ES2666157T3

ES2666157T3 - Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos

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Publication number: ES2666157T3
Application number: ES16198810.0T
Authority: ES
Inventors: Derek L. Greenfield; Elizabeth J. CLARKE; Eli S. GROBAN; Vikranth Arlagadda; Sungwon Lee; Xuezhi LI; Zhihao Hu; Baolong Zhu
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2012-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2018-05-03
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: MX358177B; EP3674399A1; KR20200038559A; KR20210095226A; EP2834350B1; US9758769B2; AU2016231497A1; US11034937B2; US20200109374A1; ES2613553T3; CO7170148A2; KR102282677B1; AU2013243602B2; WO2013152052A2; US20180135028A1; EP3385374B1; BR112014024674B1; KR20190076059A; EP3153579A1; AU2013243602A1

Abstract

Polipéptido de ácido carboxílico reductasa (CAR) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con el polipéptido de CAR silvestre de SEQ ID NO: 7, y que tiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L, R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, M930K, M930R y L1128W, en el que la expresión de dicho polipéptido de CAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un título superior de composiciones de alcoholes grasos en comparación con una célula huésped recombinante que expresa el polipéptido silvestre de SEQ ID NO: 7.

Description

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Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido graso o derivado del mismo”significa un “ácido graso” o un “derivado de ácido graso”. El término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la fòrmula RCOOH. R

representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso se prepara a partir de una ruta de biosíntesis de ácidos grasos. El término “derivado de ácido graso” significa productos producidos en parte a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos del organismo huésped de producciòn. “Derivado de ácido graso” también incluye productos

producidos en parte a partir de acil-ACP o derivados de acil-ACP. Los derivados de ácido graso a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, acil-CoA, aldehídos grasos, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos y ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o ésteres grasos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de biosíntesis que produce derivados de ácido graso, por ejemplo alcoholes grasos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye ácido graso sintasas que pueden modificarse por ingeniería genética para producir ácidos grasos y en algunas realizaciones pueden expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de ácido graso, tales como alcoholes grasos que tienen características deseadas.

Tal como se usa en el presente documento, “aldehído graso” significa un aldehído que tiene la fòrmula RCHO caracterizada por un grupo carbonilo (C=O). En algunas realizaciones, el aldehído graso es cualquier aldehído producido a partir de un alcohol graso. En determinadas realizaciones, el grupo R tiene al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19, carbonos de longitud. Alternativamente, o además, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos o 6 o menos carbonos de longitud. Por tanto, el grupo R puede tener un grupo R delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud o 12-18 carbonos de longitud. En algunas realizaciones, el aldehído graso es un aldehído graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18 C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, o uno C26. En determinadas realizaciones, el aldehído graso es un aldehído graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.

Tal como se usa en el presente documento, “alcohol graso” significa un alcohol que tiene la fòrmula ROH. En algunas realizaciones, el grupo R tiene al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19, carbonos de longitud. Alternativamente, o además, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7

o menos o 6 o menos carbonos de longitud. Por tanto, el grupo R puede tener un grupo R delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud o 12-18 carbonos. En algunas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, o uno C26. En determinadas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.

Una “composiciòn de alcohol graso” tal como se hace referencia en el presente documento se produce por una célula

huésped recombinante y comprende normalmente una mezcla de alcoholes grasos. En algunos casos, la mezcla incluye más de un tipo de producto (por ejemplo, alcoholes grasos y ácidos grasos). En otros casos, las composiciones de derivado de ácido graso pueden comprender, por ejemplo, una mezcla de alcoholes grasos con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación. En todavía otros casos, la composición de alcohol graso comprende una mezcla de tanto más de un tipo de producto como de productos con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación.

Una célula huésped modificada por ingeniería para producir un aldehído graso convertirá normalmente parte del aldehído graso en un alcohol graso. Cuando una célula huésped que produce alcoholes grasos se modifica por ingeniería genética para expresar un polinucleótido que codifica para una éster sintasa, se producen ésteres de cera. En una realización, se producen alcoholes grasos a partir de una ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Como ejemplo, puede convertirse acil-ACP en ácidos grasos por medio de la acción de una tioesterasa (por ejemplo, TesA de E. coli), que se convierten en aldehídos grasos y alcoholes grasos por medio de la acción de una ácido carboxílico reductasa (por ejemplo, CarB de E. coli). La conversión de aldehídos grasos en alcoholes grasos puede verse facilitada además, por ejemplo, por medio de la acción de un polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos. En algunas realizaciones, un gen que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos se expresa o sobreexpresa en la célula huésped. En determinadas realizaciones, el polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa. Los ejemplos de polipéptidos de alcohol deshidrogenasa útiles según la divulgación incluyen, pero no se limitan a AlrA de Acinetobacter sp. M-1 (SEQ ID NO: 3) u homólogos de AlrA, tales como AlrAadp1 (SEQ ID NO: 4) y alcohol deshidrogenasas de E. coli endógenas tales como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 5), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) e YbbO [AAC73595.1]. Se describen ejemplos adicionales en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO2007/136762, WO2008/119082 y WO2010/062480. En determinadas realizaciones, el polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1).

