JP2015512645A - Car酵素、および改良された脂肪アルコール産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、2012年4月2日に提出された米国仮出願第61/619,309号の恩典を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、EFS-Webを介してASCII形式で提出されている配列表を含む。2013年4月2日に作成されたASCIIコピーの名称はLS00039PCT_SL.txtであり、サイズは89,038バイトである。
本開示は、組換え宿主細胞における改良された脂肪アルコール産生のための変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)酵素に関する。本開示は、変異型CAR核酸およびポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞および細胞培養物にさらに関する。さらに、脂肪アルコール組成物を製造する方法を包含する。
脂肪アルコールは、産業用生化学製品の重要なカテゴリーを成している。これらの分子およびそれらの誘導体には、界面活性剤、潤滑剤、可塑剤、溶媒、乳化剤、軟化剤、増粘剤、香味剤、芳香剤および燃料などの、数多くの用途がある。産業界では、脂肪アルコールは、ココナッツ油、ヤシ油、パーム核油、獣脂およびラードなどの天然源から生成される脂肪酸の接触水素添加を介して、または石油化学原料から生成されるα-オレフィンの化学的水和によって、産生される。天然源に由来する脂肪アルコールの鎖長はさまざまである。脂肪アルコールの鎖長は、個々の用途に対して重要である。自然界では、脂肪アルコールは、アシル-ACPまたはアシル-CoA分子を対応する第一級アルコールに還元することのできる酵素によっても作製される(例えば、米国特許公開第20100105955号(特許文献1)、同第20100105963号(特許文献2)および同第20110250663号(特許文献3)を参照。これらは参照により本明細書に組み入れられる)。
本開示の1つの局面は、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドであって、アミノ酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930および1128の群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの突然変異を有するように遺伝子操作された、変異型CARポリペプチドを提供する。本明細書において、組換え宿主細胞における変異型CARポリペプチドの発現は、対応する野生型ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較してより高い力価の脂肪アルコール組成物をもたらす。関連した1つの局面において、CARポリペプチドはCarBポリペプチドである。もう1つの関連した局面において、変異型CARポリペプチドは、位置S3R、D18R、D18L、D18T、D18P、E20V、E20S、E20R、S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、F288G、Q473L、Q473W、Q473Y、Q473I、Q473H、A535S、D750A、R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、M930K、M930Rおよび/またはL1128Wに突然変異を含む。関連した1つの局面において、CARポリペプチドは、突然変異A535S;または突然変異E20R、F288G、Q473IおよびA535S;または突然変異E20R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927G;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927G;または突然変異S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128W;またはE20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128W;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930KおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927KおよびM930R;または突然変異D18R、E20R、288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930KおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、V926A、S927KおよびM930R;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535SおよびR827C;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827CおよびM930R;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L、S927GおよびM930R;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870LおよびS927G;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、V926AおよびS927G;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870LおよびL1128W;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、M930KおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、I870L、S927GおよびM930K;または突然変異E20R、F288G、Q473I、A535S、I870L、M930K;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、S927G、M930KおよびL1128W;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927GおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870LおよびS927G;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128W;または突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930RおよびL1128W;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、V926E、S927GおよびM930R;または突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、V926AおよびL1128W;またはそれらの組み合わせを含む。
全体的概観
本開示は、新規変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)酵素、ならびにそれらの核酸配列およびタンパク質配列を提供する。本開示は、脂肪アルコールの産生のための変異型CAR酵素を含む組換え宿主細胞および細胞培養物をさらに範囲に含む。発酵性糖またはバイオマスからの脂肪アルコールの産生が商業的に実現可能であるためには、生成物の効率的な変換および回収のために工程を最適化しなければならない。本開示は、遺伝子操作された変異型酵素および遺伝子操作された組換え宿主細胞を用いる改良された脂肪アルコール産生のための組成物および方法を提供することによって、この需要に応える。宿主細胞は、発酵工程を用いて高力価の脂肪アルコールの産生をもたらす生体触媒としての役割を果たす。そのため、本開示はさらに、精製脂肪酸の触媒変換が不要となるように特定鎖長の脂肪アルコールおよびα-オレフィンを直接的に産生する、光合成性かつ従属栄養性の宿主細胞を作製するための方法も提供する。この新たな方法は、生成物の品質および費用の上での利点をもたらす。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の他の方法および材料を本開示の実施に用いることができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。本開示の記載および添付の特許請求の範囲では、以下の用語を以下に述べる定義に従って用いるものとする。
