BR112016029235B1

BR112016029235B1 - Variante de polipeptídeo de fusão híbrida cyp153a-redutase, célula hospedeira recombinante, cultura de células, método de produção de um ácido graxo ômega-hidroxilado que possui um aumento na titulação e microorganismo recombinante

Info

Publication number: BR112016029235B1
Application number: BR112016029235-9A
Authority: BR
Inventors: Baolong Zhu; Andreas W. Schirmer; Cindy Chang
Original assignee: Genomatica, Inc
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2023-11-28
Also published as: US11421206B2; EP3690035A3; US11441130B2; EP3690035A2; US20230167419A1; JP2017518060A; SI3087179T1; CN114605558A; AU2021202194A1; MX2016016565A; KR20220124292A; CN106604990A; ES2803560T3; CN106604990B; US20200370024A1; KR20170066306A; US20170145390A1; EP3087179A1; CA2951925A1; MY198268A

Abstract

VARIANTE DE POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO HÍBRIDA CYP153A-REDUTASE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, CULTURA DE CÉLULAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ÁCIDO GRAXO ÔMEGA-HIDROXILADO QUE POSSUI UM AUMENTO NA TITULAÇÃO E MICROORGANISMO RECOMBINANTE. A divulgação está relacionada aos polipeptídeos de fusão relacionados à ômega-hidroxilase que resultam em produção aumentada de derivado de ácido graxo ômega-hidroxilado quando expressos em células hospedeiras recombinantes. A divulgação ainda está relacionada aos microorganismos para a expressão dos polipeptídeos de fusão relacionados à ômega- hidroxilase para a produção de derivados de ácido graxo ômega-hidroxilado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório N° 62/012.970, depositado em 16 de junho de 2014, cuja revelação integral é incorporada nesse relatório descritivo por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 16 de junho de 2015, é denominada LS00054PCT_SL.txt e tem um tamanho de 484.554 bytes.

CAMPOS

[003] A revelação está relacionada aos polipeptídeos de fusão relacionados à ômega-hidroxilase que resultam em produção aumentada de derivado de ácido graxo ômega- hidroxilado quando expressos em células hospedeiras recombinantes. A revelação ainda está relacionada aos microorganismos para a expressão dos polipeptídeos de fusão relacionados à ômega-hidroxilase para a produção de derivados de ácido graxo ômega-hidroxilado.

FUNDAMENTOS

[004] Citocromo P450 monooxigenases (P450s) são um grupo diverso de enzimas. Elas são categorizadas em famílias e subfamílias. Quando compartilham uma identidade de aminoácidos maior ou igual a quarenta por cento, elas pertencem à mesma família. Quando compartilham uma identidade de aminoácidos maior ou igual a cinquenta e cinco por cento, elas pertencem à mesma subfamília. P450s usam ácidos graxos como substratos e catalisam reações de hidroxilação. Bactérias possuem vários sistemas de P450 envolvidos na degradação de alcano e modificação de ácido graxo, e mais do que 1.000 P450s microbianas são conhecidas até hoje. Uma subfamília de P450 particular é conhecida como cyp153A, da qual a primeira foi clonada por Acinetobacter calcoaceticus em 2001. Desde então, enzimas similares foram identificadas em outras espécies que utilizam alcano como, por exemplo, Sphingomonas sp. HXN200, Mycobacterium sp. HXN1500 e Alcanivorax borkumensis (Van Bogaert e cols. (2011) FEBS Journal 278: 206-221). Várias P450s da subfamília de CYP153A bacteriana são alcano ômega- hidroxilases (w-hidroxilases, também denominadas w- oxigenases) com regiosseletividade terminal elevada. CYP153As também foram associadas à síntese de compostos alifáticos ômega-hidroxilados (w-hidroxilados) industrialmente relevantes, por exemplo, álcoois primários, ácidos graxos w-hidroxilados e derivados bifuncionais de ácido graxo como, por exemplo, ácidos a,w-dicarboxílicos e a,w-dióis (Honda Malca e cols. (2012) Chem. Commun. 48: 5.115-5.117).

SUMÁRIO

[005] A presente revelação fornece polipeptídeos de fusão relacionados à ômega-hidroxilase e variantes destes que podem produzir derivados ômega-hidroxilados e bifuncionais de ácido graxo em células hospedeiras. Mais especificamente, a presente revelação fornece variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que produzem derivados ômega-hidroxilados (w-hidroxilados) e bifuncionais de ácido graxo e composições destes, incluindo ácidos graxos w-hidroxilados, ésteres graxos w- hidroxilados, a,w-diácidos, a,w-diésteres, a,w-dióis e substâncias químicas deles derivadas como, por exemplo, macrolactonas. Também são fornecidas sequências de ácidos nucléicos e proteínas de fusão híbridas CYP153A-redutase específicas, bem como células hospedeiras recombinantes e culturas de células que englobam essas variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase criadas geneticamente. A revelação também fornece métodos de utilização das células hospedeiras que expressam a variante de polipeptídeo de fusão híbrida recombinante CYP153A- redutase a fim de produzir derivados w-hidroxilados e/ou bifuncionais de ácido graxo ou composições destes.

[006] Um aspecto da revelação fornece um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-hidroxilado (w-OH), em que o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a sequência de polipeptídeos da SEQ ID N°: 6. Ainda são incluídos métodos para a expressão do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase e variantes deste. Em um aspecto, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui pelo menos 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 6 e a expressão do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de ácidos graxos ou derivados de ácido graxo w-OH ou composições destes, quando comparada com a titulação produzida por expressão de uma CYP153A do tipo selvagem. Em um aspecto, a célula hospedeira recombinante produz um ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste com uma titulação que é pelo menos cerca de 10% maior do que a titulação de um ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste produzida por uma célula hospedeira que expressa uma CYP153A do tipo selvagem correspondente, quando cultivada em meio contendo uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em outro aspecto, o ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste é produzido extracelularmente.

[007] Outro aspecto da presente revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 6 e que possui pelo menos uma mutação em uma posição de aminoácido, incluindo a posição 796, 141, 231, 27, 82, 178, 309, 407, 415, 516 e/ou 666, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH. A variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação em qualquer uma ou mais das seguintes posições, incluindo a posição A796V, em que alanina (A) é substituída com (ou seja, trocada por) valina (V); posição V141I, em que valina é substituída com isoleucina (I); posição V141Q, em que valina (V) é substituída com glutamina (Q); posição V141G, em que valina (V) é substituída com glicina (G); posição V141M, em que valina (V) é substituída com metionina (M); posição V141L, em que valina (V) é substituída com leucina (L); posição V141T, em que valina (V) é substituída com treonina (T); posição A231T, em que alanina (A) é substituída com treonina (T); posição R27L, em que arginina (R) é substituída com lisina (L); posição R82D, em que arginina (R) é substituída com ácido aspártico (D); posição R178N, em que arginina (R) é substituída com asparagina (N); posição N309R, em que asparagina (N) é substituída com arginina (R); posição N407A, em que asparagina (N) é substituída com alanina (A); posição V415R, em que valina (V) é substituída com arginina (R); posição T516V, em que treonina (T) é substituída com valina (V); posição P666A, em que prolina (P) é substituída com alanina (A); e posição P666D, em que prolina (P) é substituída com ácido aspártico (D). Exemplos de variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase incluem a SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 e SEQ ID N°: 46. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão do tipo cyp153A-RedRhF. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste, quando comparada com a titulação de um ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase em uma célula hospedeira correspondente. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação na posição de aminoácido 796, incluindo A796V. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação na posição de aminoácido 231, incluindo A231T. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação na posição de aminoácido 141, incluindo V141I e/ou V141T. Nesse relatório descritivo, a expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com mutações A796V, V141I, V141T e/ou A231T em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um ácido graxo C12 ou C16 w-OH, respectivamente, quando comparada com uma titulação de um ácido graxo C12 ou C16 w-OH produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase.

[008] A revelação ainda contempla uma cultura de células com uma célula hospedeira recombinante que expressa uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase como descrita acima (supra). O ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste pode incluir um ou mais de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 e C20 w-OH. O ácido graxo ou derivado de ácido graxo w- OH ou composição deste pode incluir um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH saturado ou insaturado. Em outra modalidade, o ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste pode incluir um ou mais de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH insaturado Cs:i, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, Ci9:i e C20:i. Em outra modalidade, o ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste pode incluir um ácido graxo ou derivado de ácido graxo Ci2 e/ou Ci6 e/ou Ci6:i w-OH.

[009] Outro aspecto da revelação fornece um método de produção de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste que possui um aumento na titulação, incluindo o cultivo da célula hospedeira que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase (supra) com uma fonte de carbono; e a coleta de um ácido graxo w-OH ou um derivado de ácido graxo w-OH. Em um aspecto, o ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH é pelo menos cerca de 20% a 30% maior do que a titulação de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH produzido por uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase. Em outro aspecto, o ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste é produzido em uma titulação de cerca de i5 g/L até cerca de 25 g/L por uma fonte de carbono.

[0010] Outro aspecto da revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase com pelo menos cerca de 90%, 9i%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou i00% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 32 que possui uma mutação em V141I e A231T, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/θU C20:1 W-OH OU Composição deste. Outro aspecto da revelação fornece uma variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A-redutase cOm pelO menOs cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 34 que pOssui uma mutaçãO em R27L, R82D, V141M, R178N e N407A, em que a variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A- redutase catalisa a cOnversãO de um ácidO graxO em um ácidO graxO Ou derivadO de ácidO graxO C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/Ou C20:1 W-OH Ou cOmpOsiçãO deste. OutrO aspectO da revelaçãO fOrnece uma variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A-redutase cOm pelO menOs cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 36 que possui uma mutação em P666A, em que a variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A-redutase catalisa a cOnversãO de um ácidO graxO em um ácidO graxO Ou derivadO de ácidO graxO C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/Ou C20:1 W-OH Ou cOmpOsiçãO deste. OutrO aspectO da revelaçãO fOrnece uma variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A-redutase cOm pelO menOs cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 38 que pOssui uma mutaçãO em A796V, em que a variante de pOlipeptídeO de fusãO híbrida CYP153A-redutase catalisa a cOnversãO de um ácidO graxO em um ácidO graxO Ou derivadO de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, Ci9:i e/ou C20:i w-OH ou composição deste. Outro aspecto da revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 40 que possui uma mutação em A796V, P666D e T516V, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, Cl2, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH ou composição deste. Outro aspecto da revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 42 que possui uma mutação em V141I, A231T e A796V, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH ou composição deste. Outro aspecto da revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 44 que possui uma mutação em R27L, R82D, V141M, R178N, N407A e A796V, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:i w-OH ou composição deste. Outro aspecto da revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 46 que possui uma mutação em V141T, A231T e A796V, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH ou composição deste.

[0011] A revelação ainda contempla uma célula hospedeira recombinante que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase como discutida acima (supra). Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante expressa uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase como discutida acima (supra) e um polipeptídeo de tioesterase de EC 3.1.2.- ou EC 3.1.1.5 ou EC 3.1.2.14, em que a célula hospedeira recombinante produz um ácido graxo w-OH ou uma composição deste com uma titulação que é pelo menos 10% maior, pelo menos 15% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 25% maior, ou pelo menos 30% maior do que a titulação de um ácido graxo w-OH ou composição deste produzido por uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase correspondente, quando cultivada em meio contendo uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH ou composição deste pode ser produzido em uma titulação de cerca de 15 g/L até cerca de 25 g/L. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH ou composição deste é produzido extracelularmente.

[0012] Em um aspecto, a revelação engloba um microorganismo recombinante para a produção de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo w-OH in vivo quando desenvolvido em um caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono de uma matéria-prima renovável, o microorganismo possuindo uma via desenvolvida geneticamente para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo que inclui uma tioesterase de EC 3.1.2.- ou EC 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; e uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase possui pelo menos 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para qualquer um da SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22 SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 e SEQ ID N°: 46. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão CYP153A-RedRhF auto-suficiente.

[0013] Outro aspecto da presente revelação fornece uma cultura de células que inclui a célula hospedeira recombinante como discutida acima (supra), em que a cultura de células produz um ácido graxo w-OH ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo w-OH que inclui um ou mais de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C16:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C16 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C12:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C12 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C14:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C14 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C18:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C18 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C10:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C10 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C8:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C8 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C20:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C20 w-OH saturado ou composição deste. Ainda em outra modalidade, ácidos graxos w-OH saturados ou insaturados adicionais ou composições destes são produzidos pela célula hospedeira recombinante.

[0014] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de um ácido graxo w-OH que possui um aumento na titulação, incluindo o cultivo da célula hospedeira (supra) com uma fonte de carbono; e a coleta de um ácido graxo w-OH ou composição deste. O método contempla a coleta de um ácido graxo w-OH que é um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C16:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C16 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C12:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C12 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C14:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C14 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C18:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w- OH coletado é um ácido graxo C18 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo Cio:i w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo Cio w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C8:i w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C8 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C2o:i w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C2o w-OH saturado ou composição deste. Ainda em outra modalidade, ácidos graxos w-OH saturados ou insaturados adicionais ou composições destes são produzidos pelo método descrito nesse relatório descritivo.

[0015] Outro aspecto da presente revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A- redutase que possui pelo menos cerca de 9o%, 9i%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 38 e que possui pelo menos uma mutação em uma posição de aminoácido, incluindo a posição 9, io, ii, i2, i3, i4, 27, 28, 56, 6i, iii, ii9, i4o, i49, i54, i57, i62, i64, 2o4, 23i, 233, 244, 254, 27i, 273, 3o2, 3o9, 327, 4o7, 4i3, 477, 48o, 48i, 527, 544, 546, 557, 567, 59i, 648, 649, 7o3, 7o6, 7o7, 7o8, 7o9, 7io, 7i9, 72o, 736, 74i, 745, 747, 749, 757, 77o, 77i, 784, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH ou composição deste. A variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A- redutase possui uma mutação em qualquer uma ou mais das seguintes posições, incluindo a posição D9N, em que aspartato (D) é substituído com (ou seja, trocado por) asparagina (N); posição D9K, em que aspartato (D) é substituído com lisina (K); posição D10Y, em que ácido aspártico (D) é substituído com tirosina (Y); posição I11L, em que isoleucina (I) é substituída com leucina (L); posição Q12W, em que glutamina (Q) é substituída com triptofano (W); posição Q12R, em que glutamina (Q) é substituída com arginina (R); posição Q12T, em que glutamina (Q) é substituída com treonina (T); posição S13K, em que serina (S) é substituída com lisina (K); posição R14F, em que arginina (R) é substituída com fenilalanina (F); posição R27L, em que arginina (R) é substituída com leucina (L); posição Q28M, em que glutamina (Q) é substituída com metionina (M); posição Q28T, em que glutamina (Q) é substituída com treonina (T); posição P56Q, em que prolina (P) é substituída com glutamina (Q); posição N61L, em que asparagina (N) é substituída com leucina (L); posição F111A, em que fenilalanina (F) é substituída com alanina (A); posição K119R, em que lisina (K) é substituída com arginina (R); posição S140N, em que serina (S) é substituída com asparagina (N); posição P149G, em que prolina (P) é substituída com glicina (G); posição P149R, em que prolina (P) é substituída com arginina (R); posição V154G, em que valina (V) é substituída com glicina (G); posição S157R, em que serina (S) é substituída com arginina (R); posição V162C, em que valina (V) é substituída com cisteína (C); posição A164N, em que alanina (A) é substituída com asparagina (N); posição G204V, em que glicina (G) é substituída com valina (V); posição A231W, em que alanina (A) é substituída com triptofano (W); posição A231Y, em que alanina (A) é substituída com tirosina (Y); posição A231V, em que alanina (A) é substituída com valina (V); posição S233L, em que serina (S) é substituída com leucina (L); posição S233V, em que serina (S) é substituída com valina (V); posição A244R, em que alanina (A) é substituída com arginina (R); posição R254G, em que arginina (R) é substituída com glicina (G); posição E271D, em que glutamato (E) é substituído com aspartato (D); posição P273M, em que prolina (P) é substituída com metionina (M); posição T302M, em que treonina (T) é substituída com metionina (M); posição N309S, em que asparagina (N) é substituída com serina (S); posição P327D, em que prolina (P) é substituída com aspartato (D); posição N407G, em que asparagina (N) é substituída com glicina (G); posição Y413R, em que tirosina (Y) é substituída com arginina (R); posição P477G, em que prolina (P) é substituída com glicina (G); posição I480G, em que isoleucina (I) é substituída com glicina (G); posição G481I, em que glicina (G) é substituída com isoleucina (I); posição D527E, em que aspartato (D) é substituído com glutamato (E); posição D544N, em que aspartato (D) é substituído com asparagina (N); posição P546G, em que prolina (P) é substituída com glicina (G); posição E557R, em que glutamato (E) é substituído com arginina (R); posição E557W, em que glutamato (E) é substituído com triptofano (W); posição E567S, em que glutamato (E) é substituído com serina (S); posição E591Q, em que glutamato (E) é substituído com glutamina (Q); posição V648L, em que valina (V) é substituída com leucina (L); posição S649I, em que serina (S) é substituída com isoleucina (I); posição L703G, em que leucina (L) é substituída com glicina (G); posição L706E, em que leucina (L) é substituída com glutamato (E); posição L706S, em que leucina (L) é substituída com serina (S); posição L706H, em que leucina (L) é substituída com histidina (H); posição D707E, em que aspartato (D) é substituído com glutamato (E); posição P708S, em que prolina (P) é substituída com serina (S); posição D709L, em que aspartato (D) é substituído com leucina (L); posição V710C, em que valina (V) é substituída com cisteína (C); posição V710R, em que valina (V) é substituída com arginina (R); posição V710Q, em que valina (V) é substituída com glutamina (Q); posição R719W, em que arginina (R) é substituída com triptofano (W); posição D720V, em que aspartato (D) é substituído com valina (V); posição A736V, em que alanina (A) é substituída com valina (V); posição N741G, em que asparagina (N) é substituída com glicina (G); posição P745K, em que prolina (P) é substituída com lisina (K); posição P745R, em que prolina (P) é substituída com arginina (R); posição D747N, em que aspartato (D) é substituído com asparagina (N); posição E749L, em que glutamato (E) é substituído com leucina (L); posição E749M, em que glutamato (E) é substituído com metionina (M); posição E757A, em que glutamato (E) é substituído com alanina (A); posição T770G, em que treonina (T) é substituída com glicina (G); posição V771F, em que valina (V) é substituída com fenilalanina (F); e posição M784I, em que metionina (M) é substituída com isoleucina (I). Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão do tipo cyp153A-RedRhF. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um ácido graxo w-OH, quando comparada com a titulação de um ácido graxo w-OH produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase em uma célula hospedeira correspondente. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH é uma composição de ácido graxo w-OH.

[0016] Outro aspecto da presente revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 38 e que possui pelo menos uma mutação em uma posição de aminoácido, incluindo a posição 747, 12, 327, 14, 61, 28, 13, 771, 119, 10, 11, 28, 745, 9, 770, 413, 784, 749, 233, 757, e 703, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH. A variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação em qualquer uma ou mais das seguintes posições, incluindo a posição D747N, em que aspartato (D) é substituído com asparagina (N); posição Q12W, em que glutamina (Q) é substituída com triptofano (W); posição Q12R, em que glutamina (Q) é substituída com arginina (R); posição Q12T, em que glutamina (Q) é substituída com treonina (T); posição P327D, em que prolina (P) é substituída com aspartato (D); posição R14F, em que arginina (R) é substituída com fenilalanina (F); posição N61L, em que asparagina (N) é substituída com leucina (L); posição Q28M, em que glutamina (Q) é substituída com metionina (M); posição S13K, em que serina (S) é substituída com lisina (K); posição V771F, em que valina (V) é substituída com fenilalanina (F); posição K119R, em que lisina (K) é substituída com arginina (R); posição D10Y, em que ácido aspártico (D) é substituído com tirosina (Y); posição I11L, em que isoleucina (I) é substituída com leucina (L); posição Q28T, em que glutamina (Q) é substituída com treonina (T); posição P745R, em que prolina (P) é substituída com arginina (R); posição D9N, em que aspartato (D) é substituído com asparagina (N); posição D9K, em que aspartato (D) é substituído com lisina (K); posição T770G, em que treonina (T) é substituída com glicina (G); posição Y413R, em que tirosina (Y) é substituída com arginina (R); posição M784I, em que metionina (M) é substituída com isoleucina (I); posição E749L, em que glutamato (E) é substituído com leucina (L); posição S233L, em que serina (S) é substituída com leucina (L); posição E757A, em que glutamato (E) é substituído com alanina (A); e posição L703G, em que leucina (L) é substituída com glicina (G). Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão do tipo cyp153A- RedRhF. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um ácido graxo w-OH, quando comparada com a titulação de um ácido graxo w-OH produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira correspondente. Em outra modalidade, as variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase (e sequências de polinucleotídeos correspondentes) incluem os IDS. DE SEQ. Nos: 47-96. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH é uma composição de ácido graxo w-OH.

