CN106795483A - 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 - Google Patents

用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106795483A
CN106795483A CN201480051860.6A CN201480051860A CN106795483A CN 106795483 A CN106795483 A CN 106795483A CN 201480051860 A CN201480051860 A CN 201480051860A CN 106795483 A CN106795483 A CN 106795483A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coenzyme
genetically modified
synthase
npht7
carbon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480051860.6A
Other languages
English (en)
Inventor
M·林奇
M·路易
S·科普利
E·施平德勒
B·普拉瑟
M·利普斯科姆
T·利普斯科姆
H·廖
D·霍格西特
R·埃文斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cargill Inc
Original Assignee
Cargill Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cargill Inc filed Critical Cargill Inc
Publication of CN106795483A publication Critical patent/CN106795483A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0118—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase III (2.3.1.180)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01194—Acetoacetyl-CoA synthase (2.3.1.194)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及经代谢改造的微生物菌株，例如细菌菌株，在所述菌株中，提高了丙二酰辅酶A的利用率，以产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中所述经修饰微生物利用依赖丙二酰辅酶A、但不依赖丙二酰‑ACP的机理产生脂肪酰辅酶A中间体。

Description

用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月19日提交的美国临时专利申请No.61/856,652(代理人案卷号34246-780.101)的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
有关联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国政府支持下完成的，与美国能源部签定的合同号为DE-AR0000088。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
脂肪酸和脂肪酸衍生物(例如脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪醇、脂肪胺等)是制造许多消费品、工业化学品和燃料的重要前体。例如，可使用脂肪酸和脂肪酸衍生物来制作洗涤剂、清洁剂、塑料、纸张、油漆、润滑剂、蜡类、涂料与表面活性剂。也可将脂肪酸和脂肪酸衍生物用作风味剂和芳香剂。目前，脂肪酸和脂肪酸衍生物以油脂化学品(植物和动物脂肪)或石油化学品为来源生产。一般来讲，源自油脂化学品的脂肪酸的脂肪链具有偶数个碳原子，而源自石油化学品的脂肪酸的脂肪链具有奇数个碳原子。
油脂化学品和石油化学品脂肪酸有明显的缺点。最值得注意的是，用于制备此类脂肪酸的原料通常包括不同碳链长度的脂肪酸的混合物，而且可包括各种不同的链长度，以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸。图1是图表，示出了各种常用油脂化学品原料的脂肪酸碳组成。然而，脂肪酸和脂肪酸衍生物的许多商业应用需要对于其脂肪链长度具有较高特异性的脂肪酸前体。例如，用C6-C10脂肪酸生产喷射润滑剂，用C12-C14脂肪酸制作表面活性剂和洗涤剂，用C16-C18脂肪酸生产金属皂。因此，当前生产脂肪酸的方法需要成本高昂的原料加工过程，例如分馏、蒸馏，才能分离出指定应用所需的脂肪酸组分。有多种技术限制约束着这类加工过程的效率以及分离出浓度较高且链长彼此不一的脂肪酸的能力。
油脂化学品和石油化学品脂肪酸的另一个缺点是，这些原料的成本会大幅波动。油脂化学品原料的价格极不稳定，可能逐年剧烈波动，在不同地理区域也可能明显不同。由于总生产成本对原料价格非常敏感，所以这种不稳定性会显著影响利润。就石油化学品脂肪酸来说，越来越多的人认识到石油烃储量正不断减少，因而，预期这种脂肪酸的成本会持续上升。
最后，愈发让人担忧的是化学工业内的可持续性，对由可再生资源生产的化学品的需求不断增长。实际上，多个化学公司及其客户已实施了可持续发展计划，目标是用由可再生资源制成的化学品替代当前的化学品，如石油基化学品。这些公司一直在努力研制可再生化学品，这些可再生化学品对产品性能或特性的影响极小，此外，对下游产品和客户的影响也微乎其微。甚至在油脂化学品工业领域，也存在可持续性问题。虽然多种油脂化学品脂肪酸源自可再生资源，但当前的行业惯例并未以可持续方式管理这些资源的采集。例如，一直以来让人倍感忧虑的是生产棕榈油(油脂化学品脂肪酸的主要来源)过程中森林遭受砍伐。
因为石油基脂肪酸、油脂基脂肪酸和脂肪酸衍生物存在这些缺点，所以，人们越来越热衷于开发并改进可利用可持续植物基原料生产化学品和燃料的工业微生物系统。这类工业微生物系统能够完全或部分地替代石油烃或油脂化学品用来生产某些化学品和产品。
可用这类微生物系统生产多种化学品，涉及的范围从抗生素、抗疟药品，到精细化学品，再到像乙醇之类的燃料。然而，对经修饰微生物仍然有商业需求，这种微生物适宜生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物，具体地讲，适宜生产具有高浓度特定脂肪酸链长的脂肪酸和脂肪酸衍生产物。
发明内容
在一个方面，本发明提供了包含异源核酸序列的经遗传修饰生物体，该异源核酸序列编码3-酮脂酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A还原酶、羟酰辅酶A脱水酶、或烯酰辅酶A还原酶；并且其中所述微生物能够生产碳链长度为C4或C4以上的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶包括NphT7。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1-120中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，酮脂酰辅酶A还原酶选自3-酮丁酰辅酶A还原酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、3-酮戊酰辅酶A还原酶以及3-羟戊酰辅酶A脱氢酶。在一些实施例中，酮脂酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO183和SEQ ID NO 271中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，羟酰辅酶A脱水酶选自3-羟丁酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶。在一些实施例中，羟酰辅酶A脱水酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 183和SEQ ID NO 272中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为反式-2-烯酰还原酶。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 275的同源性为至少70％。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶包含经修饰NphT7多肽，该经修饰NphT7多肽包含一种或多种氨基酸置换，选自将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ，F217A、F217E、F217G、F217I、F217L、F217M、F21i7P、F217S、F217T、F217V、F217W、G288S、G309S、I147A、I147C、I147D、I147E、I147F、I147G、I147H、I147K、I147L、I147M、I147N、I147P、I147Q、I147R、I147S、I147T、I147V、I147W、I147Y、V157F、V196G和Y144L。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶包含经修饰NphT7多肽，该经修饰NphT7多肽包含两种氨基酸置换，选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶包含经修饰NphT7多肽，该经修饰NphT7多肽包含三种氨基酸置换，选自Y144L、I147T和F217V；I147T、F217V和HFLQ；I147T、V147F和F217V；以及Y144L、I147T和V157F。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶包含经修饰NphT7多肽，该经修饰NphT7多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147和Phe217。在一些实施例中，酮脂酰辅酶A还原酶选自3-酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟酰辅酶A脱氢酶。在一些实施例中，酮脂酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 183和SEQ ID NO271中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，羟酰辅酶A脱水酶选自3-羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶。在一些实施例中，羟酰辅酶A脱水酶的氨基酸序列与SEQ ID NO183和SEQ ID NO 272中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为反式-2-烯酰还原酶。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 275的同源性为至少70％。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含编码硫酯酶或蜡酯合酶的异源核酸序列。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含编码终止酶的异源核酸序列，该终止酶催化生产脂肪酸衍生产物，这些产物选自脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪酰胺、脂肪烷烃和脂肪二酸。在一些实施例中，硫酯酶为酰基辅酶A酯酶，并且生物体能够产生脂肪酸。在一些实施例中，硫酯酶选自tesA、'tesA、tesB、yciA、ybgC、ybfF、fadM、AtTE、CpTE、CperfTE、LpTE和PA2801TE。在一些实施例中，硫酯酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 277、SEQID NO 278、SEQ ID NO 279、SEQ ID NO 280、SEQ ID NO 281、SEQ ID NO 282、SEQ ID NO283、SEQ ID NO 284、SEQ ID NO 285、SEQ ID NO 286、SEQ ID NO 287和SEQ ID NO 288中任一序列的同源性为至少70％。在一些实施例中，蜡酯合酶选自Maq1、Pcry1、Rjos1和Abork1，并且其中所述生物体能够产生脂肪酯。在一些实施例中，蜡酯合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 289、SEQ ID NO 290、SEQ ID NO 291和SEQ ID NO 292中任一序列的同源性为至少70％，并且其中所述生物体能够产生脂肪酯。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶为NphT7；酮基辅酶A还原酶选自hbd和fadB；3-羟酰辅酶A脱水酶选自crt和fadB；烯酰辅酶A还原酶为ter；硫酯酶选自CpTE、fadM、PA2801TE、tesB、ybgC、ybfF和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳或五碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7I147T、NphT7 F217V和NphT7 I147T F217V；酮基辅酶A还原酶为fadB；3-羟酰辅酶A脱水酶为fadB；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳或七碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V以及合酶III；酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳或九碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。