脂肪アルコールの力価、収量および/または産生能に関する非常に高い目標を達成するために、産生宿主細胞にいくつかの改変を加えた。FadRは、脂肪酸分解経路および脂肪酸生合成経路に関与する重要な調節因子である(Cronan et al., Mol Microbiol, 29(4): 937-943 (1998))。大腸菌のACS酵素FadDおよび脂肪酸輸送タンパク質FadLは、脂肪酸取り込み系の必須の構成成分である。FadLは細菌細胞内への脂肪酸の輸送を媒介し、FadDはアシル-CoAエステルの形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合には、外来性の脂肪酸が細菌によって取り込まれてアシル-CoAエステルに変換され、これは、転写因子FadRと結合して、脂肪酸の輸送(FadL)、活性化(FadD)およびβ-酸化(FadA、FadB、FadEおよびFadH)を担うタンパク質をコードするfad遺伝子の発現を抑制することができる。代替的な炭素源が利用できる場合には、細菌は脂肪酸をアシル-ACPとして合成し、これは、リン脂質合成には用いられるがβ-酸化の基質ではない。したがって、アシル-CoAおよびアシル-ACPはいずれも、異なる最終産物をもたらしうる、脂肪酸の独立した供給源である(Caviglia et al., J Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004))。米国仮出願第61/470,989号は、対応する野生型宿主細胞におけるFadRポリペプチドの発現レベルと比較してFadRポリペプチドの発現レベルが変更されるように遺伝子操作された宿主細胞における、脂肪酸誘導体の改良された産生方法を記載している。
アシル-ACPの遊離脂肪酸(FFA)への変換を触媒するチオエステラーゼ、および遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するカルボン酸レダクターゼ(CAR)を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を遺伝子操作した。宿主細胞(例えば、大腸菌)に存在する天然(内因性)アルデヒドレダクターゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。例示的なチオエステラーゼは、例えば米国特許公開第20100154293号に記載されており、これは参照により本明細書に明示的に組み入れられる。CarBは、例示的なカルボン酸レダクターゼであり、脂肪アルコール生成経路における重要な酵素の1つである。WO2010/062480号は、NRRL 5646 CARアミノ酸配列(GenpeptアクセッションAAR91681)(SEQ ID NO:6)をクエリー配列として用いるBLAST検索、および、およそ20個の相同配列の同定におけるその使用について記載している。
いくつかの態様において、組換え宿主細胞において発現されるポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの突然変異体または変異体である。「突然変異型」および「変異体」という用語は、本明細書で用いる場合、野生型ポリペプチドとは少なくとも1つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。例えば、突然変異体は、以下の保存的アミノ酸置換のうち1つまたは複数を含みうる:脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの、別の脂肪族アミノ酸による置き換え;セリンのトレオニンによる置き換え;トレオニンのセリンによる置き換え;酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸などの、別の酸性残基による置き換え;アミド基を保有する残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンなどの、アミド基を保有する別の残基による置き換え;塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンなどの、別の塩基性残基との交換;ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンなどの、別の芳香族残基による置き換え。いくつかの態様において、突然変異型ポリペプチドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。ポリペプチドの好ましい断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能(例えば、酵素活性)の一部またはすべてを保っている。いくつかの態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約98%、またはそれ以上を保っている。他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の約100%を保っている。生物活性に影響を及ぼさずにどのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかを判定する上での手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、LASERGENE(商標)ソフトウェア(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を用いて見いだすことができる。
いくつかの態様においては、ポリヌクレオチド(または遺伝子)配列が、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結したプロモーターを含む組換えベクターにより、宿主細胞に与えられる。ある態様において、プロモーターは、発生段階調節性の(developmentally-regulated)、オルガネラ特異的な、組織特異的な、誘導性の、構成性の、または細胞特異的なプロモーターである。いくつかの態様において、組換えベクターは、(a)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた発現制御配列;(b)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた選択マーカー;(c)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたマーカー配列;(d)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた精製部分;(e)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた分泌配列;および(f)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたターゲティング配列、を含む。本明細書に記載の発現ベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存しうることが理解されるであろう。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、例えば融合ポリペプチドを産生させるために、本明細書に記載の発現ベクターは宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌(E. coli)におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、以下の3つの目的の1つまたは複数に役立つ:(1)組換えポリペプチドの発現を増大させること;(2)組換えポリペプチドの溶解性を高めること;および(3)アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって、組換えポリペプチドの精製を助けること。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列の例には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。例示的な融合発現ベクターには、pGEX(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ;Smith et al., Gene, 67: 31-40 (1988))、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)、およびpRITS(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N. J.)が含まれ、これらはそれぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを標的組換えポリペプチドと融合させるものである。
