BR122019026987B1 - Polipeptídeo variante da ácido carboxílico redutase (car), célula hospedeira recombinante, cultura de células e método de produzir uma composição de álcool graxo com alto título, rendimento ou produtividade - Google Patents

Abstract

polipeptídeo variante da ácido carboxílico redutase (car), célula hospedeira recombinante, cultura de células e método de produzir uma composição de álcool graxo com alto título, rendimento ou produtividade. a presente invenção refere-se a enzimas variantes de ácido carboxílico redutase (car)pra melhoramento da produção de álcool graxos em células recombinantes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N° 61/619.309 depositado em 2 de abril de 2012, aqui incorporado por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O pedido instantâneo contém uma lista de sequências, a qual foi apresentada em formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 02 de abril de 2013, é nomeada LS00039PCT_SL.txt e possui 89.038 bytes de tamanho.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0003] A divulgação refere-se a enzimas ácido carboxílico redutase (CAR) variantes, para a produção melhorada de alcoóis graxos em células hospedeiras recombinantes. A publicação refere-se ainda a ácidos nucleicos e polipeptídeos CAR variantes, bem como células hospedeiras recombinantes e culturas de células. Além disso, são englobados métodos de preparação de composições de álcool graxo.

CONTEXTO DA PUBLICAÇÃO

[0004] Alcoóis graxos formam uma categoria importante de compostos bioquímicos industriais. Estas moléculas e seus derivados têm numerosos usos, como surfactantes, lubrificantes, plastificantes, solventes, emulsificantes, emolientes, agentes espessantes, aromatizantes, fragrâncias, e combustíveis. Na indústria, alcoóis graxos são produzidos por meio de hidrogenação catalítica de ácidos graxos produzidos a partir de fontes naturais, tais como óleo de coco, óleo de palma, óleo de palmiste, sebo e banha de porco, ou por hidratação química de alfa-olefinas produzida a partir de fonte petroquímica. Alcoóis graxos derivados de fontes naturais têm diferentes comprimentos de cadeia. O comprimento de cadeia de alcoóis graxos é importante no que diz respeito a aplicações particulares. Na natureza, os alcoóis graxos são também produzidos por enzimas que são capazes de reduzir moléculas de acil-ACP ou acil-CoA para os alcoóis primários correspondentes (ver, por exemplo, a Publicação das Patentes Americanas Nos. 20100105955, 20100105963, 20110250663, que estão incorporadas aqui por referência).

[0005] As tecnologias atuais para a produção de alcoóis graxos envolvem redução inorgânica mediada por catalisador de ácidos graxos para os alcoóis primários correspondentes, o que é dispendioso, demorado e trabalhoso. Os ácidos graxos utilizados neste processo são derivados de fontes naturais {por exemplo, óleos vegetais e animais, e gorduras, supra). A desidratação de alcoóis graxos para alfa-olefinas também pode ser realizada por catálise química. No entanto, esta técnica não é renovável e associada a alto custo operacional e resíduos químicos perigosos para o ambiente. Assim, existe uma necessidade de métodos melhorados para a produção de álcool graxo e esta publicação responde à esta necessidade.

SUMÁRIO

[0006] Um aspecto da invenção fornece um polipeptídeo da enzima ácido carboxílico redutase (CAR) variante, que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência com a SEQ ID NO: 7, onde o polipeptídeo CAR variante é geneticamente manipulado para ter pelo menos uma mutação na posição de um aminoácido selecionado a partir do grupo de posições de aminoácido 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, e 1128. Aqui, a expressão do polipeptídeo variante CAR em uma célula hospedeira recombinante resulta num título mais elevado de composições de álcool graxo em comparação com uma célula hospedeira recombinante que expressa um polipeptídeo correspondente tipo selvagem. Num aspecto relacionado, o polipeptídeo é um polipeptídeo CarB. Num outro aspecto relacionado, o polipeptídeo CAR variante compreende uma mutação nas posições S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L, R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, M930K, M930R e/ou L1128W. Num aspecto relacionado, o polipeptídeo CAR inclui mutação A535S; ou mutações E20R, F288G, Q473I e A535S; ou mutações E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A e S927G; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827A e S927G; ou mutações S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R e L1128W; ou E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R e L1128W; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930K e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, S927K e M930R; ou mutações D18R, E20R, 288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, M930K e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, V926A, S927K e M930R; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S e R827C; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C e M930R; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L, S927G e M930R; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L e S927G; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, V926A e S927G; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L e L1128W; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, S927G e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, M930K e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, I870L, S927G e M930K; ou mutações E20R, F288G, Q473I, A535S, I870L, M930K; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, S927G, M930K e L1128W; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S,, R827C, I870L e S927G; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G e L1128W; ou mutações D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930R e L1128W; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, V926E, S927G e M930R; ou mutações E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, V926A e L1128W; ou suas combinações.

[0007] Outro aspecto da invenção fornece uma célula hospedeira incluindo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de polipeptídeo ácido carboxílico redutase (CAR) variante tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e que tem pelo menos uma mutação na posição de aminoácido incluindo as posições de aminoácidos 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, e 1128, onde a célula hospedeira geneticamente modificada produz uma composição de álcool graxo a um título ou rendimento mais elevado que uma célula hospedeira expressando um polipeptídeo tipo selvagem CAR quando cultivadas num meio contendo uma fonte de carbono sob condições efetivas para expressar o polipeptídeo CAR variante correspondente, e em que a SEQ ID NO: 7 é o polipeptídeo CAR tipo selvagem correspondente. Num aspecto relacionado, a célula hospedeira recombinante inclui ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tioesterase. Num outro aspecto, a célula hospedeira recombinante inclui ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo FabB e um polipeptídeo FadR. Num outro aspecto relacionado, a invenção fornece uma célula hospedeira recombinante que inclui um polinucleotídeo que codifica uma aldeído-graxo redutase (Alra) e uma cultura de células contendo-a.

[0008] Outro aspecto da invenção fornece uma célula hospedeira recombinante, onde a célula hospedeira geneticamente modificada tem um título que é pelo menos três vezes maior do que o título de uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo CAR tipo selvagem correspondente quando cultivadas sob as mesmas condições que a célula hospedeira geneticamente manipulada. Num aspecto relacionado, a célula hospedeira geneticamente modificada tem um título de cerca de 30 g/L a cerca de 250 g/L. Num outro aspecto, a célula hospedeira geneticamente modificada tem um título de cerca de 90 g/L a cerca de 120 g/L.

[0009] Outro aspecto da invenção fornece uma célula hospedeira recombinante, onde a célula hospedeira geneticamente modificada tem um rendimento que é pelo menos três vezes maior do que o rendimento de uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo CAR tipo selvagem correspondente quando cultivadas sob as mesmas condições que a célula hospedeira geneticamente manipulada. Num aspecto relacionado, a célula hospedeira geneticamente modificada tem um rendimento de cerca de 10% a cerca de 40%.

[0010] A publicação engloba ainda uma cultura de células incluindo a célula hospedeira recombinante tal como aqui descrito. Num aspecto relacionado, a cultura de células tem uma produtividade que é, pelo menos, cerca de 3 vezes maior do que a produtividade de uma cultura de células que expressa o polipeptídeo CAR tipo selvagem correspondente. Num outro aspecto, a produtividade varia de cerca de 0,7 mg/L/hr até cerca de 3 g/L/hr. Num outro aspecto relacionado, o meio de cultura compreende uma composição de álcool graxo. A composição de álcool graxo é produzida extracelularmente. A composição de álcool graxo pode incluir um ou mais de um álcool graxo C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17 ou C18; ou um álcool graxo insaturado C10:l C12:l C14:l C16:l ou C18:l. Num outro aspecto, a composição de álcool graxo compreende alcoóis graxos C12 e C14. Ainda, outro aspecto relacionado, a composição de álcool graxo compreende alcoóis graxos C12 e C14 numa razão de cerca de 3:1. Ainda em outro aspecto relacionado, a composição de álcool graxo engloba alcoóis graxos insaturados. Além disso, a composição de álcool graxo pode incluir um álcool graxo tendo uma ligação dupla na posição 7 da cadeia de carbono entre C7 e C8 a partir da extremidade reduzida do álcool graxo. Num outro aspecto, a composição de álcool graxo inclui alcoóis graxos saturados. Num outro aspecto, a composição de álcool graxo inclui alcoóis graxos de cadeia ramificada.

[0011] A descrição contempla ainda um método de produção de uma composição de álcool graxo com um alto título, rendimento ou produtividade elevada, incluindo as etapas da engenharia de uma célula hospedeira recombinante; cultura da célula hospedeira recombinante num meio incluindo uma fonte de carbono; e, opcionalmente, isolamento da composição de álcool graxo a partir do meio.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOD

[0012] A presente invenção é melhor entendida quando lida em conjunto com as figuras anexas, que servem para ilustrar as formas de realização preferidas. Entende-se, no entanto, que a publicação não se limita às formas de realização específicas descritas nas figuras.

[0013] A Figura 1 é um esquema geral de uma via biossintética exemplificativa para uso na produção de acil-CoA como um precursor para os derivados de ácido graxo numa célula hospedeira recombinante. O ciclo é iniciado pela condensação de malonil-ACP e acetil-CoA.

[0014] Figura 2 é um esquema geral de um ciclo de biossíntese exemplificativa de ácidos graxos, onde a malonil-ACP é produzida pela transacilação de malonil-CoA a malonil-ACP (catalisada pela malonil-CoA: ACP transacilase; FabD), então β- cetoacil-ACP sintase III (fabH) inicia a condensação do malonil-ACP com acetil-CoA. Ciclos de alongamento começam com a condensação de malonil-ACP e uma acil-ACP catalisada por β-cetoacil-ACP sintase I (fabB) e β-cetoacil-ACP sintase II (fabF) para produzir um β-cetoacil-ACP, em seguida o β-cetoacil-ACP é reduzido por uma β-cetoacil-ACP redutase dependente de NADPH (fabG) para produzir um β-hidroxiacil-ACP, que é desidratado a uma trans-2-enoil-acil-ACP desidratase pela β-hidroxiacil-ACP (fabA ou FabZ) . A FabA pode também isomerizar trans-2- enoil-acil-ACP para cis-3-enoil-acil-ACP, que pode ignorar fabI e pode ser usado por FabB (normalmente por uma cadeia alifática de comprimento até C16) para produzir de β-cetoacil-ACP. O último passo em cada ciclo é catalisado por uma enoil-ACP redutase dependente de NADH ou NADHPH (fabI) que converte trans-2-enoil-acil-ACP a acil-ACP. Nos métodos aqui descritos, o término da síntese dos ácidos graxos por tioesterase ocorre pela remoção do grupo acil de acil-ACP para liberar os ácidos graxos livres (AGL). As tioesterases (por exemplo, a TesA) hidrolisam ligações tioéster, que ocorrem entre as cadeias acil e ACP através de ligações sulfidrila.

[0015] A Figura 3 ilustra a estrutura e função do complexo enzimático acetil-CoA carboxilase (accABCD). A biotina carboxilase é codificada pelo gene accC, enquanto que a proteína transportadora de carboxil biotina (BCCP) é codificada pelo gene accB. As duas subunidades envolvidas na atividade carboxiltransferase são codificadas pelos genes e accA accD. A biotina ligada covalentemente ao BCCP transporta o radical carboxilato. O gene birA (não mostrado) biotinila o holo-accB.

[0016] A Figura 4 apresenta um esquema geral de uma via biossintética exemplificativa para a produção de álcool graxo partindo de acil-ACP, onde a produção de aldeído graxo é catalisada pela atividade enzimática da acil-ACP redutase (AAR) ou tioesterase e ácido carboxílico redutase (Car) . O aldeído graxo é convertido em álcool graxo pela aldeído redutase (também referida como álcool desidrogenase). Esta via não inclui a acil graxo-CoA sintetase (fadD).

[0017] A figura 5 ilustra a produção de ácido graxo derivado (Gorduras Totais) de E. coli cepa MG1655 com o gene fadE atenuado (ou seja, deletado) em comparação com a produção de ácidos graxos derivado de E. coli cepa MG1655. Os dados apresentados na Fig. 5 mostram que a atenuação do gene fadE não afetou a produção do ácido graxo derivado.

[0018] As figuras 6A e 6B mostram dados para a produção de "Gorduras Totais" de análises de placas duplicadas quando o plasmídio pCL-WT TRC WT TesA foi transformado em cada uma das cepas mostradas nas figuras e uma etapa de fermentação foi conduzida no meio FA2 com 20 horas da indução até a coleta a 32 °C (Figura 6A) e 37 °C (Figura 6B) .

[0019] As Figuras 7A e 7B fornecem uma representação esquemática do locus iFAB138, incluindo um diagrama do promotor cat-loxP-T5 integrada à frente do FAB138 (7A); e um diagrama de iT5_138 (7B) . A sequência do promoter cat-loxP-T5 integrada à frente do FAB 138 com 50 pares de bases de homologia mostrado em cada lado da região do promotor cat-loxP-T5 é fornecida como SEQ ID NO: l e a sequência da região promotora do iT5_138 com 50 pares de bases de homologia em cada lado é fornecida como SEQ ID NO: 2.

[0020] A figura 8 mostra o efeito da correção dos genes rph e ilvG. EG149 (rph- ilvg-) e V668 (EG149 rph+ ilvG+) foram transformadas com pCL-tesA (um plasmídio pCL1920 contendo pTRC-'tesA) obtidos de D191. A figura mostra que a correção dos genes rph e ilvG na cepa EG14 9 permite a produção de nível mais elevado AGL do que na cepa V668, onde os genes rph e ilvG não foram corrigidos.

[0021] A Figura 9 é uma representação esquemática de uma inserção de cassetes de transposon no gene yijP da cepa LC535 (transposon sucesso 68F11). Os promotores internos para o cassete de transposon são mostrados, e pode ter efeitos sobre a expressão do gene adjacente.

[0022] A Figura 10 mostra a conversão de ácidos graxos livres para alcoóis graxos pela CarB60 na cepa v324. As figuras mostram que as células que expressam CarB60 do cromossomo (barras escuras) convertem uma maior fração de ácidos graxos livres C12 e C14 em álcool graxo em comparação com CarB (barras claras).

[0023] A Figura 11 mostra que as células que expressam CarB60 a partir do cromossoma convertem uma maior fração de ácidos graxos livres C12 e C14 em álcool graxo comparado ao CarB.

[0024] A Figura 12 mostra a produção de alcoóis graxos após fermentação de mutantes de bibliotecas de combinação.

[0025] A Figura 13 mostra a produção de álcool graxo por variantes Carb na produção de plasmídio (carBl e CarB2) após a fermentação em frasco sob agitação (shake-flask fermentation).

[0026] A Figura 14 mostra a produção de álcool graxo por variantes CarB de cópia única integrados (icarBl icarB2, icarB3, e icarB4) após a fermentação em frasco sob agitação (shake-flask fermentation).

[0027] A Figura 15 mostra os resultados do sistema de triagem de dois plasmídios para variantes CarB melhoradas validados para fermentação em frasco sob agitação (shakeflask fermentation).

[0028] A Figura 16 mostra novas variantes CarB para a produção melhorada de alcoóis graxos em biorreatores.

DESCRIÇÃO DETALHADA Visão Geral

[0029] A presente invenção fornece novas enzimas variantes da ácido carboxílico redutase (CAR), bem como as suas sequências de ácidos nucleicos e proteínas. Além disso, englobados pela publicação estão as células hospedeiras recombinantes e culturas de células que incluem as enzimas variante CAR para a produção de alcoóis graxos. Para a produção de alcoóis graxos de açúcares fermentáveis ou biomassa comercialmente viável, o processo tem de ser otimizado para a conversão eficiente e recuperação do produto. A presente publicação endereça a essa necessidade ao fornecer composições e métodos para a produção melhorada de alcoóis graxos, usando enzimas variantes modificadas e células hospedeiras recombinantes modificadas. As células hospedeiras servem como biocatalisadores, resultando numa produção de título elevado de alcoóis graxos, utilizando processos de fermentação. Como tal, a descrição proporciona ainda métodos para criar células hospedeiras fotossintéticas e heterotróficas que produzem os alcoóis graxos e alfa-olefinas de comprimentos específicos de cadeia diretamente tal que a conversão catalítica de ácidos graxos purificados não é necessária. Este novo método proporciona a qualidade do produto e vantagens de custo.

[0030] Mais especificamente, a produção de uma desejada composição de álcool graxo pode ser melhorada através da modificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na via biossintética para a produção, degradação e/ou secreção de álcool graxo. A descrição proporciona células hospedeiras recombinantes, que tenham sido manipuladas para fornecer biossíntese maior de álcool graxo em relação a células hospedeiras não modificadas ou nativas (por exemplo, de melhorias das cepas). A publicação também fornece polinucleotídeos úteis nas células hospedeiras recombinantes, métodos e composições da publicação. No entanto, será reconhecido que a identidade absoluta da sequência para esses polinucleotídeos não é necessário. Por exemplo, alterações na sequência de um polinucleotídeo específico podem ser feitas e o polipeptídeo codificado avaliado para a atividade. Tais mudanças incluem tipicamente mutações conservadores e mutações silenciosas (por exemplo, otimização de códon). Polinucleotídeos modificados ou mutados (isto é, mutantes) e polipeptídeos variantes codificados podem ser selecionados para uma função desejada, tal como, uma função melhorada em comparação com o polipeptídeo parental, incluindo, mas não se limitando ao aumento da atividade catalítica, estabilidade aumentada, ou inibição diminuída (p.ex., diminuição da inibição de retorno), usando métodos conhecidos na arte.

[0031] A descrição identifica atividades enzimáticas envolvidas em várias etapas (ou seja, reações) das vias de biossíntese de ácidos graxos aqui descritos de acordo com o número de Classificação de Enzima (EC), e fornece polipeptídeos exemplares (ou seja, enzimas) categorizadas por esses EC números, e polinucleotídeos exemplares que codificam tais polipeptídeos. Esses polipeptídeos e polinucleotídeos exemplares, que são aqui identificados pelos números de acesso e/ou por números Identificadores de Sequência (ID SEQ NOs), são úteis para manipulação das vias de ácidos graxos em células hospedeiras de parentais afim de se obter as células hospedeiras recombinantes aqui descritas. É para ser entendido, no entanto, que os polipeptídeos e polinucleotídeos aqui descritos são exemplificativos e não-limitantes. As sequências de homólogos de polipeptídeos exemplares aqui descritos estão disponíveis para os peritos na arte, utilizando os bancos de dados (por exemplo, a base de dados Entrez fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), a base de dados ExPasy fornecido pelo Instituto Suíço de bioinformática, o banco de dados BRENDA fornecido pela Universidade Técnica de Braunschweig, e o banco de dados KEGG fornecido pelo Centro de Bioinformática da Universidade de Kyoto e da Universidade de Tóquio, todos estão disponíveis na World Wide web).

[0032] Uma variedade de células hospedeiras pode ser modificada para conter um álcool graxo de enzimas biossintéticas como as aqui descritas, resultando em células hospedeiras recombinantes adequadas para a produção de composições de álcool graxo. Entende-se que uma variedade de células pode fornecer fontes de material genético, incluindo sequências de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos adequados para uso numa célula hospedeira recombinante aqui fornecida.

Definições

[0033] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como usualmente entendido por um perito na arte à qual pertence a publicação. Embora outros métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática da presente publicação, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos. Ao descrever e reivindicar a presente publicação, a seguinte terminologia será utilizada de acordo com as definições estabelecidas abaixo.

[0034] Números de acesso: os números de adesão de sequência em toda esta descrição foram obtidos a partir de bancos de dados fornecidos pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantidos pelos Institutos Nacionais de Saúde, EUA (identificados aqui como "números de acesso NCBI" ou, alternativamente, como "Números de acesso ao GenBank"), e da base de Conhecimento UniProt (UniProtKB) e base de dados Swiss-Prot fornecido pelo Instituto Suíço de Bioinformática (identificados aqui como "números de adesão UniProtKB").

[0035] Número de Classificação de Enzima (EC): os números EC são estabelecidos pelo Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) , descrição a qual está disponível no site da IUBMB Nomenclatura das Enzimas na World Wide Web. Os números EC classificam as enzimas de acordo com a reação catalisada.

[0036] Tal como aqui utilizado, o termo "nucleotídeo" refere-se a uma unidade monomérica de um polinucleotídeo que é constituído por uma base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. As bases que ocorrem naturalmente (guanina, (G) , adenina (A) , citosina (C) , timina (T) e uracila (U) ) são tipicamente derivados de purina ou pirimidina, embora deva ser entendido que as que ocorrem naturalmente e os análogos de bases que não ocorrem naturalmente, também estão incluídos. O açúcar que ocorre naturalmente é a desoxirribose (que forma o DNA) pentose (açúcar com cinco carbonos) ou de ribose (que forma RA) , embora deva ser entendido que, açúcares que ocorrem naturalmente e análogos que não ocorrem naturalmente, também estão incluídos. Os ácidos nucleicos são tipicamente ligados por meio de ligações de fosfato de modo a formar ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações são conhecidas na arte (p. ex., fosforotioatos, boranofosfatos, e semelhantes).

