种类特异性地产生水平提高的油酸、亚油酸或亚麻酸脂肪酸。技术人员将能够鉴定针对SAD的其他基因。
表41.示例性的SAD酶。
SAD酶 SEQ ID NO GenBank ID No.
蓖麻 SEQ ID NO:196 ACG59946.1
向日葵 SEQ ID NO:197 AAB65145.1
芥菜 SEQ ID NO:198 AAD40245.1
大豆 SEQ ID NO:199 ACJ39209.1
油橄榄 SEQ ID NO:200 AAB67840.1
油桐 SEQ ID NO:201 ADC32803.1
SAD酶对于C18:0-ACP底物具有活性并且在Δ9位置形成碳-碳双键，从而产生油酸-ACP。使产生的C18:1脂肪酸通过油酸酯或广谱特异性TE的作用从ACP上释放。我们在此处的这些实例中显示了油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶（登录号：AAB67840.1；SEQ ID NO:172）或红花（Carthamus tinctorius）ACP硫酯酶（登录号：AAA33019.1；SEQ ID NO:195）的过表达导致C18:1脂肪酸的积累增加。对于使油酸脂肪酸水平增加有用的示例性油酸硫酯酶的氨基酸序列引用于表42中。普通技术人员将能够鉴定针对油酸硫酯酶的其他基因。
表42.用于提高的油酸脂肪酸生产的示例性硫酯酶。
硫酯酶 SEQ ID NO GenBank ID No.
向日葵 SEQ ID NO:202 AAL79361.1
白菜型油菜 SEQ ID NO:203 AAC49002.1
麻疯树 SEQ ID NO:204 ABX82799.3
玉米 SEQ ID NO:205 ACG40089.1
玉米 SEQ ID NO:206 ACG42559.1
脂肪酸去饱和酶是另外的在增加微生物中的亚油酸和亚麻酸脂肪酸方面具有效用的酶。具体而言，两种酶活性，FAD2和FAD3，在微生物中提供了增加的亚油酸和亚麻酸脂肪酸积累。示例性的FAD2和FAD3酶的氨基酸序列显示于以下表43中。
表43.示例性的FAD2和FAD3酶。
除了在表43中列出的那些酶之外，示例性的Δ12FAD酶的氨基酸序列在表44中列出。适合用于在微生物中过表达的其他Δ12FAD酶引用于表45中。示例性的Δ15FAD以及对于增加不饱和脂肪酸和TAG水平有用的其他酶的氨基酸序列在表46中列出。另外的甘油脂去饱和酶提供于表47中。
表44.用于增加亚油脂肪酸生产的示例性Δ12FAD酶。
Figure BDA00003613748601881
表45.另外的适合用于在微生物中过表达以增加亚油酸或亚麻酸的Δ12FAD酶。
Figure BDA00003613748601882
Figure BDA00003613748601891
表46.用于增加亚麻酸脂肪酸生产的示例性Δ15FAD酶。
Figure BDA00003613748601892
表47.适合用于在微生物中过表达以增加亚麻酸或增加不饱和TAG水平的甘油脂去饱和酶。
甘油脂去饱和酶 GenBank登录号
大豆（Glycine max） ACD69577.1
Glycine max cultivar volania ACS15381.1
野大豆（Glycine soja） P48621.1
拟南芥 NP_180559.1
大花亚麻（Linum grandiflorum） BAG70949.1
玉米 BAA22440.1
油橄榄 ABG88130.2
麻疯树 ABX82798.1
油桐 CAB45155.1
油桐 AAD13527.1
利用在此披露的方法将在此披露的氨基酸序列表达于在微生物中。可以将编码序列针对在微生物中表达进行优化。例如，为了在Prototheca moriformis中表达，使用了如在此于表2中披露的优选密码子使用。
实例11：将微生物工程化用于增加亚麻酸不饱和脂肪酸和甘油酯的产生
如在实例10中所述，Δ15去饱和酶在C18:2（亚油酸）脂肪酸或脂肪酰基分子的15位置处催化双键的形成，由此产生C18:3（亚麻酸）脂肪酸或脂肪酰基分子。某些产生富含亚麻酸不饱和脂肪酸的油的高等植物种类（包括甘蓝型油菜（Bn）、亚麻荠（Cs）以及亚麻）是编码Δ15去饱和酶的基因的来源，这些基因可以在微生物中表达以影响脂肪酸谱。这个实例描述了使用编码Δ15去饱和酶的多核苷酸将微生物工程化，其中该转化的微生物的脂肪酸谱已经富含亚麻酸。
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，将Protheca moriformis UTEX1435的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（A株）用在表49中列出的每一个质粒构建体单独地转化。每个构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且该蔗糖转化酶基因用作选择标记。根据表2，所有蛋白质编码区经密码子优化以反映在Prototheca moriformis UTEX1435核基因中固有的密码子偏倚。来自甘蓝型油菜的去饱和酶基因（Bn FAD3，AAA32994）、来自亚麻荠FAD-7的去饱和酶基因、以及来自亚麻的去饱和酶基因（Lu FAD3A和Lu FAD3B，GenBank登录号ABA02172和ABA02173）的编码区各自在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下。一个FLAG
Figure BDA00003613748601901
表位序列被编码在这些重组去饱和酶基因序列的N端细胞质环中。
表49.用来转化Protheca moriformis（UTEX1435）A株的质粒构建体。
质粒构建
Figure BDA00003613748601911
将构建体pSZ2124、pSZ2125、pSZ2126、以及pSZ2127中的每一个单独地转化到A株中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上选择初级转化子。将各个转化子以克隆方式纯化并且在适合于脂质产生的条件下在pH7.0生长，与在实例1中披露的那些类似。从来自每种转化子的干燥生物质制备脂质样品。将来自每种转化子的20mg-40mg的干燥生物质再悬浮于2mL的在MeOH中的5%H2SO4中，并且添加含有适当量的适合的内部标准品（C19:0）的200μl甲苯。将该混合物进行短暂的声处理以分散该生物质，然后在70℃-75℃加热3.5小时。添加2mL的庚烷以提取脂肪酸甲酯，接着添加2mL的6%K2CO3（水性）以中和酸。将该混合物剧烈搅拌，并且将一部分上层转移至含有Na2SO4（无水）的小瓶中用于使用标准FAME GC/FID（脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离检测）方法进行气相色谱分析。使用标准脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离（FAME GC/FID）检测方法分析脂肪酸谱。从一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）显示于表50中，这些代表性克隆由pSZ2124、pSZ2125、pSZ2126以及pSZ2127的A株转化产生。为了比较，将从未转化A株对照细胞获得的脂质的脂肪酸谱另外地呈现在表50中。
表50.经工程化而表达高等植物的外源去饱和酶的Prototheca moriformis细胞的不饱和C18:1、C18:2、以及C18:3脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748601912
Figure BDA00003613748601921
未转化的Prototheca moriformis的（UTEX1435）株A株展示出包含少于1%C18:3脂肪酸的脂肪酸谱。相反，表达高等植物脂肪酸去饱和酶的A株的脂肪酸谱显示出增加的C18:3脂肪酸组成，增加范围从大约2倍至17倍。工程化的表达亚麻的FAD3A或FAD3B或者甘蓝型油菜的FAD3基因产物的株系显示出最大程度的C18:3增加（表50）。18:3与总C18不饱和物的比率在未转化株中是大约1%，而在转化株中范围是从大约2%至17%。18:2与总C18:0的比率在未转化株中是大约12%-13%，而在转化株中范围是从大约1%至15%，在FAD3A转化子中水平最低。这些数据证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许Δ15去饱和酶脂肪酸去饱和酶的外源表达而改变工程化微生物的脂肪酸谱，并且尤其是增加微生物细胞中18:3脂肪酸的浓度。
实例12：通过发夹RNA途径将微生物工程化用于增加硬脂酸和硬脂酸酯的产量
硬脂酸ACP去饱和酶（SAD）是脂质合成途径中的一部分。它们起作用以将双键引入到脂肪酰基链中。例如，SAD酶催化从C18:0脂肪酸（硬脂酸）合成C18:1脂肪酸。如在实例6中所显示的，通过靶向基因破坏而中断Prototheca moriformis的SAD2等位基因，导致工程化微生物的脂肪酸谱中的C18:0脂肪酸水平的可测量的增加。这个实例描述了使用编码下调SAD2表达的发夹RNA的多核苷酸将微生物工程化，其中该转化的微生物的脂肪酸谱已经富含饱和C18:0脂肪酸。
设计了在表51中列出的四种构建体（pSZ2139-pSZ2142）以减弱Protothecamoriformis SAD2基因产物的表达。每种构建体包含编码靶向Prototheca moriformisSAD2mRNA转录本的发夹RNA的不同核酸序列（具有大小范围从180碱基对至240碱基对的茎长）、以及针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。编码每种构建体的SAD2RNA发夹的多核苷酸在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制之下。
表51.用来转化Prototheca moriformis（UTEX1435）A株的质粒构建体。
Figure BDA00003613748601931
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，将Prototheca moriformis UTEX1435的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（A株）用在表51中列出的质粒构建体单独地转化。将初级转化子在含有蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上进行筛选，以克隆方式纯化，并且使其在标准脂质产生条件下生长。使用如在实例11中所述的直接酯交换方法来确定脂肪酸谱。从一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）显示于以下表52中，这些代表性克隆由用pSZ2139、pSZ2140、pSZ214以及pSZ2142转化A株而产生。为了比较，将从未转化A株对照细胞获得的脂质的脂肪酸谱另外地呈现在表52中。
表52.经工程化而表达靶向硬脂酰ACP去饱和酶基因/基因产物的发夹RNA构建体的Prototheca moriformis细胞的不饱和C18:1、C18:2、以及C18:2脂肪酸谱。
在表52中呈现的数据表明了SAD2发夹RNA构建体的表达对宿主生物的C18:0和C18:1脂肪酸谱的明显影响。包含SAD2发夹RNA构建体的A株转化子的脂肪酸谱显示出饱和C18:0脂肪酸百分比的增加，伴随不饱和C18:1脂肪酸的同时减少。未转化株的脂肪酸谱包含大约3%C18:0。转化株的脂肪酸谱包含大于3%至大概27%的C18:0。C18:0与总C18不饱和物的比率在未转化株中是大约4%，而在转化株中范围是从大约5%至69%。这些数据表明了多核苷酸SAD RNA发夹构建体在Protothecamoriformis中的成功表达和用途，以改变工程化宿主微生物中的饱和脂肪酸的百分比，并且尤其是增加微生物细胞中的C18:0脂肪酸的浓度和减少C18:1脂肪酸。
实例13：通过β-酮脂酰-ACP合成酶II基因的过表达来改变微藻的脂肪酸谱。
β-酮脂酰-ACP合成酶II在脂肪酸生物合成过程中催化C16:0-ACP的2-碳延伸至C18:0-ACP。产生质粒构建体以评定宿主细胞的脂肪酸谱是否可以由于KASII基因的表达而受影响。KASII基因序列的来源选自Prototheca moriformis UTEX1435或高等植物（大豆，GenBank登录号AAW88763；向日葵，GenBank登录号ABI18155；以及蓖麻，GenBank登录号AAA33872）。
使用实例2的方法，将Prototheca moriformis UTEX1435的以经典方式诱变的（为了更高的油产量）衍生物（A株）用在表53中的以下质粒构建体之一单独地转化。每种构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:29列出并且用作选择标记。对于每种构建体，KASII编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:37）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下。将每种KASII酶的天然转运肽替换为原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽（SEQ ID NO:54）。根据表2，所有蛋白质编码区经密码子优化以反映Prototheca moriformis UTEX1435核基因中固有的密码子偏倚。
表53.用来转化Prototheca moriformis（UTEX1435）A株的质粒构建体。
Figure BDA00003613748601961
构建体6S::β-Tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:PmKASII:nr::6S中的相关限制性位点以小写字母、粗体以及下划线指示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Xba I、Mfe I、BamH I、EcoR I、Spe I、Asc I、Cla I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写字母序列代表来自A株的允许通过同源重组在6S基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因（赋予A株代谢蔗糖的能力）的表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的Prototheca moriformis内源amt03启动子。PmKASII的起始子ATG和终止子TGA密码子由大写字母、粗斜体指示，同时该基因的其余部分以粗斜体指示。原始小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽位于起始子ATG与Asc I位点之间。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR再次由小写字母加下划线文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A株6S基因组区域。构建体6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:PmKASII:nr::6S的相关核苷酸序列作为SEQ ID.NO:234提供于序列表中。包含原始小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽的、密码子优化的PmKASII序列作为SEQ ID.NO:235提供于序列表中。SEQ ID NO:236提供了SEQ ID NO.235的蛋白质翻译。
Figure BDA00003613748601971
Figure BDA00003613748601972
atatca
Figure BDA00003613748601974
Figure BDA00003613748601981
gctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgc
cgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccaccccc
agcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctg
ctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgca
Figure BDA00003613748601982
cgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctc
tgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcacac
acgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatc
Figure BDA00003613748601983
Figure BDA00003613748601984
Figure BDA00003613748601991
agatctcttaaggcagcagcagctcg
gatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttt
tatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcat
ccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcact
gcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacggga
agtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaa
Figure BDA00003613748601993
Figure BDA00003613748601994
在将每种质粒构建体单独地转化进入A株后，在包含蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上选择阳性克隆。如在先前的实例中，将初级转化子以克隆方式纯化并且在标准脂质产生条件下在pH7生长并且从每种转化子的干燥生物质制备脂质样品。使用如在实例11中所述的直接酯交换方法来确定脂肪酸谱。与未转化A株对照的那些脂肪酸谱比较，针对每种质粒构建体，从一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）汇总在以下表54中，这些代表性克隆由一些阳性转化子的A株脂肪酸谱（表示为面积%）的转化而产生。
表54.经工程化而过表达KAS II基因的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602001
使用pSZ2041利用在表2中指示的密码子频率进行了进一步密码子优化的Prototheca moriformis（UTEX1435）KASII基因的过表达后，观察到C16:0链长的明显减少，伴随C18:1长度脂肪酸的同时增加。在表达由β-微管蛋白启动子驱动的Prototheca moriformis（UTEX1435）KASII基因的构建体的转化后，观察到类似的脂肪酸谱变化。
这些结果显示，密码子优化的无绿藻属脂质生物合成基因的过表达可以改变基因工程化微藻的脂肪酸谱。具体地说，KASII基因的过表达可以将C18脂肪酸的百分比从未转化细胞中的大约68%增加至大约84%。
实例14：通过KASI等位基因的靶向敲除改变工程化无绿藻属中的中链脂肪酸水平
β-酮脂酰-ACP合成酶I（KASI）在脂肪酸生物合成过程中催化C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0、以及C14:0脂肪酰基-ACP分子的2-碳延伸。在这个实例中，产生了一种敲除质粒构建体pSZ2014来评定在KASI基因位点靶向破坏后对宿主细胞的脂肪酸谱的影响。
使用在实例2中所述的生物射弹转化方法，用pSZ2014构建体转化Protothecamoriformis UTEX1435的以经典方式诱变的（为了更高的油产量）衍生物（A株）。pSZ2014含有在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2转化酶表达盒，其借助于KASI基因特异性同源区域而位于任一侧的侧翼，以便使该构建体靶向整合进入Prototheca moriformis基因组的KASI基因座。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。用于核基因组整合的KASI基因座的靶向区域的相关序列显示于下文并且列于SEQ ID NO:238和SEQ ID NO:239中。pSZ2014中的相关限制性位点（以小写字母、粗体和下划线指示）分别是5’-3’BspQ1、Kpn I、AscI、Xho I、Sac I、BspQ I，显示于以下序列中。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写字母序列代表来自A株的允许通过同源重组在KASI基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动密码子优化的酵母蔗糖转化酶基因（赋予A株代谢蔗糖的能力）的表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。suc2转化酶的起始子ATG密码子和终止子TGA密码子由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示。pSZ2014的转化序列显示于下文并且作为SEQ ID NO:237列出。
Figure BDA00003613748602011
Figure BDA00003613748602021
gccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgctt
gtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatc
cctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaa
Figure BDA00003613748602022
将质粒构建体pSZ2014转化进入A株后，在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上选择阳性克隆。将初级转化子以克隆方式纯化并且使其在标准脂质产生条件下生长。从每种转化子的干燥生物质制备脂质样品。使用如在实例11中所述的直接酯交换方法来确定脂肪酸谱。与未转化A株对照的那些脂肪酸谱比较，一些阳性转化子的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）汇总在以下表55中。
表55.包含选择标记以破坏内源KASI等位基因的工程化Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602032
如在上表55中所显示的，KASI等位基因的靶向中断影响了转化微生物的脂肪酸谱。包含pSZ2014转化载体的A株的脂肪酸谱显示出C14:0和C16:0脂肪酸的组成增加，伴随C18:1脂肪酸的同时减少。在所有转化子中，C18:0脂肪酸减少。在一些转化中，KASI等位基因的中断进一步导致了一种脂肪酸谱，该脂肪酸谱包括相对于未转化A株生物的脂肪酸谱而言降低的C18:2脂肪酸百分比。
因此，我们通过内源KASI的破坏使总C14脂肪酸的百分比增加了大约35%至400%并且使C16脂肪酸的百分比增加了大约30%至50%。
这些数据证明了内源KASI等位基因的靶基因中断改变宿主微生物的脂肪酸谱的效用。
实例15：结合基因修饰方法以改变无绿藻属中的脂肪酸谱
在这个实例中，显示了将敲除KASII等位基因与同时过表达展示出中链脂肪酸水解偏好性的外源硫酯酶的基因修饰在微生物中的结合来改变该宿主生物的脂肪酸谱。
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，用质粒构建体pSZ1283初始转化Prototheca moriformis（UTEX1435）的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（C株）。pSZ1283（SEQ ID NO:258）（先前描述于PCT申请号PCT/US2011/038463和PCT/US2011/038463中）含有Cuphea wrightii FATB2（CwTE2）硫酯酶的编码序列、针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）、以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。CwTE2编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR（SEQ ID NO:32）的控制下。根据表2，CwTE2和suc2的蛋白编码区经密码子优化以反映Prototheca moriformisUTEX1435核基因中固有的密码子偏倚。
将pSZ1283转化进入C株后，在含有蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上选择阳性克隆。然后将初级转化子以克隆方式纯化并且选择了一个单个转化子（B株），用于进一步基因修饰。将这个基因工程化株系用质粒构建体pSZ2110（SEQ ID NO:240）转化，以便中断KASII等位基因1基因座。pSZ2110（写为KASII‘5::CrbTub:NeoR:nr::KASII-‘3）包含在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的新霉素抗性（NeoR）表达盒（赋予对G418的抗性），其借助于KASII基因特异性同源区域而位于任一侧的侧翼，以便使该构建体靶向整合进入Prototheca moriformis基因组的KASII基因座。在pSZ2110构建体中的相关限制性位点从5’-3’是BspQ1、KpnI、XbaI、MfeI、BamHI、EcoRI、SpeI、XhoI、Sac I、以及BspQI，以小写字母、粗体、以及下划线格式指示。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。该转化构建体的5’和3’末端处的粗体、小写字母序列代表来自UTEX1435的、经由同源重组靶向整合至KASII等位基因1基因座的基因组DNA。莱茵衣藻β-微管蛋白由小写字母加框文本指示。NeoR的起始子ATG和终止子TGA由大写字母斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。
3’UTR由小写字母加下划线文本显示。
Figure BDA00003613748602051
Figure BDA00003613748602052
atatca
Figure BDA00003613748602053
Figure BDA00003613748602061
tgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcg
aataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctg
ctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgca
atgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatccactagttctagagcggccgccaccgcggtg
Figure BDA00003613748602062
用pSZ2110转化B株后，在含有G418的选择性琼脂平板上选择阳性克隆。然后将初级转化子以克隆方式纯化并且使其以蔗糖作为碳源、在标准脂质产生条件下、在pH5.0和pH7.0两者下生长。如在实例11中所述从每种转化子的干燥生物质制备脂质样品。在以下表56中呈现了5种阳性转化子（T1-T5）的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）、在作为唯一碳源的蔗糖上生长的B株的谱（U1）、以及在以作为唯一碳源的葡萄糖上生长的未转化UTEX1435的谱（U1）。
表56.经多重工程化以消融内源KASII基因产物并且表达Cuphea wrightii硫酯酶的Prototheca moriformis（UTEX1435）的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602064
Figure BDA00003613748602071
*未测试
如在表56中所显示的，CwTE2在Prototheca moriformis（UTEX1435）B株中的表达在转化的微生物的脂肪酸谱方面的影响显著改变。表达CwTE2并且在pH7.0进行培养以从Amt03启动子促进CwTE2表达的株（B株）的脂肪酸谱显示：相对于未转化UTEX1435的脂肪酸谱，其C10:0、C12:0、以及C14:0脂肪酸组成增加，伴随C16:0和C18:1脂肪酸组成的同时减少。随后修饰B株以中断KASII等位基因（编码一种催化C16:02-碳延伸至C18:0脂肪酸的酶），导致在pH5.0培养时存在于新近工程化的株系的脂质谱中的C16:0脂肪酸增加，伴随C18:1脂肪酸的同时减少。在pH5.0的转化子增殖表明除了造成脂肪酸谱改变的原因的硫酯酶之外的KASII等位基因敲除的影响，因为这种培养基的pH对于Amt03启动子的活性不是最优的。在pH7.0处产生脂质后（因此表达CwTE2），pSZ2011转化子展示出一个脂肪酸谱，相对于UTEX1435株的谱，该脂肪酸谱在C10:0、C12:0、以及C14:0脂肪酸的组成方面增加，伴随C16:0和C18:1脂肪酸的同时减少。当在pH7.0培养时，一些pSZ2011转化子展示出一个脂肪酸谱，相对于这些转化子的亲本株（B株）在pH7.0培养时的脂肪酸谱，该脂肪酸谱富含C16:0脂肪酸并且仍然伴随C18:1脂肪酸组成的进一步减少。
这些数据证明了多重基因修饰影响宿主生物的脂肪酸谱的效用。另外，这个实例展示了针对内源KASII等位基因的靶基因中断以改变宿主微生物的脂肪酸谱的重组多核苷酸的用途。
实例16：结合基因修饰方法以改变无绿藻属中的棕榈酸组成
在这个实例中，显示了将敲除KASII等位基因与同时过表达展示出对于C14和C16脂肪酸水解的优先特异性的外源硫酯酶的基因修饰在微生物中的结合来改变该宿主生物的脂肪酸谱。
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，用质粒构建体pSZ2004转化Prototheca moriformis（UTEX1435）的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（A株）。pSZ2004（写为KASII_5’_btub-SUC2-nr_2X_Amt03-Ch16TE2-nr_KASII_3’）包含萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶（Ch16TE2，GenBank#Q39513）、用于在核基因组的KASII基因座处靶向整合的5’和3’同源重组靶向序列（在构建体侧翼）、以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。Ch16TE2是一种显示出针对C14和C16脂肪酸的优先特异性的硫酯酶。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ IDNO:159列出并且用作选择标记。Ch16TE编码区在串联重复的Prototheca moriformisAmt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下。根据表2，Ch16TE和suc2的蛋白编码区经密码子优化以反映在Protothecamoriformis UTEX1435核基因中固有的密码子偏倚。pSZ2004作为SEQ ID NO:250存在于序列表中。
用pSZ2004转化后，在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上选择初级转化子。将各个转化子以克隆方式进行纯化并且使其在标准脂质产生条件下在pH7.0生长，与在实例1中披露的条件类似。使用标准脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离（FAMEGC/FID）检测方法分析脂肪酸谱，如在实例11中所述。从由转化载体pSZ2004的转化产生的代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）显示于表57中。从在包含葡萄糖作为唯一碳源的脂质产生条件下生长的未转化株获得的脂质的脂肪酸谱另外地呈现在表57中。
表57.经多重工程化以消融内源KASII基因产物并且表达萼距花硫酯酶的Prototheca moriformis（UTEX1435）的脂肪酸谱。
脂肪酸 UTEX1435 pSZ2004
%C10:0 0.01 0.00
%C12:0 0.04 0.09
%C14:0 1.27 6.42
%C16:0 27.20 69.97
%C18:0 3.85 1.84
%C18:1 58.70 13.69
%C18:2 7.18 7.15
如在以上表57中所显示的，具有用于选择标记表达的表达盒和及C14/C16偏好型硫酯酶的KASII等位基因的靶向中断影响了转化的微生物的脂肪酸谱。包含pSZ2004转化载体的株的脂肪酸谱显示出C14:0和C16:0脂肪酸的组成增加，伴随C18:0和C18:1脂肪酸的同时减少。未转化的Prototheca moriformis的（UTEX1435）株展示出包含大约27%C16脂肪酸和大约58%C18:1脂肪酸的脂肪酸谱。相反，在KASII基因座被一个盒（使萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶和选择标记能够表达）破坏的株的脂肪酸谱包括大约70%C16脂肪酸和大约14%脂肪酸。C16:0的水平增加了超过2.5倍。这些数据显示，可以将外源基因过表达的基因修饰和内源基因消融进行结合以改变宿主生物中的脂肪酸谱。
为了比较，在KASII基因座被一个盒（使蔗糖转化酶基因能够表达）破坏的株的脂肪酸谱提供了一个具有大约35%C16脂肪酸和大约50%C18:1脂肪酸的株。
这些数据证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许硫酯酶的外源表达而改变工程化微生物的脂肪酸谱，并且尤其是增加C14和C16脂肪酸的浓度并且伴随地通过用所述多核苷酸的KASII等位基因的靶向破坏而引起微生物细胞中C18:0和C18:1脂肪酸减少。
实例17：将微生物工程化以生产亚油酸不饱和脂肪酸和甘油脂
某些Δ12脂肪酸去饱和酶可以催化C18:1脂肪酸或脂肪酰基分子中的双键形成，由此产生C18:2（亚油酸）脂肪酸或脂肪酰基分子。某些产生富含亚油酸不饱和脂肪酸的油的植物种类（包括陆地棉、红花、大豆、向日葵、以及玉米）是编码Δ12去饱和酶的基因的来源，这些基因可以在微生物中表达以影响脂肪酸谱。这个实例描述了编码Δ12去饱和酶的多核苷酸将微生物工程化的用途，其中该转化的微生物的脂肪酸谱已经富含亚油酸。
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，用在表58中列出的以下质粒构建体之一转化Prototheca moriformis UTEX1435的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（A株）。每种构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’（SEQ ID NO:82）和3’（SEQ ID NO:84）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。根据表2，所有蛋白编码区经密码子优化以反映ProtothecamoriformisUTEX1435中固有的密码子偏倚。来自陆地棉的去饱和酶基因（Gh，GenBank登录号CAA71199）、来自红花的去饱和酶基因（Ct GenBank登录号ADM48789）、来自大豆的去饱和酶基因（Gm，GenBank登录号BAD89862）、来自向日葵的去饱和酶基因（Ha，GenBank登录号AAL68983）以及来自玉米的去饱和酶基因（Zm，GenBank登录号ABF50053）的编码区各自在Prototheca moriformisAmt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下。
表58.用来转化Prototheca moriformis（UTEX1435）A株的质粒构建体。
Figure BDA00003613748602111
将在表58中列出的构建体的每一个单独地转化进入A株。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上选择初级转化子。将各个转化子以克隆方式进行纯化并且使其在标准脂质产生条件下在pH7.0生长，与如在实例1中披露的条件类似。使用在实例11中所述的标准脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离（FAME GC/FID）检测方法分析脂肪酸谱。从由表58的相应A株转化而产生的一组代表性克隆得到的脂肪酸谱显示于表59中。为了比较，将从未转化的A株对照细胞获得的脂质的脂肪酸谱另外地呈现在表59中。
表59.经工程化而表达外源FAD去饱和酶的Prototheca moriformis细胞的C18:1、C18:2、以及C18:3脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602112
Figure BDA00003613748602121
Figure BDA00003613748602131
未转化的Prototheca moriformis（UTEX1435）株展示出包含低于8.5%C18:2脂肪酸的脂肪酸谱。如在表59中所显示的，表达高等植物脂肪酸去饱和酶的A株的脂质谱显示出增加的C18:2脂肪酸。总C18不饱和脂肪酸从大约64%增加至大约67%-72%。同样，总C18多不饱和脂肪酸（C18:2和C18:3）与总的合并的C18不饱和脂肪酸（C18:1、C18:2以及C18:3）的比率从少于14%增加至超过19%。这些数据证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许Δ12去饱和酶脂肪酸去饱和酶的外源表达而改变工程化微生物的脂肪酸谱。
实例18：通过脂肪酸去饱和酶的多重等位基因破坏来改变工程化微生物的脂肪酸水平
这个实例描述了使用一种转化载体用包含选择标记和编码外源SAD酶的序列的转化盒破坏Prototheca moriformis FADc基因座，从而将微生物工程化，其中该转化的微生物的脂肪酸谱已经被改变。
根据实例2中详述的生物射弹转化方法，用转化构建体pSZ1499（SEQ ID NO:246）转化Prototheca moriformis（UTEX1435）的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（C株）。pSZ1499包含油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶基因的核苷酸序列，对该序列针对在Prototheca moriformis UTEX1435中表达进行了密码子优化。pSZ1499表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的FADc基因组区域的5’（SEQID NO:247）和3’（SEQ ID NO:248）同源重组靶向序列（在构建体侧翼）以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO:159列出并且用作选择标记。油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶编码区在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下，并且将天然转运肽替换为原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽（SEQ ID NO:49）。将整个油橄榄SAD表达盒称作pSZ1499并且可以写为FADc5’_btub-Suc2-nr_amt03-S106SAD-OeSAD-nr-FADc3’。
在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上选择初级转化子。将各个转化子以克隆方式进行纯化并且使其在标准脂质产生条件下在pH7.0生长，与如在实例1中披露的条件类似。使用如在实例11中所述的标准脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离（FAMEGC/FID）检测方法分析脂肪酸谱。从由该转化载体的转化而产生的一组代表性克隆得到的脂肪酸谱显示于表60中。从在包含葡萄糖作为唯一碳源的脂质产生条件下（pH5.0）生长的未转化株（C株）获得的脂质的脂肪酸谱另外地呈现在表60中。
表60.经多重工程化以敲除内源FADc等位基因并且表达油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶的Prototheca moriformis（UTEX1435）的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602141
如在表60中所显示的，用pSZ1499对C株的转化影响了转化的微生物的脂肪酸谱。未转化的Prototheca moriformis的（UTEX1435）株（C株）展示出包含少于60%C18:1脂肪酸和多于7%C18:2脂肪酸的脂肪酸谱。相反，用pSZ1499转化的C株展示出具有C18:1脂肪酸的组成增加以及C18:0和C18:2脂肪酸的同时减少的脂肪酸谱。在用pSZ1499转化的C株的脂肪酸谱中未检测到C18:2脂肪酸。在p SZ1499转化子中不存在可检测到的C18:2脂肪酸表明：使用含有用于整合进入多个FADc基因组座位的同源重组靶向序列的pSZ1499进行的转化已经完全破坏了FAD活性。
进行Southern印迹分析来验证多个FADc等位基因被pSZ1499转化载体中断。使用标准的分子生物学方法从C株和pSZ1499转化子中提取基因组DNA。将来自每个样品的DNA在用限制性酶PstI消化之后在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳。将来自这种凝胶的DNA转移到Nylon+膜（安玛西亚公司（Amersham））上，然后使其与相应于FADc3’区域的、P32标记的多核苷酸探针杂交。图3显示了pSZ1499转化盒、Prototheca moriformis的（UTEX1435）的两个经测序的FADc等位基因、以及被pSZ1499转化载体破坏的等位基因的预测大小的图谱。FADc等位基因1包含PstI限制性位点，而FADc等位基因2则没有。无论哪个等位基因被破坏，SAD盒的整合会将PstI限制性位点引入被破坏的FADc等位基因，导致一个约6kb的片段在Southern上分辨。图4显示了Southern印迹分析的结果。在两转化子中都在约6kb处检测到杂交带。没有检测到指示未中断的等位基因的更小的杂交带。这些结果表明两个FADc等位基因都被pSZ1499破坏。
用SAD表达盒对FADc脂肪酸去饱和酶的两个等位基因的消融导致包含大约74%C18:1的脂肪酸谱。总之，这些数据证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许FAD等位基因的敲除以及伴随的硬脂酰-ACP去饱和酶的外源表达而改变工程化微生物的脂肪酸谱。
实例19：从工程化微生物中产生的加工油的特征
用转化载体pSZ1500（SEQ ID NO:251）转化Prototheca moriformis的（UTEX1435）的方法和效果先前已经描述于PCT申请号PCT/US2011/038463和PCT/US2011/038463中。
根据在实例2中详述的生物射弹转化方法，用转化构建体pSZ1500转化Prototheca moriformis（UTEX1435）的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（C株）。将初级转化子在含有蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上进行选择，以克隆方式纯化，并且选择一个单个的工程化株系（D株）用于分析。如在此描述使D株生长。然后使用标准方法从所产生的生物质进行油的己烷提取，并且确定所得到的甘油三酯油不含残留己烷。在PCT申请号PCT/US2010/31108中描述了使用螺旋榨机从微藻中提取油的其他方法，特此通过引用而结合。
然后使用熟知的植物油加工方法将从D株的生物质提取的油进行精炼、漂白、以及除臭。这些工序产生一种油样品RBD469，根据通过美国油化学协会（AmericanOil Chemists’Society）、美国检测与材料学会（American Society for Testing andMaterials）以及国际标准化组织（International Organization for Standardization）所定义的方法，使其经受一些分析测试方案。在以下表60中汇总了这些分析的结果。
表60.油样品RBD469的分析结果。
Figure BDA00003613748602161
Figure BDA00003613748602171
根据AOCS方法对相同批的Prototheca moriformis D株RBD469油针对痕量元素含量、固体脂肪含量、以及洛维邦得色（Lovibond color）进行分析。这些分析的结果呈现在以下表61、62、以及63中。
表61.RBD469油的ICP元素分析。
Figure BDA00003613748602172
Figure BDA00003613748602181
表62.RBD469油的固体脂肪含量分析
Figure BDA00003613748602182
表63.RBD469油的洛维邦得色分析
方法编号 颜色 结果 单位
AOCS Cc13j-97 红 2 单位
AOCS Cc13j-97 黄 27 单位
使RBD469油经受酯交换以生产脂肪酸甲酯（FAME）。RBD469的所得到的脂肪酸甲酯谱显示于表64中：
表64.RBD469油的脂肪酸甲酯谱
脂肪酸 面积%
C10 0.01
C12:0 0.04
C14:0 0.64
C15:0 0.08
C16:0 8.17
C16:1异构体 0.39
C16:1 0.77
C17:0 0.08
C18:0 1.93
C18:1 85.88
C18:1 0.05
C18:2 0.05
C20:0 0.3
C20:1 0.06
C20:1 0.44
C22:0 0.11
C23:0 0.03
C24:0 0.1
鉴定的总FAME 99.13
实例20：具有改变的脂肪酸谱的工程化微藻
如上文所述，整合异源基因以敲除或敲低无绿藻种类中的特定内源脂质途径酶可以改变工程化微生物的脂肪酸谱。在这个实例中，产生质粒构建体来评定宿主细胞的脂质谱是否可以因敲除或敲低内源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因FATA1而受影响。