在一些实施例中， 一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳或十一碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基辅酶A还原酶选自fadB、fabG和fadJ；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和fadJ；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳或十三碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基辅酶A还原酶选自fadB和fadJ；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB和fadJ；烯酰辅酶A还原酶选自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度为至少十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，硫酯酶选自fadM、tesA、tesB和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十四碳或十五碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、Pa2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十六碳或十七碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、fadM、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十六碳或十七碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，生物体能够将乙酰辅酶A用作引物，将丙二酰辅酶A用作延伸分子，产生碳链长度选自4、6、8、10、12、14、16、18和20个碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，生物体能够将丙酰辅酶A用作引物，将丙二酰辅酶A用作延伸分子，产生碳链长度选自5、7、9、11、13、15、17、19和21个碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
在一个方面，本发明提供了经修饰NphT7多肽，该经修饰NphT7多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的同源性为至少70％，并包含一种或多种氨基酸置换、缺失或插入，其中该经修饰NphT7多肽能够接受碳链长度为C4或C4以上的酰基辅酶A底物。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽能够催化缩合反应，使酰基辅酶A底物与丙二酰辅酶A缩合，产生碳链长度为C6或C6以上的3-酮脂酰辅酶A。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含一种或多种氨基酸置换，选自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及这些置换的任意组合。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含一种氨基酸置换，选自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含两种氨基酸置换，选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含三种氨基酸置换，选自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及这些位置的任意组合。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含F217V氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含两种或两种以上氨基酸置换、缺失或插入。在一些实施例中，经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换和F217V氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰多肽为分离并纯化过的。
在一个方面，本发明提供了编码本发明的经修饰NphT7多肽的分离并纯化过的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供的分离并纯化过的多核苷酸的核酸序列与SEQ ID NO:2的同源性或互补性为至少70％但不到100％或为约100％，其中这种多核苷酸编码具有一种或多种氨基酸置换的SEQ ID NO:1的经修饰NphT7多肽，其中经修饰NphT7多肽能够接受碳链长度为C4或C4以上的酰基辅酶A底物。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽能够催化缩合反应，使酰基辅酶A底物与丙二酰辅酶A缩合，产生碳链长度为C6或C6以上的3-酮脂酰辅酶A。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含一种或多种氨基酸置换，选自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及这些置换的任意组合。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含一种氨基酸置换，选自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含两种氨基酸置换，选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含三种氨基酸置换，选自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及这些位置的任意组合。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含F217V氨基酸置换。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含两种或两种以上氨基酸置换。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换和F217V氨基酸置换。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸为RNA。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸为mRNA。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸为DNA。在一些实施例中，分离并纯化过的多核苷酸为cDNA。在一些实施例中，载体包含本发明的多核苷酸。在一些实施例中，质粒包含本发明的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供了选择3-酮脂酰辅酶A合酶作为候选物，来缩合丙二酰辅酶A与碳链长度为C2以上的酰基辅酶A的方法，包括：识别氨基酸序列与SEQ ID NO:1的同源性为至少70％但不到100％或为约100％的3-酮脂酰辅酶A合酶多肽；选择3-酮脂酰辅酶A合酶作为候选物，来缩合丙二酰辅酶A与碳链长度为C2以上的酰基辅酶A，前提是这种3-酮脂酰辅酶A合酶具有选自下列的一种或多种特征：(A/G)GGSR序列基序，缺少STPDXPQ序列基序，底物结合位点中只有疏水残基。在一些实施例中，该方法包括选择至少两种3-酮脂酰辅酶A合酶，其中每种合酶III占据系统发育树的不同分枝。
在一个方面，本发明提供了利用本发明的方法选择的NphT7同源物的文库。
在一个方面，本发明提供了分离的NphT7同源物，该分离的NphT7同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO.1-120中任一序列的同源性为至少70％、但不到100％。
在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的所选3-酮脂酰辅酶A合酶。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体，该经遗传修饰生物体表达本发明的所选3-酮脂酰辅酶A合酶。
在一个方面，本发明提供了产生经遗传修饰生物体的方法，该经遗传修饰生物体表达本发明的所选3-酮脂酰辅酶A合酶，该方法包括用本发明的多核苷酸转化微生物。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体，该经遗传修饰生物体能够以超过缺少遗传修饰的对照生物体的速率或滴度，产生碳链长度为C6或C6以上的脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中该经遗传修饰生物体不包含SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123中任一序列。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含本发明的载体或质粒。在一些实施例中，用载体或质粒转化经遗传修饰生物体。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含本发明的多核苷酸。在一些实施例中，经遗传修饰生物体表达本发明的经修饰多肽和/或多核苷酸。在一些实施例中，经遗传修饰生物体表达本发明的NphT7同源物或经修饰NphT7多肽。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含异源多肽，该异源多肽能够缩合丙二酰辅酶A与碳链长度为C2以上的酰基辅酶A，产生碳链长度为C4以上的3-酮脂酰辅酶A。在一些实施例中，酰基辅酶A为乙酰辅酶A，并且3-酮脂酰辅酶A为3-酮丁酰辅酶A。在一些实施例中，酰基辅酶A为乙酰辅酶A，并且3-酮脂酰辅酶A为3-酮丁酰辅酶A。在一些实施例中，酰基辅酶A为丙酰辅酶A，并且3-酮脂酰辅酶A为3-酮戊酰辅酶A。在一些实施例中，经遗传修饰生物体能够产生碳链长度为C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20或C20以上，且纯度高于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，经遗传修饰生物体能够以约0.1g/gDCW*h、约0.2g/gDCW*h或更大的速率产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于增大酰基辅酶A的产生速率。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于增大丙二酰辅酶A的产生速率。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于抑制丙二酰ACP脂肪酸合成途径。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于降低丙二酰辅酶A向丙二酰ACP的转化。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于减慢丙二酰ACP与乙酰ACP缩合的速率。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含一种或多种额外的遗传修饰，用于完全或部分地抑制选自下列的一种或多种反应：葡萄糖向甲基乙二醛转化、丙酮酸盐向乳酸盐转化、乙酰辅酶A向乙酸盐转化、乙酰辅酶A向乙醇转化、脂肪酰辅酶A向乙酰辅酶A转化，以及这些反应的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含编码3-酮脂酰辅酶A合酶的多核苷酸，该3-酮脂酰辅酶A合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1-120中任一序列的同源性为至少70％但不到100％，或为约100％。