[0037] Tal como aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" refere-se a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA), que pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos "polinucleotídeos", "sequência de ácido nucleico" e "sequência de nucleotídeos" são aqui utilizados de modo intercambiável para se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer seja RNA ou DNA. Estes termos referem-se à estrutura primária da molécula e, portanto, incluem DNA de cadeia dupla e simples e RNA de cadeia dupla e simples. Os termos incluem, como equivalentes, análogos de RNA ou DNA, quer feitos de análogos de nucleotídeos e polinucleotídeos modificados, tais como, mas não limitados a polinucleotídeos metilados e/ou com “cap’”. O polinucleotídeo pode estar em qualquer forma, incluindo, mas não limitado a plasmídio, viral, cromossômico, EST, cDNA, mRNA, e rRNA.

[0038] Tal como aqui utilizados, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados indistintamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo "polipeptídeo recombinante" refere-se a um polipeptídeo que é produzido por técnicas recombinantes, onde geralmente o DNA ou RNA codifica a proteína expressa inserida num vetor de expressão adequado, que por sua vez é utilizado para transformar uma célula hospedeira para produzir o polipeptídeo.

[0039] Tal como aqui utilizados, os termos "homólogos" e "homólogo" referem-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 50% idêntica à sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo correspondente. De preferência os polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos possuem sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou, pelo menos, cerca de 9 9% de homologia com a sequência de aminoácidos correspondente ou uma sequência de polinucleotídeo. Como aqui utilizado, o termos "homologia" de sequência e sequência "identidade" são utilizados de modo intercambiável.

[0040] Um perito na arte está familiarizado com métodos para determinar a homologia entre duas ou mais sequências. Resumidamente, os cálculos de "homologia" entre duas sequências podem ser realizados como se segue. As sequências estão alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas em uma ou ambas de uma primeira e segunda sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para um alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser ignoradas para fins de comparação). Numa forma de realização, o comprimento de uma primeira sequência que está alinhada para fins de comparação é, pelo menos, cerca de 30%, de preferência pelo menos cerca de 40%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100% do comprimento de uma segunda sequência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições dos aminoácidos ou dos nucleotídeos da primeira e da segunda sequência correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeo na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de homologia entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas entre as sequências, tendo em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzida para alinhamento ótimo entre as duas sequências.

[0041] A comparação de sequências e determinação da porcentagem de homologia entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, como BLAST (Altschul et al, J. Mol. Biol., 215(3): 403--410 (1990)). A porcentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz de Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e uma pontuação de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e uma pontuação do comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 444--453 (1970)). A porcentagem de homologia entre duas sequências de nucleotídeos também pode ser determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e uma pontuação de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso do comprimento de 1, 2 , 3, 4, 5, ou 6. Um perito na arte pode efetuar cálculos iniciais de homologia e ajustar os parâmetros do algoritmo em conformidade. Um conjunto preferido de parâmetros (e aquele que deve ser utilizado se um praticante está incerto sobre quais os parâmetros que devem ser utilizados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de homologia das reivindicações) é uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de 12, uma penalidade de extensão de lacuna estendida 4, e uma penalidade de ““ frameshift ” de 5. Os métodos de alinhamento de sequências adicionais são conhecidos nas artes de biotecnologia (ver, por exemplo, Rosenberg, BMC Bioinformatics., 6: 278 (2005); Altschul, et al, FEBS J., 272 (20): 5101-5109 (2005)).

[0042] Tal como aqui utilizado, o termo "hibridiza sob condições de baixo rigor, rigor médio, rigor elevado, ou em condições de elevado rigor" descreve as condições de hibridação e lavagem. Orientações para a realização de reações de hibridização podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Métodos aquosos e não aquosos são descritos na referência e que qualquer método pode ser usado. As condições de hibridação específicas aqui referidas são as seguintes: 1) hibridação de baixo rigor Condições -- 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido de duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS, pelo menos, a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 °C durante condições de baixo rigor); 2) hibridação de rigor médio Condições -- 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60 °C; 3) elevado rigor de hibridação Condições -- 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2X, 0,1% SDS a 65 °C; e 4) as condições de hibridação de rigor muito elevado -- 0,5 M de fosfato de sódio, 7% de SDS a 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens a 0,2X SSC, 1% SDS a 65 °C. Muitas condições de elevado rigor (4) são as condições preferidas, a menos que especificado de outra forma.

[0043] Um polipeptídeo "endógeno" refere-se a um polipeptídeo codificado pelo genoma da célula microbiana parental (também denominada "célula hospedeira") a partir da qual a célula recombinante é modificada (ou "derivada").

[0044] Um polipeptídeo "exógeno" refere-se a um polipeptídeo, que não é codificado pelo genoma da célula microbiana parental. Um polipeptídeo variante (isto é, mutante) é um exemplo de polipeptídeo exógeno.

[0045] O termo "heterólogo", geralmente significa que é derivado de uma espécie diferente, ou derivado de um organismo diferente. Tal como aqui utilizado refere-se a uma sequência nucleotídica ou uma sequência de polipeptídeo que não está naturalmente presente num organismo particular. A expressão heteróloga significa que uma proteína ou polipeptídeo é experimentalmente adicionada a uma célula que normalmente não expressa essa proteína. Como tal, heterólogo refere-se ao fato de que uma proteína transferida foi inicialmente derivada a partir de um tipo de célula diferente ou de uma espécie diferente ao destinatário. Por exemplo, uma sequência polinucleotídica endógena para uma célula vegetal pode ser introduzida numa célula hospedeira bacteriana por meio de métodos recombinantes, e o polinucleotídeo da planta é, então, um polinucleotídeo heterólogo numa célula hospedeira bacteriana recombinante.

[0046] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" de um polipeptídeo refere-se a uma porção menor de um polipeptídeo ou proteína de comprimento completo, que varie de tamanho de quatro resíduos de aminoácidos à sequência de aminoácidos completa menos um resíduo de aminoácido. Em certos trechos da presente publicação, um fragmento refere-se à sequência de aminoácidos inteira de um domínio de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um domínio de ligação ao substrato ou um domínio catalítico).

[0047] Tal como aqui utilizado, o termo "mutagênese" refere-se a um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada de uma forma estável. A mutagênese de uma sequência de ácido nucleico de codificação de uma proteína produz uma proteína mutante. Mutagênese refere-se também às mudanças nas sequências de ácidos nucleicos não codificadoras que resultam em atividade proteica modificada.

[0048] Tal como aqui utilizado, o termo "gene" refere-se a sequências de ácidos nucleicos que codificam como produto um RNA ou uma proteína, bem como sequências de ácidos nucleicos ligadas operacionalmente, afetando a expressão do RNA ou da proteína (por exemplo, tais sequências incluem, mas não estão limitadas a sequências promotoras ou acentuassomos) sequências de ácidos nucleicos ligadas operacionalmente que codificam sequências que afetam a expressão do RNA ou da proteína (por exemplo, tais sequências incluem, mas não estão limitadas a sítios de ligação de ribossomos ou sequências de controle da tradução).

[0049] As sequências de controle de expressão são conhecidas na arte e incluem, por exemplo, promotores, acentuassomos, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, sítios de entrada de ribossomo internos (IRES), e semelhantes, que fornecem a expressão da sequência de polinucleotídeo numa célula hospedeira. Sequências de controle de expressão interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição (Maniatis et ai, Science, 236: 1237-1245 (1987)). Exemplos de sequências de controle de expressão estão descritos em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0050] Nos métodos da descrição, uma sequência de controle de expressão está operacionalmente ligada a uma sequência polinucleotídica. Por "operacionalmente ligada" significa que uma sequência de polinucleotídeo e uma sequência (s) de controle de expressão estão ligadas de tal maneira a permitir a expressão do gene quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras da transcrição) são ligadas à(s) sequência(s) de controle da expressão. Promotores operativamente ligados estão localizados anteriormente à sequência polinucleotídica selecionada em termos da direção de transcrição e tradução. Acentuassomos operacionalmente ligados podem estar localizados anteriormente, internamente ou posteriormente ao polinucleotídeo selecionado.

[0051] Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico, isto é, uma sequência de polinucleotídeo, ao qual foi ligado. Um tipo de vetor útil é um epissomo (isto é, um ácido nucleico capaz de fazer replicação extra-cromossômica). Os vetores úteis são aqueles capazes de replicação e/ou expressão autônoma de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vetores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de "plasmídios", que se referem em geral, a alças DNA de cadeia dupla circular que, na sua forma de vetor, não estão ligadas ao cromossomo. Os termos "plasmídio" e "vetor" são utilizados de forma indistinta aqui, já que um plasmídio é a forma mais comummente utilizada de vetor. No entanto, também estão incluídas as outras formas de vetores de expressão que servem a funções equivalentes e que vieram a ser conhecidas na arte. Em algumas formas de, o vetor recombinante compreende, pelo menos, uma sequência incluindo (a) uma sequência de controle de expressão operacionalmente acoplado à sequência polinucleotídica; (b) um marcador de seleção acoplado operacionalmente ao polinucleotídeo; (c) uma sequência marcadora operacionalmente acoplada à sequência de polinucleotídeo; (d) uma porção de purificação operacionalmente acoplada à sequência polinucleotídica; (e) uma sequência de secreção operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo; e (f) uma sequência de direcionamento acoplada operativamente à sequência de polinucleotídeo. Os vetores de expressão aqui descritos incluem uma sequência de polinucleotídeo aqui descrito numa forma adequada para a expressão da sequência de polinucleotídeo numa célula hospedeira. Será conhecido por peritos na arte que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo pretendido, etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos nas células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos como aqui descritas.

[0052] A expressão de genes que codificam polipeptídeos em procariotos, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis direcionando a expressão a polipeptídeos de fusão ou de não-fusão. Vetores de fusão adicionam um determinado número de aminoácidos a um polipeptídeo codificado, geralmente, para os terminais amino ou carboxi do polipeptídeo recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente a uma ou mais das três seguintes finalidades: (1) para aumentar a expressão do polipeptídeo recombinante; (2) para aumentar a solubilidade do polipeptídeo recombinante; e (3) para auxiliar na purificação do polipeptídeo recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e o polipeptídeo recombinante. Isto permite a separação do polipeptídeo recombinante da porção de fusão após a purificação do polipeptídeo de fusão. Em certas formas, uma sequência polinucleotídica da descrição está operacionalmente ligada a um promotor derivado do bacteriófago T5. Em certas formas, a célula hospedeira é uma célula de levedura, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura S. cerevisiae incluem pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J., 6: 229- 234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell, 30: 933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene, 54: 113-123 (1987)), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), e picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA) . Em outras formas, a célula hospedeira é uma célula de inseto, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de baculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto em cultura (por exemplo, células Sf9) incluem, por exemplo, a série pAc (Smith et al., Mol Cell Biol., 3: 2156-2165 (1983)) e a série pVL (Lucklow et al., Virology, 170: 31-39 (1989)). Em ainda outra forma, as sequências polinucleotídicas aqui descritas podem ser expressas em células de mamíferos utilizando um vetor de expressão de mamífero. Outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas são bem conhecidos na arte; ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

[0053] Tal como aqui utilizado "Acil-CoA " refere-se a um tioéster de acil formado entre o carbono do carbonil do alquil e o grupo sulfidril do radical 4'-fosfopantetionil da coenzima A (CoA), que possui a fórmula R-C(0)S-CoA, onde R é um grupo alquil tendo pelo menos 4 átomos de carbono.

[0054] Tal como aqui utilizado "acil-ACP" refere-se a um tioéster de acil formado entre o carbono do carbonil da cadeia alquil e o grupo sulfidril da porção fosfopanteteinil de uma proteína transportadora de acil (ACP) . A porção fosfopanteteinil é ligada após a etapa de tradução a um resíduo serina conservado na ACP pela ação da proteína transportadora de holo-acil sintase (ACPS), uma fosfopanteteinil transferase. Em algumas formas, um acil-ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs totalmente saturados. Em outras formas, um acil-ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs insaturados. Em algumas formas, a cadeia de carbono terá cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 carbonos. Cada um destes acil-ACPs é substrato para enzimas que os convertem em derivados de ácidos graxos.

[0055] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido graxo ou seu derivado” significa um “ácido graxo” ou “um derivado de ácido graxo”. O termo “ácido graxo” significa um ácido carboxílico tendo a fórmula RCOOH. R representa um grupo alifático, de preferência um grupo alquil. R pode compreender entre cerca de 4 e cerca de 22 átomos de carbono. Os ácidos graxos podem ser saturados, mono-insaturados, ou poli-insaturados. Em uma forma preferida, o ácido graxo é produzido a partir de uma via de biossíntese de ácidos graxos. O termo “derivado de ácido graxo” significa produto feito, em parte, da via biossintética de ácido graxo do organismo hospedeiro. “Derivado de ácido graxo” também inclui produtos constituídos, em parte, de acil-ACP ou derivados acil-ACP. Exemplos de derivados de ácido graxo incluem, por exemplo, acil-CoA, aldeídos graxos, alcoóis graxos de cadeia curta e longa, hidrocarbonetos, e ésteres (por exemplo, ceras, ésteres de ácidos graxos, ou ésteres graxos).

[0056] Tal como aqui utilizado, o termo "via biossintética do ácido graxo" significa uma via biossintética que produz derivados de ácidos graxos, por exemplo, alcoóis graxos. A via de biossíntese de ácidos graxos inclui sintases de ácidos graxos que podem ser modificadas para produzir os ácidos graxos, e em algumas formas podem ser expressas com enzimas adicionais para a produção de derivados de ácidos graxos, como alcoóis graxos possuindo as características desejadas.

[0057] Tal como aqui utilizado, "aldeído graxo" significa um aldeído possuindo a fórmula RCHO caracterizado por um grupo carbonil (C=0). Em algumas formas, o aldeído graxo é qualquer aldeído produzido a partir de um álcool graxo. Em certas formas, o grupo R é de, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19, átomos de carbono de comprimento. Alternativamente, ou em adição, o grupo R é de 2 0 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, ou 6 ou menos átomos de carbono de comprimento. Assim, o grupo R pode ter um grupo R ligado por quaisquer dos dois pontos de extremidade acima. Por exemplo, o grupo R pode ser de 6-16 carbonos de comprimento, 10-14 carbonos de comprimento, ou 12-18 carbonos de comprimento. Em algumas formas, o aldeído graxo é um aldeído graxo de C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, ou um C26. Em certas formas, o aldeído graxo é um aldeído graxo de C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, ou C18.

[0058] Tal como aqui utilizado, "álcool graxo" significa um álcool com a fórmula ROH. Em algumas formas, o grupo R é de, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19, átomos de carbono de comprimento. Alternativamente, ou em adição, o grupo R é de 2 0 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, ou 6 ou menos átomos de carbono de comprimento. Assim, o grupo R pode ter um grupo R ligado por quaisquer dos dois pontos de extremidade acima. Por exemplo, o grupo R pode ser 6-16 carbonos de comprimento, 10-14 carbonos de comprimento, ou 12-18 carbonos de comprimento. Em algumas formas, o álcool graxo é um álcool graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, ou C26. Em certas formas, o álcool graxo é um álcool graxo C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, ou C18.

[0059] Uma "composição de álcool graxo", como aqui referida é produzida por uma célula hospedeira recombinante e, tipicamente, compreende uma mistura de alcoóis graxos. Em alguns casos, a mistura inclui mais de um tipo de produto (por exemplo, alcoóis graxos e ácidos graxos). Em outros casos, as composições de derivados de ácidos graxos podem compreender, por exemplo, uma mistura de alcoóis graxos com diversos comprimentos de cadeia e saturação ou ramificações características. Em outros casos ainda, o álcool graxo compreende uma mistura de mais de um tipo de produto e produtos com diferentes comprimentos de cadeia e de saturação ou ramificações características.

[0060] Uma célula hospedeira geneticamente modificada para produzir um aldeído graxo tipicamente irá converter parte do aldeído graxo em um álcool graxo. Quando uma célula hospedeira, que produz os alcoóis graxos é modificada para expressar um polinucleotídeo que codifica uma éster sintase, ésteres de cera são produzidos. Numa forma, os alcoóis graxos são produzidos a partir de uma via de biossíntese de ácidos graxos. Como um exemplo, Acil-ACP pode ser convertido em ácidos graxos através da ação de uma tioesterase (por exemplo, E. coli TesA) , os quais são convertidos em aldeídos graxos e alcoóis graxos através da ação de uma redutase do ácido carboxílico (por exemplo, E. coli CarB). A conversão de aldeídos graxos a alcoóis graxos pode ser ainda mais facilitada, por exemplo, através da ação de um polipeptídeo biossintético de álcool graxo. Em algumas formas, um gene que codifica um polipeptídeo de álcool graxo biossintético é expresso ou super-expresso na célula hospedeira. Em certas formas, o polipeptídeo biossintético álcool graxo tem atividade de aldeído redutase ou de álcool desidrogenase. Exemplos de polipeptídeos de álcool desidrogenase úteis de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a AlrA de Acinetobacter sp. Ml (SEQ ID NO: 3) ou homólogos AlrA, tais como AlrAad l (SEQ ID NO: 4) e álcool desidrogenases endógenas de E. coli, tais como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 5), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719) , YahK (NP_414859) , YphC (AAC75598) , yqhD (446856) e YbbO [AAC73595.1]. Exemplos adicionais estão descritos na Publicação dos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO2007/136762, WO2008/119082 e WO2010/062480, cada um dos quais é expressamente incorporada por referência neste documento. Em certas formas, o polipeptídeo biossintético de álcool graxo tem atividade de aldeído redutase ou álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) .

[0061] Tal como aqui utilizado, o termo "álcool desidrogenase" refere-se a um polipeptídeo capaz de catalisar a conversão de um aldeído para um álcool graxo (por exemplo, álcool graxo). Um perito na arte irá apreciar que determinadas álcool desidrogenases são capazes de catalisar outras reações, e tais álcool desidrogenases não específicas também são abrangidas pelo termo "álcool desidrogenase". O grupo R de um ácido graxo, aldeído graxo ou álcool graxo pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada. Cadeias ramificadas podem ter mais do que um ponto de ramificação e pode incluir cadeias cíclicas. Em algumas formas, o ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado ou o álcool graxo ramificado é um ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado ou o álcool graxo ramificado C6, C7, C8, C9, C10, Cll C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 ou C26. Em algumas formas particulares, o ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado ou álcool graxo ramificado é um o ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado ou álcool graxo ramificado C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 ou C18. Em certas formas, o grupo hidroxil do ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado, ou álcool graxo ramificado está na posição primária (C1) . Em certas formas, o ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado, ou álcool graxo ramificado é um ácido graxo iso, aldeído graxo iso, ou álcool graxo iso, ou um ácido graxo anteiso, um aldeído graxo anteiso, ou álcool graxo anteiso. Em formas exemplificativas, o ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado, ou álcool graxo ramificado é selecionado a partir de um ácido graxo ramificado, aldeído graxo ramificado, ou álcool graxo ramificado iso-C?:0, iso-C8:0, iso-C9:0, iso-C10:0, iso-C11:0, iso-C12:0, iso-C13:0, iso-C14:0, iso-Ci5:0, iso-Ci6:0, iso-Ci7:0, iso — Ci8:0, iso — Ci9:0, anteiso- C7:0, anteíso-C8:0, anteíso-C9:0, anteíso-Ci0:0, anteíso-Cii:o, anteíso-Ci2:o anteíso-Ci3:o, anteíso-Ci4:o, anteíso-Ci5:o, anteíso-Ci6:o, anteíso-Ci7:o, anteíso-Ci8:o, e anteíso-Ci9:0. O grupo R de um ácído graxo ramífícado ou não ramífícado, aldeído graxo ramificado ou não ramificado, ou álcool graxo ramificado ou não ramificado pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, o grupo R pode ter um ou mais que um ponto de insaturação. Em algumas formas, o ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou álcool graxo insaturado é um ácido graxo monoinsaturado, aldeído graxo monoinsaturado, ou álcool graxo monoinsaturado. Em certas formas, o ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou de álcool graxo insaturado é um ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou de álcool graxo insaturado C6:l, C7:l, C8:l, C9:l C10:l, Cl1:1, C12:l C13:l, C14:l C15:l C16:l C17:l C18:l, C19:l C20:l C21:l, C22:l, C23:l, C24:l, C25:l, ou C26:l. Em certas formas preferidas, o ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou álcool graxo insaturado é C10:l C12:l C14:l C16:l, ou C18:l. Em outras formas ainda, o ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou álcool graxo insaturado é insaturado na posição omega-7. Em certas formas, o ácido graxo insaturado, aldeído graxo insaturado, ou álcool graxo insaturado compreende uma ligação dupla cis.

