MX2014011903A

MX2014011903A - Enzimas de acido carboxilico-reductasa (car) y produccion mejorada de alcoholes grasos.

Info

Publication number: MX2014011903A
Application number: MX2014011903A
Authority: MX
Inventors: Derek L Greenfield; Elizabeth J Clarke; Eli S Groban; Zhihao Hu; Vikranth Arlagadda; Sungwon Lee; Xuezhi Li; Baolong Zhu
Original assignee: Reg Life Sciences Llc
Priority date: 2012-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2015-05-12
Also published as: CA2883064A1; EP3153579A1; KR20210095226A; CO7170148A2; US9758769B2; US20150064757A1; US11034937B2; BR122019026987B1; WO2013152052A2; EP3985108A1; EP4186974A1; AU2013243602A1; BR112014024674B1; KR20150032660A; KR102282677B1; KR20200038559A; ES2786633T3; EP3385374B1; US9340801B2; AU2016231497A1

Abstract

La descripción se refiere a enzimas variantes de ácido carboxílico-reductasa (CAR) para la producción mejorada de alcoholes grasos en células recombinantes.

Description

ENZIMAS DE ACIDO CARBOXILICO-REDUCTASA (CAR) Y PRODUCCION MEJORADA DE ALCOHOLES GRASOS CAMPO DE LA INVENCION La descripción se refiere a enzimas variantes de ácido carboxilico-reductasas (CAR, por sus siglas en inglés) para la producción mejorada de alcoholes grasos en células hospedadoras recombinantes. La descripción se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos y polipéptidos variantes de CAR, asi como a células hospedadoras recombinantes y a cultivos celulares. Adicionalmente se abarcan métodos para producir composiciones de alcoholes grasos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los alcoholes grasos constituyen una categoría importante de bioproductos químicos industriales. Estas moléculas y sus derivados tienen numerosos usos, que incluyen como agentes tensioactivos, lubricantes, plastificantes, solventes, emulsionadores, emolientes, espesantes, sabores, fragancias y combustibles. En la industria, los alcoholes grasos se producen mediante hidrogenación catalítica de los ácidos grasos producidos a partir de fuentes naturales, tal como aceite de coco, aceite de palma, aceite de cogollo de palma, sebo y manteca, o por hidratación química de las alfa-olefinas producidas a partir de materias primas petroquímicas. Los alcoholes grasos derivados de fuentes Ref.251582 naturales tienen longitudes variables de cadena. La longitud de cadena de los alcoholes grasos es importante con respecto a aplicaciones particulares. En la naturaleza también se producen alcoholes grasos mediante enzimas que son capaces de reducir moléculas de acil-ACP o acil-CoA a los correspondientes alcoholes primarios (ver, por ejemplo, Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 20100105955, 20100105963, y 20110250663, que se incorporan en la presente como referencia).

Las actuales teenologías para producir alcoholes grasos comprenden reducción de ácidos grasos, mediante catalizadores inorgánicos a los correspondientes alcoholes primarios, lo que es costoso, lleva mucho tiempo y es difícil. Los ácidos grasos usados en este proceso se derivan de fuentes naturales (por ejemplo, aceites y grasas vegetales y animales, supra) . También se puede lograr la deshidratación de alcoholes grasos a alfa-olefinas por catálisis química. Sin embargo, esta técnica no es renovable y está asociada con alto costo de operación y desperdicios químicos ambientalmente peligrosos. De esta manera, existe la necesidad de métodos mejorados para la producción de alcoholes grasos y la presente descripción afronta esta necesidad.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un aspecto de la descripción proporciona un polipéptido variante de ácido carboxilico-reductasa (CAR) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido variante de CAR se maneja por ingeniería genética para que tenga al menos una mutación en una posición de aminoácido seleccionado del grupo de posiciones de aminoácidos 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, y 1128. En la presente, la expresión del polipéptido variante de CAR en una célula hospedadora recombinante da por resultado un mayor título de composiciones de alcoholes grasos en comparación a una célula hospedadora recombinante que expresa un correspondiente polipéptido tipo silvestre. En un aspecto relacionado, el polipéptido de CAR es un polipéptido de CarB. En otro aspecto relacionado, el polipéptido variante de CAR comprende una mutación en las posiciones S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L,R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, M930IC,M930R y/o L1128W. En un aspecto relacionado, el polipéptido de CAR incluye la mutación A535S; o las mutaciones E20R, F288G, Q473I y A535S; o las mutaciones E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A y S927G; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827A y S927G; o las mutaciones S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R y L1128W; o E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R y L1128W; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930K y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, S927K y M930R; o mutaciones D18R, E20R, 288g, Q473I, A535S, R827C, V926E, M930K y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, V926A, S927K y M930R; o mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S y R827C; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C y M930R; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L, S927G y 930R; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L y S927G; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, V926A y S927G; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L y L1128W; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, M930K y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, I870L, S927G y M930K; o las mutaciones E20R, F288G, Q473I, A535S, I870L, M930K; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, S927G, M930K y L1128W; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S,, R827C, I870L y S927G; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128 ; o las mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930R y L1128W; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, V926E, S927G y M930R; o las mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, V926A y L1128W; o combinaciones de esto.

Otro aspecto de la descripción proporciona una célula hospedadora que incluye una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido variante de ácido carboxilico-reductasa (CAR) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7 y que tiene al menos una mutación en una posición de aminoácido incluyendo las posiciones de aminoácidos 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, y 1128, en donde la célula hospedadora genéticamente manejada produce una composición de alcoholes grasos que tiene un mayor titulo o rendimiento que una célula hospedadora que expresa un correspondiente polipéptido de CAR tipo silvestre cuando se cultiva en un medio que contiene una fuente de carbono bajo condiciones efectivas para expresar el polipéptido variante de CAR, y en donde la SEQ ID NO: 7 es el correspondiente polipéptido de CAR tipo silvestre. En un aspecto relacionado, la célula hospedadora recombinante incluye adicionalmente un polinucleótido que codifica para un polipéptido de tioesterasa. En otro aspecto relacionado, la célula hospedadora recombinante incluye adicionalmente un polinucleótido que codifica para un polipéptido de FabB y un polipéptido de FadR. En otro aspecto relacionado, la descripción proporciona una célula hospedadora recombinante que incluye un polinucleótido que codifica para una aldehido graso-reductasa (AlrA) y un cultivo celular que contiene la misma.

Otro aspecto de la descripción proporciona una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora genéticamente manejada tiene un titulo que es al menos 3 veces mayor que el titulo de una célula hospedadora que expresa el correspondiente polipéptido de CAR tipo silvestre cuando se cultiva bajo las mismas condiciones como la célula hospedadora genéticamente manejada. En un aspecto relacionado, la célula hospedadora genéticamente manejada titulo de aproximadamente 30 g/L a aproximadamente 250 g/L. En otro aspecto relacionado, la célula hospedadora genéticamente manejada tiene un titulo de aproximadamente 90 g/L a aproximadamente 120 g/L.

Otro aspecto de la descripción proporciona una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora genéticamente manejada tiene un rendimiento que es al menos 3 veces mayor que el rendimiento de una célula hospedadora que expresa el correspondiente polipéptido de CAR tipo silvestre cuando se cultiva bajo las mismas condiciones como la célula hospedadora genéticamente manejada. En un aspecto relacionado, la célula hospedadora genéticamente manejada tiene un rendimiento de aproximadamente 10% a aproximadamente 40%.

La descripción abarca adicionalmente un cultivo celular que incluye la célula hospedadora recombinante como se describe en la presente. En un aspecto relacionado, el cultivo celular tiene una productividad que es al menos aproximadamente 3 veces mayor que la productividad de un cultivo celular que expresa el correspondiente polipéptido de CAR tipo silvestre. En otro aspecto relacionado, la productividad varia desde aproximadamente 0.7 mg/L/hr y aproximadamente 3 g/L/hr. En otro aspecto relacionado, el medio de cultivo comprende una composición de alcoholes grasos. La composición de alcoholes grasos se produce de forma extracelular. La composición de alcoholes grasos puede incluir uno o más de un alcohol graso de C6, C8, CIO, C12, C13, C14, C15, C16, C17, o C18; o un alcohol graso insaturado de C10:l, C12:l, C14:l, C16:l, o un C18:l. En otro aspecto relacionado, la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos de C12 y C14 . En aún otro aspecto relacionado, la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos de C12 y C14 a una relación de aproximadamente 3:1. En aún otro aspecto relacionado, la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos insaturados. Además, la composición de alcoholes grasos puede incluir un alcohol graso que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de carbonos entre C7 y C8 del extremo reducido de alcohol graso. En otro aspecto, la composición de alcoholes grasos incluye alcoholes grasos saturados. En otro aspecto, la composición de alcoholes grasos incluye alcoholes grasos de cadena ramificada.

La descripción contempla adicionalmente un método para producir una composición de alcoholes grasos a un alto titulo, rendimiento o productividad, el cual incluye los pasos de manejar una célula hospedadora recombinante; cultivar la célula hospedadora recombinante en un medio que incluye una fuente de carbono; y opcionalmente aislar la composición de alcoholes grasos del medio.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente descripción se entiende mejor cuando se lee en unión con las figuras anexas, que sirven para ilustrar las modalidades preferidas. Sin embargo, se entiende que descripción no se limita a las modalidades especificas descritas en las figuras.

La Figura 1 es una vista general esquemática de una ruta de biosintesis de ejemplo para el uso en la producción de acil-CoA como un precursor a derivados de ácidos grasos en una célula hospedadora recombinante. El ciclo se inicia por la condensación de malonil-ACP y acetil-CoA.

La Figura 2 es una vista general esquemática de un ciclo de biosíntesis de ácidos grasos de ejemplo, donde se produce malonil-ACP por la transacilación de malonil-CoA a malonil-ACP (catalizada por malonil-CoA:ACP-transacilasa; fabD), entonces, b-cetoacil-ACP-sintasa III (fabH) inicia la condensación de malonil-ACP con acetil-CoA. Los ciclos de alargamiento empiezan con la condensación de malonil-ACP y un acil-ACP catalizado por b-cetoacil-ACP sintasa I (fabB) y b-cetoacil-ACP sintasa II (fasbF) para producir b-ceto-acil-ACP, luego, el b-ceto-acil-ACP se reduce por una b-cetoacil-ACP reductasa dependiente de NADPH (fabG) para producir una b-hidroxi-acil-ACP, que se deshidrata a una trans-2-enoil-acil-ACP por b-hidroxiacil-ACP dehidratasa (fabA o fabz). FabA también puede isomerizar trans-2-enoil-acil-ACP a cis-3-enoil-acil-ACP, que puede derivar fabl y se puede usar por fabB (típicamente, hasta una longitud de cadena alifática de C16) para producir b-ceto-acil-ACP. El paso final en cada ciclo se cataliza por enoil-ACP reductosa (fabl) dependiente de NADH o NADHPH que convierte trans-2-enoil-acil-ACP a acil-ACP. En los métodos descritos en la presente, la terminación de la síntesis de ácidos grasos se presenta por la remoción mediante tioesterasa del grupo acilo a partir de acil-ACP para liberar los ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas inglés). Las tioesterasas (por ejemplo, tesA) hidrolizan los enlaces de tioéster, que se presentan entre las cadenas de acilo y ACP a través de enlaces de sulfhidrilo.

La Figura 3 ilustra la estructura y función del complejo enzimático de acetil-CoA-carboxilasa (accABCD). La biotina-carboxilasa que se codifica por el gen accC, en tanto que la proteina portadora de carboxilo de biotina (BCCP) se codifica por el gen accB. Las dos subunidades comprendidas en la actividad carboxiltransferasa se codifican por los genes accA y accD. La biotina covalentemente unida de BCCP porta la porción de carboxilato. El gen birA (no mostrado) biotinila holo-accB.

La Figura 4 presenta una vista general esquemática de una ruta biosintética de ejemplo para la producción de alcohol gras partiendo de acil-ACP, donde la producción de aldehido graso se cataliza por la actividad enzimática de acil-ACP-reductasa (AAR) o tioesterasa y ácido carboxílico-reductasa (Car). El aldehido graso se convierte al alcohol gras por aldehido-reductasa (también referida como alcohol-deshidrogenasa). Esta ruta no incluye acil graso-CoA-sintetasa (fadD).

La Figura 5 ilustra la producción de derivados de ácidos grasos (especies grasas totales) por la cepa MG1655 de E. coli con el gen fadE atenuado (es decir, suprimido) en comparación a la producción de derivados de ácidos grasos por E. coli MG1655. Los datos presentados en la Figura 5 muestran que la atenuación del gen fadE no afecta la producción de derivados de ácidos grasos.

Las Figuras 6A y 6B muestran los datos para la producción de "especies grasas totales" de tamices de placa en duplico cuando el plásmido pCL-WT TRC WT TesA se transformó en cada una de las cepas mostradas en las figuras y se corrió una fermentación en el medio FA2 con 20 horas desde la inducción a la recolección, ambas a 32°C (Figura 6A) y 37°C (Figura 6B).

Las Figuras 7A y 7B proporcionan una representación esquemática del locus iFAB138, incluyendo un diagrama del promotor cat-loxP-T5 integrado en frente de FAB138 (7A); y un diagrama de iT5_138 (7B). La secuencia del promotor cat-loxP-T5 integrado en frente de FAB138 con 50 pares de base de homología mostrados en cada lado de la región promotora cat-loxP-T5 se proporciona como SEQ ID NO:l y la secuencia de la región promotora con iT5_138 con homología de 50 pares de base en cada lado se proporciona como SEQ ID NO: 2.

La Figura 8 muestra el efecto de corregir los genes rph e ilvG. Se transformaron EG149 (rph-ilvg-) y V668 (EG149 rph+ilvG+) con pCL-tesA (un plásmido pCL1920 que contiene PTRC_,tesA) obtenido a partir de D191. La figura muestra que la corrección de los genes rph e ilvG en la cepa EG149 permite un mayor nivel de producción de FFA que en la cepa V668 donde no se corrigieron los genes rph e ilvG.

La Figura 9 es una representación esquemática de una inserción de casete de transposón en el gen yijP de la cepa LC535 (acierto de transposón 68F11). Se muestran los promotores internos al casete de transposón, y puede tener efectos en la expresión de los genes adyacentes.

La Figura 10 muestra la conversión de ácidos grasos libres a alcoholes grasos por CarB60 en la cepa V324. Las figuras muestran que las células que expresan CarB60 del cromosoma (barras oscuras) convierten una fracción mayor de ácidos grasos libres de C12 y C14 en alcohol graso en comparación a CarB (barras claras).

La Figura 11 muestra que las células que expresan CarB60 del cromosoma convierten una mayor fracción de ácidos grasos libres de C12 y C14 en alcohol graso en comparación a CarB.

La Figura 12 muestra la producción de alcoholes grasos después de la fermentación de mutantes de biblioteca de combinación.

La Figura 13 muestra la producción de alcoholes grasos por las variantes carB en el plásmido de producción (carBl y CarB2) después de la fermentación de matraz agitado.

La Figura 14 muestra la producción de alcoholes grasos por las variantes carB integradas en copia individual (icarBl icarB2, icarB3 y icarB4) después de la fermentación en matraz agitado.

La Figura 15 muestra los resultados del sistema de examen de plásmido dual para variantes CarB mejoradas como se valida por la fermentación en matraz agitado.

La Figura 16 muestra nuevas variantes de CarB para producción mejorada de alcoholes grasos en biorreactores.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Vista General La presente descripción proporciona nuevas enzimas variantes de ácido carboxilico-reductasa (CAR) asi como sus secuencias de ácido nucleico y de proteina. Adicionalmente se abarcan por la descripción células hospedadoras recombinantes y cultivos celulares que incluyen las enzimas variantes de CAR para la producción de alcoholes grasos. A fin de que la producción de alcoholes grasos a partir de biomasa o azúcares fermentables sea comercialmente viable, el proceso se debe optimizar para la conversión y recuperación eficiente del producto. La presente descripción afronta esta necesidad al proporcionar composiciones y métodos para la producción mejorada de alcoholes grasos usando enzimas variantes manejas y células hospedadoras, recombinantes, manejadas. Las células hospedadoras sirven como biocatalizadores que dan por resultado producción en alto titulo de alcoholes grasos usando procesos de fermentación. Como tales, la descripción proporciona adicionalmente métodos para crear células hospedadoras fotosintéticas y heterotróficas que producen directamente alcoholes grasos y alfa-olefinas de longitudes especificas de cadena tal que no es necesaria la conversión catalítica de ácidos grasos purificados. Este nuevo método proporciona ventajas de costo y calidad de producto.

De manera más específica, la producción de una composición deseada de alcoholes grasos se pude mejorar al modificar la expresión de uno o más genes comprendidos en una ruta de biosíntesis para la producción de degradación y/o secreción de alcoholes grasos. La descripción proporciona células hospedadoras recombinantes, gue se han manejado para proporcionar biosíntesis mejorada de alcoholes grasos con relación a las células hospedadoras nativas o no manejadas (por ejemplo, mejoras de cepas). La descripción también proporciona polinucleótidos útiles en las células hospedadoras recombinantes, en los métodos y en las composiciones de la descripción. Sin embargo, se reconocerá que no es necesaria la identidad absoluta de secuencia para estos polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden hacer cambios en una secuencia particular de polinucleótido, y el polipéptido codificado se evalúa para la actividad. Estos cambios comprenden típicamente mutaciones conservadoras y mutaciones imperceptibles (por ejemplo, optimización por codón). Los polinucleótidos modificados o mutados (es decir, mutantes) y los polipéptidos variantes codificados se pueden examinar para una función deseada, tal como, una función mejorada en comparación al polipéptido de origen, incluyendo pero no limitado para actividad catalítica incrementada, estabilidad incrementada o inhibición disminuida (por ejemplo, inhibición de retroalimentación disminuida), usando métodos conocidos en la téenica.

La descripción identifica actividades enzimáticas comprendidas en varias pasos (es decir, reacciones) de las rutas biosintéticas de ácidos grasos descritas en la presente de acuerdo al número de Clasificación de Enzima (EC, por sus siglas en inglés), y proporciona polipéptidos de ejemplo (es decir, enzimas) categorizadas por estos números de EC, y polinucleótidos de ejemplo que codifican para estos polipéptidos. Estos polinucleótidos y polipéptidos de ejemplo, que se identifican en la presente por los números de acceso y/o los números de identificador de secuencia (SEQ ID NO), son útiles para manejar rutas de ácidos grasos en células hospedadoras parentales para obtener las células hospedadoras recombinantes descritas en la presente. Sin embargo, se va a entender que los polipéptidos y polinucleótidos descritos en la presente son de ejemplo y no limitantes. Las secuencias de homólogos de polipéptidos de ejemplo descritos están disponibles para aquellos expertos en la técnica usando bases de datos (por ejemplo, las bases de datos Entrez proporcionadas el National Center for Biotechnology Information (NCBI), las bases de datos ExPaSy proporcionadas por el Swiss Institute of Bioinformatics, la base de datos de BRENDA proporcionada por la Technical University de Braunschweig, y la base de datos KEGG proporcionada por el Bioinformatics Center de la Kyoto University y University de Tokyo, todas los cuales están disponibles en la Telaraña Mundial (World Wide Web).

Se pueden modificar una variedad de células hospedadoras para que contengan enzimas biosintéticas de alcoholes grasos tal como aquellas descritas en la presente, que dan por resultado células hospedadoras recombinantes adecuadas para la producción de composiciones de alcoholes grasos. Se entiende que una variedad de células puede proporcionar fuentes de material genético, incluyendo secuencias de polinucleótido que codifican para polipéptidos adecuados para el uso en una célula hospedadora recombinante, proporcionada con la presente.

Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde la descripción. Aunque en la práctica de la presente descripción se pueden usar métodos y materiales similares, o equivalentes, aquellos descritos en la presente, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente. Al describir y reivindicar la presente descripción, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas más adelante.