A.通过敲除内源Prototheca moriformis硫酯酶基因改变脂质谱
使用实例2的方法，用在表65中的以下质粒构建体之一转化Protothecamoriformis UTEX1435的以经典方式诱变（为了更高的油产量）的衍生物（A株）。每种构建体含有用于整合到核基因组以中断内源FATA1基因的区域和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO: 159列出并且用作选择标记。所有蛋白编码区经密码子优化以反映根据表2的Prototheca moriformisUTEX 1435核基因中固有的密码子偏倚。下文显示用于核基因组整合的FATA1基因的靶向区域的相关序列。
描述    SEQ ID NO:
用于整合进入FATA1基因座的5’序列  SEQ ID NO:253
用于整合进入FATA1基因座的3’序列  SEQ ID NO:254
表65.用来转化Prototheca moriformis（UTEX 1435）A株的质粒构建体
质粒构建体  序列元件
1           FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1
2           FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1
在构建体FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1（SEQ ID NO: 255）中的相关限制性位点以小写字母、粗体和加下划线指示并且分别是：5’-3’BspQ 1、Kpn I、Asc I、MfeI、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写字母序列代表来自A株的允许通过同源重组在FATA1基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因（赋予A株代谢蔗糖的能力）表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A株 FATA1基因组区域：
Figure BDA00003613748602201
Figure BDA00003613748602211
Figure BDA00003613748602212
ggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgc
gcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgc
aacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtat
tctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatcgta
Figure BDA00003613748602214
actagtatcgatttcgaa
Figure BDA00003613748602215
Figure BDA00003613748602216
Figure BDA00003613748602221
为了将Cuphea wrightii ACP-硫酯酶2（CwTE2）基因（登录号：U56104）在FATA1基因座处导入A株，产生了一种构建体，它在Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR（SEQ ID NO:89）和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下表达CwTE2基因的蛋白编码区。已经在A株中表达的构建体可以被写为FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1（SEQ ID NO:256）。
在构建体FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1中的相关限制性位点以小写字母、粗体和加下划线指示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Asc I、Mfe I、BamH I、EcoR I、Spe I、Asc I、Pac I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写字母序列代表来自A株的允许通过同源重组在FATA1基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因（赋予A株代谢蔗糖的能力）表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写体加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的Prototheca moriformis的内源Amt03启动子。C.wrightii ACP-硫酯酶的起始子ATG和终止子TGA密码子由大写字母、粗斜体指示，同时ACP-硫酯酶编码区的其余部分以粗斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样由小写字母加下划线文本显示，后接由小写字母粗体文本显示的A株FATA1基因组区域。
Figure BDA00003613748602222
ggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgc
gcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgc
aacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtat
Figure BDA00003613748602232
cgc
gtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgac
gaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtg
gagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatc
Figure BDA00003613748602233
Figure BDA00003613748602234
Figure BDA00003613748602241
ctcgaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctg
gtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatctt
gtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcat
cccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggct
ccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatgga
aagctt
Figure BDA00003613748602251
ttgttttccagaaggagttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgtggagg
gggttcgaa
Figure BDA00003613748602252
Figure BDA00003613748602253
将质粒构建体1或2单独地转化进入A株后，在含有蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上选择阳性克隆。如在先前的实例中，将初级转化子以克隆方式纯化并且使其在pH7在标准脂质产生条件下生长并且从每种转化子的干生物质制备脂质样品。使用如在实例11中所述的直接酯交换方法来确定脂肪酸谱。在表66中显示了与未转化的A株对照的脂肪酸谱比较，从一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%），这些代表性克隆通过用构建体1转化而产生。在表67中显示了与未转化的A株对照的脂肪酸谱相比较，从一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%），这些代表性克隆通过用构建体2转化而产生。
表66.含有破坏内源FATA1等位基因的选择标记的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602254
呈现在表66中的结果显示，消融宿主的内源FATA1等位基因改变了工程化微藻的脂肪酸谱。将选择标记靶向到内源FATA1等位基因对转化的微生物的脂肪酸谱的影响是C16:0脂肪酸的明显减少，伴随C18:1脂肪酸的同时增加。
表67.含有破坏内源FATA1等位基因的选择标记和外源硫酯酶的Protothecamoriformis细胞的脂肪酸谱。
与将选择标记单独靶向到宿主的FATA1等位基因相一致，选择标记与外源硫酯酶的整合导致工程化微藻的脂肪酸谱的改变。如在以上表67中所显示的，将外源硫酯酶基因靶向以中断FATA1等位基因导致C16:0脂肪酸产生的明显减少。CwTE2硫酯酶在FATA1基因座处的表达还影响中链脂肪酸和C18:1脂肪酸产生至这样的程度，这种程度取决于所分析的转化子中存在的外源硫酯酶活性水平。在扩增的转基因在靶整合位点处的拷贝数与硫酯酶水平之间存在良好的一致性，正如对脂肪酸谱或重组蛋白积累（通过蛋白质印迹法评定）的影响所揭示的。
其中CwTE2基因已经经历扩增的转基因系显示C10:0-C14:0脂肪酸的明显增加和C18:1脂肪酸的同时减少。相反，其中CwTE2经历很少或不经历扩增的那些转化子与较低的外源硫酯酶表达一致，导致中链脂肪酸略微增加和对C18:1脂肪酸增加的大得多的影响。
总之，这些数据显示，宿主的内源FATA1等位基因的靶向破坏改变了工程化微藻的脂质谱。这些数据证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许FATA等位基因的靶向破坏以改变工程化微生物细胞的脂肪酸谱，尤其是减少C16脂肪酸的浓度和增加C18:1脂肪酸的浓度。这些数据另外地证明了多核苷酸的效用和效果，这些多核苷酸允许FATA等位基因的靶向破坏同时伴随地表达外源硫酯酶以改变工程化微生物细胞的脂肪酸谱，尤其是减少C16脂肪酸的浓度。
B.通过敲低内源Prototheca moriformis硫酯酶基因改变脂质谱
将一种构建体导入Prototheca moriformis UTEX1435A株遗传背景，该构建体通过RNAi下调Prototheca moriformis FATA1基因表达。使用酿酒酵母suc2蔗糖转化酶基因作为选择标记，从而赋予在作为唯一碳源的蔗糖上生长的能力。该构建体利用FatA1编码区的第一外显子，其后接内源内含子，和处于反方向的第一外显子的重复单元。包括针对6S基因组区域的5’和3’同源重组靶向序列（在构建体侧翼），分别作为SEQ ID NO:82和84列出，用于将发夹构建体整合至核基因组中。这种构建体命名为6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:发夹FatA:nr::6S。
在6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:发夹FatA:nr::6S中的相关限制性酶切位点以小写证明、粗体和加下划线显示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Mfe I、BamH I、EcoRI、Spe I、Xho I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写字母序列代表来自A株的允许通过同源重组在6s基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因（赋予A株代谢蔗糖的能力）表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的驱动发夹FatA1表达的第二莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。FatA1的起始ATG密码子由大写字母、粗斜体指示，同时FatA1编码区的第一外显子的其余部分以大写字母指示。FatA基因的内含子由加下划线的大写字母指示，并且连接区域以加下划线的大写字母指示，在FatA1内含子/反向第一外显子交界处产生粗斜体，以便有助于这些载体中的RNA剪接。FatA1的倒位的第一外显子由大写字母显示指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样由小写字母加下划线文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A株6S基因组区域。这种RNAi构建体的FATA部分的序列作为SEQ ID NO:257列出。
Figure BDA00003613748602281
Figure BDA00003613748602282
atatca
Figure BDA00003613748602283
Figure BDA00003613748602284
Figure BDA00003613748602291
agctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctg
ccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccc
cagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcct
gctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgc
Figure BDA00003613748602292
cgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcct
ctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcaca
cacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatc
Figure BDA00003613748602293
Figure BDA00003613748602294
GCACCGACC
AGCCTGCTTGCCAGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGGTCCTCTGCGCGCT
CCAGCGCGTGCGCTTTTCCGGTGGATCATGCGGTCCGTGGCGCACCGCAGCGGC
CGCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCGGTCAGGGCCGCACCCG
CGGTAGCCGTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAGCTTGAGCCCT
GCAAGATGGCGGAGGACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGGTGCGTGGAG
GTCCGGGGCTGACCGGCCGTCGCATTCAACGTAATCAATCGCATGATGATCAGA
GGACACGAAGTCTTGGTGGCGGTGGCCAGAAACACTGTCCATTGCAAGGGCAT
AGGGATGCGTTCCTTCACCTCTCATTTCTCATTTCTGAATCCCTCCCTGCTCACTC
Figure BDA00003613748602296
GTG
CTCCTCCAGGAAGATGCGCTTGTCCTCCGCCATCTTGCAGGGCTCAAGCTGCTC
CCAAAACTCTTGGGCGGGTTCCGGACGGACGGCTACCGCGGGTGCGGCCCTGA
CCGCCACTGTTCGGAAGCAGCGGCGCTGCATGGGCAGCGGCCGCTGCGGTGCG
CCACGGACCGCATGATCCACCGGAAAAGCGCACGCGCTGGAGCGCGCAGAGGA
CCACAGAGAAGCGGAAGAGACGCCAGTACTGGCAAGCAGGCTGGTCGGTGCCA
T
Figure BDA00003613748602301
agatctcttaaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccaca
cttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctag
ctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcct
gctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacc
tgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaa
Figure BDA00003613748602302
6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:发夹FatA:nr::6S的表达导致沉默靶FatA基因产物的发夹RNA形成。将构建体6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:hairpin FatA:nr::6S转化进入A株之后，在含有蔗糖作为唯一碳源的琼脂平板上选择阳性克隆。将初级转化子以克隆方式纯化并且使其在标准脂质产生条件下在pH5.0生长，然后从每种转化子的干燥生物质制备脂质样品。使用如在实例11中所述的直接酯交换方法来确定脂肪酸谱。在表68中呈现了与未转化的A株对照的脂肪酸谱比较，从由转化产生的一组代表性克隆得到的脂肪酸谱（表示为总脂肪酸的面积%）。
表68.含有下调FATA表达的RNA发夹构建体的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003613748602304
Figure BDA00003613748602311
在表68中呈现的数据显示了FATA发夹RNA构建体的表达对宿主生物的C16和C18:1脂肪酸谱的明显影响。包含FATA发夹RNA构建体的A株转化子的脂肪酸谱显示出C18:1脂肪酸百分比的增加，伴随C16脂肪酸的同时减少。这些数据表明多核苷酸FATA RNA发夹构建体在Prototheca moriformis中的成功表达和用途，以改变工程化宿主微生物的脂肪酸谱，并且尤其是增加微生物细胞中C18:1脂肪酸的浓度和减少C16脂肪酸。
实例21：将Chlorella sorokinian工程化
可以通过修改如在此讨论的Dawson等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在Chlorella sorokinian中的表达。简言之，Dawson等人，《当代微生物学》（Current Microbiology）第35卷（1997）第356-362页报道了用质粒DNA对Chlorella sorokinian的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Dawson将编码完全的普通小球藻硝酸盐还原酶基因（NR，GenBank登录号U39931）的质粒pSV72-NRg引入到突变体Chlorella sorokinian（NR-突变体）中。在不使用硝酸盐作为氮源的情况下，这些NR-突变体不能够生长。硝酸盐还原酶催化硝酸盐转化为亚硝酸盐。在转化之前，Chlorella sorokinian NR-突变体不能够在包含硝酸盐（NO3 -）作为唯一氮源的培养基上生长超过小集落阶段。将普通小球藻NR基因产物在NR-突变体Chlorellasorokinian中的表达用作为一种选择标记以挽救硝酸盐代谢缺陷。用pSV72-NRg质粒转化后，获得了稳定表达普通小球藻NR基因产物的NR-突变体Chlorellasorokinian，其能够在含有硝酸盐作为唯一碳源的琼脂平板上生长超过小集落阶段。通过Southern分析进行稳定转化子的DNA的评估并且通过RNA酶保护进行稳定转化子的RNA的评估。在琼脂平板（pH7.4）上进行转化的Chlorella sorokinian（NR突变体）的选择和维持，这些琼脂平板包含0.2g/L MgSO4、0.67g/L KH2PO4、3.5g/L K2HPO4、1.0g/L Na3C6H5O7·H2O以及16.0g/L琼脂、适当的氮源（例如，NO3 -）、微量营养素、以及碳源。Dawson还报道了Chlorella sorokinian以及Chlorellasorokinian NR突变体在液体培养基中的增殖。Dawson报道质粒pSV72-NRg以及普通小球藻硝酸盐还原酶基因的启动子和3’UTR/终止子适合于使异源基因能够在Chlorella sorokinian NR-突变体中表达。Dawson还报道普通小球藻硝酸盐还原酶基因产物的表达适合用作Chlorella sorokinian NR-突变体中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pSV72-NRg（包含编码用作选择标记的普通小球藻硝酸盐还原酶（CvNR）基因产物的核苷酸序列）并且将其修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在Chlorella sorokinian中表达进行了密码子优化以反映在根据表69A-D的Chlorellasorokinian的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的CvNR启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的CvNR3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与Chlorella sorokinian基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化Chlorella sorokinian。CvNR基因产物的活性可以用作为一种选择标记以挽救Chlorella sorokinian NR突变株的氮同化缺陷以及选择稳定表达该转化载体的Chlorella sorokinian NR突变体。适合于Chlorella sorokinian脂质生产的生长培养基包括但不限于0.5g/L KH2PO4、0.5g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4-7H2O、连同补充的微量营养素以及适当的氮源和碳源（Patterson,《脂质》（Lipids）Vol.5:7（1970），pp.597-600）。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定Chlorella sorokinian脂质的脂肪酸谱的评估。
实例22-44：前言与表格
以下实例22-24描述了根据本发明的各种微生物的工程化。为了改变微生物的脂肪酸谱，可以将微生物进行基因修饰，其中将内源或外源脂质生物合成途径酶进行表达、过表达、或减弱。对一种微生物进行基因工程化以改变其有关脂肪酸不饱和度的脂肪酸谱或者减少或增加脂肪酸链长的步骤包括：转化载体（例如，质粒）的设计和构建，用一种或多种载体转化微生物，转化的微生物（转化子）的选择，转化的微生物的生长、以及由该工程化微生物产生的脂质的脂肪酸谱的分析。
改变宿主生物的脂肪酸谱的转基因可以在众多真核微生物中表达。转基因在真核微生物中表达的实例可以在科学文献中找到，这些真核微生物包括莱茵衣藻、椭圆小球藻、Chlorella saccarophila、普通小球藻、凯氏小球藻、Chlorella sorokinian、雨生红球藻、胸状盘藻、强壮团藻、杜氏盐藻、绿色杜氏藻、杜氏盐藻、极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体、微拟球藻种类、假微型海链藻、三角褐指藻、腐生舟形藻、梭形筒柱藻）、隐秘小环藻、Symbiodinium microadriacticum、前沟藻种类、角毛藻种类、高山被孢霉（Mortierella alpina）、以及解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）。这些表达技术可以与本发明的教导结合以产生具有改变的脂肪酸谱的工程化微生物。
改变宿主生物的脂肪酸谱的转基因还可以在众多原核微生物中表达。转基因在包括混浊红球菌（Rhodococcus opacus）的产油微生物中的表达的实例可以在文献中找到。这些表达技术可以与本发明的教导结合以产生具有改变的脂肪酸谱的工程化微生物。
表69A-D.密码子偏好列表。
Figure BDA00003613748602331
Figure BDA00003613748602341
Figure BDA00003613748602352
Figure BDA00003613748602361
Figure BDA00003613748602362
Figure BDA00003613748602371
Figure BDA00003613748602381
Figure BDA00003613748602392
Figure BDA00003613748602401
Figure BDA00003613748602411
表70.脂质生物合成途径蛋白。
Figure BDA00003613748602412
Figure BDA00003613748602421
Figure BDA00003613748602431
Figure BDA00003613748602441
实例22：将普通小球藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Chow和Tung等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在普通小球藻中的表达。简言之，Chow和Tung等人，Plant CellReports（《植物细胞报道》），第18卷（1999），第778-780页报道了用质粒DNA对普通小球藻的稳定核转化。使用电穿孔转化方法，Chow和Tung将质粒pIG121-Hm（GenBank登录号AB489142）引入到普通小球藻中。pIG121-Hm的核苷酸序列包含编码β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因产物的序列，该序列可操作地连接至该GUS蛋白编码序列上游的CaMV35S启动子并且进一步可操作地连接至该GUS蛋白编码序列下游的胭脂碱合成酶（nos）基因的3’UTR/终止子。质粒pIG121-Hm的序列进一步包含潮霉素B抗生素抗性盒。这种潮霉素B抗生素抗性盒包含可操作地连接至编码潮霉素磷酸转移酶（hpt，GenBank登录号BAH24259）基因产物的序列的CaMV35S启动子。在转化之前，普通小球藻不能在包含50μg/ml潮霉素B的培养基中增殖。用pIG121-Hm质粒转化后，获得普通小球藻的转化子，这些转化子能在包含50μg/ml潮霉素B的培养基中增殖。Hpt基因产物在普通小球藻中的表达使得转化的普通小球藻能够在50μg/ml潮霉素B存在的情况下增殖，由此建立了潮霉素B抗性盒作为供在普通小球藻中使用的选择标记的效用。GUS报告基因的可检测活性表明，CaMV35S启动子和nos3’UTR适合于使异源基因能够在普通小球藻中表达。通过Southern分析进行稳定转化子的基因组DNA的评估。在含有YA培养基（琼脂和4g/L酵母提取物）的琼脂平板上进行转化的普通小球藻的选择和维持。如Chow和Tung所讨论，进行普通小球藻在液体培养基中的增殖。已经描述了普通小球藻在除了YA培养基以外的培养基中的增殖（例如，参见Chader等人，Revue des EnergiesRenouvelabes，第14卷（2011），第21-26页以及Illman等人，《酶与微生物技术》（Enzyme and Microbial Technology），第27卷（2000），第631-635页）。Chow和Tung报道，质粒pIG121-Hm、CaMV35S启动子、以及根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子适合于使异源基因能够在普通小球藻中表达。另外，Chow和Tung报道，潮霉素B抗性盒适合用作普通小球藻中的选择标记。适合于使异源基因能在普通小球藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记已经讨论于Chader等人，Revue des Energies Renouvelabes，第14卷（2011），第21-26页中。
在本发明的一个实施例中，构建了pIG121-Hm（包含编码用作选择标记的潮霉素B基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在普通小球藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的普通小球藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的CaMV35S启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与普通小球藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化普通小球藻。潮霉素B抗性基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含潮霉素的琼脂培养基上选择用该转化载体转化的普通小球藻的标记。适合于普通小球藻脂质产生的生长培养基包括但不限于补充有痕量金属以及任选地1.5g/L NaNO3的BG11培养基（0.04g/LKH2PO4、0.075g/L CaCl2、0.036g/L柠檬酸、0.006g/L柠檬酸铁铵、1mg/L EDTA、以及0.02g/L Na2CO3）。适合于培养普通小球藻用于脂质产生的另外的培养基包括，例如Watanabe培养基（包含1.5g/L KNO3、1.25g/L KH2PO4、1.25g l-1MgSO4·7H2O、20mg l-1FeSO4·7H2O连同微量营养素）以及低氮培养基（包含203mg/l(NH4)2HPO4、2.236g/l KCl、2.465g/l MgSO4、1.361g/l KH2PO4以及10mg/lFeSO4），如由Illman等人，《酶与微生物技术》（Enzyme and MicrobialTechnology），第27卷（2000），第631-635页所报道。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定普通小球藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例23：将椭圆小球藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Chen等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在椭圆小球藻中的表达。简言之，Chen等人，Current Genetics（《当代遗传学》），第39:5卷（2001），第365-370页报道了用质粒DNA对椭圆小球藻的稳定转化。使用电穿孔转化方法，Chow将质粒pBinUΩNP-1引入到椭圆小球藻中。pBinUΩNP-1的核苷酸序列包含编码嗜中性粒细胞肽-1（NP-1）兔基因产物的序列，该序列可操作地连接至该NP-1蛋白编码区的上游的玉米泛素（ubi1）基因启动子并且可操作地连接至该NP-1蛋白编码区的下游的胭脂碱合成酶（nos）基因的3’UTR/终止子。质粒pBinUΩNP-1的序列进一步包含G418抗生素抗性盒。这种G418抗生素抗性盒包含编码氨基糖苷3’-磷酸转移酶（aph3’）基因产物的序列。该aph3’基因产物赋予对抗生素G418的抗性。在转化之前，椭圆小球藻不能在包含30μg/ml G418的培养基中增殖。用pBinUΩNP-1质粒转化后，获得椭圆小球藻的转化子，这些转化子能在包含30μg/ml G418的选择性培养基中增殖。aph3’基因产物在椭圆小球藻中的表达使得转化的椭圆小球藻能够在30μg/ml G418存在的情况下增殖，由此建立了G418抗生素抗性盒作为供在椭圆小球藻中使用的选择标记的效用。NP-1基因产物的可检测活性表明，ubi1启动子和nos3’UTR适合于使异源基因能在椭圆小球藻中表达。通过Southern分析进行稳定转化子的基因组DNA的评估。在具有15μg/mLG418（用于液体培养）或具有30μg/mL G418（用于包含1.8%琼脂的固体培养）的Knop培养基（包含0.2g/L K2HPO4、0.2g/L MgSO4·7H2O、0.12g/L KCl、以及10mg/L FeCl3，pH6.0-8.0，补充有0.1%的酵母提取物和0.2%的葡萄糖）上进行转化的椭圆小球藻的选择和维持。已经描述了椭圆小球藻在除了Knop培养基以外的培养基中的增殖（例如，参见Cho等人，《水产科学》（Fisheries Science），第73:5卷（2007），第1050-1056页，Jarvis和Brown,《当代遗传学》（Current Genetics），第19卷（1991），第317-321页以及Kim等人，《海洋生物技术》（MarineBiotechnology），第4卷（2002），第63-73页）。已经报道了适合于使异源基因能够在椭圆小球藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记（参见Jarvis与Brown以及Kim等人，《海洋生物技术》，第4卷（2002），第63-73页）。Chen报道了质粒pBinUΩNP-1、ubi1启动子、以及根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在椭圆小球藻中表达。另外，Chen报道了在pBinUΩNP-1上编码的G418抗性盒适合用作椭圆小球藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pBinUΩNP-1（包含编码用作选择标记的aph3’基因产物（赋予对G418的抗性）的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在椭圆小球藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的椭圆小球藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的玉米ubi1启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与椭圆小球藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化椭圆小球藻。aph3’基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含G418的Knop琼脂培养基上选择用该转化载体转化的椭圆小球藻的标记。适合于椭圆小球藻脂质产生的生长培养基包括但不限于Knop培养基以及由Jarvis和Brown以及Kim等人报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定椭圆小球藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例24：将凯氏小球藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由El-Sheekh等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在凯氏小球藻中的表达。简言之，El-Sheekh等人，BiologiaPlantarium，第42:2卷（1999），第209-216页报道了用质粒DNA对凯氏小球藻的稳定转化。使用微粒轰击转化方法，El-Sheekh将质粒pBI121（GenBank登录号AF485783）引入到凯氏小球藻中。质粒pBI121包含卡那霉素/新霉素抗生素抗性盒。这种卡那霉素/新霉素抗生素抗性盒包含根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因启动子、编码针对卡那霉素和G418抗性的新霉素磷酸转移酶II（nptII）基因产物的序列（GenBank登录号AAL92039）、以及根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因的3’UTR/终止子。pBI121进一步包含编码β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因产物的序列，该序列可操作地连接至CaMV35S启动子并且可操作地连接至nos基因的3’UTR/终止子。在转化之前，凯氏小球藻不能在包含15μg/ml卡那霉素的培养基中增殖。用pBI121质粒转化后，获得凯氏小球藻的转化子，这些转化子能在包含15mg/L卡那霉素的选择性培养基中增殖。nptII基因产物在凯氏小球藻中的表达使得能够在15mg/L卡那霉素存在的情况下增殖，由此建立了卡那霉素/新霉素抗生素抗性盒作为用于在凯氏小球藻中使用的选择标记的效用。GUS基因产物的可检测活性表明，CaMV35S启动子和nos3’UTR适合于使异源基因能够在凯氏小球藻中表达。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。如由El-Sheekh报道，在含有YEG培养基（1%酵母提取物，1%葡萄糖）和15mg/L卡那霉素的半固体琼脂平板上进行转化的凯氏小球藻的选择和维持。El-Sheekh还报道了凯氏小球藻在YEG液体培养基中的增殖。适合于培养凯氏小球藻用于脂质产生的另外的培养基披露于Sato等人，《脂质的BBA分子与细胞生物学》（BBA Molecular and Cell Biology ofLipids），第1633卷（2003），第27-34页中。El-Sheekh报道了质粒pBI121、CaMV启动子、以及胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子适合于使异源基因能够在凯氏小球藻中表达。另外，El-Sheekh报道了在pBI121上编码的卡那霉素/新霉素抗性盒适合用作凯氏小球藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pBI121（包含编码用作选择标记的卡那霉素/新霉素抗性基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在凯氏小球藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的凯氏小球藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的CaMV35S启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与凯氏小球藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化凯氏小球藻。nptII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含卡那霉素或新霉素的YEG琼脂培养基上选择用该转化载体转化的凯氏小球藻的标记。适合于凯氏小球藻脂质产生的生长培养基包括但不限于YEG培养基以及由Sato等人报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定凯氏小球藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例25：将杜氏盐藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Walker等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在杜氏盐藻中的表达。简言之，Walker等人，《应用藻类学杂志》（Journal of Applied Phycology），第17卷（2005），第363-368页报道了用质粒DNA对杜氏盐藻的稳定核转化。使用电穿孔转化方法，Walker将质粒pDbleFLAG1.2引入到杜氏盐藻中。pDbleFLAG1.2包含编码博来霉素抗生素抗性盒的序列，该序列包含编码针对抗生素抗腐草霉素抗性的印度斯坦链异壁菌（Streptoalloteichushindustanus）博来霉素结合蛋白（ble）的序列并且可操作地连接至杜氏盐藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因（rbcS1，GenBank登录号AY530155）的启动子和3’UTR。在转化之前，杜氏盐藻不能在包含1mg/L腐草霉素的培养基中增殖。用pDbleFLAG1.2质粒转化后，获得杜氏盐藻的转化子，这些转化子能在包含1mg/L腐草霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在杜氏盐藻中的表达使得能够在1mg/L腐草霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在杜氏盐藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。如由Walker报道，在进一步含有4.5g/L NaCl和1mg/L腐草霉素的杜氏藻培养基（DM，如Provasoli等人，Archiv fur Mikrobiologie,第25卷（1957），第392-428页所描述）上进行转化的杜氏盐藻的选择和维持。适合于培养杜氏盐藻用于脂质产生的另外的培养基讨论于Takagi等人，《生物科学与生物工程杂志》（Journal ofBioscience and Bioengineering），第101:3卷（2006），第223-226页以及Massart和Hanston,Proceedings Venice2010,Third International Symposium on Energy fromBiomass and Waste（第三届国际生物质与废弃物能源大会，会议记录，威尼斯2010）中。Walker报道了质粒pDbleFLAG1.2以及杜氏盐藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的启动子和3’UTR适合于使在杜氏盐藻中异源表达能够实现。另外，Walker报道了在pDbleFLAG1.2上编码的博来霉素抗性盒适合用作杜氏盐藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pDbleFLAG1.2（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在杜氏盐藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的杜氏盐藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的rbcS1启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的rbcS13’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与杜氏盐藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化杜氏盐藻。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含腐草霉素的DM培养基上选择用该转化载体转化的杜氏盐藻的标记。适合于杜氏盐藻脂质产生的生长培养基包括但不限于DM培养基以及由Takagi等人以及Massart和Hanston所描述的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定杜氏盐藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例26：将强壮团藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Hallman和Rappel等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在强壮团藻中的表达。简言之，Hallman以及Rappel等人，The Plant Journal（《植物杂志》），第17卷（1999），第99-109页报道了用质粒DNA对强壮团藻的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Hallman和Rappel将pzeoE质粒引入到强壮团藻中。pzeoE质粒包含编码博来霉素抗生素抗性盒的序列，该序列包含编码针对抗生素吉欧霉素（zeocin）抗性的印度斯坦链异壁菌（Streptoalloteichushindustanus）博来霉素结合蛋白（ble）的序列（可操作地连接至强壮团藻β-微管蛋白基因（GenBank登录号L24547）的启动子和3’UTR）。在转化之前，强壮团藻不能在包含1.5μg/ml吉欧霉素的培养基中增殖。用pzeoE质粒转化后，获得强壮团藻的转化子，这些转化子能在包含大于20μg/ml吉欧霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在强壮团藻中的表达使得能够在20μg/ml吉欧霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在强壮团藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。如Hallman和Rappel报道，在含有1mg/L腐草霉素的团藻培养基（VM，如由Provasoli和Pintner,《藻类生态学特别版2》（The Ecology of Algae,Special Publication No.2）(1959)，Tyron,C.A.与Hartman,R.T.,eds.,Pittsburgh:Univeristy of Pittsburgh（匹兹堡：匹兹堡大学），第88-96页所描述）上进行转化的强壮团藻的选择和维持。适合于培养强壮团藻用于脂质产生的培养基还由Starr在Starr R,C,.Dev Biol Suppl.（《发育生物学增刊》），第4卷（1970），第59-100页中讨论。Hallman和Rappel报道了质粒pzeoE以及强壮团藻β-微管蛋白基因的启动子和3’UTR适合于允许在强壮团藻中异源表达。另外，Hallman和Rappel报道了在pzeoE上编码的博来霉素抗性盒适合用作强壮团藻中的选择标记。已经报道了适合于使异源基因能够在强壮团藻中表达以及适合用作强壮团藻中的选择标记的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记（例如参见Hallamann和Sumper,Proceedings of the National Academy of Sciences（《美国科学院院报》），第91卷（1994），第11562-11566页以及Hallman和Wodniok,Plant CellReports（《植物细胞报道》），第25卷（2006），第582-581页）。