[0062] Tal como aqui utilizado, uma "célula hospedeira" recombinante ou modificada é uma célula hospedeira, por exemplo, um microorganismo que tenha sido modificado de tal modo que produza alcoóis graxos. Em algumas formas, a célula hospedeira recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos, cada polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo aldeído graxo e/ou atividade da enzima biossintética de álcool graxo, onde a célula hospedeira recombinante produz uma composição de álcool graxo quando cultivadas em presença de uma fonte de carbono em condições efetivas para expressar os polinucleotídeos.

[0063] Tal como aqui utilizado, o termo "clone" refere-se tipicamente a uma célula ou grupo de células descendentes e essencialmente idênticas geneticamente, de um único antepassado comum, por exemplo, uma bactéria ou de uma colônia bacteriana clonada surgida de uma única célula bacteriana.

[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "cultura" refere-se a um meio líquido contendo células viáveis. Numa forma, a cultura compreende células se reproduzindo num meio de cultura predeterminado, sob condições controladas, por exemplo, uma cultura de células hospedeiras recombinantes cultivadas em meio líquido, incluindo uma fonte de carbono e de nitrogênio selecionadas. "Cultura" ou "cultivo" refere-se ao crescimento de uma população de células microbianas sob condições adequadas num meio líquido ou sólido. Em formas específicas, a cultura refere-se à bioconversão fermentativa de um substrato a um produto final. Os meios de cultura são bem componentes e componentes individuais de tais meios de cultura estão disponíveis comercialmente, por exemplo, sob as marcas Difco™ e BBL™. Num exemplo não-limitativo, o meio nutriente aquoso é um "meio rico" abrangendo fontes complexas de nitrogênio, sais, e de carbono, tais como o meio YP, que compreende 10 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura. A célula hospedeira pode ser adicionalmente manipulada para assimilar eficientemente o carbono e utilizar materiais a base de celulose como fontes de carbono de acordo com métodos descritos, por exemplo, nas patentes americanas 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; 5.602.030 e WO2010127318, cada uma das quais é expressamente incorporada por referência neste documento. Além disso, a célula hospedeira pode ser manipulada para expressar uma invertase de modo que a sacarose pode ser utilizada como fonte de carbono.

[0065] Tal como aqui utilizado, o termo "sob condições efetivas para expressar as ditas sequências de nucleotídeos heterólogos" significa quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira produza um aldeído graxo ou álcool graxo desejado. As condições adequadas incluem, por exemplo, as condições de fermentação.

[0066] Tal como aqui utilizado, "modificado" ou uma "alteração do nível de” atividade de uma proteína, por exemplo uma enzima, em uma célula hospedeira recombinante refere-se a uma diferença de uma ou mais características da atividade determinada em relação à célula parental ou célula hospedeira nativa. Tipicamente, as diferenças na atividade são determinadas entre uma célula hospedeira recombinante, tendo a atividade modificada, e a célula hospedeira correspondente do tipo selvagem (por exemplo, a comparação de uma cultura de célula hospedeira recombinante em relação à cultura da célula hospedeira do tipo selvagem). Atividade modificada pode ser o resultado de, por exemplo, quantidades modificadas de proteína expressa por uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, como resultado de número aumentado ou diminuído de cópias de sequências de DNA que codificam a proteína, aumento ou diminuição do número de RNAm transcritos que codificam a proteína, e/ou um aumento ou diminuição da quantidade de proteína traduzida a partir do RNAm); alterações na estrutura da proteína (por exemplo, as alterações da estrutura primária, tais como, alterações da sequência de codificação da proteína que resultam em alterações na especificidade pelo substrato, alterações nos parâmetros cinéticos observados); e as alterações na estabilidade da proteína (por exemplo, aumento ou diminuição da degradação da proteína). Em algumas formas, o polipeptídeo é um mutante ou uma variante de qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos. Em certos casos, as sequências de codificação para os polipeptídeos aqui descritos são códons otimizados para a expressão numa célula hospedeira particular. Por exemplo, para a expressão em E. coli, um ou mais códons podem ser otimizados, como descrito em, por exemplo, Grosjean et al., Gene. 18:199-209 (1982).

[0067] O termo "sequências reguladoras" como aqui utilizado, tipicamente refere-se a uma sequência de bases no DNA, operacionalmente ligada a sequências de DNA que codificam uma proteína que por sua vez controla a expressão da proteína. Exemplos de sequências reguladoras incluem, mas não estão limitadas a, sequências promotoras de RNA, sequências de ligação a fator de transcrição, sequências de terminação da transcrição, moduladores de transcrição (como elementos acentuadores), sequências de nucleotídeos que afetam a estabilidade de RNA, e sequências reguladoras translacionais (como, sítios de ligação de ribossomos (por exemplo, sequências de Shine-Dalgarno em procariotos ou sequências de Kozak em eucariotos), códons de iniciação, códons de terminação).

[0068] Tal como aqui utilizada, a frase "a expressão da referida sequência de nucleotídeos é modificada em relação à sequência de nucleotídeo do tipo selvagem", significa um aumento ou uma diminuição do nível de expressão e/ou atividade de uma sequência de nucleotídeo endógena, ou a expressão e/ou a atividade de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo heterólogo ou não-nativo. Tal como aqui utilizado, o termo "super-expressar" significa expressar ou causar a expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo numa célula numa maior concentração do que é normalmente expressa numa célula do tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições.

[0069] Os termos "nível de expressão alterado" e "nível de expressão modificado" são utilizados de modo indistinto e significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou hidrocarboneto está presente numa concentração diferente em uma célula hospedeira modificada em comparação com a sua concentração em células de tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições.

[0070] Tal como aqui utilizado, o termo "título" refere-se à quantidade de aldeído graxo ou álcool graxo produzido por unidade de volume de cultura de células hospedeiras. Em qualquer aspecto das composições e métodos aqui descritos, um álcool graxo é produzido a um título de cerca de 25 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 225 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 275 mg/L, cerca de 300 mg/L, cerca de 325 mg/L, cerca de 350 mg/L, cerca de 375 mg/L, cerca de 400 mg/L, cerca de 425 mg/L, cerca de 450 mg/L, cerca de 475 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 525 mg/L, cerca de 550 mg/L, cerca de 575 mg/L, cerca de 600 mg/L, cerca de 625 mg/L, cerca de 650 mg/L, cerca de 675 mg/L, cerca de 700 mg/L, cerca de 725 mg/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 775 mg/L, cerca de 800 mg/L, cerca de 825 mg/L, cerca de 850 mg/L, cerca de 875 mg/L, cerca de 900 mg/L, cerca de 925 mg/L, cerca de 950 mg/L, cerca de 975 mg/L, cerca de 1000 mg/L, cerca de 1050 mg/L, cerca de 1075 mg/L, cerca de 1 100 mg/L, cerca de 1125 mg/L, cerca de 1150 mg/L, cerca de 1175 mg/L, cerca de 1200 mg/L, cerca de 1225 mg/L, cerca de 1250 mg/L, cerca de 1275 mg/L, cerca de 1300 mg/L, cerca de 1325 mg/L, cerca de 1350 mg/L, cerca de 1375 mg/L, cerca de 1400 mg/L , cerca de 1425 mg/L, cerca de 1450 mg/L, cerca de 1475 mg/L, cerca de 1500 mg/L, cerca de 1525 mg/L, cerca de 1550 mg/L, cerca de 1575 mg/L, cerca de 1600 mg/L, sobre 1,625 mg/L, cerca de 1650 mg/L, cerca de 1675 mg/L, cerca de 1700 mg/L, cerca de 1725 mg/L, cerca de 1750 mg/L, cerca de 1775 mg/L, cerca de 1800 mg/L, cerca de 1825 mg de/L, cerca de 1850 mg/L, cerca de 1875 mg/L, cerca de 1900 mg/L, cerca de 1925 mg/L, cerca de 1950 mg/L, cerca de 1975 mg/L, cerca de 2000 mg/L (2 g/L) , 3 g/L, 5 g/L, l0 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, lOO g/L ou um intervalo delimitado por quaisquer dos dois valores já mencionados. Em outras formas, um álcool graxo ou aldeído graxo é produzido a um título de mais de 100 g/L, superior a 200 g/L, superior a 300 g/L, ou maior, como 500 g/L, 700 g/L, 1000 g/L, 1200 g/L, 1500 g/L, ou 2000 g/L. O título preferido de aldeído graxo ou álcool graxo produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da publicação é de 5 g/L a 200 g/L, l0 g/L a 150 g/L, 20 g/L a 120 g/L e 30g/L para l00 g/L.

[0071] Tal como aqui utilizado, o termo "rendimento do aldeído graxo ou álcool graxo produzido por uma célula hospedeira" refere-se à eficiência pela qual uma fonte de entrada de carbono é convertida em produto (isto é, álcool graxo ou aldeído graxo) numa célula hospedeira. As células hospedeiras modificadas para produzir alcoóis graxos e/ou aldeídos graxo de acordo com os métodos da descrição têm um rendimento de pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, ou, pelo menos, 30% ou uma gama limitada por quaisquer dos dois valores mencionados. Em outras formas, um álcool graxo ou aldeído graxo é produzido com um rendimento de mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Alternativamente, ou em adição, o rendimento é de cerca de 30% ou menos, cerca de 27% ou menos, cerca de 25% ou menos, ou cerca de 22% ou menos. Assim, o rendimento pode ser limitado por qualquer um dos dois pontos acima. Por exemplo, o rendimento do aldeído graxo ou álcool graxo produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da descrição pode ser de 5% a 15%, 10% a 25%, 10% a 22%, 15% e 27%, 18% a 22%, 20% e 28%, ou 20% a 30%. O rendimento preferido de álcool graxo produzido pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da descrição é de 10% a 30%.

[0072] Tal como aqui utilizado, o termo "produtividade" refere-se à quantidade de aldeído graxo ou álcool graxo produzido por unidade de volume de cultura de células hospedeiras por unidade de tempo. Em quaisquer aspectos das composições e métodos aqui descritos, a produtividade do aldeído graxo ou álcool graxo produzido por uma célula hospedeira recombinante é pelo menos 100 mg/L/hora, pelo menos 200 mg/L/hora, pelo menos 300 mg/L/hora, pelo menos 400 mg/L/hora, pelo menos 500 mg/L/hora, pelo menos 600 mg/L/hora, pelo menos 700 mg/L/hora, pelo menos 800 mg/L/hora, pelo menos 900 mg/L/hora, pelo menos, 1000 mg/L/hora, pelo menos, 1100 mg/L/hora, pelo menos, 1200 mg/L/hora, pelo menos, 1300 mg/L/hora, pelo menos, 1400 mg/L/hora, pelo menos, 1500 mg/L/hora, pelo menos, 1600 mg/L/hora, pelo menos, 1700 mg/L/hora, pelo menos 1800 mg/L/hora, pelo menos, 1900 mg/L/hora, pelo menos 2000 mg/L/hora, pelo menos, 2100 mg/L/hora, pelo menos, 2200 mg/L/hora, pelo menos, 2300 mg/L/hora, pelo menos, 2400 mg/L/hora, ou , pelo menos, 2500 mg/L/hora. Alternativamente, ou em adição, a produtividade é de 2500 mg/L/hora ou menos, 2000 mg/L/ODS00 ou menos, 1500 mg/L/ODS00 ou menos, 120 mg/L/hora, ou menos, 1000 mg/L/hora ou menos, 800 mg/L/hora, ou menos, ou 600 mg/L/hora ou menos. Assim, a produtividade pode ser limitada por qualquer um dos dois pontos acima. Por exemplo, a produtividade pode ser de 3 a 30 mg/L/hora, 6 a 20 mg/L/hora, ou 15 a 30 mg/L/hora. A produtividade preferida de um álcool graxo ou aldeído graxo produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da descrição é escolhido de 500 mg/L/hora a 2500 mg/L/hora, ou de 700 mg/L/hora até 2000 mg/L/hora.

[0073] Os termos "tipos de gordura total" e "total de produtos de ácidos graxos" podem ser usados de forma intercambiável aqui com referência à quantidade total de alcoóis graxos, aldeídos graxos, ácidos graxos livres, e ésteres graxos presentes numa amostra, como avaliado por GC-FID, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 2008/119082. As amostras podem conter um, dois, três, ou quatro destes compostos, dependendo do contexto.

[0074] Tal como aqui utilizado, o termo "taxa de utilização de glicose" significa a quantidade de glicose usada pela cultura por unidade de tempo, expresso como gramas/litro/hora (g/L/h).

[0075] Tal como aqui utilizado, o termo "fonte de carbono" refere-se a um substrato ou composto adequado para ser usado como uma fonte de carbono para o crescimento celular procariótico ou eucariótico simples. As fontes de carbono podem ser de várias formas, incluindo, mas não se limitando a polímeros, carboidratos, ácidos, alcoóis, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos e gases (por exemplo, CO e CO2) . Exemplos de fontes de carbono incluem, mas não estão limitados a, monossacarídeos, como glicose, frutose, manose, galactose, xilose, arabinose e; oligossacarídeos, como fruto-oligossacarídeo e galacto- oligossacarídeo; polissacarídeos, como amido, celulose, pectina e xilano; dissacarídeos, como sacarose, maltose, celobiose, e turanose; variantes de material a base de celulose e, como hemiceluloses, metilcelulose e carboximetilcelulose de sódio; ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactato e acetato; alcoóis, como etanol, metanol, e glicerol, ou suas misturas. A fonte de carbono também pode ser um produto da fotossíntese, como glicose. Em certas formas preferidas, a fonte de carbono é biomassa. Em outras formas preferidas, a fonte de carbono é a glicose. Em outras formas preferidas, a fonte de carbono é sacarose.

[0076] Tal como aqui utilizado, o termo "biomassa" refere-se a qualquer material biológico a partir do qual uma fonte de carbono é derivada. Em algumas formas, uma biomassa é processada em uma fonte de carbono, a qual é adequada para a bioconversão. Em outras formas, a biomassa não requer qualquer processamento adicional em uma fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser convertida em um biocombustível. Uma fonte exemplar de biomassa é material de plantas ou vegetação, como milho, cana de açúcar, ou gramíneas. Outro exemplo de fonte de biomassa são resíduos metabólicos, como material animal (por exemplo, estrume de vaca) . Mais exemplos de fontes de biomassa incluem algas e outras plantas marinhas. Biomassa inclui ainda os resíduos de produtos da indústria, agricultura, silvicultura e de famílias, incluindo, mas não limitado a, resíduos de fermentação, ensilagem, palha, serragem, esgoto, lixo, resíduos urbanos celulósico, e restos de comida. O termo "biomassa" pode também referir-se a fontes de carbono, tais como carboidratos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, ou polissacarídeos).

[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado", no que diz respeito aos produtos (tais como ácidos graxos e seus derivados) refere-se a produtos que são separados a partir de componentes celulares, meios de cultura de células, ou precursores químicos ou sintéticos. Os ácidos graxos e os seus derivados produzidos pelos métodos aqui descritos podem ser relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, assim como no citoplasma. Por conseguinte, os ácidos graxos e seus derivados podem ser coletados em uma fase orgânica, quer intracelularmente ou extracelularmente.

[0078] Tal como aqui utilizados, os termos "purificar", "purificado" ou "purificação" significa a remoção ou isolamento de uma molécula a partir do seu ambiente, por exemplo, o isolamento ou separação. Moléculas "substancialmente purificadas" são, pelo menos, cerca de 60% livre (por exemplo, pelo menos cerca de 70% livre, pelo menos cerca de 75% livre, pelo menos cerca de 85% livre, pelo menos cerca de 90% livre, pelo menos cerca de 95% livre, pelo menos cerca de 97% livre, pelo menos cerca de 99% livre) de outros componentes com os quais estão associadas. Tal como aqui utilizado, estes termos também se referem à remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, a remoção de contaminantes pode resultar num aumento da porcentagem de um aldeído graxo ou um álcool graxo numa amostra. Por exemplo, quando um aldeído graxo ou um álcool graxo é produzido numa célula hospedeira recombinante, o aldeído graxo ou álcool graxo pode ser purificado pela remoção de proteínas das células hospedeiras recombinantes. Após a purificação, a porcentagem de um aldeído graxo ou um álcool graxo na amostra é amplificada. Os termos "purificar", "purificado" e "purificação" são termos relativos, que não requerem pureza absoluta. Assim, por exemplo, quando um aldeído graxo ou um álcool graxo é produzido em células hospedeiras recombinantes, um aldeído graxo purificado ou um álcool graxo purificado é um aldeído graxo ou um álcool graxo que está substancialmente separado de outros componentes celulares (por exemplo, ácidos nucleicos, polipeptídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros hidrocarbonetos).

Melhoria das Cepas

[0079] A fim de satisfazer os objetivos quanto ao título, rendimento, e/ou produtividade muito elevados de alcoóis graxos, um número de modificações foi feito nas células hospedeiras de produção. FadR é um fator regulador chave envolvido nas vias de degradação e biossíntese de ácidos graxos (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29(4):937- 943 (1998) ) . A enzima FadD da via ACS e a proteína de transporte de ácido graxo FadL são componentes essenciais de um sistema de captação de ácido graxo. Fadl medeia o transporte de ácidos graxos para dentro da célula bacteriana, e FadD medeia a formação de ésteres de acil- CoA. Quando nenhuma outra fonte de carbono está disponível, ácidos graxos exógenos são absorvidos pela bactéria e convertido em ésteres de acil-CoA, que podem se ligar ao fator de transcrição FadR e suspender a repressão da expressão dos genes fad que codificam proteínas responsáveis pelo transporte de ácidos graxos (FadL), ativação (FadD) e β-oxidação (FadA, FadB, FadE, e FadH). Quando fontes alternativas de carbono estão disponíveis, as bactérias sintetizam ácidos graxos como acil-ACPs, que são utilizados para síntese de fosfolipídio, mas não são substratos para a e-oxidação. Assim, acil-CoA e acil-ACP são duas fontes independentes de ácidos graxos que podem resultar em produtos finais diferentes (Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004)). O Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 61/470989 descreve métodos melhorados de produção de derivados de ácidos graxos onde uma célula hospedeira é geneticamente manipulada para ter nível alterado de expressão de um polipeptídeo FadR, em comparação com o nível de expressão do polipeptídio FadR numa célula hospedeira melhorada do tipo selvagem correspondente.

[0080] Há especulações conflitantes na arte quanto aos fatores limitantes da biossíntese de ácidos graxos em células hospedeiras, tais como E. coli. Uma abordagem para aumentar o fluxo através da biossíntese do ácido graxo é manipular várias enzimas na via (Figs. 1 e 2). O fornecimento de acil-ACPs a partir de acetil-CoA através do complexo acetil-CoA carboxilase (acc) (Fig. 3) e da biossíntese de ácidos graxos (fab) pode limitar a taxa de produção de álcool graxo. Numa abordagem exemplificativa detalhada no Exemplo 2, o efeito de super expressão de Corynebacterium glutamicum accABCD (±birA) demonstrou que tais modificações genéticas podem levar a um aumento da malonil-CoA e acetil-CoA na E. coli. Uma razão possível para uma baixa taxa de fluxo através da biossíntese do ácido graxo é um fornecimento limitado de precursores, chamados acetil-CoA e, em particular, malonil-CoA, e os principais precursores para a biossíntese de ácidos graxos. O Exemplo 3 descreve a construção de operons fab que codificam enzimas na via biossintética para a conversão de malonil-CoA em acil-ACPs e integração no cromossomo de uma célula hospedeira de E. coli. Ainda em outra abordagem detalhada no Exemplo 4, as mutações nos genes rph e ilvG na célula hospedeira de E. coli foram mostrados para resultar em maior produção de ácidos graxos livres (AGL), que se traduziu em maior produção de álcool graxo. Em ainda outra abordagem, mutagênese por transposon e análise de alto rendimento foi realizado para descobrir mutações benéficas que aumentam o título ou o rendimento. O Exemplo 5 descreve como a inserção de um transposon no gene yijP pode melhorar o rendimento de alcoóis graxos na fermentação em frasco sob agitação e fermentações tipo lote-alimentado.