Números de Acceso: Los números de acceso de secuencia a todo lo largo de esta descripción se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenido por lso National Institutes of Health, E.U.A. (que se identifican en la presente como "Números de Acceso NCBI" o de manera alternativa como "Números de Acceso de GenBank"), y de las bases de datos UniProt Knowledgebase (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Swiss Institute of Bioinformatics (que se identifican como "Números de Acceso UniProtKB").

Números de clasificación de enzima (EC): Los números EC se establecen por el Nomenclature Co mittee of the InternationalUnionof Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), la descripción de lo cual está disponible en el sitio web de IUBMB Enzyme Nomenclature en la Telaraña Mundial. Los números EC clasifican enzimas de acuerdo a la reacción catalizada.

Como se usa en la presente, el término "nucleótido" se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste de una base heterocielica, una azúcar, y uno o más grupos fosfato. Las bases que se presentan de forma natural (guanina, (G), adenina (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) son típicamente derivados de purina o pirimidina, aunque se debe entender que también se obtienen análogos de base que se presentan de forma natural y que no se presentan de forma natural. El azúcar que se presenta de forma natural es la pentosa (azúcar de cinco carbonos) desoxirribosa (que forma ADN) o ribosa (que forma ARN), aunque se debe entender que, también se incluyen análogos de azúcar que se presentan de forma natural y que no se presentan de forma natural. Típicamente los ácidos nucleicos se enlazan mediante enlaces de fosfato para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque en la téenica se conocen muchos otros enlaces (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).

Como se usa en la presente, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN), que puede ser de hebra individual o de doble hebra y que pueden contener nucleótidos alterados o no naturales. Los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" se usan de manera indistinta en la presente para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ARN o ADN. Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y de esta manera incluyen ADN de hebra individual y doble, y ARN de hebra individual y doble. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN producidos a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tal como, aunque no se limita a polinucleótidos metilados y/o rematados. El polinucleótido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero no limitado a, plásmido, viral, cromosómico, EST, ADNc, ARNm, y ARNr.

Como se usa en la presente, los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera indistinta para referirse a un polipéptido que se produce por téenicas recombinantes, en donde en general el ADN o ARN que codifica para la proteína expresada se inserta en un vector de expresión adecuado que se usa a su vez para transformar una célula hospedadora para producir el polipéptido.

Como se usa en la presente, los términos "homólogo", y "homologa" se refieren a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 50% idéntica a la correspondiente secuencia de polinucleótido o polipéptido. De manera preferente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótido o secuencias de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos aproximadamente 99% de homología a la correspondiente secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido. Como se usa en la presente los términos "homología" de secuencia y "identidad" de secuencia se usan de manera indistinta.

Un experto en la técnica está bien consiente de los métodos para determinar la homología entre dos o más secuencias. De forma breve, se pueden realizar como sigue los cálculos de la "homología" entre dos secuencias. Las secuencias se alinean par propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir separaciones en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima y las secuencias no homologas se pueden desechar para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una primera secuencia que se alinea para propósitos de comparación es al menos aproximadamente 30%, de manera preferente al menos aproximadamente 40%, de manera más preferente al menos aproximadamente 50%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 60%, y de manera aún más preferente al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o aproximadamente 100% de longitud de una segunda secuencia. Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido de la primera y segunda secuencias entonces se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El por ciento de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de separaciones y la longitud de cada separación, que se necesite introducir para alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del por ciento de homología entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215(3): 403-410 (1990)). El por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácido también se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6 (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)). El por ciento de homología entre dos secuencias de nucleótidos también se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de separación de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un experto en la téenica puede realizar los cálculos iniciales de homología y ajustar por consiguiente los parámetros de algoritmo. Un conjunto preferido de parámetros (y uno que se debe usar si el practicante está dudoso acerca de que parámetros se deben aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalidad de separación de 12, una penalidad de extensión de separación 4, y una penalidad de separación de desplazamiento de marco de 5. Los métodos adicionales de alineación de secuencia se conocen en la téenica bien biotecnológica (ver, por ejemplo, Rosenberg, BMC Bioinformatics, 6: 278 (2005); Altschul, et al, FEBS J., 272(20): 5101-5109(2005)).

Como se usa en la presente, el término "híbrida bajo condiciones de baja severidad, de severidad media, de alta severidad o de muy alta severidad" describe las condiciones para la hibridación y lavado. La guía para realizar las reacciones de hibridación se puede encontrar en Molecular Biology, John Wilcy & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y se puede usar cualquier método. Las condiciones específicas de hibridación referidas en la presente son como sigue: 1) condiciones de hibridación de baja severidad — 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0.2X SSC, 0.1% de SDS al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se puede incrementar de 55°C para condiciones de baja severidad); 2) condiciones de hibridación de severidad media — 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 60°C; 3) condiciones de hibridación de alta severidad -- 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2.X SSC, 0.1% SDS a 65°C; y 4) condiciones de hibridación de muy alta severidad — fosfato de sodio 0.5M, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1% SDS a 65°C. Las condiciones de muy alta severidad (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique de otro modo.

Un polipéptido "endógeno" se refiere a un polipéptido codificado por el genoma de la célula hospedadora Cpor ejemplo, célula microbiana parental) de la cual se maneja o deriva la célula recombinante.

Un polipéptido "exógeno" se refiere a un polipéptido que no se codifica por el genoma de la célula microbiana parental. Un polipéptido variante (es decir, mutante) es un ejemplo de un polipéptido exógeno.

El término "heterólogo" significa en general derivado de una especie diferente o derivado de un diferente organismo. Como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos o una secuencia de polipéptido que no se presenta de forma natural en un organismo particular. La expresión "heterólogo" significa que una proteina o polipéptido se adiciona experimentalmente a una célula que no expresa normalmente esa proteina. Como tal, heterólogo se refiere al hecho que una proteina transferida se deriva inicialmente de un diferente tipo de célula o de una diferente especie que el receptor. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido endógena a una célula vegetal se puede introducir en una célula hospedadora bacteriana por métodos recombinantes, y el polinucleótido vegetal entonces es un polinucleótido heterólogo en una célula hospedadora bacteriana, recombinante.

Como se usa en la presente, el término "fragmento" de un polipéptido se refiere a una porción más corta de un polipéptido o proteina de longitud completa que varia en tamaño desde cuatro residuos de aminoácido a la secuencia completa de aminoácidos menos un residuo de aminoácido. En ciertas modalidades de la descripción, un fragmento se refiere a la secuencia completa de aminoácidos de un dominio de un polipéptido o proteina (por ejemplo, un substrato que se une a dominio o un dominio catalítico).

Como se usa en la presente, el término "mutagénesis" se refiere a un proceso por el cual se cambia la información genética de un organismo de una manera estable. La mutagénesis de una proteína que codifica para la secuencia de ácido nucleico produce una proteína mutante. La mutagénesis también se refiere a cambios en secuencias no codificadoras de ácido nucleico que dan por resultado actividad modificada de la proteína.

Como se usa en la presente, el término "gen" se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican ya sea para un producto de ARN o un producto de proteína, así como secuencias de ácido nucleico operablemente enlazados que afectan la expresión del ARN o de la proteína (por ejemplo, estas secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias promotoras o intensificadoras) o secuencias de ácido nucleico operablemente enlazadas que codifican para secuencias que afectan la expresión del ARN o proteína (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a sitios de unión a ribosoma o secuencias de control transduccional).

Las secuencias de control de expresión se conocen en la téenica e incluyen, por ejemplo, promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, terminadores de transcripción, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES, por sus siglas en inglés), y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula hospedadora. Las secuencias de control de expresión interactúan específicamente con proteínas celulares comprendidas en la transcripción (Maniatis et al, Science, 236: 1237-1245 (1987)). Las secuencias de control de expresión de ejemplo se describen en por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

En los métodos de la descripción, una secuencia de control de expresión se enlaza operablemente a una secuencia de polinucleótido. Por "operablemente enlazada" se quiere decir que una secuencia de polinucleótido y una secuencia de control de expresión se conectan de una manera tal para permitir la expresión génica cuando se unen las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) a las secuencias de control de expresión. Los promotores operablemente enlazados están localizados y la dirección 5' de la secuencia seleccionada de polinucleótido en términos de la dirección de transcripción y traducción. Los intensificadores operablemente enlazados pueden estar localizados en la dirección 5', dentro de, o en la dirección 3' del polinucleótido seleccionado.

Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleótido, a la cual se ha enlazado. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosómica) . Los vectores útiles son aquellos capaces de replicación y expresión autónoma de ácidos nucleicos a los cuales se enlazan. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente se refieren en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las téenicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de "plásmidos", que se refieren en general como asas circulares de ADN de doble hebra que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. Los términos "plásmido" y "vector" se usan de manera indistinta en la presente, con respecto a un plásmido que es la forma más comúnmente usada del vector. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se llegarán a conocer en la téenica subsiguiente a la presente. En algunas modalidades, el vector recombinante comprende típicamente al menos una secuencia que incluye (a) una secuencia de control de expresión operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; (b) un marcador de selección operativamente acoplado a la secuencia de polinucleótido; (c) una secuencia marcadora operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; (d) una porción de purificación operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; (e) una secuencia de secreción operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; y (f) una secuencia de selección de objetivo operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido. Los vectores de expresión descritos en la presente incluyen una secuencia de polinucleótidos descrito en la presente en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula hospedadora. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, del nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en la presente se pueden introducir en células hospedadoras para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión codificados por las secuencias de polinucleótido como se describe en la presente.

La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E coli, se lleva a cabo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de ya sea polipéptidos de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión adicionan varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, usualmente al amino- o carboxi-término del polipéptido recombinante. Estos vectores de fusión sirven típicamente para uno o más de los siguientes tres propósitos: (1) incrementar la expresión del polipéptido recombinante; (2) incrementar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la porción de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión.

En ciertas modalidades, se enlaza de manera operable una secuencia de polinucleótido de la descripción a un promotor derivado de bacteriófago T5. En ciertas modalidades, la célula hospedadora es una célula de levadura, y el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari et al, EMBO J., 6:. 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan et al, Cell, 30:933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al, Gene, 54:113-123 (1987)), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), y Picz (Invitrogen Corp., San Diego, CA). En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula insectil, y el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células insectiles cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al, Mol. Cell. Biol, 3:2156-2165 (1983)) y la serie pVL (Lucklow et al, Virology, 170:31-39 (1989)). En aun otra modalidad, las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente se pueden expresar en células mamíferas usando un vector de expresión de mamífero. En la téenica son bien conocidos otros sistemas adecuados de expresión tanto para células procarióticas como eucarióticas; ver, por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Coid Spring Harbor Laboratory, (1989).

Como se usa en la presente "acil-CoA" se refiere a un acil-tioéster formado entre el carbono de carbonilo de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo de la porción 4'-fosfopantetionilo de la coenzima A (CoA), que tiene la fórmula RC(O)S-CoA, en donde R es cualquier grupo alquilo que tiene al menos 4 átomos de carbono.

Como se usa en la presente "acil-ACP" se refiere a un acil-tioéster entre el carbono de carbonilo de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo de la porción fosfopanteteinilo de una proteina portadora de acilo (ACP). La porción fosfopanteteinilo se une de manera post-trasduccional a un residuo de serina conservado en la ACP por la acción de la proteina portadora de holo-acilo-sintasa (ACPS), una fosfopanteteinil-transferasa. En algunas modalidades un acil-ACP es un compuesto intermedio en la síntesis de los acil-ACP completamente saturados. En otras modalidades, un acil-ACP es un compuesto intermedio en la síntesis de los acil-ACP insaturados. En algunas modalidades, la cadena de carbono tendrá aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 carbonos. Cada uno de estos acil-ACP son substratos para enzimas que los convierten a derivados de ácidos grasos.

Como se usa en la presente, el término "ácido graso o derivado del mismo" significa un "ácido graso" o un "derivado de ácido graso". El término "ácido graso" significa un ácido carboxilico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferentemente un grupo alquilo. R comprende entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una modalidad preferida, el ácido graso se produce a partir de una ruta de biosintesis de ácidos grasos. El término "derivado de ácido graso" significa productos producidos en parte a partir de la ruta de biosintesis de ácidos grasos del organismo hospedador de producción". El "derivado de ácido graso" también incluye productos producidos en parte de acil-ACP o derivados de acil-ACP. Los derivados de ácidos grasos de ejemplo incluyen, por ejemplo, acil-CoA, aldehidos grasos, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, y ásteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos, o ásteres grasos).

Como se usa en la presente, el término "ruta biosintética de ácidos grasos" significa una ruta biosintética que produce ácidos grasos y derivados de estos mismos. La ruta biosintética de ácidos grasos puede incluir enzimas o polipéptidos adicionales con actividades enzimáticas además de las analizadas en la presente para producir derivados de ácidos grasos que tienen características deseadas.

Como se usa en la presente, "aldehido graso" significa un aldehido que tiene la fórmula RCHO caracterizado por un grupo carbonilo (C=0). En algunas modalidades, el aldehido graso es cualquier aldehido producido de un alcohol graso. En ciertas modalidades, el grupo R es de al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, carbonos de longitud. De manera alternativa, o adicionalmente, el grupo R es de 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, o 6 o menos carbonos de longitud. De esta manera, el grupo R puede tener un grupo R resumido por cualquiera de los dos puntos terminales anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede ser de 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud, o 12-18 carbonos de longitud. En algunas modalidades, el aldehido graso es un aldehido graso de e, C7, Ce, Cg, Cío, Cu, Ci2, C13, C14, Ci5, Ci6, Ci7, Cig, C19, C20, C2i, C22 C23, C24, C25, o C26- En ciertas modalidades, el aldehido graso es un aldehido graso de C6, C7, C8, Cg, Ci0, Cu, C12, C13, C14, C15, Cig, Ci7, o C18· Como se usa en la presente, "alcohol graso" significa un alcohol que tiene la fórmula ROH. En algunas modalidades, el grupo R es de al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, carbonos de longitud. De manera alternativa, o adicionalmente, el grupo R es de 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, o 6 o menos carbonos de longitud. De esta manera, el grupo R puede tener un grupo R unido por cualquiera de los dos puntos terminales anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede ser de 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud, o 12-18 carbonos de longitud. En algunas modalidades, el alcohol graso es un alcohol graso de C6, C7, C8, C9, Ci0, Cu, C12, C13, C14, C15, Ci6, C17, Cíe, C19, C20 C21, C22, C23, C24, C25, O C26.En ciertas modalidades, el alcohol graso es un alcohol graso de C e, C7, C8, C9, Cío, CU, CI2, CI3, C14, C15, Ci6, C7, o Ci8.

Una "composición de alcoholes grasos" como se usa en la presente se produce por una célula hospedadora recombinante y comprende típicamente una mezcla de alcoholes grasos. En algunos casos, la mezcla incluye más de un tipo de producto (por ejemplo, alcoholes grasos y ácidos grasos). En otros casos, las composiciones de derivados de ácidos grasos pueden comprender, por ejemplo, una mezcla de alcoholes grasos con varias longitudes de cadena y características de saturación o ramificación. En aún otros casos, la composición de alcoholes grasos comprende una mezcla de más de un tipo de producto y productos con varias longitudes de cadena y características de saturación o ramificación.

Una célula hospedadora manejada para producir un aldehido graso convertirá típicamente algo del aldehido graso de un alcohol graso. Cuando una célula hospedadora, que produce alcoholes grasos, se maneja para expresar un polinucleótido que codifica para éster-sintasa, se producen ásteres de cera. En una modalidad, se producen alcoholes grasos a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Como un ejemplo, se puede convertir acil-ACP a ácidos grasos mediante la acción de una tioesterasa (por ejemplo, E. coli TesA), que se convierten a aldehidos grasos y alcoholes grasos mediante la acción de un ácido carboxílico-reductasa (por ejemplo, E. coli CarB). La conversión de aldehidos grasos a alcoholes grasos se puede facilitar adicionalmente, por ejemplo, mediante la acción de un polipéptido biosintético de alcohol graso. En algunas modalidades, un gen que codifica para un polipéptido biosintético de alcohol graso se expresa o sobreexpresa en la célula hospedadora. En ciertas modalidades, el polipéptido biosintético de alcohol graso tiene actividad de aldehido-reductasa o alcohol-deshidrogenasa. Los ejemplos de polipéptidos de alcohol-deshidrogenasa útiles de acuerdo con la descripción incluyen, pero no se limitan a AirA de Acinetobacter sp. M-l (SEQ ID NO: 3) u homólogos AlrA, tal como AlrAadl (SEQ ID NO: 4) y alcohol-deshidrogenasas endógenas de E. coli tal como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 5), DkgA (NP_417485), DlcgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995),YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) y YbbO [AAC73595.1]. Se describen ejemplos adicionales en las Publicaciones de Solicitudes de Patente Internacional Núms. W02007/136762, W02008/119082 y W02010/062480, cada una de los cuales se incorpora expresamente como referencia en la presente. En ciertas modalidades, el polipéptido biosintético de alcohol graso tiene actividad de aldehído-reductasa o alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1).

Como se usa en la presente, el término "alcohol-deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido capaz de catalizar la conversión de un aldehido graso a un alcohol (por ejemplo, alcohol graso). Un experto en la téenica apreciará que ciertas alcohol-deshidrogenasas son capaces de catalizar otras reacciones también, y estas alcohol-deshidrogenasas no específicas también se abarcan por el término "alcohol-deshidrogenasa. " El grupo R de un ácido graso, aldehido graso o alcohol graso puede ser una cadena recta o una cadena ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener más de un punto de ramificación y pueden incluir ramificaciones cíclicas. En algunas modalidades, el ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado es un alcohol graso ramificado, aldehido graso ramificado o ácido graso ramificado de C6, C7, C8, C9, C10, C^, ^"12/ ^"13' ^*14 t ^15, ^16 ' ^·17' ^"18' ^-19, ^-20' ^"21' C22, C23, C24, C25, O C26. En modalidades particulares, el ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado, o alcohol graso ramificado de C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, o C18. En ciertas modalidades, el grupo hidroxilo del ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado está en la posición primaria (C . En ciertas modalidades, el ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido iso-ácido graso, iso-aldehído graso, o iso-alcohol graso, o un antesio-ácido graso, un anteiso-aldehido graso, o anteiso-alcohol graso. En modalidades de ejemplo, el ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado se selecciona de ácido graso ramificado, aldehido graso ramificado o alcohol graso ramificado de iso-C7:o, iso-C8:0, iso-C9:0, ÍSO-Ci0:0, ÍSO-Cn:o, iso-Ci2:0, iso-Ci3;0, iso-Ci4:0, iso-C15;oA ÍSO-Ci6;0, ÍSO-Ci7:o, ÍSO-Ci8;0 ÍSO-Ci9:o, anteiS0-C7;o, anteiso-C8:0 anteiso-C9:o, anteiso-Ci0:or anteiso-Cn:0, anteiso-C12:o anteiso-Ci3:0, anteiso-Ci4:0, anteiso-Ci5;0, anteiso-Ci6:c anteiso-Ci7;0 anteiso-Ci8:o^ anteiso-Ci9:o. El grupo R de un ácido graso ramificado o no ramificado, aldehido graso ramificado o no ramificado, alcohol graso ramificado o no ramificado puede estar saturado o insaturado. Si está insaturado, el grupo R puede tener uno o más de un punto de insaturación. En algunas modalidades, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado es un ácido graso monoinsaturado, aldehido graso monoinsaturado, o alcohol graso monoinsaturado. En ciertas modalidades, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado es un ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado de C6:l, C7:l, C8:l, C9:l, C10:l, Cll:l, C12:l, C13:1, C14:1, C15:l, C16:l, C17:l, C18:l, C19:l, C20:l, C21:1, C22:1, C23:l, C24:l, C25:l, o C26:l. En ciertas modalidades preferidas, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado es de C10:l, C12:l, C14:l, C16:l, o C18:l. En aun otras modalidades, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado está insaturado en la posición omega-7. En ciertas modalidades, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado, o alcohol graso insaturado comprende un doble enlace cis.