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pzeoE（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在强壮团藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的强壮团藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的强壮团藻β-微管蛋白启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的强壮团藻β-微管蛋白3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与强壮团藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在强壮团藻基因组序列内的同源区域（引用于Prochnik等人的出版物《科学》（Science），第329:5988卷（2010），第223-226页中）。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化强壮团藻。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含吉欧霉素的VM培养基上选择用该转化载体转化的强壮团藻的标记。适合于强壮团藻脂质产生的生长培养基包括但不限于VM培养基以及由Starr讨论的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定强壮团藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例27：将雨生红球藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Steinbrenner和Sandmann等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在雨生红球藻中的表达。简言之，Steinbrenner和Sandmann等人，Applied and Environmental Microbiology（《应用与环境微生物学》），第72:12卷（2006），第7477-7484页报道了用质粒DNA对雨生红球藻的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Steinbrenner将质粒pPlat-pds-L504R引入到雨生红球藻中。质粒pPlat-pds-L504R包含达草灭抗性盒，该达草灭抗性盒包含启动子、蛋白编码序列、以及雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds，GenBank登录号AY781170）的3’UTR，其中Pds的蛋白编码序列在位置504被修饰（由此将亮氨酸改变为精氨酸）以编码一个赋予对除草剂达草灭的抗性的基因产物（Pds-L504R）。在用pPlat-pds-L504R转化之前，雨生红球藻不能在包含5μM达草灭的培养基上增殖。用pPlat-pds-L504R质粒转化后，获得雨生红球藻的转化子，这些转化子能在包含5μM达草灭的选择性培养基中增殖。Pds-L504R基因产物在雨生红球藻中的表达使得能够在5uM达草灭存在的情况下增殖，由此建立了达草灭除草剂抗性盒作为用于在雨生红球藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。如由Steinbrenner报道，在补充有2.42g/L Tris-乙酸盐以及5mM达草灭的、包含OHA培养基（OHM，0.41g/L KNO3、0.03g/L Na2HPO4、0.246g/L MgSO4·7H2O、0.11g/L CaCl2·2H2O、2.62mg/L柠檬酸Fe(III)x H2O、0.011mg/L CoCl2·6H2O、0.012mg/L CuSO4·5H2O、0.075mg/L Cr2O3、0.98mg/LMnCl2·4H2O、0.12mg/L Na2MoO4x2H20、0.005mg/L SeO2以及25mg/L生物素、17.5mg/L硫胺素、以及15mg/L维生素B12）的琼脂平板上进行转化的雨生红球藻的选择和维持。Steinbrenner和Sandmann使用基础培养基（如由Kobayashi等人，Applied and Environmental Microbiology（应用与环境微生物学），第59卷（1993），第867-873页所描述的基础培养基）进行了雨生红球藻在液体培养中的增殖。Steinbrenner和Sandmann报道了pPlat-pds-L504R质粒以及雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶基因的启动子和3’UTR适合于允许在雨生红球藻中异源表达。另外，Steinbrenner和Sandmann报道了在pPlat-pds-L504R上编码的达草灭抗性盒适合用作雨生红球藻中的选择标记。已经报道了适合于使异源基因能够在雨生红球藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记（参见Kathiresan等人，Journalof Phycology（《藻类学杂志》），第45卷（2009），第642-649页）。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pPlat-pds-L504R（包含编码用作选择标记的Pds-L504R基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在雨生红球藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的雨生红球藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的雨生红球藻pds基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的雨生红球藻pds基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与雨生红球藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化雨生红球藻。Pds-L504R基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含达草灭的OHA培养基上选择用该转化载体转化的雨生红球藻的标记。适合于雨生红球藻脂质产生的生长培养基包括但不限于基础培养基以及由Kobayashi等人,Kathiresan等人,以及Gong和Chen,《应用藻类学杂志》（Journal of Applied Phycology），第9:5卷（1997），第437-444页所描述的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定雨生红球藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例28：将极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体工程化
可以通过修改如在此讨论的由Abe等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中的表达。简言之，Abe等人，Plant Cell Physiology（《植物细胞生理学》），第52:9卷（2011），第1676-1685页报道了用质粒DNA对极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Abe将质粒pSA106引入到极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中。质粒pSA106包含编码博来霉素抗性盒，该抗性盒包含编码印度斯坦链异壁菌博来霉素结合蛋白基因（ble，GenBank登录号CAA37050）的序列，该基因可操作地连接至极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体叶绿素a/b-结合蛋白基因（CAB，GenBank登录号AB363403）的启动子和3’UTR。在用pSA106转化之前，极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体不能在包含3μg/ml腐草霉素的培养基上增殖。用pSA106转化后，获得极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的转化子，这些转化子能在包含3μg/ml腐草霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中的表达使能够在3μg/ml腐草霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。如由Abe报道，首先在具有C培养基（0.1g/L KNO3、0.015g/L Ca(NO3)2·4H2O、0.05g/L甘油磷酸酯-Na2、0.04g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L三(羟甲基)氨基甲烷、痕量矿物质、生物素、维生素B1和B12）的顶层琼脂上进行转化的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的选择和维持，并且然后将其分离至包含补充有腐草霉素的C培养基的琼脂平板上。如Abe报道，进行了在液体培养物中的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体在C培养基中的增殖。适合于极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的增殖的另外的液体培养基由Sekimoto等人，《DNA研究》（DNA Research），10:4（2003），第147-153页讨论。Abe报道了质粒pSA106以及极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体CAB基因的启动子和3’UTR适合于使异源基因能够在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中表达。另外，Abe报道了在pSA106上编码的博来霉素抗性盒适合用作极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中的选择标记。已经报道了适合于使异源基因能够在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记（参见Abe等人，Plant Cell Physiology（《植物细胞生理学》），第49卷（2008），第625-632页）。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pSA106（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体CAB基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体CAB基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含腐草霉素的C培养基上选择用该转化载体转化的极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体的标记。适合于极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体脂质产生的生长培养基包括但不限于C培养基以及由Abe等人和Sekimoto等人报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定极锐新月藻-瘦狭新月藻-沿岸新月藻复合体脂质的脂肪酸谱的评估。
实例29：将绿色杜氏藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Sun等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在绿色杜氏藻中的表达。简言之，Sun等人，《基因》（Gene），第377卷（2006），第140-149页报道了用质粒DNA对绿色杜氏藻的稳定核转化。使用电穿孔转化方法，Sun将编码完全的绿色杜氏藻硝酸盐还原酶基因的质粒pDVNR引入到突变体绿色杜氏藻（绿色杜氏藻NR-突变体）中。在不使用硝酸盐作为氮源的情况下，这些NR-突变体不能够生长。硝酸盐还原酶催化硝酸盐转化为亚硝酸盐。在转化之前，绿色杜氏藻NR-突变体不能在包含硝酸盐（NO3 -）作为唯一氮源的培养基中增殖。将绿色杜氏藻NR基因产物在NR-突变体绿色杜氏藻中的表达用作为一种选择标记以挽救硝酸盐代谢缺陷。用pDVNR质粒转化后，获得了稳定表达绿色杜氏藻NR基因产物的NR-突变体绿色杜氏藻，其能够在包含硝酸盐作为唯一氮源的琼脂平板上生长。通过Southern分析来进行稳定转化子的DNA的评估。在包含5mM KNO3的琼脂平板上进行转化的绿色杜氏藻（NR突变体）的选择和维持。Sun还报道了绿色杜氏藻和绿色杜氏藻NR突变体在液体培养基中的增殖。适合于绿色杜氏藻的增殖的另外的培养基由Gordillo等人，《应用藻类学杂志》（Journal of AppliedPhycology），第10:2卷（1998），第135-144页以及由Moulton和Burford,《水生生物学》（Hydrobiologia），第204-205:1卷（1990），第401-408页报道。Sun报道了质粒pDVNR以及绿色杜氏藻硝酸盐还原酶基因的启动子和3’UTR/终止子允许在绿色杜氏藻NR-突变体中的异源表达。Sun还报道了绿色杜氏藻硝酸盐还原酶基因产物的表达适合用作绿色杜氏藻NR-突变体中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pDVNR（包含编码用作选择标记的绿色杜氏藻硝酸盐还原酶（DvNR）基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在绿色杜氏藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的绿色杜氏藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的DvNR启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的DvNR3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与绿色杜氏藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化绿色杜氏藻。DvNR基因产物的活性可以用作为一种选择标记以挽救绿色杜氏藻NR突变株的氮同化缺陷以及选择稳定表达该转化载体的绿色杜氏藻NR-突变体。适合于绿色杜氏藻脂质产生的生长培养基包括但不限于由Sun等人、Moulton和Burford以及Gordillo等人讨论的那些。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定绿色杜氏藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例30：将盐生杜氏藻（Dunaliella salina）工程化
可以通过修改如在此讨论的由Geng等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在盐生杜氏藻中的表达。简言之，Geng等人，《应用藻类学杂志》（Journal of Applied Phycology），第15卷（2003），第451-456页报道了用质粒DNA对盐生杜氏藻的稳定转化。使用电穿孔转化方法，Geng将质粒pUΩHBsAg-CAT引入到盐生杜氏藻中。pUΩHBsAg-CAT包含乙型肝炎表面抗原（HBsAG）表达盒，该表达盒包含编码乙型肝炎表面抗原的序列，该序列可操作地连接至该HBsAG蛋白编码区的上游的玉米ubi1启动子并且可操作地连接至该HBsAG蛋白编码区的下游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）的3’UTR/终止子。pUΩHBsAg-CAT进一步包含氯霉素抗性盒，该抗性盒包含编码赋予对抗生素氯霉素的抗性的氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因产物的序列，该序列可操作地连接至猿猴病毒40的启动子和增强子。在用pUΩHBsAg-CAT转化之前，盐生杜氏藻不能在包含60mg/L的培养基上增殖。用pUΩHBsAg-CAT质粒转化后，获得盐生杜氏藻的转化子，这些转化子能在包含60mg/L氯霉素的选择性培养基中增殖。CAT基因产物在盐生杜氏藻中的表达使得能够在60mg/L氯霉素存在的情况下增殖，由此建立了氯霉素抗性盒作为用于在盐生杜氏藻中使用的选择标记的效用。HBsAg基因产物的可检测活性表明ubi1启动子和nos3’UTR/终止子适合于允许盐生杜氏藻中的基因表达。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Geng报道了在包含具有60mg/L氯霉素的约翰逊培养基（Johnson’s medium）（J1，由Borowitzka和Borowitzka(eds),Micro-algalBiotechnology.Cambridge University Press,Cambridge（《微藻生物技术》，剑桥大学出版社，剑桥），第460-461描述）的琼脂平板上进行的转化的盐生杜氏藻的选择和维持。Geng在具有60mg/L氯霉素的J1培养基上进行了盐生杜氏藻的液体增殖。已经讨论了盐生杜氏藻在除了J1培养基以外的培养基中的增殖（参见Feng等人，《分子生物学报道》（Mol.Bio.Reports），第36卷（2009），第1433-1439页以及Borowitzka等人，《水生生物学》（Hydrobiologia），第116-117:1卷（1984），第115-121页）。已经由Feng等人报道了适合于使异源基因能够在盐生杜氏藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记。Geng报道了质粒pUΩHBsAg-CAT、ubi1启动子、以及根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在盐生杜氏藻中表达。另外，Geng报道了在pUΩHBsAg-CAT上编码的CAT抗性盒适合用作盐生杜氏藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pUΩHBsAg-CAT（包含编码用作选择标记的CAT基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在盐生杜氏藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的盐生杜氏藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的ubi1启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与盐生杜氏藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化盐生杜氏藻。CAT基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含氯霉素的J1培养基中选择用该转化载体转化的盐生杜氏藻的选择标记。适合于盐生杜氏藻脂质产生的生长培养基包括但不限于J1培养基以及由Feng等人和Borowitzka等人描述的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定盐生杜氏藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例31：将胸状盘藻工程化
可以通过修饰如在此讨论的由Lerche和Hallman等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在胸状盘藻中的表达。简言之，Lerche和Hallman等人，《BMC生物技术》（BMC Biotechnology），第9:64卷,2009报道了用质粒DNA对胸状盘藻的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Lerche将质粒pPmr3引入到胸状盘藻中。质粒pPmr3包含巴龙霉素抗性盒，该抗性盒包含编码针对抗生素巴龙霉素的抗性的龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）的氨基糖苷3’-磷酸转移酶（aphVIII）基因产物（GenBank登录号AAB03856）的序列，该序列可操作地连接至该aphVIII蛋白编码区的上游的强壮团藻hsp70A-rbcS3杂合启动子并且可操作地连接至该aphVIII蛋白编码区的下游的强壮团藻rbcS3基因的3’UTR/终止子。在用pPmr3转化之前，胸状盘藻不能在包含0.06μg/ml巴龙霉素的培养基上增殖。用pPmr3转化后，获得胸状盘藻的转化子，这些转化子能在包含0.75μg/ml以及更高的μg/ml的巴龙霉素的选择性培养基中增殖。aphVIII基因产物在胸状盘藻中的表达使得能够在0.75以及更高的μg/ml的巴龙霉素存在的情况下增殖，由此建立了巴龙霉素抗生素抗性盒作为用于在胸状盘藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Lerche和Hallman报道了在具有1.0μg/ml巴龙霉素的液体贾沃斯基培养基（Jaworski’s medium）（20mg/L Ca(NO3)2·4H2O、12.4mg/L KH2PO4、50mg/L MgSO4·7H2O、15.9mg/L NaHCO3、2.25mg/L EDTA-FeNa、2.25mg/L EDTANa2、2.48g/L H3BO3、1.39g/L MnCl2.4H2O、1mg/L(NH4)6MO7O24.4H2O、0.04mg/L维生素B12、0.04mg/L硫胺素-HCl、0.04mg/L生物素、80mg/L NaNO3、36mg/LNa4HPO4.12H2O）中进行转化的胸状盘藻的选择和维持。由Lerche和Hallman进一步讨论了适合于使异源基因能够在胸状盘藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记。Lerche和Hallman报道了质粒pPmr3、强壮团藻hsp70A-rbcS3杂合启动子、以及强壮团藻rbcS3基因的3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在胸状盘藻中表达。另外，Lerche和Hallman报道了在pPmr3上编码的巴龙霉素抗性盒适合用作胸状盘藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pPmr3（包含编码用作选择标记的aphVIII基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在胸状盘藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的胸状盘藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的强壮团藻hsp70A-rbcS3杂合启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的强壮团藻rbcS3基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与胸状盘藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法可以实现用该转化载体稳定转化胸状盘藻。aphVIII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含巴龙霉素的贾沃斯基培养基中选择用该转化载体转化的胸状盘藻的选择标记。适合于胸状盘藻脂质产生的生长培养基包括贾沃斯基培养基以及由Stein,《美国植物学杂志》（American Journalof Botany），第45:9卷（1958），第664-672页报道的培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定胸状盘藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例32：将三角褐指藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Apt等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在三角褐指藻中的表达。简言之，Apt等人，《分子遗传学和普通遗传学》（Molecular and General Genetics），第252卷（1996）第572-579页报道了用载体DNA对三角褐指藻的稳定核转化。使用微粒轰击转化技术，Apt将质粒pfcpA引入到三角褐指藻中。质粒pfcpA包含博来霉素抗性盒，该抗性盒包含编码针对抗生素腐草霉素和吉欧霉素的抗性的印度斯坦链异壁菌博来霉素结合蛋白（ble）的序列，该序列可操作地连接至该ble蛋白编码区的上游的三角褐指藻藻褐素叶绿素a结合蛋白基因（fcpA）的启动子并且可操作地连接至该ble蛋白编码区的在3’区域或下游的三角褐指藻fcpA基因的3’UTR/终止子。在用pfcpA转化之前，三角褐指藻不能在包含50ug/ml吉欧霉素的培养基上增殖。用pfcpA转化后，获得三角褐指藻的转化子，这些转化子能在包含50μg/ml吉欧霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在三角褐指藻中的表达使得能够在50μg/ml吉欧霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在三角褐指藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Apt报道了在包含具有50mg/L吉欧霉素的LDM培养基（如由Starr和Zeikus,《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第29卷，增刊，（1993）报道）的琼脂平板上进行的转化的三角褐指藻的选择和维持。Apt报道了在含有50mg/L吉欧霉素的LDM培养基中的三角褐指藻转化子的液体增殖。已经讨论了三角褐指藻在除了LDM培养基以外的培养基中的增殖（由Zaslavskaia等人，《科学》（Science），第292卷（2001），第2073-2075卷，以及由Radokovits等人，《代谢工程》（Metabolic Engineering），第13卷（2011），第89-95页）。已经由Apt等人、由Zaslavskaia等人、以及由Radokovits等人在相同的报道中报道了适合于使异源基因能够在三角褐指藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记。Apt报道了质粒pfcp、三角褐指藻fcpA启动子和3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在三角褐指藻中表达。另外，Apt报道了在pfcpA上编码的博来霉素抗性盒适合用作三角褐指藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pfcpA（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在三角褐指藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的三角褐指藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的三角褐指藻fcpA基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的三角褐指藻fcpA基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与三角褐指藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在三角褐指藻基因组的序列内的同源区域（引用于Bowler等人的出版物，《自然》（Nature），第456卷（2008），第239-244页中）。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化三角褐指藻。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含巴龙霉素的LDM培养基中选择用该转化载体转化的三角褐指藻的标记。适合于三角褐指藻脂质产生的生长培养基包括但不限于如由Radokovits等人报道的f/2培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定三角褐指藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例33：将角毛藻种类工程化
可以通过修改如在此讨论的由Yamaguchi等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在角毛藻种类中的表达。简言之，Yamaguchi等人，《藻类学研究》（Phycological Research），第59:2卷（2011），第113-119页报道了用质粒DNA对角毛藻种类的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Yamaguchi将质粒pTpfcp/nat引入到角毛藻种类中。pTpfcp/nat包含诺尔丝菌素抗性盒，该抗性盒包含编码诺尔丝菌素乙酰转移酶（nat）基因产物（GenBank登录号AAC60439）的序列，该序列可操作地连接至该nat蛋白编码区的上游的假微型海链藻藻褐素叶绿素a/c结合蛋白基因（fcp）启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nat蛋白编码区的下游）的假微型海链藻fcp基因3’UTR/终止子。该nat基因产物赋予对抗生素诺尔丝菌素的抗性。在用pTpfcp/nat转化之前，角毛藻种类不能在包含500μg/ml诺尔丝菌素的培养基上增殖。用pTpfcp/nat转化后，获得角毛藻种类的转化子，这些转化子能在包含500μg/ml诺尔丝菌素的选择性培养基中增殖。nat基因产物在角毛藻种类中的表达使得能够在500μg/ml诺尔丝菌素存在的情况下增殖，由此建立了诺尔丝菌素抗生素抗性盒作为用于在角毛藻种类中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Yamaguchi报道了在包含具有500μg/ml诺尔丝菌素的f/2培养基（如由Guilard,R.R.,Culture of Phytoplankton for feeding marine invertebrates,InCulture of Marine Invertebrate Animals（在培养海洋无脊椎动物中，培养浮游植物用于饲喂海洋无脊椎动物），Smith和Chanley(编辑)1975,Plenum Press（普莱南出版社），纽约，第26-60页报道）的琼脂平板上进行的转化的角毛藻种类的选择和维持。如Yamaguchi所进行的，在含有500mg/L诺尔丝菌素的f/2培养基上进行了角毛藻种类转化子的液体增殖。已经报道了角毛藻种类在另外的培养基中的增殖（例如在Napolitano等人，Journal of the World Aquaculture Society（《全球水产业学会杂志》），第21:2卷（1990），第122-130页，以及Volkman等人，Journal ofExperimental Marine Biology and Ecology（《实验海洋学与生态学杂志》），第128:3卷（1989），第219-240页中）。已经由Yamaguchi等人在相同的报道中报道了适合于使异源基因能够在角毛藻种类中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记。Yamaguchi报道了质粒pTpfcp/nat、假微型海链藻fcp启动子和3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在角毛藻种类中表达。另外，Yamaguchi报道了在pTpfcp/nat上编码的诺尔丝菌素抗性盒适合用作角毛藻种类中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pTpfcp/nat（包含编码用作选择标记的nat基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在密切相关的扁形角毛藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的扁形角毛藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的假微型海链藻fcp基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的假微型海链藻fcp基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与角毛藻种类基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过包括微粒轰击的熟知的转化或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化角毛藻种类。nat基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含诺尔丝菌素的f/2琼脂培养基中选择用该转化载体转化的角毛藻种类的选择标记。适合于角毛藻种类脂质产生的生长培养基包括但不限于f/2培养基、以及由Napolitano等人和Volkman等人讨论的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定角毛藻种类脂质的脂肪酸谱的评估。
实例34：将梭形筒柱藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Poulsen和Kroger等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在梭形筒柱藻（Cylindrotheca fusiformis）中的表达。简言之，Poulsen和Kroger等人，《FEBS杂志》（FEBS Journal），第272卷（2005），第3413-3423页报道了用质粒DNA对梭形筒柱藻的转化。使用微粒轰击转化方法，Poulsen和Kroger将pCF-ble质粒引入到梭形筒柱藻中。质粒pCF-ble包含博来霉素抗性盒，该抗性盒包含编码针对抗生素吉欧霉素和腐草霉素的抗性的印度斯坦链异壁菌博来霉素结合蛋白（ble）的序列，该序列可操作地连接至该ble蛋白编码区的上游的梭形筒柱藻藻褐素叶绿素a/c结合蛋白基因（fcpA，GenBank登录号AY125580）的启动子并且可操作地连接至在3’区域（该ble蛋白编码区的下游）的梭形筒柱藻fcpA基因3’UTR/终止子。在用pCF-ble转化之前，梭形筒柱藻不能在包含1mg/ml吉欧霉素的培养基上增殖。用pCF-ble质粒转化后，获得梭形筒柱藻的转化子，这些转化子能在包含1mg/ml吉欧霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在梭形筒柱藻中的表达使得能够在1mg/ml吉欧霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在梭形筒柱藻中使用的选择标记的效用。Poulsen和Kroger报道了在包含具有1mg/ml吉欧霉素的人工海水培养基的琼脂平板上进行的转化的梭形筒柱藻的选择和维持。Poulsen和Kroger报道了在含有1mg/ml吉欧霉素的人工海水培养基中的梭形筒柱藻转化子的液体增殖。已经讨论了梭形筒柱藻在另外的培养基中的增殖（例如在Liang等人，《应用藻类学杂志》（Journal of Applied Phycology），第17:1卷（2005），第61-65页，以及Orcutt和Patterson,《脂质》（Lipids），第9:12卷（1974），第1000-1003页中）。已经由Poulsen和Kroger在相同的报道中报道了用于使异源基因能够在梭形筒柱藻中表达的另外的质粒、启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记。Poulsen和Kroger报道了质粒pCF-ble以及梭形筒柱藻fcp启动子和3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在梭形筒柱藻中表达。另外，Poulsen和Kroger报道了在pCF-ble上编码的博来霉素抗性盒适合用作梭形筒柱藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pCF-ble（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在梭形筒柱藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的梭形筒柱藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的梭形筒柱藻fcp基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的梭形筒柱藻fcp基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与梭形筒柱藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化梭形筒柱藻。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含吉欧霉素的人工海水琼脂培养基中选择用该转化载体转化的梭形筒柱藻的选择标记。适合于梭形筒柱藻脂质产生的生长培养基包括但不限于人工海水以及由Liang等人和Orcutt与Patterson报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定梭形筒柱藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例35：将前沟藻种类（Amphidinium sp.）工程化
可以通过修改如在此讨论的由ten Lohuis和Miller等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在前沟藻种类中的表达。简言之，ten Lohuis和Miller等人，《植物杂志》（The Plant Journal），第13:3卷（1998），第427-435页报道了用质粒DNA对前沟藻种类的稳定转化。使用在碳化硅晶须存在的情况下搅动的转化技术，ten Lohuis将质粒pMT NPT/GUS引入到前沟藻种类中。pMT NPT/GUS包含新霉素抗性盒，该抗性盒包含编码新霉素磷酸转移酶II（nptII）基因产物（GenBank登录号AAL92039）的序列，该序列可操作地连接至该nptII蛋白编码区的上游或5’的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nptII蛋白编码区的下游）的nos基因3’UTR/终止子。该nptII基因产物赋予对抗生素G418的抗性。pMT NPT/GUS质粒进一步包含编码β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因产物的序列，该序列可操作地连接至CaMV35S启动子并且进一步地可操作地连接至CaMV35S3’UTR/终止子。在用pMT NPT/GUS转化之前，前沟藻种类不能在包含3mg/mlG418的培养基上增殖。用pMT NPT/GUS质粒转化后，获得前沟藻种类的转化子，这些转化子能在包含3mg/ml G418的选择性培养基中增殖。nptII基因产物在前沟藻种类中的表达使得能够在3mg/ml G418存在的情况下增殖，由此建立了新霉素抗生素抗性盒作为用于在前沟藻种类中使用的选择标记的效用。GUS报告基因的可检测活性表明CaMV35S启动子和3’UTR适合于使基因能够在前沟藻种类中表达。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。ten Lohuis和Miller报道了在包含补充有F/2富集溶液（由供应商西格玛公司提供）和3mg/ml G418的海水的培养基中的前沟藻种类的液体增殖，以及在包含补充有F/2富集溶液和3mg/ml G418的海水的琼脂培养基上的前沟藻种类的选择和维持。已经报道了前沟藻种类在另外的培养基中的增殖（例如在Mansour等人，《应用藻类学杂志》（Journal of AppliedPhycology），第17:4卷（2005）第287-v300页中）。已经由ten Lohuis和Miller在相同的报道中报道了用于使异源基因能够在前沟藻种类中表达的另外的质粒（包含另外的启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记）。ten Lohuis和Miller报道了质粒pMTNPT/GUS、nos的的启动子和3’UTR/终止子以及CaMV35S基因适合于使外源基因能够在前沟藻种类中表达。另外，ten Lohuis和Miller报道了在pMT NPT/GUS上编码的新霉素抗性盒适合用作前沟藻种类中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pMT NPT/GUS（包含编码用作选择标记的nptII基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在前沟藻种类中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的近缘种（closely-related species）强壮前沟藻（Amphidinium carterae）的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的nos3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与前沟藻种类基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过包括熟知的硅纤维介导的显微注射的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化前沟藻种类。nptII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含G418的海水琼脂培养基上选择用该转化载体转化的前沟藻种类的选择标记。适合于前沟藻种类脂质产生的生长培养基包括但不限于人工海水以及由Mansour等人以及ten Lohuis和Miller报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定前沟藻种类脂质的脂肪酸谱的评估。
实例36：将Symbiodinium microadriacticum工程化
可以通过修改如在此讨论的由ten Lohuis和Miller等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在Symbiodinium microadriacticum中的表达。简言之，tenLohuis和Miller等人，《植物杂志》（The Plant Journal），第13:3卷（1998），第427-435页报道了用质粒DNA对Symbiodinium microadriacticum的稳定转化。使用硅纤维介导的显微注射的转化技术，ten Lohuis将质粒pMT NPT/GUS引入到Symbiodinium microadriacticum中。pMT NPT/GUS包含新霉素抗性盒，该抗性盒包含编码新霉素磷酸转移酶II（nptII）基因产物（GenBank登录号AAL92039）的序列，该序列可操作地连接至该nptII蛋白编码区的上游或5’的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nptII蛋白编码区的下游）的nos基因3’UTR/终止子。该nptII基因产物赋予对抗生素G418的抗性。pMTNPT/GUS质粒进一步包含编码β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因产物的序列，该序列可操作地连接至CaMV35S启动子并且进一步地可操作地连接至CaMV35S3’UTR/终止子。在用pMT NPT/GUS转化之前，Symbiodinium microadriacticum不能在包含3mg/ml G418的培养基上增殖。用pMT NPT/GUS质粒转化后，获得Symbiodiniummicroadriacticum的转化子，这些转化子能在包含3mg/ml G418的选择性培养基中增殖。nptII基因产物在Symbiodinium microadriacticum中的表达使得能够在3mg/mlG418存在的情况下增殖，由此建立了新霉素抗生素抗性盒作为用于在Symbiodiniummicroadriacticum中使用的选择标记的效用。GUS报告基因的可检测活性表明CaMV35S启动子和3’UTR适合于使基因能够在Symbiodinium microadriacticum中表达。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。ten Lohuis和Miller报道了在包含补充有F/2富集溶液（由供应商西格玛公司提供）与和3mg/ml G418的海水的培养基中的Symbiodinium microadriacticum的液体增殖，以及在包含补充有F/2富集溶液和3mg/ml G418的海水的琼脂培养基中的Symbiodinium microadriacticum的选择和维持。已经讨论了Symbiodinium microadriacticum在另外的培养基中的增殖（例如在Iglesias-Prieto等人，《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academyof Sciences），第89:21卷（1992）第10302-10305页中）。已经由ten Lohuis和Miller在相同报道中讨论了用于使异源基因能够在Symbiodinium microadriacticum中表达的另外的质粒（包含另外的启动子、3’UTR/终止子、以及选择标记）。tenLohuis和Miller报道了质粒pMT NPT/GUS、nos的启动子和3’UTR/终止子以及CaMV35S基因的适合于使外源基因能够在Symbiodinium microadriacticum中表达。另外，ten Lohuis和Miller报道了在pMT NPT/GUS上编码的新霉素抗性盒适合用作Symbiodinium microadriacticum中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pMT NPT/GUS（包含编码用作选择标记的nptII基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在Symbiodiniummicroadriacticum中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的Symbiodiniummicroadriacticum的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶（nos）基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的nos3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与Symbiodiniummicroadriacticum基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过包括熟知的硅纤维介导的显微注射的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化Symbiodinium microadriacticum。nptII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含G418的海水琼脂培养基中选择用该转化载体转化的Symbiodiniummicroadriacticum的选择标记。适合于Symbiodinium microadriacticum脂质产生的生长培养基包括但不限于人工海水以及由Iglesias-Prieto等人以及ten Lohuis和Miller报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定Symbiodiniummicroadriacticum脂质的脂肪酸谱的评估。