Ácido Carboxílico Redutase (CAR)

[0081] As células hospedeiras recombinantes foram modificadas para produzir alcoóis graxos pela expressão de uma tioesterase, que catalisa a conversão da acil-ACPs em ácidos graxos livres (AGL) e uma ácido carboxílico redutase (CAR), que converte os ácidos graxos livres em aldeídos graxos. Aldeído redutases nativas (endógenas) presentes na célula hospedeira (por exemplo, E. coli) podem converter aldeídos graxos em alcoóis graxos. Exemplos de tioesterases são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Americana No. 20100154293, expressamente incorporada aqui por referência. CarB, é um exemplo de ácido carboxílico redutase, uma enzima chave na via de produção de álcool graxo. A WO2010/062480 descreve uma busca no BLAST utilizando a sequência do aminoácido NRRL 5646 CAR (acesso GenPept AAR91681) (SEQ ID NO: 6) como a sequência de busca, e sua utilização na identificação de aproximadamente 20 sequências homólogas.

[0082] Os termos "ácido carboxílico redutase", "CAR", e "polipeptídeo biossintético aldeído graxo" são aqui utilizados de modo indiferente. Na prática da descrição, um gene que codifica um polipeptídeo da ácido carboxílico redutase é expresso ou super expresso na célula hospedeira. Em algumas formas, o polipeptídeo CarB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em outras formas, o polipeptídeo CarB é uma variante ou mutante da SEQ ID NO: 7. Em certas formas, o polipeptídeo CarB é de uma célula de mamífero, célula de planta, célula de inseto, célula de levedura, célula de fungo, célula de fungo filamentoso, uma célula bacteriana, ou qualquer outro organismo. Em algumas formas, a célula bacteriana é uma micobactéria selecionada de um grupo que consiste em Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans. Em outras formas, a célula bacteriana é uma espécie de Nocardia, por exemplo, Nocardia NRRL 5646, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Salinispora arenicola, ou Clavibacter michiganenesis. Em outras formas, o polipeptídeo CarB é um homólogo de CarB possuindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. A identidade de um polipeptídeo CarB possuindo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 não é particularmente limitada, e um perito na arte pode facilmente identificar homólogos de derivados CarB da MG1655 de E. coli e determinar a sua função, utilizando os métodos aqui descritos. Em outras formas, o polipeptídeo CarB contém uma mutação no aminoácido número 3, 12, 20, 28, 46, 74, 103, 191, 288, 473, 827, 926, 927, 930 ou 1128 da SEQ ID NO: 7. Exemplos de mutações estão detalhados na Tabela 10. Fragmentos preferidos ou mutantes de um polipeptídeo retêm alguns ou a totalidade da função biológica (por exemplo, atividade enzimática) do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em algumas formas, o fragmento ou mutante retém pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou, pelo menos, cerca de 98 % ou mais da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em outras formas, o fragmento ou mutante retém cerca de 100 % da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Orientações para se determinar quais os resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou eliminados, sem afetar a atividade biológica podem ser obtidas utilizando programas de computador bem conhecidos na arte, por exemplo, os softwares LASERGENE™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

[0083] Ainda em outras formas, um fragmento ou mutante exibe um aumento da função biológica em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Por exemplo, um fragmento ou mutante pode apresentar, pelo menos, cerca de 10 %, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90% de melhora na atividade enzimática quando comparado ao polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em outras formas, o fragmento ou mutante exibe pelo menos cerca de 100% (por exemplo, pelo menos cerca de 200%, ou pelo menos cerca de 500%), de melhoria da atividade enzimática em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Entende-se que os polipeptídeos aqui descritos podem ter substituições adicionais de aminoácidos conservados ou não essenciais, que não têm um efeito substancial sobre a função do polipeptídeo. Se uma substituição particular será tolerada (isto é, não vai afetar adversamente a função biológica desejada, como ligação a DNA ou atividade enzimática) ou não, pode ser determinado como descrito em Bowie et al. (Science, 247: 1306-1310 (1990)).

[0084] Como um resultado dos métodos e enzimas variantes da presente descrição, um ou mais do título, rendimento, e/ou produtividade do ácido graxo ou seu derivado produzido pela célula hospedeira manipulada tendo um nível de expressão alterado de um polipeptídeo CarB é aumentado em relação ao da célula hospedeira do tipo selvagem correspondente. Para permitir o máximo de conversão de ácidos graxos C12 e C14 em alcoóis graxos, CarB deve ser expressada com atividade suficiente. Uma célula hospedeira recombinante melhorada teria uma enzima CAR que é expressa, por exemplo, do cromossomo de E. coli. Como mostrado no Exemplo 6, células que expressam a enzima CarB do cromossomo têm mais atividade da ácido carboxílico redutase em relação ao CarB original e são capazes de converter mais ácidos graxos C12 e C14 em alcoóis graxos. CarB é um grande gene (3,5 kb) e aumenta consideravelmente o tamanho do plasmídeo, tornando difícil a utilização de um plasmídeo pCL para testar novos genes durante o desenvolvimento da cepa. As abordagens para aumentar a atividade de CarB, incluem o aumento da sua solubilidade, estabilidade, expressão e/ou funcionalidade. Num exemplo de abordagem, uma proteína de fusão que contém 6 histidinas e um local de clivagem de trombina no terminal N de CarB é produzido. Esta enzima difere da CarB por 60 nucleotídeos adicionais na extremidade N-terminal, e tem o nome de CarB60. Quando CarB ou CarB60 são expressas a partir do cromossomo de E. coli sob o controle do promotor pTRC, as células que contêm CarB60 têm aumentada a atividade total da ácido carboxílico redutase e convertem mais ácidos graxos livres C12 e C14 (AGLs) em alcoóis graxos. Um perito na arte irá apreciar que este é um exemplo de engenharia molecular, a fim de conseguir uma maior conversão de ácidos graxos livres (AGLs) C12 e C14 em alcoóis graxos como ilustrado no Exemplo 6, {supra). Abordagens semelhantes estão aqui englobados (ver Exemplo 7).

[0085] Fosfopanteteína transferases (PPTases) (EC 2.7.8.7) catalisa a transferência de 4'-fosfopanteteína da CoA a um substrato. Nocardia Car, CarB e vários de seus homólogos contêm um sítio de ligação teórico para 4'-fosfopanteteína (PPT) (He et al., Appl. Environ. Microbiol., 70(3): 1874-1881 (2004)). Em algumas formas da descrição, uma PPTase é expressa ou super expressa em uma célula hospedeira modificada. Em certas formas, a PPTase é EntD de E. coli MG1655 (SEQ ID NO:8). Em algumas formas, a tioesterase e uma ácido carboxílico redutase são expressas ou super expressas em uma célula hospedeira modificada. Em certas formas, a tioesterase é tesA e a ácido carboxílico redutase é CarB. Em outras formas, uma tioesterase, uma ácido carboxílico redutase e uma álcool desidrogenase são expressas ou super expressas em uma célula hospedeira modificada. Em certas formas, a tioesterase é tesA, a ácido carboxílico redutase é carB e a álcool desidrogenase é alrAadpl (número de acesso GenPept CAG70248.1) de Acinetobacter baylyi ADP1 (SEQ ID NO:4). Em outras formas ainda, uma tioesterase, uma ácido carboxílico redutase, uma PPTase, e uma álcool desidrogenase são expressas ou super expressas na célula hospedeira modificada. Em certas formas, a tioesterase é tesA, a ácido carboxílico redutase é carB, a PPTase é entD, e a álcool desidrogenase é alrAadpl. Em outras formas ainda, uma célula hospedeira modificada que expressa uma ou mais de uma tioesterase, uma CAR, uma PPTase, e uma álcool desidrogenase também tem um ou mais cepas melhoradas. Exemplos de cepas melhoradas incluem, mas não estão limitadas a expressão ou super expressão de um polipeptídeo carboxilase de acetil-CoA, super expressão de um polipeptídeo FadR, expressão ou super expressão de um operon iFAB heterólogo, ou a inserção de transposon no gene yijP ou outro gene, ou abordagens similares. A descrição também fornece uma composição de álcool graxo produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos. Uma composição de álcool graxo produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser usada diretamente como materiais de partida para a produção de outros compostos químicos (por exemplo, polímeros, surfactantes, plásticos, têxteis, adesivos, solventes, etc.), ou aditivos para cuidados pessoais. Estes compostos também podem ser utilizados como matéria prima para as reações subsequentes, por exemplo, hidrogenação, craqueamento catalítico (por exemplo, através de hidrogenação, pirólise, ou ambas) para produzir outros produtos.

Mutantes ou variantes

[0086] Em algumas formas, o polipeptídeo expresso em uma célula hospedeira recombinante é um mutante ou um variante de qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos. Os termos "mutantes" e "variantes" tal como utilizado aqui se referem a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que difere de um poliptídeo do tipo selvagem por pelo menos um aminoácido. Por exemplo, o mutante pode compreender uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos conservados: a substituição de um aminoácido alifático, como alanina, valina, leucina, isoleucina por outro aminoácido alifático; substituição de uma serina por uma treonina; substituição de uma treonina por uma serina; substituição de um resíduo acídico, como ácido aspártico e ácido glutâmico, por outro resíduo ácidico; substituição de um resíduo tendo um grupo amida, como asparagina e glutamina, por outro resíduo tendo um grupo amida; troca de um resíduo básico, como lisina e arginina, por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático, como fenilalanina e tirosina, por outro resíduo aromático. Em algumas formas, o polipeptídeo mutante tem cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais substituições, adições, inserções ou deleções de aminoácidos. Os fragmentos preferidos ou mutantes de um polipeptídeo retém alguma ou toda função biológica (por exemplo, atividade enzimática) polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em algumas formas, o fragmento ou mutante retém pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 98% ou mais da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em outras formas, o fragmento ou mutante retém cerca de 100% da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Orientações para se determinar quais os resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inserido ou eliminado, sem afetar a atividade biológica podem ser encontrado utilizando programas de computador bem conhecidos na arte, por exemplo, software LASERGENE™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

[0087] Ainda em outras formas, um fragmento ou mutante exibe um aumento da função biológica em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Por exemplo, um fragmento ou mutante pode apresentar pelo menos um 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, ou, pelo menos, de 90% de melhoria na atividade enzimática em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em outras formas, o fragmento ou mutante apresenta, pelo menos, 100% (por exemplo, pelo menos 200%, ou, pelo menos, 500%) de melhoria da atividade enzimática em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Entende-se que os polipeptídeos aqui descritos podem ter substituições adicionais conservativas ou não-essenciais de aminoácidos, que não têm um efeito substancial sobre a função de polipeptídeo. Se uma substituição particular será tolerada (isto é, não vai afetar negativamente a desejada função biológica, como atividade de ácido carboxílico redutase) ou não, pode ser determinado como descrito em Bowie et al. (Science, 247: 1306-1310 (1990)). Uma substituição de aminoácido conservado é aquele onde o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes têm sido definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (p.ex., ácido aspártico, ácido glutâmico) , cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (p.ex., treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As variantes podem ocorrer naturalmente ou serem criadas in vitro. Em particular, tais variantes podem ser criadas utilizando técnicas de engenharia genética, tais como mutagênese dirigida por local, mutagênese química aleatória, procedimentos de deleção com Exonuclease III, ou técnicas de clonagem convencionais. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos, ou derivados podem ser criados usando procedimentos de síntese química ou de modificação.

[0088] Os métodos de produção de variantes são bem conhecidos na arte. Estes incluem processos onde as sequências de ácidos nucleicos obtidos de isolados naturais são modificadas para gerar os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos tendo características que melhorem o seu valor em aplicações industriais ou laboratoriais. Em tais procedimentos, um grande número de sequências variantes tendo um ou mais nucleotídeos diferentes em relação à sequência obtida a partir do isolado natural são gerado e caracterizado. Tipicamente, estas diferenças nos nucleotídeos resultam em mudanças do aminoácido em relação aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos de isolados naturais. Por exemplo, as variantes podem ser preparadas utilizando mutagênese aleatória e dirigida por local. A mutagênese aleatória e dirigida ao local estão descritas em, por exemplo, Arnold, Curr. Opin. Biotech, 4: 450-455 (1993). A mutagênese aleatória pode ser conseguida utilizando PCR propensa a erros (ver, por exemplo, Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989); e Caldwell et al., PCR Methods Applic., 2:. 28-33 (1992)). Em PCR propensa a erros, a PCR é realizada sob condições onde a fidelidade de cópia da DNA polimerase é baixa, de tal modo que uma elevada taxa de mutações pontuais é obtida ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Resumidamente, em tais procedimentos, os ácidos nucleicos a serem mutados (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica uma enzima redutase carboxílica) são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase, e uma concentração adequada de dNTPs para atingir uma elevada taxa de mutação pontual ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada utilizando 20 fmoles de ácido nucleico a ser mutado, 30 pmol de cada iniciador de PCR, um tampão de reação compreendendo 50 mM de KCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 0,01 % de gelatina, 7 mM de MgCl2, MnCl2 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerase, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP e 1 mM de dTTP. A PCR pode ser realizada durante 30 ciclos a 94 °C durante 1 min, 45 °C durante 1 min, e 72 °C durante 1 min. No entanto, deve-se observar que estes parâmetros podem ser variados conforme apropriado. Os ácidos nucleicos com mutações são então clonados num vetor apropriado, e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos com mutações são avaliadas (ver Exemplo 7). A mutagênese dirigida por local pode ser conseguida utilizando a mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo para gerar mutações sítio-específicas em qualquer DNA clonado de interesse. A Mutagênese de oligonucleotídeo é descrita em, por exemplo, Reidhaar-Olson et al., Science, 241:. 53-57 (1988) . Resumidamente, em tais processos uma pluralidade de oligonucletídeos de cadeia dupla tendo uma ou mais mutações a ser introduzidas no DNA clonado são sintetizados e inserido no DNA clonado a ser mutado (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo CAR). Os clones contendo o DNA mutado são recuperados, e a atividade dos polipeptídeos que eles codificam é avaliada. Outro método para a geração de variantes é a PCR de montagem. A PCR de montagem envolve a montagem de um produto de PCR a partir de uma mistura de fragmentos pequenos de DNA. Um grande número de diferentes reações de PCR ocorre em paralelo no mesmo frasco, com os produtos priming de uma reação os produtos de outra reação. A montagem de PCR é descrita em, por exemplo, na Patente Americana 5.965.408. Ainda outro método de geração de variantes de mutagênese é a PCR sexual. Na mutagênese por PCR sexual ocorre a recombinação homóloga forçada entre moléculas de DNA diferentes, mas altamente relacionadas, sequências de DNA in vitro como resultado da fragmentação aleatória da molécula de DNA baseada na homologia de sequências. Isto é seguido pela fixação do cruzamento pela extensão do iniciador numa reação de PCR. A mutagênese por PCR sexual é descrita em, por exemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 91: 10747-10751 (1994).

[0089] As variantes também podem ser criadas por mutagênese in vivo. Em algumas formas, mutações aleatórias na sequência de um ácido nucleico são geradas por propagação da sequência em uma cepa bacteriana, como uma cepa de E. coli, que carrega mutações em uma ou mais das vias de reparação do DNA. Tais cepas "mutadoras" têm uma maior taxa de mutação aleatória do que a de uma cepa do tipo selvagem. A propagação de uma sequência de DNA (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo CAR) em uma destas cepas irá eventualmente gerar mutações aleatórias dentro do DNA. Cepas mutadoras adequadas para utilização em mutagênese in vivo são descritos em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 1991/016427. As variantes também podem ser geradas utilizando mutagênese por cassete. Na mutagênese por cassete, uma pequena região de uma molécula de DNA de cadeia dupla é substituída por um oligonucleotídeo sintético "cassete" que difere da sequência nativa. O oligonucleotídeo contém muitas vezes uma sequência nativa completamente e/ou parcialmente randomizada. Mutagênese de conjunto recursiva também pode ser utilizada para gerar variantes. Mutagênese de conjunto recursiva é um algoritmo para a engenharia de proteína (isto é, mutagênese de proteínas) desenvolvido para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacionadas cujos membros diferem na sequência de aminoácidos. Este método utiliza um mecanismo de feedback para controlar rodadas sucessivas de mutagênese de cassete combinatória. Mutagênese de conjunto recursiva é descrita em, por exemplo, Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , U.S.A., 89: 7811-7815 (1992). Em algumas formas, as variantes são criadas usando mutagênese de conjunto exponencial. Mutagênese de conjunto exponencial é um processo para a geração de bibliotecas combinatórias com uma elevada porcentagem de mutantes únicas e funcionais, onde pequenos grupos de resíduos são aleatorizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que levam a proteínas funcionais. Mutagênese de conjunto exponencial é descrita em, por exemplo, Delegrave et al., Biotech. Res, 11: 1548-1552 (1993). Em algumas formas, as variantes são criadas usando procedimentos de embaralhamento, onde as porções de uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos distintos são aglutinadas para criar sequências quiméricas de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos quiméricos tal como descrito em, por exemplo, nas Patentes Americanas 5.965.408 e 5.939.250.

[0090] Mutagênese por inserção é mutagênese de DNA pela inserção de uma ou mais bases. Mutações por inserção podem ocorrer naturalmente, mediadas por vírus ou transposon, ou podem ser criadas artificialmente para fins de pesquisa, no laboratório, por exemplo, mutagênese por transposons. Quando o DNA exógeno é integrado no do hospedeiro, a gravidade de qualquer mutação subsequente depende inteiramente do local dentro do genoma do hospedeiro, em que o DNA é inserido. Por exemplo, os efeitos significativos podem ser evidentes, se um transposon insere no meio de um gene essencial, uma região de promotor, ou de um repressor ou de um acentuassomo. Mutagênese de transposons e análise de alto rendimento foram feitos para descobrir mutações benéficas que aumentem o título ou o rendimento do álcool graxo. A descrição fornece células hospedeiras recombinante compreendendo (a) uma sequência polinucleotídica que codifica uma ácido carboxílico redutase que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 9 9% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e (b) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de ácido carboxílico redutase, onde a célula hospedeira recombinante é capaz de produzir um aldeído graxo ou um álcool graxo.

Modificações de Células hospedeiras

[0091] Em algumas formas, uma sequência de polinucleotídeo (ou gene) é fornecida a uma célula hospedeira através de um vetor recombinante, que compreende um promotor ligado operacionalmente à sequência de polinucleotídeo. Em certas formas, o promotor é um promotor regulado durante o desenvolvimento, organela-específico, tecido-específico, indutível, constitutivo, ou célula- específico. Em algumas formas, o vetor recombinante inclui (a) uma sequência de controle da expressão operacionalmente acoplada à sequência polinucleotídica; (b) um marcador de seleção acoplado operativamente à sequência de polinucleotídica; (c) uma sequência de marcador acoplada operacionalmente à sequência de polinucleotídica; (d) uma porção de purificação operacionalmente acoplada à sequência polinucleotídica; (e) uma sequência de secreção acoplada operativamente à sequência polinucleotídica; e (f) uma sequência de direcionamento acoplada operativamente à sequência polinucleotídica. Os vetores de expressão aqui descritos incluem uma sequência de polinucleotideo aqui descrito numa forma adequada para a expressão da sequência de polinucleotideo numa célula hospedeira. Será apreciado por aqueles peritos na arte que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzido nas células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos aqui descritos. Expressão de genes que codificam polipeptídeos em procariotos, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente conduzida com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de ambos polipeptídeos de fusão ou de não-fusão. Vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos de um polipeptídeo codificado aqui, geralmente, no terminal amino ou carboxil do polipeptídeo recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente a um ou mais dos três seguintes propósitos: (1) para aumentar a expressão do polipeptídeo recombinante; (2) para aumentar a solubilidade do polipeptídeo recombinante; e (3) para auxiliar na purificação do polipeptídeo recombinante, atuando como um ligante na purificação por afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção entre a porção de fusão e o polipeptídeo recombinante. Isto permite a separação do polipeptídeo recombinante da porção de fusão após a purificação do polipeptídeo de fusão. Exemplos de tais enzimas, e as suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina, e enteroquinase. Vetores de expressão de fusão exemplificativos incluem pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al., Gene, 67: 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), e pRITS (Pharmacia Biotech , Inc., Piscataway, NJ), que fundem a glutationa-S- transferase (GST), proteína de ligação a maltose, ou proteína A, respectivamente, para o polipeptídeo recombinante alvo.