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aproximadamente el 97%, libres en al menos aproximadamente el 99%) de otros componentes con los que se asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de un aldehído graso o un alcohol graso en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un aldehído graso o un alcohol graso en una célula huésped recombinante, el aldehído graso o alcohol graso puede purificarse mediante la retirada de proteínas de la célula huésped. Después de la purificación, el porcentaje de un aldehído graso o un alcohol graso en la muestra aumenta. Los términos “purificar”, “purificado” y “purificaciòn” son términos relativos que no requieren pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando se produce un aldehído graso o un alcohol graso en células huésped recombinantes, un aldehído graso purificado o un alcohol graso purificado es un aldehído graso o un alcohol graso que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos).

Mejoras de cepas

Con el fin de cumplir los objetivos muy altos para el título, el rendimiento y/o la productividad de alcoholes grasos, se hicieron varias modificaciones en las células huésped de producción. FadR es un factor regulador clave implicado en las rutas de biosíntesis de ácidos grasos y degradación de ácidos grasos (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29(4): 937943 (1998)). La enzima ACS de E. coli FadD y la proteína de transporte de ácidos grasos FadL son componentes esenciales de un sistema de captación de ácidos grasos. FadL media en el transporte de ácidos grasos al interior de la célula bacteriana, y FadD media en la formación de ésteres de acil-CoA. Cuando no está disponible ninguna otra fuente de carbono, la bacteria capta ácidos grasos exógenos y los convierte en ésteres de acil-CoA, que pueden unirse al factor de transcripción FadR y desreprimir la expresión de los genes fad que codifican para proteínas responsables del transporte (FadL), activación (FadD) y -oxidación (FadA, FadB, FadE y FadH) de ácidos grasos. Cuando están disponibles fuentes de carbono alternativas, las bacterias sintetizan ácidos grasos como acil-ACP, que se usan para la síntesis de fosfolípidos, pero no son sustratos para la -oxidación. Por tanto, acil-CoA y acil-ACP son ambas fuentes independientes de ácidos grasos que pueden dar como resultado diferentes productos finales (Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004)). La solicitud provisional estadounidense n.º 611470.989 describe métodos mejorados de producción de derivados de ácido graso en una célula huésped que se modifica por ingeniería genética para tener un nivel de expresión alterado de un polipéptido de FadR en comparación con el nivel de expresión del polipéptido de FadR en una célula huésped silvestre correspondiente.

Hay especulaciones contradictorias en la técnica en cuanto a los factores limitantes de la biosíntesis de ácidos grasos en células huésped, tales como E. coli. Un enfoque para aumentar el flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos es manipular diversas enzimas en la ruta (figuras 1 y 2). El suministro de acil-ACP a partir de acetil-CoA por medio del complejo de acetil-CoA carboxilasa (acc) (figura 3) y la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (fab) puede limitar la tasa de producción de alcohol graso. En un enfoque a modo de ejemplo detallado en el ejemplo 2, el efecto de la sobreexpresión de Corynebacterium glutamicum accABCD (birA) demostró que tales modificaciones genéticas pueden conducir a un aumento de acetil-coA y malonil-CoA en E. coli. Un posible motivo de una baja tasa de flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos es un suministro limitado de precursores, concretamente acetil-CoA y, en particular, malonil-CoA, y los principales precursores para la biosíntesis de ácidos grasos. El ejemplo 3 describe la construcción de operones de fab que codifican para enzimas en la ruta de biosíntesis para la conversión de malonil-CoA en acil-ACP y su integración en el cromosoma de una célula huésped de E. coli. En aún otro enfoque detallado en el ejemplo 4, se mostró que mutaciones en los genes de rph e ilvG en la célula huésped de E. coli daban como resultado una producción superior de ácido graso libre (FFA), que se tradujo en una producción superior de alcohol graso. En todavía otro enfoque, se realizaron mutagénesis de transposones y examen de alto rendimiento para encontrar mutaciones beneficiosas que aumentaran el título o rendimiento. El ejemplo 5 describe cómo una inserción de transposón en el gen de yijP puede mejorar el rendimiento de alcohol graso en fermentaciones semicontinuas y en matraz de agitación.

Ácido carboxílico reductasa (CAR)

Se han modificado por ingeniería genética células huésped recombinantes para producir alcoholes grasos expresando una tioesterasa, que cataliza la conversión de acil-ACP en ácidos grasos libres (FFA) y una ácido carboxílico reductasa (CAR), que convierte ácidos grasos libres en aldehídos grasos. Aldehído reductasas nativas (endógenas) presentes en la célula huésped (por ejemplo, E. coli) pueden convertir aldehídos grasos en alcoholes grasos. Se describen tioesterasas a modo de ejemplo por ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20100154293. CarB es una ácido carboxílico reductasa a modo de ejemplo, una enzima clave en la ruta de producción de alcohol graso. El documento WO2010/062480 describe una búsqueda con BLAST usando la secuencia de aminoácidos NRRL 5646 CAR (registro de Genpept AAR91681) (SEQ ID NO: 6) como secuencia de consulta, y el uso de la misma en la identificación de aproximadamente 20 secuencias homólogas.