[0017] Em um aspecto, a revelação engloba um microorganismo recombinante ou célula hospedeira recombinante para a produção de um ácido graxo w-OH ou derivado de ácido graxo w-OH in vivo quando desenvolvido em um caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono de uma matéria-prima renovável, o microorganismo possuindo uma via desenvolvida geneticamente para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo que inclui uma tioesterase de EC 3.1.2.- ou EC 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; e uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui pelo menos 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para qualquer um da SEQ ID N° : 48, SEQ ID N°: 50, SEQ ID N°: 52, SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56 SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 92, SEQ ID N°: 94 e SEQ ID N°: 96. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão CYP153A-RedRhF auto-suficiente.

[0018] Outro aspecto da presente revelação fornece uma cultura de células que inclui a célula hospedeira recombinante como discutida acima (supra), em que a cultura de células produz um ácido graxo w-OH ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo w-OH que inclui um ou mais de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C16:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C16 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C12:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C12 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C14:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C14 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C18:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C18 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C10:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C10 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C8:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C8 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C20:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, a cultura de células produz um ácido graxo C20 w-OH saturado ou composição deste. Ainda em outra modalidade, ácidos graxos w-OH saturados ou insaturados adicionais ou composições destes são produzidos pela célula hospedeira recombinante.

[0019] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de um ácido graxo w-OH que possui um aumento na titulação, incluindo o cultivo da célula hospedeira (supra) com uma fonte de carbono; e a coleta de um ácido graxo w-OH ou composição deste. Em particular, o método engloba a produção de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C16:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C16 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C12:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C12 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C14:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C14 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C18:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w- OH coletado é ácido graxo C18 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C10:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C10 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C8:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C8 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C20:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C20 w-OH saturado ou composição deste. Em uma modalidade, o ácido graxo w-OH coletado é um ácido graxo C22:1 w-OH insaturado ou composição deste. Em outra modalidade, o ácido graxo w- OH coletado é um ácido graxo C22 w-OH saturado ou composição deste.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A presente revelação é mais bem compreendida quando lida em conjunto com as figuras que a acompanham, que servem para ilustrar algumas modalidades preferidas. Subentende-se, no entanto, que a revelação não está limitada às modalidades específicas reveladas nas figuras.

[0021] A Figura 1 é uma visão geral esquemática de uma via biossintética exemplar para a produção de derivados de ácido graxo w-hidroxilado como, por exemplo, ácidos graxos C12 w-hidroxilados (w-OH C12 FFA) e/ou ácidos graxos C16:1 w-hidroxilados (w-OH C16:1, FFA) como resultado da expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase e de um polipeptídeo de tioesterase em um microorganismo recombinante. FAB se refere à biossíntese de ácido graxo no microorganismo; fatB1 se refere a uma acil- ACP tioesterase de cadeia média de Umbellularia californica (baía da Califórnia); e fatA3 se refere a uma acil-ACP tioesterase de cadeia longa de Arabidopsis thaliana.

[0022] A Figura 2 fornece um exemplo da produção de ácidos graxos w-hidroxilados como resultado da expressão de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase. A fim de ilustrar a produção de ácidos graxos w- hidroxilados (w-OH) por meio de variantes, uma mutagênese por saturação de sítios foi empregada. O gráfico descrito exibe os melhores hits de uma mutagênese por saturação de sítios das posições de aminoácidos 141 e 309 de cyp153A (G307A, A796V)-Red450RhF. A figura se refere às espécies totais de ácidos graxos (FAS total) (veja barra cinza escuro); para ácido w-hidróxi hexadecenóico (w-OH C16:1) (veja barra cinza claro); e percentual de ácidos graxos w- hidróxi (% de w-OH FFA) (veja a seta).

DESCRIÇÃO DETALHADA Visão geral

[0023] Uma forma de eliminar nossa dependência de substâncias petroquímicas é produzir derivados de ácido graxo como, por exemplo, derivados de ácido graxo w-OH, por meio de microorganismos ecologicamente corretos que servem como hospedeiros de produção em miniatura. Esses hospedeiros celulares (ou seja, células ou microorganismos hospedeiros recombinantes) são desenvolvidos geneticamente para produzir derivados de ácido graxo w-OH e derivados bifuncionais de ácido graxo a partir de fontes renováveis como, por exemplo, matéria-prima renovável (por exemplo, carboidratos fermentáveis, biomassa, celulose, glicerol, CO, CO2 etc.). Esses derivados de ácido graxo w-OH são as matérias-primas para produtos industriais que incluem produtos de química fina, polímeros e fragrâncias.

[0024] A presente revelação está relacionada aos polipeptídeos de fusão relacionados à w-hidroxilase, incluindo polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase e variantes destes que resultam em uma titulação, rendimento e/ou produtividade elevados de composições de derivado de ácido graxo w-OH quando expressos em células hospedeiras recombinantes. Nesse relatório descritivo, a biossíntese aumentada de derivado de ácido graxo w-OH é obtida por transformação de células hospedeiras de modo que elas expressem um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou variante deste, que catalisa a reação de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH como, por exemplo, um ácido graxo ou derivado de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH. A revelação engloba as células hospedeiras recombinantes ou cepas de produção que expressam os polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase e variantes destes. Em um aspecto, a revelação está relacionada à subfamília de P450 cyp153A.

Definições

[0025] Como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto determine claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, referência a “uma célula hospedeira” inclui duas ou mais dessas células hospedeiras, referência a “um éster graxo” inclui um ou mais ésteres graxos, ou misturas de ésteres, referência a “uma sequência de ácidos nucléicos” inclui uma ou mais sequências de ácidos nucléicos, referência e “uma enzima” inclui uma ou mais enzimas, e semelhantes.

[0026] O termo “número de classificação de enzima (EC)” se refere a um número que significa uma atividade enzimática específica. Os números de EC classificam enzimas de acordo com a reação que catalisam sob um sistema de nomenclatura de enzimas. Os números de EC especificam reações catalisadas por enzimas. Por exemplo, se enzimas diferentes de organismos diferentes catalisam a mesma reação, então elas possuem o mesmo número de EC. Além disso, enovelamentos de proteínas diferentes podem catalisar uma reação idêntica e, portanto, receberiam um número de EC idêntico (por exemplo, enzimas isofuncionais não homólogas, ou NISE). Os números de EC são estabelecidos pelo comitê de nomenclatura da “International Union of Biochemistry and Molecular Biology” (IUBMB), cuja descrição está disponível no website de nomenclatura de enzimas da IUBMB na Internet. Por exemplo, a atividade enzimática de citocromo P450 monooxigenase (P450), incluindo a atividade enzimática de w-hidroxilase ou de u-oxigenase, é classificada sob EC 1.14.15.3. A funcionalidade de enzimas englobadas pela família de enzimas P450 é conservada na maioria dos procariotas de uma espécie para a seguinte. Dessa forma, uma espécie microbiana diferente pode efetuar a mesma atividade enzimática que é classificada sob EC 1.14.15.3. Um exemplo de uma atividade enzimática que é caracterizada por EC 1.14.15.3 é a atividade enzimática de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou variante deste, como discutido nesse relatório descritivo (supra).

[0027] Os termos “ácido graxo ômega-hidroxilado” ou “ácido graxo w-hidroxilado” ou “ácido graxo w-hidróxi” ou “ácido graxo w-hidroxil” ou “ácido graxo w-OH” ou “ácido graxo wOH” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo e se referem a um ácido graxo que se origina do metabolismo de ácido graxo e possui pelo menos um grupo OH na posição ômega (w). Exemplos desses ácidos graxos w-hidroxilados são ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1. Em uma modalidade, esses ácidos graxos w-hidroxilados são ácidos graxos C8:0 w-OH, ácidos graxos C10:0 w-OH, ácidos graxos C12:0 w-OH, ácidos graxos C14:0 w-OH, ácidos graxos C16:0 w-OH, ácidos graxos C18:0 w-OH, ácidos graxos C20:0 w-OH, ácidos graxos C8:1 w-OH, ácidos graxos C10:1 w-OH, ácidos graxos C12:1 w-OH, ácidos graxos C14:1 w-OH, ácidos graxos C16:1 w-OH, ácidos graxos C18:1 w-OH, ácidos graxos C20:1 w-OH, e semelhantes. Em um microorganismo, o ácido graxo w- hidroxilado pode ser usado para produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilado como, por exemplo, ésteres graxos w- hidroxilados, bem como derivados bifuncionais de ácido graxo, incluindo a,w-diácidos, a,w-diésteres e a,w-dióis. Naquele sentido, os termos “derivado de ácido graxo ômega- hidroxilado” e “derivado de ácido graxo w-hidroxilado” e “derivado de ácido graxo w-hidróxi” e “derivado de ácido graxo w-hidroxil” e “derivado α,w-bifuncional de ácido graxo” e “derivado de ácido graxo w-OH” se referem a uma entidade química que se originou do metabolismo de ácido graxo e que possui pelo menos um grupo OH na posição ômega ou é derivada de um intermediário que possui pelo menos um grupo OH na posição ômega. Nesse relatório descritivo, a “posição ômega (w) ” se refere ao átomo de carbono terminal de um derivado de ácido graxo na extremidade oposta em relação a seu grupo funcional primário. Esses derivados de ácido graxo w-hidroxilado incluem, sem limitação, α,w- diácidos; a,w-diésteres; a,w-dióis e substâncias químicas derivadas destes (por exemplo, macrolactonas).

[0028] Uma “composição de ácido graxo w- hidroxilado” ou “composição de ácido graxo w-OH”, como citada nesse relatório descritivo, é produzida por uma célula hospedeira recombinante e tipicamente inclui uma mistura de certos tipos de ácidos graxos w-hidroxilados com vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação. Similarmente, uma “composição de derivado de ácido graxo w-hidroxilado” é produzida por uma célula hospedeira recombinante e tipicamente compreende uma mistura de certos tipos de derivados de ácido graxo w-hidroxilado com vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação (por exemplo, ácidos graxos w- hidroxilados com vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação; ésteres graxos w-hidroxilados com vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação; α,w- diácidos de vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação; α,w- diésteres de vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação; a,w-dióis de vários comprimentos de cadeia e/ou características de saturação e/ou de ramificação; e semelhantes). Em alguns casos, a composição de derivado de ácido graxo w-OH inclui principalmente um tipo de derivado de ácido graxo w-OH como, por exemplo, 1,12-dodecenodiol ou 1,14- tetradecanodiol ou éster metílico de ácido 16-hidróxi hexadecanóico ou ácido 16-hidróxi hexadecenóico ou ácido 15-hidróxi pentadecanóico, ou ácido 15-hidróxi pentadecenóico, ou ácido 18-hidróxi octadecenóico, ou os ésteres metílicos de qualquer um desses derivados de ácido graxo, ou outros. Ainda em outros casos, a composição de derivado de ácido graxo w-OH compreende uma mistura de um tipo de derivado de ácido graxo w-OH a fim de fornecer uma composição especificamente projetada (por exemplo, cerca de 20% de ácido 12-hidróxi dodecanóico e cerca de 80% de ácido 1,14-14-hidróxi tetradecanóico na mesma composição forneceriam um exemplo desse tipo).

[0029] O termo “número de acesso” ou “número de acesso em NCBI” ou “número de acesso em GenBank” se refere a um número que significa uma sequência de ácidos nucléicos específica. Números de acesso de sequência que são discutidos nessa descrição foram obtidos de bases de dados fornecidas pelo NCBI (“National Center for Biotechnology Information”) mantidas pelos “National Institutes of Health”, E.U.A., e pelo “UniProt Knowledgebase” (UniProtKB) e bases de dados Swiss-Prot fornecidas pelo “Swiss Institute of Bioinformatics” (também denominado número de acesso em UniProtKB).

[0030] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “nucleotídeo” se refere a uma unidade monomérica de um polinucleotídeo que consiste em uma base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. As bases de ocorrência natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) e uracil (U)) são tipicamente derivados de purina ou pirimidina, embora deva ser subentendido que análogos de bases de ocorrência natural e não natural também estão incluídos. O açúcar de ocorrência natural é a pentose (açúcar de cinco carbonos) desoxirribose (que forma o DNA) ou ribose (que forma o RNA), embora deva ser subentendido que análogos de açúcares de ocorrência natural e não natural também estão incluídos. Ácidos nucléicos são tipicamente ligados por meio de ligações fosfato para formar ácidos nucléicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações sejam conhecidas na técnica (por exemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, e semelhantes).

[0031] O termo “polinucleotídeo” se refere a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA), que podem ser de fita simples ou de fita dupla e que podem conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos “polinucleotídeo”, “sequência de ácidos nucléicos” e “sequência de nucleotídeos” são usados nesse relatório descritivo de forma intercambiável para se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, RNA ou DNA. Esses termos se referem à estrutura primária da molécula e, dessa forma, incluem DNA de fita dupla e de fita simples, e RNA de fita dupla e de fita simples. Os termos incluem, como equivalentes, análogos de RNA ou DNA feitos de análogos de nucleotídeo e polinucleotídeos modificados como, por exemplo, sem limitação, polinucleotídeos metilados e/ou cobertos. O polinucleotídeo pode estar em qualquer forma incluindo, sem limitação, plasmídeo, viral, cromossômico, EST, cDNA, mRNA e rRNA.

[0032] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo “polipeptídeo recombinante” se refere a um polipeptídeo que é produzido por técnicas recombinantes, em que geralmente DNA ou RNA que codifica a proteína expressa é inserido em um vetor de expressão adequado que, por sua vez, é usado para transformar uma célula hospedeira para produzir o polipeptídeo. Similarmente, os termos “polinucleotídeo recombinante” ou “ácido nucléico recombinante” ou “DNA recombinante” são produzidos por metodologias recombinantes que são conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0033] O termo “homólogo” se refere a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 50 por cento (%) idêntica ao polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeos correspondente. De preferência, polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos possuem sequências de polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de homologia para a sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos correspondente. Como usados nesse relatório descritivo, os termos “homologia” de sequência e “identidade” de sequência são usados de forma intercambiável. Aqueles versados na técnica conhecem de métodos para determinar a homologia entre duas ou mais sequências. Resumidamente, cálculos de “homologia” entre duas sequências podem ser realizados da seguinte forma. As sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma primeira sequência que é alinhada para fins de comparação é pelo menos cerca de 30%, preferivelmente pelo menos cerca de 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou cerca de 100% do comprimento de uma segunda sequência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes da primeira e segunda sequências são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A homologia percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna que precisa ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da homologia percentual entre duas sequências podem ser obtidas usando um algoritmo matemático como, por exemplo, BLAST (Altschul e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215 (3): 403410). A homologia percentual entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch que foi incorporado no programa GAP na suíte de programas GCG, usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453). A homologia percentual entre duas sequências de nucleotídeos também pode ser determinada usando o programa GAP na suíte de programas GCG, usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Aqueles versados na técnica podem realizar cálculos iniciais de homologia e ajustar os parâmetros do algoritmo de acordo. Um conjunto preferido de parâmetros (e aquele que deve ser usado se o professional não tem certeza sobre quais parâmetros devem ser aplicados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de homologia das reivindicações) é uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4, e uma penalidade de lacuna frameshift de 5. Métodos adicionais de alinhamento de sequências são conhecidos na técnica de biotecnologia (veja, por exemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6: 278; Altschul e cols. (2005) FEBS J. 272 (20): 5.101-5.109).

[0034] O termo “hibridiza sob condições de rigor baixo, rigor médio, rigor elevado ou rigor muito elevado” descreve condições para hibridização e lavagem. Diretrizes para a realização de reações de hibridização podem ser encontradas em “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Métodos aquosos e não aquosos são descritos naquela referência e qualquer um dos métodos pode ser usado. As condições de hibridização específicas aqui citadas são as seguintes: (1) condições de hibridização de rigor baixo - 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por duas lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% pelo menos a 50°C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada até 55°C para condições de rigor baixo); (2) condições de hibridização de rigor médio - 6X SSC a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 60°C; (3) condições de hibridização de rigor elevado - 6X SSC a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 65°C; e (4) condições de hibridização de rigor muito elevado - 0,5 M de fosfato de sódio, SDS 7% a 65°C, seguida por uma ou mais lavagens a 0,2X SSC, SDS 1% a 65°C. Condições de rigor muito elevado (4) são as condições preferidas, a menos que especificado de forma diferente.

[0035] Um polipeptídeo “endógeno” se refere a um polipeptídeo codificado pelo genoma da célula microbiana parental (ou célula hospedeira) da qual a célula recombinante é geneticamente modificada (ou “derivada”). Um polipeptídeo “exógeno” se refere a um polipeptídeo que não é codificado pelo genoma da célula microbiana parental. Um polipeptídeo variante ou mutante é um exemplo de um polipeptídeo exógeno. Dessa forma, uma molécula de ácido nucléico de ocorrência não natural é considerada como sendo exógena para uma célula uma vez introduzida na célula. Uma molécula de ácido nucléico que é de ocorrência natural também pode ser exógena para uma célula particular. Por exemplo, toda uma sequência codificadora isolada da célula X é um ácido nucléico exógeno com relação à célula Y após aquela sequência codificadora ser introduzida na célula Y, mesmo se X e Y são o mesmo tipo de célula.

[0036] O termo “superexpresso” significa que um gene é forçado a ser transcrito em uma taxa elevada comparada com a taxa de transcrição endógena para aquele gene. Em alguns exemplos, a superexpressão adicionalmente inclui uma taxa elevada de tradução do gene comparada com a taxa de tradução endógena para aquele gene. Métodos para testar a superexpressão são bem conhecidos na técnica; por exemplo, os níveis de RNA transcritos podem ser avaliados com o uso de rtPCR, e os níveis de proteína podem ser avaliados usando análise em gel de SDS.

[0037] O termo “heterólogo” significa derivado de um organismo diferente, tipo de célula diferente ou espécie diferente. Como usado nesse relatório descritivo, ele se refere a uma sequência de nucleotídeos, polinucleotídeo, polipeptídeos ou proteína, não presente naturalmente em certo organismo. Por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos que é nativa para cianobactérias pode ser introduzida em uma célula hospedeira de E. coli por métodos recombinantes, e o polinucleotídeo de cianobactérias é então heterólogo para a célula de E. coli (por exemplo, célula recombinante). O termo “heterólogo” também pode ser usado com referência a uma sequência de nucleotídeos, polipeptídeos ou proteína que está presente em uma célula hospedeira recombinante em um estado não nativo. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos, polinucleotídeos, polipeptídeos ou proteína “heteróloga” pode ser modificada em relação à sequência do tipo selvagem naturalmente presente na célula hospedeira do tipo selvagem correspondente, por exemplo, uma modificação no nível de expressão ou na sequência de um nucleotídeo, polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína.

[0038] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fragmento” de um polipeptídeo se refere a uma porção mais curta de um polipeptídeo ou proteína de comprimento total que varia em tamanho de dois resíduos de aminoácidos até toda a sequência de aminoácidos menos um resíduo de aminoácido. Em certas modalidades da revelação, um fragmento se refere a toda a sequência de aminoácidos de um domínio de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um domínio de ligação de substrato ou um domínio catalítico).

[0039] O termo “mutagênese” se refere a um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada de forma estável. A mutagênese de uma sequência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína produz uma proteína mutante. Mutagênese também se refere às alterações em sequências de ácidos nucléicos não codificadoras que resultam em atividade modificada da proteína.

[0040] O termo “mutação”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma alteração permanente em uma posição de ácido nucléico de um gene ou em uma posição de aminoácido de um polipeptídeo ou proteína. Mutações incluem substituições, adições, inserções e deleções. Por exemplo, uma mutação em uma posição de aminoácido pode ser uma substituição de um tipo de aminoácido com outro tipo de aminoácido (por exemplo, uma serina (S) pode ser substituída com uma alanina (A); uma lisina (L) pode ser substituída com um T (Treonina); etc.). Dessa forma, um polipeptídeo ou uma proteína pode ter uma ou mais mutações, em que um aminoácido é substituído com outro aminoácido.

[0041] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “gene” se refere às sequências de ácidos nucléicos que codificam um produto de RNA ou um produto de proteína, além de sequências de ácidos nucléicos ligadas operacionalmente que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, essas sequências incluem, sem limitação, sequências promotoras ou intensificadoras) ou sequências de ácidos nucléicos ligadas operacionalmente que codificam sequências que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, essas sequências incluem, sem limitação, sítios de ligação de ribossomo ou sequências de controle da tradução).

[0042] Sequências de controle da expressão são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores da transcrição, sítios internos de entrada de ribossomos (IRES), e semelhantes, que permitem a expressão da sequência de polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Sequências de controle da expressão interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição (Maniatis e cols. (1987) Science 236: 1.2371.245). Sequências de controle da expressão exemplares são descritas, por exemplo, em Goeddel, “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology”, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Nos métodos da revelação, uma sequência de controle da expressão está ligada operacionalmente a uma sequência de polinucleotídeos. O termo “ligada operacionalmente” significa que uma sequência de polinucleotídeos e uma sequência de controle da expressão estão conectadas de modo a permitir a expressão do gene quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras da transcrição) estão ligadas à sequência de controle da expressão. Promotores ligados operacionalmente estão localizados acima da sequência de polinucleotídeos selecionada em termos da direção de transcrição e tradução. Intensificadores ligados operacionalmente podem estar localizados acima, dentro ou abaixo do polinucleotídeo selecionado.