Como se usa en la presente, una "célula hospedadora" recombinante o manejada es una célula hospedadora, por ejemplo, un microorganismo que se ha modificado tal que produce alcoholes grasos. En algunas modalidades, la célula hospedadora recombinante comprende uno o más polinucleótidos, cada polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad biosintética de aldehido graso y/o alcohol graso, en donde la célula hospedadora recombinante produce una composición de alcoholes grasos cuando se cultiva en la presencia de una fuente de carbono bajo condiciones efectivas para expresar los polinucleótidos.

Como se usa en la presente, el término "clon" se refiere típicamente a una célula o grupo de células descendientes de y esencialmente idénticas de forma genética a un ancestro común único, por ejemplo, la bacteria de una colonia bacteriana clonada surgida de una célula bacteriana única.

Como se usa en la presente, el término "cultivo" se refiere típicamente a un medio líquido que comprende células viables. En una modalidad, un cultivo comprende células que se reproducen en un medio predeterminado de cultivo bajo condiciones controladas, por ejemplo, un cultivo de células hospedadoras recombinantes cultivadas en medio liquido que comprende una fuente seleccionada de carbono y nitrógeno. "Cultivo" o "cultivación" se refiere a hacer crecer una población de células hospedadoras recombinantes bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En modalidades particulares cultivo se refiere a la bioconversión fermentativa de un substrato a un producto final. Los medios de cultivo son bien conocidos y los componentes individuales de estos medios de cultivo están disponibles de fuentes comerciales, por ejemplo, bajo las marcas comerciales DifcoMR y BBLMR. En una modalidad no de ejemplo, el medio nutriente acuoso es un "medio rico" que comprende fuentes complejas de nitrógeno, sales, y carbono, tal como el medio YP, que comprende 10 g/L de peptona y 10 g/L de extracto de levadura de este medio. La célula hospedadora de un cultivo se puede manejar de forma adicional, para asimilar de manera eficiente el carbono y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono de acuerdo a los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; 5,602,030; WO 2010127318, cada una de las cuales se incorpora expresamente en la presente como referencia. Además, en algunas modalidades, la célula hospedadora se maneja para expresar una invertasa de modo que se puede usar sacarosa como una fuente de carbono.

Como se usa en la presente, el término "bajo condiciones efectivas para expresar una secuencia de polinucleótido géticamente manejada" significa cualquier condición que permita una célula hospedadora produzca un derivado de ácido graso, deseado. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación.

Como se usa en la presente, "modificado" o una "nivel alterado" de la actividad de una proteina, por ejemplo una enzima, en una célula hospedadora recombinante se refiere a una diferencia en una o más características en la actividad determinada con relación a la célula hospedadora nativa o de origen. Típicamente se determinan diferencias en la actividad entre una célula hospedadora recombinante, que tiene actividad modificada, y la correspondiente célula hospedadora tipo silvestre (por ejemplo, comparación de un cultivo de una célula hospedadora recombinante con relación a la célula hospedadora tipo silvestre). Las actividades modificadas pueden ser el resultado de, por ejemplo, cantidades modificadas de proteína expresada por una célula hospedadora recombinante (por ejemplo como resultado del número incrementado o disminuido de copias de secuencias de ADN que codifican para la proteína, número incrementado o disminuido de transcriptos de ARNm que codifican para la proteína, y/o cantidades incrementadas o disminuidas de traducción de proteína de la proteína del ARNm); cambios en la estructura de la proteína (por ejemplo, cambios en la estructura primaria, tal como, cambios a la secuencia codificadora de la proteína que dan por resultado cambios en la especificidad del substrato, cambios en los parámetros cinéticos observados); y cambios en la estabilidad de la proteína (por ejemplo, degradación incrementada o disminuida de la proteína) . En algunas modalidades, el polipéptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. En ciertos casos, las secuencias codificadoras de los polipéptidos descritos en la presente están optimizadas por codón para la expresión en una célula hospedadora particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, se pueden optimizar uno o más codones como se describe en, por ejemplo, en Grosjean et al, Gene 18:199-209 (1982).

El término "secuencias reguladoras" como se usa en la presente se refiere típicamente a una secuencia de bases en ADN, operablemente enlazada a secuencias de ADN que codifican para una proteína que controla finalmente la expresión de la proteína. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras de ARN, secuencias de unión al factor de transcripción, secuencias de terminación de transcripción, moduladores de transcripción (tal como elementos intensificadores, secuencias de nucleótidos) que afectan la estabilidad de ARN, y secuencias reguladoras de trascripción (tal como, sitios de unión de ribosoma (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno en procariotas o secuencias Kozak en eucariotas), codones de inicio, codones de terminación).

Como se usa en la presente, la frase "la expresión de la secuencia de nucleótidos se modifica con relación a la secuencia de nucleótidos tipo silvestre", significa un incremento o disminución en el nivel de expresión y/o actividad de una secuencia endógena de nucleótidos o la expresión y/o actividad de una secuencia de nucleótidos, que codifica para un polipéptido no nativo o heterólogo. Como se usa en la presente, el término "sobreexpresa" significa que expresa o provoca que se exprese un polinucleótido o polipéptido en una célula a una mayor concentración de lo que se expresa normalmente en una correspondiente célula tipo silvestre bajo las mismas condiciones.

Los términos "nivel alterado de expresión" y "nivel modificado de expresión" se usan de manera indistinta y significan que un polinucleótido, polipéptido, o hidrocarburo está presente en una concentración diferente en una célula hospedadora manejada en comparación a su concentración en una correspondiente célula tipo silvestre bajo las mismas condiciones.

Como se usa en la presente, el término "titulo" se refiere a la cantidad de derivado de ácido graso producido por volumen unitario de cultivo de célula hospedadora. En cualquier aspecto de las composiciones y métodos descritos en la presente, un derivado de ácido graso se produce a un titulo de aproximadamente 25 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 75 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 125 mg/L, aproximadamente 150 mg/L, aproximadamente 175 mg/L, aproximadamente 200 mg/L, aproximadamente 225 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 275 mg/L, aproximadamente 300 mg/L, aproximadamente 325 mg/L, aproximadamente 350 mg/L, aproximadamente 375 mg/L, aproximadamente 400 mg/L, aproximadamente 425 mg/L, aproximadamente 450 mg/L, aproximadamente 475 mg/L, aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 525 mg/L, aproximadamente 550 mg/L, aproximadamente 575 mg/L, aproximadamente 600 mg/L, aproximadamente 625 mg/L, aproximadamente 650 mg/L, aproximadamente 675 mg/L, aproximadamente 700 mg/L, aproximadamente 725 mg/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 775 mg/L, aproximadamente 800 mg/L, aproximadamente 825 mg/L, aproximadamente 850 mg/L, aproximadamente 875 mg/L, aproximadamente 900 mg/L, aproximadamente 925 mg/L, aproximadamente 950 mg/L, aproximadamente 975 mg/L, aproximadamente 1000 mg/L, aproximadamente 1050 mg/L, aproximadamente 1075 mg/L, aproximadamente 1100 mg/L, aproximadamente 1,125 mg/L, aproximadamente 1150 mg/L, aproximadamente 1175 mg/L, aproximadamente 1200 mg/L, aproximadamente 1225 mg/L, aproximadamente 1250 mg/L, aproximadamente 1275 mg/L, aproximadamente 1300 mg/L, aproximadamente 1325 mg/L, aproximadamente 1350 mg/L, aproximadamente 1375 mg/L, aproximadamente 1400 mg/L, aproximadamente 1425 mg/L, aproximadamente 1450 mg/L, aproximadamente 1475 mg/L, aproximadamente 1500 mg/L, aproximadamente 1525 mg/L, aproximadamente 1550 mg/L, aproximadamente 1575 mg/L, aproximadamente 1600 mg/L, aproximadamente 1625 mg/L, aproximadamente 1650 mg/L, aproximadamente 1675 mg/L, aproximadamente 1700 mg/L, aproximadamente 1725 mg/L, aproximadamente 1,750 mg/L, aproximadamente 1775 mg/L, aproximadamente 1800 mg/L, aproximadamente 1825 mg/L, aproximadamente 1850 mg/L, aproximadamente 1875 mg/L, aproximadamente 1900 mg/L, aproximadamente 1925 mg/L, aproximadamente 1950 mg/L, aproximadamente 1975 mg/L, aproximadamente 2000 mg/L (2g/L), 3g/L, 5g/L, lOg/L, 20g/L, 30g/L, 40g/L, 50g/L, 60g/L, 70g/L, 80g/L, 90g/L, 100g/L o un intervalo unido por cualquiera de dos de los valores anteriores. En otras modalidades, se produce un derivado de ácido graso a un titulo de más de 100g/L, más de 200g/L, más de 300g/L, o más alto, tal como 500g/L, 700g/L, l,000g/L, 1,200g/L, 1,500g/L, o 2000 g/L. El titulo preferido de derivado de ácido graso producido por una célula hospedadora recombinante de acuerdo a los métodos de la descripción es de 5g/L a 200g/L, lOg/L a 150g/L, 20g/L a 120g/L y 30g/L a 100 g/L.

Como se usa en la presente, el "rendimiento de aldehido graso o alcohol graso producir por una célula hospedadora" se refiere a la eficiencia por la cual se convierte una fuente de carbono de entrada al producto (es decir, alcohol graso o aldehido graso) en una célula hospedadora. Las células hospedadora manejadas para producir aldehidos grasos y/o alcoholes grasos de acuerdo a los métodos de la descripción tienen un rendimiento de al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 16%, al menos 17%, al menos 18%, al menos 19%, al menos 20%, al menos 21%, al menos 22%, al menos 23%, al menos 24%, al menos 25%, al menos 26%, al menos 27%, al menos 28%, al menos 29%, o al menos 30% o un intervalo unido por cualquiera de dos de los valores anteriores. En otras modalidades, un aldehido graso o alcohol graso se produce a un rendimiento de más de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. De manera alternativa, o adicionalmente, el rendimiento es aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 27% o menos, aproximadamente 25% o menos, o aproximadamente 22% o menos. De esta manera, el rendimiento se puede unir por cualquiera de dos de los puntos terminales anteriores. Por ejemplo, el rendimiento de un aldehido graso o alcohol graso producido por la célula hospedadora recombinante de acuerdo a los métodos de la descripción puede ser 5% a 15%, 10% a 25%, 10% a 22%, 15% a 27%, 18% a 22%, 20% a 28%, o 20% a 30%. El rendimiento preferido del alcohol graso producido por la célula hospedadora recombinante de acuerdo a los métodos de la descripción es de 10% a 30%.

Como se usa en la presente, el término "productividad" se refiere a la cantidad de aldehido graso o alcohol graso producida por volumen unitario del cultivo de célula hospedadora por tiempo unitario. En cualquier aspecto de las composiciones y métodos descritos en la presente, la productividad de un aldehido graso o alcohol graso producido por una célula hospedadora recombinante es al menos 100 mg/L/hora, al menos 200 mg/L/hora, al menos 300 mg/L/hora, al menos 400 mg/L/hora, al menos 500 mg/L/hora, al menos 600 mg/L/hora, al menos 700 mg/L/hora, al menos 800 mg/L/hora, en menos 900 mg/L/hora, al menos 1000 mg/L/hora, al menos 1100 mg/L/hora, al menos 1200 mg/L/hora, al menos 1300 mg/L/hora, al menos 1400 mg/L/hora, al menos 1500 mg/L/hora, al menos 1600 mg/L/hora, al menos 1700 mg/L/hora, al menos 1800 mg/L/hora, al menos 1900 mg/L/hora, al menos 2000 mg/L/hora, al menos 2100 mg/L/hora, al menos 2200 mg/L/hora, al menos 2300 mg/L/hora, al menos 2400 mg/L/hora, o al menos 2500 mg/L/hora. De manera alternativa, o además la productividad es de 2500 mg/L/hora o menos, 2o00 mg/L/hora o menos, 1500 mg/L/hora o menos, 120 mg/L/hora o menos, 1000 mg/L/hora o menos, 800 mg/L/hora o menos, o 600 mg/L/hora o menos. De esta manera, la productividad se puede unir por cualquiera de los dos puntos finales anteriores. Por ejemplo, la productividad puede ser de 3 a 30 mg/L/hora, de 6 a 20 mg/L/hora, o de 15 a 30 mg/L/hora. La productividad preferida de un aldehido graso o alcohol graso producido por una célula hospedadora recombinante de acuerdo a los métodos de la descripción se selecciona de 500 mg/L/hora a 2500 mg/L/hora, o 700 mg/L/hora a 2000 mg/L/hora.

Los términos "especie grasa total" y "producto de ácido graso total" se pueden usar de manera indistinta en la presente con referencia a la cantidad de alcoholes grasos, aldehidos grasos, ácidos grasos y ésteres grasos presentes en una muestra cómo se evaluó por GC-FID, como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional W02008/119082. Las muestras pueden contener uno, dos, tres, o cuatro de estos compuestos dependiendo del contexto.

Como se usa en la presente, el término "velocidad de utilización de glucosa" significa la cantidad de glucosa usada por el cultivo por tiempo unitario, reportada como gramos/litro/hora (g/L/hr).

Como se usa en la presente, el término "fuente de carbono" se refiere a un substrato o compuesto adecuado para que se use como una fuente de carbono para crecimiento de células procarióticas o eucarióticas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en varias formas, incluyendo, pero no limitado a, polímeros, carbohidratos, ácidos, alcoholes, aldehidos, cetonas, aminoácidos, péptidos, y gases (por ejemplo, CO y CO2)- Las fuentes de carbono de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tal como glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, xilosa, y arabinosa; oligosacáridos, tal como fructo-oligosacáridos y galacto-oligosacárido; polisacáridos tal como almidón, celulosa, pectina, y xilano; disacáridos, tal como sacarosa, maltosa, celobiosa, y turanosa; material celulósico y variantes tal como hemicelulosas, metil-celulosa y carboximetil-celulosa sódica; ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tal como etanol, metanol y glicerol, o mezclas de estos. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, por ejemplo glucosa. En ciertas modalidades preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras modalidades preferidas, la fuente de carbono es glucosa. En otras modalidades preferidas, la fuente de carbono es sacarosa.

Como se usa en la presente, el término "biomasa" se refiere a cualquier material biológico del cual se deriva una fuente de carbono. En algunas modalidades, se procesa una biomasa en una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversión. En otras modalidades, la biomasa no requiere procesamiento adicional en una fuente de carbono. La fuente de carbono se puede convertir en un biocombustible. Una fuente de biomasa de ejemplo es materia vegetal o vegetación, tal como maíz, caña de azúcar, o césped de pradera. Otra fuente de biomasa de ejemplo son productos de desperdicio metabólico, tal como materia animal (por ejemplo, abono de vaca). Las fuentes adicionales de biomasa de ejemplo incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, agricultura, silvicultura y domésticos, incluyendo, pero no limitado a, desperdicios de fermentación, ensilaje, paja, madera, agua negras, basura, desperdicios urbanos celulósico, y restos de comida. El término "biomasa" también se refiere a fuentes de carbono, tal como carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos).

Como se usa en la presente, el término "aislado", con respecto a productos (tal como ácidos grasos y derivados de estos) se refieren a productos que se separan de componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores químicos o sintéticos. Los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos por los métodos descritos en la presente pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por lo tanto, los ácidos grasos y derivados de los mismos pueden colectarse en una fase orgánica, ya sea de manera intracelular o de forma extracelular.

Como se usa en la presente, los términos "purificar", "purificado" o "purificación" significan la remoción o aislamiento de una molécula de su ambiente, por ejemplo, aislamiento o separación. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están al menos aproximadamente 60% libres (por ejemplo, al menos aproximadamente 70% libres, al menos aproximadamente 75% libres, al menos aproximadamente 85% libres, al menos aproximadamente 90% libres, al menos aproximadamente 95% libres, al menos aproximadamente 97% libres, al menos aproximadamente 99% libres) de otros componentes con los cuales están asociados. Como se usa en la presente, estos términos también se refieren a la remoción de una muestra. Por ejemplo, la remoción de contaminantes puede dar por resultado un incremento en el porcentaje de un aldehido graso o un alcohol graso en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un aldehido graso o un alcohol graso en una célula hospedadora recombinante, el aldehido graso o alcohol graso se puede purificar por la remoción de proteínas de células hospedadoras. Después de la purificación, se incrementa el porcentaje de aldehido graso o alcohol graso en la muestra. Los términos "purificar", "purificado" y "purificación" son términos relativos que no requieren pureza absoluta. De esta manera, por ejemplo, cuando se produce un aldehido graso o un alcohol graso en células hospedadoras recombinantes, un un aldehido graso o un alcohol graso purificado es un aldehido graso o un alcohol graso que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, carbohidratos, u otros hidrocarburos).

Mejoras de cepas A fin de generar un mayor titulo, rendimiento y/o productividad de alcoholes grasos, se hicieron varias modificaciones a las células hospedadoras, productoras. El FadR es un factor regulador clave comprendido en la degradación de ácidos grasos y en las rutas biosintéticas de ácidos grasos (Cronan et al, Ma Microbiol, 29 (4):937-943 (1998)). La enzima FadD de E. coli ACS y la proteina de transporte FadL de ácidos grasos son componentes de un sistema de captación de ácidos grasos. FadL media el transporte de ácidos grasos en la célula bacteriana, y FadD media la formación de ésteres de acil-CoA. Cuando no está disponible otra fuente de carbono, los ácidos grasos exógenos se captan por las bacterias y se convierten a ésteres de acil-CoA, que pueden unirse al factor de transporte FadR y reducen la expresión de los genes fad que codifican para las proteínas responsables del transporte (FadL), activación (FadD), y b-oxidación (FadA, fadB, fADE, y FAdH) de ácidos grasos. Cuando están disponibles fuentes alternativas de carbono, las bacterias sintetizan ácidos grasos como acil-ACP, que se usan para la síntesis de fosfolípidos, pero no son substratos para la b-oxidación. De esta manera, acil-CoA y acil-ACP son ambos fuentes independientes de ácidos grasos que pueden dar por resultado diferentes productos terminales (Caviglia et al, J. Biol Chem, 279 (12):1163-1169 (2004)). Las Solicitud provisional EUA No.61/470989 describe métodos mejorados para producir derivados de ácidos grasos en una célula hospedadora que se maneja genéticamente para tener un nivel alterado de expresión de un polipéptido FadR en comparación al nivel de expresión del polipéptido FadR en la correspondiente célula hospedadora tipo silvestre.