Los términos “ácido carboxílico reductasa”, “CAR” y “polipéptido de biosíntesis de aldehídos grasos” se usan de manera intercambiable en el presente documento. En la práctica de la divulgación, se expresa o sobreexpresa un gen que codifica para un polipéptido de ácido carboxílico reductasa en la célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido de CarB tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En otras realizaciones, el polipéptido de CarB es una variante o un mutante de SEQ ID NO: 7. En determinadas realizaciones, el polipéptido de CarB es de una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula fúngica, célula de hongos

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filamentosos, una célula bacteriana o cualquier otro organismo. En algunas realizaciones, la célula bacteriana es una micobacteria seleccionada del grupo que consiste en Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum y Mycobacterium ulcerans. En otras realizaciones, la célula bacteriana es de una especie de Nocardia, por ejemplo, Nocardia NRRL 5646, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Salinispora arenicola o Clavibacter michiganenesis. En otras realizaciones, el polipéptido de CarB es un homólogo de CarB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Un experto habitual en la técnica puede identificar fácilmente homólogos de CarB derivados de E. coli MG1566 y determinar su función usando los métodos descritos en el presente documento. En otras realizaciones, el polipéptido de CarB contiene una mutación en el número de aminoácido 3, 12, 20, 28, 46, 74, 103, 191, 288, 473, 827, 926, 927, 930 ó 1128 de SEQ ID NO: 7. Se detallan mutaciones a modo de ejemplo en la tabla 10. Los fragmentos o mutantes preferidos de un polipéptido conservan parte o toda la función biológica (por ejemplo, actividad enzimática) del polipéptido silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el fragmento o mutante conserva al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 98% o más de la función biológica del polipéptido silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento o mutante conserva aproximadamente el 100% de la función biológica del polipéptido silvestre correspondiente. Puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

En aún otras realizaciones, un fragmento o mutante presenta una función biológica aumentada en comparación con un polipéptido silvestre correspondiente. Por ejemplo, un fragmento o mutante puede presentar una mejora de al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75% o al menos aproximadamente el 90% en la actividad enzimática en comparación con el polipéptido silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento o mutante presenta una mejora de al menos aproximadamente el 100% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 200%, o al menos aproximadamente el 500%) en la actividad enzimática en comparación con el polipéptido silvestre correspondiente. Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos no esenciales o conservativas adicionales, que no tienen un efecto sustancial sobre la función del polipéptido. Puede determinarse si se tolerará o no una sustitución particular (es decir, no afectará de manera adversa a la función biológica deseada, tal como unión al ADN o actividad enzimática) tal como se describe en Bowie et al. (Science, 247: 1306-1310 (1990)).

Como resultado de los métodos y las enzimas variantes de la presente divulgación, uno o más del título, el rendimiento y/o la productividad del ácido graso o derivado del mismo producido por la célula huésped modificada por ingeniería genética que tiene un nivel de expresión alterado de un polipéptido de CarB se aumenta en relación con el de la célula huésped silvestre correspondiente. Para permitir una conversión máxima de ácidos grasos C12 y C14 en alcoholes grasos, CarB debe expresarse a actividad suficiente. Una célula huésped recombinante mejorada tendría una enzima CAR que se expresa a partir de, por ejemplo, el cromosoma de E. coli. Tal como se muestra en el ejemplo 6, las células que expresan la enzima CarB a partir del cromosoma tienen más actividad ácido carboxílico reductasa en relación con la CarB original y pueden convertir más ácidos grasos C12 y C14 en alcoholes grasos. CarB es un gen grande (3,5 kb) y aumenta el tamaño del plásmido considerablemente, lo que hace difícil usar un plásmido pCL para someter a prueba nuevos genes durante el desarrollo de cepas. Los enfoques para aumentar la actividad de CarB incluyen aumentar su solubilidad, estabilidad, expresión y/o funcionalidad. En un enfoque a modo de ejemplo, se produce una proteína de fusión que contiene 6 histidinas y un sitio de escisión de trombina en el extremo N-terminal de CarB. Esta enzima difiere de CarB en 60 nucleótidos adicionales en el extremo N-terminal, y se denomina CarB60. Cuando se expresan CarB o CarB60 a partir del cromosoma de E. coli bajo el control del promotor pTRC, las células que contienen CarB60 tienen una actividad ácido carboxílico reductasa celular total aumentada y convierten más ácidos grasos libres (FFA) C12 y C14 en alcoholes grasos. Un experto en la técnica apreciará que esto es un ejemplo de modificación por ingeniería genética molecular con el fin de lograr una mayor conversión de ácidos grasos libres (FFA) C12 y C14 en alcoholes grasos tal como se ilustra en el ejemplo 6 (citado anteriormente). Se engloban enfoques similares en el presente documento (véase el ejemplo 7).

Las fosfopanteteína transferasas (PPTasas) (EC 2.7.8.7) catalizan la transferencia de 4’-fosfopanteteína desde CoA hasta un sustrato. Car, CarB de Nocardia y varios homólogos de las mismas contienen un sitio de unión supuesto para 4’-fosfopanteteína (PPT) (He et al., Appl. Enviran. Microbiol., 70(3): 187 4-1881 (2004)). En algunas realizaciones de la divulgación, se expresa o sobreexpresa una PPTasa en una célula huésped modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la PPTasa es EntD de E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, se expresan o sobreexpresan una tioesterasa y una ácido carboxílico reductasa en una célula huésped modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la tioesterasa es tesA y la ácido carboxílico reductasa es carB. En otras realizaciones, se expresan o sobreexpresan una tioesterasa, una ácido carboxílico reductasa y una alcohol deshidrogenasa en una célula huésped modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la tioesterasa es tesA, la ácido carboxílico reductasa es carB y la alcohol deshidrogenasa es alrAadp1 (número de registro de GenPept CAG70248.1) de Acinetobacter baylyi ADP1 (SEQ ID NO: 4). En todavía otras realizaciones, se expresan o sobreexpresan una tioesterasa, una ácido carboxílico reductasa una PPTasa y una alcohol deshidrogenasa en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la tioesterasa es tesA, la