[0043] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico, ou seja, uma sequência de polinucleotídeos, ao qual foi ligada. Um tipo de vetor útil é um epissomo (ou seja, um ácido nucléico capaz de replicação extracromossômica). Vetores úteis são aqueles capazes de replicação autônoma e/ou expressão de ácidos nucléicos aos quais estão ligados. Vetores capazes de dirigir a expressão de genes ao qual estão ligados operacionalmente são denominados nesse relatório descritivo “vetores de expressão”. Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de “plasmídeos”, que geralmente se referem às alças de DNA de fita dupla circulares que, em sua forma de vetor, não estão ligadas ao cromossomo. Outros vetores de expressão úteis são fornecidos em forma linear. Também estão incluídas essas outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que se tornaram conhecidas na técnica subsequentemente a esse pedido. Em algumas modalidades, um vetor recombinante ainda inclui um promotor ligado operacionalmente à sequência de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor regulado pelo desenvolvimento, um promotor organela-específico, um promotor tecido-específico, um promotor indutível, um promotor constitutivo ou um promotor célula-específico. O vetor recombinante tipicamente compreende pelo menos uma sequência selecionada de uma sequência de controle da expressão acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; um marcador de seleção acoplado operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; uma sequência marcadora operacionalmente acoplada à sequência de polinucleotídeos; uma porção de purificação acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; uma sequência de secreção acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; e uma sequência de direcionamento acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos é incorporada estavelmente no DNA genômico da célula hospedeira, e a expressão da sequência de nucleotídeos está sob o controle de uma região promotora regulada. Os vetores de expressão como usados nesse relatório descritivo incluem uma sequência de polinucleotídeos particular como aqui descrita em uma forma adequada à expressão da sequência de polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Será observado por aqueles versados na técnica que o design do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de polipeptídeo desejado etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos como descritas nesse relatório descritivo. A expressão de genes que codificam polipeptídeos em procariotas, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores que contêm promotores constitutivos ou indutíveis que dirigem a expressão de polipeptídeos de fusão ou não fusão. Vetores de fusão adicionam diversos aminoácidos a um polipeptídeo nele codificado, normalmente ao terminal amino ou carbóxi do polipeptídeo recombinante. Esses vetores de fusão tipicamente servem a uma ou mais das três finalidades seguintes, incluindo aumentar a expressão do polipeptídeo recombinante; aumentar a solubilidade do polipeptídeo recombinante; e auxiliar na purificação do polipeptídeo recombinante por atuação como um ligante na purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e do polipeptídeo recombinante. Isso permite a separação do polipeptídeo recombinante da porção de fusão após purificação do polipeptídeo de fusão. Em certas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos da revelação está ligada operacionalmente a um promotor derivado de bacteriófago T5.

[0044] Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura S. cerevisiae incluem pYepSec1 (Baldari e cols. (1987) EMBO J. 6: 229-234); pMFa (Kurjan e cols. (1982) Cell 30:933- 943); pJRY88 (Schultz e cols. (1987) Gene 54: 113-123); pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) e picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de inseto, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf9) incluem, por exemplo, a série pAc (Smith e cols. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2.156-2.165) e a série pVL (Lucklow e cols. (1989) Virology 170: 31-39). Ainda em outra modalidade, as sequências de polinucleotídeos descritas nesse relatório descritivo podem ser expressas em células de mamíferos usando um vetor de expressão de mamífero. Outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto para células eucarióticas são bem conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Sambrook e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

[0045] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “CoA” ou “acil-CoA” se refere a um acil tioéster formado entre o carbono de carbonil da cadeia alquil e o grupo sulfidrila da porção 4’-fosfopantetionil de coenzima A (CoA), que possui a fórmula R-C(O)S-CoA, em que R é qualquer grupo alquil que possui pelo menos 4 átomos de carbono.

[0046] O termo “ACP” significa proteína carreadora de acil. ACP é um carreador altamente conservado de intermediários acil durante a biossíntese de ácido graxo, no qual a cadeia em crescimento está ligada durante a síntese como um tiol éster no tiol distal de uma porção 4’- fosfopanteteína. A proteína existe em duas formas, ou seja, apo-ACP (inativa na biossíntese de ácido graxo) e ACP ou holo-ACP (ativa na biossíntese de ácido graxo). Os termos “ACP” e “holo-ACP” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo e se referem à forma ativa da proteína. Uma enzima denominada uma fosfopanteteiniltransferase está envolvida na conversão da apo-ACP inativa na holo-ACP ativa. Mais especificamente, ACP é expressa na forma de apo-ACP inativa e uma porção 4’- fosfopanteteína deve ser anexada pós-tradução a um resíduo conservado de serina na ACP pela ação da proteína carreadora de holo-acil sintase (ACPS), uma fosfopanteteiniltransferase, a fim de produzir holo-ACP.

[0047] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “acil-ACP” se refere a um acil tioéster formado entre o carbono de carbonil de uma cadeia alquil e o grupo sulfidrila da porção fosfopanteteinil de uma proteína carreadora de acil (ACP). Em algumas modalidades, uma ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs totalmente saturadas. Em outras modalidades, uma ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs insaturadas. Em algumas modalidades, a cadeia de carbono terá cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 carbonos.

[0048] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “derivado de ácido graxo” significa um “ácido graxo” ou um “derivado de ácido graxo”, que pode ser denominado um “ácido graxo ou derivado deste”. O termo “ácido graxo” significa um ácido carboxílico que possui a fórmula RCOOH. R representa um grupo alifático, preferivelmente um grupo alquil. R pode incluir entre cerca de 4 e cerca de 22 átomos de carbono. Ácidos graxos podem ser saturados, monoinsaturados ou poliinsaturados. Um “derivado de ácido graxo” é um produto feito em parte pela via biossintética de ácido graxo do organismo de produção hospedeiro (por exemplo, célula hospedeira recombinante ou microorganismo). “Derivados de ácido graxo” incluem produtos feitos em parte a partir de derivados ACP, acil-ACP ou acil-ACP. Derivados de ácido graxo exemplares incluem, por exemplo, acil-CoA, ácidos graxos, aldeídos graxos, álcoois de cadeia curta e longa, álcoois graxos, hidrocarbonetos, ésteres (por exemplo, ceras, ésteres de ácido graxo ou ésteres graxos), olefinas terminais, olefinas internas, cetonas, além de ácidos graxos w-OH e derivados de ácido graxo w-OH destes, incluindo a,w-diácidos, e outros compostos bifuncionais.

[0049] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “via biossintética de ácido graxo” significa uma via biossintética que produz ácidos graxos e derivados destes. A via biossintética de ácido graxo pode incluir enzimas adicionais para produzir derivados de ácidos graxos que possuem características desejadas.

[0050] O grupo R de um ácido graxo pode ter uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada. Cadeias ramificadas podem ter mais do que um ponto de ramificação e podem incluir ramificações cíclicas. Em algumas modalidades, o ácido graxo ramificado é um ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, ou C26 ramificado. Em outras modalidades, o ácido graxo ramificado é um ácido graxo C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 C18, ou C20 ramificado. Em certas modalidades, o grupo hidroxil (OH) do ácido graxo ramificado está na posição ômega (w) . Em certas modalidades, o ácido graxo ramificado é um ácido iso-graxo ou um ácido anteiso-graxo. Em modalidades exemplares, o ácido graxo ramificado é selecionado de ácido graxo iso-C7:0-, iso-C8:0-, iso-C9:0-, iso-C10:0-, iso-C11:0-, iso-C12:0-, iso-C13:0-, iso-C14:0-, iso- C15:0-, iso-C16:0-, iso-C17:0-, iso- C18:0-, iso-C19:0-, iso-C20:0, anteiso-C7:0-, anteiso-C9:0-, anteiso-C11:0-, anteiso-C13:0-, anteiso-C15:0-, anteiso-C17:0- e anteiso-C19:0 ramificado.

[0051] O grupo R de um ácido graxo pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, o grupo R pode ter um ou mais do que um ponto de insaturação. Em algumas modalidades, o ácido graxo insaturado é um ácido graxo monoinsaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é um ácido graxo C8:1-, C9:1-, C10:1-, C11:1-, C12:1-, C13:1-, C14:1-, C15:1-, C16:1-, C17:1-, C18:1-, C19:1-, C20:1-, C21:1-, C22:1-, C23:1-, C24:1-, C25:1- ou C26:1 insaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é C8:1, C10:1, C12:1, C14:1, C16:1, C18:1 ou C20:1. Ainda em outras modalidades, o ácido graxo insaturado é insaturado na posição ômega-7. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado possui uma cis ligação dupla.

[0052] Como usada nesse relatório descritivo, uma “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira modificada geneticamente” é uma célula hospedeira, por exemplo, um microorganismo, que foi modificado de modo a produzir ácidos graxos w-hidroxilados e derivados de ácido graxo w-hidroxilado, incluindo derivados bifuncionais de ácido graxo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recombinante inclui um ou mais polinucleotídeos, cada polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou variante deste que possui atividade enzimática biossintética de w-hidroxilase, em que a célula hospedeira recombinante produz um ácido graxo w- hidroxilado e/ou derivado de ácido graxo w-hidroxilado ou composição deste quando cultivada na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar os polinucleotídeos.

[0053] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “clone” tipicamente se refere a uma célula ou grupo de células descentes e basicamente geneticamente idênticas a um ancestral comum único, por exemplo, as bactérias de uma colônia bacteriana clonada que surgiu de uma única célula bacteriana.

[0054] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “cultura” tipicamente se refere aos meios líquidos que compreendem células viáveis. Em uma modalidade, uma cultura compreende células que se reproduzem em meios de cultura predeterminados sob condições controladas, por exemplo, uma cultura de células hospedeiras recombinantes desenvolvidas em meios líquidos que compreendem uma fonte de carbono selecionada e/ou nitrogênio.

[0055] O termo “cultivo” ou “cultivação” se refere ao crescimento de uma população de células (por exemplo, células microbianas) sob condições adequadas em um meio líquido ou sólido. Em modalidades particulares, o cultivo se refere à bioconversão fermentativa de um substrato em um produto final. Os meios de cultivo são bem conhecidos e os componentes individuais desses meios de cultura estão disponíveis por fontes comerciais, por exemplo, sob os meios DIFCO e meios BBL. Em um exemplo não limitante, o meio nutriente aquoso é um “meio rico” que compreende fontes complexas de nitrogênio, sais e carbono, por exemplo, meio YP, que compreende 10 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura de um meio desse tipo. Além disso, a célula hospedeira pode ser modificada geneticamente para assimilar carbono e usar eficientemente materiais celulósicos como fontes de carbono de acordo com métodos descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.000.000, 5.028.539, 5.424.202, 5.482.846, 5.602.030 e WO 2010127318. Além disso, a célula hospedeira pode ser modificada geneticamente para expressar uma invertase de modo que sacarose possa ser usada como uma fonte de carbono.

[0056] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sob condições eficazes para expressar as referidas sequências de nucleotídeos heterólogas” significa quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira produza um derivado de ácido graxo desejado (por exemplo, ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH). Condições adequadas incluem, por exemplo, condições de fermentação.

[0057] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “modificada” ou um “nível alterado de” atividade de uma proteína, por exemplo, uma enzima, em uma célula hospedeira recombinante, se refere a uma diferença em uma ou mais características nas atividades determinadas em relação à célula hospedeira parente ou nativa. Tipicamente, diferenças na atividade são determinadas entre uma célula hospedeira recombinante, que possui atividade modificada, e a célula hospedeira do tipo selvagem correspondente (por exemplo, comparação de uma cultura de uma célula hospedeira recombinante em relação à célula hospedeira do tipo selvagem). Atividades modificadas podem ser o resultado de, por exemplo, quantidades modificadas de proteínas expressas por uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, como resultado de número aumentado ou diminuído de cópias de sequências de DNA que codificam a proteína, número aumentado ou diminuído de transcritos de mRNA que codificam a proteína e/ou quantidades aumentadas ou diminuídas de tradução de proteína da proteína por mRNA); alterações na estrutura da proteína (por exemplo, alterações à estrutura primária, por exemplo, alterações à sequência codificadora da proteína que resultam em alterações na especificidade de substrato, alterações nos parâmetros cinéticos observados); e alterações na estabilidade da proteína (por exemplo, degradação aumentada ou diminuída da proteína). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um mutante ou uma variante de qualquer um dos polipeptídeos descritos nesse relatório descritivo. Em certos casos, a sequência codificadora para os polipeptídeos como descritos nesse relatório descritivo é códon-otimizada para expressão em uma célula hospedeira em particular. Por exemplo, para expressão em E. coli, um ou mais códons podem ser otimizados (Grosjean e cols. (1982) Gene 18: 199-209).

[0058] O termo “sequências reguladoras”, como usado nesse relatório descritivo, tipicamente se refere a uma sequência de bases em DNA, ligada operacionalmente às sequências de DNA que codificam uma proteína que, em última análise, controla a expressão da proteína. Exemplos de sequências reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras de RNA, sequências de ligação de fator de transcrição, sequências de terminação da transcrição, moduladores de transcrição (por exemplo, elementos intensificadores), sequências de nucleotídeos que afetam a estabilidade do RNA, e sequências reguladoras da tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo (por exemplo, sequências de Shine-Dalgarno em procariotas ou sequências de Kozak em eucariotas), códons de iniciação, códons de terminação).

[0059] Como usada nesse relatório descritivo, a frase “a expressão da referida sequência de nucleotídeos é modificada em relação à sequência de nucleotídeos do tipo selvagem”, significa um aumento ou uma diminuição no nível de expressão e/ou atividade de uma sequência de nucleotídeos endógena ou da expressão e/ou atividade de uma sequência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo heteróloga ou não nativa.

[0060] Como usada nesse relatório descritivo, a frase “a atividade de uma variante da sequência de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é modificada em relação à atividade de uma sequência de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase (ou seja, um modelo de polipeptídeo) significa um aumento ou uma diminuição no nível de atividade de uma sequência de polipeptídeos variante expressa, em comparação com um modelo de sequência de polipeptídeos expresso. O modelo de polipeptídeo é codificado por um modelo de ácido nucléico (ou seja, uma sequência de modelo de DNA). Um exemplo de um modelo de sequência de polipeptídeos é uma sequência da proteína de fusão híbrida cyp153A-RedRhF, em que uma cyp153A está fundida com um domínio de redutase. Outro exemplo de um modelo de sequência de polipeptídeos é a SEQ ID N°: 6. Outro exemplo de um modelo de sequência de polipeptídeos é a SEQ ID N°: 38. Qualquer sequência de polipeptídeos pode servir como um modelo, incluindo variantes.

[0061] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “expressar”, com relação a um polinucleotídeo, significa fazer com que ele funcione. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo (ou proteína) será, quando expresso, transcrito e traduzido para produzir aquele polipeptídeo (ou proteína). Como usado nesse relatório descritivo, o termo “superexpressar” significa expressar (ou fazer com que expresse) um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma célula em uma concentração maior do que é normalmente expresso em uma célula do tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições. Em outra modalidade, o termo “superexpressar” significa expressar (ou fazer com que expresse) um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma célula em uma concentração maior do que ele é normalmente expresso em uma célula correspondente que expressa o polinucleotídeo modelo ou sequência de polipeptídeos modelo sob as mesmas condições. Um exemplo de uma sequência de polipeptídeos modelo é o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-RedRhF.

[0062] Os termos “nível alterado de expressão” e “nível modificado de expressão” são usados de forma intercambiável e significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo ou derivado de ácido graxo está presente em uma concentração diferente em uma célula hospedeira modificada geneticamente, quando comparada com sua concentração em uma célula do tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições.

[0063] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “titulação” se refere à quantidade de ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH produzida por unidade de volume de cultura da célula hospedeira. Em qualquer aspecto das composições e dos métodos descritos nesse relatório descritivo, um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH é produzido em uma titulação de cerca de 25 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 225 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 275 mg/L, cerca de 300 mg/L, cerca de 325 mg/L, cerca de 350 mg/L, cerca de 375 mg/L, cerca de 400 mg/L, cerca de 425 mg/L, cerca de 450 mg/L, cerca de 475 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 525 mg/L, cerca de 550 mg/L, cerca de 575 mg/L, cerca de 600 mg/L, cerca de 625 mg/L, cerca de 650 mg/L, cerca de 675 mg/L, cerca de 700 mg/L, cerca de 725 mg/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 775 mg/L, cerca de 800 mg/L, cerca de 825 mg/L, cerca de 850 mg/L, cerca de 875 mg/L, cerca de 900 mg/L, cerca de 925 mg/L, cerca de 950 mg/L, cerca de 975 mg/L, cerca de 1.0 00 mg/L, cerca de 1. 050 mg/L, cerca de 1.075 mg/L, cerca de 1.100 mg/L, cerca de 1. 125 mg/L, cerca de 1.150 mg/L, cerca de 1.175 mg/L, cerca de 1.200 mg/L, cerca de 1.225 mg/L, cerca de 1.250 mg/L, cerca de 1.275 mg/L, cerca de 1.300 mg/L, cerca de 1.325 mg/L, cerca de 1.350 mg/L, cerca de 1.375 mg/L, cerca de 1.400 mg/L, cerca de 1.425 mg/L, cerca de 1.450 mg/L, cerca de 1.475 mg/L, cerca de 1.500 mg/L, cerca de 1.525 mg/L, cerca de 1.550 mg/L, cerca de 1.575 mg/L, cerca de 1.600 mg/L, cerca de 1.625 mg/L, cerca de 1.650 mg/L, cerca de 1.675 mg/L, cerca de 1.700 mg/L, cerca de 1.725 mg/L, cerca de 1.750 mg/L, cerca de 1.775 mg/L, cerca de 1.800 mg/L, cerca de 1.825 mg/L, cerca de 1.850 mg/L, cerca de 1.875 mg/L, cerca de 1.900 mg/L, cerca de 1.925 mg/L, cerca de 1.950 mg/L, cerca de 1.975 mg/L, cerca de 2.000 mg/L (2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores citados anteriormente. Em outras modalidades, um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH é produzido em uma titulação de mais do que 100 g/L, mais do que 200 g/L, mais do que 300 g/L, ou maior, por exemplo, 500 g/L, 700 g/L, 1.000 g/L, 1.200 g/L, 1.500 g/L ou 2.000 g/L. Em uma modalidade, a titulação de um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação é de 5 g/L até 200 g/L, 10 g/L até 150 g/L, 20 g/L até 120 g/L, 25 g/L até 1 10 g/L e 30 g/L até 100 g/L.

[0064] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “rendimento dos ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH produzidos por uma célula hospedeira” se refere à eficiência pela qual uma fonte de carbono inserida é convertida em produto (ou seja, ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH) em uma célula hospedeira. Células hospedeiras modificadas geneticamente para produzir ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH de acordo com os métodos da revelação possuem um rendimento de pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20 %, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, ou pelo menos 30% ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores citados anteriormente. Em outras modalidades, um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH é produzido em um rendimento de mais do que 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Alternativamente, ou em adição, o rendimento é cerca de 30% ou menos, cerca de 27% ou menos, cerca de 25% ou menos, ou cerca de 22% ou menos. Dessa forma, o rendimento pode ser limitado por quaisquer dois dos pontos finais acima. Por exemplo, o rendimento de um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação pode ser 5% a 15%, 10% a 25%, 10% a 22%, 15% a 27%, 18% a 22%, 20% a 28%, 20% a 30%, 25% a 40%, ou maior. Um exemplo de um rendimento preferido de um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação é de 10% a 30%. Outro exemplo de um rendimento preferido de um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação é de 10% a 40%. Outro exemplo de um rendimento preferido de um ácido graxo w-OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação é de 10% a 50%.

[0065] Como usado aqui, o termo “produtividade” se refere à quantidade de ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH produzida por unidade de volume de cultura da célula hospedeira por unidade de tempo. Em qualquer aspecto das composições e dos métodos descritos nesse relatório descritivo, a produtividade de um ácido graxo w- OH e/ou derivado de ácido graxo w-OH produzido por uma célula hospedeira recombinante é pelo menos 100 mg/L/hora, pelo menos 200 mg/L/hora, pelo menos 300 mg/L/hora, pelo menos 400 mg/L/hora, pelo menos 500 mg/L/hora, pelo menos 600 mg/L/hora, pelo menos 700 mg/L/hora, pelo menos 800 mg/L/hora, pelo menos 900 mg/L/hora, pelo menos 1.000 mg/L/hora, pelo menos 1.100 mg/L/hora, pelo menos 1.200 mg/L/hora, pelo menos 1.300 mg/L/hora, pelo menos 1.400 mg/L/hora, pelo menos 1.500 mg/L/hora, pelo menos 1.600 mg/L/hora, pelo menos 1.700 mg/L/hora, pelo menos 1.800 mg/L/hora, pelo menos 1.900 mg/L/hora, pelo menos 2.000 mg/L/hora, pelo menos 2.100 mg/L/hora, pelo menos 2.200 mg/L/hora, pelo menos 2.300 mg/L/hora, pelo menos 2.400 mg/L/hora, ou pelo menos 2.500 mg/L/hora. Além disso, a produtividade pode ser 2.500 mg/L/hora ou menos, 2.000 mg/L/OD600 ou menos, 1.500 mg/L/OD600 ou menos, 120 mg/L/hora, ou menos, 1.000 mg/L/hora ou menos, 800 mg/L/hora, ou menos, ou 600 mg/L/hora ou menos. Dessa forma, a produtividade pode se r limitada por quaisquer dois dos pontos finais acima . Por exemplo, a produtividade pode ser 3 a 30 mg/L/hora, 6 a 20 mg/L/hora, ou 15 a 30 mg/L/hora. A produtividade preferida de um ácido graxo w-OH e/ou w-OH derivado de ácido graxo produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da revelação é selecionada de 500 mg/L/hora até 2.500 mg/L/hora, ou de 700 mg/L/hora até 2.000 mg/L/hora.