Hay especulaciones en conflicto en la téenica con respecto a los factores limitantes de la biosintesis de ácidos grasos en una célula hospedadora, tal como E. coli . Un planteamiento para incrementar el flujo a través de la biosintesis de ácidos grasos es manipular varias enzimas en la ruta (Figuras 1 y 2). El suministro de acil-ACP a partir de acetil-CoA mediante el complejo de acetil-CoA carboxilasa (acc) (Figura 3) y la ruta biosintética de ácidos grasos (fab) puede limitar la velocidad de producción de alcoholes grasos. En un planteamiento de ejemplo detallado en el ejemplo 2, el efecto de la sobreexpresión de Corynebacterium glutamicum accABCD (ibirA) demostró que estas modificaciones genéticas pueden conducir a acetil-CoA y malonil-CoA incrementados en E. coli . Una posible razón para una baja velocidad de flujo a través de la biosintesis de ácidos grasos es un suministro limitado de precursores, específicamente, acetil-CoA y en particular malonil-CoA, y los principales precursores para la biosintesis de ácidos grasos. El ejemplo 3 describe la construcción de operones fab que codifican para enzimas en la ruta biosintética para la conversión de malonil-CoA en acil-ACP y la integración en el cromosoma de una célula hospedadora de E. coli . En aun otro planteamiento detallo en el ejemplo 4, las mutaciones en los genes rph e ilvG en la célula hospedadora de E. coli se mostró que dan por resultado mayor producción de ácidos grasos libres (FFA), que se traduce en mayor producción de alcohol graso. En aún otro planteamiento, se realizó la mutagénesis de transposón y examen de alto rendimiento para encontrar mutaciones benéficas que incrementan el titulo o el rendimiento. El ejemplo 5 describe como una inserción de transposón en el gen yijP puede mejorar el rendimiento de alcoholes grasos en fermentaciones en matraz agitado y lote alimentado. Ácidos carboxílico-reductasa (CAR) Se han manejado células hospedadoras recombinantes para producir alcoholes grasos al expresar una tioesterasa, que cataliza la conversión de acil-ACP en ácidos grasos libres (FFA) y una ácido carboxilico-reductasa (CAR), que convierte ácidos grasos libres en aldehidos grasos. Las aldehidos-reductasas nativas (endógenas) presentes en la célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) pueden convertir aldehidos grasos en alcoholes grasos. Las tioesterasas de ejemplo se describen por ejemplo en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20100154293, incorporada expresamente en la presente como referencia. CarB, es una ácido carboxilico-reductasa de ejemplo, una enzima clave en la ruta de producción de alcoholes grasos. La W02010/062480 describe una búsqueda BLAST que usa la secuencia de aminoácidos NRRL 5646 CAR (acceso Genpept AAR91681) (SEQ ID NO: 6) como la secuencia de consulta, y uso en la misma en identificación de aproximadamente 20 secuencias homologas.

Los términos "ácido carboxilico-reductasa", "CAR" y "polipéptido biosintético de aldehido graso" se usan de manera indistinta en la presente. Al practicar la descripción, en la célula hospedadora se expresa o sobreexpresa un gen que codifica para un polipéptido de ácido carboxilico-reductasa. En algunas modalidades, el polipéptido CarB tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En otras modalidades, el polipéptido CarB es una variante o mutante de SEQ ID NO: 7 En ciertas modalidades, el polipéptido CraB es de una célula mamlfera, célula vegetal, célula insectil, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongo filamentoso, una célula bacteriana, o cualquier otro organismo. En algunas modalidades, la célula bacteriana es una micobacteria seleccionada del grupo que consiste de Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum, y Mycobacterium ulcerans . En otras modalidades, la célula bacteriana es de una especie Nocardia, por ejemplo, NocardiaNRRL 5646, Nocardia farcinica , Streptomyces griseus, Salinispora arenicola , o Clavibacter michiganenesis . En otras modalidades, el polipéptido CarB es un homólogo de CarB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. La identidad de un polipéptido CarB que tiene al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 no se limita de manera particular, y un experto en la téenica puede identificar fácilmente homólogos de CarB derivado de MG1655 de E. coli y determinar su función usando los métodos descritos en la presente. En otras modalidades, el polipéptido CarB contiene una mutación en el número de aminoácido 3, 12, 20.28, 46, 74, 103, 191, 288, 473, 827, 926, 927, 930 o 1128 de SEQ ID NO: 7. En la tabla 10 se detallan las mutaciones de ejemplo. Los fragmentos o mutantes preferidos de un polipéptido retienen alguna o toda la función biológica (por ejemplo, actividad enzimática) del correspondiente polipéptido tipo silvestre. En algunas modalidades, el fragmento o mutante retiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% o más de la función biológica del correspondiente polipéptido tipo silvestre. En otras modalidades, el fragmento o mutante retiene aproximadamente 100% de la función biológica del correspondiente polipéptido tipo silvestre. La guia para determinar que residuos de aminoácido pueden estar substituidos, insertados o suprimidos sin afectar la actividad biológica se pueden encontrar usando programas de computadora bien conocidos en la téenica, por ejemplo, software LASERGENEMR (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

En aún otras modalidades, un fragmento o mutante exhibe función biológica incrementada en comparación a un correspondiente polipéptido tipo silvestre. Por ejemplo, un fragmento o mutante pueden presentar al menos aproximadamente una mejora de 10%, al menos aproximadamente de 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 90% de una actividad enzimática en comparación al correspondiente polipéptido tipo silvestre. En otras modalidades, el fragmento o mutante presenta al menos aproximadamente 100% (por ejemplo, al menos aproximadamente 200%, o al menos aproximadamente 500%) de mejora en la actividad enzimática en comparación al correspondiente polipéptido tipo silvestre. Se entiende que los polipéptidos descritos en la presente pueden tener sustituciones de aminoácido conservadoras o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial en la función del polipéptido. Si o no se tolerará una sustitución particular (es decir, no afectará de manera adversa la función biológica deseada, tal como la actividad enzimática o unión a ADN) se puede determinar cómo se describe en Bowie et al. ( Science, 247:1306-1310 (1990)).

Como resultado de los métodos y enzimas variantes de la presente descripción, uno o más del titulo, rendimiento, y/o productividad del ácido graso o derivado del mismo producido por la célula hospedadora manejada que tiene un nivel alterado de expresión de un polipéptido CarB se incrementa con relación a aquel de la correspondiente célula hospedadora tipo silvestre. Para permitir la conversión máxima de ácidos grasos de C12 y C14 en alcoholes grasos, se debe expresar CarB en actividad suficiente. Una célula hospedadora, recombinante, mejorada tendrá una enzima CAR que se expresa de, por ejemplo, el cromosoma de E. coli . Como se muestra en el ejemplo 6, las células que expresan la enzima CarB del cromosoma tienen más actividad de ácido carboxílico-reductasa con relación a la CarB original y son capaces de convertir más ácidos grasos de C12 y C14 en alcoholes grasos. CarB es un gen grande (3.5 kb) e incrementa considerablemente el tamaño de plásmido, haciendo difícil usar un plásmido pCL para probar nuevos genes durante el desarrollo de la cepa.

Los planteamientos para incrementar la actividad de CarB, incluyen su solubilidad, estabilidad, expresión y/o funcionalidad. En un planteamiento de ejemplo, una proteina de fusión que contiene 6 histidinas y un sitio de escisión de trombina en el N-terminal de CarB se produce. Esta enzima difiere de CarB por 60 nucleótidos adicionales en el N-terminal, y se llama CarB60. Cuando CarB o CarB60 se expresan del cromosoma de E. coli bajo el control del promotor pTRC, las células que contienen CarB60 tienen actividad de ácido carboxilico-reductasa celular total incrementada y convierten más ácidos grasos libres de C12 y C14 (FFA) en alcoholes grasos. Un experto en la téenica apreciará que este es un ejemplo de ingeniería molecular a fin de lograr una mayor conversión de ácidos grasos libres (FFA) de C12 y C14 en alcoholes grasos como se ilustra en el ejemplo 6 ( supra). En la presente se abarcan planteamientos similares (ver ejemplo 7).

Las fosfopanteteína-transferasas (PPTasas) (EC 2.7.8.7) catalizan la transferencia de 4 ' -fosfopanteteína de CoA a un substrato. Car, CarB de Nocardia y varios homólogos de esto contienen un sitio putativo de unión para 4'-fosfopanteteína (PPT) (He et al, Appl . Environ . Microbiol, 70 (3):1874-1881 (2004)). En algunas modalidades de la descripción, una PPTasa se expresa o sobreexpresa en una célula hospedadora manejada. En ciertas modalidades, la PPTasa es EntD de E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 8). En algunas modalidades, una tioesterasa y una ácido carboxilico-reductasa se expresan o sobreexpresan en una célula hospedadora manejada. En ciertas modalidades, la tioesterasa es tesA y la ácido carboxilico-reductasa es carB. En otras modalidades, una tioesterasa, una ácido carboxilico-reductasa y una alcohol-deshidrogenasa se expresan o sobreexpresan en una célula hospedadora manejada. En ciertas modalidades, la tioesterasa es tesA, la ácido carboxilico-reductasa es carB y la alcohol-deshidrogenasa es alrAadpl (número de acceso GenPept CAG70248.1) de Acinetobacter baylyi ADP1 (SEQ ID NO: 4). En aún otras modalidades, una tioesterasa, una ácido carboxilico-reductasa, una PPTasa, y una alcohol-deshidrogenasa se expresan o sobreexpresan en una célula hospedadora manejada. En ciertas modalidades, la tioesterasa es tesA, la ácido carboxilico-reductasa es carB, la PPTasa es entD, y la alcohol-deshidrogenasa es alrAadpl. En aún modalidades adicionales, una célula hospedadora modificada que expresa una o más de una de tioesterasa, una CAR, una PPTasa, y una alcohol-deshidrogenasa también tiene una o más mejoras de cepa. Las mejoras de cepa de ejemplo incluyen, pero no se limitan a expresión o sobreexpresión de un polipéptido de acetil-CoA-carboxilasa, sobreexpresión de un polipéptido FadR, expresión o sobreexpresión de un operón de iFAB heterólogo, o inserción de transposón en el gen yijP u otro gen, o planteamientos similares. La descripción también proporciona una composición de alcoholes grasos producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente. Una composición de alcoholes grasos producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente se puede usar directamente como materia prima para la producción de otros compuestos químicos (por ejemplo, polímeros, agentes tensioactivos, plásticos, textiles, solventes, adhesivos, etcétera) o aditivos de cuidado personal. Estos compuestos también se pueden usar como materia prima para reacciones subsiguientes, por ejemplo, hidrogenación, craqueo catalítico (por ejemplo, mediante hidrogenación, pirólisis, o ambos) para producir otros productos.

Mutantes o Variantes En algunas modalidades, el polipéptido expresado en una célula hospedadora recombinante es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. Los términos "mutante" y "variante" se usan en la presente para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un polipéptido tipo silvestre por al menos un aminoácido. Por ejemplo, el mutante puede comprender una o más de las siguientes sustituciones conservadoras de aminoácido: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina, e isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina; reemplazo de una treonina con una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que tiene un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que tiene un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, con otro residuo aromático. En algunas modalidades, el polipéptido mutante tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más sustituciones, adiciones, inserciones o supresiones de aminoácido. Los fragmentos o mutantes preferidos de un polipéptido retienen algo o toda la función biológica (por ejemplo, actividad enzimática) del correspondiente polipéptido tipo silvestre. En algunas modalidades, el fragmento o mutante retiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% o más de la función biológica del correspondiente polipéptido tipo silvestre. En otras modalidades, el fragmento o mutante retiene aproximadamente 100% de la función biológica del correspondiente polipéptido tipo silvestre. La guia para determinar que residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o suprimir sin afectar la actividad biológica se puede encontrar usando programas de computadora bien conocidos en la téenica, tal como el software Lasergene"11 (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

En aún otras modalidades, un fragmento o mutante exhibe función biológica incrementada en comparación a un correspondiente polipéptido tipo silvestre. Por ejemplo, un fragmento o mutante puede presentar al menos una mejora de 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, o al menos 90% en la actividad enzimática en comparación al correspondiente polipéptido tipo silvestre. En otras modalidades, el fragmento o mutante presenta al menos 100% (por ejemplo, al menos 200%, o al menos 500%) de mejora en la actividad enzimática en comparación al correspondiente polipéptido tipo silvestre. Se entiende que los polipéptidos descritos en la presente pueden tener sustituciones de aminoácido conservadoras o no esenciales, adicionales, que no tienen un efecto sustancial en la función del polipéptido. Si o no una sustitución particular se tolerará (es decir, no afectará de manera adversa la función biológica deseada, tal como la actividad de ácido carboxilico-reductasa) se puede determinar como se describe en Bowie et al. ( Science, 247:1306-1310 (1990)). Una sustitución conservadora de aminoácido es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la téenica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, U sina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Las variantes se pueden presentar de forma natural o se crean in vitro. En particular, estas variantes se pueden crear usando técnicas de ingeniería genética, tal como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión por exonucleasa III, o técnicas de clonación normal. De manera alternativa, estas variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear usando procedimientos de modificación o síntesis química.

En la técnica son bien conocidos los métodos para producir variantes. Estos incluyen procedimientos en los cuales las secuencias de ácido nucleico obtenidas de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen características que mejoran su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En estos procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Típicamente, estas diferencias de nucleótidos dan por resultado cambios de aminoácido con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales. Por ejemplo, se pueden preparar variantes al usar de mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describe en, por ejemplo, Arnold, Curr. Opin . Biotech, 4:450-455 (1993). La mutagénesis aleatoria se puede lograr usando PCR propensa a error (ver, por ejemplo, Leung et al, Technique, 1:11-15 (1989) y Caldwell et al, PCR Methods Applic, 2:28-33 (1992)). En la PCT propensa a error, se realiza la PCR bajo condiciones donde la fidelidad de copia del ADN-polimerasa es baja, tal que se obtiene una alta proporción de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de PCR. Brevemente, en estos procedimientos, los ácidos nucleicos que se van a mutagenizar (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de reductasa carboxílica) se mezclan con cebadores de PCR, amortiguador de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq-polimerasa, y una concentración apropiada de dNTP para lograr una alta proporción de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede realizar usando 20 fmoles del ácido nucleico que se va a mutagenizar, 30 pmol de cada cebador de PCR, un amortiguador de reacción que comprende KC1 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8.3), gelatina al 0.01%, MgC127 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de Taq-polimerasa, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La PCR se puede realizar durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar como sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados entonces se clonan en un vector apropiado, y se evalúan (ver ejemplo 7) las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados. Se puede lograr la mutagénesis dirigida al sitio usando mutagénesis dirigida por oligonucleótido para generar mutaciones especificas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótido se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson et al, Science, 241:53-57 (1988). De forma breve, en estos procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos de doble hebra que tienen una o más mutaciones que se van a introducir en el ADN clonado se sintetizan e insertan en el ADN clonado que se va mutagenizar (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de CAR). Se recuperan los clones que contienen el ADN mutagenizado, y se valoran las actividades de los polipéptidos que codifican. Otro método para generar variantes es PCR de montaje. La PCR de montaje comprende el montaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Se presentan un número grande de diferentes reacciones de PCR en paralelo en el mismo frasco, con los productos de una reacción que ceban los productos de otra reacción. La PCR montaje se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No.5,965,408. Aun otro método para generar variantes es mutagénesis por PCR sexual. En la mutagénesis por PCR sexual, se presenta recombinación homologa forzada entre moléculas de ADN de diferentes secuencias de ADN, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN con base a la homología de secuencia. Esto se sigue por fijación del cruce por extensión de cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis por PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer, Proc. Nati . Acad. Sci ., EUA, 91:10747-10751 (1994).

También se pueden crear variantes por mutagénesis in vivo. En algunas modalidades, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de ácido nucleico al propagar la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que tiene mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Estas cepas mutadoras tienen una mayor proporción de mutación aleatoria que aquellas de una cepa tipo silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido CAR) en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para el uso para la mutagénesis in vivo se describen en, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 1991/016427. Las variantes también se pueden generar usando mutagénesis de casete. En mutagénesis de casete, se reemplaza una pequeña región de una molécula de ADN de doble hebra con un "casete" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene frecuentemente una secuencia nativa aleatorizada de forma completa y/o parcial. La mutagénesis de montaje recursivo también se puede usar para generar variantes. La mutagénesis de montaje recursivo es un algoritmo para manejo de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar las rondas sucesivas de la mutagénesis de casete combinatorio. La mutagénesis de montaje recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin et al, Proc. Nati . Acad. Sci, E. U. A. , 89:7811-7815 (1992). En algunas modalidades, se crean variantes usando mutagénesis de montaje exponencial. La mutagénesis de montaje exponencial es un proceso para generar bibliotecas de combinación con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de montaje exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave et al, Biotech, Res , 11:1548-1552 (1993). En algunas modalidades, se crean variantes usando procedimientos de transposición en donde se fusionan conjuntamente porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que .codifican para distintos polipéptidos, para crear secuencias quiméricas de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos quiméricos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,965,408 y 5,939,250.

La mutagénesis de inserción es la mutagénesis de ADN mediante la inserción de una o más bases. Las mutaciones de inserción pueden presentarse de forma natural, estar mediadas por virus o transposón, o se pueden crear de manera artificial para propósitos de investigación en el laboratorio, por ejemplo, por mutagénesis de transposón. Cuando el ADN exógeno se integra en aquel del hospedador, la severidad de cualquier mutación resultante depende directamente de la ubicación dentro del genoma del hospedador en donde se inserta el ADN. Por ejemplo, pueden ser evidentes efectos significativos si se inserta un transposón de un gen esencial, en una región promotora, o en una región represora o intensificadora. La mutagénesis de transposón y el examen de alto rendimiento se hacen para encontrar mutaciones benéficas que incrementan el titulo o rendimiento del alcohol graso. La descripción proporciona células hospedadoras recombinantes que comprenden (a) una secuencia de polinucleótidos que codifica para una ácido carboxílico-reductasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de ácido carboxílico-reductosa, en donde la célula hospedadora recombinante es capaz de producir un aldehido graso o un alcohol graso.

Manejo de células hospedadoras En algunas modalidades, se proporciona una secuencia (o gen) de polinucleótido a una célula hospedadora por medio de un vector recombinante, que comprende un promotor operablemente enlazado a la secuencia de polinucleótido. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor regulado en el desarrollo, uno especifico del organelo, uno especifico de tejido, uno inducible, uno constitutivo, o uno especifico de la célula. En algunas modalidades, el vector recombinante incluye (a) una secuencia de control de expresión operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; (b) un marcador de selección operativamente acoplado a la secuencia de polinucleótido; (c) una secuencia marcadora operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; (d) una porción de purificación operativamente acoplado a la secuencia de polinucleótido; (e) una secuencia de secreción operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido; y (f) una secuencia de selección a objetivo operativamente acoplada a la secuencia de polinucleótido. Los vectores de expresión descritos en la presente incluyen una secuencia de polinucleótido descrita en la presente en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula hospedadora. Se apreciará por aquellos expertos en la téenica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etcétera, los vectores de expresión descritos en la presente se pueden introducir en células hospedadoras para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente. La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de ya sea los polipéptidos de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión adicionan varios aminoácidos a un polipéptido codificado en el mismo, usualmente al amino- o carboxi-término del polipéptido recombinante. Estos vectores de fusión sirven típicamente para uno o más de los siguientes tres propósitos: (1) para incrementar la expresión del polipéptido recombinante; (2) para incrementar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) para ayudar en la purificación del polipéptido recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la porción de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de estas enzimas, y sus secuencias cognadas de reconocimiento, incluyen el Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al, Gene, 67: 31-40 (1988).), PMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), y pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), que fusionan glutationa-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana.

Los ejemplos de vectores inducibles de expresión de E. coli n de fusión incluyen pTrc (Amann et al, Gene (1988) 69:301-315) y pET lid (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión génica diana del vector pTrc depende de la transcripción de ARN-polimerasa del hospedador de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión génica diana del vector pET lid depende de la transcripción del promotor de fusión T7 gnlO-lac mediada por una ARN-polimerasa viral co-expresada (T7 gnl). Esta polimerasa viral se suministra por las cepas hospedadoras BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago l residente que tiene un gen T7 gnl bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. En la téenica son bien conocidos los sistemas adecuados de expresión tanto para células procarióticas como eucarióticas; ver, por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Coid Spring Harbor Laboratory, (1989). Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli , no de fusión, inducibles incluyen pTrc (Amann et al, Gene, 69:301-315 (1988)) y PET lid (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, páginas 60-89 (1990)). En ciertas modalidades, una secuencia de polinucleótido de la descripción se enlaza de manera operable a un promotor derivado de bacteriófago T5. En una modalidad, la célula hospedadora es una célula de levadura. En esta modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Se pueden introducir vectores en células procarióticas o eucarióticas mediante una variedad de téenicas reconocidas para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en, por ejemplo, Sambrook et al. ( supra) . Para transformación estable de células bacterianas, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transformación usada, solo una pequeña fracción de células tomará y replicará el vector de expresión. En algunas modalidades, a fin de identificar y seleccionar estos transformantes, se introduce un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionadles incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos tal como, pero no limitados a, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetracielina. En la célula hospedadora se pueden introducir ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en el mismo vector como aquel que codifica para un polipéptido descrito en la presente o se pueden introducir en un vector separado. Las células transformadas de manera estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar por crecimiento en la presencia de un fármaco apropiado de selección.