[0092] Exemplos de vetores de expressão de E. coli induzíveis, de não-fusão incluem pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) e pET l1d (Studier et al., Gene Expression Tecnology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, na Calif. (1990) 60-89). Expressão do gene alvo a partir do vetor pTrc baseia-se na transcrição da polimerase do RNA do hospedeiro a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. Expressão do gene alvo a partir do vetor pET l1d depende da transcrição de um promotor de fusão T7 gn10-lac mediada por uma RNA polimerase viral co-expressa (T7 gnl). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um profago À residente contendo um gene T7 gn1 sob o control transcricional do promotor lacUV 5. Os sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas são bem conhecidos na arte; ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Exemplos de vetores de expressão indutível e de não fusão de E. coli incluindo pTrc (Amann et a., Gene, 69: 301-315 (1988)) e PET 11d (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89 (1990)). Em certas formas, uma sequência polinucleotídica da descrição está operativamente ligada a um promotor derivado do bacteriófago T5. Numa forma, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nesta forma, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Os vetores podem ser introduzidos em células procarióticas ou eucarióticas através de uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) numa célula hospedeira. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em, por exemplo, Sambrook et al. (supra) . Para a transformação estável de células bacterianas, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transformação utilizada, apenas uma pequena fração das células incorporará e replicará o vetor de expressão. Em algumas formas, de modo a identificar e selecionar estas células transformadas, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, de resistência a um antibiótico) é introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a drogas, tais como, mas não limitados a, ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os ácidos nucleicos que codificam um marcador de seleção podem ser introduzidos numa célula hospedeira no mesmo vetor como aquele que codifica um polipeptídeo aqui descrito ou pode ser introduzido num vetor separado. As células transformadas estáveis com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas através do crescimento em presença de uma seleção de droga apropriada.

Produção das Composições de Alcoóis Graxos por células hospedeiras recombinantes

[0093] As estratégias para aumentar a produção de alcoóis graxos pelas células hospedeiras recombinantes incluem o aumento do fluxo através da via de biossíntese de ácidos graxos pela super-expressão de genes da biossíntese de ácidos graxos nativos e expressão de genes da biossíntese de ácidos graxos exógenos de organismos diferentes em um hospedeiro de produção modificado. A atividade aumentada de enzimas relevantes na via biossintética do álcool graxo, por exemplo, CAR, bem como outras estratégias para otimizar o crescimento e produtividade da célula hospedeira podem também ser empregados para maximizar a produção. Em algumas formas, a célula hospedeira recombinante compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo (uma enzima) tendo atividade biossintética de álcool graxo (ou seja, um polipeptídeo biossintético de álcool graxo ou uma enzima biossintética de álcool graxo), e um álcool graxo é produzido pela célula hospedeira recombinante. Uma composição compreendendo alcoóis graxos (uma composição de álcool graxo) pode ser produzida por cultura de célula hospedeira recombinante na presença de uma fonte de carbono sob condições efetivas para expressar uma enzima biossintética de álcool graxo. Em algumas formas, a composição de álcool graxo compreende alcoóis graxo, no entanto, uma composição de álcool graxo pode compreender outros derivados de ácidos graxo. Tipicamente, a composição de álcool graxo é recuperada do ambiente extracelular da célula hospedeira recombinante, ou seja, o meio de cultura celular. Numa abordagem, as células hospedeiras recombinantes foram modificadas para produzir alcoóis graxos, expressando uma tioesterase, a qual catalisa a conversão da acil-ACPs em ácidos graxos livres (AGL) e uma ácido carboxílico redutase (CAR), que converte os ácidos graxos livres em aldeídos graxos. Aldeído redutases nativas (endógenas) presentes na célula hospedeira (por exemplo, E. coli) pode converter aldeídos graxos em alcoóis graxos. Em algumas formas, o álcool graxo é produzido expressando ou super-expressando na célula hospedeira recombinante um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade biossintética de álcool graxo que converte um aldeído graxo em um álcool graxo. Por exemplo, uma álcool desidrogenase (também referida aqui como uma aldeído redutase, por exemplo, EC 1.1.1.1), pode ser usado na prática da descrição. Tal como aqui utilizado, o termo "álcool desidrogenase" refere-se a um polipeptídeo capaz de catalisar a conversão de um aldeído para um álcool (por exemplo, um álcool graxo). Um perito na arte irá reconhecer que determinadas álcool desidrogenases são capazes de catalisar outras reações, e estas álcool desidrogenases não específicas também estão englobadas pelo termo "álcool desidrogenase." Exemplos de polipeptídeos de álcool desidrogenase úteis de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a AlrAadpl (SEQ ID NO: 4) ou AlrA homólogos e álcool desidrogenases endógenas de E. coli, como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 5), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995) , YhdH (NP_417719) , YahK (P_414859) , YphC (AAC75598), YqhD (446856) e YbbO [AAC73595.1]. Exemplos adicionais estão descritos nas Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO2007/136762, WO2008/119082 e WO 2010/062480, cada um dos quais é expressamente incorporada por referência neste documento. Em certas formas, o polipeptídeo biossintético álcool graxo tem atividade de aldeído redutase ou álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1). Numa outra abordagem, as células hospedeiras recombinantes foram modificadas para produzir alcoóis graxos expressando álcool graxos formando acil-CoA redutases ou acil graxo redutases (FARs) que convertem substratos de acil-tioéster graxo (por exemplo, acil-CoA graxo ou acil-ACP graxo) para álcoois gordos. Em algumas formas, o álcool graxo é produzido expressando ou super- expressando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo álcool graxo apresentando atividade de acil-CoA redutase (FAR) formadora de álcool graxo em uma célula hospedeira recombinante. Exemplos de polipeptídeos FAR úteis de acordo com esta forma de realização estão descritos na Publicação PCT No. WO2010/062480, a qual é expressamente incorporada por referência neste documento.

[0094] Um álcool graxo pode ser produzido através de uma via dependente de acil-CoA utilizando intermediários o acil-graxo ACP e o acil-graxo CoA e uma via independente de acil-CoA graxo utilizando intermediários acil-graxo ACP, mas não um intermediário acil-graxo CoA. Em concretizações particulares, a enzima codificada pelo gene super-expresso é selecionado a partir de uma ácido graxo sintase, uma acil-ACP tioesterase, uma acil-graxo CoA sintetase e uma acetil-CoA carboxilase. Em algumas formas, a proteína codificada pelo gene super-expresso é endógena para a célula hospedeira. Em outras formas, a proteína codificada pelo gene super-expresso é heteróloga para a célula hospedeira. Os alcoóis graxos também são produzidos na natureza por enzimas que são capazes de reduzir várias moléculas de acil-ACP ou acil-CoA para os alcoóis primários correspondentes. Ver também, a Publicação das Patentes Americanas Nos. 20100105963, 20110206630 e a Patente Americana No. 8097439, expressamente incorporada aqui por referência. Tal como aqui utilizado, uma célula hospedeira recombinante ou uma célula hospedeira modificada refere-se a uma célula hospedeira, cuja composição genética foi modificada em relação à célula hospedeira do tipo selvagem correspondente, por exemplo, pela introdução deliberada de novos elementos genéticos e/ou modificação deliberada de elementos genéticos presentes naturalmente na célula hospedeira. A descendência de tais células hospedeiras recombinantes também contêm estes novos elementos genéticos e/ou modificados. Em qualquer um dos aspectos da publicação aqui descrita, a célula hospedeira pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula de planta, célula de inseto, célula de fungo (por exemplo, um fungo filamentoso, como Candida sp., ou uma levedura de brotamento, como Saccharomyces sp.), uma célula de alga e uma célula bacteriana. Numa forma preferida, as células hospedeiras recombinantes são células microbianas recombinantes. Exemplos de células hospedeiras que são células microbianas, incluem, mas não estão limitados a células do gênero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococciis, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia, ou Streptomyces. Em algumas formas, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram positiva. Em outras formas, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram negativa. Em algumas formas, a célula hospedeira é uma célula E. coli. Em outras formas, a célula hospedeira é uma célula de Bacillus lentus, uma célula de Bacillus brevis, uma célula de Bacillus stearothermophilus, uma célula de Bacillus lichenoformis, uma célula de Bacillus alkalophilus, uma célula de Bacillus coagulans, uma célula de Bacillus circulans, uma célula de Bacillus pumilis, uma célula Bacillus thuringiensis, uma célula de Bacillus clausii, uma célula de Bacillus megaterhim, uma célula de Bacillus subtilis, ou uma célula Bacillus amyloliquefaciens. Em outras formas, a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma koningii, uma célula de Trichoderma viride, uma célula de Trichoderma reesei, uma célula de Trichoderma longibrachiatum, uma célula Aspergillus awamori, uma célula de Aspergillus fumigatus, uma célula Aspergillus foetidus, uma célula de Aspergillus nidulans, uma célula de Aspergillus niger, uma célula de Aspergillus oryzae, uma célula de Humicola insolens, uma célula de Humicola lanuginose, uma célula de Rhodococciis opacus, uma célula de Rhizomucor miehei, ou uma célula de Mucor michei.

[0095] Ainda em outras formas, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces lividans ou uma célula de Streptomyces murinus. Em outras formas ainda, a célula hospedeira uma célula de Actinomycetes. Em algumas formas, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Em outras formas, a célula hospedeira é uma célula eucariótica de uma planta, alga, cianobactéria, bactéria verde sulfurosa, bactéria verde não sulfurosa, bactéria púrpura sulfurosa, bactéria púrpura não sulfurosa, extremófilo, levedura, fungo, um organismo manipulado do mesmo, ou um organismo sintético. Em algumas formas, a célula hospedeira é dependente de luz ou fixa carbono. Em algumas formas, a célula hospedeira é dependente de luz ou fixa carbono. Em algumas formas, a célula hospedeira tem atividade autotrófica. Em algumas formas, a célula hospedeira tem atividade fotoautotrófica, como na presença de luz. Em algumas formas, a célula hospedeira é heterotrófica ou mixotrófica na ausência de luz. Em certas formas, a célula hospedeira é uma célula de Avabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromathiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridiuthermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonasjluorescens, ou Zymomonas mobilis.

Cultura e Fermentação de células hospedeiras modificadas

[0096] Tal como aqui utilizado, fermentação geral refere-se à conversão de materiais orgânicos em substâncias alvo pelas células hospedeiras, por exemplo, a conversão de uma fonte de carbono pelas células hospedeiras recombinantes em ácidos graxos ou seus derivados pela propagação de uma cultura de células hospedeiras recombinantes em um meio contendo a fonte de carbono. Tal como aqui utilizado, condições permissivas para a produção significa quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira produza um produto desejado, como um ácido graxo ou um derivado de ácido graxo. Do mesmo modo, as condições nas quais a sequência polinucleotídica de um vetor é expresso significam quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira sintetize um polipeptídeo. As condições adequadas incluem, por exemplo, as condições de fermentação. As condições de fermentação podem compreender diversos parâmetros, incluindo, mas não limitando a faixas de temperatura, os níveis de aeração, as taxas de alimentação e da composição do meio. Cada uma destas condições, individualmente e em combinação, permite que a célula hospedeira cresça. A fermentação pode ser aeróbia, anaeróbia, ou suas variações (como micro-aeróbica) . Os meios de cultura exemplificativos incluem caldos ou géis. Geralmente, a forma inclui uma fonte de carbono que pode ser metabolizada por uma célula hospedeira diretamente. Além disso, as enzimas podem ser usadas no meio para facilitar a mobilização (por exemplo, a despolimerização da celulose ou de amido em açúcares fermentáveis) e metabolismo subsequente da fonte de carbono. Para produção em pequena escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em lotes de, por exemplo, cerca de 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L, 10L ou; fermentado; e induzido para expressar uma sequência de polinucleotídeo desejado, como uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo CAR. Para produção em larga escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em lotes de cerca de 10 L, 100 L, 1000 L, 10.000 L, 100.000 L, 1.000.000 L ou maior; fermentado; e induzido para expressar uma sequência de polinucleotídeo desejado. Alternativamente, fermentação tipo lote-alimentado em grande escala pode ser conduzida.

Composições de álcool graxo

[0097] As composições de alcoóis graxos descritas aqui são encontradas no ambiente extracelular da cultura da célula hospedeira recombinante e podem ser facilmente isoladas do meio de cultura. Uma composição de álcool graxo pode ser secretada pela célula hospedeira recombinante, transportada para o ambiente extracelular ou passivamente transferida para o ambiente extracelular da cultura da célula hospedeira recombinante. A composição de álcool graxo é isolada de uma cultura de células hospedeiras recombinante, utilizando métodos de rotina conhecidos na arte. A descrição fornece composições produzidas por células hospedeiras recombinantes ou manipuladas (bioprodutos), que incluem um ou mais aldeídos graxos e/ou alcoóis graxos. Embora um componente de álcool graxo com um comprimento de cadeia particular e grau de saturação possa constituir a maior parte dos bioprodutos produzidos por uma cultura de célula hospedeira recombinante ou modificada, a composição inclui, tipicamente, uma mistura de aldeídos graxos e/ou alcoóis graxos que varia em relação ao comprimento da cadeia e/ou grau de saturação. Como usado aqui, a fração de carbono moderno ou fM tem o mesmo significado como definido pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) Materiais de Referência Padrão (SRMs 4990B e 4990C, conhecido como padrões de ácido oxálico HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental relaciona a 0,95 vezes razão isotópica 14C/12C HOxI (com referência a AD 1950) . Isto é aproximadamente equivalente à madeira pré-Revolução Industrial com decaimento corrigido. Para biosfera viva atual (material vegetal), fM é de aproximadamente 1,1.

[0098] Bioprodutos (por exemplo, aldeídos graxos e alcoóis graxos produzidos de acordo com a presente descrição) que compreendem os compostos orgânicos biologicamente produzidos, e em particular, os aldeídos graxos e alcoóis graxos biologicamente produzidos utilizando aqui o ácido graxo biossintético, não tendo sido produzido de fontes renováveis e, como tal, são novas composições de matéria. Estes novos bioprodutos podem ser distinguidos de compostos orgânicos derivados de carbono petroquímico com base nas assinaturas de carbono isotópico duplo ou datação de 14C. Além disso, a fonte específica de carbono oriundo de biofonte {por exemplo, glicose vs. glicerol) pode ser determinada por assinaturas de carbono isotópico duplo {ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 7.169.588, que é aqui incorporada por referência). A capacidade de distinguir bioprodutos de compostos orgânicos à base de petróleo é benéfica na localização desses materiais no comércio. Por exemplo, compostos orgânicos ou produtos químicos que compreendem tanto perfis de isótopos de carbono de base biológica e à base de petróleo podem ser distinguidas de compostos orgânicos e produtos químicos produzidos somente de materiais à base de petróleo. Assim, os bioprodutos podem ser seguidos ou acompanhados no comércio, com base no seu perfil único de isótopo de carbono. Bioprodutos podem ser distinguidos de compostos orgânicos à base de petróleo através da comparação da razão isotópica do carbono estável (13C/12C) em cada combustível. A razão 13C/12C num determinado bioproduto é uma consequência da razão 13C/12C no dióxido de carbono atmosférico no momento em que o dióxido de carbono é fixado. Ele também reflete a via metabólica precisa. Variações regionais também podem ocorrer. Petróleo, plantas C3 (as folhosas), as plantas C4 (gramíneas) e carbonatos marinhos todos mostram diferenças significativas em 13C/12C e os valores de δ13C correspondentes. Além disso, materiais lipídicos de plantas C3 e C4 apresentam características analíticas distintas daquelas dos materiais derivados dos componentes de carboidratos das mesmas plantas como uma consequência da via metabólica. Dentro da precisão da medição, 13C mostra grandes variações devido aos efeitos do fracionamento isotópico, a mais significativa dentre as quais para bioprodutos é o mecanismo fotossintético. A principal causa das diferenças na razão de isótopos de carbono em plantas está intimamente associada com as diferenças na via de metabolismo de carbono fotossintético nas plantas, em particular a reação que ocorre durante a carboxilação primária (isto é, a fixação inicial de CO2 atmosférico). Duas grandes classes de vegetação são aquelas que incorporam o ciclo fotossintético C3 (ou Calvin- Benson) e aqueles que incorporam o ciclo fotossintético C4 (ou Hatch-Slack) . Em plantas C3, a fixação primária de CO2 ou reação de carboxilação envolve a enzima ribulose-l,5- difosfato carboxilase, e o primeiro produto estável é um composto de carbono-3. Plantas C3, como as folhosas e as coníferas, são dominantes nas zonas de clima temperado. Em plantas C4, uma reação de carboxilação adicional envolvendo uma outra enzima, a fosfoenol-piruvato carboxilase, é a reação de carboxilação primária. O primeiro composto estável de carbono é um ácido de carbono-4 que é subsequentemente descarboxilado. O CO2 assim liberado é refixado pelo ciclo C3. Exemplos de plantas C4 são gramíneas tropicais, milho e cana-de-açúcar. Ambas as plantas C4 e C3 apresentam uma faixa de razões isotópicas 13C/12C, mas os valores típicos são cerca de -7 a cerca de -13 por mil para plantas C4 e cerca de -19 para cerca de -27 por mil para plantas C3 (ver, por exemplo, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355 (1977)). O carvão e o petróleo geralmente apresentam-se neste último intervalo. A escala de medição de 13C foi originalmente definida por um conjunto zero por Pee Dee Belemnite (PDB) de calcário, onde os valores são dados por variações de partes por milhar deste material. Os valores “δ13C" são expressos em partes por mil (por mil), abreviada, O/OO, e são calculados como se segue: δ13C (0/00) = [(13C/12C)sample-(13C/12C)padrão]/( 13C/12C)padrão X 1000 Uma vez que o material de referência PDB (RM) foi esgotado, uma série de RMs alternativos tem sido desenvolvida em cooperação com a IAEA, USGS, NIST, e outros laboratórios internacionais de isótopos selecionados. Notações para os desvios por mil de PDB é δ13C. As medições são feitas em CO2 por espectrometria de massa de razão estável de alta precisão (IRMS) com íons moleculares de massas 44, 45, e 46. As composições aqui descritas incluem bioprodutos produzidos por qualquer um dos métodos aqui descritos, incluindo, por exemplo, aldeídos graxos e produtos de álcool. Especificamente, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -28 ou maior, cerca de -27 ou maior, -20 ou maior, -18 ou maior, -15 ou maior, -13 ou maior, -10 ou maior, -8 ou maior. Por exemplo, os bioprodutos pode ter um δ13C de cerca de -30 a cerca de -15, -27 a cerca de -19, cerca de -25 a cerca de -21, cerca de -15 a cerca de -5, cerca de -13 a cerca de -7, ou cerca de -13 a cerca de -10. Em outros casos, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -10, -11, -12, ou -12,3. Bioprodutos, incluindo os bioprodutos produzidos de acordo com esta descrição, também podem ser distinguidas de compostos orgânicos à base de petróleo pela comparação da quantidade de 14C em cada composto. Devido ao 14C ter uma meia-vida nuclear de 5.730 anos, combustíveis à base de petróleo que contenham carbonos "mais velhos" podem ser distinguidos de bioprodutos que contêm carbonos "mais novos" {ver, por exemplo, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", ““ Characterization of Environmental Particles ”, J. Buffle e H. P. van Leeuwen, Eds., 1 de Vol. I das Séries de Química Analítica Ambiental da IUPAC (Lewis Publishers, Inc.) , 3-74, (1992)) .

[0099] O pressuposto básico da datação por radiocarbono é que a constância da concentração de 14C na atmosfera leva à constância de 14C nos organismos vivos. No entanto, por causa de testes nucleares na atmosfera desde 1950 e da queima de combustíveis fósseis desde 1850, 14C adquiriu uma característica de tempo geoquímico secundária. Sua concentração no CO2 atmosférico, e, portanto, na biosfera viva, aproximadamente dobrou no pico do teste nuclear, em meados da década de 1960. Desde então, está gradualmente voltando ao estado de equilíbrio cosmogênico (atmosférica) da linha de base de isótopos com taxa de (14C/12C) de cerca de 1,2 x 10-12, com "meia-vida" de relaxamento aproximada de 7-10 anos. (Esta última meia-vida não deve ser tomada literalmente, mas sim, deve-se usar a função de entrada/decaimento nuclear atmosférico detalhada para traçar a variação de 14C atmosférico e da biosfera desde o início da era nuclear) É esta última característica de tempo de 14C biosférico que mantém a promessa de datações anuais de carbono biosférico recente. O 14C pode ser medido por espectrometria de massa com acelerador (AMS), com resultados dados em unidades de "fração de carbono moderno" (fM). fM é definido pelos Materiais de Referência Padrão (MRE) 4990B e 4990C do National Institute of Standards and Tecnology (NIST). Como usado aqui, a fração de carbono moderno (fM) tem o mesmo significado como definido pelos materiais de referência padrão (MRE) 4990B 4990C do National Institute of Standards and Tecnology (NIST), conhecidos como padrões de ácidos oxálicos HOxI HOxII, respectivamente. A definição fundamental refere-se a 0,95 vezes a 14C/12C razão isotópica HOxI (com referência a AD 1950) . Este é mais ou menos equivalente ao pré-madeira- corrigida decadência Revolução Industrial. Para a vida atual na biosfera (material vegetal), FM é de aproximadamente 1,1. Isto é aproximadamente equivalente à madeira pré-Revolução Industrial com decaimento corrigido. Para biosfera viva atual (material vegetal), fM é de aproximadamente 1,1.