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Curr. Opin. Biotech. 4:450-455 (1993). Puede lograrse la mutagénesis al azar usando PCR propensa a error (véanse, por ejemplo, Leung et al. Technique 1:11-15 (1989); y Caldwell et al. PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)). En la PCR propensa a error, la se realiza PCR en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. En resumen, en tales procedimientos, se mezclan ácidos nucleicos que van a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima ácido carboxílico reductasa) con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa, y una concentración apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción puede realizarse usando 20 fmoles de ácido nucleico que va a mutagenizarse, 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3), gelatina al 0,01%, MgCl2 7 mM, MnCl2 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. Puede realizarse PCR durante 30 ciclos de 94ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que estos parámetros pueden variarse según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan entonces en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados (véase el ejemplo 7). Puede lograrse la mutagénesis dirigida al sitio usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis por oligonucleótidos se describe en, por ejemplo, Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988). En resumen, en tales procedimientos, se sintetizan una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que van a introducirse en el ADN clonado, y se insertan en el ADN clonado que va a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de CAR). Se recuperan los clones que contienen el ADN mutagenizado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos para los que codifican. Otro método para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Un gran número de diferentes reacciones PCR se producen en paralelo en el mismo vial, cebando con los productos de una reacción los productos de otra reacción. La PCR de ensamblaje se describe en, por ejemplo, la patente estadounidense 5.965.408. Todavía otro método de generación de variantes es la mutagénesis por PCR sexual. En la mutagénesis por PCR sexual, se produce recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de diferentes secuencias de ADN, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de fragmentación al azar de la molécula de ADN basándose en la homología de secuencia. Esto va seguido por fijación del cruzamiento mediante extensión de cebadores en una reacción PCR. La mutagénesis por PCR sexual se describe en, por ejemplo, Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:10747-10751 (1994).

También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones al azar en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de

E. coli, que porta mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una mayor tasa de mutación al azar que la de una cepa silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de CAR) en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones al azar dentro del ADN. Se describen cepas mutadoras adecuadas para su uso para mutagénesis in vivo en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.º WO1991/016427). También pueden generarse variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenario se reemplaza por un “casete” de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene a menudo una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada. También puede usarse mutagénesis de conjunto recursivo para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursivo es un algoritmo para la modificación por ingeniería de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de realimentación para controlar tandas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria. La mutagénesis de conjunto recursivo se describe en, por ejemplo, Arkin et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:7811-7815 (1992). En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales (véase, por ejemplo, Delegrave et al. (1993) Biotech. Res. 11:1548-1552). En algunas realizaciones, se crean variantes usando procedimientos de intercambio en los se fusionan entre sí partes de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para distintos polipéptidos para crear secuencias de ácido nucleico quiméricas que codifican para polipéptidos quiméricos tal como se describe en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.965.408 y 5.939.250.

La mutagénesis por inserción es mutagénesis de ADN mediante la inserción de una o más bases. Las mutaciones por inserción pueden producirse de manera natural, mediadas por virus o transposón, o pueden crearse artificialmente para fines de investigación en el laboratorio, por ejemplo, mediante mutagénesis de transposones. Cuando se integra ADN exógeno en el del huésped, la gravedad de cualquier mutación consiguiente depende totalmente de la ubicación dentro del genoma del huésped en el que se inserta el ADN. Por ejemplo, pueden ser evidentes efectos significativos si se inserta un transposón en el medio de un gen esencial, en una región promotora o en una región represora o potenciadora. Se realizaron mutagénesis de transposones y examen de alto rendimiento para encontrar mutaciones beneficiosas que aumentaran el título o rendimiento de alcohol graso. Se describen en el presente documento células huésped recombinantes que comprenden (a) una secuencia de polinucleótido que codifica para una ácido carboxílico reductasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el

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apogeo de las pruebas nucleares, a mediados de los años 1960. Desde entonces se ha vuelto gradualmente a la tasa isotópica (14C/12C) inicial cosmogénica (atmosférica) de estado estacionario de aproximadamente 1,2 x 10-12, con una “semivida” de relajaciòn aproximada de 7-10 años. (Esta última semivida no ha de tomarse literalmente; más bien, debe usarse la función de entrada/desintegración nuclear atmosférica detallada para rastrear la variación de 14C atmosférico y de la biosfera desde el comienzo de la era nuclear). Es esta última característica temporal de 14C de la biosfera la que mantiene la promesa de datación anual de carbono reciente de la biosfera. Puede medirse el 14C

mediante espectrometría de masas con acelerador (AMS), facilitándose los resultados en unidades de “fracciòn de carbono moderno” (fM). fM se define por los materiales de referencia patrón 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST). Tal como se usa en el presente documento, la fracción de carbono moderno (fM) tiene el mismo significado definido por los materiales de referencia patrón (SRM) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST), conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente). La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón isotópica 14C/12C HOxI (con referencia a 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera anterior a la Revolución Industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1. Esto es aproximadamente equivalente a la madera anterior a la Revolución Industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.