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源多肽，选自酮基辅酶A还原酶(KCR)、3-羟酰辅酶A脱水酶(3HDh)、烯酰辅酶A还原酶(EnCR)、硫酯酶，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源KCR，选自fadB、fabG、fadJ、ech2、PhaB、PaFabG，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3HDh，选自fadB、fadJ、ech、ech2、crt，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源EnCR，选自ter、ccr、fadE、ydiO，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源硫酯酶，选自yciA、PA2801TE、ATTE、YbgC、tesA、YbfF、fadM、LpTE、CpTE(或CperfTE)，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7，以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：异源fadB；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、yciA、PA2801TE和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fabG；一种或多种异源3HDh，选自fadB、ech和ech2；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、yciA、PA2801TE和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fabG；一种或多种异源3HDh，选自fadB、ech和ech2；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、ATTE、YbgC和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB、fabG、fadJ和它们的任意组合；一种或多种异源3HDh，选自fadB、fadJ、ech和它们的任意组合；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、ybgC、ybFF和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fadJ；一种或多种异源3HDh，选自fadB和fadJ；一种或多种异源EnCR，选自ter、ydiO和fadE；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、fadM和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于降低选自下列的一种或多种内源多肽的活性：KCR、hbd、烯酰辅酶A还原酶、硫酯酶，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，用于降低一种或多种温度敏感性内源多肽的活性。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一个或多个载体，所述载体编码本发明的第二遗传修饰。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含异源转运体，该异源转运体可转运碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸穿过细胞膜。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含异源转运体，该异源转运体为ABC转运体。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含脂肪酸衍生产物，该脂肪酸衍生产物为脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪酰胺、脂肪酯、脂肪烷烃或脂肪二酸。在一些实施例中，一种或多种硫酯酶被完全或部分敲除，所述硫酯酶选自tesB、YciA、AtTE、CpTE和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为分离并纯化过的。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体具有选自下列的遗传修饰：F-、Δ(araD-araB)567、ΔlacZ4787(::rrnB-3)、LAM-、rph-1、Δ(rhaD-rhaB)568、hsdR514、ΔldhA::frt、ΔpflB::frt、ΔmgsA::frt、ΔpoxB::frt、Δpta-ack::frt、fabI(ts)-(S241F)-zeoR、Δtig::frt、ΔatoDAEB::frt和ΔfadD::frt；以及额外的遗传修饰，用于增强从辅酶A底物合成脂肪酸。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含宿主基因缺失，其中该缺失导致丙二酰辅酶A产量增加。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含选自下列的一个或多个基因的缺失：乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酮酸氧化酶基因、磷酸转乙酰酶基因、乙酸激酶基因、双功能乙酰辅酶A还原酶/乙醇脱氢酶基因，以及这些基因的任意组合。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰与选自下列的一种或多种酶有关：ACP、fabI、fabB、fabH、fabD、fabF、fabG、fabA、fabZ、fabR，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰与选自下列的一种或多种酶有关：udhA、pntAB、PDH、CoAA、panD、aceA、aceB、aceK、GAPDH、pyk、pyk、gltA、CS、bicA、GOGAT、gdh、can、cynT、cynS、puuC、aldA、aldB、yieP、yibD、pstS、BAAT、rhtA、mdtM、yddG、yebS、yeeO、dedA、ycaP、ytfL、ybbP、yegH、ykgH、ytfF、eamB、ydhP、ypjD、mdlB、acrD、ydcO、emrD、citT、citS、citM、citH，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰生物体还包含与乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)有关的额外遗传修饰。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰与选自下列的一种或多种酶有关：cscA、cscB、cscK、galP、galKf，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰与选自下列的一种或多种酶有关：fadE、fadD、fadA、fadB、fadI、fadJ、ydiO、paaJ、yqeF、tig、atoD、atoA、atoE、atoB，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰与选自下列的一种或多种酶有关：NphT7、SaFabH、BsFabH、PaFabH、MtFabH、FabH、PaFabG、fabG、hbd、crt、ech、ech2、ter、ccr，以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含引起异源硫酯酶表达的额外遗传修饰。在一些实施例中，受任一权利要求保护的经遗传修饰生物体包含一种或多种异源硫酯酶，选自tesA、'tesA、tesB、yciA、ybgC、ybfF、fadM、AtTE、CpTE(或CperfTE)、LpTE、Pa2801TE以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含引起异源蜡酯合酶表达的额外遗传修饰。在一些实施例中，经遗传修饰生物体包含一种或多种异源蜡酯合酶，选自Maq1、Pcry1、Rjos1、Abork1以及这些酶的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体还包含额外的遗传修饰，这种额外的遗传修饰引起选自下列的一种或多种异源蛋白质的表达：prpE、phaA、phaB、phaC、THNS、THNS"和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为微生物。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为大肠杆菌(E.Coli)。
在一个方面，本发明提供了由丙二酰辅酶A生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括用碳进料源培养经转化微生物，从而产生游离脂肪酸。
在一个方面，本发明提供了由丙二酰辅酶A生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：诱导微生物表达多肽；然后用碳进料源培养经转化微生物，从而产生游离脂肪酸。
在一个方面，本发明提供了由丙二酰辅酶A生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：提供经遗传修饰微生物；然后用碳进料源培养经转化微生物，从而产生游离脂肪酸。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以增加酰基辅酶A和丙二酰辅酶A产量的条件下培养。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以让丙二酰辅酶A与碳链长度为C2或C2以上的酰基辅酶A缩合的条件下培养，从而缩合得到链长为C6或C6以上的酮脂酰辅酶A产物。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以还原碳链长度为C6或C6以上的酮脂酰辅酶A产物中的酮基的条件下培养，从而产生碳链长度为C6或C6以上的羟脂酰辅酶A产物。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以让碳链长度为C6或C6以上的羟脂酰辅酶A产物与脱水酶反应的条件下培养，从而产生碳链长度为C6或C6以上的烯脂酰辅酶A产物。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以还原碳链长度为C6或C6以上的烯脂酰辅酶A产物的烯酰基团的条件下培养，从而产生碳链长度为C6或C6以上的酰基辅酶A产物。
在一个方面，本发明提供了生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸的方法，包括：将微生物置于足以从碳链长度为C6或C6以上的酰基辅酶A产物移除辅酶A基团的条件下培养，从而产生碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
在一个方面，本发明提供了由丙二酰辅酶A生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方法，包括：将经遗传修饰生物体置于足以增加酰基辅酶A和丙二酰辅酶A产量的条件下培养，在经遗传修饰生物体中缩合酰基辅酶A和丙二酰辅酶A，产生碳链长度为C6或C6以上的酮脂酰辅酶A产物；还原酮脂酰辅酶A产物中的酮基，产生碳链长度为C6或C6以上的羟脂酰辅酶A产物；让羟脂酰辅酶A产物与脱水酶反应，产生碳链长度为C6或C6以上的烯脂酰辅酶A产物；还原烯脂酰辅酶A产物的烯酰基团，产生碳链长度为C6或C6以上的酰基辅酶A产物；以及从酰基辅酶A产物移除辅酶A基团，得到碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C6或C6以上的碳链长度。在一些实施例中，该方法包括培养经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7，以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：异源fadB；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自yciA和PA2801TE。在一些实施例中，经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C8或C8以上的碳链长度。在一些实施例中，该方法还包括培养经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fabG；一种或多种异源3HDh，选自fadB、ech和ech2；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、yciA、PA2801TE和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C10或C10以上的碳链长度。在一些实施例中，该方法还包括培养经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fabG；一种或多种异源3HDh，选自fadB、ech和ech2；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、ATTE、YbgC和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C12的碳链长度。在一些实施例中，该方法还包括培养经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB、fabG、fadJ和它们的任意组合；一种或多种异源3HDh，选自fadB、fadJ、ech和它们的任意组合；异源ter；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、ybgC、ybFF和它们的任意组合。在一些实施例中，经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸的至少50％、60％、70％、80％或90％具有C14或C16的碳链长度。在一些实施例中，该方法还包括培养经遗传修饰生物体，这种经遗传修饰生物体包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，选自野生型NphT7、具有I147T突变的NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及这些酶的任意组合；此外，还包含下列酶中的至少一种：一种或多种异源KCR，选自fadB和fadJ；一种或多种异源3HDh，选自fadB和fadJ；一种或多种异源EnCR，选自ter、ydiO和fadE；和/或一种或多种硫酯酶，选自tesA、fadM和它们的任意组合。在一些实施例中，该方法还包括含有多个反应的循环，其中该循环包括的反应采用了NphT7、KCR、3HDh和EnCR，其中执行了至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个循环，并且NphT7、KCR、3HDh和/或EnCR中的至少一者经修饰。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体产生的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