組換え宿主細胞による脂肪アルコールの産生を増加させるための戦略には、遺伝子操作された産生宿主における、天然脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異なる生物由来の外因性脂肪酸生合成遺伝子の発現による、脂肪酸生合成経路を経由する流れの増大が含まれる。産生を最大限にするために、脂肪アルコール生合成経路において重要性のある酵素、例えばCARの活性の強化、ならびに宿主細胞の増殖および産生能を最適化するための他の戦略を採用することもできる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、脂肪アルコール生合成活性(すなわち、脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたは脂肪アルコール生合成酵素)を有するポリペプチド(酵素)をコードするポリヌクレオチドを含み、組換え宿主細胞によって脂肪アルコールが産生される。脂肪アルコールを含む組成物(脂肪アルコール組成物)は、組換え宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アルコール生合成酵素を発現させるために有効な条件下で培養することによって産生される。いくつかの態様において、脂肪アルコール組成物は脂肪アルコールを含むが、しかしながら、脂肪アルコール組成物が他の脂肪酸誘導体を含んでもよい。典型的には、脂肪アルコール組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。1つのアプローチでは、アシル-ACPの遊離脂肪酸(FFA)への変換を触媒するチオエステラーゼ、および遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するカルボン酸レダクターゼ(CAR)を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を遺伝子操作した。宿主細胞(例えば、大腸菌)に存在する天然(内因性)アルデヒドレダクターゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換する脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ(本明細書ではアルデヒドレダクターゼとも称する。例えば、EC 1.1.1.1)を、本開示の実施に際して用いてもよい。本明細書で用いる場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、脂肪アルデヒドのアルコール(例えば、脂肪アルコール)への変換を触媒しうるポリペプチドのことを指す。当業者は、ある種のアルコールデヒドロゲナーゼは他の反応も触媒しうることを理解していると考えられ、これらの非特異的アルコールデヒドロゲナーゼも「アルコールデヒドロゲナーゼ」の範囲に含まれる。本開示に従って有用なアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの例には、AlrAadp1(SEQ ID NO:4)またはAlrAホモログ、および内因性大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばYjgB(AAC77226)(SEQ ID NO:5)、DkgA(NP_417485)、DkgB(NP_414743)、YdjL(AAC74846)、YdjJ(NP_416288)、AdhP(NP_415995)、YhdH(NP_417719)、YahK(NP_414859)、YphC(AAC75598)、YqhD(446856)およびYbbO[AAC73595.1]などが非限定的に含まれる。そのほかの例は、国際特許出願公開WO2007/136762、WO2008/119082およびWO2010/062480に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。ある態様において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドはアルデヒドレダクターゼ活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する(EC 1.1.1.1)。もう1つのアプローチでは、脂肪アルコール形成アシル-CoAレダクターゼ、または脂肪アシル-チオエステル基質(例えば、脂肪アシル-CoAまたは脂肪アシル-ACP)を脂肪アルコールに変換する脂肪アシルレダクターゼ(FAR)を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を遺伝子操作した。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、脂肪アルコール形成アシル-CoAレダクターゼ(FAR)活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。この態様に従って有用なFARポリペプチドの例は、PCT公開WO2010/062480に記載されており、これは参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
本明細書で用いる場合、発酵とは、組換え宿主細胞の培養物を炭素源を含む培地中で繁殖させることによる、宿主細胞による有機材料の標的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源の脂肪酸またはその誘導体への変換のことを広く指す。本明細書で用いる場合、産生を許容する条件とは、宿主細胞が所望の生成物、例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体などを産生することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。同様に、ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される条件とは、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、供給速度および培地組成を非限定的に含む多くのパラメーターを含みうる。これらの条件のそれぞれは、個々に、または組み合わされて、宿主細胞が増殖することを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそれらの変形物(微好気性など)であってよい。例示的な培養培地には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝されうる炭素源を含む。加えて、炭素源の動態化(例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への解重合)およびその後の代謝を促進するために、培地中に酵素を用いることもできる。小規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、例えば約100mL、500mL、1L、2L、5Lまたは10Lバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列、例えばCARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列などを発現するように誘導することができる。大規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、約10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000Lまたはそれ以上のバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。または、大規模流加発酵を実施することもできる。
本明細書に記載の脂肪アルコール組成物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境において認められ、培養培地から容易に単離することができる。脂肪アルコール組成物は組換え宿主細胞によって分泌され、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に輸送されるか、または細胞外環境に受動的に移行する。脂肪アルコール組成物は、当技術分野において公知の慣行的な方法を用いて、組換え宿主細胞培養物から単離される。本開示は、1つまたは複数の脂肪アルデヒドおよび/または脂肪アルコールを含む、遺伝子操作された宿主細胞または組換え宿主細胞によって産生される組成物(バイオ生成物(bioproduct))を提供する。特定の鎖長および飽和度を有する脂肪アルコール構成成分が、培養された、遺伝子操作された宿主細胞または組換え宿主細胞によって産生されるバイオ生成物の大半を構成しているものの、該組成物は通常、鎖長および/または飽和度に関してさまざまである脂肪アルデヒドおよび/または脂肪アルコールの混合物を含む。本明細書で用いる場合、現代炭素分率(fraction of modern carbon)すなわちfMという用語は、米国国立標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology(NIST))標準物質(Standard Reference Material(SRM))4990Bおよび4990C、それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIとして知られるもの、によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C/12C同位体比の0.95倍に相当する(西暦1950年を基準とする)。これは、減衰補正された産業革命前の木とおおむね等しい。現在の生体生物圏(植物材料)については、fMはおよそ1.1である。
δ13C(‰)=[(13C/12C)試料-(13C/12C)標準物質]/(13C/12C)標準物質×1000