P d ió d siciones de alcoholes sos células inantes Las estrategias para incrementar la producción de alcoholes grasos por células hospedadoras recombinantes incluyen flujo incrementado a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos mediante la sobreexpresión de genes nativos de biosíntesis de ácidos grasos y la expresión de genes de biosíntesis de ácidos grasos exógenos de diferentes organismos en un hospedador manejado de producción. La actividad mejorada de las enzimas pertinentes en la ruta de biosíntesis de alcoholes grasos, por ejemplo, CAR, así como otras estrategias para optimizar el crecimiento y productividad de la célula hospedadora también se puede emplear para aumentar al máximo la producción. En algunas modalidades, la célula hospedadora recombinante comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido (una enzima) que tiene actividad biosintética de alcohol graso (es decir, un péptido biosintético de alcohol graso o una enzima biosintética de alcohol graso), y se produce un alcohol graso por una célula hospedadora recombinante. Se puede producir una composición que comprende alcoholes grasos (una composición de alcoholes grasos) al cultivar la célula hospedadora recombinante en la presencia de una fuente de carbono bajo condiciones efectivas para expresar una enzima biosintética de alcohol graso. En algunas modalidades, la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos, sin embargo, una composición de alcoholes grasos puede comprender otros derivados de ácidos grasos. Típicamente, la composición de alcoholes grasos se recupera del ambiente extracelular de la célula hospedadora recombinante, es decir, el medio de cultivo celular. En un planteamiento, se han manejado células hospedadoras recombinantes para producir alcoholes grasos al expresar una tioesterasa, que cataliza la conversión de acil-ACP en ácidos grasos libres (FFA) y una ácido carboxílico-reductasa (CAR), que convierte ácidos grasos libres en aldehidos grasos. Las aldehidos-reductasas nativas (endógenas) presentes en la célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) pueden convertir los aldehidos grasos en alcoholes grasos. En algunas modalidades, el alcohol graso se produce al expresar o sobreexpresar en la célula hospedadora recombinante un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de biosíntesis de alcoholes grasos que convierte un aldehido graso a un alcohol graso. Por ejemplo, se puede usar una alcohol-deshidrogenasa (también referida en la presente como una aldehido-reductasa, por ejemplo, EC 1.1.1.1), al practicar la descripción. Como se usa en la presente, el término "alcohol-deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido capaz de catalizar la conversión de un aldehido graso a un alcohol (por ejemplo, un alcohol graso). Un experto en la téenica apreciará que ciertas alcohol-deshidrogenasas son capaces de catalizar también otras reacciones, y estas alcohol-deshidrogenasas no específicas también se abarcan por el término "alcohol-deshidrogenasa". Los ejemplos de polipéptidos de alcohol-deshidrogenasas útiles de acuerdo con la descripción incluyen, pero no se limitan a AlrAadpl (SEQ ID NO: 4) u homólogos de AirA y alcohol-deshidrogenasas endógenas de E. coli tal como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 5), DlcgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) y YbbO [AAC73595.1]. Los ejemplos adicionales se describen en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional núms. W02007/136762, W02008/119082 y WO 2010/062480, cada una de los cuales se incorpora de manera expresa como referencia en la presente. En ciertas modalidades, el polipéptido de biosíntesis de alcohol graso tiene actividad de aldehido-reductasa o alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). En otro planteamiento, se han manejado células hospedadoras recombinantes para producir alcoholes grasos al expresar acil-CoA-reductasas o acil graso-reductasas (FAR) formadoras de alcoholes grasos que convierten sustratos de acil graso-tioéster (por ejemplo, acil graso-CoA o acil graso-ACP) a alcoholes grasos. En algunas modalidades, el alcohol graso se produce al expresar o sobreexpresar un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de acil-CoA-reductasa (FAR) formadora de alcohol graso en una célula hospedadora recombinante. Los ejemplos de polipéptidos FAR útiles de acuerdo con esta modalidad se describen en la Publicación PCT número W02010/062480, que se incorpora expresamente en la presente como referencia.

El alcohol graso se puede producir mediante una ruta dependiente de acil-CoA que utiliza compuestos intermedios de acil graso-ACP y acil graso-CoA y una ruta independiente de acil-CoA que utiliza compuestos intermedios de acil graso-ACP, pero no un compuesto intermedio de acil graso-CoA. En modalidades particulares, la enzima codificada por el gen sobreexpresado se selecciona de una ácido graso-sintasa, una acil-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA-sintasa y una acetil-CoA-carboxilasa. En algunas modalidades, la proteina codificada por el gen sobreexpresado es endógena a la célula hospedadora. En otras modalidades, la proteina codificada por el gen sobreexpresado es heteróloga a la célula hospedadora. También se producen alcoholes grasos en la naturaleza por enzimas que son capaces de reducir varias moléculas de acil-ACP o acil-CoA a los correspondientes alcoholes primarios. Ver también, Publicaciones de Patente de los Estados Unidos núms. 20100105963, y 20110206630 y la Patente de los Estados Unidos No. 8097439, incorporadas expresamente en el presente como referencia. Como se usa en la presente, una célula hospedadora recombinante o una célula hospedadora manejada se refieren a una célula hospedadora cuya constitución genética se ha alterado con relación a la célula hospedadora tipo silvestre correspondiente, por ejemplo, mediante introducción deliberada de nuevos elementos genéticos y/o modificación deliberada de elementos genéticos naturalmente presentes en la célula hospedadora. La descendencia de estas células hospedadoras recombinantes también contiene estos nuevos y/o modificados elementos genéticos. En cualquiera de los aspectos de la descripción descrita en la presente, la célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste de una célula vegetal, célula insectil, célula fúngica (por ejemplo, un hongo filamentoso, tal como Candida sp., o una levadura de brote, tal como Saccharomyces sp.), o una célula de alga y una célula bacteriana. En una modalidad preferida, las células hospedadoras recombinantes son células microbianas recombinantes. Los ejemplos de células hospedadoras que son células microbianas, incluyen pero no se limitan a células del género Escherichia , Bacillus , Lactobacillus , Zymomonas, Rhodococciis , Pseiidomonas, Aspergillus , Trichoderma , Neurospora , Fusarium , Humicola , Rhizomucor , Kluyveromyces , Pichia , Mucor, Myceliophtora , Penicillium, Phanerochaete , Pleurotus , Trametes, Chrysosporium r Saccharomyces , Schizosaccharomyces, Stenotrophamonas , Yarrowia , o Streptomyces . En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana Grampositiva. En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana Gra negativa. En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula de E. coli . En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichenoformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensís, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterhim, una célula de Bacillus subtilis, o una célula de Bacillus amyloliquefaciens. En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Tríchoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus , una célula de Aspergillus nidulans, una Célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginosa, una célula de Rhodococciis opacus, una célula de Rhizomucor miehei, o una célula de Mucor michei .

En aun otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. En aun otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Actinomycetes . En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de una planta eucariótica, alga, cianobacteria, bacteria de azufre verde, bacteria no de azufre verde, bacteria de azufre púrpura, bacteria no de azufre púrpura, extremófilo, levadura, hongo, un organismo manejado de esto, o un organismo sintético. En algunas modalidades, la célula hospedadora es dependiente de la luz o fija carbono. En algunas modalidades, la célula hospedadora es dependiente de la luz o fija carbono. En algunas modalidades, la célula hospedadora tiene actividad autotrófica. En algunas modalidades, la célula hospedadora tiene actividad fotoautotrófica, tal como en la presencia de luz. En algunas modalidades, la célula hospedadora es heterotrófica o mixotrófica en la ausencia de luz. En ciertas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Avabidopsis thaliana , Panicum virgatum, Miscanthus giganteas , Zea mays, Botryococcuse braunii , Chlamydomonas reinhardtii , Dunaliela salina , Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC6803, Thermosynechococcus elongates BP-1 , Chlorobium tepidum, Chloroj lexus auranticus , Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsiilatus , Rhodopseudomonaspalusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridiuthermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichiapastoris , Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe , Pseudomonasj luorescens o Zymomonas mobilis.

Cultivo y fermentación de células hospedadoras manejadas Como se usa en la presente, fermentación se refiere ampliamente a la conversión de materiales orgánicos en sustancias diana por células hospedadoras, por ejemplo, la conversión de una fuente de carbono por células hospedadoras recombinantes en ácidos grasos o derivados de estos al propagar un cultivo de las células hospedadoras recombinantes en un medio que comprende la fuente de carbono. Como se usa en la presente, las condiciones permisivas para la producción significan cualquier condición que permita que una célula hospedadora produzca un producto deseado, tal como un ácido graso o un derivado de ácido graso. De manera similar, las condiciones en las cuales se expresa la secuencia de polinucleótido de un vector significa cualquier condición que permita que una célula hospedadora sintetice un polipéptido. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros, incluyendo pero no limitado a intervalos de temperatura, niveles de aireación, velocidades de alimentación y composición de medios. Cada una de estas condiciones, individualmente y en combinación, permite que la célula hospedadora crezca. La fermentación puede ser aeróbica, anaeróbica, o variaciones de esto (tal como micro-aeróbica). El medio de cultivo de ejemplo incluye caldos o geles. En general, el medio incluye una fuente de carbono que se puede metabolizar por una célula hospedadora directamente. Además, se pueden usar enzimas en el medio facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa a azúcares fermentables) y el metabolismo subsiguiente de la fuente de carbono. Para la producción a pequeña escala, las células hospedadoras manejadas se pueden cultivar en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L o 10 L; fermentar; e inducir para expresar una secuencia deseada de polinucleótido, tal como una secuencia de polinucleótido que codifique para un polipéptido de CAR. Para la producción a gran escala, las células hospedadoras manejadas se pueden cultivar en lotes de aproximadamente 10 L, 100 L, 1000 L, 10,000 L, 100,000 L, 1,000,000 L o más grandes; fermentar; e inducir para expresar una secuencia deseada de polinucleótido. De manera alternativa, se puede llevar a cabo una fermentación por lote alimentado de gran escala.

Composiciones de alcoholes grasos Las composiciones de alcoholes grasos descritas en la presente se encuentran en el ambiente extracelular del cultivo de células hospedadoras recombinantes y se pueden aislar fácilmente del medio de cultivo. Una composición de alcoholes grasos se puede segregar por la célula hospedadora recombinante, transportar en el ambiente extracelular o transferir de manera pasiva al ambiente extracelular del cultivo de la célula hospedadora recombinante. La composición de alcoholes grasos se aísla de un cultivo de células hospedadoras recombinantes usando métodos de rutina conocidos en la téenica. La descripción proporciona composiciones producidas por células hospedadoras recombinantes o manejadas (bioproductos) que incluyen uno o más aldehidos grasos y/o alcoholes grasos. Aunque un componente de alcohol graso con una longitud particular de cadena y grado de saturación puede constituir la mayoría del bioproducto producido por una célula hospedadora recombinante o manejada, cultiva, la composición incluye típicamente una mezcla de aldehidos grasos y/o alcoholes grasos que varía con respecto a la longitud de cadena y/o grado de saturación. Como se usa en la presente, la fracción de carbono moderno o fM tiene el mismo significado como se define por National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs 4990B y 4990C, conocido como las normas HOxI y HOxII de ácidos oxálicos, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0.95 veces de la relación HOxI de isotopos 14C/12C (referida a AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera pre-revolución industrial corregida por descomposición. Para la biosfera viviente actual (material vegetal), fM es aproximadamente 1.1.

Los bioproductos (por ejemplo, los aldehidos y alcoholes grasos producidos de acuerdo con la presente descripción) que comprenden compuestos orgánicos biológicamente producidos, y en particular, los aldehidos y alcoholes grasos producidos usando la ruta biosintética de ácidos grasos de la presente, no se han producido de fuentes renovables y como tales son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos bioproductos se pueden distinguir de compuestos orgánicos derivados de carbono petroquímico en base a la huella isotópica de carbono dual o datación co 14C. Adicionalmente, la fuente especifica de carbono de fuente biológica (por ejemplo, glucosa vs. glicerol) se puede determinar por la huella isotópica de carbono dual (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No.7,169,588, que se incorpora en la presente como referencia). La capacidad para distinguir bioproductos de compuestos orgánicos basados en petróleo es benéfica al seguir estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los productos químicos o compuestos orgánicos que comprenden perfiles de isotopos de carbono tanto de base biológica como de base de petróleo se pueden distinguir de productos químicos y compuestos orgánicos hechos solo de materiales a base de petróleo. Por lo tanto, los bioproductos en la presente se pueden seguir o rastrear en el comercio en base a su perfil único de isotopo de carbono. Los bioproductos se pueden distinguir de compuestos orgánicos basados en petróleo al comparar la relación estable de isótopos de carbono (13C/12C) en cada muestra. La relación 13C/12C en un bioproducto determinado es una consecuencia de la relación 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en que se fija el dióxido de carbono. También refleja la ruta metabólica precisa. También se presentan variaciones regionales. Los carbonatos de petróleo, vegetales de C3 (de hoja ancha), vegetales de C4 (de céspedes), y -marinos muestran todos diferencia significativas en 13C/12C y los correspondientes valores de 513C. Adicionalmente, la materia lipidica de plantas de C3 y C4 analiza de manera diferente que los materiales derivados de los componentes de carbohidratos de las mismas plantas como una consecuencia de la ruta metabólica. Dentro de la precisión de medición, 13C muestra grandes variaciones debido a efectos de fraccionamiento isotópico, el más significativo de los cuales para los bioproductos es el mecanismo fotosintético. La causa principal de diferencias en la relación de isotopos de carbono en plantas está cercanamente relacionada con diferencias en la ruta del metabolismo de carbono fotosintético en las plantas, particularmente la reacción que se presenta durante la carboxilación primaria (es decir, la fijación inicial de CO2 atmosférico). Dos grandes clases de vegetación son aquellas que incorporan el ciclo fotosintético "C3" (o de Calvin-Benson) y aquellas que incorporan el ciclo fotosintético "C4" (o de Hatch-Slack). En las plantas C3, la reacción de carboxilación o fijación de C02 primario comprende la enzima ribulosa-1,5-difosfato-carboxilasa, y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Las plantas C3, tal como maderas duras y coniferas, son dominantes en las zonas de clima templado. En las plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que comprende otra enzima, la fosfoenol-piruvato-carboxilasa, es la reacción de carboxilación primaria. El primer compuesto estable de carbono es un ácido de 4 carbonos que subsiguientemente se descarboxila. El C02 liberado de esta manera se vuelve a fijar por el ciclo C3. Los ejemplos de plantas C4 son pastos tropicales, maíz, y caña de azúcar. Tanto las plantas C4 como C3 exhiben una variedad de relaciones isotópicas de 13C/12C, pero los valores típicos son de aproximadamente -7 a aproximadamente -13 por mil para plantas C4 y aproximadamente -19 a aproximadamente - 27 por mil para plantas C3 (ver, por ejemplo, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355 (1977)). El carbón y el petróleo caen en general en este intervalo anterior. La escala de medición de 13C se definió originalmente por un ajuste cero por piedra caliza de Pee Dee Belemnite (PDB), donde se dan valores en partes por mil desviaciones de este material. Los valores "513C" se expresan en parte por mil (por mil), abreviados, %/00, y se calculan como sigue: ( 0/00 ) = [ ( 13C/12C) muestra 13C/12C) n0nna] / (13C/12C) norma X 1000 Puesto que se ha agotado el material de referencia PDB (RM) se ha desarrollado una serie de RM alternativos en cooperación con los laboratorios IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isotopos, internacionales, seleccionados. Las notaciones para las desviaciones por mil de PDB son 613C. Se hacen mediciones en CO2 por espectrometría de masa de relación estable de alta precisión (IRMS) en iones moleculares de masas 44, 45, y 46. Las composiciones descritas en la presente incluyen bioproductos producidos por cualquiera de los métodos descritos en la presente, incluyendo, por ejemplo, productos de alcoholes y aldehidos grasos. Específicamente, el bioproducto puede tener un delta 513C de aproximadamente -28 o mayor, aproximadamente -27 o mayor, -20 o mayor, -18 o mayor, -15 o mayor, -13 o mayor, -10 o mayor, o -8 o mayor. Por ejemplo, el bioproducto puede tener un 613C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, aproximadamente de -27 a aproximadamente de -19, aproximadamente -25 a aproximadamente -21, aproximadamente de -15 a aproximadamente -5, aproximadamente de -13 a aproximadamente -7, o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En otros casos, el bioproducto puede tener un 513C de aproximadamente -10, -11, -12, o -12.3. Los bioproductos producidos de acuerdo con la descripción de la presente, también se pueden distinguir de compuestos orgánicos a base de petróleo al comparar la cantidad de 14C en cada compuesto. Debido a que 14C tiene una vida media nuclear de 5730 años, los combustibles a base de petróleo que contienen carbono "más viejo" se pueden distinguir de los bioproductos que contienen carbono "más nueva" (ver, por ejemplo, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)).

La suposición básica en la datación por radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en organismos vivos. Sin embargo, debido a la prueba nuclear atmosférica desde 1950 y a la quema de combustible fósil desde 1850, el 14C ha adquirido una segunda característica de tiempo geoquímico. Su concentración en el CO2 atmosférico, y por lo tanto en la biosfera viva, duplicó aproximadamente en el pico de la prueba nuclear, a mediados de 1960. Puesto que gradualmente ha estado regresando a la proporción de isótopos de línea base cosmogénica (atmosférica) de estado estable (14C/12C) de aproximadamente 1.2 x 10-12, con una "vida media" de relajación aproximada de 7-10 años. (Esta última vida media no se debe tomar de forma literal; más bien, se debe usar la función de entrada/descomposición nuclear atmosférica detallada para trazar la variación de 14C atmosférico y bioesférico desde el comienzo de la era nuclear). Es esta última característica de tiempo de 14C bioesférico lo que sostiene la promesa de datación anual de carbono bioesférico reciente. Se puede medir 14C por espectrometría de masas de acelerador (AMS), con resultados dados en unidades de "fracción de carbono moderno" (fM). La fM se define por National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C. Como se usa en la presente, la "fracción de carbono moderno" o "fM" tiene el mismo significado como se define por National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B and 4990C, conocidas como normas de ácido oxálico HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0.95 veces la relación de isotopos 14C/12C HOxI (referida a AD 1950). Esto es aproximadamente divalente a la madera pre-Revolución Industrial corregida por descomposición. Para la biosfera viva actual (material vegetal), la fM es de aproximadamente 1.1.