在一个方面，本发明提供了利用本发明的方法产生的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，脂肪酸衍生产物为脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪烷烃或脂肪二酸，这些产物中的每一种为取代或未取代的。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体用于产生碳链长度为C6或C6以上的脂肪酸的用途。
在一个方面，本发明提供了用于生产碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物的系统，该系统包括：一种或多种经遗传修饰生物体和/或经修饰多肽；以及培养箱，该培养箱被构造成用于培养一种或多种经遗传修饰生物体。在一些实施例中，该系统包括培养基，培养基包含碳进料源。在一些实施例中，该系统包括纯化系统，用于纯化游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统包括经遗传修饰生物体的至少两种菌株。在一些实施例中，该系统包括经遗传修饰生物体的至少三种菌株。在一些实施例中，该系统能够以约5g/L、约10g/L或更大的滴度产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统能够以约0.5g/L或更大的浓度产生碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统能够以约0.7g/L或更大的浓度产生碳链长度为C12的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统能够以约0.7g/L或更大的浓度产生碳链长度为C14的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统能够以约0.8g/L或更大的浓度产生碳链长度为C16的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统能够以约0.125g/g、约0.16g/g或更大的收率产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，该系统还包括混合装置。在一些实施例中，该系统还包括加热装置，其中培养箱包括加热装置。在一些实施例中，该系统还包括贮存器。在一些实施例中，该系统还包括泵。在一些实施例中，该系统的贮存器可操作地连接到培养箱，并且其中泵被可操作地构造成将材料从贮存器泵送至培养箱。在一些实施例中，该系统还包括裂解装置。在一些实施例中，该系统还包括提取装置。在一些实施例中，该系统还包括蒸馏装置。
在一个方面，本发明提供了经遗传修饰生物体，所述经遗传修饰生物体为梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、破囊壶菌(Thraustochytrids)、噬菌体或酵母属(Saccharomyces)。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为原核细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为真核细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为酵母细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为细菌细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为真菌细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为微藻类细胞。在一些实施例中，经遗传修饰生物体为藻类细胞。
在一个方面，本发明提供的碳源包括C6碳源。在一些实施例中，碳源包括C3碳源。在一些实施例中，碳源包括一种或多种纤维素糖。在一些实施例中，碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋葡萄糖、乳糖、木糖，或这些物质的任意组合。在一些实施例中，碳源包含按质量计小于约50％、40％、30％、20％、10％或5％甘油。
在一个方面，本发明提供了包含经遗传修饰生物体的生物质。在一些实施例中，生物质包含裂解的经遗传修饰生物体。在一些实施例中，生物质包含经修饰NphT7多肽。在一些实施例中，生物质包含经修饰多肽。在一些实施例中，生物质包含多核苷酸。在一些实施例中，生物质包含游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，生物质为脱水的。
在一个方面，本发明提供了包含经遗传修饰生物体的发酵液。在一个方面，本发明提供了包含裂解的经遗传修饰生物体的发酵液。在一个方面，本发明提供了包含经修饰NphT7多肽的发酵液。在一个方面，本发明提供了包含经修饰多肽的发酵液。在一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的发酵液。在一个方面，本发明提供了包含本发明的游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物的发酵液。
在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，该酰基辅酶A产物包含按质量计约15％至50％的碳链长度为C4的酰基辅酶A。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，该酰基辅酶A产物包含按质量计约40％至50％的碳链长度为C6的酰基辅酶A。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，该酰基辅酶A产物包含按质量计约5％至30％的碳链长度为C8的酰基辅酶A。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，该酰基辅酶A产物包含按质量计约1％至20％的碳链长度为C12的酰基辅酶A。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，其中碳链长度为C4的酰基辅酶A、碳链长度为C6的酰基辅酶A、碳链长度为C8的酰基辅酶A与碳链长度为C12的酰基辅酶A的质量比为约2:4:2:1。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，其中碳链长度为C4的酰基辅酶A、碳链长度为C6的酰基辅酶A与碳链长度为C8的酰基辅酶A的质量比为约7:8:1。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，其中碳链长度为C4的酰基辅酶A、碳链长度为C6的酰基辅酶A、碳链长度为C8的酰基辅酶A与碳链长度为C12的酰基辅酶A的质量比为约2:1:1:1。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物，其中碳链长度为C4的酰基辅酶A、碳链长度为C6的酰基辅酶A、碳链长度为C8的酰基辅酶A与碳链长度为C12的酰基辅酶A的质量比为约8:2:3:1。在一些实施例中，酰基辅酶A产物选自3-酮脂酰辅酶A、3-羟酰辅酶A和烯酰辅酶A。
在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约15％至50％的碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约40％至50％的碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约5％至30％的碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约1％至20％的碳链长度为C12的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物与碳链长度为C12的酰基辅酶A的质量比为约2:4:2:1。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物与碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的质量比为约7:8:1。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物与碳链长度为C12的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的质量比为约2:1:1:1。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物与碳链长度为C12的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的质量比为约8:2:3:1。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约16％或16％以上的碳链长度为C14的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约20％或20％以上的碳链长度为C16的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约36％或36％以上的碳链长度为C14或C16的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其包含按质量计约60％或60％以上的碳链长度为C14或C16的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一个方面，本发明提供了游离脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中碳链长度为C4的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C6的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C8的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C10的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C12的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C14的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳链长度为C16的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物与碳链长度为C18的游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的质量比为约10:20:12:7:8:16:20:7，或为约1:2:1:1:1:2:2:1。在一个方面，本发明提供了酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物，这些产物都是分离并纯化过的。
在一个方面，本发明提供了生产选自下列的一种或多种脂肪酸衍生产物的方法：脂肪酯、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪烷烃、脂肪二酸和它们的任意组合；该方法包括：让碳源与微生物接触，形成碳链长度为C6或C6以上的游离脂肪酸；将这种游离脂肪酸转化成脂肪酸衍生产物，其中脂肪酸衍生产物具有C6或C6以上的碳链长度。在一个方面，本发明提供了生产脂肪酸酯的方法，该方法包括将经遗传修饰生物体产生的脂肪酸酯化。在一个方面，本发明提供了生产脂肪酸酰胺的方法，该方法包括形成本发明的经遗传修饰生物体所产生脂肪酸的酰胺。在一个方面，本发明提供了生产脂肪醇的方法，该方法包括由本发明的经遗传修饰生物体所产生的脂肪酸形成脂肪醇。在一个方面，本发明提供了生产脂肪酸醛的方法，该方法包括形成本发明的经遗传修饰生物体所产生脂肪酸的醛。
在一个方面，本发明提供了燃料，该燃料包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了洗剂，该洗剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了肥皂，该肥皂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了食品，该食品包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了霜膏，该霜膏包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了洗发剂，该洗发剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了调理剂，该调理剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了清洁剂，该清洁剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了洗涤剂，该洗涤剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了润滑剂，该润滑剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了油漆，该油漆包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了染色剂，该染色剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了油墨，该油墨包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一个方面，本发明提供了药物制剂，该药物制剂包含本发明的酰基辅酶A产物、游离脂肪酸产物或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，产物还包含一种或多种活性剂。在一些实施例中，产物还包含赋形剂。