[0066] Os termos “espécie graxa total (FAS)” e “produto de ácido graxo total” podem ser usados nesse relatório descritivo de forma intercambiável com referência à quantidade total de ácidos graxos w-OH e ácidos graxos presente em uma amostra como avaliada por GC-FID, como descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2008/119082.

[0067] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “taxa de utilização de glicose” significa a quantidade de glicose usada pela cultura por unidade de tempo, registrada como gramas/Litro/hora (g/L/h).

[0068] O termo “fonte de carbono de uma matéria- prima renovável”, quando usado isoladamente ou em referência a uma fonte de alimentação, inclui qualquer material biológico (incluindo matérias-primas renováveis e/ou biomassa e/ou refugos) do qual carbono é derivado, exceto oleoquímicos (ou seja, óleos refinados de plantas e animais como, por exemplo, ácidos graxos, ésteres de ácido graxo, TAGs, ácidos hidróxi graxos, e semelhantes) e substâncias petroquímicas (ou seja, substâncias químicas derivadas de petróleo como, por exemplo, alcanos, alcenos, e semelhantes). Dessa forma, o termo “fonte de carbono de uma matéria-prima renovável”, como usado nesse relatório descritivo, exclui carbono derivado de oleoquímicos e substâncias petroquímicas. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui açúcares ou carboidratos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos). Em algumas modalidades, a fonte de carbono é glicose e/ou sacarose. Em outras modalidades, a fonte de carbono é derivada de uma matéria-prima renovável como, por exemplo, carboidratos de milho, cana de açúcar ou biomassa lignocelulósica; ou refugos como, por exemplo, glicerol, flu-gas, gás de síntese; ou a reformação de materiais orgânicos como, por exemplo, biomassa ou gás natural; ou é dióxido de carbono que é fixado fotossinteticamente. Em outras modalidades, uma biomassa é processada em uma fonte de carbono, que é adequada para bioconversão. Ainda em outras modalidades, a biomassa não necessita de processamento adicional em uma fonte de carbono, mas pode ser usada diretamente como fonte de carbono. Uma fonte dessa biomassa exemplar é matéria de planta ou vegetação, por exemplo, capim-elefante. Outra fonte de carbono exemplar inclui resíduos metabólicos, por exemplo, matéria animal (por exemplo, esterco de vaca). Fontes de carbono exemplares adicionais incluem algas e outras plantas marinhas. Outra fonte de carbono (incluindo biomassa) inclui refugos de indústria, agricultura, silvicultura e domésticos, incluindo, sem limitação, resíduos de fermentação, biomassa de fermentação, glicerol/glicerina, forragem, palha, tábuas, esgoto, lixo, resíduo sólido de manípulo, resíduo urbano celulósico e restos de alimentos.

[0069] Como usado aqui, o termo “isolado”, com relação a produtos como, por exemplo, ácidos graxos w-OH e derivados destes, se refere aos produtos que são separados de componentes celulares, meios de cultura de células ou precursores químicos ou sintéticos. Os ácidos graxos e derivados destes (por exemplo, ácido graxo w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH) produzidos pelos métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, bem como no citoplasma. Portanto, os ácidos graxos e derivados destes podem ser coletados em uma fase orgânica intracelularmente ou extracelularmente.

[0070] Como usados aqui, os termos “purificar”, “purificado” ou “purificação” significam a remoção ou isolamento de uma molécula de seu ambiente, por exemplo, por isolamento ou separação. Moléculas “substancialmente purificadas” são pelo menos cerca de 60% livres (por exemplo, pelo menos cerca de 70% livres, pelo menos cerca de 75% livres, pelo menos cerca de 85% livres, pelo menos cerca de 90% livres, pelo menos cerca de 95% livres, pelo menos cerca de 97% livres, pelo menos cerca de 99% livres) de outros componentes com os quais estão associadas. Como usados nesse relatório descritivo, esses termos também se referem à remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, a remoção de contaminantes pode resultar em um aumento na percentagem de derivados de ácido graxo como, por exemplo, ácido graxo w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH, em uma amostra. Por exemplo, quando um derivado de ácido graxo é produzido em uma célula hospedeira recombinante, o derivado de ácido graxo pode ser purificado pela remoção de proteínas da célula hospedeira ou outros materiais da célula hospedeira. Após a purificação, a percentagem de derivado de ácido graxo na amostra é aumentada. Os termos “purificar”, “purificado” e “purificação” são termos relativos que não necessitam de pureza absoluta. Dessa forma, por exemplo, quando um derivado de ácido graxo é produzido em células hospedeiras recombinantes, um derivado de ácido graxo purificado é um derivado de ácido graxo que está substancialmente separado de outros componentes celulares (por exemplo, ácidos nucléicos, polipeptídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros hidrocarbonetos).

Produção de ácido graxo e derivado de ácido graxo ômega-hidroxilado

[0071] A revelação fornece a produção de ácidos graxos w-OH e derivados de ácido graxo w-OH em uma célula hospedeira. A produção de ácido graxo w-OH pode ser aumentada como resultado da expressão de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. As variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase produzem os derivados e composições de ácido graxo w-OH em uma titulação elevada. Nesse relatório descritivo, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase está envolvida em uma via biossintética para a produção de derivados de ácido graxo w-OH; ela pode ser usada isoladamente ou em combinação com outras enzimas. Por exemplo, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase pode ser usada em uma via biossintética modificada geneticamente na qual uma enzima tioesterase (ou seja, expressa naturalmente ou de forma heteróloga) converte uma acil-ACP em um ácido graxo. A variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase pode então converter o ácido graxo em um ácido graxo w-OH (veja a Figura 1). Enzimas adicionais na via podem converter ácidos graxos w-OH em outros derivados bifuncionais de ácido graxo como, por exemplo, a,w-diácidos.

[0072] Mais especificamente, um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma sequência de polipeptídeos que possui pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 6 e serve como uma sequência-modelo para introduzir mutações a fim de criar variantes com atividade enzimática aumentada para a produção de ácidos graxos e derivados de ácido graxo w-OH. O polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase é auto-suficiente e possui atividade enzimática de w-hidroxilase que catalisa a reação de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH. Um exemplo de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é um polipeptídeo de fusão híbrida do tipo cyp153A-RedRhF. Em uma modalidade, o termo “variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase” se refere a um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase modificado que possui pelo menos uma mutação em sua sequência de aminoácidos incluindo, sem limitação, uma mutação nas posições de aminoácido 796, 141, 231, 27, 82, 178, 309, 407, 415, 516 e 666 ou uma combinação destas. A expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em células hospedeiras recombinantes resulta em titulação, rendimento e/ou produtividade aumentados de ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH ou composições destes, quando comparada com a expressão do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira correspondente.

[0073] Um exemplo de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é a SEQ ID N° : 38, que possui uma mutação na posição 796, em que uma alanina é substituída com uma valina. Essa variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma sequência de polipeptídeos que possui pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 38 e ainda serve como uma sequência-modelo para criar mutações adicionais ou variantes adicionais. Similarmente, essa variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase é auto-suficiente e possui atividade enzimática de w-hidroxilase que catalisa a reação de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH. Em uma modalidade, o termo “variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase” se refere a um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase modificado que possui pelo menos uma mutação adicional em sua sequência de aminoácidos incluindo, sem limitação, uma mutação nas posições de aminoácido 747, 12, 327, 14, 61, 28, 13, 771, 119, 10, 11, 28, 745, 9, 770, 413, 784, 749, 231, 233, 757 e 703, ou uma combinação destas. A expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase em células hospedeiras recombinantes resulta em titulação, rendimento e/ou produtividade aumentados de ácidos graxos w-OH e/ou derivados de ácido graxo w-OH, quando comparada com a expressão do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase (SEQ ID N°: 6) em uma célula hospedeira correspondente.

[0074] Quando uma célula foi transformada com uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, ela é uma célula que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase (por exemplo, a célula recombinante). Em uma modalidade, a titulação e/ou rendimento de um ácido graxo w-OH produzido por uma célula que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é pelo menos duas vezes aquele de uma célula correspondente que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em um hospedeiro como, por exemplo, Escherichia coli, ácidos graxos w-OH podem ser convertidos em derivados bifuncionais de ácido graxo por enzimas expressas naturalmente ou de forma heteróloga. Em outra modalidade, a titulação e/ou o rendimento de um ácido graxo w-OH ou derivado deste produzido por uma célula que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é pelo menos cerca de 1 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes maior do que aquele de uma célula correspondente que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em uma modalidade, a titulação e/ou o rendimento de um ácido graxo w-OH ou derivado deste produzido por uma célula que expressa a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é pelo menos cerca de 1 por cento, pelo menos cerca de 2 por cento, pelo menos cerca de 3 por cento, pelo menos cerca de 4 por cento, pelo menos cerca de 5 por cento, pelo menos cerca de 6 por cento, pelo menos cerca de 7 por cento, pelo menos cerca de 8 por cento, pelo menos cerca de 9 por cento, ou pelo menos cerca de 10 por cento maior do que aquele de uma célula correspondente que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em outra modalidade, a titulação e/ou o rendimento de um ácido graxo w-OH ou derivado deste produzido em uma célula recombinante em função da expressão de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase é pelo menos cerca de 20 por cento até pelo menos cerca de 80 por cento maior do que aquele de uma célula correspondente que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em algumas modalidades, a titulação e/ou o rendimento de um ácido graxo w-OH produzido por uma célula é pelo menos cerca de 20 por cento, pelo menos cerca de 25 por cento, pelo menos cerca de 30 por cento, pelo menos cerca de 35 por cento, pelo menos cerca de 40 por cento, pelo menos cerca de 45 por cento, pelo menos cerca de 50 por cento, pelo menos cerca de 55 por cento, pelo menos cerca de 60 por cento, pelo menos cerca de 65 por cento, pelo menos cerca de 70 por cento, pelo menos cerca de 75 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento, pelo menos cerca de 85 por cento, pelo menos cerca de 90 por cento, pelo menos cerca de 95 por cento, pelo menos cerca de 97 por cento, pelo menos cerca de 98 por cento, ou pelo menos cerca de 100 por cento maior do que aquele da célula correspondente que expressa o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase.

[0075] Dessa forma, a revelação fornece células hospedeiras recombinantes, que foram modificadas geneticamente para expressar uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para produzir ácidos graxos w-OH ou derivados destes. A biossíntese de ácidos graxos w-OH é aumentada em relação às células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, ou seja, células hospedeiras que expressam a polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com base no SEQ ID N°: 6 (ou seja, polipeptídeo-modelo) ou outros polipeptídeos com a mesma função enzimática. Diversas células hospedeiras diferentes podem ser modificadas para expressar uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, tais como aquelas descritas nesse relatório descritivo, resultando em células hospedeiras recombinantes adequadas à produção aumentada de ácido graxo w-OH e derivados de ácido graxo w-OH ou composições destes. Exemplos de ácidos graxos w-OH que são produzidos são ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1. Em uma modalidade, esses ácidos graxos w-OH são ácidos graxos C8:0 w-OH, ácidos graxos C10:0 w-OH, ácidos graxos C12:0 w-OH, ácidos graxos C14:0 w-OH, ácidos graxos C16:0 w-OH, ácidos graxos C18:0 w-OH, ácidos graxos C20:0 w-OH, ácidos graxos C8:1 w-OH, ácidos graxos C10:1 w-OH, ácidos graxos C12:1 w-OH, ácidos graxos C14:1 w-OH, ácidos graxos C16:1 w-OH, ácidos graxos C18:1 w-OH, ácidos graxos C20:1 w-OH, e semelhantes. Subentende-se que diversas células podem fornecer fontes de material genético, incluindo sequências de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos adequados para uso em uma célula hospedeira recombinante como descrita nesse relatório descritivo.

Modificação genética da via e atividades enzimáticas

[0076] A síntese de ácido graxo é um dos sistemas mais conservados do maquinário biossintético bacteriano. O complexo de multienzimas de ácido graxo sintase (FAS) está presente em todas as bactérias e eucariotas. A maioria dos genes relacionados ao FAS é indispensável para o crescimento e a sobrevida das células. FAS eucariótico e bacteriano dirigem basicamente o mesmo tipo de transformação bioquímica. Em eucariotas, FAS é denominado FAS I e a maior parte de seus domínios catalíticos são codificadas por uma cadeia polipeptídica (ao dissociável). Em procariotas como, por exemplo, bactérias, FAS é denominado FASII e suas enzimas e proteínas carreadoras individuais são codificadas por genes separados que codificam proteínas distintas (dissociáveis). Dessa forma, FASII é um sistema complexo com variações significantes e peculiaridades distintas.

[0077] A proteína carreadora de acil (ACP), juntamente com as enzimas em uma via de FAS, controlam o comprimento, grau de saturação e ramificação dos ácidos graxos produzidos em um organismo nativo. As etapas nessa via são catalisadas por enzimas da biossíntese de ácido graxo (FAB) e das famílias de genes de acetil-CoA carboxilase (ACC). Por exemplo, enzimas que podem ser incluídas em uma via de FAS incluem AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB e FabF. Dependendo do produto desejado, um ou mais desses genes podem ser atenuados ou superexpressados. Dessa forma, procariotas foram modificados geneticamente para aumentar a produção de derivados de ácido graxo a partir de matéria- prima renovável como, por exemplo, glicose ou outras fontes de carbono. Nesse relatório descritivo, o objetivo principal é aumentar a atividade de enzimas de controle cruciais que regulam a produção de derivados de ácido graxo a fim de converter a cepa bacteriana em uma fábrica microbiana para a produção de derivados de ácido graxo, incluindo ésteres metílicos de ácido graxo (FAMEs), ésteres etílicos de ácido graxo (FAEEs), e álcoois graxos (FALC) (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 8.283.143, incorporada por referência nesse relatório descritivo).

[0078] A presente revelação identifica polinucleotídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase que codificam polipeptídeos de função enzimática a fim de modificar vias enzimáticas para a produção de compostos desejados como, por exemplo, ácidos graxos w-OH e derivados de ácido graxo w-OH. Esses polipeptídeos, que são identificados nesse relatório descritivo por Números de Acesso de Enzima (Números de EC), são úteis para a modificação genética de vias de ácido graxo que levam à produção de ácidos graxos w-OH e outras moléculas bifuncionais como, por exemplo, derivados de ácido graxo w- OH como a,w-diácidos (veja Figura 1).

[0079] Em uma modalidade, são reveladas vias na Figura 1 que usam uma fonte de carbono derivada de uma matéria-prima renovável como, por exemplo, glicose, para produzir derivados de ácido graxo w-OH. Um carboidrato (por exemplo, glicose) é convertido em um acil-tioéster como, por exemplo, uma acil-ACP, pelo organismo nativo (veja a etapa 1 na Figura 1). Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos com atividade enzimática de degradação de ácido graxo podem ser opcionalmente atenuados, dependendo do produto desejado (veja os Exemplos, infra). Exemplos não limitantes desses polipeptídeos são acil-CoA sintetase (FadD) e acil-CoA desidrogenase (FadE). A Tabela 1 fornece uma lista abrangente de atividade enzimática (infra) dentro da via metabólica, incluindo várias enzimas de degradação de ácido graxo que podem ser opcionalmente atenuadas de acordo com métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 8.283.143, supra) .

[0080] Por exemplo, FadR (veja a Tabela 1, infra) é um fator regulador crucial envolvido na degradação de ácido graxo e vias biossintéticas de ácido graxo (Cronan e cols., Mol. Microbiol., 29 (4): 937-943 (1998)). A enzima de E. coli FadD (veja a Tabela 1, infra) e a proteína de transporte de ácido graxo FadL são componentes de um sistema de captação de ácido graxo. FadL medeia o transporte de ácidos graxos para dentro da célula bacteriana, e FadD medeia a formação de acil-CoA ésteres. Quando nenhuma outra fonte de carbono está disponível, ácidos graxos exógenos são recolhidos por bactérias e convertidos em acil-CoA ésteres, que podem se ligar ao fator de transcrição FadR e deprimir a expressão dos genes fad que codificam proteínas responsáveis pelo transporte de ácido graxo (FadL), ativação (FadD) e e-oxidação (FadA, FadB e FadE). Quando fontes de carbono alternativas estão disponíveis, as bactérias sintetizam ácidos graxos como acil-ACPs, que são usados para síntese de fosfolipídeo, mas não são substratos para β-oxidação. Dessa forma, acil-CoA e acil-ACP são, ambas, fontes de ácidos graxos independentes que podem resultar em produtos finais diferentes (Caviglia e cols., J. Biol. Chem., 279 (12): 1.163-1.169 (2004)). Tabela 1: Atividades enzimáticas.

[0081] A Figura 1 mostra uma via exemplar na qual um acil tioéster como, por exemplo, uma acil-ACP, pode ser convertido em um ácido graxo C12 ou C16:1 (FFA) como um precursor intermediário. Na etapa 1 da Figura 1, uma tioesterase é empregada para converter uma acil-ACP em um FFA. Em certas modalidades, o gene que codifica uma tioesterase é tesA, ‘tesA, tesB, fatB1, fatB2, fatB3, fatA1 ou fatA (veja também a Tabela 1 que mostra polipeptídeos que possuem a atividade enzimática de uma tioesterase que podem ser usados para catalisar essa etapa, supra). Na etapa 2, um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou variante deste é usado para gerar ácidos graxos w-OH (FFAs w-OH) a partir de ácidos graxos. Outras moléculas bifuncionais podem ser produzidas abaixo nessa via, por exemplo, a,w-diácidos ou outros derivados de ácido graxo w- OH, dependendo das funcionalidades enzimáticas que estão presentes nessa via.

Polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-Redutase

[0082] w-Hidroxilases (ou w-oxigenases) incluem certas oxigenases di-ferro não heme (por exemplo, alkB de GPo1 de Pseudomonas putida) e certas oxigenases P450 do tipo heme (por exemplo, w-hidroxilases como, por exemplo, cyp153A de Marinobacter aquaeolei). P450s são enzimas distribuídas universalmente, que possuem alta complexidade e exibem um campo de atividade amplo. Elas são proteínas codificadas por uma superfamília de genes que convertem uma ampla variedade de substratos e catalisam diversas reações químicas. Cyp153A é uma subfamília de citocromo P450s bacterianas solúveis que hidroxilam cadeias hidrocarboneto com alta seletividade pela posição w (van Beilen e cols. (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72: 59-65). Membros da família de cyp153A demonstraram in vitro que hidroxilam seletivamente a posição w de alcanos, ácidos graxos ou álcoois graxos, por exemplo, cyp153A6 de Mycobacterium sp. HXN-1500 (Funhoff e cols. (2006) J. Bacteriol. 188: 5.220-5.227), cyp153A16 de Mycobacterium marinum e cyp153A de Polaromonas sp. JS666 (Scheps e cols. (2011) Org. Biomol. Chem. 9: 6.727-6.733), bem como cyp153A de Marinobacter aquaeoli (Honda-Malca e cols. (2012) Chem. Commun. 48: 5.115-5.117). As Tabelas 2A e 2B abaixo mostram exemplos de enzimas e parceiros redox que possuem atividade enzimática de w-hidroxilase que podem ser usados para produzir ácidos graxos w-OH e derivados de ácido graxo w-OH. Tabela 2A: Exemplos de atividade enzimática de Q- hidroxilase (P450) (EC 1.14.15.3). Tabela 2B: Exemplos de parceiros redox para atividade enzimática de w-hidroxilase (P450) (EC 1.14.15.3).

[0083] Como ocorre com todas as citocromo P450s, Cyp153A w-hidroxilases necessitam de elétrons para sua atividade catalítica, que são fornecidos por meio de proteínas redox específicas como, por exemplo, ferredoxina e ferredoxina redutase. Essas são proteínas distintas que interagem com cyp153A. Uma cyp153A oxigenase híbrida (quimérica) auto-suficiente (ou seja, uma oxigenase que não necessita de proteínas ferredoxina e ferredoxina redutase distintas para atividade) foi criada previamente por fusão de cyp153A de Alcanivorax borkumensis SK2 (Kubota e cols. (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69: 2.421-2.430; Fujita e cols. (2009) Biosci. Biotechnol. Biochem. 73: 1.8251.830) com o domínio de redutase de P450RhF, que inclui mononucleotídeo de flavina (FMN) e sítios de ligação de NADPH e um centro de ferredoxina [2FeS] (Hunter e cols. (2005) FEBS Lett. 579: 2.215-2.220). P450RhF pertence ao PFOR P450-fundido classe-I (DeMot e Parret (2003) Trends Microbiol. 10: 502). Essa proteína de fusão híbrida cyp153A-RedRhF demonstrou biotransformações in vitro que hidroxilam octano na posição w e que também hidroxilam outros compostos como, por exemplo, ciclohexano ou butilbenzeno. Outras cyp153A oxigenases híbridas auto- suficientes (quiméricas) foram criadas por fusão de cyp153A de Marinobacter aquaeolei com os domínios de redutase de P450RhF e P450-BM3 (Scheps e cols. (2013) Microb. Biotechnol. 6: 694-707). Exemplos de proteínas de fusão P450-redutase naturais são mostrados nas Tabelas 2C e 2D abaixo. Tabela 2C: Exemplos de proteínas de fusão auto-suficientes a-1, a-2, w-3-hidroxilase (EC 1.14.14.1). Tabela 2D: Exemplos de proteínas de fusão auto-suficientes PFOR P450-fundido Classe-I.