实例37：将微拟球藻种类工程化
可以通过修改如在此讨论的由Kilian等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在微拟球藻种类W2J3B中的表达。简言之，Kilian等人，《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academy of Sciences），第108:52卷（2011）第21265-21269页报道了用一种转化构建体对微拟球藻属的稳定核转化。使用电穿孔转化方法，Kilian将转化构建体C2引入到微拟球藻种类W2J3B中。C2转化构建体包含博来霉素抗性盒，该抗性盒包含编码针对抗生素腐草霉素和吉欧霉素的抗性的印度斯坦链异壁菌博来霉素结合蛋白（ble）的序列，该序列可操作地连接至该ble蛋白编码区的上游的微拟球藻种类W2J3B紫黄质/叶绿素a-结合蛋白基因VCP2的启动子并且可操作地连接至该ble蛋白编码区的下游的微拟球藻种类W2J3B紫黄质/叶绿素a-结合蛋白基因VCP1的3’UTR/终止子。在用C2转化之前，微拟球藻种类W2J3B不能在包含2μg/ml吉欧霉素的培养基上增殖。用C2转化后，获得微拟球藻种类W2J3B的转化子，这些转化子能在包含2μg/ml吉欧霉素的选择性培养基中增殖。ble基因产物在微拟球藻种类W2J3B中的表达使得能够在2μg/ml吉欧霉素存在的情况下增殖，由此建立了博来霉素抗生素抗性盒作为用于在微绿球藻属中使用的选择标记的效用。通过PCR来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Kilian报道了在包含五倍水平的痕量金属、维生素、以及磷酸盐溶液并且进一步包含2μg/ml吉欧霉素的F/2培养基（由Guilard和Ryther,《加拿大微生物学杂志》（Canadian Journal ofMicrobiology），第8卷（1962），第229-239页报道）中的微拟球藻种类W2J3B转化子的液体增殖。Kilian还报道了在包含人工海水2mg/ml吉欧霉素的琼脂F/2培养基上的微拟球藻种类W2J3B转化子的选择和维持。已经讨论了微拟球藻属在另外的培养基中的增殖（例如在Chiu等人，《生物资源技术》（Bioresour Technol.），第100:2卷（2009），第833-838页以及Pal等人，《应用微生物学与生物技术》（Applied Microbiology and Biotechnology），第90:4卷（2011），第1429-1441页中）。已经由Kilian在相同的报道中描述了另外的转化载体，这些转化载体包含用于使异源基因能够在微拟球藻种类W2J3B中表达的另外的启动子和3’UTR/终止子以及用于转化子选择的选择标记。Kilian报道了转化载体C2以及微拟球藻种类W2J3B紫黄质/叶绿素a-结合蛋白基因VCP2的启动子以及微拟球藻种类W2J3B紫黄质/叶绿素a-结合蛋白基因VCP1的3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在微拟球藻种类W2J3B中表达。另外，Kilian报道了在C2上编码的博来霉素抗性盒适合用作微拟球藻种类W2J3B中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了转化构建体C2（包含编码用作选择标记的ble基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在微拟球藻种类W2J3B中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的微拟球藻种类的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的微拟球藻种类W2J3B VCP2基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的微拟球藻种类W2J3B VCP1基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与微拟球藻种类W2J3B基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化微拟球藻种类W2J3B。ble基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含吉欧霉素的F/2培养基中选择用该转化载体转化的微拟球藻种类W2J3B的选择标记。适合于微拟球藻种类W2J3B脂质产生的生长培养基包括但不限于F/2培养基以及由Chiu等人以及Pal等人报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定微拟球藻种类W2J3B脂质的脂肪酸谱的评估。
实例38：将隐秘小环藻（Cyclotella cryptica）工程化
可以通过修改如在此讨论的由Dunahay等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在隐秘小环藻中的表达。简言之，Dunahay等人，《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第31卷（1995），第1004-1012页报道了用质粒DNA对隐秘小环藻的稳定转化。使用微粒轰击转化方法，Dunahay将质粒pACCNPT5.1引入到隐秘小环藻中。质粒pACCNPT5.1包含新霉素抗性盒，该抗性盒包含新霉素磷酸转移酶II（nptII）基因产物的编码序列，该序列可操作地连接至该nptII蛋白编码区的上游的隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）基因（GenBank登录号L20784）的启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nptII蛋白编码区的下游）的隐秘小环藻ACCase基因的3’UTR/终止子。该nptII基因产物赋予对抗生素G418的抗性。在用pACCNPT5.1转化之前，隐秘小环藻不能在包含100μg/ml G418的50%人工海水培养基上增殖。用pACCNPT5.1转化后，获得隐秘小环藻的转化子，这些转化子能在包含100μg/ml G418的选择性50%人工海水培养基中增殖。nptII基因产物在隐秘小环藻中的表达使得能够在100μg/ml G418存在的情况下增殖，由此建立了新霉素抗生素抗性盒作为用于在隐秘小环藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Dunahay报道了在补充有1.07mM硅酸钠以及100μg/ml G418的人工海水培养基（ASW，如由Brown,L.,《藻类学》（Phycologia），第21卷（1982），第408-410页讨论）中的隐秘小环藻的液体增殖。Dunahay还报道了在包含具有100μg/ml G418的ASW培养基的琼脂平板上的隐秘小环藻转化子的选择和维持。已经讨论了隐秘小环藻在另外的培养基中的增殖（例如在Sriharan等人，Applied Biochemistry and Biotechnology（《应用生物化学与生物技术》），第28-29:1卷（1991），第317-326页以及Pahl等人，《生物科学与生物工程杂志》（Journalof Bioscience and Bioengineering），第109:3卷（2010），第235-239页中）。Dunahay报道了质粒pACCNPT5.1以及隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）基因的启动子适合于使外源基因能够在隐秘小环藻中表达。另外，Dunahay报道了在pACCNPT5.1上编码的新霉素抗性盒适合用作隐秘小环藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pACCNPT5.1（包含编码用作选择标记的nptII基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在隐秘小环藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的隐秘小环藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的隐秘小环藻ACCase启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的隐秘小环藻ACCase3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与隐秘小环藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化隐秘小环藻。nptII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含G418的琼脂ASW培养基中选择用该转化载体转化的隐秘小环藻的标记。适合于隐秘小环藻脂质产生的生长培养基包括但不限于ASW培养基以及由Sriharan等人（1991）以及Pahl等人报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定隐秘小环藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例39：将腐生舟形藻（Navicula saprophila）工程化
可以通过修改如在此讨论的由Dunahay等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在腐生舟形藻中的表达。简言之，Dunahay等人，《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第31卷（1995），第1004-1012页报道了用质粒DNA对腐生舟形藻的稳定转化。使用微粒轰击转化方法，Dunahay将质粒pACCNPT5.1引入到腐生舟形藻中。质粒pACCNPT5.1包含新霉素抗性盒，该抗性盒包含新霉素磷酸转移酶II（nptII）基因产物的编码序列，该序列可操作地连接至该nptII蛋白编码区的上游的隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）基因（GenBank登录号L20784）的启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nptII蛋白编码区的下游）的隐秘小环藻ACCase基因的3’UTR/终止子。该nptII基因产物赋予对抗生素G418的抗性。在用pACCNPT5.1转化之前，腐生舟形藻不能在包含100μg/ml G418的人工海水培养基上增殖。用pACCNPT5.1转化后，获得腐生舟形藻的转化子，这些转化子能在包含100μg/ml G418的选择性人工海水培养基中增殖。nptII基因产物在腐生舟形藻中的表达使得能够在G418存在的情况下增殖，由此建立了新霉素抗生素抗性盒作为用于在腐生舟形藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Dunahay报道了在补充有1.07mM硅酸钠和100μg/ml G418的人工海水培养基（ASW，如由Brown,L.,《藻类学》（Phycologia），第21卷（1982），第408-410页所讨论）中的腐生舟形藻的液体增殖。Dunahay还报道了在包含具有100μg/ml G418的ASW培养基的琼脂平板上的腐生舟形藻转化子的选择和维持。已经讨论了腐生舟形藻在另外的培养基中的增殖（例如在Tadros与Johansen,《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第24:4卷（1988），第445-452页以及Sriharan等人，《应用生物化学与生物技术》（Applied Biochemistry and Biotechnology），第20-21:1卷（1989），第281-291页中）。Dunahay报道了质粒pACCNPT5.1和隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）基因的启动子适合于使外源基因能够在腐生舟形藻中表达。另外，Dunahay报道在pACCNPT5.1上编码的新霉素抗性盒适合用作腐生舟形藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pACCNPT5.1（包含编码用作选择标记的nptII基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在腐生舟形藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的近缘的羽纹硅藻（Navicula pelliculosa）的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的隐秘小环藻ACCase基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的隐秘小环藻ACCase基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与腐生舟形藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化腐生舟形藻。nptII基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含G418的琼脂ASW培养基中选择用该转化载体转化的腐生舟形藻的选择标记。适合于腐生舟形藻脂质产生的生长培养基包括但不限于ASW培养基以及由Sriharan等人（1989）以及Tadros和Johansen报道的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定腐生舟形藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例40：将假微型海链藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Poulsen等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在假微型海链藻中的表达。简言之，Poulsen等人，《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第42卷（2006），第1059-1065页报道了用质粒DNA对假微型海链藻的稳定转化。使用微粒轰击转化方法，Poulsen将质粒pTpfcp/nat引入到假微型海链藻中。pTpfcp/nat包含诺尔丝菌素抗性盒，该抗性盒包含编码诺尔丝菌素乙酰转移酶（nat）基因产物（GenBank登录号AAC60439）的序列，该序列可操作地连接至该nat蛋白编码区的上游的假微型海链藻藻褐素叶绿素a/c结合蛋白基因（fcp）启动子并且可操作地连接至在3’区域（该nat蛋白编码区的下游）的假微型海链藻fcp基因3’UTR/终止子。该nat基因产物赋予对抗生素诺尔丝菌素的抗性。在用pTpfcp/nat转化之前，假微型海链藻不能在包含10μg/ml诺尔丝菌素的培养基上增殖。用pTpfcp/nat转化后，获得假微型海链藻的转化子，这些转化子能在包含100μg/ml诺尔丝菌素的选择性培养基中增殖。nat基因产物在假微型海链藻中的表达使得能够在100μg/ml诺尔丝菌素存在的情况下增殖，由此建立了诺尔丝菌素抗生素抗性盒作为用于在假微型海链藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Poulsen报道了在包含具有100μg/ml诺尔丝菌素的改良ESAW培养基（如由Harrison等人，《藻类学杂志》（Journal of Phycology），第16卷（1980），第28-35页所讨论）的液体培养中进行的转化的假微型海链藻的选择和维持。已经讨论了假微型海链藻在另外的培养基中的增殖（例如在Volkman等人，《实验海洋生物学与生态学杂志》（Journal of Experimental Marine Biology andEcology），第128:3卷（1989），第219-240页中）。已经由Poulsen在相同的报道中讨论了另外的质粒（包含适合于在假微型海链藻中使用的另外的选择标记）。Poulsen报道了质粒pTpfcp/nat、假微型海链藻fcp启动子以及3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在假微型海链藻中表达。另外，Poulsen报道了在pTpfcp/nat上编码的诺尔丝菌素抗性盒适合用作假微型海链藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pTpfcp/nat（包含编码用作选择标记的nat基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在假微型海链藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的假微型海链藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的假微型海链藻fcp基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的假微型海链藻fcp基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与假微型海链藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在假微型海链藻基因组的序列内的同源区域（引用于Armbrust等人的出版物，《科学》（Science），第306:5693卷（2004）：第79-86页中）。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化假微型海链藻。nat基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含诺尔丝菌素的ESAW琼脂培养基中选择用该转化载体转化的假微型海链藻的标记。适合于假微型海链藻脂质产生的生长培养基包括但不限于ESAW培养基以及由Volkman等人和Harrison等人讨论的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定假微型海链藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例41：将莱茵衣藻工程化
可以通过修改如在此讨论的由Cerutti等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在莱茵衣藻中的表达。简言之，Cerutti等人，《遗传学》（Genetics），第145:1卷（1997），第97-110页报道了用转化载体对莱茵衣藻的稳定核转化。使用微粒轰击转化方法，Cerutti将转化构建体P引入到莱茵衣藻中。构建体P包含壮观霉素抗性盒，该抗性盒包含编码氨基糖甙3’’-腺苷转移酶（aadA）基因产物的序列，该序列可操作地连接至该aadA蛋白编码区的上游的莱茵衣藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因（RbcS2，GenBank登录号X04472）启动子并且可操作地连接至在3’区域（该aadA蛋白编码区的下游）的莱茵衣藻RbcS2基因3’UTR/终止子。该aadA基因产物赋予对抗生素壮观霉素的抗性。在用P转化之前，莱茵衣藻不能在包含90μg/ml壮观霉素的培养基上增殖。用P转化后，得到莱茵衣藻的转化子，这些转化子能在包含90μg/ml壮观霉素的选择性培养基中增殖，由此建立了壮观霉素抗生素抗性盒作为用于在莱茵衣藻中使用的选择标记的效用。通过Southern分析来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Cerutti报道了在包含具有90μg/ml壮观霉素的Tris-乙酸盐-磷酸盐培养基（TAP，如由Harris,《衣藻属资料手册》（The ChlamydomonasSourcebook），学术出版社，圣地亚哥，1989所描述）的琼脂平板上进行的转化的莱茵衣藻的选择和维持。Cerutti另外报道了莱茵衣藻在具有90μg/ml壮观霉素的TAP液体培养中的增殖。已经讨论了莱茵衣藻在可替代的培养基中的增殖（例如在Dent等人，《非洲微生物学研究杂志》（African Journal of Microbiology Research），第5:3卷（2011），第260-270页以及Yantao等人，《生物技术与生物工程》（Biotechnology and Bioengineering），第107:2卷（2010），第258-268页中）。适合用于促进异源基因在莱茵衣藻中的表达的另外的构建体（包含适合于在莱茵衣藻中使用的另外的选择标记以及很多调节序列（包括启动子与3’UTR））在本领域是已知的并且已经讨论（为了回顾，参见Radakovits等人，《真核细胞》（EurkaryoticCell），第9:4卷（2010），第486-501页）。Poulsen报道了转化载体P以及莱茵衣藻启动子和3’UTR/终止子适合于使外源基因能够在莱茵衣藻中表达。另外，Cerutti报道了在P上编码的壮观霉素抗性盒适合用作莱茵衣藻中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体P（包含编码用作选择标记的aadA基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在莱茵衣藻中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的莱茵衣藻的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的莱茵衣藻RbcS2启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的莱茵衣藻RbcS23’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与莱茵衣藻基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在莱茵衣藻基因组的序列内的同源区域（引用于Merchant等人的出版物，《科学》（Science）第318:5848卷（2007）：第245-250页中）。通过熟知的包括微粒轰击的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化莱茵衣藻。aadA基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含壮观霉素的TAP琼脂培养基上选择用该转化载体转化的莱茵衣藻的标记。适合于莱茵衣藻脂质产生的生长培养基包括但不限于ESAW培养基以及由Yantao等人和Dent等人讨论的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定莱茵衣藻脂质的脂肪酸谱的评估。
实例42：将解脂耶罗威亚酵母工程化
可以通过修改如在此讨论的由Fickers等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在解脂耶罗威亚酵母中的表达。简言之，Fickers等人,《微生物学方法杂志》（Journal of Microbiological Methods），第55卷（2003），第727-737页报道了用质粒DNA对解脂耶罗威亚酵母的稳定核转化。使用乙酸锂转化方法，Fickers将质粒JMP123引入到解脂耶罗威亚酵母中。质粒JMP123包含潮霉素B抗性盒，该抗性盒包含编码潮霉素B磷酸转移酶基因产物（hph）的序列，该序列可操作地连接至该hph蛋白编码区的上游的解脂耶罗威亚酵母LIP2基因启动子（GenBank登录号AJ012632）并且可操作地连接至该hph蛋白编码区的下游的解脂耶罗威亚酵母LIP2基因3’UTR/终止子。在用JMP123转化前，解脂耶罗威亚酵母不能在包含100μg/ml潮霉素的培养基上增殖。用JMP123转化后，得到了转化的解脂耶罗威亚酵母，它们能在包含100μg/ml潮霉素的培养基上增殖，由此建立了潮霉素B抗生素抗性盒作为用于在解脂耶罗威亚酵母中使用的选择标记的效用。该核苷酸序列在JMP123上提供了用作用于将hph编码序列同源重组到LIP2基因座的供体序列的解脂耶罗威亚酵母LIP2基因的启动子和3’UTR/终止子。通过Southern来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Fickers报道了在包含具有100μg/ml潮霉素的标准YPD培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）的琼脂平板上进行的转化的解脂耶罗威亚酵母的选择和维持。在具有潮霉素的YPD培养基中进行转化的解脂耶罗威亚酵母的液体培养。已经报道了用于培养解脂耶罗威亚酵母的其他培养基和技术并且已经报道了用于在解脂耶罗威亚酵母中使用的许多其他质粒、启动子、3’UTR、以及选择标记（例如参见Pignede等人，《应用与环境生物学》（Applied and Environmental Biology），第66:8卷（2000），第3283-3289页，Chuang等人，《新生物技术》（New Biotechnology），第27:4卷（2010），第277-282页以及Barth和Gaillardin,(1996),In:K,W.(编辑),《生物技术中的非常规酵母》（Nonconventional Yeasts in Biotecnology），Sprinter-Verlag，柏林-海德尔堡，第313-388页）。Fickers报道了转化载体JMP123以及解脂耶罗威亚酵母LIP2基因启动子和3’UTR/终止子适合于使异源基因能够在解脂耶罗威亚酵母中表达。另外，Fickers报道了在JMP123上编码的潮霉素抗性盒适合用作解脂耶罗威亚酵母中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体JMP123（包含编码用作选择标记的hph基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在解脂耶罗威亚酵母中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的解脂耶罗威亚酵母的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的解脂耶罗威亚酵母LIP2基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的解脂耶罗威亚酵母LIP2基因3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与解脂耶罗威亚酵母基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在解脂耶罗威亚酵母基因组的序列内的同源区域（引用于Dujun等人的出版物，《自然》（Nature），第430卷（2004），第35-44页中）。通过熟知的包括乙酸锂转化的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化解脂耶罗威亚酵母。hph基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含潮霉素的YPD培养基上选择用该转化载体转化的解脂耶罗威亚酵母的标记。适合于解脂耶罗威亚酵母脂质产生的生长培养基包括但不限于YPD培养基以及由Chuang等人描述的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定解脂耶罗威亚酵母脂质的脂肪酸谱的评估。
实例43：将高山被孢霉工程化
可以通过修改如在此讨论的由Mackenzie等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在高山被孢霉中的表达。简言之，Mackenzie等人,《应用与环境微生物学》（Applied and Environmental Microbiology），第66卷（2000），第4655-4661页报道了用质粒DNA对高山被孢霉的稳定核转化。使用原生质体转化方法，MacKenzie将质粒pD4引入到高山被孢霉中。质粒pD4包含潮霉素B抗性盒，该抗性盒包含编码潮霉素B磷酸转移酶基因产物（hpt）的序列，该序列可操作地连接至该hpt蛋白编码区的上游的高山被孢霉组蛋白H4.1基因启动子（GenBank登录号AJ249812）并且可操作地连接至该hpt蛋白编码区的下游的构巢曲霉（Aspergillus nidulans）N-(5’-磷酸核糖)邻氨基苯甲酸异构酶（phophoribosyl)anthranilate isomerase）（trpC）基因3’UTR/终止子。在用pD4转化前，高山被孢霉不能在包含300μg/ml潮霉素的培养基上增殖。用pD4转化后，得到了转化的高山被孢霉，它们能在包含300μg/ml潮霉素的培养基上增殖，由此建立了潮霉素B抗生素抗性盒作为用于在高山被孢霉中使用的选择标记的效用。通过Southern来进行稳定转化子的基因组DNA的评估。Mackenzie报道了在包含潮霉素的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上进行的转化的高山被孢霉的选择和维持。由Mackenzie在具有潮霉素的PDA培养基中或S2GYE培养基中（包含5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.18%NH4SO4、0.02%MgSO4-7H2O、0.0001%FeCl3-6H2O、0.1%微量元素、10mM K2HPO4-NaH2PO4）上进行了转化的高山被孢霉的液体培养。已经报道了用于培养高山被孢霉的其他培养基和技术并且已经报道了用于在高山被孢霉中使用的其他质粒、启动子、3’UTR、以及选择标记（例如参见Ando等人，《应用与环境生物学》（Applied and Environmental Biology），第75:17卷（2009）第5529-35页以及Lu等人，《应用生物化学与生物技术》（Applied Biochemistry andBiotechnology），第164:7卷（2001），第979-90页）。Mackenzie报道了转化载体pD4以及高山被孢霉组蛋白H4.1启动子和构巢曲霉trpC基因3’UTR/终止子适合于使异源基因能够在高山被孢霉中表达。另外，Mackenzie报道了在pD4上编码的潮霉素抗性盒适合用作高山被孢霉中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pD4（包含编码用作选择标记的hpt基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在高山被孢霉中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的高山被孢霉的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的高山被孢霉组蛋白H4.1基因启动子并且可操作地连接至该蛋白编码序列的在3’区域或下游的构巢曲霉trpC3’UTR/终止子。该转化构建体可以另外地包含与高山被孢霉基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在高山被孢霉基因组的序列内的同源区域（引用于Wang等人的出版物，PLOS One,第6:12卷（2011）中）。通过熟知的包括原生质体转化的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化高山被孢霉。hpt基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含潮霉素的PDA培养基上选择用该转化载体转化的高山被孢霉的标记。适合于高山被孢霉脂质产生的生长培养基包括但不限于S2GYE培养基以及由Lu等人和Ando等人描述的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定高山被孢霉脂质的脂肪酸谱的评估。
实例44：将混浊红球菌PD630工程化
可以通过修改如在此讨论的由Kalscheuer等人传授的方法和载体来完成根据本发明的重组基因在混浊红球菌PD630中的表达。简言之，Kalscheuer等人,《应用与环境微生物学》（Applied and Environmental Microbiology），第52卷（1999），第508-515页报道了用质粒DNA对混浊红球菌的稳定转化。使用电穿孔转化方法，Kalscheuer将质粒pNC9501引入到混浊红球菌PD63中。质粒pNC9501包含硫链丝菌素抗性（thior）盒，该抗性盒包含远青链霉菌（Streptomyces azureus）23S rRNAA1067甲基转移酶基因的完全核苷酸序列，包括该基因的启动子和3’终止子序列。用pNC9501转化之前，混浊红球菌不能在包含1mg/ml硫链丝菌素的培养基上增殖。用pNC9501对混浊红球菌PD630转化后，得到了转化子，这些转化子能在包含1mg/ml硫链丝菌素的培养基上增殖，由此建立了硫链丝菌素抗性盒作为混浊红球菌PD630中的选择标记的用途。由Kalscheuer描述的一种第二质粒pAK68包含抗性thior盒以及真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha）β-酮硫解酶（phaB）、乙酰乙酸-CoA还原酶（phaA）、和针对聚羟基脂肪酸酯生物合成的聚3-羟基脂肪酸合成酶（phaC）基因的基因序列，由lacZ启动子驱动。pAK68对聚羟基脂肪酸酯生物合成缺陷型混浊红球菌PD630株转化后，得到转化的混浊红球菌PD630，其比未转化株生产更高量的聚羟基脂肪酸酯。被引入的真氧产碱杆菌phaB、phaA、以及phaC酶的可检测活性表明在pAK68质粒上编码的调节元件适合于在混浊红球菌PD630中的异源基因表达。Kalscheuer报道了在包含硫链丝菌素的标准Luria Broth（LB）培养基、营养肉汤（NB）、或矿物盐培养基（MSM）上进行的转化的混浊红球菌PD630的选择和维持。已经描述了用于培养混浊红球菌PD630的其他培养基和技术（例如参见Kurosawa等人，《生物技术杂志》（Journal of Biotechnology），第147:3-4卷（2010），第212-218页以及Alverez等人，《应用微生物与生物技术》（AppliedMicrobial and Biotechnology），第54:2卷（2000），第218-223页）。Kalscheuer报道了转化载体pNC9501和pAK68、远青链霉菌23S rRNA A1067甲基转移酶基因和lacZ基因的启动子适合于使异源基因能够在混浊红球菌PD630中表达。另外，Kalscheuer报道了在pNC9501和pAK68上编码的thior盒适合用作混浊红球菌PD630中的选择标记。
在本发明的一个实施例中，构建了载体pNC9501（包含编码用作选择标记的thior基因产物的核苷酸序列）并且将其进行修饰以进一步包含脂质生物合成途径表达盒序列，由此产生了一种转化载体。该脂质生物合成途径表达盒编码一种或多种选自表70的脂质生物合成途径蛋白，对每种蛋白编码序列针对在混浊红球菌PD630中表达进行了密码子优化以反映根据表69A-D的混浊红球菌的核基因中的固有密码子偏倚。对于表70的每种脂质生物合成途径蛋白，密码子优化的基因序列可以单独地可操作地连接至该蛋白编码序列上游的lacZ基因启动子。该转化构建体可以另外地包含与混浊红球菌PD630基因组同源的区域，用于该转化载体的靶向基因组整合。可以选择同源区域以破坏内源脂质生物合成途径基因的一个或多个基因组位点。本领域的技术人员可以鉴定这样的在混浊红球菌PD630基因组的序列内的同源区域（引用于Holder等人的出版物，《PLOS遗传学》（PLOS Genetics），第7:9卷（2011）中）。通过熟知的包括电穿孔的转化技术或其他已知方法实现用该转化载体稳定转化混浊红球菌PD630。远青链霉菌23S rRNA A1067甲基转移酶基因产物的活性可以用作用于在（但不限于）包含硫链丝菌素的LB培养基上选择用该转化载体转化的混浊红球菌PD630的标记。适合于混浊红球菌PD630脂质产生的生长培养基包括但不限于由Kurosawa等人和Alvarez等人讨论的那些培养基。可以通过在此描述的标准脂质提取和分析方法来评定混浊红球菌PD630脂质的脂肪酸谱的评估。
在此引证的所有参考文献，包括专利、专利申请、以及出版物，包括Genbank登录号，特此通过引用以其整体而结合，无论先前是否明确地结合。出于描述和披露可以与本发明一起使用的试剂、方法学和构思的目的而引证在此所提到的出版物。在此任何内容均不得解释为承认这些参考文献相对于在此所述的发明是现有技术。具体而言，出于所有目的将以下专利申请特此通过引用以其整体而结合：PCT申请号PCT/US2008/065563，2008年6月2日提交，名称为“微生物中油的生产（Productionof Oil in Microorganisms）”，PCT申请号PCT/US2010/31108，2010年4月14日提交，名称为“微生物油提取和分离方法（Methods of Microbial Oil Extraction andSeparation）”、以及PCT申请号PCT/US2009/066142，2009年11月30日提交，名称为“异养微生物中定制油的生产（Production of Tailored Oils in HeterotrophicMicroorganisms）”。
Figure IDA00003613749300021
Figure IDA00003613749300031
Figure IDA00003613749300041
Figure IDA00003613749300051
Figure IDA00003613749300061
Figure IDA00003613749300071
Figure IDA00003613749300081
Figure IDA00003613749300091
Figure IDA00003613749300101
Figure IDA00003613749300111
Figure IDA00003613749300121
Figure IDA00003613749300131
Figure IDA00003613749300141
Figure IDA00003613749300151
Figure IDA00003613749300161
Figure IDA00003613749300171
Figure IDA00003613749300181
Figure IDA00003613749300191
Figure IDA00003613749300211
Figure IDA00003613749300221
Figure IDA00003613749300231
Figure IDA00003613749300241
Figure IDA00003613749300261
Figure IDA00003613749300271
Figure IDA00003613749300291
Figure IDA00003613749300301
Figure IDA00003613749300311
Figure IDA00003613749300321
Figure IDA00003613749300331
Figure IDA00003613749300341
Figure IDA00003613749300351
Figure IDA00003613749300361
Figure IDA00003613749300371
Figure IDA00003613749300381
Figure IDA00003613749300401
Figure IDA00003613749300411
Figure IDA00003613749300421
Figure IDA00003613749300431
Figure IDA00003613749300441
Figure IDA00003613749300451
Figure IDA00003613749300461
Figure IDA00003613749300471
Figure IDA00003613749300491
Figure IDA00003613749300501
Figure IDA00003613749300511
Figure IDA00003613749300531
Figure IDA00003613749300541
Figure IDA00003613749300551
Figure IDA00003613749300561
Figure IDA00003613749300571
Figure IDA00003613749300591
Figure IDA00003613749300601
Figure IDA00003613749300621
Figure IDA00003613749300631
Figure IDA00003613749300641
Figure IDA00003613749300651
Figure IDA00003613749300661
Figure IDA00003613749300671
Figure IDA00003613749300691
Figure IDA00003613749300701
Figure IDA00003613749300711
Figure IDA00003613749300721
Figure IDA00003613749300731
Figure IDA00003613749300741
Figure IDA00003613749300751
Figure IDA00003613749300761
Figure IDA00003613749300771
Figure IDA00003613749300781
Figure IDA00003613749300801
Figure IDA00003613749300811
Figure IDA00003613749300821
Figure IDA00003613749300831
Figure IDA00003613749300841
Figure IDA00003613749300851
Figure IDA00003613749300861
Figure IDA00003613749300871
Figure IDA00003613749300881
Figure IDA00003613749300891
Figure IDA00003613749300911
Figure IDA00003613749300931
Figure IDA00003613749300941
Figure IDA00003613749300951
Figure IDA00003613749300971
Figure IDA00003613749300991
Figure IDA00003613749301001
Figure IDA00003613749301011
Figure IDA00003613749301021
Figure IDA00003613749301031
Figure IDA00003613749301041
Figure IDA00003613749301051
Figure IDA00003613749301071
Figure IDA00003613749301081
Figure IDA00003613749301111
Figure IDA00003613749301121
Figure IDA00003613749301141
Figure IDA00003613749301151
Figure IDA00003613749301161
Figure IDA00003613749301171
Figure IDA00003613749301181
Figure IDA00003613749301201
Figure IDA00003613749301211
Figure IDA00003613749301221
Figure IDA00003613749301231
Figure IDA00003613749301251
Figure IDA00003613749301261
Figure IDA00003613749301271
Figure IDA00003613749301291
Figure IDA00003613749301301
Figure IDA00003613749301331
Figure IDA00003613749301341
Figure IDA00003613749301361
Figure IDA00003613749301371
Figure IDA00003613749301381
Figure IDA00003613749301391
Figure IDA00003613749301401
Figure IDA00003613749301411
Figure IDA00003613749301421
Figure IDA00003613749301431
Figure IDA00003613749301441
Figure IDA00003613749301451
Figure IDA00003613749301461