在一个方面，本发明提供了一种或多种分离并纯化过的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子编码下列蛋白质：乙酰乙酰辅酶A合酶、酮基辅酶A还原酶、3-羟酰辅酶A脱水酶、烯酰辅酶A还原酶和硫酯酶；其中3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V和合酶VI；酮基辅酶A还原酶选自hbd、fadB、fabG和fadJ；3-羟酰辅酶A脱水酶选自crt、ech、fadB和fadJ；烯酰辅酶A还原酶选自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶为NphT7；酮基辅酶A还原酶选自hbd和fadB；3-羟酰辅酶A脱水酶选自crt和fadB；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶为yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA。在一些实施例中，3-酮脂酰辅酶A合酶为NphT7，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶选自hbd和fadB，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶选自crt和fadB，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为ter，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自CpTE、fadM、PA2801TE、tesB、ybgC、ybfF和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V以及NphT7I147T F217V；酮基辅酶A还原酶为fadB；3-羟酰辅酶A脱水酶为fadB；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V以及NphT7 I147T与F217V，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶为fadB，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶为fadB，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为ter，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V以及合酶III；并且酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V以及合酶III，并且由其中所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为ter，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7I147S与F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为ter，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基辅酶A还原酶选自fadB、fabG和fadJ；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和fadJ；烯酰辅酶A还原酶为ter；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶选自fadB、fabG和fadJ，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和fadJ，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶为ter，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基辅酶A还原酶选自fadB和fadJ；3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB和fadJ；烯酰辅酶A还原酶选自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度为至少十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，硫酯酶选自fadM、tesA、tesB和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、Pa2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、fadM、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7 I147T与F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S与F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度大于或等于十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，酮基辅酶A还原酶选自fadB和fadJ，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度大于或等于十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB和fadJ，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度大于或等于十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，烯酰辅酶A还原酶选自ter、ydiO和fadE，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度大于或等于十四个碳的脂肪酸。在一些实施例中，硫酯酶选自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生碳链长度大于或等于十四个碳的脂肪酸。
在一个方面，本发明提供了一种或多种分离并纯化过的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子编码多种蛋白质，包括来自选自下列的物种的3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III：潮汐别样希瓦氏菌(Alishewanella aestuarii)B11、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)ED-1、梭菌目(Clostridiales)细菌1_7_47_FAA、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter oboediens)174Bp2、爱知戈登氏菌(Gordonia aichiensis)NBRC108223、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种STM 4661、Pelosinus fermentans DSM17108、加利西亚褐色杆菌(Phaeobacter gallaeciensis)2.10、青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)Po82、运青糖单孢菌(Saccharomonospora azurea)NA-128、青色糖单孢菌(Saccharomonospora glauca)K62以及海洋疣孢菌(Verrucosispora maris)AB-18-032，其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生脂肪酸。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：Pelosinus fermentans DSM 17108、青色糖单孢菌K62、海洋疣孢菌AB-18-032以及梭菌目细菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生乙酰辅酶A。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：青色糖单孢菌K62、运青糖单孢菌NA-128、中慢生根瘤菌属物种STM 4661以及梭菌目细菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：爱知戈登氏菌NBRC 108223、布氏弓形杆菌ED-1、梭菌目细菌1_7_47_FAA、青色糖单孢菌K62以及青枯劳尔氏菌Po82，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：爱知戈登氏菌NBRC 108223、木葡糖酸醋杆菌174Bp2、布氏弓形杆菌ED-1、青枯劳尔氏菌Po82以及加利西亚褐色杆菌2.10，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自潮汐别样希瓦氏菌B11，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生产物。在一些实施例中，由所述多核苷酸编码的蛋白质还包括来自链霉菌属(菌株CL190)的3-酮脂酰辅酶A合酶。
以引用方式并入此案
本文的所有出版物、专利和专利申请按等同程度以引用方式并入本文，如同明确指明每篇出版物、专利或专利申请都独立地以引用方式并入。如果本文的术语和并入供参考的文献的术语有冲突，以本文的术语为准。
附图说明
图1是图表，示出了用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的油脂化学品原料中的碳链长度分布。
图2是示意图，示出了本发明的多种完整生物生产途径，并提供了多种碳源向C10脂肪酸或C10脂肪酯转化的代表性例子。
图3是示意图，示出了将乙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为偶数的脂肪酸的流程。
图4是示意图，示出了将乙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为偶数的脂肪酸酯的流程。
图5是示意图，示出了将丙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为奇数的脂肪酸的流程。
图6是示意图，示出了将丙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为奇数的脂肪酸酯的流程。
图7至图14为根据本发明的一系列不同反应途径。
图15为条形图，示出了用NphT7变体和NphT7突变体产生的酰基辅酶A产物的浓度，其中NphT7变体和NphT7突变体(100μg，30min测定法)在存在羟酰辅酶A还原酶PaFabG时，作用于丙二酰辅酶A和C4-、C6-或C10-辅酶A，产生对应的C6-、C8-和C12-羟酰辅酶A。
图16为条形图，示出了硫酯酶对不同碳链长度的酰基辅酶A底物的活性。
图17为条形图，示出了不同细菌菌株产生C8-C18游离脂肪酸的速率。
图18为条形图，示出了不同细菌菌株产生C6-C18游离脂肪酸的滴度。
图19为饼形图，示出了菌株样品3产生的游离脂肪酸的链长度特异性分布。
图20为条形图，示出了不同3HDh的链长度特异性偏好。
图21为坐标图，示出了根据本发明、利用多种微生物产生的脂肪酸碳链长度分布。
图22包括一系列饼形图，示出了根据本发明、利用多种微生物产生的脂肪酸碳链长度分布。
图23为条形图，示出了根据本发明、利用多种经遗传修饰微生物产生的C4、C6和C8游离脂肪酸的量。
图24为条形图，示出了根据本发明、利用多种经遗传修饰微生物产生的总脂肪酸(C4-C18)的量。
图25包括一系列饼形图，示出了根据本发明、利用多种经遗传修饰微生物产生的游离脂肪酸的分布。
图26示出了包括四个步骤的脂肪酸途径，其利用的途径与细菌利用的II型脂肪酸合成(FAS)系统类似。图26示出了这两种脂肪酸合成途径。A.在步骤1中，3-酮脂酰辅酶A合酶催化酰基辅酶A(或在链延伸开始步骤时，乙酰辅酶A)与丙二酰辅酶A缩合，产生β-酮脂酰辅酶A。在后续步骤中，β-酮脂酰辅酶A被β-酮脂酰辅酶A还原酶还原(步骤2)、在β-羟酰辅酶A脱水酶作用下脱水(步骤3)，最后被烯酰辅酶A还原酶还原(步骤4)。让反应重复进行，每循环一次向酰基辅酶A链添加两个碳。(B)II型FAS系统由β-酮脂酰ACP合酶(KASIII)引发脂肪酸合成(步骤1a)，其中β-酮脂酰ACP合酶(KASIII)催化乙酰辅酶A与丙二酰ACP缩合，产生β-酮脂酰ACP。在后续步骤中，β-酮脂酰ACP经历还原(步骤2)、脱水(步骤3)，以及与辅酶A特异性途径类似的还原(步骤4)。进一步的延伸步骤由KASI或KASII引发(步骤1b)，其中KASI或KASII催化酰基ACP与丙二酰ACP缩合。图27示出新型辅酶A依赖性脂肪酸途径和相关的关键酶。
图27示出新型辅酶A依赖性脂肪酸途径和相关的关键酶。
具体实施方式
在本文附图、权利要求和说明书部分示出了一个或多个本发明实施例的详情。除非明确排除，否则本文公开和设想的本发明实施例的其他特征、目标和优点可与任何其他实施例结合。