PDB標準物質(reference material;RM)が枯渇したことから、IAEA、USGS、NIST、および他の選ばれた国際的同位体研究所の協同で、一連の代替RMが開発されている。PDBからのパーミル偏位の表記がδ13Cである。測定は、CO2に対して、高精度安定同位体比質量分析(high precision stable ratio mass spectrometry)(IRMS)により、質量44、45および46の分子イオンに関して行われる。本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたバイオ生成物を含み、これには例えば、脂肪アルデヒドおよびアルコール生成物が含まれる。具体的には、バイオ生成物は、約-28もしくはそれ以上、約-27もしくはそれ以上、-20もしくはそれ以上、-18もしくはそれ以上、-15もしくはそれ以上、-13もしくはそれ以上、-10もしくはそれ以上、または-8もしくはそれ以上のδ13Cを有することができる。例えば、バイオ生成物は、約-30〜約-15、約-27〜約-19、約-25〜約-21、約-15〜約-5、約-13〜約-7、または約-13〜約-10のδ13Cを有することができる。別の場合には、バイオ生成物は、約-10、-11、-12、または-12.3のδ13Cを有することができる。バイオ生成物は、本明細書における本開示に従って産生されたバイオ生成物を含め、各化合物における14Cの量を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することもできる。14Cは5730年という核半減期を有するので、「古い(older)」炭素を含有する石油ベース燃料を、「新しい(newer)」炭素を含有するバイオ生成物と区別することができる(例えば、Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol.I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)を参照)。
条件が発現を可能とするのに十分であるかを判定するためには、異種遺伝子または改変された天然遺伝子を含む組換え宿主細胞を、例えば、約4、8、12、24、36または48時間にわたって培養する。培養中および/または培養後に、試料を集菌して分析することにより、脂肪アルコール産生レベル(力価、収量または産生能)が、改変されていない野生型親細胞のものと異なるか否かを判定することができる。例えば、宿主細胞を増殖させた培地を、所望の生成物の存在について調べることができる。ある生成物の存在について調べる場合には、例えば、TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MSなど、ただしこれらには限定されないアッセイを用いることができる。組換え宿主細胞菌株は、改変された脂肪アルコールまたは脂肪種の産生レベルに関するスクリーニングの目的で、プレートまたは振盪フラスコ内の少容量(0.001L〜1L)培地中で培養することができる。候補菌株すなわち「ヒット」が小規模で同定されたら、脂肪アルコールまたは脂肪種の正確な産生レベルを決定するために、これらの菌株を、バイオリアクター、タンクおよびパイロットプラントにおけるより大きな容量(1L〜1000L)の培地中で培養する。これらの大容量培養条件は、所望の脂肪アルコールまたは脂肪種の産生を得るための培養条件を最適化するために当業者によって用いられる。
アルデヒドは、多くの特殊化学物質を産生するために用いられる。例えば、アルデヒドは、ポリマー、樹脂(例えば、ベークライト)、染料、香味剤、可塑剤、香料、医薬品および他の化学物質を産生するために用いられ、溶媒、保存料、または消毒薬として用いられるものもある。加えて、ビタミンおよびホルモンなどのある種の天然化合物および合成化合物はアルデヒドであり、多くの糖類はアルデヒド基を含有する。脂肪アルデヒドは、化学的または酵素的還元によって脂肪アルコールに変換することができる。脂肪アルコールは多くの商業用途を有する。全世界での脂肪アルコールおよびその誘導体の年間売上高は10億米ドルを超える。短鎖(shorter chain)脂肪アルコールは、化粧品産業および食品産業において、乳化剤、軟化剤、および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールは、その両親媒性ゆえに、パーソナルケア用品および家事用品、例えば洗剤などに役立つ非イオン界面活性剤として作用する。また、脂肪アルコールは、蝋、ゴム、樹脂、医薬軟膏およびローション、潤滑油添加物、繊維用帯電防止剤および表面処理剤、可塑剤、化粧品、工業用溶媒、ならびに脂肪用の溶媒として使用される。本開示はまた、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された脂肪アルコールを含む界面活性剤組成物または洗剤組成物も提供する。当業者は、界面活性剤組成物または洗剤組成物の意図する目的に応じて、異なる脂肪アルコールを産生して用いることができることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の脂肪アルコールが、界面活性剤または洗剤の産生のための原料として用いられる場合、当業者は、脂肪アルコール原料の特性が、産生される界面活性剤または洗剤組成物の特性に影響を及ぼすことを理解するであろう。それ故に、原料として用いるための特定の脂肪アルコールを産生することにより、界面活性剤または洗剤組成物の特性を選択することができる。本明細書に記載の脂肪アルコールベースの界面活性剤および/または洗剤組成物は、当技術分野において周知の他の界面活性剤および/または洗剤と混合することができる。いくつかの態様において、混合物は、重量比で少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲の脂肪アルコールを含むことができる。他の例では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22炭素長である炭素鎖を含む脂肪アルコールを、重量比で少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲で含む界面活性剤または洗剤組成物を製造することができる。そのような界面活性剤または洗剤組成物は、非微生物源由来のマイクロエマルションまたは界面活性剤または洗剤などの少なくとも1つの添加物も含むことができ、それらは脂肪アルコールとの重量比で少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または前記の値のいずれか2つを境界とする範囲の量で存在しうる。以下の実施例によって、本開示をさらに例示する。これらの実施例は例示の目的で提示されるのにすぎない。決して、これらの実施例を、本開示の範囲または内容を限定するものと解釈してはならない。
産生宿主の改変‐アシル-CoAデヒドロゲナーゼの減弱化
本実施例では、脂肪酸分解酵素の発現が減弱化されている、遺伝子操作された宿主細胞の構築について述べる。Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645 (2000)によって記載されたLambda Red(Red-Driven Integrationとしても知られる)系に以下の改変を加えた上で用いて、大腸菌MG1655(大腸菌K株の1つ)のfadE遺伝子を欠失させた。
脂肪酸合成経路を経由する流れの増大‐アセチルCoAカルボキシラーゼ媒介性
脂肪酸生合成のための主な前駆体はマロニル-CoAおよびアセチル-CoAである(図1)。これらの前駆体は大腸菌における脂肪酸生合成の速度を制限することが示唆されている(図2)。本実施例では、合成accオペロン[コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)accABCD(±birA)]を過剰発現させ、この遺伝子改変が、大腸菌におけるアセチル-coAおよびマロニル-CoAの産生の増大をもたらした。1つのアプローチでは、マロニル-CoAレベルを上昇させる目的で、コリネバクテリウム・グルタミクム(C.グルタミクム)由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼ酵素複合体を大腸菌で過剰発現させた。アセチル-CoAカルボキシラーゼ(acc)は、4つの別個のサブユニット、accA、accB、accCおよびaccDからなる(図3)。C.グルタミクムaccの利点は、2つのサブユニットが、融合タンパク質accCBおよびaccDAとしてそれぞれ発現されることであり、これにより、その均衡のとれた発現が容易になる。さらに、accBサブユニットをビオチン化するC.グルタミクムbirA(図3)も過剰発現させた。実施例3では、acc遺伝子とfabオペロン全体との共発現について述べる。
脂肪酸合成経路を経由する流れの増大‐iFAB
脂肪酸誘導体の産生:
組換え宿主細胞における脂肪酸合成経路を経由する流れを増大させるための戦略には、大腸菌における、天然の大腸菌脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異なる生物由来の外因性の脂肪酸生合成遺伝子の発現の両方が含まれる。本研究では、異なる生物由来の脂肪酸生合成遺伝子を、大腸菌DV2のゲノム中で組み合わせた。iFAB 130〜145を含む16種の菌株を評価した。iFAB 130〜145の詳細な構造は、以下のiFABの表1に提示されている。
プラスミド:pDG109、pLC56およびpV171.1は、carBおよびtesAのさまざまな発現を伴うpCL_Ptrc_carB_tesA_alrA_fabB_fadRオペロンである。iFAB138はSEQ ID NO:13である。