Claims (114)

1.一种用于生产包含三酰甘油酯的天然油或产自该天然油的产品的方法，该方法包括：
培养一种重组微生物细胞，这种细胞包含可操作的重组核酸以
(a)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且任选地其中这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因的两个拷贝的表达；或
(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或
(c)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I或β-酮脂酰-ACP合成酶II的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或
(d)减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；以及
从这种细胞回收该天然油，并且任选地进一步加工该天然油以生产食物、燃料、或化学产品，
其中该天然油由于这些重组核酸而具有改变的脂肪酸谱。
2.如权利要求1所述的方法，其中这些微生物通过II型脂肪酸生物合成途径来合成脂肪酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中该微生物是一种微藻。
4.如权利要求3所述的方法，其中该微藻是一种专性异养生物。
5.如权利要求2所述的方法，其中该微藻是无绿藻属或小球藻属的一个种类。
6.如权利要求5所述的方法，其中该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。
7.如权利要求2所述的方法，其中该微藻是凯氏小球藻、Chlorellaluteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该培养是异养的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该脂肪酸去饱和酶是ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶、或Δ12脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中这种细胞被培养以便包含按干细胞重量计至少50%、至少60%、至少70%、或50%至90%的甘油三酯。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该油包含少于500ppm、50ppm、或5ppm的着色分子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中这些重组核酸被稳定地整合。
14.如权利要求13所述的方法，其中这些重组核酸被稳定地整合到该微生物的染色体中。
15.如权利要求4所述的方法，进一步包括至少一种选择标记。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中这种细胞包含可操作的重组核酸以通过反义、RNAi、或dsRNA的表达来减少或消除一种酶的表达，这些反义、RNAi、或dsRNA靶向编码该酶的基因的转录本。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达的减少或消除是由于用一种或多种编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因对这一种或多种基因的中断或替换。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中这种重组细胞进一步包含一种编码油酸12-羟化酶的外源基因，以便合成蓖麻油酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由KASII基因编码的β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达，并且表达编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
20.如权利要求19所述的方法，其中这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少40%、50%、60%、70%、或80%C16脂肪酸的脂肪酸谱的油。
21.如权利要求20所述的方法，其中这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少50%-75%C16:0的脂肪酸谱的油。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中这种细胞产生一种具有其特征进一步地在于具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱的油。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因产生一种活性酰基-ACP硫酯酶，该活性酰基-ACP硫酯酶在C8-C16脂肪酰基链的水解中具有比这种细胞的天然酰基-ACP硫酯酶更强的活性。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因中断该KASII基因。
25.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I的一种或多种基因编码的酶的表达。
26.如权利要求25所述的方法，其中所产生的油具有一种其特征在于由于这些重组核酸而更短的平均脂肪酸链长的脂肪酸谱。
27.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由至少一种FAD基因编码的脂肪酸去饱和酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因的产物。
28.如权利要求27所述的方法，其中核酸是可操作的以减少或消除由脂肪酸去饱和酶基因的多个拷贝编码的脂肪酸去饱和酶的表达。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中该硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因是被重组进入该脂肪酸去饱和酶基因的编码区之内的一个基因座。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所产生的油具备一种具有升高的油酸的脂肪酸谱。
31.如权利要求30所述的方法，其中油酸构成这些脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。
32.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶II的β-酮脂酰-ACP合成酶II外源基因的产物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所产生的油的特征在于一种由于这些重组核酸所致的C18:1脂肪酸升高和C16脂肪酸降低的脂肪酸谱。如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以通过RNA干扰减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所产生的油具有一种其特征在于C18:0脂肪酸增加的脂肪酸谱。
35.如权利要求34所述的方法，其中所产生的油的特征在于一种脂肪酸谱，该脂肪酸谱具有至少50%、60%、70%、80%、或90%C18:0。
36.如权利要求35所述的方法，其中所产生的油的特征在于一种具有至少50%-75%C18:0的脂肪酸谱。
37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所产生的油的特征另外地在于一种具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱。
38.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的基因的两个拷贝的表达。
39.如权利要求1-18中任一项所述的方法，可操作以表达编码活性ω-3脂肪酸去饱和酶和/或ω-6油酸去饱和酶的脂肪酸去饱和酶外源基因的产物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所产生的油具有一种其特征在于水平提高的亚油酸、亚麻酸、或两者的脂肪酸谱。
41.如权利要求35所述的方法，其中该油的脂肪酸谱的特征在于具有至少10%、20%、30%、40%、或50%亚油酸、亚麻酸、或两者。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中该油的进一步的加工包括精炼、漂白、脱臭、复分解、酯交换（transesterification）、氢化、水解、氢化、脱氧、加氢裂解、异构化、羟基化、酯交换（interesterification）、酰胺化、磺化、以及硫化中的一种或多种。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中该油被加工以产生食用油、脂肪酸、脂肪醇、润滑剂、肥皂、脂肪酸酯、脂肪酸乙氧基化物、脂肪胺、烷基氯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、磺化油、硫化油、柴油燃料、喷气燃料、汽油、燃料混合原料（fuelblendstock）、燃料添加剂、润滑添加剂、或涂层。
44.一种通过如权利要求1-43中任一项所述的方法可获得的天然油。
45.一种从如权利要求44所述的天然油制成的产品。
46.如权利要求45所述的产品，包括食用油、脂肪酸、脂肪醇、润滑剂、肥皂、脂肪酸酯、脂肪酸乙氧基化物、脂肪胺、烷基氯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、磺化油、硫化油、柴油燃料、喷气燃料、汽油、燃料混合原料、燃料添加剂、化学添加剂、或涂层。
47.一种重组细胞，包含可操作的重组核酸以
(a)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且任选地其中这种细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因的两个拷贝的表达；或
(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或
(c)减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I或β-酮脂酰-ACP合成酶II的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物；或
(d)减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达，并且表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、或酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
48.如权利要求46所述的细胞，其中该微生物通过II型脂肪酸生物合成途径来合成脂肪酸。
49.如权利要求48所述的细胞，其中该微生物是一种微藻。
50.如权利要求49所述的细胞，其中该微藻是一种专性异养生物。
51.如权利要求50所述的细胞，其中该微藻是无绿藻属或小球藻属的一个种类。
52.如权利要求51所述的细胞，其中该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。
53.如权利要求51所述的细胞，其中该微藻是凯氏小球藻、Chlorellaluteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。
54.如权利要求46-53中任一项所述的细胞，其中这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。
55.如权利要求46-54中任一项所述的细胞，其中这种细胞能够异养生长。
56.如权利要求46-55中任一项所述的细胞，其中该脂肪酸去饱和酶是ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、或ω-6油酸去饱和酶、或Δ12脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。
57.如权利要求46-56中任一项所述的细胞，其中这种细胞能够被培养以便包含按干细胞重量计在至少50%、至少60%、至少70%、或50%至90%之间的甘油三酯。
58.如权利要求46-57中任一项所述的细胞，其中这些重组核酸被稳定地整合。
59.如权利要求58所述的细胞，其中这些重组核酸被稳定地整合到该微生物的染色体中。
60.如权利要求59所述的细胞，进一步包含至少一种选择标记。
61.如权利要求46-60中任一项所述的细胞，其中这种细胞包含可操作的重组核酸以通过反义、RNAi、或dsRNA的表达来减少或消除一种酶的表达，这些反义、RNAi、或dsRNA靶向编码该酶的基因的转录本。
62.如权利要求46-61中任一项所述的细胞，由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达的减少或消除是由于用一种或多种编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶、或酰基-ACP硫酯酶的基因对这一种或多种基因的中断或替换。
63.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中这种重组细胞进一步包含一种编码油酸12-羟化酶的外源基因，以便合成蓖麻油酸。
64.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由KASII基因编码的β-酮脂酰-ACP合成酶II的表达，并且表达编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
65.如权利要求64所述的细胞，其中这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少40%、50%、60%、70%、或80%C16脂肪酸的脂肪酸谱的油。
66.如权利要求65所述的细胞，其中这种细胞产生一种具有其特征在于具有至少50%-75%C16:0脂肪酸谱的油。
67.如权利要求66所述的细胞，其中这种细胞产生一种具有其特征进一步地在于具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱的油。
68.如权利要求64或65所述的细胞，其中该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因产生一种活性酰基-ACP硫酯酶，该活性酰基-ACP硫酯酶在C8-C16脂肪酰基链的水解中具有比这种细胞的天然酰基-ACP硫酯酶更强的活性。
69.如权利要求64-66中任一项所述的细胞，其中该编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因中断该KASII基因。
70.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中该重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由编码β-酮脂酰-ACP合成酶I的一种或多种基因编码的酶的表达。
71.如权利要求70所述的细胞，其中所产生的油具有一种其特征在于由于这些重组核酸而更短的平均脂肪酸链长的脂肪酸谱。
72.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以减少或消除由至少一种FAD基因编码的脂肪酸去饱和酶的表达，并且表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因的产物。
73.如权利要求72所述的细胞，其中核酸是可操作的以减少或消除由脂肪酸去饱和酶基因的多个拷贝编码的脂肪酸去饱和酶的表达。
74.如权利要求72或73所述的细胞，其中该硬脂酰-ACP去饱和酶外源基因被重组进入该脂肪酸去饱和酶基因的编码区之内的一个基因座。
75.如权利要求72-74中任一项所述的细胞，其中所产生的油具备一种具有升高的油酸的脂肪酸谱。
76.如权利要求75所述的细胞，其中油酸构成这些脂肪酸的至少50%、60%、70%、80%、或90%。
77.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶II的β-酮脂酰-ACP合成酶II外源基因的产物。
78.如权利要求77所述的细胞，其中所产生的油的特征在于一种由于这些重组核酸所致的C18:1脂肪酸升高和C16脂肪酸降低的脂肪酸谱。
79.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中这种重组细胞包含可操作的核酸以通过RNA干扰减少或消除由编码硬脂酰ACP去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达。
80.根据权利要求79所述的细胞，其中所产生的油具有一种其特征在于C18:0脂肪酸增加的脂肪酸谱。
81.如权利要求80所述的细胞，其中所产生的油的特征在于一种具有至少50%、60%、70%、80%、或90%C18:0的脂肪酸谱。
82.如权利要求80所述的细胞，其中所产生的油的特征在于一种具有至少50%-75%C18:0的脂肪酸谱。
83.如权利要求79-82所述的细胞，其中所产生的油的特征进一步地在于一种具有至少20%-40%C18:1的脂肪酸谱。
84.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，其中该细胞包含可操作的重组核酸以减少或消除编码β-酮脂酰-ACP合成酶I、β-酮脂酰-ACP合成酶II、硬脂酰ACP去饱和酶、或脂肪酸去饱和酶的基因的两个拷贝的表达。
85.如权利要求46-62中任一项所述的细胞，可操作以表达编码活性ω-3脂肪酸去饱和酶和/或ω-6油酸去饱和酶的脂肪酸去饱和酶外源基因的产物。
86.如权利要求85所述的细胞，其中所产生的油具有一种其特征在于水平提高的亚油酸、亚麻酸、或两者的脂肪酸谱。
87.如权利要求86所述的细胞，其中该油的脂肪酸谱的特征在于具有至少10%、20%、30%、40%、或50%亚油酸、亚麻酸、或两者。
88.一种从如权利要求46-87中任一项所述的细胞产生的天然油或含油产品。
89.一种用于生产包含包括蓖麻油酸的三酰甘油酯的天然油或产自该天然油的产品的方法，该方法包括：
培养一种重组微生物细胞，这种细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物，以便合成蓖麻油酸。
90.如权利要求48所述的方法，其中该微生物具有II型脂肪酸生物合成途径。
91.如权利要求90所述的方法，其中该微生物是一种微藻。
92.如权利要求91所述的方法，其中该微藻是一种专性异养生物。
93.如权利要求92所述的方法，其中该微藻是无绿藻属的一个种类。
94.如权利要求93所述的方法，其中该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。
95.如权利要求91所述的方法，其中该微藻是凯氏小球藻、Chlorellaluteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。
96.如权利要求46-95中任一项所述的方法，其中这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。
97.如权利要求46-96中任一项所述的方法，其中该培养是异养的。
98.如权利要求46-98中任一项所述的方法，其中这种细胞在缺乏重组核酸的情况下产生至少40%、50%、60%、70%、80%、或90%的油酸，这些重组核酸可操作以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物。
99.如权利要求89-98中任一项所述的方法，进一步包含可操作的重组核酸以增强油酸的产生，以便提高油酸12-羟化酶的底物水平。
100.如权利要求99所述的方法，其中这种细胞包含可操作的重组核酸以
(a)表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的外源基因的产物并且减少或消除由编码脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达；或
(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I的外源基因的产物并且表达编码活性酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
101.一种根据权利要求89-100中任一项所述的方法生产的产品。
102.一种微生物细胞，这种微生物细胞包含可操作的重组核酸以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物，以便合成蓖麻油酸。
103.如权利要求102所述的细胞，其中该微生物具有II型脂肪酸生物合成途径。
104.如权利要求103所述的细胞，其中该微生物是一种微藻。
105.如权利要求104所述的细胞，其中该微藻是一种专性异养生物。
106.如权利要求105所述的细胞，其中该微藻是无绿藻属的一个种类。
107.如权利要求106所述的细胞，其中该微藻是魏氏无绿藻、雍滞无绿藻、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、或祖菲无绿藻。
108.如权利要求104所述的细胞，其中该微藻是凯氏小球藻、Chlorellaluteoviridis、原始小球藻、或普通小球藻。
109.如权利要求102-108中任一项所述的细胞，其中这种细胞是一种表达活性蔗糖转化酶的重组细胞。
110.如权利要求102至109中任一项所述的细胞，其中这种细胞能够异养生长。
111.如权利要求102至109中任一项所述的细胞，其中这种细胞在缺乏重组核酸的情况下产生至少40%、50%、60%、70%、80%、或90%的油酸，这些重组核酸可操作以表达编码活性油酸12-羟化酶的外源基因的产物。
112.如权利要求102-111中任一项所述的细胞，进一步包含可操作的重组核酸以增强油酸的产生，以便提高油酸12-羟化酶的底物水平。
113.如权利要求112所述的细胞，其中这种细胞包含可操作的重组核酸以
(a)表达编码活性硬脂酰ACP去饱和酶的外源基因的产物并且减少或消除由编码脂肪酸去饱和酶的一种或多种基因编码的酶的表达；或
(b)表达编码活性β-酮脂酰-ACP合成酶I的外源基因的产物并且表达编码活性酰基-ACP硫酯酶的外源基因的产物。
114.一种包含如权利要求44所述的油的食物。
CN201280007593.3A 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油 Pending CN103827307A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910164460.0A CN110066836A (zh) 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161438969P 2011-02-02 2011-02-02
US61/438,969 2011-02-02
US201161476691P 2011-04-18 2011-04-18
US61/476,691 2011-04-18
US201161484458P 2011-05-10 2011-05-10
US61/484,458 2011-05-10
US201161548616P 2011-10-18 2011-10-18
US61/548,616 2011-10-18
PCT/US2012/023696 WO2012106560A1 (en) 2011-02-02 2012-02-02 Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910164460.0A Division CN110066836A (zh) 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103827307A true CN103827307A (zh) 2014-05-28