[0084] Considerando sua alta seletividade em direção à posição w de cadeias hidrocarboneto, a família de cyp153A oxigenases pareceu fornecer bons exemplos de candidatos adequados para produzir derivados α,w- bifuncionais de ácido graxo a partir de uma fonte de carbono renovável. Isso permitiria o desenvolvimento de processos comercialmente factíveis para produzir esses compostos valiosos. No entanto, como ocorre com outras citocromo P450s, a família de proteínas cyp153A tem sido até agora aplicada principalmente a experimentos in vitro com enzimas purificadas ou lisados de células brutos ou em biotransformações de células em repouso às quais os derivados de ácido graxo ou hidrocarbonetos são adicionados exogenamente (Kubota e cols., Fujita e cols., Honda-Malca e cols., Scheps e cols., supra). No entanto, os procedimentos in vitro ou biotransformações de células em repouso com o emprego de fusão híbrida não conduzem à produção em larga escala e custo-efetivos de derivados de ácido graxo a- hidróxi. O conhecimento amplamente aceito na técnica é que muitas citocromo P450s, bem como a-hidroxilases do tipo alkB, não são fáceis de se expressar funcionalmente em microorganismos recombinantes, pois as enzimas são frequentemente inativas e sua química tem sido difícil de elucidar. Na verdade, o único trabalho in vivo que utiliza uma fonte de carbono renovável diferente de derivados de ácido graxo que foi até hoje tentada empregava a- hidroxilase alkB e obteve titulação apenas baixa de derivados de ácido graxo a-hidróxi em uma fermentação em alta densidade de células (WO 2013/024114A2).

[0085] A presente revelação fornece variantes de proteína de fusão híbrida CYP153A-redutase que são capazes de produzir eficientemente derivados de ácido graxo a- hidróxi in vivo a partir de uma fonte de carbono renovável. Mais especificamente, um gene de Marinobacter aquaeoli que codifica uma proteína de fusão híbrida do domínio catalítico de P450 CYP153A (G307A), em que uma alanina (A) substituiu uma glicina (G) na posição 307, foi fundida com um gene que codifica o domínio de redutase contendo FMN e Fe/S do terminal C de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB 9784. O polipeptídeo resultante é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-RedRhF (SEQ ID N°: 6) com uma sequência de ácidos nucléicos correspondente (SEQ ID N°: 5). Quando essa proteína de fusão híbrida CYP153A-redutase foi expressa em células de E. coli com uma fonte de carbono simples como, por exemplo, glicose, derivados de ácido graxo foram eficientemente convertidos em derivados de ácido graxo a- hidróxi (veja o Exemplo 1). Outros exemplos para a- hidroxilases adequadas (EC 1.14.15.3) e seus parceiros redox que podem ser usados para gerar polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase similares estão listados nas Tabelas 2A e 2B (supra).

Variantes de polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A- redutase

[0086] A presente revelação identifica variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que resultam em titulação, rendimento e/ou produtividade elevados de composições de derivado de ácido graxo w-hidroxilado quando expressas em células hospedeiras. Em exemplos não limitantes da presente revelação (veja os Exemplos 1-7, infra), o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A(G307A)- RedRhF (supra) foi usado como um modelo para modificar geneticamente de forma eficiente variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para produzir quantidades aumentadas de ácidos graxos w-OH e derivados de ácido graxo w-OH. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase desse tipo pode converter eficientemente compostos como, por exemplo, ácido dodecanóico em ácido 12-hidróxi dodecanóico in vivo a partir de uma fonte de carbono simples como, por exemplo, glicose. Qualquer fonte de carbono simples, por exemplo, como derivada de uma matéria-prima renovável, é adequada. Foi demonstrado que variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase criadas geneticamente (ou seja, ilustradas por meio de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-RedRhF modificada geneticamente) podem converter eficientemente ácidos graxos in vivo em compostos desejados específicos, incluindo ácidos graxos w- OH, quando co-expressas com uma tioesterase em uma célula hospedeira como, por exemplo, E. coli, por utilização de uma fonte de carbono como, por exemplo, glicose de uma matéria-prima renovável (veja os Exemplos, infra). Com o uso da presente revelação, outras variantes de polipeptídeo de fusão híbrida podem ser modificadas geneticamente por ligação de um gene mutado como, por exemplo, um gene que codifica uma proteína CYP153A, a um gene mutado que codifica um domínio de redutase do terminal C (veja as Tabelas 2A a 2D, supra). São aqui englobadas variações, por exemplo, mutação de ambos os genes (o P5450 e domínio de redutase) ou mutação de um gene (o P450 ou domínio de redutase). Seguindo essas instruções, variantes similares de proteína de fusão podem ser criadas a partir de outros tipos de M-hidroxilases.

[0087] Dessa forma, a presente revelação está relacionada às variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que resultam em titulação, rendimento e/ou produtividade elevados de composições de derivado de ácido graxo M-hidroxilado quando expressas em células hospedeiras. As variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possuem uma ou mais mutações no domínio de CYP153A ou domínio de redutase ou ambos. Em uma modalidade, a presente revelação fornece uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 6 e que possui uma ou mais mutações em uma posição de aminoácido, incluindo a posição 27, 82, 141, 178, 231, 309, 407, 415, 516, 666 e/ou 796, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um ácido graxo w-OH. Mais especificamente, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma ou mais das mutações seguintes, incluindo R27L, em que arginina (R) é substituída com lisina (L); posição R82D, em que arginina (R) é substituída com ácido aspártico (D); posição V141I, em que valina é substituída com isoleucina (I); posição V141Q, em que valina (V) é substituída com glutamina (Q); posição V141G, em que valina (V) é substituída com glicina (G); posição V141M, em que valina (V) é substituída com metionina (M); posição V141L, em que valina (V) é substituída com leucina (L); posição V141T, em que valina (V) é substituída com treonina (T); posição R178N, em que arginina (R) é substituída com asparagina (N); posição A231T, em que alanina (A) é substituída com treonina (T); posição N309R, em que asparagina (N) é substituída com arginina (R); posição N407A, em que asparagina (N) é substituída com alanina (A); posição V415R, em que valina (V) é substituída com arginina (R); posição T516V, em que treonina (T) é substituída com valina (V); posição P666A, em que prolina (P) é substituída com alanina (A); posição P666D, em que prolina (P) é substituída com ácido aspártico (D); e posição A796V, em que alanina (A) é substituída com valina (V). Exemplos de variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase incluem a SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 e SEQ ID N°: 46. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante híbrida de proteína de fusão do tipo cyp153A- RedRhF. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um derivado de ácido graxo w-OH ou composição deste, quando comparada com a titulação de um ácido graxo w-OH ou composição deste produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira correspondente. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui uma mutação na posição de aminoácido 141, incluindo V141I e/ou V141T. Nesse relatório descritivo, a expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com mutações V141I ou V141T em uma célula hospedeira recombinante resulta em uma titulação maior de um ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, respectivamente, quando comparada com uma titulação de um ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações V141I e A231T (SEQ ID N°: 32) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações R27L, R82D, V141M, R178N e N407A (SEQ ID N°: 34) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, Ci9:i e/ou C20:i w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui a mutação P666A (SEQ ID N°: 36) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui a mutação A796V (SEQ ID N°: 38) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações A796V, P666D e T516V (SEQ ID N°: 40) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações V141I, A231T e A796V (SEQ ID N°: 42) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:i w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações R27L, R82D, V141M, R178N, N407A e A796V (SEQ ID N°: 44) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui mutações V141T, A231T e A796V (SEQ ID N°: 46) e produz quantidades aumentadas de ácidos graxos C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1 w-OH, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em uma modalidade, as variantes da SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 e SEQ ID N°: 46 produziram quantidades aumentadas de ácidos graxos w-OH ou derivados de ácido graxo, quando comparados com a SEQ ID N°: 6. Em uma modalidade, esses ácidos graxos w-OH são ácidos graxos C8:0 w-OH, ácidos graxos C10:0 w-OH, ácidos graxos C12:0 w-OH, ácidos graxos C14:0 w-OH, ácidos graxos C16:0 w-OH, ácidos graxos C18:0 w-OH, ácidos graxos C20:0 w-OH, ácidos graxos Cθ:i w-OH, ácidos graxos Cio:i w-OH, ácidos graxos Ci2:i w-OH, ácidos graxos Ci4:i w-OH, ácidos graxos Ci6:i w-OH, ácidos graxos Ci8:i w-OH, ácidos graxos C2o:i w-OH, e semelhantes.

[0088] A revelação identifica polinucleotídeo e variantes de polipeptídeo relacionados à fusão híbrida CYPi53A-redutase. As variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYPi53A-redutase incluem os IDS. DE SEQ. Nos: 8, io, i2, i4, i6, i8, 2o, 22, 24, 26, 28, 3o, 32, 34, 36, 38, 4o, 42, 44 e 46. As variantes de ácido nucléico de fusão híbrida CYPi53A-redutase (sequências de DNA) incluem os IDS. DE SEQ. Nos: 7, 9, ii, i3, i5, i7, i9, 2i, 23, 25, 27, 29, 3i, 33, 35, 37, 39, 4i, 43, 45 e 47. No entanto, será reconhecido que a identidade de sequência absoluta para variantes do polinucleotídeo de fusão híbrida CYPi53A- redutase não é necessária. Por exemplo, podem ser feitas alterações em uma sequência de polinucleotídeos particular e o polipeptídeo codificado avaliado quanto à atividade. Essas alterações tipicamente incluem mutações conservadoras e mutações silenciosas como, por exemplo, por meio de otimização de códons. Polinucleotídeos modificados ou mutados (ou seja, mutantes) e polipeptídeos variantes codificados podem ser avaliados quanto a uma função desejada, por exemplo, uma função aumentada, comparados com o polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo incluindo, sem limitação, atividade catalítica aumentada, estabilidade aumentada ou inibição diminuída (por exemplo, inibição de feedback diminuída), com o uso de métodos conhecidos na técnica. A revelação identifica atividades enzimáticas envolvidas em várias etapas (ou seja, reações) das vias biossintéticas de ácido graxo descritas nesse relatório descritivo de acordo com o número de Classificação de Enzima (EC), e fornece polipeptídeos exemplares (por exemplo, que funcionam como enzimas específicas e exibem atividade enzimática específica) categorizados por esses números de EC, e polinucleotídeos exemplares que codificam esses polipeptídeos. Esses polipeptídeos e polinucleotídeos exemplares, que são identificados nesse relatório descritivo por Números de Identificador de Sequência (IDS. DE SEQ. Nos; supra), são úteis para a modificação genética de vias de ácido graxo em células hospedeiras, tais como aquelas mostradas na Figura 1. Deve ser subentendido, no entanto, que polipeptídeos e polinucleotídeos descritos nesse relatório descritivo são exemplares e, dessa forma, não limitantes. As sequências de homólogos de polipeptídeos exemplares descritos nesse relatório descritivo estão disponíveis àqueles versados na técnica com o uso de bases de dados como, por exemplo, as bases de dados Entrez fornecidas pelo “National Center for Biotechnology Information” (NCBI), as bases de dados ExPasy fornecidas pelo “Swiss Institute of Bioinformatics”, a base de dados BRENDA fornecida pela “Technical University of Braunschweig” e a base de dados KEGG fornecida pelo “Bioinformatics Center of Kyoto University” e “University of Tokyo”, todos disponíveis na Internet.

[0089] Em uma modalidade, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 e SEQ ID N°: 46. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase é derivada de um polipeptídeo CYP153A (G307A) de Marinobacter aquaeolei, em que uma alanina (A) substitui uma glicina (G), e fundida com um domínio de redutase de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB 9784. Citocromo P450RhF é auto-suficiente, exibe um grau elevado de promiscuidade de substrato e catalisa uma ampla gama de grupos funcionais. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 ou SEQ ID N°: 46, e também pode incluir uma ou mais substituições que resultam em características e/ou propriedades úteis como descritas nesse relatório descritivo. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 42, SEQ ID N°: 44 ou SEQ ID N°: 46. Ainda em outras modalidades, o domínio catalítico de P450 da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de um organismo diferente de Marinobacter aquaeolei. Esses outros organismos incluem, sem limitação, Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis, Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., Mycobacterium sp. Ainda em outras modalidades, o domínio de redutase da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de um organismo diferente de Rhodococcus sp. Esses outros organismos incluem, sem limitação, Rhodococcus equi, Acinetobacter radioresistens, Burkholderia mallei, Burkholderia mallei, Ralstonia eutropha, Cupriavidus metallidurans.

[0090] Em uma modalidade relacionada, a revelação inclui uma variante do polinucleotídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que possui pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N° : 5, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 37, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 43, SEQ ID N°: 45 ou SEQ ID N°: 47. Em algumas modalidades a sequência de ácidos nucléicos codifica uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com uma ou mais substituições que resultam em características e/ou propriedades aprimoradas, como descritas nesse relatório descritivo. Ainda em outra modalidade relacionada, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação é codificada por uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 37, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 43, SEQ ID N°: 45 ou SEQ ID N°: 47. Em outro aspecto, a revelação está relacionada às variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que englobam uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucléicos que hibridiza sob condições rigorosas ao longo de substancialmente todo o comprimento de uma sequência de ácidos nucléicos que corresponde a SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 37, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 43, SEQ ID N°: 45 ou SEQ ID N°: 47. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivada de Marinobacter aquaeolei. Em outras modalidades, o polipeptídeo de fusão híbrida P450 é derivado de Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis, Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., e Mycobacterium sp.

Variantes adicionais de polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase

[0091] A revelação identifica polinucleotídeo e variantes de polipeptídeo adicionais relacionados à fusão híbrida CYP153A-redutase, em que uma variante foi usada como um modelo. O modelo de variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase se baseia no polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A(G307A)-RedRhF e ainda inclui a mutação A796V (SEQ ID N°: 38). Uma biblioteca de saturação total da proteína de fusão cyp153A-Red450RhF foi construída e avaliada quanto às variantes que exibissem aprimoramentos em relação a cyp153A(G307A)-Red450RhF(A796V) (SEQ ID N°: 38) (veja o Exemplo 7). As mutações G307A e A796V são mutações benéficas que aumentam a atividade de w- hidroxilase de cyp153A (veja a SEQ ID N°: 38) . As variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase resultantes são mostradas na Tabela 11 (infra). Essas variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase produziram uma quantidade aumentada de ácidos graxos w- hidróxi (titulação de FFA w-OH) quando comparadas com a SEQ ID N°: 38 e incluem os IDS. DE SEQ. Nos: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 e 96. Essas variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase podem produzir quantidades aumentadas de ácidos graxos w-OH, incluindo ácidos graxos e/ou derivados de ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1 e/ou C20:1.

[0092] As variantes de ácido nucléico de fusão híbrida CYP153A-redutase (sequências de DNA) incluem os IDS. DE SEQ. Nos: 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 e 95. No entanto, será reconhecido que a identidade de sequência absoluta para variantes do polinucleotídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase não é necessária. Por exemplo, podem ser feitas alterações em uma sequência de polinucleotídeos particular e o polipeptídeo codificado avaliado quanto à atividade. Essas alterações tipicamente incluem mutações conservadoras e mutações silenciosas como, por exemplo, por meio de otimização de códons. Polinucleotídeos modificados ou mutados (ou seja, mutantes) e polipeptídeos variantes codificados podem ser avaliados quanto a uma função desejada, por exemplo, uma função aumentada, comparados com o polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo incluindo, sem limitação, atividade catalítica aumentada, estabilidade aumentada ou inibição diminuída (por exemplo, inibição de feedback diminuída), com o uso de métodos conhecidos na técnica. A revelação identifica atividades enzimáticas envolvidas em várias etapas (ou seja, reações) das vias biossintéticas de ácido graxo descritas nesse relatório descritivo de acordo com o número de Classificação de Enzima (EC), e fornece polipeptídeos exemplares (por exemplo, que funcionam como enzimas específicas e exibem atividade enzimática específica) categorizados por esses números de EC, e polinucleotídeos exemplares que codificam esses polipeptídeos. Esses polipeptídeos e polinucleotídeos exemplares, que são identificados nesse relatório descritivo por Números de Identificador de Sequência (IDS. DE SEQ. Nos; supra), são úteis para a modificação genética de vias de ácido graxo em células hospedeiras, tais como aquelas mostradas na Figura 1. Deve ser subentendido, no entanto, que polipeptídeos e polinucleotídeos descritos nesse relatório descritivo são exemplares e, dessa forma, não limitantes. As sequências de homólogos de polipeptídeos exemplares descritos nesse relatório descritivo estão disponíveis àqueles versados na técnica com o uso de bases de dados como, por exemplo, as bases de dados Entrez fornecidas pelo “National Center for Biotechnology Information” (NCBI), as bases de dados ExPasy fornecidas pelo “Swiss Institute of Bioinformatics”, a base de dados BRENDA fornecida pela “Technical University of Braunschweig” e a base de dados KEGG fornecida pelo “Bioinformatics Center of Kyoto University” e “University of Tokyo”, todos disponíveis na Internet.

[0093] Em uma modalidade, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 48, SEQ ID N°: 50, SEQ ID N°: 52, SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 68 ou SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 92, SEQ ID N°: 94 e SEQ ID N°: 96. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivada de um polipeptídeo CYP153A (G307A) de Marinobacter aquaeolei, em que uma glicina (G) é substituída com uma alanina (A), e fundida com um domínio de redutase de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB 9784, e inclui uma mutação adicional de A796V, em que uma alanina (A) é substituída com uma valina (V). Citocromo P450RhF é auto-suficiente, exibe um grau elevado de promiscuidade de substrato e catalisa uma ampla gama de grupos funcionais. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 48, SEQ ID N°: 50, SEQ ID N°: 52, SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 68 ou SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 92, SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N° : 96, e também pode incluir uma ou mais substituições que resultam em características e/ou propriedades úteis como descritas nesse relatório descritivo. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação possui pelo menos cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 48, SEQ ID N° : 50, SEQ ID N°: 52, SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 68 ou SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 92, SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°: 96. Ainda em outras modalidades, o domínio catalítico de P450 da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de um organismo diferente de Marinobacter aquaeolei. Esses outros organismos incluem, sem limitação, Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis, Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., Mycobacterium sp. Ainda em outras modalidades, o domínio de redutase da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de um organismo diferente de Rhodococcus sp. Esses outros organismos incluem, sem limitação, Rhodococcus equi, Acinetobacter radioresistens, Burkholderia mallei, Burkholderia mallei, Ralstonia eutropha, Cupriavidus metallidurans.

[0094] Em uma modalidade relacionada, a revelação inclui uma variante do polinucleotídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que possui pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 49, SEQ ID N°: 51, SEQ ID N°: 53, SEQ ID N°: 55, SEQ ID N°: 57, SEQ ID N°: 59, SEQ ID N°: 61, SEQ ID N°: 63, SEQ ID N°: 65, SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 73, SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 93 ou SEQ ID N°: 95. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos codifica uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com uma ou mais substituições que resultam em características e/ou propriedades aprimoradas, como descritas nesse relatório descritivo. Ainda em outra modalidade relacionada, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da revelação é codificada por uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 49, SEQ ID N°: 51, SEQ ID N°: 53, SEQ ID N°: 55, SEQ ID N°: 57, SEQ ID N°: 59, SEQ ID N°: 61, SEQ ID N°: 63, SEQ ID N°: 65, SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 73, SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 93 ou SEQ ID N°: 95. Em outro aspecto, a revelação está relacionada às variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que englobam uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucléicos que hibridiza sob condições rigorosas ao longo de substancialmente todo o comprimento de uma sequência de ácidos nucléicos que corresponde a SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 49, SEQ ID N°: 51, SEQ ID N°: 53, SEQ ID N°: 55, SEQ ID N°: 57, SEQ ID N°: 59, SEQ ID N°: 61, SEQ ID N°: 63, SEQ ID N°: 65, SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 73, SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 93 ou SEQ ID N°: 95. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivada de uma espécie de Marinobacter aquaeolei. Em outras modalidades, o polipeptídeo de fusão híbrida P450 é derivado de Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis, Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., e Mycobacterium sp.

Sequências

[0095] As variantes mostradas na tabela abaixo se baseiam na proteína de fusão híbrida de citocromo P450 cyp153A16(G307A)-RedRhF.