[0100] As composições aqui descritas incluem bioprodutos que podem ter um fM 14C de pelo menos cerca de 1. Por exemplo, o bioprodutos da descrição pode ter uma fM 14C de pelo menos cerca de 1,01, uma fM 14C de cerca de 1 a cerca de 1,5, um fM 14C de cerca de 1,04 a cerca de 1,18, ou um fM 14C de cerca de 1,111 para cerca de 1,124. Outra medida de 14C é conhecida como a porcentagem de carbono moderno (pMC) . Para um arqueólogo ou um geólogo usando datação de 14C, AD 1950 equivale a "zero anos". Isto também representa 100 pMC. A "Bomba de carbono" na atmosfera atingiu quase o dobro do nível normal em 1963, no auge de armas termonucleares. A sua distribuição dentro da atmosfera tem sido aproximada desde seu surgimento, apresentando valores que são maiores que 100 pMC para as plantas e animais que vivem desde AD 1950. Tem diminuído gradualmente ao longo do tempo, com o valor de hoje estando perto de 107,5 pMC. Isto significa que um material de biomassa fresca, tal como milho, daria um sinal de 14C perto de 107,5 pMC. Compostos à base de petróleo terão um valor de pMC igual a zero. Combinando carbono fóssil com carbono presente no dia resultará numa diluição do valor de pMC atual. Presumindo que 107,5 pMC representa o teor de 14C em materiais de biomassa atuais e 0 pMC representa o teor de 14C em produtos à base de petróleo, o valor de pMC medido para aquele material irá refletir as proporções dos dois tipos de componentes. Por exemplo, um material 100% derivado de grãos de soja atuais daria uma assinatura de radiocarbono perto de 107,5 pMC. Se esse material foi diluído a 50% com produtos à base de petróleo, daria uma assinatura de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Um conteúdo de carbono de base biológica é derivado atribuindo "100%" igual a 107,5 pMC e "0%" igual a 0 pMC. Por exemplo, uma amostra com 9 9 pMC dará um teor de carbono equivalente de base biológica de 93%. Este valor é referido como o resultado médio de carbono de base biológica e assume todos os componentes dentro do material analisado originados quer a partir de material biológico atual ou de material à base de petróleo. Um bioproduto compreendendo um ou mais aldeídos ou alcoóis graxos, tal como aqui descrito pode ter um pMC de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100. Em outros casos, um bioproduto aqui descrito pode ter um pMC de pelo menos cerca de 50 e cerca de 100; cerca de 60 e cerca de 100; cerca de 70 e cerca de 100; cerca de 80 e cerca de 100; cerca de 85 e cerca de 100; cerca de 87 e cerca de 98; ou cerca de 90 e cerca de 95. Ainda em outros casos, um bioproduto aqui descrito pode ter um pMC de cerca de 90, 91, 92, 93, 94 ou 94,2.

Triagem das Composições Alcoóis Graxos Produzidos pela célula hospedeira recombinante

[0101] Para determinar se as condições são suficientes para permitir a expressão, uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene heterólogo ou um gene nativo modificado é cultivada, por exemplo, para cerca de 4, 8, 12, 24, 36, ou 48 horas. Durante e/ou após a cultura, as amostras podem ser obtidas e analisadas para determinar se o nível de produção de álcool graxo (título, rendimento ou da produtividade) é diferente do que a da célula parental do tipo selvagem correspondente que não foi modificada. Por exemplo, o meio no qual as células hospedeiras foram cultivadas pode ser testado quanto à presença de um produto desejado. Quando se testa a presença de um produto, ensaios como, mas não limitados a, TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS, podem ser utilizados. Cepas de células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em pequenos volumes (0,001 L a 1 L) de meio em placas ou em frascos sob agitação de modo a pesquisar por nível alterado de produção de álcool graxo ou de espécies graxas. Uma vez que as cepas candidatas são identificadas em pequena escala, essas cepas são cultivadas em volumes maiores (1 L a 1000 L) de meio em biorreatores, tanques e plantas-piloto para determinar o nível preciso de produção de álcool graxo ou espécies graxas. Estas condições para cultura de grandes volumes são utilizadas pelos peritos na arte, para otimizar as condições de cultura para se obter produção álcool graxo ou de espécies graxas desejadas.

Vantagem das Composições de Aldeído Graxo e álcool Graxo

[0102] Os aldeídos são usados para produzir muitos produtos químicos especiais. Por exemplo, os aldeídos são utilizados para produzir polímeros, resinas (por exemplo, Baquelite), corantes, aromatizantes, plastificantes, perfumes, produtos farmacêuticos e outros produtos químicos, alguns dos quais podem ser utilizados como solventes, conservantes ou desinfetantes. Além disso, certos compostos naturais e sintéticos, como vitaminas e hormônios, são aldeídos, e muitos açúcares contêm grupos aldeído. Aldeídos graxos podem ser convertidos em alcoóis graxos, por redução química ou enzimática. Alcoóis graxos têm muitos usos comerciais. As vendas anuais mundiais de alcoóis graxos e seus derivados são acima de 1 bilhão de dólares. Os alcoóis graxos de cadeia mais curta são utilizados nas indústrias cosméticas e alimentícias como emulsificantes, emolientes e espessantes. Devido à sua natureza anfifílica, alcoóis graxos se comportam como surfactantes não iônicos, que são úteis em cuidados domésticos e produtos de uso pessoal, como, por exemplo, detergentes. Além disso, os alcoóis graxos são usados em ceras, gomas, resinas, pomadas e loções farmacêuticas, aditivos de óleo lubrificante, agentes têxteis antiestáticos e de acabamento, plastificantes, cosméticos, solventes industriais, e solventes para gorduras. A descrição também fornece uma composição de surfactantes ou uma composição de detergente compreendendo um álcool graxo produzido por qualquer um dos métodos aqui descritos. Um perito na arte reconhecerá que, dependendo da finalidade a que se destina a composição detergente ou surfactante, diferentes alcoóis graxos podem ser produzidos e utilizados. Por exemplo, quando os alcoóis graxos aqui descritos são utilizados como matéria prima para a produção de surfactante ou detergente, um perito na arte reconhecerá que as características do álcool graxo como matéria prima afetará as características da composição de surfactante ou detergente produzido. Assim, as características da composição do detergente ou do surfactante podem ser selecionadas para produzir alcoóis graxos particulares para utilização como matéria prima. Uma composição de um surfactante e/ou um detergente à base de álcool graxo aqui descrito pode ser misturado com outros surfactantes e/ou detergentes bem conhecidos na arte. Em algumas formas, a mistura pode incluir, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, ou uma faixa limitada por quaisquer de dois dos valores mencionados, por peso do álcool graxo. Em outros exemplos, uma composição detergente ou surfactante pode ser produzida, que inclui, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 2 0%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou uma faixa limitada por quaisquer de dois dos valores mencionados, por peso de um álcool graxo que inclui uma cadeia de carbono que é de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 carbonos de comprimento. Tais composições surfactantes ou detergentes também podem incluir pelo menos um aditivo, como uma microemulsão ou um surfactante ou detergente de fontes não-microbianas tais como óleos vegetais ou de petróleo, que podem estar presentes na quantidade de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou uma faixa limitada por quaisquer de dois dos valores mencionados, por peso do álcool graxo. A descrição é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos. Os exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos. Eles não são para ser interpretados como limitando o conteúdo ou escopo da descrição de qualquer maneira.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Modificações no Hospedeiro de produção - Atenuação da Acil- CoA Desidrogenase

[0103] Este exemplo descreve a construção de uma célula hospedeira geneticamente modificada onde a expressão de uma enzima de degradação de ácido graxo é atenuada. O gene fadE de Escherichia coli MG1655 (uma cepa de E. coli K) foi deletado usando o sistema Lambda vermelho (também conhecido como a Red-Driven Integration) descrito por Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640- 6645 (2000), com as seguintes modificações:

[0104] Os dois seguintes incicadores foram utilizados para criar a deleção de fadE: Del-fadE- F5' - AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGG ATCCGTCGACC (SEQ ID NO: 9); e Del-fadE-R5'- AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGG AGCTGCTTC (SEQ ID NO: 10)

[0105] Os indicadores Del-fadE-F e Del-fadE-R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina (KmR) do plasmídio pKD13 (descrito por Datsenko et al., Supra) por PCR. O produto de PCR foi então utilizado para transformar células electrocompetentes de E. coli MG1655 contendo pKD46 (descrito no Datsenko et al., supra) que tinha sido previamente induzida com arabinose durante 3-4 horas. Na sequência de crescimento de 3 horas em meio de cultura super ótimo com meio de repressão catabólica (SOC) a 37 °C, as células foram plaqueadas em placas de agar de Luria contendo 50 μg/mL de canamicina. As colônias resistentes foram identificadas e isoladas após incubação durante a noite a 3 7 °C. O rompimento do gene fadE foi confirmada por amplificação por PCR utilizando os iniciadores fadE-L2 e fadE-R1, que foram desenhados para parear o gene fadE de E. coli.

[0106] Os iniciadores de fadE de confirmação de exclusão foram: Fade-L2 5'-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC (SEQ ID NO: 11); e Fade-Rl 5'-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG (SEQ ID NO: 12)

[0107] Depois que a deleção de fadE foi confirmada, uma única colônia foi utilizada para remover o marcador KmR utilizando o plasmídio pCP20 como descrito por Datsenko et al., Supra. A cepa resultante de E. coli MG1655 com o gene fadE excluído e o marcador KmR removido foi nomeado E. coli MG1655 ΔfadE, ou E. coli MG 1655 Dl. A produção de derivado do ácido graxo ("Espécies Totais de Gorduras") pela cepa de E. coli MG1655 com o gene fadE excluído foi comparada com a produção de ácidos graxos derivados de E. coli MG1655. As células foram transformadas com plasmídio de produção pDG109 (pCL192 0_PTRc_carBopt_12H08_alrAadp1_fabB [A329G]_fadR) e fermentado em meio com mínimo de glicose. Os dados apresentados na Fig. 5 mostram que a deleção do gene fadE não afetou a produção de derivado de ácido graxo.

EXEMPLO 2 Fluxo Aumentado Através da Via de Síntese de Ácidos Graxos - Mediada pela Acetil CoA carboxilase

[0108] Os principais precursores para a biossíntese de ácidos graxos são malonil-CoA e acetil-CoA (Figura 1). Tem sido sugerido que estes precursores limitam a taxa de biossíntese de ácidos graxos (Figura 2) em E. coli. Neste exemplo, operons acc sintéticos [Corynebacterium glutamicum accABCD (±birA)] foram super-expressos e as modificações genéticas levaram a um aumento da produção de acetil-CoA e malonil-CoA em E. coli. Numa abordagem, a fim de aumentar os níveis de malonil-CoA, um complexo enzimático acetil-CoA carboxilase de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) foi super-expresso em E. coli. A Acetil-CoA carboxilase (acc) é constituída por quatro subunidades distintas, accA, accB, accC e accD (Figura 3) . A vantagem de C. glutamicum acc é que duas subunidades são expressas como proteínas de fusão, accCB accDA, respectivamente, o que facilita a sua expressão equilibrada. Além disso, C. glutamicum birA, que biotinila a subunidade accB (Figura 3) foi super-expresso. O Exemplo 3 descreve a co-expressão de genes acc em conjunto com os operons fab inteiros.

EXEMPLO 3 Fluxo Aumentado Através da Via de Síntese de ácidos graxos - iFABs Produção dos derivados de Ácidos Graxos:

[0109] As estratégias para aumentar o fluxo através da via de síntese de ácidos graxos em células hospedeiras recombinantes incluem tanto a super expressão de genes da biossíntese de ácido graxo em E. coli nativas quanto a expressão de genes da biossíntese de ácidos graxos exógenos de organismos diferentes em E. coli. Neste estudo, os genes da biossíntese dos ácidos graxos de diferentes organismos foram combinados no genoma de E. coli DV2. Dezesseis cepas contendo iFABs 130-145 foram avaliadas. A estrutura detalhada dos iFABs 130-145 está apresentada na Tabela 1, abaixo. Tabela 1. Componentes encontrados em iFABs 130-145.

[0110] Cada "iFAB" incluiu vários fab genes na seguinte ordem: 1) uma enoil-ACP redutase (BS_fabI, BS_FabL, Vc_FabV, ou Ec_FabI); 2) uma b-cetoacil-ACP sintetase III (St_fabH); 3) uma malonil-CoA-ACP transacilase (St_fabD); 4) uma b-cetoacil-ACP-redutase (St_fabG); 5) uma 3-hidroxi- acil-ACP desidratase (St_fabA ou St_fabZ); 6) uma b- cetoacil-ACP sintetase II (Cac_fabF). Observe que St_fabA também tem atividade de trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerase (ref) e que tem Cac_fabF atividade de b-cetoacil- ACP sintetase II e b-cetoacil-ACP sintetase I (Zhu et al., BMC Microbiology 9:119 (2009)) . Ver Tabela 2, abaixo para a composição específica de iFABs 130 - 145. Ver Figs. 7A e B, que fornecem representação esquemática do locus iFAB138, incluindo um diagrama do promotor cat-loxP-T5 integrado anteriormente a FAB138 (7A); e um diagrama de iT5_138 (7B). Tabela 2. Composição de iFABs 130-145.

[0111] O plasmídio pCL_Ptrc_tesA foi transformado em cada uma das cepas e uma fermentação foi conduzida em meio FA2 com 20 horas desde a indução até a colheita, tanto a 32 °C como a 37 °C. Dados para a produção Espécies totais graxas obtidos a partir de análise de duplicatas de placas são mostrados nas Figs. 6A e 6B. A partir desta análise da biblioteca o melhor constructo foi determinado como sendo DV2 com iFAB138. O constructo iFAB138 foi transferida para a cepa D178 para produzir a cepa EG149. Esta cepa foi utilizada para modificação posterior. A sequência de iFAB138 no genoma de EG149 está apresentada como SEQ ID NO:13. A Tabela 3 apresenta a caracterização genética de um número de cepas de E. coli onde os plasmídios contendo os constructos de expressão aqui descritos foram introduzidos como descrito abaixo. Estas cepas e plasmídios foram utilizados para demonstrar as células hospedeiras recombinantes, culturas e métodos de certas formas de realização da presente publicação. As designações genéticoas na Tabela 3 são designações convencionais conhecidas por especialistas na arte. Tabela 3: Caracterização genética de cepas de E. coli

Plasmídios: pDG109, pLC56 and pV171.1 são operons pCL_Ptrc_carB_tesA_alrA_fabB_fadR com expressão variável de carB e tesA. A iFAB138 é SEQ ID NO: 13.

EXEMPLO 4 Aumentando a Quantidade de Ácidos Graxos Livres (AGL) pelo Reparo de Mutações do rph e ilvG

[0112] As mutações ilvG e rph foram corrigidas nesta cepa, resultando numa maior produção de AGL. As cepas D178, EG149 e V668 (Tabela 3) foram transformadas com pCL_Ptrc_tesA. A fermentação foi realizada a 32 °C em meio FA2 durante 4 0 horas para comparar a produção de AGL, das cepas D178, EG149 e V668 com pCL_Ptrc_tesA. A Correção das mutações de rph e ilvG resultou num aumento de 116% na produção de AGL da cepa base com pCL_Ptrc_tesA. Como pode ser visto na Figura 8, V6 6 8/pCL_Ptrc_tesA produz mais AGL do que D178/ pCL_Ptrc_tesA, ou o controle EG149/ pCL_Ptrc_tesA. Como AGL é um precursor para os produtos LS9, uma maior produção de AGL é um bom indicador de que a nova cepa pode produzir níveis mais elevados de produtos LS9. A fermentação e a extração foram executadas de acordo com um protocolo padrão de fermentação FALC exemplificada como segue.

[0113] Um frasco do banco de células congeladas selecionadas da cepa de E. coli foi utilizada para inocular 20 mL de caldo de LB em 125 mL num frasco sob agitação contendo o antibiótico espectinomicina a uma concentração de 115 μg/mL. Este frasco sob agitação foi incubado num agitador orbital a 32 °C durante cerca de seis horas, em seguida, 1,25 mL de caldo foi transferido para 125 mL meio de cultura PFA2 baixo (2 g/L de NH4Cl, 0,5 g/L de NaCl, 3 g/L de KH2PO4, 0,25 g/L MgS04-7H20, 0,015 g/L mM CaCl2-2H20, 30 g/L de glicose, 1 mL/L de uma solução de minerais (2 g/L de ZnCl2 • 4H20, 2 g/L de CaCl2 • 6H20, 2 g/L de Na2Mo04 • 2H20, 1,9 g/L de CuS04 • 5H20, 0,5 g/L de H3BO3, e 10 mL/L de HCl concentrado), 10 mg/L de citrato férrico, 100 mM de tampão de Bis-Tris (pH 7,0), e 115 μg/mL de espectinomicina), num Erlenmeyer de 500 mL frasco sob agitação, e incubadas num agitador durante a noite a 32 °C. 100 mL desse meio de cultura PFA2 baixo foram usados para inocular um biorreator Biostat Aplus (Sartorius BBI) de 5L, inicialmente contendo 1,9 L de meio de fermentação esterilizado para biorreator F1. Este meio é composto inicialmente de 3,5 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de (NH4)2S04, 0,5 g/L de MgS04 hepta-hidratado, 10 g/L de glicose esterilizada por filtração, 80 mg/L de citrato férrico, 5 g/L ácidos Casaminos, 10 mL/L de solução de minerais esterilizada por filtração, 1,25 mL/L de uma solução de vitaminas esterilizada por filtração (0,42 g/L de riboflavina, 5,4 g/L de ácido pantotênico, 6 g/L de niacina, 1,4 g/L de piridoxina, 0,06 g/L de biotina, e 0,04 g/L de ácido fólico), e espectinomicina na mesma concentração utilizada nos meios de cultura. O pH da cultura foi mantido a 6,9 utilizando 28% p/v de amônia em água, a temperatura a 33 °C, a taxa de aeração de 1 lpm (0,5 v/v/m), e teor de oxigênio dissolvido a 30% de saturação, utilizando o circuito de agitação em cascata para o controlador DO e suplementação de oxigênio. A formação de espuma foi controlada pela adição automática de um agente antiespumante à base de emulsão de silicone (Dow Corning 1410).

[0114] Um suprimento de nutriente composto de 3,9 g/L de MgS04 hepta-hidratado e 600 g/L de glicose foi iniciado quando a glicose no meio inicial foi quase esgotada (cerca de 4-6 horas após a inoculação) , sob uma taxa de nutrição exponencial de 0,3 hr-1 uma taxa constante de suprimento máximo de glicose de 10 - 12 g/L/h, com base no volume nominal de fermentação de 2L. A produção de álcool graxo no biorreator foi induzida quando a cultura atingiu uma OD de 5 AU (aproximadamente 3-4 horas após a inoculação) pela adição de uma solução estoque de IPTG a 1M até a uma concentração final de 1 mM. O biorreator foi amostrado duas vezes por dia depois disso, e colhidas aproximadamente 72 horas após a inoculação. Uma amostra de 0,5 mL do caldo de fermentação bem homogeneizada foi transferida para um tubo cônico de 15 mL (VWR) , e bem misturada com 5 mL de acetato de butila. O tubo foi vertido várias vezes para misturar, em seguida, agitadas vigorosamente durante aproximadamente dois minutos. O tubo foi então centrifugado durante cinco minutos para separar as fases orgânica e aquosa, e uma porção da fase orgânica transferida para um frasco de vidro para análise por cromatografia gasosa.