Family

ID=46601075

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280007593.3A Pending CN103827307A (zh) 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油
CN201910164460.0A Pending CN110066836A (zh) 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910164460.0A Pending CN110066836A (zh) 2011-02-02 2012-02-02 产自重组产油微生物的定制油

Country Status (11)

Country Link
US (5) US9249436B2 (zh)
EP (2) EP3643774A1 (zh)
JP (3) JP6071904B2 (zh)
KR (2) KR101964965B1 (zh)
CN (2) CN103827307A (zh)
AU (3) AU2012212079B2 (zh)
BR (1) BR112013019699A2 (zh)
CA (1) CA2825691C (zh)
MX (2) MX351063B (zh)
SG (1) SG192594A1 (zh)
WO (1) WO2012106560A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107087416A (zh) * 2014-07-24 2017-08-22 泰拉瑞亚控股公司 变体硫酯酶及使用方法
CN107624135A (zh) * 2015-04-28 2018-01-23 拜尔作物科学公司 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物
CN111436499A (zh) * 2018-12-29 2020-07-24 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 油脂组合物及其制备方法和用途
CN112576229A (zh) * 2020-12-11 2021-03-30 大庆油田有限责任公司 一种利用微生物作用地下原油产甲烷方法

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8790914B2 (en) 2007-06-01 2014-07-29 Solazyme, Inc. Use of cellulosic materials for cultivation of microorganisms
US20100303989A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Microalgal Flour
EP3517622A1 (en) 2008-11-28 2019-07-31 Corbion Biotech, Inc. Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms
MX352746B (es) 2010-05-28 2017-12-06 Terravia Holdings Inc Aceites específicos producidos a partir de microorganismos heterótrofos recombinantes.
CA3024641A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Corbion Biotech, Inc. Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods
KR101964965B1 (ko) 2011-02-02 2019-04-03 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일
BR112013023613A2 (pt) 2011-03-17 2017-09-19 Solazyme Inc método de gaseificação, método de conversão da biomassa de um micróbio oleaginoso, composição torrificada combustível, e, combustível combinado
KR20140033378A (ko) 2011-05-06 2014-03-18 솔라짐, 인코포레이티드 자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물
US9328351B2 (en) 2011-11-28 2016-05-03 Solazyme, Inc. Genetically engineered microbial strains including Prototheca lipid pathway genes
US9163267B2 (en) * 2012-04-11 2015-10-20 REG Life Sciences, LLC Metathesis transformations of microbially-produced fatty acids and fatty acid derivatives
CA2870364A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 Solazyme, Inc. Recombinant microbes with modified fatty acid synthetic pathway enzymes and uses thereof
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
US20130316364A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Lanzatech New Zealand Limited Selection Method and Recombinant Microorganisms and uses Therefor
BR112015013193A2 (pt) 2012-12-07 2017-07-11 Solazyme Inc ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula, método para obter óleo microbiano, óleo microbiano, e, método para obter óleo microbiano.
US10098371B2 (en) 2013-01-28 2018-10-16 Solazyme Roquette Nutritionals, LLC Microalgal flour
US9816079B2 (en) 2013-01-29 2017-11-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US9567615B2 (en) 2013-01-29 2017-02-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
ES2828751T3 (es) 2013-03-07 2021-05-27 Genomatica Inc Procesamiento corriente abajo de composiciones de alcohol graso producidas por células huésped recombinantes
CN105164230A (zh) 2013-03-08 2015-12-16 索拉兹米公司 产油微生物润滑剂
WO2014138732A2 (en) * 2013-03-08 2014-09-12 Bp Corporation North America Inc. Microorganisms with altered fatty acid profiles for renewable materials and biofuel production
AU2014236594B2 (en) 2013-03-14 2018-06-14 The University Of Wyoming Research Corporation Methods and systems for biological coal-to-biofuels and bioproducts
US10376837B2 (en) 2013-03-14 2019-08-13 The University Of Wyoming Research Corporation Conversion of carbon dioxide utilizing chemoautotrophic microorganisms systems and methods
US9290749B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Solazyme, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
KR20150128770A (ko) * 2013-03-15 2015-11-18 솔라짐, 인코포레이티드 티오에스테라아제 및 맞춤형 오일 생산용 세포
US9783836B2 (en) 2013-03-15 2017-10-10 Terravia Holdings, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
JP2014212732A (ja) * 2013-04-25 2014-11-17 旭硝子株式会社 リシノール酸産生酵母
WO2014176515A2 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
AU2014277874B2 (en) 2013-06-14 2020-12-03 Genomatica, Inc. Methods of producing omega-hydroxylated fatty acid derivatives
WO2014207043A1 (en) * 2013-06-25 2014-12-31 Cellectis Modified diatoms for biofuel production
FR3009619B1 (fr) 2013-08-07 2017-12-29 Roquette Freres Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee
SG10201802834YA (en) 2013-10-04 2018-05-30 Terravia Holdings Inc Tailored oils
US10687218B2 (en) 2013-12-03 2020-06-16 Qualcomm Incorporated Power metric optimization and uplink DM-RS design for LTE/LTE-A uplink transmissions in unlicensed spectrum
WO2015133305A1 (ja) * 2014-03-03 2015-09-11 花王株式会社 β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
US9394550B2 (en) 2014-03-28 2016-07-19 Terravia Holdings, Inc. Lauric ester compositions
WO2015164550A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Solazyme, Inc. Food-related uses of high-stability oil
BR112016029235B1 (pt) 2014-06-16 2023-11-28 Genomatica, Inc Variante de polipeptídeo de fusão híbrida cyp153a-redutase, célula hospedeira recombinante, cultura de células, método de produção de um ácido graxo ômega-hidroxilado que possui um aumento na titulação e microorganismo recombinante
US20160002521A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Solazyme, Inc. Lubricants and wellbore fluids
ES2764273T3 (es) 2014-07-10 2020-06-02 Corbion Biotech Inc Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos
WO2016039300A1 (ja) * 2014-09-08 2016-03-17 公立大学法人兵庫県立大学 珪藻の新規形質転換ベクターおよびその含有する新規プロモーター配列
BR112017005370A2 (pt) 2014-09-18 2017-12-12 Terravia Holdings Inc acil-acp tioesterases e mutantes das mesmas
WO2016105931A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Bridgestone Americas Tire Operations, Llc Oil-containing rubber compositions and related methods
US11352602B2 (en) 2015-03-31 2022-06-07 Corbion Biotech, Inc. Microalgae adapted for heterotrophic culture conditions
CN107960101A (zh) 2015-04-06 2018-04-24 柯碧恩生物技术公司 具有lpaat消融的产油微藻
JP6587468B2 (ja) * 2015-09-11 2019-10-09 花王株式会社 脂質の製造方法
WO2017101987A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
US10650621B1 (en) 2016-09-13 2020-05-12 Iocurrents, Inc. Interfacing with a vehicular controller area network
US20180142218A1 (en) 2016-10-05 2018-05-24 Terravia Holdings, Inc. Novel acyltransferases, variant thioesterases, and uses thereof
EP3619301A4 (en) 2017-05-05 2021-03-03 Purissima, Inc. NEUROTRANSMITTERS AND THEIR MANUFACTURING PROCESSES
WO2020041521A1 (en) * 2018-08-22 2020-02-27 Corbion Biotech, Inc. β-KETOACYL-ACP SYNTHASE II VARIANTS
BR112021003913A2 (pt) 2018-08-30 2021-05-18 Checkerspot, Inc. triglicerídeos hidroformilados e seus usos
CN110885754B (zh) * 2018-09-07 2021-11-12 中国石油化工股份有限公司 一种利用表面活性剂防治微藻培养过程中生物污染的方法
BR112021015352A2 (pt) 2019-02-11 2021-10-05 Checkerspot, Inc. Composições de óleo de triglicerídeo
CN110184084A (zh) * 2019-05-27 2019-08-30 江苏大学 一种微藻与白土油热解制备生物油的方法及其系统
EP4077439A4 (en) 2019-12-18 2023-12-13 Checkerspot, Inc. USES OF MICROBE-DERIVED MATERIALS IN POLYMER APPLICATIONS
IL295395A (en) * 2020-02-10 2022-10-01 C16 Biosciences Inc Microbially produced palm oil substitutes
GB202005179D0 (en) * 2020-04-08 2020-05-20 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Methods for the selection of nucleic acid sequences
GB202005180D0 (en) * 2020-04-08 2020-05-20 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Methods for targeted integration
WO2022026341A1 (en) * 2020-07-28 2022-02-03 The Regents Of The University Of California Expressing multiple genes from a single transcript in algae and plants
US20230404102A1 (en) * 2020-11-12 2023-12-21 C16 Biosciences, Inc. Edible microbial oil
KR102491250B1 (ko) 2021-07-30 2023-01-20 류시창 승강식 피난기
EP4208528B1 (en) 2021-09-17 2025-04-02 Checkerspot, Inc. High oleic oil compositions and uses thereof
WO2023091669A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Checkerspot, Inc. Recycled polyurethane formulations
WO2023102069A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Checkerspot, Inc. Polyols, polyurethane dispersions, and uses thereof
WO2023133417A2 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 Change Foods, Inc. Dairy-like compositions
WO2023131656A1 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 Biotrino Aps Chlorella vulgaris strain with reduced chlorophyll content
WO2023196923A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Checkerspot, Inc. Ricinoleate oil production and uses thereof
WO2024238964A1 (en) * 2023-05-17 2024-11-21 Yali Biosciences Inc. Engineered yeast and use for production of triacylglycerol