[0096] As variantes mostradas na tabela abaixo se baseiam na proteína de fusão híbrida de citocromo P450 cyp153A(G307A)-Red450RhF(A796V).

Variações e mutações

[0097] Um polipeptídeo variante como usado nesse relatório descritivo se refere a um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que difere de um polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo por pelo menos um aminoácido. Por exemplo, a variante (por exemplo, mutante) pode ter uma ou mais das seguintes substituições conservadoras de aminoácidos incluindo, sem limitação, substituição de um aminoácido alifático, por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina, com outro aminoácido alifático; substituição de uma serina com uma treonina; substituição de uma treonina com uma serina; substituição de um resíduo ácido, por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico, com outro resíduo ácido; substituição de um resíduo que abriga um grupo amida, por exemplo, asparagina e glutamina, com outro resíduo que abriga um grupo amida; troca de um resíduo básico, por exemplo, lisina e arginina, com outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático, por exemplo, fenilalanina e tirosina, com outro resíduo aromático. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante possui cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99, ou mais substituições, adições, inserções ou deleções de aminoácidos. Alguns fragmentos preferidos de um polipeptídeo que funcionam como uma variante ou mutante retêm uma parte ou toda a função biológica (por exemplo, atividade enzimática) do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o fragmento retém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% ou mais da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo correspondente. Em outras modalidades, o fragmento ou mutante retém cerca de 100% da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo correspondente. Em outras modalidades, alguns fragmentos exibem função biológica aumentada, comparados com o polipeptídeo do tipo selvagem ou modelo correspondente. Diretrizes para determinar quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados, sem afetar a atividade biológica podem ser encontradas com o uso de programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o software LASERGENE (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Em algumas modalidades, um fragmento exibe função biológica aumentada quando comparado com um polipeptídeo do tipo selvagem ou polipeptídeo-modelo correspondente. Por exemplo, um fragmento pode exibir um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75% ou pelo menos 90% na atividade enzimática, quando comparado com o polipeptídeo do tipo selvagem ou polipeptídeo-modelo correspondente. Em outras modalidades, o fragmento exibe pelo menos 100%, pelo menos 200% ou pelo menos 500% de aumento na atividade enzimática, quando comparado com o polipeptídeo do tipo selvagem ou polipeptídeo-modelo correspondente.

[0098] Subentende-se que os polipeptídeos descritos nesse relatório descritivo podem ter substituições de aminoácidos conservadoras ou não essenciais adicionais que não possuam um efeito substancial sobre a função do polipeptídeo. Se uma substituição particular será ou não tolerada (ou seja, não afetará adversamente a função biológica desejada, por exemplo, atividade enzimática de w- hidroxilase) pode ser determinado como conhecido na técnica (veja Bowie e cols. (1990) Science, 247: 1.306-1.310). Uma substituição de aminoácido conservadora é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0099] Variantes podem ser de ocorrência natural ou criadas in vitro. Em particular, essas variantes podem ser criadas com o uso de técnicas de engenharia genética, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida, mutagênese química aleatória, procedimentos de deleção de Exonuclease III ou técnicas de clonagem padronizadas. Alternativamente, essas variantes, mutantes, fragmentos, análogos ou derivados podem ser criados com o uso de síntese química ou procedimentos de modificação. Métodos de produção de variantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes podem ser preparadas por utilização de mutagênese aleatória e sítio-dirigida. Mutagêneses aleatória e sítio- dirigida são geralmente conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Arnold (1993) Curr. Opin. Biotech. 4: 450-455). A mutagênese aleatória pode ser obtida com o uso de PCR error-prone (veja, por exemplo, Leung e cols. (1989) Technique 1: 11-15; e Caldwell e cols. (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33). Na PCR error-prone, a verdadeira PCR é realizada sob condições nas quais a fidelidade da cópia da DNA polimerase é baixa, de tal modo que uma taxa elevada de mutações pontuais seja obtida ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Resumidamente, nesses procedimentos, os ácidos nucléicos a serem mutagenizados (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína P450 ou polipeptídeo de fusão híbrida P450) são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase e uma concentração apropriada de dNTPs para obtenção de uma taxa elevada de mutação pontual ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada com o uso de 20 fmol do ácido nucléico a ser mutagenizado, 30 pmol de cada iniciador de PCR, um tampão de reação que compreende 50 mM de KCl, 10 mM de Tris HCl (pH 8,3), gelatina 0,01%, 7 mM de MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 5 unidades de Taq polimerase, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP e 1 mM de dTTP. PCR pode ser realizada por 30 ciclos de 94°C por 1 min, 45°C por 1 min e 72°C por 1 min. No entanto, será observado por aqueles versados na técnica que esses parâmetros podem ser variados como apropriado. Os ácidos nucléicos mutagenizados são então clonados em um vetor apropriado, e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos mutagenizados são avaliados. A mutagênese sítio-dirigida pode ser obtida usando mutagênese oligonucleotídeo-dirigida para gerar mutações sítio- específicas em qualquer DNA clonado de interesse. A mutagênese de oligonucleotídeos é descrita na técnica (veja, por exemplo, Reidhaar-Olson e cols. (1988) Science 241: 53-57). Resumidamente, nesses procedimentos, diversos oligonucleotídeos de fita dupla que abrigam uma ou mais mutações a serem introduzidas no DNA clonado são sintetizados e inseridos no DNA clonado a ser mutagenizado (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo P450 ou polipeptídeo de fusão híbrida P450). Clones que contêm o DNA mutagenizado são recuperados, e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.

[00100] Outro método para a geração de variantes é PCR por montagem. A PCR por montagem envolve a montagem de um produto de PCR a partir de uma mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um grande número de reações de diferentes PCR ocorre em paralelo no mesmo frasco, com os produtos de uma reação sensibilizando os produtos de outra reação (veja a Patente U.S. 5.965.408). Ainda outro método de geração de variantes é a mutagênese por PCR sexual. Na mutagênese por PCR sexual, a recombinação homóloga forçada ocorre entre moléculas de DNA de sequências de DNA diferentes, mas altamente relacionadas in vitro, como um resultado de fragmentação aleatória da molécula de DNA com base na homologia de sequência. Isso é seguido por fixação do cruzamento por extensão do iniciador em uma reação de PCR. A mutagênese por PCR sexual é descrita em publicações conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 10.747-10.751). Variantes também podem ser criadas por mutagênese in vivo. Em algumas modalidades, mutações aleatórias em uma sequência de ácidos nucléicos são geradas por propagação da sequência em uma cepa bacteriana, por exemplo, uma cepa de E. coli, que carrega mutações em uma ou mais das vias de reparo de DNA. Essas cepas mutadoras possuem uma taxa de mutação aleatória maior do que aquela de uma cepa do tipo selvagem. A propagação de uma sequência de DNA (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de fusão híbrida P450) em uma dessas cepas irá gerar eventualmente mutações aleatórias dentro do DNA. Cepas mutadoras adequadas para uso para mutagênese in vivo são descritas em publicação na técnica (veja, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 1991/016427). Variantes também podem ser geradas com o uso de mutagênese de cassete. Na mutagênese de cassete, uma pequena região de uma molécula de DNA de fita dupla é substituída com um cassete de oligonucleotídeo sintético que difere da sequência nativa. O oligonucleotídeo frequentemente contém uma sequência nativa completa e/ou parcialmente randomizada. A mutagênese por agrupamento recursivo também pode ser usada para a geração de variantes. A mutagênese por agrupamento recursivo é um algoritmo para modificação genética de proteínas (ou seja, mutagênese de proteína) desenvolvido para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacionados cujos membros diferem na sequência de aminoácidos. Esse método usa um mecanismo de feedback para controlar rodadas sucessivas de mutagênese combinatória de cassete (veja, por exemplo, Arkin e cols. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89: 7.811-7.815). Em algumas modalidades, são criadas variantes usando mutagênese por agrupamento exponencial. A mutagênese por agrupamento exponencial é um processo para a geração de bibliotecas combinatórias com uma percentagem elevada de mutantes únicos e funcionais, em que pequenos grupos de resíduos são randomizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que levam a proteínas funcionais (veja, por exemplo, Delegrave e cols. (1993) Biotech. Res. 11: 1.548-1.552). Em algumas modalidades, são criadas variantes com o uso de procedimentos de embaralhamento nos quais porções de diversos ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidas em conjunto para criar sequências de ácidos nucléicos quiméricas que codificam polipeptídeos quiméricos (como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.965.408 e 5.939.250).

Células hospedeiras

[00101] Estratégias para aumentar a produção de composições de ácido graxo w-OH por células hospedeiras recombinantes incluem fluxo aumentado por meio da via biossintética de ácido graxo por expressão de um gene de fusão híbrida CYP153A-redutase e um gene de tioesterase no hospedeiro de produção. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira modificada geneticamente” se refere a uma célula hospedeira cuja constituição genética foi alterada em relação à célula hospedeira do tipo selvagem correspondente, por exemplo, por introdução deliberada de novos elementos genéticos e/ou modificação deliberada de elementos genéticos naturalmente presentes na célula hospedeira. A prole dessas células hospedeiras recombinantes também contêm esses elementos genéticos novos e/ou modificados. Em qualquer um dos aspectos da revelação descritos nesse relatório descritivo, a célula hospedeira pode selecionada de uma célula de planta, célula de inseto, célula de fungo (por exemplo, um fungo filamentoso, por exemplo, Candida sp., ou uma levedura de brotamento, por exemplo, Saccharomyces sp.), uma célula de alga e uma célula bacteriana. Em uma modalidade, células hospedeiras recombinantes são microorganismos recombinantes. Exemplos de células hospedeiras que são microorganismos incluem, sem limitação, células do gênero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia ou Streptomyces. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana Gram-positiva. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana Gram-negativa. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de E. coli B, uma célula de E. coli C, uma célula de E. coli K ou uma célula de E. coli W. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Bacillus lentus, uma célula de Bacillus brevis, uma célula de Bacillus stearothermophilus, uma célula de Bacillus lichenoformis, uma célula de Bacillus alkalophilus, uma célula de Bacillus coagulans, uma célula de Bacillus circulans, uma célula de Bacillus pumilis, uma célula de Bacillus thuringiensis, uma célula de Bacillus clausii, uma célula de Bacillus megaterium, uma célula de Bacillus subtilis ou uma célula de Bacillus amyloliquefaciens. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma koningii, uma célula de Trichoderma viride, uma célula de Trichoderma reesei, uma célula de Trichoderma longibrachiatum, uma célula de Aspergillus awamori, uma célula de Aspergillus fumigatus, uma célula de Aspergillus foetidus, uma célula de Aspergillus nidulans, uma célula de Aspergillus niger, uma célula de Aspergillus oryzae, uma célula de Humicola insolens, uma célula de Humicola lanuginose, uma célula de Rhodococcusopacus, uma célula de Rhizomucormiehei ou uma célula de Mucormichei. Ainda em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces lividans ou uma célula de Streptomyces murinus. Ainda em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Actinomycetes. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

[00102] Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica de planta, uma célula de alga, uma célula de cianobactéria, uma célula de bactéria verde- enxofre, uma célula de bactéria verde não enxofre, uma célula de bactéria violeta-enxofre, uma célula de bactéria violeta não enxofre, uma célula extremófila, uma célula de levedura, uma célula fúngica, uma célula modificada geneticamente de qualquer um dos organismos descritos nesse relatório descritivo, ou um organismo sintético. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é luz-dependente ou fixa carbono. Em algumas modalidades, a célula hospedeira possui atividade autotrófica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira possui atividade fotoautotrófica, por exemplo, na presença de luz. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é heterotrófica ou mixotrófica na ausência de luz. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens ou Zymomonas mobilis. Em uma modalidade, a célula microbiana é de uma cianobactéria incluindo, sem limitação, Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece, e Nostoc punctiforme. Em outra modalidade, a célula microbiana é de uma espécie de cianobactéria específica incluindo, sem limitação, Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC 7001.

Vetores de expressão

[00103] Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos (ou gene) é fornecida à célula hospedeira por meio de um vetor recombinante, que inclui um promotor ligado operacionalmente à sequência de polinucleotídeos. Em certas modalidades, o promotor é um regulado pelo desenvolvimento, um promotor organela-específico, um promotor tecido-específico, um promotor indutível, um promotor constitutivo ou um promotor célula-específico. Em algumas modalidades, o vetor recombinante inclui pelo menos uma sequência selecionada de uma sequência de controle da expressão acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; um marcador de seleção acoplado operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; uma sequência marcadora acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; uma porção de purificação acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; uma sequência de secreção acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos; e uma sequência de direcionamento acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídeos. Os vetores de expressão aqui descritos incluem uma sequência de polinucleotídeos em uma forma adequada para expressão da sequência de polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Será observado por aqueles versados na técnica que o design do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de polipeptídeo desejado, e semelhantes. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos, como descrito acima (supra). A expressão de genes que codificam polipeptídeos em procariotas, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores que contêm promotores constitutivos ou indutíveis que dirigem a expressão de polipeptídeos de fusão ou não fusão. Vetores de fusão adicionam diversos aminoácidos a um polipeptídeo nele codificado, normalmente ao terminal amino ou carbóxi do polipeptídeo recombinante. Esses vetores de fusão tipicamente servem a uma ou mais das três finalidades seguintes, incluindo o aumento da expressão do polipeptídeo recombinante; o aumento da solubilidade do polipeptídeo recombinante; e o auxílio na purificação do polipeptídeo recombinante por atuação como um ligante na purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e o polipeptídeo recombinante. Isso permite a separação do polipeptídeo recombinante da porção de fusão após purificação do polipeptídeo de fusão. Exemplos dessas enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enteroquinase. Vetores de expressão de fusão exemplares incluem vetor pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith e cols. (1988) Gene 67: 31-40), vetor pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), e vetor pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.), que fundem glutationa S- transferase (GST), proteína de ligação de maltose E ou proteína A, respectivamente, ao polipeptídeo recombinante- alvo.

[00104] Exemplos de vetores de expressão indutíveis, não fusão, de E. coli incluem vetor pTrc (Amann e cols. (1988) Gene 69: 301-315) e vetor pET 11d (Studier e cols., “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). A expressão do gene-alvo pelo vetor pTrc se baseia na transcrição de RNA polimerase do hospedeiro por um promotor de fusão híbrido trp-lac. A expressão do gene-alvo pelo vetor pET 11d se baseia na transcrição por um promotor de fusão T7 gn10-lac mediada por uma RNA polimerase viral co- expressa (T7 gn1). Essa polimerase viral é fornecida por cepas hospedeiras como, por exemplo, BL21(DE3) ou HMS174(DE3), de um pró-fago À residente que abriga um gene de T7 gn1 sob o controle transcricional do promotor lacUV 5. Sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto para células eucarióticas são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e cols. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory). Exemplos de vetores de expressão indutíveis, não fusão, de E. coli incluem o vetor pTrc (Amann e cols. (1988) Gene 69: 301-315) e o vetor PET 11d (Studier e cols. (1990) “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, CA, páginas 60-89). Em certas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos da revelação está ligada operacionalmente a um promotor derivado de bacteriófago T5. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nessa modalidade, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Vetores podem ser introduzidos em células procarióticas ou eucarióticas por meio de diversas metodologias reconhecidas na técnica para a introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira. Métodos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook e cols. (supra). Para transformação estável de células bacterianas, sabe-se que (dependendo do vetor de expressão e da técnica de transformação usados) certa fração de células irá captar e replicar o vetor de expressão. A fim de identificar e selecionar esses transformantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a um antibiótico) pode ser introduzido nas células hospedeiras, juntamente com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a fármacos como, por exemplo, sem limitação, ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Ácidos nucléicos que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidos em uma célula hospedeira no mesmo vetor que aquele que codifica um polipeptídeo descrito nesse relatório descritivo, ou podem ser introduzidos em um vetor separado.

Manipulação genética opcional da via

[00105] As células ou microorganismos hospedeiros da revelação incluem cepas hospedeiras ou células hospedeiras que são geneticamente planejadas ou modificadas para conter alterações a fim de testar a eficiência de mutações sobre atividades enzimáticas específicas (ou seja, células ou microorganismos recombinantes). Várias manipulações e alterações genéticas opcionais podem ser usadas de forma intercambiável de uma célula hospedeira para outra, dependendo de quais vias enzimáticas nativas estão presentes na célula hospedeira original. Em uma modalidade, uma cepa hospedeira pode ser usada para testar a expressão de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase em combinação com outros polipeptídeos biossintéticos (por exemplo, enzimas). Uma cepa hospedeira pode englobar diversas alterações genéticas a fim de testar variáveis específicas incluindo, sem limitação, condições de cultura, incluindo componentes de fermentação, fonte de carbono (por exemplo, matéria-prima), temperatura, pressão, condições reduzidas de contaminação da cultura e níveis de oxigênio.

[00106] Em uma modalidade, uma cepa hospedeira engloba uma deleção fadE e fhuA opcional. Acil-CoA desidrogenase (FadE) é uma enzima que é importante para a metabolização de ácidos graxos. Ela catalisa a segunda etapa na utilização de ácido graxo (beta-oxidação), que é o processo de quebra de cadeias longas de ácidos graxos (acil-CoAs) em moléculas de acetil-CoA. Mais especificamente, a segunda etapa do ciclo de e-oxidação da degradação de ácido graxo em bactérias é a oxidação de acil-CoA em 2-enoil-CoA, que é catalisada por FadE. Quando E. coli não possui FadE, ela não pode crescer em ácidos graxos como uma fonte de carbono, mas pode crescer em acetato. A inabilidade para utilizar ácidos graxos de qualquer comprimento de cadeia é consistente com o fenótipo relatado de cepas de fadE, ou seja, cepas mutantes de fadE nas quais a função de FadE está rompida. O gene fadE pode ser opcionalmente submetido a knockout ou atenuado para assegurar que acil-CoAs, que podem ser intermediárias em uma via de derivado de ácido graxo, possam se acumular na célula, de tal forma que todas as acil-CoAs possam ser convertidas eficientemente em derivados de ácido graxo. No entanto, a atenuação de fadE é opcional quando se usa açúcar como uma fonte de carbono, na medida em que sob essa condição a expressão de FadE é provavelmente reprimida e FadE, portanto, pode só estar presente em pequenas quantidades e não ser capaz de competir eficientemente com éster sintase ou outras enzimas pelos substratos de acil- CoA. FadE é reprimida em função da repressão de catabólito. E. coli e muitos outros micróbios preferem consumir açúcar em relação aos ácidos graxos e, portanto, quando ambas as fontes estão disponíveis, açúcar é consumido primeiro por repressão do regulão de fad (veja D. Clark, J. Bacteriol. (1981) 148 (2): 521-6)). Além disso, a ausência de açúcares e a presença de ácidos graxos induzem a expressão de FadE. Intermediários de Acil-CoA poderiam ser perdidos para a via de oxidação beta, já que as proteínas expressas pelo regulão de fad (incluindo FadE) estão supra-reguladas e competirão eficientemente por acil-CoAs. Dessa forma, pode ser benéfico ter o gene de fadE knocked out ou atenuado. Na medida em que a maioria das fontes de carbono se baseia principalmente em açúcar, é opcional atenuar FadE. O gene fhuA codifica a proteína TonA, que é um transportador e receptor acoplados à energia na membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J. Bacteriol. 191 (11): 3.431-3.436). Sua deleção é opcional. A deleção de fhuA permite que a célula se torne mais resistente ao ataque de fago que pode ser benéfico em certas condições de fermentação. Dessa forma, pode ser desejável deletar fhuA em uma célula hospedeira que provavelmente esteja sujeita à contaminação potencial durante rodadas de fermentação.

[00107] Em outra modalidade, a cepa hospedeira (supra) também engloba a superexpressão opcional de um ou mais dos seguintes genes, incluindo fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV e/ou fabF. Exemplos desses genes são fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) e fabF de Clostridium acetobutilicum (NP_350156). A superexpressão de um ou mais desses genes, que codificam enzimas e reguladores na biossíntese de ácido graxo, pode servir para aumentar a titulação de compostos de derivado de ácido graxo, incluindo ácidos graxos w-OH e derivados destes, sob várias condições de cultura.

[00108] Em outra modalidade, cepas de E. coli são usadas como células hospedeiras para a produção de ácidos graxos w-OH e derivados destes. Similarmente, essas células hospedeiras fornecem superexpressão opcional de um ou mais genes da biossíntese (ou seja, genes que codificam enzimas e reguladores da biossíntese de ácido graxo) que podem aumentar ou intensificar ainda mais a titulação de compostos de derivado de ácido graxo como, por exemplo, derivados de ácido graxo (por exemplo, ácidos graxos w-OH e a,w-diácidos etc.) sob várias condições de cultura incluindo, sem limitação, fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV e/ou fabF. Exemplos de alterações genéticas incluem fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) e fabF de Clostridium acetobutilicum (NP_350156). Em algumas modalidades, óperons sintéticos que carregam esses genes biossintéticos podem ser modificados geneticamente e expressos em células a fim de testar a expressão de P450 sob várias condições de cultura e/ou aumentar ainda mais a produção de ácido graxo w-OH e α,w- diácido. Esses óperons sintéticos contêm um ou mais genes biossintéticos. Um óperon modificado geneticamente pode conter genes biossintéticos de ácido graxo opcionais, incluindo fabV de Vibrio cholera, fabH de Salmonella typhimurium, fabD de S. typhimurium, fabG de S. typhimurium, fabA de S. typhimurium e/ou fabF de Clostridium acetobutilicum que podem ser usados para facilitar a superexpressão de derivados de ácido graxo a fim de testar condições de cultura específicas. Uma vantagem desses óperons sintéticos é que a taxa de produção de derivado de ácido graxo w-OH pode ser aumentada ou intensificada ainda mais.