Las composiciones descritas en el presente documento incluyen bioproductos que pueden tener un fM14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto de la divulgación puede tener un fM14C de al menos 1,01, un fM14C de 1 a 1,5, un fM14C de 1,04 a 1,18, o un fM14C de 1,111 a 1,124. Otra medición de 14C se conoce como el tanto por ciento de carbono moderno (pMC). Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones por 14C, 1950 es igual a una

edadde “cero años”.Estotambién representa 100 pMC. El“carbono de bombas” en la atmòsfera alcanzò casi eldoble

del nivel normal en 1963 en el apogeo de las armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son mayores de 100 pMC para plantas y animales que viven desde 1950. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor de hoy en día próximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, proporcionaría una firma de 14C próxima a 107,5 pMC. Los compuestos basados en el petróleo tendrán un valor de pMC de cero. La combinación de carbono fósil con carbono de hoy en día dará como resultado una dilución del contenido de pMC de hoy en día. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de materiales de biomasa de hoy en día y 0 pMC representa el contenido de 14C de productos basados en el petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componente. Por ejemplo, un material derivado al 100% de soja de hoy en día proporcionará una firma de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyera al 50% con productos basados en el petróleo, proporcionaría una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Se deriva un contenido de carbono de base biològica asignando el“100%” igual a 107,5pMC y el “0%” igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC proporcionará un contenido de carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originan o bien a partir de material biológico de hoy en día o bien a partir de material basado en el petróleo. Un bioproducto que comprende uno o más derivados de ácido graso tal como se describe en el presente documento puede tener un pMC de al menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100. En otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de entre 50 y 100; entre 60 y 100; entre 70 y 100; entre 80 y 100; entre 85 y 100; entre 87 y 98; o entre 90 y 95. En aún otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de 90, 91, 92, 93, 94 ó 94,2.

Examen de composiciones de alcoholes grasos producidas por la célula huésped recombinante

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la expresión, se cultiva una célula huésped recombinante que comprende un gen heterólogo o un gen nativo modificado, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36 ó 48 horas. Durante y/o después del cultivo, pueden obtenerse muestras y analizarse para determinar si el nivel de producción de alcohol graso (título, rendimiento o productividad) es diferente del de la célula parental silvestre correspondiente que no se ha modificado. Por ejemplo, el medio en el que las células huésped se hicieron crecer puede someterse a prueba para detectar la presencia de un producto deseado. Cuando se somete a prueba para detectar la presencia de un producto, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitarse a, CCF, HPLC, CG/FID, CG/EM, CL/EM, EM. Pueden cultivarse cepas de células huésped recombinantes en volúmenes pequeños (de 0,001 l a 1 l) de medio en placas o matraces de agitación con el fin de examinar para detectar un nivel alterado de producción de especies grasas o alcohol graso. Una vez identificadas las cepas candidatas o “aciertos” a pequeña escala, estas cepas se cultivan en volúmenes más grandes (de 1 l a 1000 l) de medio en biorreactores, tanques y plantas piloto para determinar el nivel preciso de producción de especies grasas o alcohol graso. Estas condiciones de cultivo de volumen grande las usan los expertos en la técnica para optimizar las condiciones de cultivo para obtener la producción deseada de especies grasas o alcohol graso.

Utilidad de composiciones de alcoholes grasos y aldehídos grasos

Se usan aldehídos para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, se usan aldehídos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, Baquelita), colorantes, saborizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos, y otros productos químicos, algunos de los cuales pueden usarse como disolventes, conservantes o desinfectantes. Además, determinados compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos, y muchos azúcares contienen grupos aldehído. Los aldehídos grasos pueden convertirse en alcoholes

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grasos mediante reducción química o enzimática. Los alcoholes grasos también tienen muchos usos comerciales. Las ventas anuales a nivel mundial de alcoholes grasos y sus derivados son superiores a mil millones de USD. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos para el cuidado personal y de uso doméstico, tales como, por ejemplo, detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, pomadas y lociones farmacéuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes textiles antiestáticos y de acabado, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas. También se describe en el presente documento una composición de tensioactivo o una composición de detergente que comprende un alcohol graso producido mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Un experto habitual en la técnica apreciará que, dependiendo del fin previsto de la composición de tensioactivo o detergente, pueden producirse y usarse diferentes alcoholes grasos. Por ejemplo, cuando los alcoholes grasos descritos en el presente documento se usan como materia prima para la producción de tensioactivos o detergentes, un experto habitual en la técnica apreciará que las características de la materia prima de alcohol graso afectarán a las características de la composición de tensioactivo o detergente producida. Así, las características de la composición de tensioactivo o detergente pueden seleccionarse para producir alcoholes grasos particulares para su uso como materia prima. Una composición de detergente y/o tensioactivo basado en alcohol graso descrita en el presente documento puede mezclarse con otros tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la mezcla puede incluir al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso del alcohol graso. En otros ejemplos, puede producirse una composición de tensioactivo o detergente que incluye al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso de un alcohol graso que incluye una cadena de carbonos que tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos de longitud. Tales composiciones de tensioactivo o detergente también pueden incluir al menos un aditivo, tal como una microemulsión o un tensioactivo o un detergente de fuentes no microbianas tales como aceites vegetales o petróleo, que pueden estar presentes en la cantidad de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso del alcohol graso. La divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan para fines ilustrativos sólo. No deben interpretarse como limitativos del alcance o contenido de la divulgación de ningún modo.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Modificaciones del huésped de producción -Atenuación de Acil-CoA deshidrogenasa