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000066750A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US20030079249A1 (en) * 2001-06-29 2003-04-24 John Shanklin Isoform of castor oleate hydroxylase
WO2008151149A2 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Solazyme, Inc. Production of oil in microorganisms
US20100151539A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-17 Solazyme, Inc. Recombinant Microalgae Cells Producing Novel Oils

Family Cites Families (381)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2235056A (en) 1938-03-04 1941-03-18 Ici Ltd Process for the recovery of glycerol from still residues from fermentation processes
US2383602A (en) 1943-03-04 1945-08-28 Colgate Palmolive Peet Co Process for treatment of fatty glycerides
US2967700A (en) 1955-03-01 1961-01-10 Morris B Kallison Whipping and aerating apparatus
US2874171A (en) 1957-02-20 1959-02-17 Upjohn Co Recovery of ergosterol
US3142135A (en) 1962-02-13 1964-07-28 Grain Processing Corp Production of carotenoids by the cultivation of algae
US3280502A (en) 1962-11-07 1966-10-25 Hoffmann La Roche Process for the preparation of lutein
US3320693A (en) 1964-09-11 1967-05-23 Kk Method of industral cultivation of unicellular green algae such as chlorella
US3475274A (en) 1967-08-07 1969-10-28 Commercial Solvents Corp Production of riboflavin
US3962466A (en) 1972-11-10 1976-06-08 Dai-Nippon Sugar Manufacturing Co., Ltd. Method for treatment of microorganisms
US4049724A (en) 1973-11-20 1977-09-20 Atlantic Richfield Company Osmium catalyzed organic hydroperoxide hydroxylation of olefinic compounds
US4058492A (en) 1974-01-10 1977-11-15 Bayer Aktiengesellschaft Process for molding polyurethane foams
JPS5328989B2 (zh) 1974-05-27 1978-08-17
US4005062A (en) 1974-08-16 1977-01-25 Standard Oil Company (Indiana) Process of preparing water-soluble whippable extract from microorganism protein material
US3957578A (en) 1975-01-03 1976-05-18 Hokkaido Sugar Co., Ltd. Method for manufacture of α-galactosidase by microorganism
US4103039A (en) 1976-08-18 1978-07-25 Fuji Oil Company, Limited Method for producing improved shea fat
FR2375319A1 (fr) 1976-12-23 1978-07-21 British Petroleum Co Procede de traitement d'extraits lipidiques
US4182777A (en) 1977-03-01 1980-01-08 Standard Oil Company (Indiana) Co-dried yeast whey food product and process
US4266617A (en) 1979-02-23 1981-05-12 Excel Industries, Inc. Tractor with full-floating tool bar
US4288378A (en) 1979-05-23 1981-09-08 The Procter & Gamble Company Method of preparing an enriched peanut oil peanut butter stabilizer
IL57712A (en) 1979-07-03 1984-02-29 Yissum Res Dev Co Cultivation of halophilic algae of the dunaliella species for the production of fuel-like product
US4273790A (en) 1979-11-19 1981-06-16 Standard Brands Incorporated Low-fat liquid spread and process
US4335156A (en) 1980-09-19 1982-06-15 Nabisco Brands, Inc. Edible fat product
US4373434A (en) 1980-11-24 1983-02-15 Simon-Rosedowns Limited Apparatus for the expansion of oil bearing seeds
JPS57150379A (en) 1981-03-14 1982-09-17 Kikujiro Ishiwatari Crushing of cell membrane of chlorella
US4390561A (en) 1981-11-04 1983-06-28 The Procter & Gamble Company Margarine oil product
US4584139A (en) 1983-01-31 1986-04-22 Olin Corporation Hydrogenation of long chain olefinic oils with Raney catalyst
DK402583D0 (da) 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
US4519845A (en) 1984-02-09 1985-05-28 Uop Inc. Separation of sucrose from molasses
US4940845A (en) 1984-05-30 1990-07-10 Kao Corporation Esterification process of fats and oils and enzymatic preparation to use therein
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4627192B1 (en) 1984-11-16 1995-10-17 Sigco Res Inc Sunflower products and methods for their production
US4755467A (en) 1985-06-03 1988-07-05 Unisearch Limited Method for the production of sorbitol and gluconate
US5792631A (en) 1985-07-01 1998-08-11 Dcv, Inc. Microbial process for the production of ascorbic acid using Chlorella protothecoides
US5900370A (en) 1985-07-01 1999-05-04 Bio-Technical Resources Process for the production of ascorbic acid with prototheca
US5001059A (en) 1985-07-01 1991-03-19 Bio-Technical Resources, Inc. L-ascorbic acid production in microorganisms
US4603188A (en) 1985-07-10 1986-07-29 Itoh Seiyu Kabushiki Kaisha Curable urethane composition
US4673490A (en) 1985-08-23 1987-06-16 Fluor Corporation Process for separating crude oil components
US5091116A (en) 1986-11-26 1992-02-25 Kraft General Foods, Inc. Methods for treatment of edible oils
US5360730A (en) 1987-06-05 1994-11-01 Universal Foods Corporation Zeaxanthin producing strains of Neospongiococcum Excentricum
DK399387D0 (da) 1987-07-31 1987-07-31 Novo Industri As Immobiliseret lipase og dennes anvendelse
JP2641935B2 (ja) 1987-09-28 1997-08-20 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼの固定化方法
FR2626584B1 (fr) 1988-01-28 1990-07-13 Agronomique Inst Nat Rech Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation
US4992605A (en) 1988-02-16 1991-02-12 Craig Wayne K Production of hydrocarbons with a relatively high cetane rating
US4901635A (en) 1988-04-08 1990-02-20 Anderson International Corp. Apparatus and method for the continuous extrusion and partial deliquefaction of oleaginous materials
US5080848A (en) 1988-12-22 1992-01-14 The Proctor & Gamble Company Process for making concentrated surfactant granules
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US20060094089A1 (en) 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US6680426B2 (en) 1991-01-07 2004-01-20 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
DE3836447C2 (de) 1988-10-26 1994-02-03 Stockhausen Chem Fab Gmbh Verfahren zur Gewinnung hochsulfatierter Fettsäuren, Hydroxifettsäuren oder oxalkylierter Hydroxifettsäuren
DK638688D0 (da) 1988-11-16 1988-11-16 Novo Industri As Partikelformet immobiliseret lipase-praeparat, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
JPH04507257A (ja) 1989-05-10 1992-12-17 ダーヴィー・プロセス・テクノロジー・リミテッド 多段水素化脱硫法
US5258197A (en) 1989-09-20 1993-11-02 Nabisco, Inc. Reduced calorie triglyceride mixtures
US5391383A (en) 1989-09-20 1995-02-21 Nabisco, Inc. Edible spray oil
US5434278A (en) 1989-09-20 1995-07-18 Nabisco, Inc. Synthesis of acetoglyceride fats
WO1991009924A1 (en) 1989-12-29 1991-07-11 The Procter & Gamble Company Ultra mild surfactant with good lather
US4992189A (en) 1990-02-07 1991-02-12 Mobil Oil Corporation Lubricants and lube additives from hydroxylation and esterification of lower alkene oligomers
DE4004800C2 (de) 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
US5407957A (en) 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
US7053267B2 (en) 1990-03-16 2006-05-30 Calgene Llc Plant seed oils
US5298421A (en) 1990-04-26 1994-03-29 Calgene, Inc. Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods
US5164308A (en) 1990-05-21 1992-11-17 Martek Corporation Preparation of labelled triglyceride oils by cultivation of microorganisms
US6022577A (en) 1990-12-07 2000-02-08 Nabisco Technology Company High stearic acid soybean oil blends
WO1992011373A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences of soybean acyl-acp thioesterase genes
US5945585A (en) 1990-12-20 1999-08-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Specific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp thioesters nucleic acid fragments encoding acyl-acp thiosesterase enzymes and the use of these fragments in altering plant oil composition
MY107920A (en) 1990-12-27 1996-06-29 Kao Corp Process for producing alcohol
JPH0699337B2 (ja) 1990-12-27 1994-12-07 花王株式会社 アルコールの製造方法
US5380894A (en) 1991-03-01 1995-01-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of hydroxy fatty acids and estolide intermediates
US5346724A (en) 1991-04-12 1994-09-13 Nippon Oil Company, Ltd. Oil and fat composition for lubricating food processing machines and use thereof
CU22292A1 (es) 1991-05-07 1995-01-31 Cigb Procedimiento para la obtencion a escala industrial de licores de fructosa-glucosa a partir de sacarosa e instalacion para el mismo
US5455167A (en) 1991-05-21 1995-10-03 Calgene Inc. Medium-chain thioesterases in plants
US5270175A (en) 1991-07-12 1993-12-14 Dna Plant Technology Corporation Methods and compositions for producing metabolic products for algae
US5268192A (en) 1991-07-16 1993-12-07 Nabisco, Inc. Low calorie nut products and process of making
JP3143636B2 (ja) 1991-09-11 2001-03-07 株式会社サン・クロレラ 細胞破裂によるクロレラ細胞壁の破砕方法
DE4130986A1 (de) 1991-09-18 1993-03-25 Bayer Ag Pinosylvinsynthase-gene
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US6355861B1 (en) 1991-10-10 2002-03-12 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
FR2686619B1 (fr) 1992-01-28 1995-07-13 Commissariat Energie Atomique Procede de production selective de lipides poly-insatures a partir d'une culture de micro-algues du type porphyridium et cuve utilisee dans ce procede.
US5395455A (en) 1992-03-10 1995-03-07 Energy, Mines And Resources - Canada Process for the production of anhydrosugars from lignin and cellulose containing biomass by pyrolysis
DE4209779C1 (zh) 1992-03-26 1993-07-15 Oelmuehle Leer Connemann Gmbh & Co., 2950 Leer, De
US5597400A (en) 1992-06-19 1997-01-28 Nonomura; Arthur M. Methods and compositions for enhancing carbon fixation in plants
TW211523B (en) 1992-06-29 1993-08-21 Amerchol Corp Hydroxylated milk glycerides
US6410281B1 (en) 1992-07-10 2002-06-25 Omegatech, Inc. Reducing corrosion in a fermentor by providing sodium with a non-chloride sodium salt
US5298637A (en) 1992-10-22 1994-03-29 Arco Chemical Technology, L.P. Process for producing a reduced calorie lipid composition
JP3090810B2 (ja) 1993-03-09 2000-09-25 日本碍子株式会社 パルミトオレイン酸の製造方法
GB2277052A (en) 1993-04-14 1994-10-19 Du Pont Canada Polyurethane foam laminates
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
JPH078217A (ja) 1993-06-29 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有健康食品およびその製造方法
JP3506740B2 (ja) 1993-09-09 2004-03-15 日清オイリオ株式会社 ドコサヘキサエン酸含有藻類の培養方法
CA2118071C (en) 1993-10-28 2004-09-14 Rodney B. Croteau Dna encoding limonene synthase from mentha spicata
WO1995013390A2 (en) 1993-11-10 1995-05-18 Calgene, Inc. Plant acyl acp thioesterase sequences
US5458795A (en) 1994-01-28 1995-10-17 The Lubrizol Corporation Oils thickened with estolides of hydroxy-containing triglycerides
US5427704A (en) 1994-01-28 1995-06-27 The Lubrizol Corporation Triglyceride oils thickened with estolides of hydroxy-containing triglycerides
US5451332A (en) 1994-01-28 1995-09-19 The Lubrizol Corporation Estolides of hydroxy-containing triglycerides that contain a performance additive
EP0746608B1 (en) 1994-02-21 2003-08-20 Novozymes A/S Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation
US5910630A (en) 1994-04-06 1999-06-08 Davies; Huw Maelor Plant lysophosphatidic acid acyltransferases
US5563058A (en) 1994-04-06 1996-10-08 Calgene, Inc. Plant lysophosphatidic acid acyltransferases
US5506201A (en) 1994-04-29 1996-04-09 International Flavors & Fragrances Inc. Formulation of a fat surfactant vehicle containing a fragrance
ATE368118T1 (de) 1994-05-18 2007-08-15 Bayer Bioscience Gmbh Für enzyme, die die fähigkeit besitzen lineare alpha 1,4-glucane in pflanzen, pilzen und mikroorganismen zu synthesieren, kodierende dna sequenzen
JP3375726B2 (ja) 1994-05-18 2003-02-10 雪印乳業株式会社 食用油脂および油脂混合物
US6113971A (en) 1994-07-25 2000-09-05 Elmaleh; David R. Olive oil butter
DK0776356T3 (da) 1994-08-16 2000-01-24 Frische Gmbh Fremgangsmåde til indvinding af ikke-vandopløselige native produkter fra native materialer ved hjælp af centrifugalkraft
US5756135A (en) 1994-09-15 1998-05-26 Robert D. Seeley Trust Water insoluble yeast solids product and process of making same
WO1996012467A1 (en) 1994-10-20 1996-05-02 The Procter & Gamble Company Personal treatment compositions and/or cosmetic compositions containing enduring perfume
US5475160A (en) 1994-11-07 1995-12-12 Shell Oil Company Process for the direct hydrogenation of triglycerides
US5680812A (en) 1995-01-23 1997-10-28 Linsgeseder; Helmut Apparatus and method for the extraction of vegetable oils
DE19503062A1 (de) 1995-02-01 1996-08-08 Henkel Kgaa Verwendung von Alkoxylierungsprodukten epoxydierter Fettstoffe als Entschäumer
US5942479A (en) 1995-05-27 1999-08-24 The Proctor & Gamble Company Aqueous personal cleansing composition with a dispersed oil phase comprising two specifically defined oil components
NZ318114A (en) 1995-06-06 2000-06-23 Agro Man Group Inc Vegetable based biodegradable liquid lubricants
US5685218A (en) 1995-07-14 1997-11-11 The French Oil Mill Machinery Co. Method for treating oil-bearing material
US6004923A (en) 1995-10-27 1999-12-21 Basf Aktiengesellschaft Fatty acid derivatives and their use as surfactants in detergents and cleaners
FI100248B (fi) 1996-02-05 1997-10-31 Fortum Oil Oy Keskitisleen valmistus
US6086903A (en) 1996-02-26 2000-07-11 The Proctor & Gamble Company Personal treatment compositions and/or cosmetic compositions containing enduring perfume
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
EP0907312B1 (en) 1996-04-15 2006-03-08 Washington State University Research Foundation Compositions and methods for taxol biosynthesis
AR006830A1 (es) 1996-04-26 1999-09-29 Du Pont Aceite de soja con alta estabilidad oxidativa
US5595965A (en) 1996-05-08 1997-01-21 The Lubrizol Corporation Biodegradable vegetable oil grease
US6312623B1 (en) 1996-06-18 2001-11-06 Abb Power T&D Company Inc. High oleic acid oil compositions and methods of making and electrical insulation fluids and devices comprising the same
WO1998005294A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Plum Kemi Produktion A/S An oil-in-water emulsion for use on human skin for cleansing, preserving or improving the condition of the skin
BR9711037A (pt) 1996-08-08 1999-08-17 Procter & Gamble Sintese de poli-steres poliÄis
US5885440A (en) 1996-10-01 1999-03-23 Uop Llc Hydrocracking process with integrated effluent hydrotreating zone
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
AU5498198A (en) 1997-01-24 1998-08-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Beta-ketoacyl-acp-synthetase ii enzyme and gene encoding the same
US6465642B1 (en) 1997-02-07 2002-10-15 The Procter & Gamble Company Lower alkyl ester recycling in polyol fatty acid polyester synthesis
DE19710152C2 (de) 1997-03-12 1999-04-22 Henkel Kgaa Verfahren zur Herstellung von Aniontensidgranulaten
US6395965B1 (en) 1997-03-21 2002-05-28 Restoragen, Inc. Plant containing a gene construct comprising a chlorella virus promoter and a lac operator
US6243725B1 (en) 1997-05-21 2001-06-05 Premier International, Ltd. List building system
US6083731A (en) 1997-06-24 2000-07-04 Washington State University Research Foundation Recombinant materials and methods for the production of limonene hydroxylases
US6429014B1 (en) 1997-07-11 2002-08-06 Washington State University Research Foundation Monoterpene synthases from grand fir (Abies grandis)
WO1999006585A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Martek Biosciences Corporation Dha-containing nutritional compositions and methods for their production
US5891697A (en) 1997-09-25 1999-04-06 Washington State University Research Foundation Monoterpene synthases from common sage (Salvia officinalis)
ATE346909T1 (de) 1997-09-29 2006-12-15 Japan Tobacco Inc Hefeextraktzusammensetzung, hefe zur herstellung derselben und verfahren zur herstellung einer hefeextraktzusammensetzung
IL137443A (en) 1998-01-21 2003-07-06 Univ Maryland Biotech Inst Methods for the enrichment of live feed with nutrients essential for fish larvae
US6265639B1 (en) 1998-01-22 2001-07-24 Washington State University Foundation Gymnosperm nucleic acid molecules encoding sesquiterpene synthases and methods of use
US6407044B2 (en) 1998-01-28 2002-06-18 The Proctor & Gamble Company Aerosol personal cleansing emulsion compositions which contain low vapor pressure propellants
AU2490399A (en) 1998-02-02 1999-08-16 Regents Of The University Of California, The Germacrene c synthase gene of (lycopersicon esculentum)
US6139897A (en) 1998-03-24 2000-10-31 Kao Corporation Oil or fat composition containing phytosterol
US6468955B1 (en) 1998-05-01 2002-10-22 The Proctor & Gamble Company Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified enzyme
US20020012979A1 (en) 1998-06-08 2002-01-31 Alan Berry Vitamin c production in microorganisms and plants
US6051539A (en) 1998-07-02 2000-04-18 Cargill, Inc. Process for modifying unsaturated triacylglycerol oils resulting products and uses thereof
WO2000001650A1 (en) 1998-07-06 2000-01-13 Dcv, Inc. Doing Business As Bio-Technical Resources Method of vitamin production
EP2305825B1 (en) 1998-07-06 2015-01-14 DCV Inc. doing business as Bio-Technical Resourses Method of vitamin production
US7511190B2 (en) 1999-11-17 2009-03-31 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
JP2000136199A (ja) 1998-10-29 2000-05-16 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能なシグナルペプチド、分泌型発現ベクター、およびそれらを用いたタンパク質生産方法
US6043072A (en) 1998-11-05 2000-03-28 Washington State University Research Foundation Nucleic acids encoding Taxus geranylgeranyl diphosphate synthase, and methods of use
US6762345B1 (en) 1998-12-03 2004-07-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant stearoyl desaturases
JP2000175696A (ja) 1998-12-14 2000-06-27 Yoshio Tanaka ドナリエラ藻体の抽出方法
US6166231A (en) 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
ATE234890T1 (de) 1998-12-21 2003-04-15 Goldschmidt Ag Th Verwendung von metallsalzen der ricinolsäure bei der herstellung von polyurethanschäumen
US6020509A (en) 1998-12-22 2000-02-01 Condea Vista Company Method for producing surfactant compositions
US6630066B2 (en) 1999-01-08 2003-10-07 Chevron U.S.A. Inc. Hydrocracking and hydrotreating separate refinery streams
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7211418B2 (en) * 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US6278006B1 (en) 1999-01-19 2001-08-21 Cargill, Incorporated Transesterified oils
AU4211600A (en) * 1999-04-10 2000-11-14 Maxygen, Inc. Modified lipid production
WO2000061771A2 (en) 1999-04-12 2000-10-19 Monsanto Technology Llc Transgenic plants containing altered levels of sterol compounds and tocopherols
DE19926456A1 (de) 1999-06-10 2000-12-14 Norddeutsche Pflanzenzucht Han Verfahren zur Erhöhung des Fettsäuregehalts in Pflanzensamen
AU5764800A (en) 1999-07-01 2001-01-22 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Cleansing compositions
US6217746B1 (en) 1999-08-16 2001-04-17 Uop Llc Two stage hydrocracking process
DE10000978A1 (de) 2000-01-12 2001-07-26 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Fettsäuren in Pflanzen und Mikroorganismen
US6391815B1 (en) 2000-01-18 2002-05-21 Süd-Chemie Inc. Combination sulphur adsorbent and hydrogenation catalyst for edible oils
ES2675517T3 (es) 2000-01-19 2018-07-11 Dsm Ip Assets B.V. Proceso de extracción sin solvente
US6338866B1 (en) 2000-02-15 2002-01-15 Applied Food Biotechnology, Inc. Pet foods using algal or fungal waste containing fatty acids
GB0007651D0 (en) 2000-03-29 2000-05-17 Ascorbex Ltd Gene sequence
ES2291312T3 (es) 2000-04-21 2008-03-01 Martek Biosciences Corporation Conversion trofica de algas fototroficas estrictas mediante ingenieria metabolica.
US6268517B1 (en) 2000-05-09 2001-07-31 Condea Vista Company Method for producing surfactant compositions
WO2001085892A1 (en) 2000-05-11 2001-11-15 The Procter & Gamble Company Highly concentrated fabric softener compositions and articles containing such compositions
US20020178467A1 (en) 2000-05-12 2002-11-28 Katayoon Dehesh Plastid transit peptide sequences for efficient plastid targeting
MY122480A (en) 2000-05-29 2006-04-29 Premium Vegetable Oils Sdn Bhd Trans free hard structural fat for margarine blend and spreads
DE50105445D1 (de) 2000-06-20 2005-04-07 Goldschmidt Ag Th Verwendung von Ricinolsäure in der Herstellung von Polyurethanschäumen
BR0112716A (pt) * 2000-07-25 2003-06-24 Calgene Llc Sequencias de ácidos nucléicos codificando beta-cetoacil-acp sintase e aplicações das mesmas
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
FR2814064B1 (fr) 2000-09-20 2005-06-17 Oreal Composition de lavage comprenant des particules d'oxyde d'aluminium, au moins un agent conditionneur et au moins un tensioactif detergent
US6596155B1 (en) 2000-09-26 2003-07-22 Uop Llc Hydrocracking process
JP2002125601A (ja) 2000-10-25 2002-05-08 Kurorera Kogyo Kk 動物性プランクトン用餌料とその製造方法及び動物性プランクトンの培養方法
AU2002224445A1 (en) 2000-10-26 2002-05-06 Joe E. Guyer Method of generating and recovering gas from subsurface formations of coal, carbonaceous shale and organic-rich shales
US6538169B1 (en) 2000-11-13 2003-03-25 Uop Llc FCC process with improved yield of light olefins
CZ20031418A3 (cs) 2000-11-21 2003-09-17 Unilever N. V. Emulzní pomazánka typu vody v oleji
US7081567B2 (en) 2000-12-03 2006-07-25 Lexun Xue Transgenic dunaliella salina as a bioreactor
US7288278B2 (en) 2000-12-21 2007-10-30 Aarhuskarlshamn Denmark A/S Process for preparing vegetable oil fractions rich in non-tocolic, high-melting, unsaponifiable matter
US20020144455A1 (en) 2001-01-06 2002-10-10 Bertrand Jerome C. Non sooting candle composition
AU2002252124B2 (en) 2001-03-26 2007-09-06 Dow Global Technologies Inc. Metathesis of unsaturated fatty acid esters or unsaturated fatty acids with lower olefins
JP4823430B2 (ja) 2001-03-28 2011-11-24 花王株式会社 界面活性剤組成物
EP1390470A4 (en) 2001-04-20 2004-08-18 Cargill Inc PRODUCTION OF ALPHA-LIPOIC ACID
US6620427B2 (en) 2001-04-24 2003-09-16 Abbott Laboratories Method for improving bone mineralization
FR2824266B1 (fr) 2001-05-04 2005-11-18 Oreal Composition cosmetique de soin ou de maquillage des matieres keratiniques comprenant un ester a groupement aromatique et un agent photoprotecteur et utilisations
US6503285B1 (en) 2001-05-11 2003-01-07 Cargill, Inc. Triacylglycerol based candle wax
US6596768B2 (en) 2001-05-22 2003-07-22 Church & Dwight Co., Inc. Unsaturated lipid-enriched feedstock for ruminants
US6398707B1 (en) 2001-05-31 2002-06-04 Wen-Teng Wu Method of preparing lower alkyl fatty acids esters and in particular biodiesel
US20030082595A1 (en) 2001-08-03 2003-05-01 Bo Jiang Nucleic acids of aspergillus fumigatus encoding industrial enzymes and methods of use
US6706659B2 (en) 2001-08-29 2004-03-16 Uop Llc High-activity isomerization catalyst and process
WO2003037884A2 (en) 2001-09-19 2003-05-08 Archer-Daniels-Midland Company Process for separation of tocopherols
JP3816774B2 (ja) 2001-10-01 2006-08-30 独立行政法人科学技術振興機構 炭化水素資化微細藻類およびそれを用いたバイオレメディエーション方法
CA2472099A1 (en) 2002-01-03 2003-07-24 Archer-Daniels-Midland Company Polyunsaturated fatty acids as part of reactive structures for latex paints: thickeners, surfactants and dispersants
DK1468093T4 (en) 2002-01-23 2018-04-09 Dsm Ip Assets Bv Fermentation of pentose sugars
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US6590113B1 (en) 2002-03-26 2003-07-08 Ronald T. Sleeter Process for treating oils containing antioxidant compounds
US20030229237A1 (en) 2002-04-02 2003-12-11 Haas Michael J. In situ production of fatty acid alkyl esters
CA2484334C (en) 2002-05-03 2013-01-22 Martek Biosciences Corporation High-quality lipids and methods for producing by enzymatic liberation from biomass
US20030211594A1 (en) 2002-05-07 2003-11-13 Rosebrook Donald Ian Microalgae for remediation of waste and method of culturing the same
US7264886B2 (en) 2002-05-14 2007-09-04 Viance, Llc Water repellent compositions for wood preservatives
US6818589B1 (en) 2002-06-18 2004-11-16 Uop Llc Isomerization catalyst and processes
JP2005530506A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 モンサント テクノロジー エルエルシー 改変された脂肪酸組成を持つ植物の生成のためのチオエステラーゼ関連核酸配列およびその使用方法
PL217409B1 (pl) 2002-07-19 2014-07-31 Cytos Biotechnology Ag Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna i kompozycje szczepionki zawierające układ antygenowy amyloidu beta 1-6 oraz sposób ich wytwarzania i zastosowanie
US7232935B2 (en) 2002-09-06 2007-06-19 Fortum Oyj Process for producing a hydrocarbon component of biological origin
US7041866B1 (en) 2002-10-08 2006-05-09 Uop Llc Solid-acid isomerization catalyst and process
US20040074760A1 (en) 2002-10-17 2004-04-22 Carnegie Mellon University Production of biofuels
FI116627B (fi) 2002-11-01 2006-01-13 Danisco Menetelmä triglyseridien rasvahappoketjukoostumuksen säätelemiseksi sekä niiden käyttö
US7135290B2 (en) 2003-04-12 2006-11-14 Solazyme, Inc. Methods and compositions for evolving hydrogenase genes
BR0316380A (pt) 2002-11-18 2005-10-04 Monsanto Technology Llc Produção de proteìna e óleo aumentada em plantas pelo rompimento da trilha de fenilpropanóide
KR101124449B1 (ko) 2003-01-08 2012-03-21 텍사스 테크 유니버시티 피마자유/에폭시화 대두유계 엘라스토머 조성물
EP1604027A2 (de) 2003-01-20 2005-12-14 Sungene GmbH & Co. KGaA Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen
WO2004067736A2 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
US20060156436A1 (en) 2003-03-03 2006-07-13 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Transgenic plant having fructooligosaccharide accumulated therein and process for constructing
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7032664B2 (en) 2004-06-02 2006-04-25 Halliburton Energy Services, Inc. Nanocomposite particulates and methods of using nanocomposite particulates
US7259255B2 (en) 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
EP1642959B1 (en) 2003-07-09 2010-05-19 The Nisshin OilliO Group, Ltd. Process for producing symmetrical triglyceride
US7354734B2 (en) 2003-08-25 2008-04-08 Funzyme Biotechnologies Sa Fungal proteins and nucleic acids encoding same
PE20050398A1 (es) 2003-09-22 2005-06-03 Rosales Jose Antonio Socla Proceso y purificacion de las xantofilas de marigold
US20060048240A1 (en) 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7638314B2 (en) 2003-10-02 2009-12-29 Mississippi State University Production of biodiesel and other valuable chemicals from wastewater treatment plant sludges
US20050132441A1 (en) * 2003-11-12 2005-06-16 Damude Howard G. Delta15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
EP1682466B1 (en) 2003-11-13 2008-11-12 Neste Oil OYJ Process for the hydrogenation of olefins
KR100927924B1 (ko) 2003-11-20 2009-11-19 솔베이(소시에떼아노님) 유기 화합물의 제조 방법
EP2256207A1 (en) 2003-12-23 2010-12-01 BASF Plant Science GmbH Sugar and lipid metabolism regulators in plants VI
CN1238469C (zh) 2004-01-16 2006-01-25 清华大学 有机介质反应体系中脂肪酶转化油脂生产生物柴油新工艺
US7063957B2 (en) 2004-03-26 2006-06-20 The University Of Hong Kong Methods for production of astaxanthin from the green microalgae Chlorella in dark-heterotrophic cultures
CN101018862B (zh) * 2004-04-22 2013-10-09 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
WO2005108586A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-17 Universität Regensburg A method for increasing the ratio of homologous to non-homologous recombination
US7364883B2 (en) 2004-05-07 2008-04-29 Yeastern Biotech Co., Ltd. Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts
EP1766037B1 (en) 2004-05-12 2015-07-01 Transworld Technologies Limited Generation of hydrogen from hydrocarbon-bearing materials
US7214297B2 (en) 2004-06-28 2007-05-08 Applied Materials, Inc. Substrate support element for an electrochemical plating cell
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7279617B2 (en) 2004-09-22 2007-10-09 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
ES2689290T3 (es) 2004-09-28 2018-11-13 Neste Oyj Proceso para eterificar iso-olefinas
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
WO2006047445A2 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for preparing materials for extraction
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7550286B2 (en) 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7238277B2 (en) 2004-12-16 2007-07-03 Chevron U.S.A. Inc. High conversion hydroprocessing
US20060225341A1 (en) 2004-12-20 2006-10-12 Rodolfo Rohr Production of biodiesel
CA2563549C (en) 2004-12-30 2012-10-09 Sun Drilling Products Corporation Thermoset nanocomposite particles, processing for their production, and their use in oil and natural gas drilling applications
PL1681337T3 (pl) 2005-01-14 2011-05-31 Neste Oil Oyj Sposób wytwarzania węglowodorów
DE102005003624A1 (de) 2005-01-26 2006-07-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Herstellung und Anwendung eines antioxidativ wirksamen Extraktes aus Crypthecodinium sp.
US7692049B2 (en) 2005-01-31 2010-04-06 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Hydrocarbon compositions useful for producing fuels and methods of producing the same
EP2194140A2 (en) 2005-03-02 2010-06-09 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
EA016258B1 (ru) 2005-03-18 2012-03-30 Микробиа, Инк. Рекомбинантные грибы, продуцирующие каротиноиды, и способы их применения
US20060223153A1 (en) 2005-04-05 2006-10-05 Luca Technologies, Llc Generation of materials with enhanced hydrogen content from anaerobic microbial consortia
US7426960B2 (en) 2005-05-03 2008-09-23 Luca Technologies, Inc. Biogenic fuel gas generation in geologic hydrocarbon deposits
US20090324636A1 (en) 2005-05-11 2009-12-31 Advanced Dionutrition Corporation Fish oil in stabilized form
WO2006124598A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Martek Biosciences Corporation Biomass hydrolysate and uses and production thereof
US7288685B2 (en) 2005-05-19 2007-10-30 Uop Llc Production of olefins from biorenewable feedstocks
EP1741768B2 (en) 2005-07-04 2023-04-05 Neste Oyj Process for the manufacture of diesel range hydrocarbons
EP1741767B2 (en) 2005-07-04 2023-04-05 Neste Oyj Process for the manufacture of diesel range hydrocarbons
BRPI0615085A2 (pt) 2005-08-25 2011-06-28 Solix Biofuels Inc método, aparelho, e sistema para produção de biodiesel a partir de alga
WO2007027669A1 (en) 2005-08-29 2007-03-08 Cps Biofuels, Inc. Improved biodiesel fuel, additives, and lubbricants
FR2890961B1 (fr) 2005-09-21 2007-11-23 Inst Francais Du Petrole Procede perfectionne de fabrication d'esters ethyliques a partir de corps gras d'origine naturelle
US8269065B2 (en) 2005-09-27 2012-09-18 Nestec, S.A. Nucleic acids and proteins associated with sucrose degradation in coffee
US8163675B2 (en) 2005-10-20 2012-04-24 Akzo Nobel N.V. Emulsifier based on polyamines and fatty acid/maleic anhydride
ES2491871T3 (es) 2005-12-12 2014-09-08 Neste Oil Oyj Proceso para la elaboración de hidrocarburos
US20070167396A1 (en) 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for cholesterol reduction in mammals
US20090274736A1 (en) 2006-01-19 2009-11-05 Solazyme Inc. Nutraceutical Compositions From Microalgae And Related Methods of Production And Administration
US20070166266A1 (en) 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for improving the health and appearance of skin
US9109170B2 (en) 2006-02-02 2015-08-18 Reg Biofuels, Llc Biodiesel cold filtration process
US20070218183A1 (en) 2006-03-14 2007-09-20 Bunge Oils, Inc. Oil composition of conjugated linoleic acid
JP5227302B2 (ja) 2006-03-15 2013-07-03 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． Ｐｕｆａポリケチドシンターゼ系を用いた異種生物における多価不飽和脂肪酸の生産方法
CN100590186C (zh) 2006-03-17 2010-02-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种生产生物油脂和生物柴油的方法
CN101460141A (zh) 2006-04-03 2009-06-17 先进生物营养公司 包含二十二碳六烯酸的饲料制剂
US20100248322A1 (en) 2006-04-05 2010-09-30 Luca Technologies, Inc. Chemical amendments for the stimulation of biogenic gas generation in deposits of carbonaceous material
WO2007121100A2 (en) 2006-04-13 2007-10-25 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US7309602B2 (en) 2006-04-13 2007-12-18 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
JP2009536830A (ja) 2006-05-12 2009-10-22 アリゾナ ボード オブ リージェンツ， ア ボディー コーポレイト オブ ザ ステート オブ アリゾナ アクティング フォー アンド オン ビハーフ オブ アリゾナ ステート ユニバーシティー 新規Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種およびその使用
CA2654337A1 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Total Raffinage Marketing Lysophosphatidic acid acyltransferase genes and uses thereof
CA2656557C (en) 2006-06-28 2015-08-11 Cibus, Llc Fatty acid blends and uses therefor
CN101108997B (zh) 2006-07-19 2010-07-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种微生物油脂的制备方法
BRPI0716831A2 (pt) 2006-09-14 2013-10-29 Biofuelbox Corp Método de conversão consistente e eficiente de lipídeos celulares em biocombustíveis
US20100028962A1 (en) 2006-09-18 2010-02-04 Qiang Hu Algal Medium Chain Length Fatty Acids and Hydrocarbons
JP2008081559A (ja) 2006-09-26 2008-04-10 Nippon Shokubai Co Ltd バイオディーゼル燃料組成物およびその製造方法
WO2008130372A2 (en) 2006-09-28 2008-10-30 Microbia, Inc. Production of sterols in oleaginous yeast and fungi
EP2076484B1 (en) 2006-10-13 2020-01-08 Elevance Renewable Sciences, Inc. Synthesis of terminal alkenes from internal alkenes via olefin metathesis
US9101161B2 (en) 2006-11-02 2015-08-11 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with phytoestrogen and compositions sweetened therewith
WO2008060571A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Aurora Biofuels, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
ITMI20062193A1 (it) 2006-11-15 2008-05-16 Eni Spa Processo per produrre frazioni idrocarburiche da miscele di origine biologica
JP4820277B2 (ja) 2006-12-20 2011-11-24 花王株式会社 ケトン体及び／又は２級アルコールの製造法
JP2008178871A (ja) 2006-12-28 2008-08-07 Tohoku Techno Arch Co Ltd 強塩基性陰イオン交換樹脂の再生方法
US9003695B2 (en) 2006-12-29 2015-04-14 Genifuel Corporation Controlled growth environments for algae cultivation
US8404004B2 (en) 2006-12-29 2013-03-26 Genifuel Corporation Process of producing oil from algae using biological rupturing
CN101652477A (zh) 2007-02-02 2010-02-17 麒麟控股株式会社 编码木糖醇脱氢酶的dna
US8129512B2 (en) 2007-04-12 2012-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and creating rubisco large subunit variants with improved rubisco activity, compositions and methods of use thereof
US8969030B2 (en) 2007-05-02 2015-03-03 Ouro Fino Participacoes E Empreendimentos Ltda Process to produce biodiesel and/or fuel oil
WO2008144224A1 (en) 2007-05-15 2008-11-27 Dow Global Technologies Inc. High resilience foams
US8801975B2 (en) 2007-05-17 2014-08-12 Cooper Industries, Llc Vegetable oil dielectric fluid composition
US7914832B2 (en) 2007-06-01 2011-03-29 Kyoto Eiyo Co., Ltd. Method for producing chlorella fermented food
GB2464024A (en) 2007-06-12 2010-04-07 Cps Biofuels Inc Production of gasoline from fermentable feedstocks
US20090018300A1 (en) 2007-07-11 2009-01-15 Archer-Daniels-Midland Company Monomers and polymers from bioderived carbon
CN101092353B (zh) 2007-07-12 2010-12-01 上海交通大学 动植物油脂转化脂肪酸单酯的制备方法
CN103120225A (zh) 2007-08-31 2013-05-29 马太克生物科学公司 含多不饱和脂肪酸的固体脂肪组合物及其制备与应用
JP2010538642A (ja) 2007-09-12 2010-12-16 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 生物油ならびにその生産および使用
WO2009036385A2 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Kuehnle Agrosystems, Inc. Expression of nucleic acid sequences for production of biofuels and other products in algae and cyanobacteria
CA2701094A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Optimized strains of yarrowia lipolytica for high eicosapentaenoic acid production
EP2211881A4 (en) 2007-11-01 2012-01-04 Wake Forest University School Of Medicine COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF SEDUCTIVES OF MAMMALS
FR2924126B1 (fr) 2007-11-28 2011-04-15 Roquette Freres Nouveau procede de culture d'une microalgue heterotrophe
US8815567B2 (en) 2007-11-30 2014-08-26 E I Du Pont De Nemours And Company Coenzyme Q10 production in a recombinant oleaginous yeast
US20090145392A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Clark Richard Hugh Fuel formulations
AU2008335089B2 (en) * 2007-12-11 2014-06-26 Synthetic Genomics, Inc. Secretion of fatty acids by photosynthetic microorganisms
GB0724720D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Ici Plc Triglyceride macromonomers
WO2009105620A1 (en) 2008-02-20 2009-08-27 Cco Technology, Ltd. Selective short chain monounsaturated oils
CN101230364A (zh) 2008-02-25 2008-07-30 清华大学 一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法
US8048654B2 (en) 2010-06-09 2011-11-01 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of fatty acids and esters
US8598378B2 (en) 2008-03-14 2013-12-03 University Of Hawaii Methods and compositions for extraction and transesterification of biomass components
US8043496B1 (en) 2008-03-18 2011-10-25 Peter Allen Schuh System for extracting oil from algae
AU2009231810A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Kuehnle Agrosystems, Inc. Nuclear based expression of genes for production of biofuels and process co-products in algae
WO2009126843A2 (en) 2008-04-09 2009-10-15 Solazyme, Inc. Direct chemical modification of microbial biomass and microbial oils
US20100170144A1 (en) 2008-04-09 2010-07-08 Solazyme, Inc. Hydroprocessing Microalgal Oils
US20110065821A1 (en) 2008-05-13 2011-03-17 Cargill, Incorporated Polyol made from partialy hydrogenated, fully epoxidized natural oils
CN101280328B (zh) 2008-05-27 2011-06-29 清华大学 一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法
US8435790B2 (en) 2008-07-25 2013-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of modulating lipid concentrations in eukaryotic cells
US8273694B2 (en) 2008-07-28 2012-09-25 Jeffrey A Brown Synthetic compositions obtained from algae
JP2011529345A (ja) 2008-07-28 2011-12-08 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 微生物における産物の生産を向上させるための方法および組成物
CA2638451A1 (en) 2008-08-01 2010-02-01 Profero Energy Inc. Methods and systems for gas production from a reservoir
US20100035309A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Luca Technologies, Inc. Analysis and enhancement of metabolic pathways for methanogenesis
US8927475B2 (en) 2008-08-08 2015-01-06 The Dial Corporation Consumer products comprising algae derived ingredients
WO2010019813A2 (en) 2008-08-13 2010-02-18 Sapphire Energy, Inc. Production of fatty actds by genetically modified photosynthetic organisms
US8546645B2 (en) 2008-10-03 2013-10-01 Agrisoma Biosciences Inc. Production of modified fatty acids in plants through rDNA targeted integration of heterologous genes
CA2738938C (en) 2008-10-07 2019-04-30 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing fatty aldehydes
US20100297292A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Reduced Pigmentation Microalgae Strains and Products Therefrom
US20100303957A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Edible Oil and Processes for Its Production from Microalgae
US20100297295A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Microalgae-Based Beverages
US20100297323A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Gluten-free Foods Containing Microalgae
BRPI0920280B8 (pt) 2008-10-14 2022-11-16 Corbion Biotech Inc Composição alimentícia, e, método para fabricar uma composição alimentícia
US20100303961A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Methods of Inducing Satiety
US20130122180A1 (en) 2008-10-14 2013-05-16 Solazyme, Inc. Microalgal Food Compositions
US20100297331A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Reduced Fat Foods Containing High-Lipid Microalgae with Improved Sensory Properties
US20100297296A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Healthier Baked Goods Containing Microalgae
US20120128851A1 (en) 2008-10-14 2012-05-24 Solazyme, Inc Novel microalgal food compositions
US20100303990A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. High Protein and High Fiber Algal Food Materials
US20100297325A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Egg Products Containing Microalgae
US20100303989A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Microalgal Flour
US8003365B2 (en) 2008-12-11 2011-08-23 Bio Architecture Lab, Inc. Biosynthesis of commodity chemicals
MX2011006785A (es) 2008-12-23 2011-09-27 Ls9 Inc Metodos y composiciones relacionados con tioesterasa enzima.
US8389625B2 (en) 2008-12-23 2013-03-05 Exxonmobil Research And Engineering Company Production of synthetic hydrocarbon fluids, plasticizers and synthetic lubricant base stocks from renewable feedstocks
US20100196575A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Solae, Llc Melting Vegetable Protein Based Substitute Cheese
CN101824440A (zh) 2009-03-04 2010-09-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种微生物油脂的分离方法
GB0903717D0 (en) 2009-03-04 2009-04-15 Innochem Ltd Flexible polyurethane foam
EP2411481B1 (en) 2009-03-27 2016-08-03 E. I. du Pont de Nemours and Company Dielectric heat-transfer fluid
AU2010236491B2 (en) 2009-04-14 2015-10-01 Corbion Biotech, Inc. Novel microalgal food compositions
BRPI1014451B1 (pt) 2009-04-14 2018-12-18 Solazyme Inc métodos para extrair óleos triglicerídeos a partir de biomassa de microalga
CA2760326A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
EP2470665A4 (en) 2009-08-28 2013-04-17 Phycal Inc BIOFUEL FROM RECOMBINANT OIL-CONTAINING ALGAE USING SUGAR CARBON SOURCES
CA3056664A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Alfred Gaertner Production of fatty acid derivatives in recombinant bacterial cells expressing an ester synthase variant
EP2327776A1 (en) 2009-11-30 2011-06-01 Institut National De La Recherche Agronomique Method for the production of Very Long Chain Fatty Acids (VLCFA) by fermentation with a recombinant Yarrowia sp
CA2782423C (en) 2009-12-18 2019-06-18 Cargill Incorporated Brassica plants yielding oils with a low total saturated fatty acid content
WO2011090730A1 (en) 2009-12-28 2011-07-28 Martek Biosciences Corporation Recombinant thraustochytrids that grow on xylose, and compositions, methods of making, and uses thereof
US9328335B2 (en) 2009-12-30 2016-05-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Method to produce acetyldiacylglycerols (ac-TAGs) by expression of an acetyltransferase gene isolated from Euonymus alatus (burning bush)
WO2011130576A1 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Solazyme, Inc. Oleaginous yeast food compositions
BR112012026242A2 (pt) 2010-04-14 2019-09-24 Solazyme Inc método para produção de óleo e óleo isolado de levedura oleaginosa
WO2011130578A2 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Solazyme, Inc. Lipid-rich microalgal flour food compositions
MX352746B (es) 2010-05-28 2017-12-06 Terravia Holdings Inc Aceites específicos producidos a partir de microorganismos heterótrofos recombinantes.
CA3024641A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Corbion Biotech, Inc. Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods
US8530207B2 (en) 2010-12-23 2013-09-10 Exxonmobil Research And Engineering Company Photosynthetic microorganisms comprising exogenous prokaryotic acyl-ACP thioesterases and methods for producing fatty acids
KR101964965B1 (ko) 2011-02-02 2019-04-03 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일
WO2012145626A1 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Ancora Pharmaceuticals Inc. Synthetic oligosaccharides for staphylococcus vaccine
KR20140033378A (ko) 2011-05-06 2014-03-18 솔라짐, 인코포레이티드 자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물
US9328351B2 (en) 2011-11-28 2016-05-03 Solazyme, Inc. Genetically engineered microbial strains including Prototheca lipid pathway genes
SG11201403419SA (en) 2011-12-23 2014-07-30 Solazyme Inc Algal thermoplastics, thermosets, paper, adsorbants and absorbants
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
CA2870364A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 Solazyme, Inc. Recombinant microbes with modified fatty acid synthetic pathway enzymes and uses thereof
CN105164230A (zh) 2013-03-08 2015-12-16 索拉兹米公司 产油微生物润滑剂
WO2014176515A2 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
SG10201802834YA (en) 2013-10-04 2018-05-30 Terravia Holdings Inc Tailored oils
US9394550B2 (en) 2014-03-28 2016-07-19 Terravia Holdings, Inc. Lauric ester compositions
ES2764273T3 (es) 2014-07-10 2020-06-02 Corbion Biotech Inc Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos
EP3172320B1 (en) 2014-07-24 2019-11-20 Corbion Biotech, Inc. Variant thioesterases and methods of use
CN107960101A (zh) 2015-04-06 2018-04-24 柯碧恩生物技术公司 具有lpaat消融的产油微藻
WO2017058802A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Terravia Holdings, Inc. Triglyceride oils having asymmetric triglyceride molecules