本发明整体涉及多种化学产品的多种生产方法和/或可用于发酵生产多种化学产品的经遗传修饰微生物，涉及利用容器中的这类微生物的群体生产此类化学产品的方法，还涉及采用这些微生物和方法生产化学产品的系统。本发明利用这类微生物在发酵事件或发酵循环期间生产化学产品，一个好处是比生产率(specific productivity)增大。
本发明提供了生产技术和/或经遗传修饰微生物，用来生产感兴趣的化学产品，例如脂肪酸或脂肪酸衍生产物。本发明提供了一种或多种用于调节丙二酰辅酶A向脂肪酰分子转化的装置，其中生产途径包括丙二酰辅酶A依赖性途径，该丙二酰辅酶A依赖性途径包括将丙二酰辅酶A用作底物的酶转化步骤。根据某些实施例，丙二酰辅酶A依赖性途径也是丙二酰ACP非依赖性途径，可以将该途径与抑制微生物天然的丙二酰ACP依赖性脂肪酸合酶途径结合起来。根据本发明的某些其他实施例，生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方式取决于丙二酰辅酶A依赖性途径和丙二酰ACP依赖性途径。
本发明的经遗传修饰微生物被代谢改造为，增加至少部分为丙二酰辅酶A依赖性的代谢途径对丙二酰辅酶A的利用率，从而产生更多脂肪酸或脂肪酸衍生产物。脂肪酸衍生产物可包括去饱和及链支化程度各异的酯、醛、醇、烷烃、烯烃和二酸，以及由这些化学产物进一步制成的下游产物。另外，可进行遗传修饰，以产生一种或多种化学产物。
本发明还涉及经遗传工程改造的微生物，这种微生物在其中编码独特的酶和酶的组合，所述独特的酶和酶的组合在丙二酰辅酶A依赖性途径中起作用而产生特定链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。所述微生物和方法提供了有成本竞争力的手段来生产浓度相对较高的下列产物：特定链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生产物，或具有相对较窄碳链长度分布的产物(即，脂肪酸产物内的2种、3种、4种或不到5种不同碳链长度，例如C8/C10或C8/C10/C12)。
I.定义/命名
本文使用的开放术语，比如“包含”、“含有”、“包括”等，除非另外指明，都意味着“包括但不限于”。
本文的一些实施例设想了数值范围。当提供数值范围时，该范围包括范围的端点。数值范围包括其中所有的值和子范围，如同将这些值和子范围明确写出。
本文使用的冠词“一个/种”，除非另外明确指明，都意味着一个或多个/一种或多种。
本文使用的单字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V，代表自然界中合成的肽内常见的二十种氨基酸，除非另外指明。
如本文所用，除非另外指明，否则约定“第1字母数字第2字母”在应用于多肽时表示多肽内该数字位置处，具有第1字母这一单字母代码的氨基酸被具有第2字母这一单字母代码的氨基酸置换。例如，I147T意味着肽中第147位处存在的氨基酸I被氨基酸T置换。
本文使用的符号C数字，除非另外指明，都意味着碳主链的链长度为示出的碳原子数。例如，C20意味着化学主链的链长度为20个碳。应当注意，碳主链所含的碳原子数不包括附接在主链上的功能单元(例如，脂肪酸衍生产物中的功能单元)中所含的碳原子数。
本文使用“酶活性降低”、“降低酶活性”等表述来表明，微生物细胞的酶或分离得到的酶展示的活性水平低于在相同物种的可比细胞或其天然酶中测得的酶活性水平。也就是说，该酶在已知标准条件下、将指出的底物转化为指出的产物的酶活性，比天然(未修饰的)酶在指定的标准条件下发挥同一生物化学转化作用的酶活性低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。这些术语也可涵盖酶活性被消除。可采用本领域技术人员已知的多种方式降低酶活性，包括(例如)基因破坏或基因缺失。酶活性降低可能是暂时的，可通过各种遗传因子的表达来控制，或者可响应细胞的培养条件而降低。可使用本领域已知的任何方法来识别酶活性降低的细胞。例如，可使用酶活性测定法来识别酶活性降低的细胞。参见例如Enzyme Nomenclature,AcademicPress,Inc.,New York 2007(《酶命名法》，纽约学术出版社，2007年)。
本文使用“酶活性增加”、“增加酶活性”等表述来表明，微生物细胞的酶或分离得到的酶展示的活性水平高于在相同物种的可比细胞或其天然酶中测得的酶活性水平。也就是说，该酶在已知标准条件下、将指出的底物转化为指出的产物的酶活性，比天然(未修饰的)酶在指定的标准条件下发挥同一生物化学转化作用的酶活性高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。这些术语也可涵盖增加外源酶活性。酶活性增加可能是暂时的，可通过各种遗传因子的表达来控制，或者可响应细胞的培养条件而增加。可使用本领域已知的任何方法来识别酶活性增加的细胞，包括上文指出的用于识别酶活性降低的细胞的酶活性测定法。
本文使用术语“基因破坏”或其语法等同物(并包括“破坏酶功能”等)来指对微生物的遗传修饰，这种遗传修饰致使编码的基因产物的多肽活性与未这样修饰的微生物细胞中的多肽活性、或来自未这样修饰的微生物细胞的多肽活性相比降低。遗传修饰可为(例如)整个基因缺失，转录或翻译所需的调控序列缺失或该调控序列上的其他修饰，产生截短基因产物(例如酶)的基因部分缺失，或者降低所编码基因产物的活性(包括降至无法检出的活性水平)的各种突变策略中的任一种。广义的破坏可包括编码酶的核酸序列全部或部分缺失，还包括但不限于其他类型的遗传修饰，例如引入终止密码子、移码突变，引入或移除基因的一部分，以及引入降解信号，这些遗传修饰会影响mRNA转录水平和/或稳定性，并改变编码该酶的基因上游的启动子或阻遏子。
在各种语境中，“基因破坏”是指任何导致多肽活性降低的对DNA、由该DNA编码的mRNA和对应氨基酸序列的遗传修饰。可使用许多不同的方法来产生多肽活性降低的细胞。例如，可使用常用的诱变或敲除技术，将细胞改造成具有被破坏的调控序列或编码多肽的序列。参见例如Methods in Yeast Genetics(1997edition),Adams et al.,Cold SpringHarbor Press(1998)(《酵母遗传学方法》，1997年版，Adams等人，冷泉港出版社，1998年)。一种特别有用的基因破坏方法是完全缺失基因，因为这会降低或消除本发明的经遗传修饰微生物发生遗传回复。因此，破坏产物为酶的基因，就破坏了酶功能。或者，可使用反义技术来降低特定多肽的活性。例如，可将细胞改造成含有编码阻止多肽翻译的反义分子的cDNA。另外，可使用基因沉默来降低特定多肽的活性。
术语“异源的”本意包括术语“外源的”，因为本领域时常使用术语“外源的”。异源可以指宿主细胞通常不会产生的多肽和/或核酸。因此，这类异源多肽和/或核酸可包括与宿主细胞所产生蛋白质的氨基酸序列实质上没有同源性的多肽，或可包括与宿主细胞或衍生宿主细胞的细胞系所产生蛋白质实质上有同源性但不完全同源的多肽。
本文使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等，是指符合至少一种下述情况的核酸序列：(a)此核酸序列是给定宿主微生物的外来序列(也就是说，并非天然存在于给定宿主微生物中)；(b)此序列可能天然存在于给定宿主微生物中，但含量反常(例如，大于预期含量)或位置异常；或者(c)此核酸序列包含的两种或更多种子序列彼此间的关系不同于自然情况下的这种关系。例如，就情况(c)来说，重组产生的异源核酸序列将具有源自排列为产生新的功能性核酸的不相关基因的两种或更多种序列。
本文使用的术语“反义分子”，涵盖含有与内源多肽的编码链对应的序列的任何核酸分子或核酸类似物(例如肽核酸)。反义分子也可具有旁侧序列(例如调控序列)。所以，反义分子可为核糖酶或反义寡核苷酸。
本文使用的核糖酶可具有任一种一般结构，包括但不限于发夹结构、锤头结构或斧头结构，只要酶分子能切断RNA即可。
本文使用的生物生产过程可以是需氧过程、微需氧过程或厌氧过程。
本文使用的表述“充分同源”是指，与本申请提供的多种氨基酸序列(包括多个SEQID NO.或序列表)中的某一氨基酸序列相比，蛋白质或其部分的氨基酸序列包含最少数量相同或相当的氨基酸残基，使得蛋白质或其部分能够实现各自的酶反应和/或其他功能。可利用酶活性测定法(例如本领域公知的那些)来确定特定蛋白质或其部分是否充分同源。
关于序列同一性和同源性的描述和方法是示例性的，并且公认的是，这些概念是本领域熟知的。此外应当理解，核酸序列可以变化，但仍可编码显现所需功能的酶或其他多肽，而且此类变化属于本发明的范围。
此外对于核酸序列而言，“杂交”是指两种单链多核苷酸非共价结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可以指三链杂交。所得(通常情况下)双链多核苷酸为“杂交体”或“双链体”。“杂交条件”通常包括盐浓度低于约1M，更通常低于约500mM，以及低于约200mM。杂交温度可低至5℃，但通常高于22℃、更通常高于约30℃，并时常超过约37℃。杂交通常在严格条件下进行，所谓严格条件，就是探针会与其靶子序列杂交的条件。严格条件取决于序列，并在不同的情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交温度才能特异性杂交。由于其他因素(包括互补链的碱基组成和长度，存在有机溶剂，以及碱基错配的程度)可能影响杂交的严格度，所以，多个参数的组合比任一个单独参数的绝对度量更重要。一般来讲，选择的严格条件比规定了离子强度和pH值的特定序列的Tm(在该温度下，半数DNA以单链(变性)形式存在)大约低5℃。示例性严格条件包括pH值为7.0至8.3、温度至少25℃时，钠盐(或其他盐)浓度为至少0.01M、但不超过1M Na离子浓度。例如，温度为25至30℃，5XSSPE(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)这样的条件适合等位基因特异性探针杂交。要了解更多的严格条件，可参见(例如)Sambrook and Russell and Anderson“NucleicAcid Hybridization”1st Ed.,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)(Sambrook、Russell和Anderson，《核酸杂交》，第1版，BIOS科学出版社，1999年)，该文献中讲述杂交方案的章节以引用方式并入本文。“特异性杂交”、“与……特异性杂交”或类似表述是指，当一种或多种特定核苷酸序列以(例如全细胞)DNA或RNA这一复杂混合物形式存在时，分子在严格条件下显著与该特定核苷酸序列结合、与该特定核苷酸序列形成双链或与该特定核苷酸序列杂交，或者只与该特定核苷酸序列结合、只与该特定核苷酸序列形成双链或只与该特定核苷酸序列杂交。
本文使用的短语“所关注片段”包括所关注的基因和任何其他核酸序列片段。用来获得所关注片段的方法的一个例子是采集微生物的培养物，其中该微生物的基因组包含所关注的基因或核酸序列片段。
本文(包括权利要求书)在提及对基因产物(即，酶)的遗传修饰时，应当理解，这种遗传修饰是对通常编码规定基因产物(即，酶)的核酸序列(例如基因，或包括基因)的遗传修饰。
在一些实施例中，截短多肽具有编码相应天然酶的核酸序列所编码多肽全长的至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％，更具体地讲，具有编码相应天然酶的核酸序列所编码多肽全长的至少95％。所谓多肽的氨基酸序列至少与多肽的参考氨基酸序列(例如)95％“相同”，是指受权利要求书保护的多肽的氨基酸序列与该多肽的参考氨基酸序列的每一百个氨基酸只有不超过五个氨基酸发生改变，除此之外都与参考序列相同。换句话讲，要获得氨基酸序列至少与参考氨基酸序列95％相同的多肽，可使参考序列中不超过5％的氨基酸残基缺失、或可将参考序列中不超过5％的氨基酸残基置换为另一种氨基酸，或者可将数量不超过参考序列中氨基酸残基总数5％的氨基酸插入参考序列。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这两个末端位置间的任意位置，要么散布在参考序列的多个残基处，要么以连续成组的形式分布于参考序列内一段或多段位置。在其他实施例中，截短幅度可更大，本文在其他章节讲述这一点。
根据微生物学领域技术人员熟悉的分类法识别菌种和其他系统发育标志。
如果本文所述的方法和步骤表示按某种顺序发生的某些事件，则本领域的普通技术人员会认识到，他们可以依据本发明的变型形式，更改某些步骤的顺序。另外，除可循序执行某些步骤外，如果有条件，还可平行执行这些步骤。
缩写的意义如下：“℃”代表摄氏度，其用法清楚表明这一点；DCW代表干细胞重量；“s”代表秒；“min”代表分钟；“h”或“hr”代表小时；“psi”代表磅每平方英寸；“nm”代表纳米；“d”代表日；“μL”、“uL”或“ul”代表微升；“mL”代表毫升；“L”代表升；“mm”代表毫米；“nm”代表纳米；“mM”代表毫摩尔浓度；“μM”或“uM”代表微摩尔浓度；“M”代表摩尔浓度；“mmol”代表毫摩尔；“μmol”或“uMol”代表微摩尔；“g”代表克；“μg”或“ug”代表微克；“ng”代表纳克；“PCR”代表聚合酶链反应；“OD”代表光密度；“OD600”代表在600nm光子波长处测得的光密度；“kDa”代表千道尔顿；“g”代表万有引力常数；“bp”代表碱基对；“kbp”代表千碱基对；“％w/v”代表重量体积百分比；“％v/v”代表体积体积百分比；“IPTG”代表异丙基-μ-D-硫代半乳糖吡喃糖苷；“RBS”代表核糖体结合位点；“rpm”代表每分钟转数；“HPLC”代表高效液相色谱法；“UPLC”代表超高效液相色谱法；“GC”代表气相色谱法。
所谓“调节手段”，是指以下任一项：1)在微生物细胞中提供至少一种多核苷酸，其编码至少一种具有特定酶活性的多肽，其中这样编码的多肽的酶活性为以下三种情况中的任一种：(a)外源酶活性，(b)天然酶活性，但比天然形式多肽的酶活性低或高(例如，由于存在突变和/或启动子置换等)，或(c)在发酵过程中任意时刻经调节而具有降低或增大的酶活性(例如，凭借温度敏感性启动子、诱导型启动子等)；或者2)向装有微生物细胞或微生物细胞群体的容器中添加抑制剂，用以抑制酶活性；或添加补充剂，用以增大酶活性。这些调节手段可彼此结合提供。