Este ejemplo describe la construcción de una célula huésped modificada por ingeniería genética en la que la expresión de una enzima de degradación de ácidos grasos está atenuada. Se delecionó el gen de fadE de Escherichia coli MG1655 (una cepa de E. coli K) usando el sistema Lambda Red (también conocido como Red-Driven Integration) descrito por Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645 (2000), con las siguientes modificaciones:

Se usaron los siguientes cebadores para crear la deleción de fadE:

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Se usaron los cebadores Del-fadE-F y Del-fadE-R para amplificar el casete de resistencia a kanamicina (KmR) del plásmido pKD13 (descrito por Datsenko et al., citado anteriormente) mediante PCR. Entonces se usó el producto de PCR para transformar células de E. coli MG1655 electrocompetentes que contenían pKD46 (descrito en Datsenko et al., citado anteriormente) que se habían inducido previamente con arabinosa durante 3-4 horas. Tras un crecimiento de 3 horas en un caldo súper óptimo con medio de represión de catabolitos (SOC) a 37ºC, se sembraron en placa las células en placas de agar Luria que contenían 50 g/ml de kanamicina. Se identificaron colonias resistentes y se aislaron tras una incubación durante la noche a 37ºC. Se confirmó la alteración del gen de fadE mediante amplificación

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por PCR usando los cebadores fadE-L2 y fadE-R1, que se diseñaron para flanquear el gen de fadE de E. coli. Los cebadores de confirmación de la deleción de fadE fueron:

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Tras confirmarse la deleción de fadE, se usó una única colonia para eliminar el marcador KmR usando el plásmido pCP20 tal como se describe por Datsenko et al., citado anteriormente. La cepa de E. coli MG1655 con el gen de fadE delecionado y el marcador KmR eliminado resultante se denominó E. coli MG1655 fadE, o E. coli MG1655 D1. Se comparò la producciòn de derivados de ácido graso (“especie grasa total”) por la cepa de E. coli MG1655 con el gen fadE delecionado con la producción de derivados de ácido graso por E. coli MG1655. Se transformaron las células con el plásmido de producción pDG109 (pCL1920_PTRC_carBopt_12H08_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR) y se fermentaron en medio mínimo de glucosa. Los datos presentados en la figura 5 muestran que la deleción del gen fadE no afectó a la producción de derivados de ácido graso.

EJEMPLO 2

Aumento del flujo a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos -mediada por acetil CoA carboxilasa

Los principales precursores para la biosíntesis de ácidos grasos son malonil-CoA y acetil-CoA (figura 1). Se ha sugerido que estos precursores limitan la velocidad de biosíntesis de ácidos grasos (figura 2) en E. coli. En este ejemplo, se sobreexpresaron operones de acc sintéticos [accABCD de Corynebacterium glutamicum (birA)] y las modificaciones genéticas condujeron a un aumento de la producción de acetil-coA y malonil-CoA en E. coli. En un enfoque, con el fin de aumentar los niveles de malonil-CoA, se sobreexpresó un complejo enzimático de acetil-CoA carboxilasa de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) en E. coli. Acetil-CoA carboxilasa (acc) consiste en cuatro subunidades diferenciadas, accA, accB, accC y accD (figura 3). La ventaja de acc de C. glutamicum es que dos subunidades se expresan como proteínas de fusión, accCB y accDA, respectivamente, lo que facilita su expresión equilibrada. Adicionalmente, se sobreexpresó birA de C. glutamicum, que biotinila la subunidad accB (figura 3). El ejemplo 3 describe la coexpresión de genes de acc junto con operones de fab completos.

EJEMPLO 3

Aumento del flujo a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos -iFAB

Producción de derivados de ácido graso:

Las estrategias para aumentar el flujo a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos en células huésped recombinantes incluyen tanto la sobreexpresión de genes de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativos como la expresión de genes de biosíntesis de ácidos grasos endógenos de diferentes organismos en E. coli. En este estudio, se combinaron genes de biosíntesis de ácidos grasos de diferentes organismos en el genoma de E. coli DV2. Se evaluaron dieciséis cepas que contienen iFAB 130 -145. Se presenta la estructura detallada de iFAB 130 -145 en la tabla 1 de iFAB, a continuación.

Tabla 1. Componentes encontrados en iFAB 130-145.

Abreviatura: Descripción completa

St_fabD: Gen de fabD de Salmonella typhimurium

nSt_fabH: Gen de fabH de Salmonella typhimurium con el RBS nativo

sSt-fabH: Gen de fabH de Salmonella typhimurium con un RBS sintético

Cac_fabF: Gen de fabF de Clostridum acetobutylicum (ATCC824)