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000066750A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US20030079249A1 (en) * 2001-06-29 2003-04-24 John Shanklin Isoform of castor oleate hydroxylase
WO2008151149A2 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Solazyme, Inc. Production of oil in microorganisms
CN101765661A (zh) * 2007-06-01 2010-06-30 索拉兹米公司 在微生物中生产油
US20100151539A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-17 Solazyme, Inc. Recombinant Microalgae Cells Producing Novel Oils

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107087416A (zh) * 2014-07-24 2017-08-22 泰拉瑞亚控股公司 变体硫酯酶及使用方法
CN107624135A (zh) * 2015-04-28 2018-01-23 拜尔作物科学公司 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物
CN111436499A (zh) * 2018-12-29 2020-07-24 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 油脂组合物及其制备方法和用途
CN111436499B (zh) * 2018-12-29 2023-03-24 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 油脂组合物及其制备方法和用途
CN112576229A (zh) * 2020-12-11 2021-03-30 大庆油田有限责任公司 一种利用微生物作用地下原油产甲烷方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10100341B2 (en) 2018-10-16
US9249436B2 (en) 2016-02-02
AU2016247159A1 (en) 2016-11-10
US8633012B2 (en) 2014-01-21
BR112013019699A2 (pt) 2017-12-19
US20160186219A1 (en) 2016-06-30
US20190100780A1 (en) 2019-04-04
AU2019200668A1 (en) 2019-02-21
MX351063B (es) 2017-09-29
AU2012212079B2 (en) 2016-07-28
WO2012106560A1 (en) 2012-08-09
CA2825691A1 (en) 2012-08-09
KR101964965B1 (ko) 2019-04-03
CA2825691C (en) 2020-08-25
MX344012B (es) 2016-12-02
EP2670855A4 (en) 2015-09-30
US20130034887A1 (en) 2013-02-07
JP6071904B2 (ja) 2017-02-01
JP6513058B2 (ja) 2019-05-15
WO2012106560A9 (en) 2013-01-24
AU2016247159B2 (en) 2018-11-01
CN110066836A (zh) 2019-07-30
KR102117225B1 (ko) 2020-06-02
JP2014511140A (ja) 2014-05-12
US20120203018A1 (en) 2012-08-09
KR20140114274A (ko) 2014-09-26
EP2670855B1 (en) 2019-08-21
SG192594A1 (en) 2013-09-30
KR20190036571A (ko) 2019-04-04
AU2012212079A1 (en) 2013-08-15
US20120277452A1 (en) 2012-11-01
EP3643774A1 (en) 2020-04-29
JP2016182145A (ja) 2016-10-20
US8852885B2 (en) 2014-10-07
EP2670855A1 (en) 2013-12-11
MX2013008651A (es) 2013-09-02
JP2018099138A (ja) 2018-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6513058B2 (ja) 組み換え油産生微生物から生成される用途に応じた油
JP6150911B2 (ja) 組み換え従属栄養性微生物から産生された用途に応じた油
CN102712858B (zh) 在重组异养型微生物中制备特制油
US20170145450A1 (en) Structuring fats and methods of producing structring fats
US9567615B2 (en) Variant thioesterases and methods of use
CN104126006A (zh) 包括原藻脂质通路基因的基因工程化的微生物株系

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: American California

Applicant after: Tara Rhea holding company

Address before: American California

Applicant before: Solazyme Inc.

COR Change of bibliographic data
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180208

Address after: American California

Applicant after: Kirbyn Biotech Corp

Address before: American California

Applicant before: Tara Rhea holding company

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140528

RJ01 Rejection of invention patent application after publication