EXEMPLO 5 Produção aumentada de Álcool Graxo por Mutagênese de Transposon - yijP

[0115] Para melhorar o título, rendimento, produtividade da produção de álcool graxo por E. coli, a mutagênese de transpon e análise de alto rendimento foram conduzidas e mutações benéficas foram sequenciadas. A inserção do transposon na cepa yijP mostrou melhorar o rendimento de alcoóis graxos nas fermentações de frasco sob agitação e fermentação por lote-alimentado. A cepa SL313 produz alcoóis graxos. O genótipo desta cepa está fornecida na Tabela 3. Os clones de transposon foram então submetidos à análise de alto rendimento para medir a produção de alcoóis graxos. Resumidamente, as colônias foram repicadas para placas de poços profundos contendo LB, cultivadas durante a noite, e inoculados em LB fresco e em crescimento durante 3 horas, inoculados em meios FA2.1 fresco, cultivada durante 16 horas, em seguida extraídas usando acetato de butila. O extrato bruto foi derivatizado com BSTFA (N,0- bis [Trimetilsilil]trifluoracetamida) e analisados utilizando GC/FID. Espectinomicina (l00 mg/L) foi incluído em todos os meios para manter a seleção do plasmídio pDG109. Foram selecionados os que obtiveram sucesso, escolhendo clones que produziram espécies graxas totais similares às da cepa controle SL313, mas que tinham uma maior porcentagem de espécies de alcoóis graxos e uma porcentagem menor de ácidos graxos livres do que o controle. A cepa 68F11 foi identificada como acerto e foi validada em uma fermentação em frasco sob agitação usando meio FA2.1. Uma comparação do hit de transposon 68F11 com relação ao controle SL313 indicou que 68F11 produz uma porcentagem mais elevada de espécies de álcool graxo do que o controle, enquanto que ambas as cepas produzem títulos semelhantes de espécies graxas totais. Uma única colônia do hit 68F11, denominada LC535, foi sequenciada para identificar o local de inserção do transposon. Resumidamente, o DNA genômico foi purificado a partir de 10 ml de cultura LB durante a noite usando o kit ZR fúngico/bacteriano DNA MiniPrep™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA genômico purificado foi sequenciado no sentido externo do transposon utilizando iniciadores internos para o transposon: DG150 5'-GCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTTGCTACGCCTG-3' (SEQ ID NO: 14) DG131 5’-GAGCCAATATGCGAGAACACCCGAGAA-3'(SEQ ID NO: 15)

[0116] A cepa LC535 foi determinada para ter uma inserção de transposon no gene yijP (Figura 18) . O yijP codifica uma proteína de membrana interna conservada cuja função não é clara. O gene é yijP está num operon e é co- transcrito com o gene ppc, que codifica a fosfoenolpiruvato carboxilase, e o gene yijO, que codifica um regulador de transcrição ligante a DNA predito de função desconhecida. Os promotores internos para o transposon provavelmente terão efeitos sobre o nível e o tempo de transcrição de yijP, ppc e yijO, e também pode ter efeitos sobre genes adjacentes frwD, pflC, pfld e ArgE. Os promotores internos para o cassete de transposon são mostrados na Figura 18, e podem ter efeitos sobre a expressão do gene adjacente. A cepa LC535 foi avaliada numa fermentação tipo lote- alimentado em duas datas diferentes. Ambas as fermentações demonstraram que LC535 produziu alcoóis graxos com um rendimento mais elevado do que o controle SL313, e a melhora foi de 1,3 - 1,9% de rendimento absoluto baseada na entrada de carbono. O cassete de transposon yijP foi avaliada ainda num cepa diferente V940, que produz álcool graxo com rendimento maior do que a cepa SL313 tensão. O cassete yijP::Tn5-cat foi amplificado a partir da cepa LC535 utilizando os iniciadores: LC277 5’-CGCTGAACGTATTGCAGGCCGAGTTGCTGCACCGCTCCCGCCAGGCAG- 3'(SEQ ID NO: 16) LC278 5’- GGAATTGCCACGGTGCGGCAGGCTCCATACGCGAGGCCAGGTTATCCAACG-3'(SEQ ID NO: 17)

[0117] Este DNA linear foi eletroporado na cepa SL571 e integrado no cromossomo, utilizando o sistema recombinação lambda vermelho. As colônias foram selecionadas utilizando-se iniciadores de fora da região do transposon: DG407 5'-AATCACCAGCACTAAAGTGCGCGGTTCGTTACCCG-3'(SEQ ID NO: 18) DG408 5 '-ATCTGCCGTGGATTGCAGAGTCTATTCAGCTACG-3' (SEQ ID NO: 19)

[0118] Uma colônia com o cassete de transposon yijP correto (Fig. 9) foi transformado com o plasmídio de produção pV171.1 para produzir a cepa D851. D851 (V940 yijP::Tn5-cat) foi testada numa fermentação de frasco sob agitação contra a cepa isogênica V940 que não contém o cassete de transposon yijP. O resultado desta fermentação mostrou que o cassete de transposon yijP confere produção de uma maior porcentagem de álcool graxo pela cepa D851 em relação à cepa V940 e produz títulos semelhantes de espécies graxas totais à da controle V940. A cepa D851 foi avaliada em uma fermentação tipo lote-alimentado em duas datas diferentes. Os dados destas fermentações são mostrados na Tabela 4, que demonstra que em 5 litros de fermentação tipo lote-alimentado, as cepas com a inserção do transposon yijP::Tn5-cat teve um aumento no rendimento de espécies graxos totais ("FAS") e um aumento na porcentagem álcool graxo ("FALC"). "Espécies Graxas" incluem FALC e AGL. Tabela 4: Efeito da inserção do transposon yijp no título e na produção de FAS e FALC

Método de fermentação no tanque:

[0119] Para avaliar a produção de ésteres de ácidos graxos no tanque um frasco de glicerol da cepa desejada foi usado para inocular 20 mL de LB + espectinomicina em frasco sob agitação, e incubar a 32 °C durante cerca de seis horas. 4 mL de cultura de LB foi usada para inocular 125 mL de meio de cultura PFA2 baixo (abaixo) , que foi então incubada a 32 °C no agitador durante a noite. 50 mL desta cultura foi usado para inocular 1 L de meio de cultura para tanque. Os tanques foram mantidos a um pH de 7,2 e 30,5 °C, sob condições de pH com uma taxa de alimentação máxima de 16 g/L/h (glicose ou metanol). Tabela 5: Meio de Cultura PFA baixo

Tabela 6: Meio de Cultura para Tanque

EXEMPLO 6 A Adição de um marcador de fusão N-Terminal de 60bp para CarB (CarB60)

[0120] Existem várias formas de aumentar a solubilidade, a estabilidade, a expressão ou a funcionalidade de uma proteína. Numa abordagem para aumentar a solubilidade de CarB, um marcador de fusão poderia ser clonado anteriormente ao gene. Outra abordagem o aumento da expressão de CarB, o promotor ou local de ligação ao ribossomo (RBS) do gene podem ser alterados. Neste estudo, carB (SEQ ID NO: 7) foi modificada pela adição de um marcador de fusão N-terminal de 60bp. Para gerar a proteína modificada (aqui referida como "CarB60"), carB foi primeiro clonado no vetor pET15b utilizando os iniciadores: 5'- GCAATTCCATATGACGAGCGATGTTCACGA-3'(SEQ ID NO: 20); e 5'- CCGCTCGAGTAAATCAGACCGAACTCGCG (SEQ ID NO: 21).

[0121] A pET15b - carB constructo continha 60 nucleotídeos posicionados diretamente antes do gene carB: 5 ' - ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA T (SEQ ID NO: 22)

[0122] A versão do marcador de carB foi renomeada carB60. O pET15b_carB60 foi então digerido usando as enzimas de restrição NcoI e HindIII e subclonado no vetor OP80 derivado de pCL1920 que foi cortado com as mesmas enzimas. Este plasmídio foi transformado na cepa V324 (MG1655 ΔfadE::FRT ΔfhuA::FRT fabB::A329V entD::T5-entD lacIZ::PTRc-‘TesA) para avaliar a produção de FALC. As cepas procederam à fermentação de acordo com um procedimento padrão (resumidos abaixo) e os títulos das espécies graxas totais e do total de álcool graxo foram quantificados. A Figura 10 mostra que CarB60 aumenta os títulos de álcool graxo e, por conseguinte, a enzima CarB60 tem atividade celular total maior do que CarB quando expresso a partir de um plasmídio multicópia.

[0123] Para avaliar a produção de alcoóis graxos nas cepas de produção, os organismos transformados foram cultivados em 2 mL de caldo LB suplementado com antibióticos (100 mg/L) a 37 °C. Após crescimento durante a noite, 40 uL da cultura foi transferida para 2 mL de LB fresco suplementado com antibióticos. Após 3 horas de crescimento, 2 mL da cultura foram transferidos para um frasco de 125 mL contendo 20 mL de meio M9 com 3% de glicose suplementado com 20 μL solução de minerais, 10 μg/L de citrato de ferro, 1 μg/L de tiamina e antibióticos (meio FA2) . Quando o OD600 da cultura atingiu 1,0, 1 mM de IPTG foi adicionado a cada frasco. Após 20 horas de crescimento a 37 °C, amostras de 400 μL de cada frasco foram removidas e os alcoóis graxos extraídos com 400 μL de acetato de butila. Para entender melhor o mecanismo da melhoria da atividade de CarB, CarB60 foi purificada da cepa D178 que não contém ‘tesA (MG1655 ΔfadE::FRT ΔfhuA::FRT fabB::A329V entD::PT5-entD). Resumidamente, pCL1920_carB60 foi transformada na cepa D178, o qual foi modificada para a produção de álcool graxo, e a fermentação foi realizada a 37 °C em FA-2 suplementado com espectinomicina (100 μg/mL). Quando o OD600 da cultura atingiu 1,6, as células foram induzidas com 1 mM de isopropil-βD-tiogalactopiranosideo (IPTG) e incubadas durante mais 23 h a 37 °C. Para a purificação de CarB60, as células foram coletadas por centrifugação durante 20 min a 4 °C a 4500 rpm. A massa celular (10 g) foi suspensa em 12 mL de BugBuster MasterMix (Novagen) e uma solução de mistura de inibidores de protease. As células foram rompidas com prensa francesa e o homogeneizado resultante foi centrifugado a 10000 rpm para remover os restos celulares. Ni-NTA foi adicionada à mistura resultante, e a suspensão foi agitada a 4 °C, a 100 rpm durante 1 hora num agitador rotativo. A mistura resultante foi aplicada em uma coluna e o fluxo de passagem foi coletado. A resina Ni-NTA foi lavada com 10 mM de imidazol em 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 8,0 contendo 3 00 mM de NaCl, e ainda lavada com 2 0 mM de imidazol em 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 8,0 contendo 300 mM de NaCl. A proteína CarB60 foi eluida com 250 mM de imidazol em 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 8,0 contendo 300 mM de NaCl, e analisados por SDS-PAGE. A proteína foi dialisada contra 20% (v/v) de glicerol em 50 de tampão fosfato de sódio pH 7,5 produzindo aproximadamente 10 mg de CarB60 por litro de cultura. A proteína foi rapidamente congelada e armazenada a -80 °C até utilização.

[0124] A proteína CarB60 foi abundantemente expressa a partir de um plasmídio de cópias múltiplas. A análise adicional de SDS-PAGE mostrou que a expressão de CarB60 foi maior do que CarB. O nível de expressão mais elevado de CarB60 sugeriu que o gene carB60 integrado no cromossoma de E. coli produziria mais proteína do que o gene carB no mesmo local. Para testar esta hipótese, o gene carB60 foi integrado no cromossomo de E. coli. Resumidamente, o gene carB60 foi primeiro amplificado a partir pCL_carB60 utilizando iniciador a frente: 5'-ACGGATCCCCGGAATGCGCAACGCAATTAATGTaAGTTAGCGC-3' (SEQ ID NO:23); e iniciador reverso: 5'-TGCGTCATCGCCATTGAATTCCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGG-3' (SEQ ID NO:24).

[0125] Um segundo produto de PCR foi amplificado a partir do vetor pAH56 utilizando iniciador à frente: 5'- ATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' (SEQ ID NO:25); e iniciador reverso: 5'-AATGGCGATGACGCATCCTCACG-3'(SEQ ID NO:26)

[0126] Este fragmento contém um cassete de resistência à canamicina, sítio ÀattP, e origem YR6k de replicação. Os dois produtos de PCR foram unidos usando o kit de InFusion (Clontech) para criar o plasmídio pSL116-126. A cepa de produção de alcoóis graxos que contém uma forma integrada de 'TesA12H08 e um plasmídio auxiliar pINT foi transformado com qualquer pSL116-126 contendo o gene carB60 ou plasmídio F27 contendo o gene carB. Estas cepas foram fermentadas em meio FA2 de acordo com procedimentos padrão para fermentação em frasco sob agitação, como descrito acima. Foi utilizada para caracterizar e quantificar os alcoóis graxos e ésteres de ácidos graxos, detecção por cromatografia gasosa ("GC"), acoplada à ionização de chama ("FID"). O extrato bruto foi derivatizado com BSTFA (N,O- bis[Trimetilsilil]trifluoroacetamida) e analisados utilizando um GC/FID. A quantificação foi efetuada através da injeção de várias concentrações de referências autênticas adequados usando o método GC descrito acima, bem como os ensaios incluindo, mas não se limitando a, cromatografia em fase gasosa (GC), espectroscopia de massa (MS) , cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida (LC), GC acoplado a um detector de ionização de chama (GC-FID), GC-MS e LC-MS, podem ser utilizados. Ao proceder a um ensaio para a expressão de um polipeptídeo, podem ser utilizadas técnicas como transferência Western blotting e dot blotting.

[0127] Os resultados da fermentação após 20 horas são mostradas na Figura 11. Os títulos de produtos graxos totais das duas cepas são semelhantes (2,4 g/L espécies graxas totais), no entanto CarB60 integrada converte uma maior fração de ácidos graxos livres de comprimento de cadeia C12 e C14 em alcoóis graxos, comparado com CarB sem o marcador N-terminal. Estes dados sugerem que as células que expressam CarB60 tem uma atividade mais elevada da ácido carboxílico redutase celular total, e pode converter mais de AGL em alcoóis graxos. Assim, carB60 quando integrada no cromossomo é um modelo CarB melhorado que fornece atividade desejada para gene CarB evoluído para identificar variantes CarB melhoradas.

EXEMPLO 7 Geração de Mutantes CarB

[0128] A enzima CarB é um passo limitante da velocidade na produção de alcoóis graxos, sob determinadas condições de processo. Para produzir alcoóis graxos de forma econômica, foram feitos esforços para aumentar a atividade da enzima CarB.

[0129] Análise de Biblioteca de PCR propensa a erro:

[0130] A mutagênese aleatória utilizando PCR propensa a erro foi realizada sob condições onde a fidelidade da cópia da DNA polimerase é baixa. Os ácidos nucleicos mutagenizados foram clonados em um vetor, e a PCR propensa a erro seguida por análise de alto rendimento foram feitas para descobrir mutações benéficas que aumentem a conversão de ácidos graxos livres para alcoóis graxos (como detalhado abaixo). Resíduos importantes foram mutados por outros aminoácidos. Uma série de mutações de aminoácidos individuais e combinações de mutações aumentou a fração de espécies graxas que são convertidas em alcoóis graxos. Resumidamente, foram geradas mutações aleatórias no gene carB60opt por PCR propensa a erro, utilizando o kit de Genemorph II (Stratagene). As mutações foram geradas apenas em um dos dois domínios da carB60opt separadamente, para facilitar a clonagem. A biblioteca 1 continha os primeiros 759 resíduos de carB60opt e foi gerado por PCR propensa a erro utilizando os iniciadores: HZ117 5’- ACGGAAAGGAGCTAGCACATGGGCAGCAGCCATCATCAT-3'(SEQ ID NO:27); e DG264 5'- GTAAAGGATGGACGGCGGTCACCCGCC-3'(SEQ ID NO:28). O vetor para a Biblioteca 1 foi um plasmídio pDG115 digerido com as enzimas NheI e PshAI. A biblioteca 2 continha os últimos 435 resíduos de carB60opt e foi gerada por PCR propensa a erro utilizando os iniciadores: DG263 5'-CACGGC GGGTGA CCGCCG TCCATCC-3'(SEQ ID NO:29); e HZ118 5'-TTAATTCCGGGGATCCCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGGTC-3'(SEQ ID NO:30).

[0131] O vetor para a Biblioteca 2 foi o plasmídio pDGl15 digerido com as enzimas PshAI e BamHI. As inserções propensas a erro foram clonadas nos vetores utilizando InFusion Advantage (Clontech) e amplificadas através da cepa de clonagem NEB Turbo (New England Biolabs). As bibliotecas foram, então, transformadas em cepas EG442 (EG149 Tn7::PTRC-ABR lacIZ::PT5O-ABR). Os clones carB60opt propenso a erros foram então submetidos à análise de alto rendimento para medir a produção de alcoóis graxos. Resumidamente, as colônias foram repicadas para placas de poços profundos contendo LB, cultivadas durante a noite, inoculados em LB fresco e cresceram durante 3 horas, inoculados em meio FA-2.1, cultivadas durante 16 horas, em seguida extraiu-se usando acetato de butila. O extrato em bruto foi derivatizado com BSTFA (N,O-bis[Trimetilsilil] trifluoroacetamida) e analisadas utilizando um método GC/FID padrão. Espectinomicina (100 mg/L) foi incluída em todos os meios para manter a seleção do plasmídio pDG115. Os que tiveram sucessos foram selecionados, escolhendo clones que produziram um título menor de ácidos graxos livres totais e um maior título de álcool graxo total comparado com a cepa controle. Para comparar os sucessos de diferentes análises de fermentação, a conversão de ácidos graxos livres para alcoóis graxos foi normalizado pelo cálculo do percentual de ácidos graxos livres normalizado NORM AGL = Percentual de mutante AGL/Percentual Controle de AGL onde "Percentual de AGL" é o título de espécies de ácidos graxos livres totais dividido pelo título total de espécies graxas. Os sucessos foram submetidas a uma posterior verificação utilizando fermentações em frasco sob agitação, conforme descrito abaixo.

[0132] Os sucessos foram sequenciados para identificar mutações benéficas. O sequenciamento foi realizado por colônia de PCR do gene carB60opt completo utilizando iniciadores SL59 5'-CAGCCGTTTATTGCCGACTGGATG-3 '(SEQ ID NO:31); e EG479 5'-CTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTC-3'(SEQ ID NO: 32), e sequenciado utilizando os iniciadores internos para a enzima carB60opt.

[0133] As mutações benéficas que melhoraram a enzima CarB60opt são mostrados na Tabela 7. A coluna de ácido graxo livre normalizado (NORM AGL) indica o melhoramento da enzima, com os valores mais baixos que indicam o melhor aperfeiçoamento. "Poço #" indica o poço em que essa mutação foi encontrada. Todos os números dos resíduos referem-se à sequência da proteína CarB, a qual não inclui o marcador de 60 bp. Mutações indicados com o prefixo "Tag:" indica mutações no marcador N-terminal 60 bp/20 resíduo. Tabela 7: Mutações benéficas na enzima CarB Identificadas Durante a Análise de propensão a erro (Mutações de marcador removidas)

[0134] Mutagênese de Saturação (Bibliotecas Combo 1 e 2 geradas):

[0135] As posições de aminoácidos consideradas benéficas para a produção de alcoóis graxos seguida de PCR propensa a erros foram submetidas a mutagênese. Os iniciadores contendo os nucleotídeos degenerados NNK ou NNS foram usados para substituir estas posições por outros aminoácidos. As “bibliotecas de mutagênese de saturação" resultantes foram pesquisadas como descrito acima para as bibliotecas propensas de erro, e os sucessos foram ainda identificadas por uma conversão melhorada do álcool graxo (um título menor de ácidos graxos livres totais e um maior título de álcool graxo total comparado à cepa parental "controle"). Mudanças de um único aminoácido/codon em nove posições diferentes que melhoram a produção de alcoóis graxos estão apresentadas na Tabela 8. Os sucessos foram sujeitos a uma verificação posterior usando fermentações em frasco sob agitação, tal como aqui descrito. Tabela 8: Mutações benéficas Identificadas na enzima CarB Durante Mutagênese de Saturação de Aminoácidos

[0136] As substituições de aminoácidos consideradas benéficas para a produção de alcoóis graxos foram combinadas posteriormente. Utilizou-se PCR para amplificar partes do gene carBopt contendo várias mutações desejadas, e as partes foram unidas entre si utilizando um método baseado em PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. e Pease, L.R. 1989). O gene carBopt foi analisado sem o marcador N-terminal 60 bp. As mutações combinadas nesta biblioteca de combinação são mostradas na Tabela 9. Tabela 9: Mutações Carb da Primeira Biblioteca de Combinação

[0137] Para facilitar a triagem, a biblioteca de combinação CarB resultante foi, em seguida, integrada no cromossomo da cepa V668 no locus lacZ. A sequência do gene carBopt neste locus é apresentada como SEQ ID NO:7. O genótipo da cepa V668 é MG1655 (ΔfadE::FRT ΔfhuA::FRT ΔfabB::A329V ΔentD::T5-entD ΔinsH-l1:: Piacuvsfabl38 rph+ilvG+) (como mostrado na Tabela 3 e Fig. 16). As cepas foram então transformadas com o plasmídio pVA3, que contém TesA, uma enzima CarB inativa cataliticamente CarB [S693A], que destrói o sítio de ligação à fosfopanteteína, e outros genes que aumentam a produção de ácidos graxos livres. A biblioteca de combinação foi analisada como acima descrito para a biblioteca propensa a erro. V668 com carBopt integrado (A535S) na região lacZ e contendo pVA3 foi utilizada como controle. Foram selecionados os sucessos que aumentaram a produção de alcoóis graxos e foram sujeitas a uma verificação posterior usando fermentações em frascos sob agitação, tal como descrito no Exemplo 5. A porcentagem melhorada da produção de álcool graxo seguida por fermentação em frasco sob agitação de células hospedeiras recombinantes que expressando mutantes de combinação CarB é mostrado na Figura 12.