St_fabG: Gen de fabG de Salmonella typhimurium

St_fabA: Gen de fabA de Salmonella typhimurium

St_fabZ: Gen de fabZ de Salmonella typhimurium

BS_fabI: Gen de fabI de Bacillus subtilis

BS_FabL: Gen de fabL de Bacillus subtilis

Vc_FabV: Gen de fabV de Vibrio cholerae

Ec_FabI: Gen de fabI de Escherichia Coli

Cada “iFAB” incluía diversos genes de fab en el siguiente orden: 1) una enoil-ACP reductasa (BS_fabI, BS_FabL, Vc_FabV o Ec_FabI); 2) una b-cetoacil-ACP sintetasa III (St_fabH); 3) una malonil-CoA-ACP transacilasa (St_fabD); 4) una b-cetoacil-ACP reductasa (St_fabG); 5) una 3-hidroxi-acil-ACP deshidratasa (St_fabA o St_fabZ); 6) una bcetoacil-ACP sintetasa II (Cac_fabF). Obsérvese que St_fabA tiene también actividad trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa (ref) y que Cac_fabF tiene actividades b-cetoacil-ACP sintetasa II y b-cetoacil-ACP sintetasa I (Zhu et al., BMC Microbiology 9:119 (2009)). Véase la tabla 2, a continuación para la composición específica de iFAB 130 -145. Véanse las figuras 7A y B que proporcionan la representación esquemática del locus iFAB138, incluyendo un diagrama

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I: ATC 77,20%

K: AAG 90,30%

L: CTA 90,10%

M: ATG 89,00%

R: AGG 88,00%

V: GTG 89,20%

W: TGG 84,50%

Y: TAC 86,00%

A535: GCC A TCC 71,80%

R827: CGC A GCC 93,20%

C: TGT 87,90%

C: TGC 83,20%

V926: GTT A GCT 78,10%

A: GCG 66,30%

A: GCC 69,50%

E: GAG 65,80%

G: GGC 78,60%

S927: AGC G GGG 77,60%

G: GGT 79,30%

I: ATC 90,80%

K: AAG 70,70%

V: GTG 87,90%

M930: ATG K AAG 82,30%

R: CGG 73,80%

R: AGG 69,80%

L1128: TTG A GCG 92,70%

G: GGG 89,70%

K: AAG 94,80%

M: ATG 95,80%

P: CCG 98,40%

R: AGG 90,90%

R: CGG 88,50%

S: TCG 88,90%

T: ACG 96,30%

V: GTG 93,90%

W: TGG 78,80%

Y: TAC 87,90%

A continuación se combinaron sustituciones de aminoácidos que se consideraban beneficiosas para la producción de alcohol graso. Se usó PCR para amplificar partes del gen de carBopt que contenía diversas mutaciones deseadas, y se unieron las partes entre sí usando un método basado en PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. y Pease, L.R. 1989). Se examinó el gen de carBopt sin la etiqueta N-terminal de 60 pb. Las mutaciones combinadas en esta biblioteca de combinación se muestran en la tabla 9.

Tabla 9: Mutaciones de CarB de la primera biblioteca de combinación

Mutación: Codón

E20V: GTG

E20S: TCG

E20R: CGC

V191S: AGT

F288R: AGG

F288S: AGC

F288G: GGG

Q473L: CTG

Q473W: TGG

Q473Y: TAC

Q473I: ATC

Q473H: CAC

A535S: TCC

Para facilitar el examen, se integró entonces la biblioteca de combinación de CarB resultante en el cromosoma de la cepa V668 en el locus lacZ. La secuencia del gen de carBopt en este locus se presenta como SEQ ID NO: 7. El genotipo de la cepa V668 es MG1655 (fadE::FRT fhuA::FRT fabB::A329V entD::T5-entD insH-11:: PlacUV5

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Nombre: Mutación/mutaciones Cepa Datos de tanque Notas

carB: Ninguna = silvestre (E20 V191 F288 Q473) la proteína es SEQ ID NO: 7

carB60: Ninguna + etiqueta V324

carB1: A535S V940 83% de FALC; C12/C14=3,4 tiene una copia de TE cromosómico 12H08

carB2: E20R, F288G, Q473I, A535S LH375 97% de FALC; C12/C14=3,6 tiene dos copias de TE cromosómico 12H08

carB2: E20R, F288G, Q473I, A535S LH346 96% de FALC; C12/C14=3,7 tiene una copia de TE cromosómico 12H08

carB3: E20R, F288G, Q473H, A535S Biblioteca combinada L Sin ejemplos ejecutados en biorreactores hasta la fecha

carB4: E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G Biblioteca combinada R (VA-219) 97% de FALC; C12/C14=3,9 tiene dos copias de TE cromosómico 12H08

carA: Ninguna Véase la publicación de patente estadounidense n.º 20100105963 la proteína es SEQ ID NO: 39

FadD9: Ninguna Véase la publicación de patente estadounidense n.º 20100105963 la proteína es SEQ ID NO: 40

Las secuencias de ADN de CarA, FadD9, CarB y CarB60 se presentan en el presente documento como SEQ ID NO: 41, 42, 43 y 44, respectivamente.

Identificación de mutaciones beneficiosas adicionales en la enzima CarB mediante mutagénesis de saturación:

Se desarrolló posteriormente un sistema de examen de plásmido doble y se validó para identificar variantes de CarB

5 mejoradas con respecto a CarB4 para la producción de FALC. Este sistema de plásmido doble cumplía los siguientes criterios: 1) Los clones mutantes producen un alto título de FA para proporcionar flujo de ácidos grasos en exceso de la actividad de CarB. Esto se logra transformando una cepa base (V668 con dos copias de TE cromosómico) con un plásmido (pLYC4, pCL1920_PTRC_carDead_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR) que porta el operón de FALC con una enzima CarB catalíticamente inactiva CarB[S693A] para potenciar la producción de ácidos grasos libres; 2) el plásmido

10 de examen con molde de mutante de carB, preferiblemente menor de 9 kb, es propenso a procedimientos de mutagénesis de saturación y es compatible para la expresión con pLYC4; 3) el intervalo dinámico de actividad de CarB puede ajustarse. Esto se logra combinando un promotor más débil (PTRC1) y codones de iniciación alternativos (GTG

o TTG) para ajustar los niveles de expresión de CarB4. 3) Se introdujo una buena estabilidad del plásmido, un módulo de toxina/antitoxina (operón de ccdBA) para mantener la estabilidad del plásmido.