本文提及“合酶III”、“合酶IV”、“合酶V”和“合酶VI”(表中FASTA标头项下特定酶序列名称这一语境中除外)，分别是指一组合酶中包括的第三种、第四种、第五种和第六种合酶。合酶III、合酶IV、合酶V和合酶VI可为本文公开的任一种3-酮脂酰辅酶A合酶。例如，本文提及包含异源核酸序列的经遗传修饰生物体，其中异源核酸序列编码选自合酶III和合酶IV的3-酮脂酰辅酶A合酶，是指下述任一种生物体：(1)包含编码至少三种3-酮脂酰辅酶A合酶的异源核酸序列的经遗传修饰生物体，其中这些3-酮脂酰辅酶A合酶中至少有一种为本文公开的3-酮脂酰辅酶A合酶；或者(2)包含编码至少四种3-酮脂酰辅酶A合酶的异源核酸序列的经遗传修饰生物体，其中这些3-酮脂酰辅酶A合酶中至少有一种为本文公开的3-酮脂酰辅酶A合酶。
II.本发明的生物生产途径
A.辅酶A依赖性途径
本发明涉及包括四个步骤的脂肪酸途径，其所利用的途径与细菌利用的II型脂肪酸合成(FAS)系统类似。下文的方案1示出了这两种脂肪酸合成。如描绘方案1的图26所示，这两种途径都是涉及下述步骤的循环过程：1)酰基链缩合，2)缩合产物还原，3)脱水，4)还原产生链长增加两个碳原子的酰基链；该过程重复进行，每循环一次向酰基链添加两个碳。考虑到这两种过程类似，II型FAS系统用到的大多数酶也可以在推荐使用的脂肪酸途径中发挥作用。然而，涉及酰基部分链延伸的关键步骤截然不同。根据本发明，推荐使用的脂肪酸途径的缩合步骤特别采用了酮脂酰辅酶A合酶，来催化酰基辅酶A与丙二酰辅酶A缩合；而II型FAS系统则利用酮脂酰ACP合酶，来催化酰基ACP与丙二酰ACP缩合。以前就知道，这种辅酶A依赖性途径可延伸碳链，得到较长的脂肪酸链长度(例如，延伸到C14至C16，或更长)。然而根据本发明，申请人发现了一些新型经遗传修饰微生物，它们能够经由方案1A示出的延伸途径生产脂肪酸，还能够经由该途径延伸得到较短的碳链长度(例如，延伸得到C4至C6、C6至C8、C8至C10、C10至C12、C12至C14)。(应当注意，β-酮脂酰和3-酮脂酰是同义词。)
图27示出了新型辅酶A依赖性脂肪酸途径和相关的关键酶，用于生产C6脂肪酸。本领域的技术人员会认识到，该途径本质上是循环进行的；其中在每个循环期间都添加丙二酰辅酶A，直到获得所需碳链长度。错误！未找到引用源。至图6进一步说明该新型途径本质上是循环进行的。错误！未找到引用源。示出了将乙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为偶数的脂肪酸的流程。0示出了将乙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为偶数的脂肪酸酯的流程。图5示出了将丙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为奇数的脂肪酸的流程。图6示出了将丙酰辅酶A用作引物并将丙二酰辅酶A(MCA)用作延伸分子，来生产链长为奇数的脂肪酸酯的流程。
根据本发明，生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方式至少部分取决于丙二酰辅酶A依赖性途径。根据某些实施例，丙二酰辅酶A依赖性途径也是丙二酰ACP非依赖性脂肪酸生产途径，可以将该途径与抑制微生物的丙二酰ACP依赖性脂肪酸合酶途径结合起来。根据本发明的某些其他实施例，经由部分为丙二酰辅酶A依赖性、部分为丙二酰ACP依赖性的微生物途径来生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物。根据本发明的某些其他实施例，丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A经由辅酶A依赖性途径反应，由该反应引发微生物途径，继而生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
参见图7至图14，示出了各种丙二酰辅酶A依赖性途径的例子。示出的途径是生产碳链长度为4、6、8或10的脂肪酸或脂肪酸酯的例子。本领域的技术人员会认识到，鉴于这些途径本质上是循环进行的，所以可延长这些途径，绘出更长的碳链长度。根据本发明，提供的经遗传修饰微生物包含各种酶组合，用于确定：(1)由该生物体产生的碳链长度，以及(2)途径依赖辅酶A或依赖辅酶A和ACP两者的程度。此外，如果将引发图7错误！未找到引用源。至图14所示途径的乙酰辅酶A前体变成丙酰辅酶A，则经由这些途径产生的会是碳链长度为奇数(即，5、7、9或11)的脂肪酸或脂肪酸酯。
III.对微生物的遗传修饰
本发明提供了经遗传修饰微生物，其中的遗传修饰使微生物能够至少部分经由丙二酰辅酶A依赖性途径产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，并且/或者可改善微生物至少部分经由丙二酰辅酶A依赖性途径产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的能力。丙二酰辅酶A依赖性途径可能与丙二酰ACP途径相互独立，也可与丙二酰ACP途径相结合。
一般来讲，本文所述的经遗传修饰生物体可为梭菌属、发酵单胞菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、破囊壶菌、噬菌体、酵母属；可为原核细胞；可为真核细胞；并且/或者可为细菌、酵母、真菌、微藻类细胞或藻类细胞。经遗传修饰生物体优选大肠杆菌。
本发明设想的遗传修饰包括增强生物体在本文设想的辅酶A依赖性脂肪酸途径的三个阶段中的功能，这三个阶段分别为：(1)引发脂肪酸途径；(2)延长(或延伸)链长度；以及(3)一旦获得需要的链长度，便终止该过程。图7至图14举例说明了这三个阶段。
A.用来驱动第一阶段(反应引发阶段)的遗传修饰
丙二酰辅酶A依赖性途径的第一阶段为反应引发阶段。用来产生链长为偶数的脂肪酸产物的反应由乙酰辅酶A+丙二酰辅酶A向3-酮丁酰辅酶A转化来引发。该转化过程需要合酶，即酮丁酰辅酶A合酶。如图7所示，酮丁酰辅酶A在三种酶作用下转化为丁酰辅酶A，反应引发阶段即告完成，这三种酶分别是：酮脂酰辅酶A还原酶(“KCR”)、羟酰辅酶A脱水酶(“3HDh”)和烯酰辅酶A还原酶(“EnCr”)。用来产生链长为奇数的脂肪酸产物的反应，引发阶段为丙酰辅酶A+丙二酰辅酶A向3-酮戊酰辅酶A转化，后续在KCR、3HDh和EnCr催化下还原并脱水。因此，本发明的经遗传修饰微生物包含其中编码的提供这些功能的天然酶或外源酶。
(1)第一阶段(反应引发阶段)―合酶
根据本发明的一个方面，用NphT7这种来自链霉菌属菌株CL190的3-酮脂酰辅酶A合酶充当酮丁酰辅酶A合酶，来引发脂肪酸合成，途径为催化乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合，得到3-酮丁酰辅酶A，再还原→脱水→还原为丁酰辅酶A(C4辅酶A)。根据本发明的一个方面，用NphT7充当3-酮戊酰辅酶A合酶，来引发脂肪酸合成，途径为催化丙酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合，得到3-酮戊酰辅酶A，再还原→脱水→还原为戊酰辅酶A(C5辅酶A)。下文提供了NphT7的蛋白质序列(BAJ10048.1GI:299758082)及其核苷酸序列(AB540131.1GI:299758081)(分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2)。
SEQ ID NO:1
MTDVRFRIIGTGAYVPERIVSNDEVGAPAGVDDDWITRKTGIRQRRWAADDQATSDLATAAGRAALKAAGITPEQLTVIAVATSTPDRPQPPTAAYVQHHLGATGTAAFDVNAVCSGTVFALSSVAGTLVYRGGYALVIGADLYSRILNPADRKTVVLFGDGAGAMVLGPTSTGTGPIVRRVALHTFGGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMDGREVRRFVTEHLPQLIKGFLHEAGVDAADISHFVPHQANGVMLDEVFGELHLPRATMHRTVETYGNTGAASIPITMDAAVRAGSFRPGELVLLAGFGGGMAASFALIEW
SEQ ID NO:2
在一些实施例中，本发明的3-酮丁酰辅酶A合酶是蛋白质序列为SEQ ID NO.1-120中任一序列的合酶(如下表1所示)的同源物。在一些实施例中，本发明的3-酮丁酰辅酶A合酶是氨基酸序列与SEQ ID NO.1-120中任一序列的同源性为至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约96％、约98％或约99％、但不到100％或为约100％的3-酮脂酰辅酶A合酶。在一些实施例中，本文的方法包括选择至少两种3-酮脂酰辅酶A合酶，其中每种合酶占据系统发育树的不同分枝。在一个方面，本发明提供了利用本文的方法选择的NphT7同源物的文库。
在一些实施例中，本发明的3-酮戊酰辅酶A合酶是蛋白质序列为SEQ ID NO.1-120中任一序列的合酶(如下表1所示)的同源物。在一些实施例中，本发明的3-酮戊酰辅酶A合酶是氨基酸序列与SEQ ID NO.1-120中任一序列的同源性为至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约96％、约98％或约99％、但不到100％或为约100％的3-酮脂酰辅酶A合酶。在一些实施例中，本文的方法包括选择至少两种3-酮脂酰辅酶A合酶，其中每种合酶占据系统发育树的不同分枝。在一个方面，本发明提供了利用本文的方法选择的本文NphT7同源物的文库。
表1：合酶序列
(2)第一阶段(反应引发阶段)―酮脂酰辅酶A还原酶、3-羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A 还原酶
如上文所指出，3-酮丁酰辅酶A在三种酶作用下转化为丁酰辅酶A，用来产生链长为偶数的脂肪酸产物的反应的引发阶段即告完成，这三种酶分别是：酮脂酰辅酶A还原酶、羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A还原酶。就该阶段来说，酮脂酰辅酶A还原酶可选自3-酮丁酰辅酶A还原酶(例如双功能酶fadB―SEQ ID NO 183)和3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(例如hbd―SEQ ID NO 271)；羟酰辅酶A脱水酶可选自3-羟丁酰辅酶A脱水酶(例如双功能酶fadB―SEQID NO 183)和烯酰辅酶A水合酶(例如crt―SEQ ID NO 272)；烯酰辅酶A还原酶可为反式-2-烯酰还原酶(例如ter―SEQ ID NO 275)。优选的是，双功能fadB既为酮脂酰辅酶A还原酶，又为羟酰辅酶A脱水酶；或者酮脂酰辅酶A还原酶为hbd，羟酰辅酶A脱水酶为crt。
如上文所指出，3-酮戊酰辅酶A在三种酶作用下转化为戊酰辅酶A，用来产生链长为奇数的脂肪酸产物的反应的引发阶段即告完成，这三种酶分别是：酮脂酰辅酶A还原酶、羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A还原酶。就该阶段来说，酮脂酰辅酶A还原酶可选自3-酮戊酰辅酶A还原酶(例如双功能酶fadB―SEQ ID NO 183)和3-羟戊酰辅酶A脱氢酶(例如hbd―SEQ ID NO 271)；羟酰辅酶A脱水酶可选自3-羟戊酰辅酶A脱水酶(例如双功能酶fadB―SEQID NO 183)和烯酰辅酶A水合酶(例如crt―SEQ ID NO 272)；烯酰辅酶A还原酶可为反式-2-烯酰还原酶(例如ter―SEQ ID NO 275)。优选的是，双功能fadB既为酮脂酰辅酶A还原酶，又为羟酰辅酶A脱水酶；或者酮脂酰辅酶A还原酶为hbd，羟酰辅酶A脱水酶为crt。
(3)第一阶段(反应引发阶段)―丙二酰ACP途径
根据可供选择的实施例，如图12和图13所示，可利用丙二酰ACP依赖性途径实现反应引发阶段，而一个或多个后续阶段(即延伸阶段和/或终止阶段)的至少一部分依赖丙二酰辅酶A依赖性途径。根据该实施例，用来产生链长为偶数的脂肪酸产物的反应由乙酰辅酶A+丙二酰ACP向3-酮丁酰ACP转化来引发。根据该实施例，用来产生链长为偶数的脂肪酸产物的反应由丙酰辅酶A+丙二酰ACP向3-酮戊酰ACP转化来引发。根据该实施例，提供的经遗传修饰微生物具有在其中编码的本文所述的一种或多种酶，这些酶沿丙二酰辅酶A依赖性途径催化反应，并且其中天然酶经由天然丙二酰ACP途径推进引发阶段。
(4)第一阶段―辅酶A/ACP或ACP/辅酶A转变到延伸
如果ACP依赖性引发阶段后紧跟着辅酶A依赖性延伸阶段(参见例如图13)，则微生物还必须编码转酰酶，例如丁酰ACP:辅酶A转酰酶，用来将丁酰ACP转化为丁酰辅酶A；或戊酰ACP:辅酶A转酰酶，用来将戊酰ACP转化为戊酰辅酶A。与此类似，如果辅酶A依赖性引发阶段后紧跟着ACP依赖性延伸阶段(参见例如图11)，则微生物还必须编码转酰酶，例如丁酰辅酶A:ACP转酰酶，用来将丁酰辅酶A转化为丁酰ACP；或戊酰辅酶A:ACP转酰酶，用来将戊酰辅酶A转化为戊酰ACP。合适的丁酰辅酶A:ACP转酰酶包括优选来自大肠杆菌的fabH、优选来自智人的FASN、优选来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FAS1。另外的转酰酶包括例如来自芥菜(Brassica juncea)、小眼虫(Euglena gracilis)的2.3.1.38类酶，和来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)的ACT。
或者，经遗传修饰微生物可编码一种基因，这种基因经由将任一种ACP中间体转化成对应的辅酶A中间体、或将任一种辅酶A中间体转化成对应的ACP中间体，而将脂肪酸生产途径从ACP依赖性途径转变成辅酶A依赖性途径，或反之，从辅酶A依赖性途径转变成ACP依赖性途径。例如，经遗传修饰微生物可编码优选来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的phaG基因，其中phaG将3-羟酰ACP转化成3-羟酰辅酶A。
B.用来驱动第二阶段―链长度延长(延伸)的遗传修饰