[0138] Os mutantes de combinação CarB integrados foram amplificados a partir de sucessos carB integrado por PCR utilizando os iniciadores: EG58 5'-GCACTCGACCGGAATTATCG (SEQ ID NO:33); e EG626 5'-GCACTACGCGTACTGTGAGCCAGAG (SEQ ID NO:34).

[0139] Estes insertos foram reamplificados utilizando os iniciadores: DG243 5'-GAGGAATAAACCATGACGAGCGATGTTCACGACGCGACCGACGGC (SEQ ID NO:35); e DG210 5'-CTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGG (SEQ ID NO:36).

[0140] Usando InFusion de clonagem, os mutantes carB agrupados foram clonados num plasmídio de produção, pV869, que foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores: DG228 5'-CATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATAC (SEQ ID NO:37); e DG318 5'-TGACCTGCGCGAGTTCGGTCTGATTTAG (SEQ ID NO:38).

[0141] O mutante carB que tiveram o melhor desempenho na análise de plasmídio de fermentação em frasco sob agitação (carB2; Tabela 11) foi designado VA101 e da cepa controle transportando carBopt [A535S] foi designada VA82. Veja Fig. 13 .

[0142] As substituições de aminoácidos no domínio de redução de carB considerados benéficos para a produção de álcool graxo foram combinadas com um dos melhores sucessos da biblioteca de combinação carB-L, "carB3" (Tabela 11) . Foi usado PCR para amplificar partes do gene carBopt contendo várias mutações desejadas no domínio Redução, e as partes foram unidas entre si utilizando SOE PCR. As mutações combinadas nesta biblioteca de combinação são mostradas na Tabela 10. Tabela 10: Mutações CarB da Segunda Biblioteca de Combinação

[0143] A biblioteca de combinação foi analisada como acima descrito para a biblioteca propensa erro. V668 com carB3 integrada na região lacZ e contendo pVA3 foi utilizado como um controle. Os sucessos que exibiram um aumento da produção de alcoóis graxos foram selecionados e foram sujeitos a uma verificação posterior usando fermentações em frasco sob agitação, tal como descrito acima. Os resultados de uma fermentação em frasco sob agitação, mostrando uma melhoria percentual da produção de álcool graxo usando uma distinta mutação de combinação CarB (carB4) são mostrados na Tabela 11. Uma representação gráfica da eficiência da conversão relativa de variantes de baixa cópia de CarB é apresentada na Fig. 14. Os resultados apresentados na Tabela 11 são obtidos de ensaios em bioreatores em condições idênticas. Tabela 11: Variantes CAR

As sequências de DNA de CarA, FadD9, CarB, e CarB60 são aqui apresentadas como SEQ ID NO: 41, 42, 43 e 44, respectivamente.

[0144] Identificação de mutações benéficas adicionais na enzima CarB por mutagênese de saturação:

[0145] Um sistema de triagem dual-plasmídio foi posteriormente desenvolvido e validado para identificar variantes CarB melhoradas sobre CarB4 para a produção de FALC. O sistema de duplo plasmídio preenchiam os seguintes critérios: 1) clones mutantes produzem um título elevado de FA para proporcionar fluxo de ácido graxo em excesso da atividade CarB. Isto é realizado pela transformação de uma cepa base (V668 com duas cópias do cromossômico TE) com um plasmídeo (pLYC4, pCL192 0_PTRC_carDead_tesA_alrAadpl_fabB [A329G]_fadR) que transporta o operon FALC com uma enzima CarB inativa cataliticamente CarB[S693A] para aumentar a produção de ácidos graxos livres; 2). O plasmídio de triagem com o molde mutante carB, preferencialmente menor do que 9 kb, é passível de procedimentos de mutagênese de saturação e é compatível com a expressão de pLYC4; 3). A faixa dinâmica da atividade CarB é ajustável. Isto é conseguido pela combinação de um promotor mais fraco (PTRCI) e códons de iniciação alternativos (GTG ou TTG) para ajustar os níveis de expressão de CarB4. 3) Boa estabilidade do plasmídio, um módulo de toxina/antitoxina (operon ccdBA) foi introduzido para manter a estabilidade do plasmídio.

[0145] Em resumo, o plasmídio de triagem pBZ1 (pACYCDuet-l_PTRC1- carB4GTG_rrnBter_ccdAB) foi construído a partir de quatro partes usando método de clonagem In-Fusion HD (Clontech) misturando proporções molares iguais de quatro partes (PTRCI, carB4 com códons de iniciação ATG/TTG/GTG, iniciar códon terminadores rrnB T1T2 com ccdAB, e vetor pACYCDuet-1) . As partes (1 a 4) foram amplificadas por PCR com os seguintes pares de iniciadores: (1) PTRCI- Iniciador direto 5’- CGGTTC TGGCAA ATATTC TGAAAT GAGCTG TTGACA ATTAAT CAAATC CGGCTC GTATAA TGTGTG-3'(SEQ ID NO:45) e iniciador reverso 5'-GGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATACAT-3'(SEQ ID NO:46) usando plasmídio pVA232 (pCL1920_PTRc_carB4_tesA_alrAadp1_fabB [A329G]_fadR) como molde. (1) carB4 com ATG/TTG/GTG - começar códons carB4 ATG 5’ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCG AC-3'(SEQ ID NO:47); carB4 GTG 5’ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCGTGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCG AC-3'(SEQ ID NO: 48); e carB4 TTG 5'- ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCTTGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCGAC -3'(SEQ ID NO:49); e reverter cartilha carB4 rev 5'- TTCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAG-3’ (SEQ ID NO:50), utilizando o plasmídio pVA232 como molde. (3) Os terminadores rrnB e T1T2 com ccdAB - Iniciador direto rrnB T1T2 termo 5'CTGCGCGAGTTCGGTCTGATTTAGAATTCCTCGAGGATGGTAGTGTGG-3'(SEQ ID NO:51) e iniciador reverso ccdAB rev 5'- CAGTCGACATACGAAACGGGAATGCGG-3' (SEQ ID NO:52), utilizando o plasmídio pAH008 (operon pV171_ccdBA). (4) O pACYCDuet-1 vetor de espinha dorsal - Encaminhar iniciador vetor pACYC para 5' CCGCATTCCCGTTTCGTATGTCGACTGAAACCTCAGGCATTGAGAAGCACACGGTC- 3'(SEQ ID NO:53) e iniciador inverso do vetor pACYC rev 5'- CTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTAATTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAG- 3'(SEQ ID NO:54).

[0146] O plasmídio pBZ1 foi co-expresso com pLYC4 na cepa descrita acima e validado por fermentação em frasco sob agitação e fermentação de placa de poço profundo. As condições de fermentação foram otimizadas de tal modo que o modelo CarB4_GTG reprodutível tem ~65% de conversão para FALC em ambas as plataformas de fermentação tal como descrito no Exemplo 5. Os resultados da fermentação em frasco sob agitação são mostrados na Figura 15.

[0147] Locais adicionais (18, 19, 22, 28, 80, 87, 90, 143, 212, 231, 259, 292, 396, 416, 418, 530, 541, 574, 612, 636, 677, 712, 750, 799, 809, 810, 870, 936, 985, 986, 1026, 1062, 1080, 1134, 1149, 1158, 1161, 1170) contendo mutações nas variantes CarB melhoradas (Tabela 7) foram submetidos à completa mutagênese de saturação. Os iniciadores contendo os nucleotideos degenerados NNK ou NNS foram usados para transformar estas posições para outros aminoácidos através de um método baseado em PCR (Sawano e Miyawaki 2000, Nucl. Acids Res. 28: e78). A biblioteca de Saturação foi construída utilizando o plasmídio pBZl (pACYCDuet-l_PTRC1-carB4GTG_rrnBter_ccdAB) modelo. Clones mutantes foram transformados em NEB Turbo (New England Biolab) e cepas de clonagem e plasmídios foram isoladas e misturadas. Os plasmídios misturados foram então transformados numa cepa base V668 transportando o plasmídio pLYC4 e os transformantes foram selecionados em placas de agar LB suplementado com antibióticos (100 mg/L de espectinomicina e 34 mg/L de cloranfenicol).

[0148] Variantes CarB da biblioteca de saturação foram então pesquisados para a produção de alcoóis graxos. As colônias únicas foram colhidas diretamente em placas de 96 poços de acordo com um protocolo de fermentação em placa de poços profundos modificado, tal como descrito no Exemplo 5. Os sucessos foram selecionados, escolhendo clones que produziram um título menor de ácidos graxos livres totais e um maior título de álcool graxo total comparado com a cepa controle. Para comparar os sucessos de diferentes lotes de fermentação, a conversão de ácidos graxos livres para alcoóis graxos foi normalizado por meio do cálculo de percentual de ácidos graxos livres normalizado. O NORM AGL (%) foi também usado na validação dos sucessos como descrito no Exemplo 5. NORM AGL (%) = Porcentagem de AGL Mutante/porcentagem de AGL controle; onde "AGL por cento" é o título de espécies de ácido graxo livre total dividido pelo total de título das espécies graxas. Os sucessos foram submetidos a uma validação adicional usando fermentações em frascos sob agitação, tal como descrito no Exemplo 5. A coluna de ácido graxo livre normalizado (NORM AGL) indica melhoramento da enzima, com os valores mais baixos indicando o melhor aperfeiçoamento. "Hit ID" indica a posição do poço da placa onde o menor Fenótipo NORM AGL foi encontrado. Hits mutações foram identificadas por sequenciamento de produtos de PCR amplificados de "hit" contendo plasmídios pBZ1 utilizando iniciadores específicos do gene mutante carB (BZ1 para 5'-GGATCTCGACGCTCTCCCTT- 3'(SEQ ID NO:55) e iniciador BZ12_ccdAB 5'- TCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTG-3'(SEQ ID NO:56). Os valores NORM AGL e as mutações identificadas nos sucessos validados estão resumidos na Tabela 12. Tabela 12: Mutações Benéficas na Enzima CarB4 identificados Durante Mutagênese de Saturação de Aminoácidos

[0149] A identificação de novas variantes da enzima CarB por mutagênese combinatória completa:

[0150] A biblioteca combinatória completa foi construída para incluir os seguintes resíduos de aminoácidos: 18D, 18R, 22S, 22R, 473H, 473I, 827R, 827C, 870I, 870L, 926V, 926A, 926E, 927S, 927K, 927G, 930M , 930K, 930R, 1128L, e 1128W. Os iniciadores contendo códons nativos e mutantes em todas as posições foram usados para a construção da biblioteca por um método baseado em PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. e Pease, L.R. 1989). Mutações benéficas conservadas em CarB2, CarB3, e CarB4 (20R, 288G, 535S) não foram alteradas, portanto, carB2GTG clonado em pBZl (modificado pBZl_ PTRCI _carB2GTG_ccdAB) foi usado como molde de PCR. A construção da biblioteca foi concluída, reunindo fragmentos de PCR em Carb ORFs contendo as mutações combinatórias acima. Os mutantes CarB ORF foram então clonados na cadeia de pBZl pelo método In-Fusion (Clontech). O produto de In-fusão foi precipitado e eletroporado diretamente na cepa de análise carreando o plasmídio pLYC4. A análise da biblioteca, a placa de poços profundos e a fermentação em frasco sob agitação foram conduzidos como descrito no Exemplo 5. As atividades (NORM AGL normalizado por CarB2, 100%) de mutantes CarB com mutações combinatórias específicas estão resumidas na Tabela 13. CarB2, CarB4, e CarB5 (CarB4-S22R) são incluídos como controles. A coluna NORM AGL indica a melhoria da enzima CarB, com os valores mais baixos, indicando melhor aperfeiçoamento. A melhoria da dobradura (X-FIOC) de controle (CarB2) também é mostrada. Todas as mutações indicadas estão em relação à sequência de polipeptídeo CarB wt (SEQ ID NO:7). Por exemplo, CarBl tem uma mutação A535S, e CarBDead (uma enzima CarB cataliticamente inativa) transporta uma mutação S693 que destrói o sítio de ligação à fosfopanteteína.

[0151] Novas variantes CarB para melhoramento da produção de alcoóis graxos em biorreatores:

[0152] O objetivo de identificar novas variantes CarB listadas na Tabela 13 é usá-las para melhorar a produção de álcoois graxos. A variante CarB superior (P06B6 - S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, L1128W) da Tabela 13 carrega uma mutação espontânea (tipo selvagem AGC para AGA) na posição 3. Ambas variantes CarB P06B6, denominada CarB7 (aminoácido R por AGA na posição 3 - S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, L1128W) e CarB8 (tipo selvagem aminoácido S pela AGC na posição 3 - E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, LI 128W) foram feitas e clonadas na cadeia do plasmídeo pLC1920 de produção de alcoóis graxos de baixo número de cópias para gerar os seguintes operons de álcool graxo, diferindo apenas em CarB. O códon de iniciação da tradução (GTG) para todas as variantes CarB (CarB2, CarB7 e carB8) foi revertido para ATG para maximizar a expressão. pCL192 0_PTRc_carB2_tesA_alrAadpl_fabB [A32 9G] _fadR pCL192 0_PTRc_carB7_tesA_alrAadpl_fabB [A329G]_fadR pCL192 0_PTRc_carB8_tesA_alrAadpl_fabB [A32 9G] _fadR

[0153] Os plasmídeos descritos acima foram transformados em uma cepa baseada em V6 6 8 com uma cópia de TE cromossômico, e as cepas resultantes foram analisadas em biorreatores, como descrito no EXEMPLO 4. A melhoria (medida por % do produto alcoóis graxos de fermentação no biorreator) de CarB7 e CarB8 sobre CarB2 foi mostrada na Figura 16. A ordem de atividade é CarB7>CarB8>CarB2. A mutação na posição 3 de CarB7 (AGC para um códon raro AGA) conferiu uma maior atividade do que CarB8, além disso, a análise de SDS-PAGE de proteínas solúveis totais revelou expressão mais elevada de CarB7 do que de CarB 8 e CarB2. Os níveis de expressão de CarB2 e CarB8 foram semelhantes. Isto é consistente com os dados de CarB60 descritos no EXEMPLO 6, tanto na mutação do códon raro AGA R na posição 3 quanto o marcador CarB60 na sua extremidade N-terminal podem melhorar a expressão CarB. Entende-se que CarB7 e CarB8 terá melhor desempenho do que CarB2 em cepas com um aumento do fluxo de ácidos graxos livres por qualquer modificação genética das cepas hospedeiras e/ou manipulação de outros componentes operons da produção de alcoóis graxos. Tabela 13: Resumo das variantes CarB identificadas a partir Biblioteca Combinatória no sistema plasmídeo duplo

[0154] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, a menos que indicado de outro modo aqui ou de outro modo claramente contraindicado pelo contexto. A utilização de quaisquer de todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "como") fornecida aqui, apenas visa iluminar melhor a publicação e não representa uma limitação no alcance da descrição, a menos que dito em contrário. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não-dito como essencial para a prática da publicação. Deve ser entendido que a terminologia aqui utilizada é com o propósito de descrever apenas formas particulares de realização, e não se pretende ser limitativa. Formas preferidas de realização da presente publicação são aqui descritas. As variações destas formas preferidas podem se tornar evidentes para os peritos na arte após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que peritos qualificados empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores têm a intenção de que a descrição seja praticada senão como especificamente aqui descrito. Assim, a presente publicação inclui todas as modificações e equivalentes do assunto citado nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis da mesma são abrangidas pela descrição, a menos que de outra forma aqui indicado ou de outra forma em clara contradição com o contexto.

Claims (19)

1. Polipeptídeo variante da ácido carboxílico redutase (CAR) caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo variante da CAR é geneticamente manipulado para ter pelo menos uma mutação no polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 em uma posição do aminoácido selecionada do grupo consistindo em E636K; M259I; A574T; T90M; E20F; E20L; E20Y; V191A; Q473A; Q473F; Q473K; Q473M; Q473R; Q473V; V926G; S927I; S927V; L1128A; L1128G; L1128K; L1128M; L1128P; L1128R; L1128S; L1128T; L1128V; L1128Y; D18V e D292N; E20K e V191A; P809L e M1062V; D143E e A612T; M1062T e R1080H; E936K, e P1134R; I870V, S927I, S985I, e I1164F; L799M, V810F, S927R, M1062L, A1158V, e F1170I; e L80Q, T231M, F288L, A418T, V530M, A541V, G677D, e P712A, em que a expressão do dito polipeptídeo variante da CAR em uma célula hospedeira recombinante resulta em um título mais alto de composições de álcool graxo em comparação com uma célula hospedeira recombinante expressando o polipeptídeo da CAR tipo selvagem da SEQ ID NO: 7.

2. Polipeptídeo variante da CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo variante compreende: (a) as mutações P809L e M1062V; (b) as mutações D143E e A612T; (c) as mutações M1062T e R1080H; (d) as mutações E936K e P1134R; (e) as mutações I870V, S927I, S985I e I1164F; (f) as mutações L799M, V810F, S927R, M1062L, A1158V e F1170I; ou (g) as mutações L80Q, T231M, F288L, A418T, V530M, A541V, G677D e P712A.

3. Célula hospedeira recombinante de Escherichia coli caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 43 que codifica um polipeptídeo da variante da ácido carboxílico redutase (CAR) que consiste no polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 e que tem ao menos uma mutação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em E636K; M259I; A574T; T90M; E20F; E20L; E20Y; V191A; Q473A; Q473F; Q473K; Q473M; Q473R; Q473V; V926G; S927I; S927V; L1128A; L1128G; L1128K; L1128M; L1128P; L1128R; L1128S; L1128T; L1128V; L1128Y; D18V e D292N; E20K e V191A; P809L e M1062V; D143E e A612T; M1062T e R1080H; E936K, e P1134R; I870V, S927I, S985I, e I1164F; L799M, V810F, S927R, M1062L, A1158V, e F1170I; e L80Q, T231M, F288L, A418T, V530M, A541V, G677D, e P712A, em que a célula hospedeira recombinante de Escherichia coli produz uma composição de álcool graxo em um título ou rendimento mais alto do que uma célula hospedeira expressando o polipeptídeo da CAR tipo selvagem da SEQ ID NO: 7, quando cultivada em um meio contendo uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar o dito polipeptídeo variante da CAR.

4. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira recombinante tem um título ou um rendimento que é pelo menos 3 vezes maior do que o título ou o rendimento de uma célula hospedeira expressando o polipeptídeo da CAR tipo selvagem correspondente, quando cultivada sob as mesmas condições que a célula hospedeira recombinante.

5. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira recombinante tem um título de 30 g/L a 250 g/L, ou um título de 90 g/L a 120 g/L.

6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira recombinante tem um rendimento de 10% a 40%.

7. Cultura de células caracterizada pelo fato de compreender a célula hospedeira recombinante de Escherichia coli, conforme definida na reivindicação 3.

8. Cultura de células, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a cultura de células recombinantes de Escherichia coli apresenta produtividade que é pelo menos 3 vezes maior do que a produtividade de uma cultura de células que expressa o polipeptídeo da CAR tipo selvagem correspondente.

9. Cultura de células, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita produtividade varia de 0,7 mg/L/h a 3 g/L/h.

10. Cultura de células, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o meio de cultura compreende uma composição de álcool graxo.

11. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo se acumula em uma fase orgânica extracelularmente.

12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende um ou mais de um álcool graxo C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 ou C18.

13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende um álcool graxo insaturado C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 ou C18:1.

14. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende os álcoois graxos C12 e C14.

15. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende os álcoois graxos C12 e C14 a uma razão de 3:1.

16. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende álcoois graxos insaturados ou álcoois graxos saturados.

17. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende um álcool graxo insaturado com uma dupla ligação na posição 7 na cadeia carbônica entre C7 e C8 a partir da extremidade reduzida do álcool graxo.

18. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de álcool graxo compreende os álcoois graxos de cadeia ramificada.

19. Método de produzir uma composição de álcool graxo caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) manipular uma célula hospedeira recombinante de Escherichia coli, conforme definida na reivindicação 3; (b) cultivar a dita célula hospedeira recombinante de Escherichia coli em um meio que compreende uma fonte de carbono; e (c) isolar a composição de álcool graxo do dito meio.

Images