[00109] Em algumas modalidades, as células ou microorganismos hospedeiros que são usados para expressar ACP e enzimas biossintéticas (por exemplo, w-hidroxilase, tioesterase etc.) irão ainda expressar genes que englobam certas atividades enzimáticas que podem aumentar a produção de um ou mais derivados de ácido graxo particulares como, por exemplo, ácidos graxos w-OH, derivados de ácido graxo w-OH, a,w-diácidos e semelhantes. Em uma modalidade, a célula hospedeira possui atividade de tioesterase (E.C.3.1.2.* ou E.C.3.1.2.14 ou E.C.3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos, que pode ser aumentada por superexpressão do gene. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de éster sintase (E.C. 2.3.1.75) para a produção de ésteres graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de acil- ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) e/ou atividade de álcool desidrogenase (E.C. 1.1.1.1.) e/ou atividade de álcool graxo acil-CoA redutase (FAR) (E.C. 1.1.1.*) e/ou atividade de ácido carboxílico redutase (CAR) (EC 1.2.99.6) para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de acil-ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) para a produção de aldeídos graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de acil-ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) e atividade de descarbonilase (ADC) para a produção de alcanos e alcenos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de acil-CoA redutase (E.C. 1.2.1.50), atividade de acil-CoA sintase (FadD) (E.C. 2.3.1.86) e atividade de tioesterase (E.C. 3.1.2 * ou E.C. 3.1.2.14 ou E.C. 3.1.1.5) para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de éster sintase (E.C. 2.3.1.75), atividade de acil-CoA sintase (FadD) (E.C. 2.3.1.86) e atividade de tioesterase (E.C. 3.1.2.* ou E.C. 3.1. 2.14 ou E.C. 3.1.1.5) para a produção de ésteres graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de OleA para a produção de cetonas. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de OleBCD para a produção de olefinas internas. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de acil-ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) e atividade de álcool desidrogenase (E.C. 1.1.1.1.) para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira possui atividade de tioesterase (E.C. 3.1.2.* ou E.C. 3.1. 2.14 ou E.C. 3.1.1.5) e atividade de descarboxilase para a produção de olefinas terminais. A expressão de atividades enzimáticas em microorganismos e células microbianas é ensinada pelas Patentes U.S. Números 8.097.439, 8.110.093, 8.110.670, 8.183.028, 8.268.599, 8.283. 143, 8.232.924, 8.372.610 e 8.530.221, que são incorporadas nesse relatório descritivo por referência. Em outras modalidades, as células ou microorganismos hospedeiros que são usados para expressar ACP e outras enzimas biossintéticas incluirão certas atividades enzimáticas nativas que são supra-reguladas ou superexpressas a fim de produzir um ou mais derivados de ácido graxos particulares como, por exemplo, ácidos graxos w-OH, derivados de ácido graxo w-OH e a,w-diácidos. Em uma modalidade, a célula hospedeira possui uma atividade nativa de tioesterase (E.C. 3.1.2.* ou E.C. 3.1. 2.14 ou E.C. 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos, que pode ser aumentada por superexpressão do gene de tioesterase.

[00110] A presente revelação inclui cepas ou microorganismos hospedeiros que expressam genes que codificam variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase e outras enzimas biossintéticas (supra). As células hospedeiras recombinantes produzem derivados de ácido graxo como, por exemplo, ácidos graxos w-OH, derivados de ácido graxo w-OH, a,w-diácidos e composições e misturas destes. Os derivados de ácido graxo são tipicamente recuperados do meio de cultura e/ou são isolados das células hospedeiras. Em uma modalidade, os derivados de ácido graxo são recuperados do meio de cultura (extracelular). Em outra modalidade, os derivados de ácido graxo são isolados das células hospedeiras (intracelular). Em outra modalidade, os derivados de ácido graxo são recuperados do meio de cultura e isolados das células hospedeiras. Os derivados ou composições de ácido graxo produzidos por uma célula hospedeira podem ser analisados com o uso de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, GC-FID, a fim de determinar a distribuição de derivados de ácido graxo particulares, bem como de comprimentos de cadeia e grau de saturação dos componentes dos derivados de ácido graxo w-OH como, por exemplo, ácidos graxos w-OH, w- OH ésteres graxos, a,w-diácidos, e semelhantes.

Cultura e fermentação

[00111] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fermentação” se refere de forma ampla à conversão de materiais orgânicos em substâncias-alvo por células hospedeiras, por exemplo, a conversão de uma fonte de carbono por células hospedeiras recombinantes em ácidos graxos w-OH ou derivados destes por propagação de uma cultura das células hospedeiras recombinantes em um meio que compreende a fonte de carbono. As condições que permitem a produção se referem a quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira produza um produto desejado, por exemplo, ácidos graxos w-OH. Similarmente, a condição ou condições nas quais a sequência de polinucleotídeos de um vetor é expressa significam quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira sintetize um polipeptídeo. Condições adequadas incluem, por exemplo, condições de fermentação. Condições de fermentação podem incluir muitos parâmetros incluindo, sem limitação, faixas de temperatura, níveis de aeração, taxas de alimentação e composição dos meios. Cada uma dessas condições, individualmente e em combinação, permite que a célula hospedeira cresça. A fermentação pode ser aeróbica, anaeróbica, ou variações destas (por exemplo, microaeróbica). Meios de cultura exemplares incluem caldos ou géis. Geralmente, o meio inclui uma fonte de carbono que pode ser metabolizada por uma célula hospedeira diretamente. Além disso, enzimas podem ser usadas no meio para facilitar a mobilização (por exemplo, a despolimerização de amido ou celulose em açúcares fermentáveis) e subsequente metabolismo da fonte de carbono.

[00112] Para produção em pequena escala, as células hospedeiras modificadas geneticamente podem ser desenvolvidas em bateladas de, por exemplo, cerca de 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l, ou 10 l; fermentadas; e induzidas a expressar uma sequência de polinucleotídeos desejada, por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de fusão híbrida P450. Para produção em larga escala, as células hospedeiras modificadas geneticamente podem ser desenvolvidas em bateladas de cerca de 10 l, 100 l, 1.000 l, 10.000 l, 100.000 l e 1.000.000 l ou maiores; fermentadas; e induzidas a expressar uma sequência de polinucleotídeos desejada. Alternativamente, pode ser realizada fermentação em batelada alimentada em larga escala. Os ácidos graxos w-OH, derivados e composições destes como descritos nesse relatório descritivo são encontrados no ambiente extracelular da cultura da célula hospedeira recombinante e podem ser facilmente isolados do meio de cultura. Um ácido graxo w-OH ou derivado deste pode ser secretado pela célula hospedeira recombinante, transportado para o ambiente extracelular ou passivamente transferido para o ambiente extracelular da cultura da célula hospedeira recombinante. Os ácidos graxos w-OH ou derivados destes são isolados de uma cultura da célula hospedeira recombinante com o uso de métodos de rotina conhecidos na técnica.

Produtos derivados de células hospedeiras recombinantes

[00113] Como usada nesse relatório descritivo, a fração de carbono moderno ou fM possui o mesmo significado como definido por “National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials” (SRMs4990B e 4990C, conhecidos como padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental está relacionada a 0,95 vez a proporção de isótopos 14C/12C HOxI (citada como AD 1950). Isso é aproximadamente equivalente à madeira pré-Revolução Industrial corrigida pelo decaimento. Para a biosfera viva atual (material de planta), fM é aproximadamente 1,1. Bioprodutos (por exemplo, os derivados de ácido graxo, incluindo ácidos graxos w-OH e derivados produzidos de acordo com a presente revelação) incluem compostos orgânicos produzidos biologicamente. Em particular, os derivados de ácido graxo (por exemplo, ácidos graxos w-OH e derivados destes) produzidos com o uso da via biossintética de ácido graxo apresentada nesse relatório descritivo não eram produzidos a partir de fontes renováveis e, dessa forma, são novas composições de matéria. Esses novos bioprodutos podem ser distinguidos a partir de compostos orgânicos derivados de carbono petroquímico com base na impressão digital dupla carbono- isotópica ou datação de 14C. Adicionalmente, a fonte específica de carbono de origem biológica (por exemplo, glicose vs. glicerol) pode ser determinada por impressão digital dupla carbono-isotópica (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 7.169.588). A habilidade para distinguir bioprodutos de compostos orgânicos à base de petróleo é benéfica no rastreamento desses materiais no comércio. Por exemplo, compostos ou substâncias químicas orgânicas que incluem perfis tanto baseados biologicamente quanto de petróleo baseados em isótopo de carbono podem ser distinguidos de compostos e substâncias químicas orgânicas feitas apenas de materiais à base de petróleo. Dessa forma, os bioprodutos apresentados nesse relatório descritivo podem ser acompanhados ou rastreados no comércio com base em seu perfil único de isótopo de carbono. Bioprodutos podem ser distinguidos de compostos orgânicos à base de petróleo por comparação da proporção de isótopo de carbono estável (13C/C12) em cada amostra. A proporção de 13C/C12 em certo bioproduto é uma consequência da proporção de 13C/C12 no dióxido de carbono atmosférico no momento em que o dióxido de carbono é fixado. Ela também reflete a via metabólica precisa. Variações regionais também ocorrem. Petróleo, plantas C3 (um latifoliado), plantas C4 (as gramíneas) e carbonatos marinhos, todos mostram diferenças significantes em 13C/C12 e nos valores de δ13C correspondentes. Além disso, matéria lipídica de plantas C3 e C4 analisam diferentemente em relação a materiais derivados dos componentes de carboidrato das mesmas plantas como uma consequência da via metabólica. Dentro da precisão da medição, 13C mostra grandes variações em função dos efeitos de fracionamento isotópico, o mais significante deles para bioprodutos sendo o mecanismo fotossintético. A causa principal das diferenças na proporção de isótopo de carbono em plantas está intimamente associada às diferenças na via do metabolismo fotossintético de carbono nas plantas, particularmente a reação que ocorre durante a carboxilação primária (ou seja, a fixação inicial de CO2 atmosférico). Duas grandes classes de vegetação são aquelas que incorporam o ciclo fotossintético de C3 (ou de Calvin- Benson) e aquelas que incorporam o ciclo fotossintético de C4 (ou de Hatch-Slack). Em plantas C3, a fixação de CO2 primária ou reação de carboxilação envolve a enzima ribulose-1,5-difosfato carboxilase, e o primeiro produto estável é um composto de 3 carbonos. Plantas C3, por exemplo, madeiras duras e coníferas, são dominantes nas zonas de clima temperado. Em plantas C4, uma reação de carboxilação adicional que envolve outra enzima, fosfoenol- piruvato carboxilase, é a reação de carboxilação primária. O primeiro composto de carbono estável é um ácido de 4 carbonos que é subsequentemente descarboxilado. O CO2 assim liberado é fixado novamente pelo ciclo de C3. Exemplos de plantas C4 são gramíneas tropicais, milho e cana de açúcar. Plantas tanto C4 quanto C3 exibem uma gama de proporções isotópicas, mas valores típicos são cerca de -7 até cerca de -13 por mil para plantas C4 e cerca de -19 até cerca de -27 por mil para plantas C3 (veja, por exemplo, Stuiver e cols. (1977) Radiocarbon 19: 355). Carvão e petróleo caem geralmente nessa última faixa. A escala de medição de 13C foi originalmente definida por um zero estabelecido pela pedra calcária belemnita de Pee Dee (PDB), na qual os valores são dados em partes por mil desvios desse material. Os valores de δ13C são expressos em partes por mil (por mil), abreviadas %o, e são calculados da seguinte forma: δ13C (%o)= [(13C/12C) da amostra - (13C/12C) do padrão]/ (13C/12C) do padrão x 1.000

[00114] Como o PDB do material de referência (RM) foi exaurido, uma série de RMs alternativos foi desenvolvida em cooperação com o IAEA, USGS, NIST e outros laboratórios de isótopos internacionais selecionados. A notação para os desvios por mil de PDB é δ13C. São feitas medições em CO2 por espectrometria de massa de proporção estável de alta precisão (IRMS) em íons moleculares de massas 44, 45 e 46. As composições descritas nesse relatório descritivo incluem bioprodutos produzidos por qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo incluindo, por exemplo, produtos de derivados de ácido graxo. Especificamente, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -28 ou maior, cerca de - 27 ou maior, -20 ou maior, -18 ou maior, -15 ou maior, -13 ou maior, -10 ou maior, ou -8 ou maior. Por exemplo, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -30 até cerca de -15, cerca de -27 até cerca de -19, cerca de -25 até cerca de -21, cerca de -15 até cerca de -5, cerca de -13 até cerca de -7, ou cerca de -13 até cerca de -10. Em outros casos, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -10, -11, -12 ou -12.3. Bioprodutos produzidos de acordo com a revelação aqui apresentada também podem ser distinguidos de compostos orgânicos à base de petróleo por comparação da quantidade de 14C em cada composto. Como o 14C possui uma meia-vida nuclear de 5.730 anos, combustíveis à base de petróleo que contêm carbono mais velho podem ser distinguidos de bioprodutos que contêm carbono mais novo (veja, por exemplo, “Currie, Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environmental Particles”, J. Buffle e H.P. van Leeuwen, Eds., 1 de Vol. I da “IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series” (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)). O pressuposto básico na datação de radiocarbono é que a constância da concentração de 14C na atmosfera leva à constância do 14C nos organismos vivos. No entanto, por causa dos testes nucleares atmosféricos desde 1950 e da queima de combustível fóssil desde 1850, o 14C adquiriu uma segunda característica temporal, geoquímica. Sua concentração no CO2 atmosférico e, portanto, na biosfera viva, aproximadamente dobrou no pico dos testes nucleares, no meio da década de 1960. Desde então vem retornando gradualmente à taxa cosmogênica (atmosférica) de isótopos basais de equilíbrio (14C/12C) de cerca de 1,2 x 10-12, com uma “meia-vida” de relaxamento aproximada de 7-10 anos. Essa última meia-vida não deve ser considerada literalmente, mas sim deve-se usar a função detalhada de entrada/decaimento nuclear atmosférico para rastrear a variação de 14C atmosférico e biosférico desde o início da era nuclear. É essa última característica temporal do 14C biosférico que mantém a promessa de datação anual do carbono biosférico recente. O 14C pode ser medido por espectrometria de massa em acelerador (AMS), com resultados expressos em unidades de fração de carbono moderno (fM). fM é definido pelo “National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials” (SRMs) 4990B e 4990C. Como usada nesse relatório descritivo, a fração de carbono moderno ou fM possui o mesmo significado como definido por “National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials” (SRMs) 4990B e 4990C, conhecidos como padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental está relacionada a 0,95 vez a proporção de isótopos 14C/12C HOxI (citada como AD 1950). Isso é aproximadamente equivalente à madeira pré-Revolução Industrial corrigida pelo decaimento. Para a biosfera viva atual (material de planta), fM é aproximadamente 1,1. As composições descritas nesse relatório descritivo incluem bioprodutos que podem ter um fM14C de pelo menos cerca de 1. Por exemplo, o bioproduto da revelação pode ter um fM14C de pelo menos cerca de 1,01, um fM14C de cerca de 1 até cerca de 1,5, um fM14C de cerca de 1,04 até cerca de 1,18, ou um fM14C de cerca de 1,111 até cerca de 1,124.

[00115] Outra medição de 14C é conhecida como o percentual de carbono moderno (pMC). Para um arqueólogo ou geólogo que utiliza datas de 14C, AD 1950 é igual a zero ano de idade. Isso também representa 100 pMC. O bombardeamento de carbono na atmosfera alcançou quase duas vezes o nível normal em 1963 no pico das armas termonucleares. Sua distribuição dentro da atmosfera foi aproximada desde seu aparecimento, mostrando valores que são maiores do que 100 pMC para plantas e animais vivos desde AD 1950. Ela diminuiu gradualmente ao longo do tempo, com o valor de hoje sendo próximo a 107,5 pMC. Isso significa que um material de biomassa fresco, por exemplo, milho, geraria uma assinatura de 14C próxima a 107,5 pMC. Compostos à base de petróleo terão um valor de pMC de zero. A combinação de carbono fóssil com carbono do tempo presente resultará em uma diluição do teor de pMC do tempo presente. Supondo-se que 107,5 pMC representa o teor de 14C materiais de biomassa do tempo presente e 0 pMC representa o teor de 14C de produtos à base de petróleo, o valor de pMC medido para aquele material refletirá as proporções dos dois tipos de componentes. Por exemplo, um material derivado 100% de sojas do tempo presente geraria uma assinatura de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Se aquele material fosse diluído 50% com produtos à base de petróleo, ele geraria uma assinatura de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Um teor de carbono baseado biologicamente é derivado atribuindo-se 100% igual a 107,5 pMC e 0% igual a 0 pMC. Por exemplo, uma amostra que mede 99 pMC irá gerar um teor de carbono baseado biologicamente equivalente de 93%. Esse valor é denominado o resultado de carbono baseado biologicamente médio e supõe que todos os componentes dentro do material analisado se originaram de material biológico do tempo presente ou de material à base de petróleo. Um bioproduto que compreende um ou mais derivados de ácido graxo como descritos nesse relatório descritivo pode ter um pMC de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100. Em outros casos, um derivado de ácido graxo descrito nesse relatório descritivo pode ter um pMC entre cerca de 50 e cerca de 100; cerca de 60 e cerca de 100; cerca de 70 e cerca de 100; cerca de 80 e cerca de 100; cerca de 85 e cerca de 100; cerca de 87 e cerca de 98; ou cerca de 90 e cerca de 95. Ainda em outros casos, um derivado de ácido graxo descrito nesse relatório descritivo pode ter um pMC de cerca de 90, 91, 92, 93, 94 ou 94,2.

EXEMPLOS

[00116] Os exemplos específicos seguintes visam ilustrar a revelação e não devem ser considerados como limitantes do escopo das reivindicações.

Protocolos e métodos Triagem de uma biblioteca

[00117] Todos os protocolos descritos nesse relatório descritivo se baseiam em um sistema de 2 ml de placa de 96 poços master block (Greiner Bio-One, Monroe, NC ou Corning, Amsterdam, Holanda) para o crescimento de culturas, e placas (Costar, Inc.) para a extração de espécies de ácido graxo do caldo de cultura. Os protocolos fornecidos abaixo são exemplos de condições de fermentação. Protocolos alternativos podem ser usados para avaliar a produção de espécies de ácido graxo.

Protocolo de cultura a 32°C Plim

[00118] Trinta μl de cultura em LB (de uma cultura em LB que cresce em uma placa de 96 poços) foram usados para inocular 290 μl de meios Plim (Tabela 2), que foram então incubados por aproximadamente 16 horas a 32°C com agitação. Quarenta μl da semente de um dia para o outro foram usados para inocular 360 μl de meios Plim. Após crescimento a 32°C por 2 horas, as culturas foram induzidas com IPTG (concentração final de 1 mM) (Tabela 3 abaixo). As culturas foram então incubadas a 32°C com agitação por 20 horas se não observado de forma diferente, e depois foram extraídas seguindo o protocolo de extração-padrão detalhado abaixo.

Protocolo de cultura a 35°C Nlim

[00119] Quarenta μl de cultura em LB (de uma cultura em LB que cresce em uma placa de 96 poços) foram usados para inocular 360 μl de meios LB (Tabela 3 abaixo), que foram então incubados por aproximadamente 4 horas a 32°C agitação. Quarenta μl da semente em LB foram usados para inocular 360 μl de meios Nlim. Após crescimento a 32°C por 2 horas a 35°C, as culturas foram induzidas com IPTG (concentração final de 1 mM) (Tabela 3 abaixo). As culturas foram então incubadas a 35°C com agitação por 20 horas se não observado de forma diferente, e depois foram extraídas seguindo o protocolo de extração-padrão detalhado abaixo. Tabela 3: Nomes dos meios e formulações.

Protocolo de extração-padrão de espécies de ácido graxo

[00120] A cada poço a ser extraído, 80 μl de 1 M de HCl, seguidos por 400 μl de acetato de butila (com 500 mg/L de pentadecanol como padrão interno) foram adicionados. As placas de 96 poços foram então seladas por calor usando uma seladora de placas (aquecedor ALPS-300; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL), e agitadas por 15 minutos a 2.000 rpm usando um misturador MIXMATE (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Após agitação, as placas foram centrifugadas por 10 minutos a 4.500 rpm em temperatura ambiente (Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA) para separar as camadas aquosas e orgânicas. Cem μl da camada orgânica foram transferidos para uma placa de 96 poços (propileno, Corning, Amsterdam, Holanda) e derivatizados com 100 μl de BSTFA. A placa foi subsequentemente selada por calor e armazenada a -20°C até ser avaliada por GC-FID usando o método de FFA w-OH, que foi realizado da seguinte forma: 1 μl de amostra foi injetado em uma coluna analítica (DB-1, 10 m x 180 μm x 0,2 μM de espessura da película, disponível por JW 121-101A) em um dispositivo Agilent 7890A GC Ultra (Agilent, Santa Clara, CA) com um detector de ionização em chama (FID) com uma fenda 1-20. O instrumento foi configurado para detectar e quantificar ácidos graxos C10 a C18 e ácidos graxos o- hidroxilados. O protocolo detalhado acima representa condições-padrão, que podem ser modificadas como necessário para otimizar os resultados analíticos.