Las composiciones descritas en la presente incluyen bioproductos que pueden tener una fM 14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto de la descripción puede tener una fM 14C de al menos aproximadamente 1.01, una fM 14C de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.5, una fM 14C de aproximadamente 1.04 ao aproximadamente 1.18, o una fM 14C de aproximadamente 1.111 a aproximadamente 1.124. Se conoce otra medición de 14C como el por ciento de carbono moderno (pMC). Para un arqueólogo o geólogo que usa fechas de 14C, AD 1950 es igual a "edad de cero años". Esto también representa 100 pMC. El "carbono de la bomba" en la atmósfera alcanzó casi dos veces el nivel normal en 1963 en el pico de las guerras termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son mayores de 100 pMC para plantas y animales que viven desde AD 1950. Ha disminuido gradualmente con el paso del tiempo con el valor en la actualidad que es cerca de 107.5 pMC. Esto significa que un material de biomasa fresca, tal como maíz, dará una asignatura de 14C cerca de 107.5 pMC. Los compuestos a base de petróleo tendrán un valor de pMC de cero. La combinación de carbono fósil con carbono del día actual dará por resultado una dilución del contenido de pMC del día actual. Al presumir que 107.5 pMC representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa del día actual y 0 pMC representa el contenido de 14C de productos a base de petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado 100% de soyas el día actual dará una asignatura de radiocarbono cercana a 107.5 pMC. Si ese material se diluyó 50% con productos a base de petróleo, dará una asignatura de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Un contenido de carbono de base biológica se deriva al asignar "100%" igual a 107.5 pMC y "0%" igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC dará un contenido de carbono de base biológica equivalente de 93%. Este valor se refleja con respecto al resultado medio de carbono de base biológica y asume todos los componentes dentro del material analizado originado ya sea de material biológico del dia actual o material a base de petróleo. Un bioproducto que comprende uno o más derivados de ácidos grasos como se describe en la presente puede tener un pMC de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100. En otros casos, un derivado de ácido graso descrito en la presente puede tener un pMC de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100; aproximadamente 60 y aproximadamente 100; de aproximadamente 70 y aproximadamente 100; de aproximadamente 80 y aproximadamente 100; aproximadamente de 85 y aproximadamente 100; de aproximadamente 87 y aproximadamente 98; o de aproximadamente 90 y aproximadamente 95. En aún otros casos, un derivado de ácido graso descrito en la presente puede tener un pMC de aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, o 94.2.

Examen de composiciones de alcoholes grasos producidas por célula hospedadora recombinante Para determinar si son suficientes las condiciones para permitir la expresión, se cultiva una célula hospedadora recombinante que comprende un gen heterólogo o gen nativo modificado, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36, o 48 horas. Durante y/o después del cultivo, se pueden obtener y analizar muestras para determinar si el nivel de producción de alcoholes grasos (titulo, rendimiento o productividad) es diferente de aquel de la correspondiente célula parenteral tipo silvestre, que no se ha modificado. Por ejemplo, el medio en el cual se cultivaron las células hospedadoras se puede probar para la presencia de un producto deseado. Cuando se prueba para la presencia de un producto, se pueden usar ensayos, tal como, pero no limitado a, TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS. Se pueden cultivar cepas de células hospedadoras recombinantes en pequeños volúmenes (0.001 L a 1 L) de medios en placas o matraces agitados a fin de examinar el nivel alterado de producción de alcoholes grasos o especies grasas. Una vez que se identifican las cepas candidatas o "aciertos" a una pequeña escala, estas cepas se cultivan en volúmenes más grandes (1 L a 1000 L) de medio en biorreactores, tanques y plantas piloto para determinar el nivel preciso de producción de alcoholes grasos o especies grasas. Estas condiciones de cultivo a gran volumen se usan por aquellos expertos en la téenica para optimizar las condiciones de cultivo para obtener la producción deseada de alcoholes grasos o especies grasas. Utilidad de composiciones de aldehidos grasos y alcoholes grasos Se usan aldehidos para producir muchos productos químicos de especialidad. Por ejemplo, se usan aldehidos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, Baquelita), tintes, saborizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos, algunos de los cuales se pueden usar como solventes, conservadores o desinfectantes. Además, ciertos compuestos naturales y sintéticos, tal como vitaminas y hormonas, son aldehidos, y muchos azúcares contienen grupos de aldehido. Los aldehidos grasos se pueden convertir a alcoholes grasos por reducción química o enzimática. Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Las ventas anuales a nivel mundial de los alcoholes grasos y sus derivados exceden el $1 billón de dólares americanos. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimenticia como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfifílica, los alcoholes grasos se comportan como agentes tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos caseros y de cuidado personal, tal como por ejemplo, detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, bálsamos y lociones farmacéuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes de terminado y anti-estáticos textiles, plastificantes, cosméticos, solvente industriales, y solventes para grasas. La descripción también proporciona una composición de agente tensioactivo o una composición detergente que comprende un alcohol graso producido por cualquiera de los métodos descritos en la presente. Un experto en la téenica apreciará que, dependiendo del propósito propuesto de la composición de agente tensioactivo o detergente, se pueden producir y usar diferentes alcoholes grasos. Por ejemplo, cuando los alcoholes grasos descritos en la presente se usan como una materia prima para la producción de agentes tensioactivos o detergentes, un experto en la técnica apreciará que las características de la materia prima de alcoholes grasos afectarán las características de la composición producida de agentes tensioactivo o detergente. Por lo tanto, las características de la composición de agente tensioactivo o detergente se pueden seleccionar producir alcoholes grasos particulares para el uso como una materia prima. Una composición detergente y/o de agente tensioactivo a base de alcohol graso, descrito en la presente, se puede mezclar con otros agentes tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, o un intervalo unido por cualquiera de dos de los valores anteriores, en peso del alcohol graso. En otros ejemplos, una composición de agente tensioactivo o detergente se puede producir la cual incluye al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o un intervalo unido por cualquiera de dos de los valores anteriores, en peso de un alcohol graso que incluye una cadena de carbonos que es de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 carbonos de longitud. Estas composiciones de agentes tensioactivos o detergentes también pueden incluir al menos un aditivo, tal como una microemulsión o un agente tensioactivo detergente de fuentes no microbianas tal como aceites vegetales o petróleo, que pueden estar presentes en la cantidad de al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o un intervalo unido por cualquiera de dos de los valores anteriores, en peso del alcohol graso. La descripción se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos. Se proporcionan los ejemplos solo para propósitos ilustrativos. No se van a considerar como limitantes del alcance o de contenido de la descripción de ninguna manera.

Ejemplos Ejemplos 1 Modificaciones de Hospedador de Producción.- Atenuación de acil-CoA-deshidrogenasa Este ejemplo describe la construcción de una célula hospedadora genéticamente manejada en donde se atenúa la expresión de una enzima de degradación de ácido graso. El gen fadE de Escherechia coli MG1655 (cepa K de E. coli ) se suprimió usando el sistema Lambda Red (también conocido como la Integración Activada Roja) descrita por Datsenko et al., Proc, Nati, Acad, Sci, EUA 97: 6640.-6645 (2000), con las siguientes modificaciones: Se usaron los siguientes dos cebadores para crear la supresión de fadE: Del-fadE- F5'AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGG GATCCGTCGACC (SEQ ID NO:9); y Del-fadE- R5'AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTG GAGCTGCTTC (SEQ ID NO:10) Se usaron los cebadores Del-fadE-D y DelfadE-R para amplificar el casete de resistencia a kanamicina (KmR) del plásmido pKD13 (descrito por Datsenko et al., supra) por PCR. El producto de PR entonces se usó para transformar células MG1655 de E. coli electrocompetentes que contienen pKD46 (descrito en Datsenko et al., supra) que se ha inducido previamente con arabinosa durante 3-4 horas. Después de una excrecencia de tres horas en un caldo superóptimo con medio de represión de catabolitos (SOC) a 37°C, las células se colocaron en placas de agar Luria que contiene 50 mg/ml de kanamicina. Se identificaron colonias resistentes y se aislaron después de una incubación durante la noche a 37°C. La ruptura del gen fadE se confirmó por amplificación de PCR usando los cebadores fadE-L2 y fadE-Rl, que se diseñan para flanquear el gen fadE de E. coli.

Los cebadores de confirmación de supresión de fadE fueron: fadE-L2 5'-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC (SEQ ID NO: 11); y fadE-Rl 5'-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG (SEQ ID NO: 12) Después de que se confirmó la supresión de fadE, se usó una colonia individual para remover el marcador KmR usando el plásmido pCP20 como se describe por Datsenlco et al., supra. La cepa MG1655 de E. coli resultante con el gen fadE suprimido y el marcador KmR removido se nombró E. coli MG1655 AfadE, o E. coli MG 1655D1. La producción de derivados de ácidos grasos (especies grasas totales) por la cepa MG1655 de E. coli con el gen fadE suprimido se comparó a la producción de derivados de ácidos grasos por E. coli MG1655. Las células se transformaron con el plásmido de producción pDGl09 (pCL1920_PTRC_carBopt_12H08_alrAadpl_fabB [A329G]_fadR) y se fermentaron en medio mínimo de glucosa. Los datos presentados en la Figura 5 muestran que la supresión del gen fadE no afecta la producción de derivados de ácidos grasos .

Ejemplo 2 Flujo incrementado a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos.- mediada por acetil-CoA-carboxilasa Los precursores principales para la biosíntesis de ácidos grasos son malonil-CoA y acetil-CoA (Figura 1). Se ha sugerido que estos precursores limitan la velocidad de la biosíntesis de ácidos grasos (Figura 2) en E. coli . En este ejemplo, se sobreexpresaron los operones sintéticos acc [ Corynebacterium glutamicum accABCD (ibirA)] y las modificaciones genéticas condujeron a la producción incrementada de acetil-CoA y malonil-CoA en E. coli . En un planteamiento, a fin de incrementar los niveles de malonil-CoA, en E. coli, se sobreexpresó el complejo de enzima acetil-CoA-carboxilasa de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) . La acetil-CoA-carboxilasa (ACC) consiste de cuatro subunidades discretas, accA, accB, accC y accD (Figura 3). La ventaja de C. glutamicum acc es que se expresan dos subunidades como proteínas de fusión, accCB y accDA, respectivamente, lo que facilita su expresión equilibrada. Adicionalmente, C. glutamicum birA, que biotinila la subunidad accB (Figura 3) se sobreexpresó. El ejemplo 3 describe la co expresión de los genes acc junto con los operones fab completos .

Ejemplo 3 Flujo incrementado a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos- iFAB: Las estrategias para incrementar el flujo a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos en células hospedadoras recombinantes incluyen tanto la sobreexpresión de genes de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli como la expresión de genes de exógenos de biosíntesis de ácidos grasos de diferentes organismos en E. coli . En este estudio, se combinaron genes de biosíntesis de ácidos grasos de diferente organismos en el genoma de E . coli DV2. Se evaluaron dieciséis cepas que contienen iFABs 130 - 145. La estructura detallada de iFABs 130 - 145 se presenta en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1; Componentes encontrados en iFABs 130-145 Cada "iFAB" incluyó varios genes fab en el siguiente orden: 1) una enoil-ACP reductasa (BS_fabI, BS_FabL, Vc_FabV, o Ec_FabI); 2) una b-cetoacil-ACP sintetasa III (St_fabH); 3) una malonil-CoA-ACP transacilasa (St_fabD); 4) una b-cetoacil-ACP reductasa (St_fabG); 5) una 3-hidroxi-acil-ACP deshidratasa (St_fabA o St_fabZ); 6) una b-cetoacil-ACP sintetasa II (Cac_fabF). Se señala que St_fabA también tiene actividad de trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa y que Cae fabF tiene actividades de b-cetoacil-ACP sintetasa II y b-cetoacil-ACP sintetasa I (Zhu et al, BMC Microbiology 9:119 (2009)). Ver Tabla 2, posterior para la composición especifica de iFABs 130-145. Ver Figuras 7A y 7B que proporcionan representación esquemática del locus ÍFAB138, incluyendo un diagrama del promotor cat-loxP-T5 integrado en frente de FAB138 (7A); y un diagrama de iT5_138 (7B).

Tabla 2.- Composición de iFABs 130-145 I ' : ' El plásmido pCL_Ptrc_tesA se transformó en cada una de las cepas y se corrió una fermentación en el medio FA2 con 20 horas desde la inducción a la recolección tanto a 32°C y 37°C. Los datos para la producción de Especies Grasas Totales de exámenes en placas duplicadas se muestran en las Figuras 6A y 6B. De este examen de biblioteca, se determinó la mejor construcción como que es DV2 con ÍFAB138. La construcción de iFAB138 se transfirió a la cepa D178 para producir la cepa EG149. Esta cepa se usó para manejo adicional. La secuencia de ÍFAB138 en el genoma de EG149 se presenta como SEC ID NO: 13. La tabla 3 presenta la caracterización genética de varias cepas de E. coli en las cuales se introdujo como se describe más adelante plásmidos que contienen las construcciones de expresión descritas en la presente. Estas cepas y plásmidos se usaron para demostrar las células hospedadoras recombinantes, cultivos y métodos de ciertas modalidades de la presente descripción. Las designaciones genéticas en la tabla 3 son designaciones normales conocidas por aquellos expertos en la téenica.

Tabla 3: Caracterización genética de cepas de E. coli Plásmidos: pDG109, pLC56 y pV171.1 son el operón pCL_Ptrc_carB_tesA_alrA_fabB_fadR con expresión variable de carB y tesA. ÍFAB138 es SEQ ID NO: 13.

Ejemplo 4 Incremento de la cantidad de producto de ácidos libres (FFA) al reparar las mutaciones rph e ilvG Las mutaciones ilvG y rph se corrigieron en esta cepa dando por resultado mayor producción de FFA. Las cepas D178, EG149 y V668 (tabla 3) se transformaron con pCL_Ptrc_tesA. La fermentación se corrió a 32°C en medio FA2 durante 40 horas para comparar la producción de FFA de las cepas D178, EG149 y V668 con pCL_Ptrc_tesA. La corrección de la mutaciones lph e ilvG dio por resultado un incremento de 116% en la producción de FFA de la cepa base con pCL_Ptrc_tesA. Como se ve en la Figura 8, V668/pCL_Ptrc_tesA produce FFA más que D178/pCL_Ptrc_tesA, o el control EG149/ pCL_Ptrc_tesA. Puesto que el FFA es un precursor a los productos LS9, una mayor producción de FFA es un buen indicador que la nueva cepa puede producir mayores niveles de productos LS9. Se corrió la fermentación y extracción de acuerdo al protocolo de fermentación normal FALC explicado en lo siguiente.

Un frasco de banco celular congelado de la cepa de E. coli seleccionada se usó para inocular 20 mL de caldo LB en un matraz agitado con deflectores de 125 mL que contiene el antibiótico espectinomicina a una concentración de 115 ^g/mL. Este matraz agitado se incubó en un agitador orbital a 32°C durante aproximadamente seis horas, luego se transfirieron 1.25 mL del caldo en 125 mL de medio de siembra FAP2 bajo P (2 g/L de NH4C1, 0.5 g/L de NaCl, 3 g/L de KH2P04 0.25 g/L de MgSO4-7H20, 0.015 de g/L mMCaC12-2H20, g/L de glucosa, 1 mL/L de una solución de minerales traza (2 g/L de ZnCl2·4H20, 2 g/L de CaC12*6H20, 2 g/L de Na2Mo04·2H20, 1.9 g/L de CuS04«5H20, 0.5 g/L de H3B03 y 10 mL/L de HCl concentrado), 10 mg/L de citrato de férrico, lOOmM de amortiguador Bis-Tris (pH7.0), y 115 mg/mL de espectinomicina), en un matraz agitado Erlenmcyer con deflectores de 500 mL, y se incubó en un agitador durante la noche a 32°C. Se usaron 100 mL de este cultivo de siembra FA2 de bajo P para inocular un biorreactor Biostat Aplus 5L (Sartorius BBI), que contiene inicialmente 1.9 L de medio de fermentación de biorreactor F1 esterilizado. Este medio está compuesto inicialmente de 3.5 g/L de KHP04, 0.5 g/L de (NH4)2S04, 0.5 g/L de MgS04 heptahidratado, 10 g/L de glucosa filtrada estéril, 80 mg/L de citrato férrico, 5 g/L de Casaminoácidos, 10 mL/L de la solución estéril filtrada de minerales traza, 1.25 mL/L de una solución estéril filtrada de vitaminas (0.42 g/L de riboflavina, 5.4 g/L de ácido pantoténico, 6 g/L de niacina, 1.4 g/L de piridoxina, 0.06 g/L de biotina, y 0.04 g/L de ácido fólico), y la espectinomicina a la misma concentración como se utilizó en el medio de siembra. El pH del cultivo se mantuvo a 6.9 usando agua con amoniaco al 28% p/v, la temperatura a 33°C, la velocidad de aireación a 1 lpm (0.5 v/v/m) , la tensión de oxigeno disuelto a 30% de saturación, utilizando el circuito de agitación en cascada al controlador DO y complementación de oxigeno . Se controló la espumación por la adición automatizada de un antiespuma a base de emulsión de Silicon (Dow Corning 1410).

Una alimentación nutriente compuesta de 3.9 g/L de heptahidrato de MgSO4 y 600 g/L de glucosa se inició cuando casi se agotó la glucosa en el medio inicial (aproximadamente 4 - 6 horas después de la inoculación) bajo una velocidad de exponencial de alimentación de 0.3 hrl a una velocidad constante de máxima de alimentación de glucosa de 10-12 g/L/hr, con base al volumen nominal de fermentación de 2L. La producción de alcohol graso en el biorreactor se indujo cuando el cultivo logró un DO de 5 AU (aproximadamente 3-4 horas después de la inoculación) por medio de la adición de una solución concentrada de IPTG 1M a una concentración final de 1 mM. El biorreactor se muestreó dos veces por dia después de esto, y se recolectó aproximadamente 72 horas después de la inoculación. Una muestra de 0.5 mL del caldo de fermentación bien mezclado se transfirió a un tubo cónico de 15 mL (VWR) y se mezcló completamente con 5 mL de acetato de butilo. El tubo se invirtió varias veces para mezclar, luego se sometió a vórtice vigorosamente durante aproximadamente dos minutos. El tubo entonces se centrifugó durante cinco minutos para separar las capas orgánica y acuosa, y una porción de la capa orgánica se transfirió a un frasco de vidrio para análisis cro atográfico de gases.