rphおよびilvGの突然変異を修復することによって、遊離脂肪酸(FFA)生成物の量を増加させる
この菌株においてilvGおよびrph突然変異を修復した結果、FFAがより多く産生された。菌株D178、EG149およびV668(表3)を、pCL_Ptrc_tesAで形質転換した。FA2培地中での発酵を32℃で40時間行って、pCL_Ptrc_tesAを有する菌株D178、EG149、およびV668のFFA産生を比較した。rphおよびilvG突然変異の修復は、pCL_Ptrc_tesAを有する基準菌株と比べてFFA産生の116%の増加をもたらした。図8に見られるように、V668/pCL_Ptrc_tesAは、D178/pCL_Ptrc_tesAまたはEG149/pCL_Ptrc_tesA対照よりも多くのFFAを産生する。FFAはLS9生成物の前駆体であるため、FFA産生の増加は、新たな菌株がLS9生成物をより高レベルで産生しうることの優れた指標となる。発酵および抽出は、以下に例示する標準的なFALC発酵プロトコールに従って行った。
トランスポゾン突然変異誘発による脂肪アルコール産生の増大‐yijP
大腸菌による脂肪アルコールの産生の力価、収量、産生能を改善するために、トランスポゾン突然変異誘発およびハイスループットスクリーニングを実施し、有益な突然変異のシークエンシングを行った。yijP菌株におけるトランスポゾン挿入は、振盪フラスコ発酵および流加発酵のいずれにおいても、該菌株の脂肪アルコール収量を改善することが示された。SL313菌株は脂肪アルコールを産生する。この菌株の遺伝子型を表3に提示している。続いて、脂肪アルコールの産生を測定するために、トランスポゾンクローンをハイスループットスクリーニングに供した。手短に述べると、コロニーを選び取り、LBを含有するディープウェルプレートに入れて、終夜増殖させ、新たなLBに播種して、3時間増殖させ、新たなFA2.1培地に播種して、16時間増殖させ、続いて酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物をBSTFA(N,O-ビス[トリメチルシリル]トリフルオロアセトアミド)で誘導体化した後に、GC/FIDを用いて分析した。pDG109プラスミドの選択を維持するために、すべての培地にスペクチノマイシン(100mg/L)を含めた。対照菌株SL313と同程度に総脂肪種を産生するが対照よりも脂肪アルコール種のパーセンテージが高くかつ遊離脂肪酸のパーセンテージが低いクローンを選ぶことにより、ヒットを選択した。菌株68F11がヒットとして同定され、これを、FA2.1培地を用いる振盪フラスコ発酵で検証した。トランスポゾンヒット68F11と対照菌株SL313との比較により、68F11は対照よりも高いパーセンテージで脂肪アルコール種を産生する一方で、両方の菌株とも総脂肪種は同程度の力価で産生することが示された。LC535と名付けられたヒット68F11の単一コロニーについて、トランスポゾン挿入の場所を同定するためにシークエンシングを行った。手短に述べると、キットZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(商標)(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)を製造元の説明書に従って用いて、10mLの終夜LB培養物からゲノムDNAを精製した。精製されたゲノムDNAのシークエンシングを、トランスポゾンの内部にあるプライマーを用いて、トランスポゾンから外側に向かって行った:
。
。
。
タンクでの脂肪酸エステルの産生について評価するために、所望の菌株のグリセロールバイアルを用いて振盪フラスコ内の20mL LB+スペクチノマイシンに播種し、32℃でおよそ6時間培養した。4mLのLB培養物を用いて125mLの低PFA播種培地(以下)に播種し、これを続いて32℃の振盪機にて終夜培養した。50mLの終夜培養物を用いて1Lのタンク培地に播種した。タンクを、pH 7.2および30.5℃でpH固定条件下、最大供給速度16g/L/hr(グルコースまたはメタノール)で動作させた。
CarBへのN末端60bp融合タグの付加(CarB60)
タンパク質の溶解性、安定性、発現または機能性を高めるためには、多くの手段がある。CarBの溶解性を高めるための1つのアプローチでは、融合タグを該遺伝子の前にクローニングすることができる。CarBの発現を増加させるもう1つのアプローチでは、該遺伝子のプロモーターまたはリボソーム結合部位(RBS)を変更することができる。本検討では、N末端60bp融合タグの付加によって、carB(SEQ ID NO:7)を改変した。改変されたタンパク質(本明細書では「CarB60」と称する)を作製するために、carBをまず、pET15bベクター中に、以下のプライマーを用いてクローニングした:
。
;および逆方向プライマー:
を用いて増幅した。
CarB突然変異体の作製
CarB酵素は、ある特定の処理条件下において脂肪アルコールの産生の律速段階である。脂肪アルコールを経済的に産生するために、CarB酵素の活性を高めるための取り組みを行った。
エラープローンPCRを用いるランダム突然変異誘発を、DNAポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下で行った。遊離脂肪酸の脂肪アルコールへの変換を増大させる有益な突然変異を見いだすために、突然変異誘発させた核酸をベクター中にクローニングし、エラープローンPCRおよびその後ハイスループットスクリーニングを行った(以下に詳述する)。重要な残基を他のアミノ酸へとさらに突然変異させた。いくつかの単一のアミノ酸突然変異および突然変異の組み合わせが、脂肪アルコールに変換される脂肪種の割合を増加させた。手短に述べると、Genemorph IIキット(Stratagene)を用いるエラープローンPCRによって、carB60opt遺伝子中にランダム突然変異を誘発した。クローニングを容易にするために、突然変異はcarB60optの2つのドメインの一方のみに別々に誘発した。ライブラリー1はcarB60optの先頭の759残基を含み、これはプライマー:
を用いるエラープローンPCRによって作製した。ライブラリー1用のベクターは、酵素NheIおよびPshAIで消化したプラスミドpDG115とした。ライブラリー2はcarB60optの末尾の435残基を含み、これはプライマー:
を用いるエラープローンPCRによって作製した。
を用いるcarB60opt遺伝子全体のコロニーPCRによって行い、carB60opt酵素の内部にあるプライマーを用いてシークエンシングを行った。
エラープローンPCRの後に脂肪アルコールの産生に有益であると考えられたアミノ酸位置を、さらなる突然変異誘発に供した。縮重ヌクレオチドNNKまたはNNSを含むプライマーを用いて、これらの位置を他のアミノ酸に突然変異させた。得られた「飽和突然変異誘発ライブラリー」を、エラープローンライブラリーに関して上述したようにスクリーニングし、脂肪アルコール変換をさらに改善するヒット(親の「対照」菌株と比較して、総遊離脂肪酸力価がより小さく総脂肪アルコール力価がより大きいもの)を同定した。脂肪アルコールの産生を改善する9つの異なる位置における単一のアミノ酸/コドン変化を表8に示している。ヒットを、本明細書に述べたような振盪フラスコ発酵を用いるさらなる検証に供した。
後に二重プラスミドスクリーニング系を開発し、FALC産生に関してCarB4を上回る改良されたCarB変異体を同定するための検証を行った。この二重プラスミド系は以下の基準を満たした:1)突然変異型クローンが、CarB活性を上回る脂肪酸の流れをもたらすための高いFA力価を生じること。これは、基準菌株(染色体TEのコピーを2つ有するV668)を、触媒的に不活性なCarB酵素であるCarB[S693A]を有するFALCオペロンを保持するプラスミド(pLYC4、pCL1920_PTRC_carDead_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR)で形質転換して、遊離脂肪酸の産生を強化することによって実現される;2)好ましくは9kbよりも小さなcarB突然変異体テンプレートを有するスクリーニング用プラスミドが飽和突然変異誘発手順に適用可能であり、かつpLYC4による発現に互換性があること;3)CarB活性のダイナミックレンジが調整可能であること。これは、CarB4発現レベルを調整するために、比較的弱いプロモーター(PTRC1)と代替的な開始コドン(GTGまたはTTG)を組み合わせることによって達成される。3)優れたプラスミド安定性、プラスミド安定性を維持するために毒素/抗毒素モジュール(ccdBAオペロン)を導入した。
および逆方向プライマー
により、pVA232(pCL1920_PTRC_carB4_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR)プラスミドをテンプレートとして用いてPCR増幅した。(1)ATG/TTG/GTG開始コドンを有するcarB4‐順方向プライマー
;ならびに逆方向プライマーcarB4 rev
により、pVA232プラスミドをテンプレートとして用いた。(3) ccdABを有するrrnB T1T2終結因子‐順方向プライマーrrnB T1T2 term
および逆方向プライマーccdAB rev