Construção de bibliotecas com propensão ao erro

[00121] Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas com propensão ao erro. Em um exemplo, o arcabouço do vetor foi preparado usando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada por amplificação por PCR a partir de um modelo de DNA sob condições que favorecem a incorporação de nucleotídeos com erro de pareamento. Em uma abordagem, a clonagem do arcabouço do vetor e de um inserto de DNA com diversidade foi realizada usando o Sistema de Clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), de acordo com o protocolo do fabricante.

Construção de bibliotecas de saturação

[00122] Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Em um exemplo, o arcabouço do vetor foi preparado usando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada com o uso de iniciadores degenerados. Em uma abordagem, a clonagem do arcabouço do vetor e de um inserto de DNA com diversidade foi realizada usando Sistema de Clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Construção de bibliotecas combinadas

[00123] As mutações identificadas como benéficas foram combinadas para fornecer variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153-redutase (por exemplo, híbrida CYP153A-RedRhF proteína variantes) com aprimoramentos adicionais na produção de espécies de derivados de ácido graxo w-OH. Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar as bibliotecas combinadas. Em um exemplo, o arcabouço do vetor foi preparado usando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada com o uso de iniciadores para introduzir as mutações desejadas. Como descrito acima, em uma abordagem, a clonagem do arcabouço do vetor e de um inserto de DNA com diversidade foi realizada usando Sistema de Clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Bibliotecas combinadas podem ser geradas com o uso do protocolo de PCR por transferência (tPCR) (Erijman e cols. (2011) J. Structural Bio. 175: 171-177).

Avaliação da biblioteca

[00124] Após a diversidade da biblioteca ter sido gerada em uma biblioteca com propensão ao erro, em uma biblioteca de saturação ou em uma biblioteca combinada, ela foi avaliada usando um dos métodos descritos acima. Dois tipos de hits foram identificados: (1) quantidade aumentada de ácidos graxos w-hidróxi (titulação de FFA w-OH); e/ou (2) conversão aumentada de ácidos graxos em ácidos graxos w-hidróxi. As mutações nas variantes híbridas da proteína cyp153A-RedRhF dentro de cada hit foram identificadas por sequenciamento, com o uso de técnicas-padrão rotineiramente empregadas por aqueles versados na técnica. As Tabelas 5, 6 e 7 abaixo listam as mutações (hits) identificadas como benéficas em bibliotecas de saturação.

EXEMPLO 1: Cepa e construção de plasmídeo para avaliação da biblioteca

[00125] Esse exemplo descreve as cepas e plasmídeos construídos para avaliação de biblioteca de mutagênese de saturação ou combinatória.

[00126] Um gene que codifica uma proteína de fusão híbrida feita da proteína catalítica CYP153A(G307A) P450 de Marinobacter aquaeoli e do domínio de redutase contendo FMN e Fe/S do terminal C de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB 9784 foi criado da seguinte forma: O gene cyp165A(G307A)_Maqu foi amplificado a partir de DNA genômico e fundido com um domínio de redutase P450RhF sintético códon-otimizado por cross-over PCR. O gene de fusão resultante (SEQ ID N°: 5) foi clonado em um derivado de pACYC (ou seja, replicon p15A, marcador de resistência à canamicina), de tal forma que sua transcrição fosse controlada pelo promotor Vtrc indutível por IPTG. O plasmídeo foi denominado pEP125 (veja a Tabela 4, infra).

[00127] O gene que codifica a proteína de fusão híbrida cyp153A(G307A)-Red450RhF também foi amplificado a partir de pEP125 e clonado em um vetor derivado de pCL1920 (replicon SC101, marcador de resistência à espectinomicina), de tal forma que sua transcrição fosse controlada pelo promotor Vtrc indutível por IPTG e ele formou um óperon com genes que codificam uma tioesterase de planta (fatB1), uma variante de 3-ceto-acil-ACP sintase (fabB) e um regulador da transcrição (fadR). O plasmídeo foi denominado pLC81 (veja a Tabela 4, infra).

[00128] Plasmídeos adicionais foram criados da seguinte forma: O gene que codifica uma tioesterase de planta (fatB1) de Umbellularia californica foi sintetizado como DNA códon-otimizado e clonado em um vetor derivado de pCL1920 (replicon SC101, marcador de resistência à espectinomicina), de tal forma que sua transcrição fosse controlada pelo promotor Vtrc indutível por IPTG e ele formou um óperon com genes que codificam acetil-CoA carboxilase (accDACB), biotina ligase (birA) e a proteína carreadora de acil. O plasmídeo foi denominado pNH305 (veja a Tabela 4, infra). O plasmídeo pAS033 foi criado por substituição de fatB1 em pNH305 com a tioesterase de planta sintética códon-otimizada (fatA3) de Arabidopsis thaliana (veja a Tabela 4, infra). O plasmídeo pEP146 foi criado por substituição de fatB1 em pLC81 com uma tioesterase de planta sintética códon-otimizada (fatA3) de Arabidopsis thaliana (veja a Tabela 4, infra). pEP146 também efetuou uma mutação na proteína repA codificada pelo plasmídeo.

[00129] As cepas de base usadas para transformação de plasmídeo foram GLP077 e BZ128. Resumidamente, o genoma da cepa de base GLPH077 foi manipulado da seguinte forma: o gene de acil-CoA desidrogenase (fadE) foi deletado e um regulador da transcrição (fadR) e um óperon sintético da biossíntese de ácido graxo foram superexpressos. Resumidamente, o genoma da cepa de base BZ128 foi manipulado da seguinte forma: o gene fadE (acil-CoA desidrogenase) foi deletado e um óperon sintético da biossíntese de ácido graxo, uma β-hidr0xi acil graxo-ACP desidratase (fabZ) e uma variante de uma tioesterase (tesA) foram superexpressos. Além disso, a cepa havia sido submetida previamente à mutagênese e avaliação por transposon e também N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Tabela 4: Plasmídeos usados para avaliação da biblioteca.

[00130] A proteína de fusão híbrida cyp153A(G307A)- Red450RhF foi testada para ver se a expressão em células hospedeiras poderia produzir derivados de ácido graxo w-OH. Um microorganismo que expressa a SEQ ID N°: 5 era capaz de produzir mais de 1 g/L de derivados de ácido graxo w-OH a partir de glicose. Dessa forma, essa enzima modificada geneticamente foi selecionada para estudos de evolução adicionais.

EXEMPLO 2: Bibliotecas de saturação do domínio catalítico de P450 da proteína de fusão cyp153A(G307A)- Red450RhF

[00131] Uma biblioteca de saturação total do domínio catalítico de P450 da proteína de fusão cyp153A-Red450RhF foi construída e avaliada quanto às variantes que exibissem aprimoramentos em relação a cyp153A(G307A)-Red450RhF (ou seja, o polipeptídeo-modelo). G307A (ou seja, um resíduo de alanina substituiu uma glicina na posição 307) é uma mutação benéfica que aumenta a atividade de w-hidroxilase de cyp153A (veja Honda Malca e cols. (2012) Chem. Commun. 48: 5.115). Os critérios de seleção para hits foram: (1) quantidade aumentada de ácidos graxos w-hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) conversão aumentada de ácidos graxos em ácidos graxos w-hidróxi.

[00132] Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Os plasmídeos pEP125 e pLC81 (veja a Tabela 4, supra) foram usados para produzir as bibliotecas de saturação total. Três bibliotecas de saturação foram avaliadas: para a primeira biblioteca, pEP125 foi transformado junto com pNH305 na cepa GLPH077, para a segunda biblioteca pLC81, foi transformado em BZ128, e para a terceira biblioteca, pEP125 foi transformado junto com pAS.033 na cepa GLPH077. A primeira biblioteca e a segunda biblioteca foram avaliadas em particular quanto às variantes aprimoradas na formação de ácido w-hidróxi dodecanóico e a terceira biblioteca foi avaliada em particular quanto às variantes aprimoradas na formação de ácido w-hidróxi hexadecenóico. As bibliotecas foram avaliadas com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As variantes aprimoradas são mostradas nas Tabelas 5 a 7 abaixo (infra). Em particular, variantes da posição 141 foram identificadas várias vezes e foi constatado que são enzimas significantemente aprimoradas tanto para a formação de ácido w-hidróxi dodecanóico quanto para a formação de ácido w-hidróxi hexadecenóico. Tabela 5: Resumo de variantes aprimoradas da primeira biblioteca de saturação de sítios do domínio catalítico de cyp153A(G307A)-Red450RhF. FIOC: Razão de aumento em relação ao controle; o controle está em negrito Tabela 6: Resumo de variantes aprimoradas da segunda biblioteca de saturação de sítios domínio catalítico de cyp153A(G307A) -Red450RhF. FIOC: Razão de aumento em relação ao controle; o controle está em negrito. Tabela 7: Resumo de variantes aprimoradas da terceira biblioteca de saturação de sítios do domínio catalítico de cyp153A(G307A)-Red450RhF. FIOC: Razão de aumento em relação ao controle; o controle está em negrito.

EXEMPLO 3: Bibliotecas de saturação parcial de sítios do domínio de redutase da proteína de fusão cyp153A(G307A)- Red450RhF

[00133] Uma biblioteca de saturação parcial (todo 10° aminoácido foi mutado) dos domínios de redutase da proteína de fusão híbrida cyp153A-Red450RhF foi construída e avaliada quanto às variantes que exibissem aprimoramentos em relação a cyp153A(V141I, A231T, G307A)-Red450RhF (SEQ ID N°: 32), uma variante identificada na biblioteca de mutagênese por saturação de sítios do domínio catalítico de P450 cyp153A. Os critérios de seleção para hits foram: (1) quantidade aumentada de ácido w-hidróxi dodecanóico (titulação de FFA wOH); e/ou (2) conversão aumentada de ácido dodecanóico em ácido w-hidróxi dodecanóico.

[00134] Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Para a biblioteca, pLC81 que abriga cyp153A(V141I, A231T, G307A)-Red450RhF foi transformado em BZ128. A biblioteca foi avaliada com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As variantes aprimoradas são mostradas na Tabela 8. Em particular, as variantes A796V (SEQ ID N°: 42) e P666A eram enzimas significantemente aprimoradas. Tabela 8: Resumo de variantes aprimoradas de uma biblioteca de saturação parcial do domínio de redutase de cyp153A(V141I A231T G307A)-Red450RhF. FIOC: Razão de aumento em relação ao controle; o controle está em negrito.

EXEMPLO 4: Biblioteca combinatória do domínio de redutase da proteína de fusão cyp153A(G307A)-Red450RhF

[00135] Mutações benéficas identificadas na biblioteca de saturação parcial do domínio de redutase (Exemplo 3) foram a base de uma biblioteca combinada para aprimorar ainda mais a proteína de fusão cyp153A(G307A)- Red450RhF. Os critérios de seleção foram: (1) quantidade aumentada de ácido w-hidróxi dodecanóico (titulação de FFA wOH); e/ou (2) conversão aumentada de ácido dodecanóico em ácido w-hidróxi dodecanóico.

[00136] A biblioteca combinada foi construída em pLC81 que abriga cyp153A(V141I, A231T, G307A)-Red450RhF (SEQ ID N°: 32) e transformada em BZ128. Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas combinadas. A biblioteca foi avaliada com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As variantes aprimoradas são mostradas na Tabela 9 abaixo. Tabela 9: Resumo de variantes aprimoradas de uma biblioteca combinada do domínio de redutase de cyp153A(V141I, A231T, G307A)-Red450RhF. FIOC: Razão de aumento em relação ao controle; o controle está em negrito.

EXEMPLO 5: Biblioteca combinatória do domínio catalítico e de redutase da proteína de fusão cyp153A(G307A)-Red450RhF

[00137] Mutações benéficas identificadas nas bibliotecas de saturação (Exemplos 2 e 3) foram a base de uma biblioteca combinada para aprimorar ainda mais a proteína de fusão cyp153A(G307A)-Red450RhF. Os critérios de seleção foram: (1) quantidade aumentada de ácido w-hidróxi dodecanóico (titulação de FFA wOH); e/ou (2) conversão aumentada de ácido dodecanóico em ácido w-hidróxi dodecanóico. A biblioteca combinada foi construída em pLC81 e transformada em BZ128. Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas combinadas. A biblioteca foi avaliada com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As duas melhores variantes aprimoradas são mostradas na Tabela 10. Tabela 10: Melhores variantes aprimoradas de uma biblioteca combinatória de cyp153A(G307A)-Red450RhF. * Titulação (mg/L) após 48 h

EXEMPLO 6: Mutagênese de saturação de sítios das posições 141 e 309 de cyp153A(G307A, A796V)-Red450RhF

[00138] Foi observado que alterações na posição 141 influenciaram a especificidade de substrato. Portanto, uma mutagênese por saturação de sítios dessas duas posições foi realizada em cyp153A(G307A, A796V)-Red450RhF. Os critérios de seleção para hits foram: (1) quantidade aumentada de ácido w-hidróxi hexadecenóico; e/ou (2) conversão aumentada de ácido hexadecenóico em ácido w-hidróxi hexadecenóico.

[00139] Para a biblioteca, pEP146 que abriga cyp153A(G307A A796V)-Red450RhF (SEQ ID N°: 38) foi transformado em BZ128. Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar site bibliotecas de saturação. A biblioteca foi avaliada com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As variantes aprimoradas são mostradas na Figura 2. Em particular, as variantes com V141T (SEQ ID N°: 46) mostraram a maior titulação de ácido w-hidróxi hexadecenóico e a maior conversão a partir de ácido hexadecenóico.

EXEMPLO 7: Bibliotecas de saturação da proteína de fusão cyp153A(G307A)-Red450RhF(A796V)

[00140] Uma biblioteca de saturação total da proteína de fusão cyp153A-Red450RhF foi construída e avaliada quanto às variantes que exibissem aprimoramentos em relação a cyp153A(G307A)-Red450RhF(A796V) (ou seja, o polipeptídeo-modelo). G307A (ou seja, um resíduo de alanina substituiu uma glicina na posição 307) e A796V (ou seja, um resíduo de valina substituiu uma alanina na posição 796) são mutações benéficas que aumentam a atividade de w- hidroxilase de cyp153A (veja acima). Os critérios de seleção para hits foram: (1) uma quantidade aumentada de ácidos graxos w-hidróxi (titulação de FFA w-OH); e/ou (2) conversão aumentada de ácidos graxos em ácidos graxos w- hidróxi.

[00141] Metodologias padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar a biblioteca de saturação. O plasmídeo pEP302 foi usado para produzir a biblioteca de saturação total, que era um derivado de pEP146 (veja tabela 4), no qual a ordem dos genes foi alterada (fatA3-fadB-fadR-cyp153A(G307A)- Red450RhF(A796V)) e o último gene foi expresso por um promotor separado. A biblioteca foi transformada na cepa stNH1525. Resumidamente, o genoma da cepa de base stNH1525 foi manipulado da seguinte forma: o gene fadE (acil-CoA desidrogenase) foi deletado e um óperon sintético da biossíntese de ácido graxo foi superexpresso. Além disso, a cepa havia sido submetida previamente à mutagênese e avaliação por transposon e N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG).

[00142] As bibliotecas foram avaliadas com o uso de um dos protocolos padronizados descritos acima. As variantes aprimoradas são mostradas na Tabela 11 abaixo, em particular, variantes que aumentaram significantemente a ácido w-hidróxi hexadecanóico e a formação de ácido w- hidróxi hexadecenóico. Tabela 11: Resumo de variantes aprimoradas pela biblioteca de saturação de sítios de cyp153A(G307A)-Red450RhF(A976V). FOIC : Razão de aumento em relação ao controle interno; o controle está em negrito.

[00143] Como é evidente para aqueles versados na técnica, diversas modificações e variações dos aspectos e ser feitas sem se afastar do revelação. Essas modificações e escopo dessa revelação.

Claims

1. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase caracterizada pelo fato da variante ser uma variante de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID N°: 38 e que possui pelo menos uma mutação em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 9, 10, 12, 13, 14, 28, 61, 119, 327, 413, 703, 745, 747, 749, 757, 770, 771, or 784 da SEQ ID NO: 38, em que a referida variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo em um u-hidroxi-ácido graxo.

2. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma variante da proteína de fusão híbrida CYP 153A-RedRhF.

3. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase possui um ou mais mutações que correspondem a D9N, D9K, D10Y, I11L, Q12W, Q12R, Q12T, S13K, R14F, Q28M, Q28T, N61L, K119R, A231Y, S233L, P327D, Y413R, L703G, P745R, D747N, E749L, E757A, T770G, V771F, ou M784I.

4. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que possui ainda uma mutação na posição de aminoácido que corresponde a uma ou mais posições 6, 11, 27, 40, 41, 56, 82, 111, 116, 129, 131, 132, 134, 136, 138, 140, 141, 142, 144, 149, 153, 154, 157, 161, 162, 164, 168, 178, 204, 205, 208, 231, 233, 244, 254, 258, 271, 273, 302, 304, 307, 308, 309, 407, 415, 419, 477, 480, 481, 516, 527, 544, 546, 557, 567, 591, 648, 649, 666, 696, 706, 707, 708, 709, 710, 719, 720, 736, 741, ou 796 da SEQ ID NO:38.

5. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que possui um ou mais mutações que correspondem a R6F, I11C, R27L, R 40H, K41V, P56Q , R82D, F111A, F116R, Q129R, I131L, L132T, D134G, P136T, P136C, G138F, S140N, V141Q, V141G, V141I, V141T, V141M, V141L, E142Q, E142R, F144R, P149R, P149G, D153G, V154G, V154A, S157R, S157V, G161P, G161A, V162C, A164N, L168V, R178N, G204V, R205L, M228R, A231W, A231V, A231T, S233R, S233N, S233V, A244R, R254G, R258Y, E271D, E271F, P273M, T302M, L304W, G307A, G308W, N309R, N309S, N407G, N407A, V415R, M419V, P477G, I480G, G481I, T516E, T516G, T516V, D527E, D544N, P546G, E557W, E557R, E567S, E591Q, V648L, S649I, P666A, P666H, P666D, P666K, P666M, V696K, V696T, L706E, L706H, L706S, D707E, P708S, D709L, V710C, V710Q, V710R, R719W, D720V, A736V, N741G, P745K, E749M, ou A796V.

6. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a expressão da referida variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase em uma célula hospedeira microbiana recombinante resulta em uma titulação maior de um w-hidroxi-ácido graxo, quando comparada com uma titulação de um w-hidroxi-ácido graxo produzido por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase da SEQ ID N°: 38.

7. Variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por consistir na sequência de aminoácidos conforme estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94 e SEQ ID NO: 96.

8. Célula microbiana recombinante caracterizada por expressar a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Célula microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por expressar ainda uma tioesterase ou uma éstersintase.

10. Célula microbiana recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizada pela célula microbiana recombinante produzir um w-hidroxi-ácido graxo ou um derivado do mesmo.

11. Célula microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo: w-hidroxi-ácido graxo ou um derivado do mesmo ser produzido intracelularmente ou extracelularmente; w-hidroxi-ácido graxo ou um derivado do mesmo ser um ou mais de um w-hidroxi-ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, ou C20 saturado ou insaturado; e w-hidroxi-ácido graxo ou um derivado do mesmo ser um w- hidroxi-ácido graxo, um w-hidroxi-éster graxo, um α,w- diácido, um a,w-diéster, ou um α,w-diol.

12. Célula microbina recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por produzir uma composição de w-hidroxi-ácido graxo com uma titulação que é pelo menos 10% maior, pelo menos 15% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 25% maior, ou pelo menos 30% maior do que a titulação de uma composição de w-hidroxi-ácido graxo produzido por uma célula microbiana que expressa um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase de SEQ ID NO: 38, quando cultivada em meio contendo uma fonte de carbono.

13. Cultura de células microbianas caracterizada por compreender a célula microbiana recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 12.

14. Cultura de células microbianas, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que produz um ou mais de um w-hidroxi ácido graxo C12, C16, e C16:1.

15. Método de produção de um w-hidroxi ácido graxo ou um derivado de w-hidroxi ácido graxo, caracterizado por compreender: i. cultivar a célula microbiana, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 12, com uma fonte de carbono; e ii. coletar o w-hidroxi ácido graxo ou derivado do w- hidroxi ácido graxo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido w-hidroxi ácido graxo ou derivado do w-hidroxi ácido graxo é um w-hidroxi ácido graxo ou derivado do w-hidroxi ácido graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, ou C20 saturado ou insaturado.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o referido w-hidroxi ácido graxo ou derivado do w-hidroxi ácido graxo é um w-hidroxi-ácido graxo, um w-hidroxi-éster graxo, um a,w-diácido, um a,w-diéster, ou um α,w-diol.