Ejemplo 5: Producción Incrementada de Alcoholes Grasos por Mutagénesis de transposón.- yijP Para mejorar el título, rendimientos, productividad de alcoholes grasos por E. coJi , se llevó a cabo mutagénesis de transposón y examen de alto rendimiento y se secuenciaron las mutaciones benéficas. Se muestra que la inserción de transposón en la cepa yijP mejora el rendimiento de alcoholes grasos de la cepa tanto en fermentaciones en matraz agitado como en fermentaciones de lote alimentado. La cepa SL313 produce alcoholes grasos. En la Tabla 3 se proporciona el genotipo de esta cepa. Entonces los clones de transposón se sometieron a examen de alto rendimiento para medir la producción de alcoholes grasos. De forma breve, se recolectaron colonias en placas de concavidad profunda que contienen LB, se cultivaron durante la noche, se inocularon en LB fresco y se cultivaron durante 3 horas, se inocularon en medio FA2.1 fresco, se cultivaron durante 16 horas, luego se excretaron usando acetato de butilo. El extracto crudo se derivó con BSTFA (N,O-bis[Trimetilsilil]trifluoroacetamida) y se analizó usando GC/FID. Se incluyó espectinomicina (100mg/L) en todos los medios para mantener la selección del plásmido pDG109. Se seleccionaron los aciertos al elegir clones que produjeron una especie grasa total similar como la cepa de control SL313, pero que tienen un mayor por ciento de especies de alcoholes grasos y un menor por ciento de ácidos grasos libres que el control. Se identificó la cepa 68F11 como un acierto y se validó en una fermentación de matraz agitado que usa medio FA2.1. Una comparación del acierto de transposón 68F11 a la cepa de controlo SL313 indicó que 68F11 produce un mayor porcentaje de especies de alcoholes grasos que el control, en tanto que ambas cepas producen títulos similares de especies grasas totales. Una colonia individual del acierto 68F11, nombrada LC535, se secuenció para identificar la ubicación de la inserción del transposón. De forma breve, se purificó ADN genómico de un cultivo LB durante la noche de 10 mL usando el equipo de ADN fúngico/bacteriano ZR MiniPrepMR (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN genómico purificado se secuenció hacia afuera del transposón usando cebadores internos al transposón: DG150 5 '-GCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTTGCTACGCCTG-3'(SEQ ID NO: 14) DG131 5'- GAGCCAATATGCGAGAACACCCGAGAA-3'(SEQ ID NO: 15) Se determinó que la cepa LC535 tiene una inserción de transposón en el gen yijP (Figura 9). yijP codifica para una proteina conservada de membrana interior cuya función no es clara. El gen yijP está en un operón y se co-transcribe en el gen ppc, que codifica para fosfoenolpiruvato-carboxilasa, y el gen yijO, que codifica para un regulador transcripcional previsto que se une a ADN de función desconocida. Los promotores internos al transposón tienen probablemente efectos en el nivel y en la sincronización de transcripción de yijP, ppc y yijO, y también pueden tener efectos en los genes adyacentes frwD, pflC, pfld, y argE. Los promotores internos al casete de transposón se muestran en la Figura 9, y pueden tener efectos en la expresión de genes adyacentes. Se evaluó la cepa LC535 en una fermentación de lote alimentado en dos diferentes fechas. Ambas fermentaciones demostraron que LC535 produjo alcoholes grasos con un mayor rendimiento que el control SL313, y la mejora fue de 1.3-1.9% de rendimiento absoluto con base a la entrada de carbono. El casete de transposón yijP se evaluó adicionalmente en una diferente cepa V940, que produce alcohol graso a un mayor rendimiento que la cepa SL313. El casete yijP::Tn5-cat se amplificó de la cepa LC535 usando los cebadores: LC277 5'- CGCTGAACGTATTGCAGGCCGAGTTGCTGCACCGCTCCCGCCAGGCAG-3' (SEQ ID NO: 16) LC278 5'- GGAATTGCCACGGTGCGGCAGGCTCCATACGCGAGGCCAGGTTATCCAACG- 3' (SEQ ID NO: 17) Este ADN lineal se sometió a electroforesis en la capa SL571 y se integró en el cromosoma usando el sistema de recombinación rojo lambda. Las colonias se examinan usando cebadores fuera de la región de transposón: DG407 5 '-AATCACCAGCACTAAAGTGCGCGGTTCGTTACCCG-3'(SEQ ID NO: 18) DG408 5'-ATCTGCCGTGGATTGCAGAGTCTATTCAGCTACG-3'(SEQ ID NO: 19) Una colonia con el casete de transposón yijP correcto (Fig. 9) se transformó con el plásmido de producción pV171.1 para producir la cepa D851. Se probó D851 (V940 yijP::Tn5-cat) en una fermentación de matraz agitado contra la cepa V940 que no contiene el casete de transposón yijP. El resultado de esta fermentación mostró que el casete de transposón yijP confiere producción de un mayor por ciento de alcohol graso por la cepa D851 con relación a la cepa V940 y produce títulos similares de especies grasas totales como la cepa de control V940 es evaluó la cepa de D851 en una fermentación de lote alimentado en dos diferentes fechas. Los datos de estas fermentaciones se muestran en la Tabla 4 que ilustra que en fermentaciones de lote alimentado de 5 litros, las cepas con la inserción de transposón yijP::Tn5-cat tienen un rendimiento incrementado de especies grasas totales ("FAS") y un incremento en el por ciento de alcohol graso ("FALC""). "Especies grasas" incluye FALC y FFA.

Tabla 4; Efecto de inserción de transposón yijP en título y rendimiento de FAS y FALC Metodo de Fermentación en Tanque; Para la valoración de la producción de ásteres de ácidos grasos en tanque, se usó un frasco de glicerol de la cepa deseada para inocular 20mL de LB + espectinomicina en matraz agitado y se incubó a 32°C durante aproximadamente seis horas. Se usaron 4 mL de cultivo LB para inocular 125mL de medio de Siembra bajo PFA (posterior), que entonces se incubó a 32°C en agitador durante la noche. Se usaron 50 mL del cultivo durante la noche para inocular 1 L del medio del tanque. Los tanques se corrieron a pH 7.2 y 30.5°C bajo condiciones señaladas de pH con una velocidad máxima de alimentación de 16 g/L/hr (de glucosa o metanol).

Tabla 5: Medio de Siembra FA Bajo en P; Tabla 6: Medio de Tanque Ejemplo 6 Adición de una Marca de Fusión de 60pb N-terminal a CarB (CarB60) Hay muchas maneras para incrementar la solubilidad, estabilidad, expresión o funcionalidad de una proteina. En un planteamiento para incrementar la solubilidad de CarB, se puede clonar una marca de fusión antes del gen. En otro planteamiento para incrementar la expresión de CarB, el promotor o sitio de unión a ribosoma (RBS) del gen se puede alterar. En este estudio, se modificó carB (SEQ ID NO: 7) por la adición de una marca de fusión de 60pb N-terminal. Para generar la proteina modificada (referida en la presente como "CarB60"), se clonó primero carB *en el vector pETl5b usando los cebadores: 5'- GCAATTCCATATGACGAGCGATGTTCACGA-3' (SEQ ID N0:20); y 5'- CCGCTCGAGTAAATCAGACCGAACTCGCG (SEQ ID NO:21).

La construcción pETl5b - carB contuvo 60 nucleótidos directamente en la direcciónO 5' del gen carB: 5'- ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT (SEQ ID NO:22) La versión de la marca de fusión de carB se renombró carB60. Entonces se digirió el pETl 5b_carB60 usando las enzimas de restricción Ncol y HindIII y se subclonó en el vector Op80 derivado de pCL1920 que se cortó con las mismas enzimas. Este plásmido se transformó en la cepa V324 (MG1655 AfadE::FRT AfhuA::FRT fabB::A329V entD::T5-entD lacIZ::PTRC-'TesA) para evaluar la producción de FALO. Las cepas se fermentaron de acuerdo a un procedimiento normal (resumido más adelante) y se cuantificaron el titulo total de especies grasas y el titulo total de alcoholes grasos. La Figura 10 muestra que CarB60 incrementa los títulos de alcoholes grasos y por lo tanto la enzima CarB60 tiene mayor actividad celular total que CarB cuando se expresa de un plásmido multicopia.

Para valorar la producción de alcoholes grasos en cepas de producción, se cultivaron transformantes en 2 mi de caldo LB complementado con antibióticos (100 mg/L) a 37°C. Después del crecimiento durante la noche, se transfirieron 40 ul de cultivo a 2 mi de LB fresco complementado con antibióticos. Después de 3 horas de crecimiento, se transfirieron 2 mi de cultivo en un matraz de 125 mL que contiene 20 mi del medio M9 con 3% de glucosa complementada con 20 ml de solución de minerales traza, 10 mg/L de citrato de hierro, 1 mq/L de tiamina, y antibióticos (medio FA2). Cuando la OD6oo del cultivo alcanzó 1.0, a cada matraz se adicionó 1 mM de IPTG. Después de 20 horas de crecimiento a 37°C, se removieron muestras de 400 mB de cada matraz y los alcoholes grasos se extrajeron con 400 ml de acetato de butilo. Para entender adicionalmente el mecanismo de la actividad mejorada de CarB, se purificó CarB60 a partir de la cepa D178 que no contiene 'TesA (MG1655 AfadE::FRT AfhuA::FRT fabB::A329V entD::Px5-entD).de forma breve, se transformó pCL1920_carB60 en la cepa D178, que se ha manejado para la producción de alcoholes grasos, y se llevó a cabo la fermentación a 37°C en el medio FA-2 complementado con espectinomicina (100 mr/ih?). Cuando la O?boo del cultivo alcanzó 1.6, las células se indujeron con isopropil-b-O-tiogalactopiranosido 1 mM (IPTG) y se incubó durante 23 horas adicionales a 37°C. Para la purificación de CarB60, las células se recolectaron por centrifugación durante 20 minutos a 4°C a 4,500 rpm. La pasta celular (10 g) se suspendió en 12 mi de BugBuster MasterMix (Novagen) y solución de cóctel de inhibidor de proteasa. Las células se rompieron por prensa francesa y el homogenador resultante se centrifugó a 10,000 rpm para remover los desechos celulares. Se adicionó Ni-NTA a la mezcla resultante y la suspensión se remolinó a 4°C a 100 rpm durante 1 hora en un agitador giratorio. La suspensión espesa se vertió en una columna, y se recolectó el flujo de paso. La resina Ni- NTA se lavó con imidazol 10 mM en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 8.0 que contiene NaCl 300 mM, y se lavó con imidazol 20 mM en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 8.0 que contiene NaCl 300 mM. La proteina CarB60 se eluyó con imidazol 250 mM en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 8.0 que contiene NaCl 300 mM, y se analizó por SDS-PAGE. La proteina se dializó contra glicerol al 20% (v/v) en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 7.5 produciendo aproximadamente 10 mg de CarB60 por litro de cultivo. La proteina se congeló instantáneamente y se almacenó a -80°C hasta que se necesite.

La proteina CarB60 se expresó abundantemente de un plásmido multicopia. El análisis SDS-PAGE adicional mostró que la expresión de CarB60 fue mayor que CarB. El mayor nivel de expresión de CarB60 sugirió que el gen sea carB60 integrado en el cromosoma de E. coli producirá más proteina que el gen carB en la misma ubicación. Para probar esta hipótesis, el gen carB60 se integró en el cromosoma de E. coli . De forma breve, el gen carB60 se amplificó primero de pCL_carB60 usando el cebador directo: 5'-ACGGATCCCCGGAATGCGCAACGCAATTAATGTaAGTTAGCGC-3' (SEQ ID NO:23); y el cebador inverso: 5 ' -TGCGTCATCGCCATTGAATTCCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGG-3 ' (SEQ ID NO:24).

Un segundo producto de PCR se amplificó del vector pAH56 usando el cebador directo: 5'-ATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' (SEQ ID NO:25); y el cebador inverso: 5'-AATGGCGATGACGCATCCTCACG-3' (SEO ID NO:26) Este fragmento contiene un casete de resistencia a canamicina, un sitio lb^ R y un origen de replicación yR6k. Los dos productos de PCR se unieron usando el equipo InFusion (Clontech) para crear el plásmido pSL116-126. Una cepa de producción de alcoholes grasos que contiene una forma integrada de 'TesA12H08 y un plásmido auxiliar pINT se transformó con ya sea pSL116-126 que contiene el gen carB60 o plásmido F27 que contiene el gen carB. Estas cepas se fermentaron en el medio FA2 de acuerdo a los procedimientos normales para fermentaciones en matraz agitado, como se escribe anteriormente. Para caracterizar y cuantificar los alcoholes grasos y ásteres de ácidos grasos, se usó detección por cromatografía de gases ("GC") acoplada con ionización a flama ("FID"). El extracto crudo se derivatizó con BSTFA (N,O-bis[Trimetilsilil]trifluoroacetamida) y se analizó usando una GC/FID. Se llevó a cabo la cuantificación al inyectar varias concentraciones de las referencias auténticas apropiadas usando el método de GC descrito anteriormente así como se pueden usar ensayos que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de gases (GC), espectroscopia de masa (MS), cromatografía de capa delgada (TLC), cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), cromatografía líquida (LC), GC acoplada con un detector de ionización a la flama (GC-FID), GC-MS, y LC-MS. Cuando se prueba para la expresión de un polipéptido, se pueden usar téenicas tal como transferencia Western y transferencia de punto.

Los resultados de la fermentación después de 20 horas se muestran en la Figura 11. Los títulos totales de productos grasos de las dos cepas son similares (2.4 g/L de especies grasas totales), sin embargo CarB60 integrado convierte una mayor fracción de ácidos grasos libres de longitud de cadena de C12 y C14 en alcoholes grasos, en comparación a CarB sin la marca N-terminal. Estos datos sugieren que las células que expresan CarB60 tienen una mayor actividad celular total de ácido carboxilico-reductasa, y pueden convertir más FFA en alcoholes grasos. De esta manera, carB60 cuando se integra en el cromosoma es una plantilla mejorada de carB que proporciona actividad deseada para hacer evolucionar el gen carB para identificar variantes mejoradas de carB.

Ejemplo 7 Generación de Mutantes de CarB La enzima CarB es un paso limitante de velocidad en la producción de alcoholes grasos bajo ciertas condiciones de proceso. Para producir económicamente alcoholes grasos, se hicieron esfuerzos para incrementar la actividad de la enzima CarB.

Examen de bibliotecas por PCR propensa a error: Se realizó la mutagénesis aleatoria usando PCR propensa a error bajo condiciones donde es baja la fidelidad de copia de la ADN polimerasa. Los ácidos nucleicos mutageneizados se clonaron en un vector, y se realizó la PCR propensa a error seguida por examen de alto rendimiento para encontrar mutaciones benéficas que incrementan la conversión de ácidos grasos libres a alcoholes grasos (como se detalla más adelante). Adicionalmente se mutaron residuos importantes a otros aminoácidos. Varias mutaciones individuales de aminoácido y combinaciones de mutaciones incrementaron la fracción de especies grasas que se convierten a alcoholes grasos. De forma breve, se generaron mutaciones aleatorias en el gen carB60opt por la PCR propensa a error usando el equipo Genemorph II (Stratagene) . Se generaron mutaciones en solo uno de los dos dominios de carB60opt de forma separada para facilitar la clonación. La biblioteca 1 contuvo los primeros 759 residuos de carB60opt y se generó por PCR propensa a error usando los cebadores: HZ117 5'- ACGGAAAGGAGCTAGCACATGGGCAGCAGCCATCATCAT-3 ' (SEQ ID NO:27); y DG264 5'- GTAAAGGATGGACGGCGGTCACCCGCC- 3 ' (SEQ ID NO :28).

El vector para la biblioteca 1 fue el plásmido pDGl 15 digerido con las enzimas Nhel y PshAI. La biblioteca 2 contuvo los últimos 435 residuos de carB60opt y se generó por PCR propensa a error usando los cebadores: DG263 5 '- CACGGCGGGTGACCGCCGTCCATCC-3' (SEQ ID NO:29); Y HZ118 5'- TTAATTCCGGGGATCCCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGGTC- 3' (SEQ ID NO:30).

El vector para la biblioteca 2 fue el plásmido pDG115 digerido con las enzimas PshAI y BamHI. Las instrucciones propensas a error se clonaron en los vectores usando InFusion Advantage (Clontech) y se hicieron pasar a través de la cepa de clonación NEB Turbo (New England Biolabs). Las bibliotecas entonces se transformaron en la cepa EG442 (EG149 Tn7::PTRC_ABR lacIZ: :Px50-ABR). Los clones de carB60opt propensos a error entonces se sometieron a examen de alto rendimiento para medir la producción de alcoholes grasos. De forma breve, se recolectaron colonias en placas de concavidades profundas que contienen LB, se cultivaron durante la noche, se inocularon en LB fresco y se cultivaron durante 3 horas, se inocularon en medio FA-2.1 fresco, se cultivaron durante 16 horas y luego se extrajeron usando acetato de butilo. El extracto crudo se derivatizó con BSTFA (N,0-bis [Trimetilsilil ]trif luoroacetamida ) y se analizó usando un método GC/FID normal. Se incluyó espect imicina (100 mg/L) en todos los medios para mantener la selección del plásmido pDG115. Se seleccionaron los aciertos al elegir clones que produjeron un menor titulo total de ácidos grasos libres y un mayor titulo total de alcoholes grasos en comparación a la cepa de control. Para comparar los aciertos de diferentes exámenes de fermentación, la conversión de ácidos grasos libres a alcoholes grasos se normalizó al calcular un porcentaje normalizado de ácidos grasos libres NORM FFA = Por ciento Mutante FFA / Por ciento de Control FFA donde ''Porciento de FFA" es el titulo total de especies de ácidos grasos libres dividido por el titulo total de especies grasas. Los aciertos se sometieron a verificación adicional usando fermentaciones de matraz agitado, como se describe más adelante .

Los aciertos se secuenciaron para identificar las mutaciones benéficas. La secuenciación se realizó por PCR de colonia del gen carB60opt completo usando los cebadores SL5 9 5'- CAGCCGTTTATTGCCGACTGGATG- 3' (SEQ ID NO:31); y EG479 5'- CTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTC- 3 ' (SEQ ID NO:32), y se secuenció usando los cebadores internos a la enzima carB60op. Las mutaciones benéficas que mejoraron la enzima CarB60opt se muestran en la Tabla 7. La columna de ácido graso libre normalizado (NORM FFA) indica la mejora en la enzima, con los valores más bajos que indican la mejor mejora. "Concavidad #" indica la concavidad de secuenciación primaria que esta mutación se encontró. Todos los números de residuos se refieren a la secuencia de proteina CarB, que no incluye la marca de 60 pb. Las mutaciones indicadas con el prefijo "Marca:" indican mutaciones en la marca N-terminal de 60 pb/20 resido.

Tabla 7: Mutaciones Benéficas en la enzima CarB Identificadas Durante Examen Propenso a Error (Mutaciones de TAG Removidas) Mutaqénes i s de Saturación ( Librería Combo 1 y 2 Generadas ): Las posiciones de aminoácido juzgadas benéficas para la producción de alcoholes grasos después de la PCR propensa a error se somel:ieron a mutagénesis adicional. Los cebadores que cont ienen los nucleótidos degenerados NNK o NNS se usaron para mutar estas posiciones a otros aminoácidos. Las "bibliotecas de mutagénesis de saturación" resultante se examinaron como se describe anteriormente para las bibliotecas propensas a error, y los aciertos se identificaron que mejoraron adicionalmente la conversión de alcoholes grasos (un titulo total menor de ácidos grasos y un mayor titulo total de alcoholes grasos en comparación a la cepa de origen de "control") . Los cambios individuales de aminoácido/codón en nueve diferentes posiciones que mejoraron la producción de alcoholes grasos se muestran en la Tabla 8. Los aciertos se sometieron a verificación adicional usando fermentaciones en matraz agitado, como se describe en la presente.

Tabla 8: Mutaciones Benéficas en la Enzima CarB Identificadas Durante la Mutagénesis de Saturación de Amino Ácidos Las sustituciones de aminoácido juzgadas benéficas a la producción de alcoholes grasos se combinaron entonces. Se usó PCR para amplificar las partes del gen carBopt que contiene varias mutaciones deseadas y las partes se unieron conjuntamente usando un método basado en PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. y Pease, L.R.1989). El gen carBopt se examinó sin la marca N-terminal de 60 pb. Las mutaciones combinadas en esta biblioteca de combinación se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Mutaciones CarB de la Primera Biblioteca de Combinación Para facilitar el examen, la biblioteca de combinación de CarB resultante entonces se integró en el cromosoma de la cepa V668 en el locus lacZ. La secuencia del gen carBopt en este locus se presenta como SEQ ID NO:7. El genotipo de la cepa Y668 es MG1655 (AfadE::FRT AfhuA::FRT AfabB::A329V AentD::T5-entD AinsH-ll:: Piaouvsfabl38 rph+ ilvG+) (como se muestra en Tabla 3 y Figura 16). Las cepas entonces se transformaron con el plásmido pVA3, que contiene TesA, una enzima CarB catalíticamente inactiva CarB[S693A] que destruye el sitio de unión de fosfopanteteí na, y otros genes que incrementan la producción de ácidos grasos libres. La biblioteca de combinación se examinó como se describe anteriormente para la biblioteca propensa a error. V668 con carBopt integrado (A535S) en la región lacZ y que contiene pVA3 se usó como el control. Se seleccionaron aciertos que incrementaron la producción de alcoholes grasos y se sometieron a verificación adicional usando fermentaciones de matraz agitado, como se describe en el Ejemplo 5. El porcentaje mejorado de producción de alcoholes grasos después de la fermentación en matraz agitado de células hospedadoras recombinantes que expresan los mutantes de combinación de CarB se muestran en la Figura 12.

Los mutantes de combinación de CarB integrados se amplificaron de los aciertos de carB integrados por PCR usando los cebadores: EG58 5'- GCACTCGACCGGAATTATCG (SEQ ID NO:33); y EG6265'- GCACTACGCGTACTGTGAGCCAGAG (SEQ ID NO:34).

Estas inserciones se re-amplificaron usando los cebadores : DG243 5'- GAGGAATAAACCATGACGAGCGATGTTCACGACGCGACCGACGGC (SEQ ID NO:35); y DG210 5'- CTAAATCAGACCGAACTCGCGCAGG (SEQ ID NO:36).