により、プラスミドpAH008(pV171_ccdBAオペロン)を用いた。(4)pACYCDuet-1ベクター骨格‐順方向プライマーpACYCベクターfor
および逆方向プライマーpACYCベクターrev
を用いた。
およびBZ12_ccdABユニークプライマー
)を用いて増幅したPCR産物をシークエンシングすることによって同定した。NORM FFA値および検証したヒットにおいて同定された突然変異を表12にまとめている。
完全コンビナトリアルライブラリーを、以下のアミノ酸残基を含むように構築した:18D、18R、22S、22R、473H、473I、827R、827C、870I、870L、926V、926A、926E、927S、927K、927G、930M、930K、930R、1128Lおよび1128W。PCRベースの方法によってライブラリーを構築するために(Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. and Pease, L.R. 1989)、天然コドンおよび突然変異型コドンをすべての位置に含むプライマーを設計した。CarB2、CarB3、およびCarB4で保存されている有益な突然変異(20R、288G、および535S)は変化させず、このため、carB2GTGをpBZ1中にクローニングしたもの(改変pBZ1_PTRC1_carB2GTG_ccdAB)をPCRテンプレートとして用いた。ライブラリー構築は、PCR断片をアセンブルして、上記のコンビナトリアル突然変異を含むCarB ORFとすることによって完了した。続いて、突然変異型CarB ORFを、In-Fusion法(Clontech)を用いて、pBZ1骨格中にクローニングした。In-Fusion産物を沈降させ、プラスミドpLYC4を保持するスクリーニング用菌株へエレクトロポレーションにより直接導入した。ライブラリーのスクリーニング、ディープウェルプレートおよび振盪フラスコ発酵は、実施例5に記載した通りに実施した。特定のコンビナトリアル突然変異を有するCarB突然変異体の活性(CarB2、100%によって標準化したNORM FFA)を、表13にまとめている。CarB2、CarB4、およびCarB5(CarB4-S22R)を対照として含めている。NORM FFAの列はCarB酵素の改善を示しており、値が小さいほど優れた改善を示している。対照(CarB2)に対する改善倍率(X-FIOC)も示している。列記した突然変異はすべて、CarB wtのポリペプチド配列(SEQ ID NO:7)を基準としている。例えば、CarB1はA535S突然変異を有し、CarBDead(触媒的に不活性なCarB酵素)は、ホスホパンテテイン付着部位を破壊するS693A突然変異を保持する。
表13に列記した新規CarB変異体を同定した目的は、それらを脂肪アルコール産生の改良に用いることである。表13の一番上のCarB変異体(P06B6‐S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R、L1128W)は、位置3に自然突然変異(野生型AGCからAGAへ)を保持する。P06B6 CarB変異体、すなわちCarB7(位置3はAGAによりアミノ酸R‐S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R、L1128W)およびCarB8(位置3はAGCにより野生型アミノ酸S‐E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R、L1128W)の両方を作製し、低コピー数の脂肪アルコール産生プラスミド骨格pCL1920中にクローニングして、CarBのみが異なる以下の脂肪アルコールオペロンを得た。最大限に発現させるために、すべてのCarB変異体(CarB2、CarB7、およびcarB8)で、翻訳開始コドン(GTG)をATGに戻した。
[本発明1001]
SEQ ID NO:7に対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドであって、アミノ酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930および1128からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの突然変異を有するように遺伝子操作された、変異型CARポリペプチド。
[本発明1002]
組換え宿主細胞における前記変異型CARポリペプチドの発現が、対応する野生型ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較してより高い力価の脂肪アルコール組成物をもたらす、本発明1001の変異型CARポリペプチド。
[本発明1003]
CARポリペプチドがCarBポリペプチドである、本発明1001の変異型CARポリペプチド。
[本発明1004]
S3R、D18R、D18L、D18T、D18P、E20V、E20S、E20R、S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、F288G、Q473L、Q473W、Q473Y、Q473I、Q473H、A535S、D750A、R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、M930K、M930RおよびL1128Wからなる群より選択される突然変異を含む、本発明1001の変異型CARポリペプチド。
[本発明1005]
突然変異A535Sを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1006]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473IおよびA535Sを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1007]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927Gを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1008]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927Gを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1009]
変異型ポリペプチドが突然変異S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1010]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1011]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1012]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927KおよびM930Rを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1013]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930KおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1014]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、V926A、S927KおよびM930Rを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1015]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535SおよびR827Cを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1016]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827CおよびM930Rを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1017]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L、S927GおよびM930Rを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1018]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870LおよびS927Gを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1019]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、V926AおよびS927Gを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1020]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870LおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1021]