15 En resumen, se construyó el plásmido de examen pBZ1 (pACYCDuet-1_PTRC1-carB4GTG_rrnBter_ccdAB) a partir de cuatro partes usando el método de clonación In-Fusion HD (Clontech) mezclando razones molares iguales de cuatro partes (PTRC1, carB4 con codones de iniciación ATG/TTG/GTG, terminadores rrnB T1T2 con ccdAB y vector pACYCDuet-1). Se amplificaron por PCR las partes (1 a 4) mediante los siguientes pares de cebadores: (1) PTRC1 cebador directo 5’

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usando el plásmido

pVA232 (pCL1920_PTRC_carB4_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR) como molde. (1) carB4 con codones de iniciación

ATG/TTG/GTG -cebador directo carB4 ATG

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P05H3: 26,7 3,75 D18R, E20R, 288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, M930K, L1128W

P10F10: 31,9 3,13 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, V926A, S927K, M930R

P01C12: 34,2 2,92 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C

P03B1: 36,9 2,71 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, M930R

P06E4: 36,9 2,71 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L, S927G, M930R

P14C6: 37,4 2,67 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L, S927G

P05F10: 40,4 2,48 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, V926A, S927G

P06C8: 40,8 2,45 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, L1128W

P15E4: 40,8 2,45 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, S927G, L1128W

P05H7: 40,9 2,44 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, L1128W

P15A6: 41 2,44 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, M930K, L1128W

P08F5: 41,2 2,43 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, I870L, S927G, M930K

P14C7: 41,3 2,42 E20R, F288G, Q473I, A535S, I870L, M930K

P16H10: 42,1 2,38 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, S927G, M930K, L1128W

P16A1: 44,1 2,27 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, L1128W

P14H4: 44,2 2,26 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G

P15C1: 46,5 2,15 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, L1128W

P16E5: 47,2 2,12 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930R, L1128W

P15A3: 47,2 2,12 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, V926E, S927G, M930R

P05A2: 52,4 1,91 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, V926A, L1128W

CarB2: 100 1 E20R, F288G, Q473I, A535S

CarB4: 77,8 1,29 E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G

CarB5: 48,9 2,04 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G

CarB1: ND A535S

CarB silvestre: ND SEQ ID NO: 7

CarBDead: ND S693A

Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto de otra forma. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o una expresiòn a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, pretende meramente iluminar mejor la divulgación y no supone una limitación en el alcance de 5 la divulgación a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse que indica que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la divulgación. Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones particulares sólo, y no pretende ser limitativa. Se describen en el presente documento realizaciones preferidas de esta divulgación. Variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos habituales en la técnica tras

10 la lectura de la descripción anterior.

Tabla 14: Secuencias

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Claims

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el 85% con el polipéptido de CAR silvestre de SEQ ID NO: 7 y que tiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L, R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, M930K, M930R y L1128W, en la que la célula huésped recombinante produce una composición de alcohol graso a un título o rendimiento mayor que una célula huésped que expresa el polipéptido de CAR silvestre de SEQ ID NO: 7 cuando se cultiva en un medio que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar dicho polipéptido de CAR variante.
4.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 3, que comprende además un polinucleótido que codifica para un polipéptido de tioesterasa.
5.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 4, que comprende además un polinucleótido que codifica para

(i)

un polipéptido de FabB y un polipéptido de FadR, o

(ii)

una aldehído graso reductasa.
6.

Célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en la que dicha célula huésped recombinante tiene un título o un rendimiento que es al menos 3 veces mayor que el título o el rendimiento de una célula huésped que expresa el polipéptido de CAR silvestre correspondiente cuando se cultiva en las mismas condiciones que la célula huésped recombinante.
7.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 6, en la que dicha célula huésped recombinante tiene un título de desde 30 g/l hasta 250 g/l, o un título de desde 90 g/l hasta 120 g/l.
8.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 6, en la que dicha célula huésped recombinante tiene un rendimiento de desde el 10% hasta el 40%.
9.

Cultivo celular que comprende la célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
10.

Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que dicho cultivo celular tiene una productividad que es al menos 3 veces mayor que la productividad de un cultivo celular que expresa el polipéptido de CAR silvestre correspondiente.
11.

Cultivo celular según la reivindicación 10, en el que dicha productividad oscila entre 0,7 mg/l/h y 3 g/l/h.
12.

Cultivo celular según la reivindicación 11, en el que el medio de cultivo comprende una composición de alcohol graso.
13.

Célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en la que la composición de alcohol graso se recoge en una fase orgánica extracelularmente.
14.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 13, en la que la composición de alcohol graso comprende uno o más de un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.
15.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 13, en la que la composición de alcohol graso comprende un alcohol graso insaturado C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 o C18:1.
16.

Célula huésped recombinante según la reivindicación 13, en la que la composición de alcohol graso comprende alcoholes grasos C12 y C14.

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