Usando la clonación InFusion, los mutantes de carB mezclados se clonaron en un plásmido producción, pV869, que se amplificó por PCR usando los cebadores: DG228 5 ' - CATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATAC (SEQ ID NO:37); y DG318 5'- TGACCTGCGCGAGTTCGGTCTGATTTAG (SEQ ID NO:38).

El mutante de carB que se desempeñó mejor en el examen de plásmidos por fermentación en matraz agitado (carB2; Tabla 11) se designó VA101 y la cepa de control que tiene carBopt [A535S] se designó VA82. Ver Figura 13.

Las sustituciones de aminoácido en el dominio de reducción de carB que se juzgaron benéficas a la producción de alcoholes grasos se combinaron con uno de los mejores aciertos de la biblioteca de combinación de carB-L, "carB3" (Tabla 11). Se usó PCR para amplificar las partes del gen carBopt que contiene varias mutaciones deseadas en el domino de reducción y las partes se unieron con untamente usando SOE PCR. Las mutaciones combinadas en esta biblioteca de combinación se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10: Mutaciones de CarB de la Segunda Biblioteca de combinación La biblioteca de combinación se examinó como se describe anteriormente para la biblioteca propensa a error. Como un control se usó V668 integrado con carB3 en la región lacZ que contiene pVA3. Se seleccionaron los aciertos que exhibieron producción incrementada de alcoholes grasos y se sometieron a verificación adicional usando fermentaciones de matraz agitado, como se describe anteriormente. Los resultados de una fermentación de matraz agitado que muestran un porcentaje mejorado de producción de alcoholes grasos usando una mutación de combinación adicional de CarB (carB4) se muestra en la Tabla 11. En la Figura 14 se presenta una representación gráfica de la eficiencia de conversión relativa de las variantes de CarB de copia baja. Los resultados reportados en la Tabla 11 son de corridas de bioreactor llevadas a cabo bajo condiciones idénticas.

Tabla 11: Variantes de CAR Las secuencias de ADN de CarA, FadD9, CarB, y CarB60 se presentan en la presente como SEQ ID NOs: 41, 42, 43 y 44, respectivamente.

Identificación de mutaciones adicionales beneficas en la enzima CarB por mutagénesis de saturación: Un sistema de examen de plásmido dual se desarrolló posteriormente y se validó para identificar variantes mejoradas de CarB con respecto a CarB4 para la producción de FALC. El sistema de plásmido dual cumplió con los siguientes criterios: 1) Clones mutantes producen alto titulo de FA para proporcionar flujo de ácidos grasos en exceso de la actividad de CarB. Esto se logra al transformar una cepa base (V668 con dos copias de TE cromosómicos) con un plásmido (pLYC4, pCLl920_PTRc_carDead_tesA_alrAadpl_fabB[A329G]_fadR) que tiene el operon FALC con una enzima de CarB catalíticamente inactiva CarB[S693A] para mejorar la producción de ácidos grasos libres; 2) El plásmido de examen con la plantilla mutante de carB, preferentemente más pequeño que 9-kb, es tratable a los procedimientos de mutagénesis de saturación y es compatible para la expresión con pLYC4; 3) El intervalo dinámico de la actividad de CarB es ajustable. Esto se logra al combinar un promotor más débil (PTRCI) Y codones de inicio alternativos (GTG o TTG) para ajustar los niveles de expresión de CarB4. Buena estabilidad de plásmido, un módulo de toxina/antitoxina (operon ccdBA) se introdujo para mantener la estabilidad del plásmido.

De forma breve, el plásmido de examen pBZl (pACYCDuet-l_ PTECI- carB4GTG_rrnBter_ccdAB) se construyó de cuatro partes usando el método de clonación In-Fusion HD (Clontech) al mezclar relaciones molares iguales de cuatro partes (PTRCI/ carB4 con los condones de inicio ATG/TTG/GTG, los terminadores rrnB T1T2 con ccdAB, y el vector y pACYCDuet-1). Las partes (1 a 4) se amplificaron por PCR por los siguientes pares de cebadores: (1) cebador directo PTRCIC - CGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAAATCCGGCTCGTA TAATGTGTG-3' (SEQ ID NO:45 ) y cebador inverso 5'-GGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATACAT-3' (SEQ ID NO:46) usando el plásmido pVA232 (pCL1920_PTRC_carB4_tesA_alrAadpl_fabB[A329G]_fadR). (1) carB4 con los codones de inicio ATG/TTG/GTG.- Cebador directo carB4 ATG 5 'ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCGAC -3' (SEQ ID NO:47); carB4 GTG 5'ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCGTGGGCACGAGCGATGTTCACGACG CGAC-3' (SEQ ID NO:48); y carB4 TTG 5'- ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCTTGGGCACGAGCGATGTTCACGACGC GAC-3' (SEQ ID NO:49); y el cebador inverso carB4 rev 5'-TTCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAG-31 (SEQ ID NO:50), usando el plásmido pYA232 como plantilla. (3) los terminadores rrnB T1T2 con ccdAB - cebador directo rrnB T1T2 ter 5'-CTGCGCGAGTTCGGTCTGATTTAGAATTCCTCGAGGATGGTAGTGTGG-3' (SEQ ID NO:51) y cebador inverso ccdAB rev 5'- CAGTCGACATACGAAACGGGAATGCGG-3' (SEQ ID NO:52), usando el plásmido pAH008 (pV171_ccdBA operon). (4) La estructura de vector pACYCDuet-1.- Cebador directo, vector pACYC para 5' CCGCATTCCCGTTTCGTATGTCGACTGAAACCTCAGGCATTGAGAAGCACACGGTC- 3 ' (SEQ ID NO:53) y cebador inverso vector pACYC rev 5'-CTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTAATTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAG-3' (SEQ ID NO:54).

El plásmido pBZl se co-expresó con pLYC4 en la cepa descrita anteriormente y se validó por fermentación de matraz agitado y en placa de concavidades profundas. Las condiciones de fermentación se optimizaron tal que la plantilla de CarB4_GTG tienen de manera reproducible una conversión de -65% de FALO en ambas plataformas de fermentación como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados para la fermentación de matraz agitado se muestran en la Figura 15.

Los sitios adicionales (18, 19, 22, 28, 80, 87, 90, 143, 212, 231, 259, 292, 396, 416, 418, 530, 541, 574, 612, 636, 677, 712, 750, 799, 809, 810, 870, 936, 985, 986, 1026, 1062, 1080, 1134, 1149, 1158, 1161, 1170) que contienen mutaciones en las variantes de CarB mejoradas (Tabla 7) se sometieron a mutagénesis de saturación completa. Se usaron cebadores que contienen los nucleótidos degenerados NNK o NNS para mutar estas posiciones a otros aminoácidos por un método basado en PCR (Sawano y Miyawaki 2000, Nucí. Acids Res. 28: e78). Se construyó la biblioteca de saturación usando la plantilla de plásmido pBZl (pACYCDuet-l_ PTRCi-carB4GTG_rrnBter_ccdAB) . Los clones mutantes se transformaron en las cepas de clonación NEB Turbo (New England Biolab) y los plásmidos se aislaron y mezclaron. Los plásmidos mezclados entonces se transformaron en una cepa basada en V668 que tiene el plásmido pLYC4 y los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB complementadas con antibióticos (100 mg/L de espectinomicina y 34 mg/L de cloranfenicol).

Las variantes de CarB de la biblioteca de saturación entonces se examinaron para la producción de alcoholes grasos. Se recolectaron colonas individuales directamente en placas de 96 concavidades de acuerdo a un protocolo modificado de fermentación en placas de concavidades profundas como se describe en el Ejemplo 5. Se seleccionaron los aciertos al dirigir clones que produjeron un titulo total más pequeño de ácidos grasos libres y un titulo total mayor de alcoholes grasos en comparación a la cepa de control. Para comparar los aciertos de diferentes lotes de fermentación, la conversión de ácidos grasos libres a alcoholes grasos se normalizó al calcular un porcentaje normalizado de ácidos grasos libres. También se usó NORM FFA (%) en la validación de los aciertos como se describe en el Ejemplo 5. NORM FFA (%) = Por ciento Mutante-FFA / Por ciento Control FFA; donde "Por ciento de FFA" es el titulo total de especies de ácidos grasos libres dividido por el titulo total de especies grasas. Los aciertos se sometieron a validación adicional usando fermentaciones de matraz agitado como se describe en el Ejemplo 5. La columna de ácido graso libre normalizado (NORM FFA) indica la mejora en la enzima, con los valores inferiores que indican la mejor mejora. "ID de Acierto" indica la posición de la concavidad de la placa de examen primario donde se encontró el fenotipo de menor NORM FFA. Se identificaron las mutaciones de acierto al secuenciar los productos de PCR amplificados del "Acierto" que contiene los plásmidos pBZl usando los cebadores específicos del gen carB mutante (BZ1 por 51-GGATCTCGACGCTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO:55 )y el cebador único de BZ12 ccdAB 5 ' -TCAAAAACGCCATTA ACCTGATGTTCTG-3 ' (SEQ ID NO:56). Los valores NORM FFA y las mutaciones identificadas en los aciertos validados se resumen en la Tabla 12.

Tabla 12: Mutaciones Benéficas en Enzimas CarB4 Identificadas durante Mutagénesis de Saturación de Aminoácidos Identificación de nuevas variantes de la enzima CarB por mutagénesis combinatoria completa: Se construyó una biblioteca combinatoria completa para incluir los siguientes residuos de aminoácidos: 18D, 18R, 22S, 22R, 473H, 4731, 827R, 82 7C, 8701, 870L, 926V, 926A, 926E, 927S, 927K, 927G, 93 0M, 930K, 930R, 1128L, y 1128W. Los cebadores que contienen los codones nativos y mutantes en todas las posiciones se diseñaron para la construcción de bibliotecas por un método basado en PCR P (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. y Pease, L.R. 1989). Las mutaciones benéficas conservadas en CarB2, CarB3, y CarB4 (20R, 288G, y 535S) no se cambiaron, por lo tanto carB2GTG se clonó en pBZl (pBZl_ PTRCI _carB2GTG_ccdAB ) se usó como plantilla de PCR. La construcción de bibliotecas se completó al montar fragmentos de PCR en CarB ORF que contiene las mutaciones combinatorias anteriores. Los CarB ORF mutantes entonces se clonaron en la estructura pBZl por el método In-Fusion (Clontech) . El producto In-Fusion se precipitó y sometió a elect roporación directamente en la cepa de examen que tiene el plásmido pLYC4. El examen de la biblioteca, la fermentación en placa de concavidad profunda y en matraz agitado, se llevaron cabo como se describe en el Ejemplo 5. Las actividades (NORM FFA normalizado por CarB2, 100%) de los mutantes de CarB con mutaciones combinatorias especificas se resumen en la Tabla 13. Se incluyen como controles CarB2, CarB4, y CarB5 (CarB4-S22R) . La columna NORM FFA indica la mejora en la enzima CarB, con los menores valores que indican la mejor mejora. Las veces de mejora (X-FIOC) del control (CarB2) también se muestra. Todas las mutaciones mostradas también se muestran con relación a la secuencia de polinucleót ido de CarB wt (SEQ ID NO:7). Por ejemplo, CarBl tiene la mutación A535S, y la CarBDead (una enzima CarB catalíticamente inactiva) tiene la mutación S693A que destruye el sitio de unión de fosfopanteteina.

Nuevas variantes de CarB para producción mejorada de alcoholes graso en bioreactores: El propósito de identificar nuevas variantes de CarB listadas en la Tabla 13 es para usarlas para la producción mejorada de alcoholes grasos. La variante superiores de CarB (P06B6 - S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, L1128W) de la Tabla 13 tiene una mutación espontánea (AGC a AGA tipo silvestre) en la posición 3. Ambas variantes P06B6 CarB, específicamente CarB7 (aminoácido R por AGA en la posición 3 - S3R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, L1128W), y CarB8 (aminoácido S tipo silvestre por AGC en la posición 3 - E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R, L1128W) se produjeron y clonaron en la estructura pCLl920 de plásmido de producción de alcoholes grasos de bajo número de copia para generar los siguientes operones de alcohol grasos que difieren solo en CarB. El codón de inicio de traducción (GTG) para toda las variantes de CarB (CarB2, CarB7, y carB8) se invirtió a ATG para aumentar la expresión. pCL1920_PTRC_carB2_tesA_alrAadpl_fabB[A329G]_fadR pCL1920_PTRC_carB7_tesA_alrAadpl_fabB[A329G]_fadR pCLl920_PxRc_carB 8tesA_alrAadp lfabB [A329G]_fadR Los plásmidos descritos anteriormente se transformaron en una cepa basada en V668 con una copia de TE cromosómico, y las cepas resultantes se examinaron en bioreactores como se describe en el Ejemplo 4. La mejora (medida como % de alcoholes grasos en el producto de ferementación de bioreactor) de CarB7 y CarB8 con respecto a CarB2 se mostró en la Figura 16. El orden de actividad es CarB7 > CarB8 > CarB2. La mutación en la posición 3 de CarB7 (AGC a un codón raro AGA R) confirió mayor actividad que CarB8, además, el análisis SDS-PAGE de proteínas totales solubles reveló mayor expresión de CarB7 que CarB8 y CarB2 . Fueron similares los niveles de expresión de CarB2 y CarB8 . Esto es consistente con los datos de CarB60 descritos en el Ejemplo 6, tanto la mutación de codón raro AGA R de la posición 3 como la marca CarB60 en su N-terminal puede mejorar la expresión de CarB. Se entiende que CarB7 y CarB8 se desempeñarán mejor que CarB2 en cepas con flujo incrementado de ácidos grasos libres al manejar ya sea las cepas hospedadoras y/o al manejar los otros componentes del operón de producción de alcoholes grasos.

Tabla 13: Resumen de Variantes de CarB Identificadas de Biblioteca Combinatoria en Sistema de Plásmido Dual Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en la presente o se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, se propone solo para ilustrar mejor la descripción y no posee una limitación del alcance de la descripción a menos que se reivindique de otro modo.

Ningún texto en la especificación se debe considerar como que indique algún elemento no reivindicado como esencial a la práctica de la descripción. Se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir solo modalidades particulares y no se propone para que sea limitante. En la presente se describe modalidades preferidas de esta descripción. Pueden llegar a ser evidentes varias variaciones de las modalidades preferidas para los expertos en la téenica en la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la técnica empleen estas variaciones como sea apropiado y los inventores proponen que la descripción se practique de otro modo de lo que se describe específicamente en la presente. Por consiguiente, la descripción incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia citada en las reivindicaciones anexas a la presente como se permita por la lcy aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de la misma se abarcan por la descripción a menos que se indique de otro modo en la presente o se contradiga claramente de otro modo por el contexto.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido variante de ácido carboxilico-reductasa (CAR), caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido CAR variante se maneja por ingeniería genética para que tenga al menos una mutación en una posición de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de posiciones de aminoácido 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, y 1128.

2. El polipéptido CAR variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del polipéptido CAR variante en una célula hospedadora recombinante da por resultado un mayo titulo de Composiciones de alcoholes grasos en comparación a una célula hospedadora recombinante que expresa un correspondiente polipéptido tipo silvestre.

3. El polipéptido CAR variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un polipéptido CarB.

4. El polipéptido CAR variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste de S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L, R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, 930K, M930R y L1128W. .

5. El polipéptido CAR variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende: (a) mutación A535S; (b) mutaciones E20R F288G, Q473I y A535S; (c) mutaciones E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A y S927G; (d) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827A y S927G; (e) mutaciones S3R, E20R S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R y L1128 ; (f) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R873S, S927G, M930R y L1128W; (g) mutaciones D18R, E20R S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930K y L1128W; (h) mutaciones E20R S22K, F288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, S927K y M930R; (i) mutaciones D18R, E20R 288G, Q473I, A535S, R827C, V926E, M930K y L1128 ; (j) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H A535S, R827C, V926A, S927K y M930R; (k) mutaciones E20R, S22R F288G, Q473H, A535S y R827C; (l) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C y M930R; (m) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L, S927G y M930R; (n) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, I870L y S927G; (o) mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, V926A y S927G; (p) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L y L1128W; (q) mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128W; (r) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128W; (s) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, M930K y L1128W; (t) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, I870L, S927G y M930K; (u) mutaciones E20R, F288G, Q473I, A535S, I870L, 930K; (v) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, S927G, M930K y L1128W; (w) mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G y L1128W; (x) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L y S927G; (y) mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G y L1128W; (z) mutaciones D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930R y L1128W; (zz) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, V926E, S927G y M930R; o (zzz) mutaciones E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, V926A y L1128W.

6. Una célula hospedadora recombinante, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido variante de ácido carboxilico-reductasa (CAR) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7 y que tiene al menos una mutación en una posición de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de posiciones de aminoácido 3, 18, 20, 22, 80, 87, 191, 288, 473, 535, 750, 827, 870, 873, 926, 927, 930, y 1128, en donde la célula hospedadora recombinante produce una composición de alcoholes grasos a un mayor titulo o rendimiento que una célula hospedadora que expresa un correspondiente polipéptido CAR tipo silvestre cuando se cultiva en un medio que contiene una fuente de carbono bajo condiciones efectivas para expresar el polipéptido CAR variante.

7. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque SEQ ID NO: 7 es el correspondiente polipéptido CAR tipo silvestre.

8. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque además comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de tioesterasa.

9. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido FabB y un polipéptido FadR.

10. La célula hospedadora recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizada porque la célula hospedadora genéticamente manejada tiene un titulo o rendimiento que es al menos 3 veces mayor que el titulo de una célula hospedadora que expresa el correspondiente polipéptido CAR tipo silvestre cuando se cultiva bajo las mismas condiciones como la célula hospedadora recombinante.

11. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque tiene un titulo de aproximadamente 30g/L a aproximadamente 250g/L; o un título de aproximadamente 90 g/L a aproximadamente 120g/L.

12. La célula hospedadora recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizada porque tiene un rendimiento que es al menos 3 veces mayor que el rendimiento de una célula hospedadora que expresa el correspondiente polipéptido CAR tipo silvestre cuando se cultiva bajo las mismas condiciones como la célula hospedadora recombinante.

13. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque tiene un rendimiento de aproximadamente 10% a aproximadamente 40%.

14. Un cultivo celular, caracterizado porque comprende la célula hospedadora recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 6-9.

15. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque tiene productividad que es al menos 3 veces mayor que la productividad de un cultivo celular que expresa el correspondiente polipéptido CAR tipo silvestre.

16. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la productividad varía desde aproximadamente 0.7mg/L/hr a aproximadamente 3g/L/hr.

17. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el medio de cultivo comprende una composición de alcoholes grasos.

18. La célula hospedadora recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-17, caracterizada porque la composición de alcoholes grasos se colecta en una fase orgánica extracelularmente.

19. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende uno o más de un alcohol graso de C6, C8, CIO, C12, C13, C14, C15, C16, C17, o C18.

20. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende un alcohol graso insaturado de CIO:1, C12:1, C14:l, C16:l, o C18:l.

21. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos de Ci2 y Ci4.

22. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos de Ci2 y C14 a una relación de aproximadamente 3:1.

23. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos insaturados o alcoholes grasos saturados.

24. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende un alcohol graso insaturados que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de carbono entre C7 y Cs del extremo reducido del alcohol graso.

25. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición de alcoholes grasos comprende alcoholes grasos de cadena ramificada.

26. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además comprende un polinucleótido que codifica para aldehido graso-reductasa (AlrA).

27. Un cultivo celular, caracterizado porque comprende la célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 26.

28. Un método para producir una composición de alcoholes grasos a un mayor titulo, rendimiento o productividad, caracterizado porque comprende los pasos de (a) manejar una célula hospedadora recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; (b) cultivar la célula hospedadora recombinante en un medio que comprende una fuente de carbono; y (c) aislar opcionalmente la composición de alcoholes grasos del medio.