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1022]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1023]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1024]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、I870L、S927GおよびM930Kを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1025]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473I、A535S、I870L、M930Kを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1026]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1027]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927GおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1028]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870LおよびS927Gを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1029]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1030]
変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1031]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、V926E、S927GおよびM930Rを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1032]
変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、V926AおよびL1128Wを含む、本発明1004の変異型CARポリペプチド。
[本発明1033]
SEQ ID NO:7に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、アミノ酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930および1128からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの突然変異を有する変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、遺伝子操作された該宿主細胞が、炭素源を含有する培地中で、該変異型CARポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞よりも高い力価または収量で脂肪アルコール組成物を産生する、組換え宿主細胞。
[本発明1034]
SEQ ID NO:7が前記対応する野生型CARポリペプチドである、本発明1033の組換え宿主細胞。
[本発明1035]
チオエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1033の組換え宿主細胞。
[本発明1036]
FabBポリペプチドおよびFadRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1035の組換え宿主細胞。
[本発明1037]
前記遺伝子操作された宿主細胞が、該遺伝子操作された宿主細胞と同じ条件下で培養した場合の前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞の力価よりも少なくとも3倍高い力価を有する、本発明1033〜1036のいずれかの組換え宿主細胞。
[本発明1038]
約30g/L〜約250g/Lの力価を有する、本発明1037の組換え宿主細胞。
[本発明1039]
約90g/L〜約120g/Lの力価を有する、本発明1038の組換え宿主細胞。
[本発明1040]
前記遺伝子操作された宿主細胞と同じ条件下で培養した場合の前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞の収量よりも少なくとも3倍多い収量を有する、本発明1033〜1036のいずれかの組換え宿主細胞。
[本発明1041]
前記遺伝子操作された宿主細胞が約10%〜約40%までの収量を有する、本発明1040の組換え宿主細胞。
[本発明1042]
本発明1033〜1036のいずれかの組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
[本発明1043]
前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する細胞培養物の産生能よりも少なくとも3倍高い産生能を有する、本発明1042の細胞培養物。
[本発明1044]
産生能が約0.7mg/L/hr〜約3g/L/hrの範囲である、本発明1043の細胞培養物。
[本発明1045]
培養培地が脂肪アルコール組成物を含む、本発明1044の細胞培養物。
[本発明1046]
前記脂肪アルコール組成物が細胞外に産生される、本発明1033〜1045のいずれかの組換え宿主細胞。
[本発明1047]
前記脂肪アルコール組成物がC6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルコールのうち1つまたは複数を含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1048]
前記脂肪アルコール組成物がC10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪アルコールを含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1049]
前記脂肪アルコール組成物がC 12 およびC 14 脂肪アルコールを含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1050]
前記脂肪アルコール組成物がC 12 およびC 14 脂肪アルコールを約3:1の比で含む、本発明1049の細胞培養物。
[本発明1051]
前記脂肪アルコール組成物が不飽和脂肪アルコールを含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1052]
前記脂肪アルコール組成物が、脂肪アルコールの還元末端からC 7 〜C 8 の間の炭素鎖における7番目の位置に二重結合を有する該脂肪アルコールを含む、本発明1051の細胞培養物。
[本発明1053]
前記脂肪アルコール組成物が飽和脂肪アルコールを含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1054]
前記脂肪アルコール組成物が分枝鎖脂肪アルコールを含む、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1055]
脂肪アルデヒドレダクターゼ(AlrA)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1035の組換え宿主細胞。
[本発明1056]
本発明1055の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
[本発明1057]
脂肪アルコール組成物を高い力価、収量または産生能で製造する方法であって、
(a)本発明1001〜1041のいずれかの組換え宿主細胞を遺伝子工学的に作製する段階;
(b)炭素源を含む培地中で該組換え宿主細胞を培養する段階;および
(c)任意で、該培地から該脂肪アルコール組成物を単離する段階
を含む、方法。
Claims (57)
- SEQ ID NO:7に対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドであって、アミノ酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930および1128からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの突然変異を有するように遺伝子操作された、変異型CARポリペプチド。
- 組換え宿主細胞における前記変異型CARポリペプチドの発現が、対応する野生型ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較してより高い力価の脂肪アルコール組成物をもたらす、請求項1記載の変異型CARポリペプチド。
- CARポリペプチドがCarBポリペプチドである、請求項1記載の変異型CARポリペプチド。
- S3R、D18R、D18L、D18T、D18P、E20V、E20S、E20R、S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、F288G、Q473L、Q473W、Q473Y、Q473I、Q473H、A535S、D750A、R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、M930K、M930RおよびL1128Wからなる群より選択される突然変異を含む、請求項1記載の変異型CARポリペプチド。
- 突然変異A535Sを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473IおよびA535Sを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927Gを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827AおよびS927Gを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927KおよびM930Rを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930KおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、V926A、S927KおよびM930Rを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535SおよびR827Cを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827CおよびM930Rを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L、S927GおよびM930Rを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870LおよびS927Gを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、V926AおよびS927Gを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870LおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、I870L、S927GおよびM930Kを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、F288G、Q473I、A535S、I870L、M930Kを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、S927G、M930KおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927GおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870LおよびS927Gを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927GおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930RおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、V926E、S927GおよびM930Rを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- 変異型ポリペプチドが突然変異E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、V926AおよびL1128Wを含む、請求項4記載の変異型CARポリペプチド。
- SEQ ID NO:7に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、アミノ酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930および1128からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの突然変異を有する変異型カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、遺伝子操作された該宿主細胞が、炭素源を含有する培地中で、該変異型CARポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞よりも高い力価または収量で脂肪アルコール組成物を産生する、組換え宿主細胞。
- SEQ ID NO:7が前記対応する野生型CARポリペプチドである、請求項33記載の組換え宿主細胞。
- チオエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項33記載の組換え宿主細胞。
- FabBポリペプチドおよびFadRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項35記載の組換え宿主細胞。
- 前記遺伝子操作された宿主細胞が、該遺伝子操作された宿主細胞と同じ条件下で培養した場合の前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞の力価よりも少なくとも3倍高い力価を有する、請求項33〜36のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
- 約30g/L〜約250g/Lの力価を有する、請求項37記載の組換え宿主細胞。
- 約90g/L〜約120g/Lの力価を有する、請求項38記載の組換え宿主細胞。
- 前記遺伝子操作された宿主細胞と同じ条件下で培養した場合の前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する宿主細胞の収量よりも少なくとも3倍多い収量を有する、請求項33〜36のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
- 前記遺伝子操作された宿主細胞が約10%〜約40%までの収量を有する、請求項40記載の組換え宿主細胞。
- 請求項33〜36のいずれか一項記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
- 前記対応する野生型CARポリペプチドを発現する細胞培養物の産生能よりも少なくとも3倍高い産生能を有する、請求項42記載の細胞培養物。
- 産生能が約0.7mg/L/hr〜約3g/L/hrの範囲である、請求項43記載の細胞培養物。
- 培養培地が脂肪アルコール組成物を含む、請求項44記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物が細胞外に産生される、請求項33〜45のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
- 前記脂肪アルコール組成物がC6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルコールのうち1つまたは複数を含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物がC10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪アルコールを含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物がC12およびC14脂肪アルコールを含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物がC12およびC14脂肪アルコールを約3:1の比で含む、請求項49記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物が不飽和脂肪アルコールを含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物が、脂肪アルコールの還元末端からC7〜C8の間の炭素鎖における7番目の位置に二重結合を有する該脂肪アルコールを含む、請求項51記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物が飽和脂肪アルコールを含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記脂肪アルコール組成物が分枝鎖脂肪アルコールを含む、請求項46記載の細胞培養物。
- 脂肪アルデヒドレダクターゼ(AlrA)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項35記載の組換え宿主細胞。
- 請求項55記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
- 脂肪アルコール組成物を高い力価、収量または産生能で製造する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項記載の組換え宿主細胞を遺伝子工学的に作製する段階;
(b)炭素源を含む培地中で該組換え宿主細胞を培養する段階;および
(c)任意で、該培地から該脂肪アルコール組成物を単離する段階
を含む、方法。
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