丙二酰辅酶A依赖性途径的第二阶段涉及循环过程，其中每循环一次，碳链长度便延长两个碳。如图7所示，该阶段需要酮脂酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A还原酶、羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A还原酶。因此，本发明的经遗传修饰微生物包含其中编码的提供这些功能的天然酶或外源酶。
(1)第二阶段(延伸)―酮脂酰辅酶A合酶
NphT7对于在引发阶段充当引物的乙酰辅酶A和丙酰辅酶A表现出显著的特异性，而且在延伸阶段期间对于较长的酰基辅酶A链显示极小活性。能够催化较长的酰基辅酶A链缩合的大多数3-酮脂酰辅酶A合酶可以在植物、哺乳动物、酵母和其他低等真核生物体内找到。如果没有对于较长的酰基辅酶A具有特异性的3-酮脂酰辅酶A合酶，则比C4辅酶A或C5辅酶A长的酰基辅酶A链不会延伸；因此，可能需要对于较长的酰基辅酶A具有特异性的3-酮脂酰辅酶A合酶。
在一个方面，本发明提供了在丙二酰辅酶A依赖性途径的延伸阶段期间充当酮脂酰辅酶A合酶的经修饰NphT7多肽。这种经修饰NphT7的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的同源性为至少70％、但不到100％或为约100％，并包含一种或多种氨基酸置换、缺失或插入，其中这种经修饰NphT7多肽能够接受碳链长度为C4或C4以上(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的酰基辅酶A底物。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽能够催化酰基辅酶A底物与丙二酰辅酶A缩合，产生碳链长度为C6或C6以上(例如C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的3-酮脂酰辅酶A。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含一种或多种氨基酸置换，选自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及这些置换的任意组合。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含一种氨基酸置换，选自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含两种氨基酸置换，选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些实施例中，任意实施例的这种经修饰NphT7多肽包含三种氨基酸置换，选自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及这些位置的任意组合。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含F217V氨基酸置换。在一些实施例中，这种经修饰NphT7多肽包含两种或两种以上氨基酸置换、缺失或插入，例如I147T氨基酸置换和F217V氨基酸置换。在一些实施例中，这种经修饰多肽为分离并纯化过的。
在一个方面，本发明提供了编码经修饰NphT7多肽的分离并纯化过的多核苷酸。在一些实施例中，这种分离并纯化过的多核苷酸的核酸序列与SEQ ID NO:2的同源性或互补性为至少70％、但不到100％或为约100％，其中该多核苷酸编码具有一种或多种氨基酸置换、缺失或插入的SEQ ID NO:1的经修饰NphT7多肽，其中经修饰NphT7多肽能够接受碳链长度为C4或C4以上(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的酰基辅酶A底物。在一些实施例中，这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽能够催化缩合反应，使酰基辅酶A底物与丙二酰辅酶A缩合，产生碳链长度为C6或C6以上(例如C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的3-酮脂酰辅酶A。任意实施例的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含一种或多种氨基酸置换，选自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及这些置换的任意组合。在一些实施例中，这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含一种氨基酸置换，选自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些实施例中，这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含两种氨基酸置换，选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含三种氨基酸置换，选自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及这些位置的任意组合。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含F217V氨基酸置换。在一些方面，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含两种或两种以上氨基酸置换、缺失或插入。在一些方面，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸编码的经修饰NphT7多肽包含I147T氨基酸置换和F217V氨基酸置换。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸为RNA、mRNA、DNA或cDNA。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸为合成的多核苷酸。在一些实施例中，本文的这种分离并纯化过的多核苷酸为合成的RNA、mRNA、DNA或cDNA。
在一个方面，本发明提供了在丙二酰辅酶A依赖性途径的延伸阶段期间有活性的酮脂酰辅酶A合酶，其中这种酮脂酰辅酶A合酶选自npht7F217V、npht7 I147T、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；其中npht7F217V和/或npht7 I147T在延伸阶段催化添加第5个和/或第6个碳的反应，npht7 F217V、npht7 I147T和/或合酶III在延伸阶段催化添加第7个和/或第8个碳的反应，npht7 F217V、npht7 I147T、合酶III、合酶IV和/或合酶V在延伸阶段催化添加第9个和/或第10个碳的反应，或者其中npht7F217V、npht7 I147T、合酶III、合酶IV、合酶V和/或合酶VI在延伸阶段催化添加第9个和/或序数更高的碳的反应。
(2)第二阶段(延伸)―酮脂酰辅酶A还原酶、3-羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A还原酶
再次参见图7，丙二酰辅酶A依赖性延伸阶段的每个循环除需要3-酮脂酰辅酶A合酶外，还需要3-酮脂酰辅酶A还原酶(“KCR”)、羟酰辅酶A脱水酶(“3HDh”)和烯酰辅酶A还原酶(“EnCr”)。
就延伸阶段来说，酮脂酰辅酶A还原酶可选自3-酮脂酰辅酶A还原酶(例如双功能酶fadB―SEQ ID NO 183)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(例如hbd―SEQ ID NO 271)；羟酰辅酶A脱水酶可选自3-羟酰辅酶A脱水酶(例如双功能酶fadB―SEQ ID NO 183)和烯酰辅酶A水合酶(例如crt―SEQ ID NO 272)；并且烯酰辅酶A还原酶可为反式-2-烯酰还原酶(例如ter―SEQ ID NO 275)。优选的是，双功能fadB既为酮脂酰辅酶A还原酶，又为羟酰辅酶A脱水酶；或者酮脂酰辅酶A还原酶为hbd，羟酰辅酶A脱水酶为crt。
C.用来驱动第三阶段―链长度终止的遗传修饰
一旦获得需要的链长度，就用终止步骤结束延伸阶段。在本发明的一个方面，经遗传修饰微生物编码一种酶，这种酶能够在以下位置终止酰基延伸循环：基本上在需要的链长度处，或基本上位于较窄链长度分布(即，2至4个碳的分布，例如C8至C10、C8至C12、C10至C12、C10至C14等)内。在本发明的另一方面，终止酶为硫酯酶(例如酰基辅酶A酯酶)，微生物产生脂肪酸。合适的硫酯酶包括tesA―SEQ ID NO 277、'tesA―SEQ ID NO 278、tesB―SEQID NO 279、yciA―SEQ ID NO 280、ybgC―SEQ ID NO 281、ybfF―SEQ ID NO 282、fadM―SEQ ID NO 283、AtTE―SEQ ID NO 284、CpTE―SEQ ID NO 285、CperfTE―SEQ ID NO 286、LpTE―SEQ ID NO 287和PA2801TE―SEQ ID NO 288，以及这些酶的组合。或者，终止酶为蜡酯合酶，微生物产生脂肪酯。合适的蜡酯合酶包括Maq1―SEQ ID NO 289、Pcry1―SEQ IDNO 290、Rjos1―SEQ ID NO 291和Abork1―SEQ ID NO 292。或者，属于本领域技术范畴的是，添加其他已知的终止酶来使经遗传修饰微生物产生可选的脂肪酸衍生物，例如脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪酰胺、脂肪烷烃或脂肪二酸。举例来说，终止酶可为催化产生脂肪醇或脂肪醛的脂肪酸或酰基辅酶A还原酶，或催化产生脂肪醛的醛脱羧酶，或与酰基ACP还原酶或酰基辅酶A还原酶一道催化产生烷烃的醛脱羧酶。
D.与特定链长度相关的遗传修饰
根据本发明的一个方面，将经遗传修饰微生物改造成能够产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物，这种脂肪酸或脂肪酸衍生产物具有基本上特定的链长度，或具有基本上较窄的链长度分布(即，2至4个碳)。优选地，本发明的经遗传修饰微生物产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的至少50％、60％、70％、80％或90％具有需要的链长度，或位于所需的较窄链长度分布内。申请人已确定，改造微生物，使其编码将导致产生链长度特定的脂肪酸和脂肪酸衍生物的各种基因组合，就可实现这种特异性。下表2示出了导致产生表2所示碳链长度的产物的某些独特基因组合。
表2：在多种脂肪酸途径中使用酶组合获得的脂肪酸产物的链长度特异性
根据本发明的一个方面，提供了一种经遗传修饰微生物，该微生物其中编码了表2中包括的某一给定途径的基因，其中这种微生物能够按这一给定途径产生具有表2所示碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。还提供了一种经遗传修饰微生物，该微生物其中编码了上表2中包括的多条途径的组合的基因，其中这种微生物能够按多条途径的这种组合，产生碳链长度基本上位于与表2所示碳链长度对应的较窄分布内的脂肪酸或脂肪酸衍生物。例如，提供了包含NphT7、fadB、ter、AtTE和tesA(C10途径A和C12途径A)的经遗传修饰微生物，其中所述微生物能够产生包含C10和C12脂肪酸的脂肪酸组合物。
在另一方面，申请人已发现，可使用来自某些特定物种生物体的某些酶来控制链长度特异性。因此，本发明提供了一种或多种分离并纯化过的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子编码多种蛋白质，包括来自选自下列的物种的3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III：潮汐别样希瓦氏菌B11、布氏弓形杆菌ED-1、梭菌目细菌1_7_47_FAA、木葡糖酸醋杆菌174Bp2、爱知戈登氏菌NBRC 108223、中慢生根瘤菌属物种STM 4661、Pelosinusfermentans DSM 17108、加利西亚褐色杆菌2.10、青枯劳尔氏菌Po82、运青糖单孢菌NA-128、青色糖单孢菌K62以及海洋疣孢菌AB-18-032，其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生脂肪酸。
在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：Pelosinus fermentans DSM 17108、青色糖单孢菌K62、海洋疣孢菌AB-18-032以及梭菌目细菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生乙酰辅酶A。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：青色糖单孢菌K62、运青糖单孢菌NA-128、中慢生根瘤菌属物种STM 4661以及梭菌目细菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生四碳脂肪酸。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：爱知戈登氏菌NBRC 108223、布氏弓形杆菌ED-1、梭菌目细菌1_7_47_FAA、青色糖单孢菌K62以及青枯劳尔氏菌Po82，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生六碳脂肪酸。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自选自下列的物种：爱知戈登氏菌NBRC 108223、木葡糖酸醋杆菌174Bp2、布氏弓形杆菌ED-1、青枯劳尔氏菌Po82以及加利西亚褐色杆菌2.10，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生八碳脂肪酸。在一些实施例中，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶III来自潮汐别样希瓦氏菌B11，并且其中由所述多核苷酸编码的蛋白质能够产生十碳脂肪酸。
E.用来将丙二酰辅酶A从天然丙二酰ACP依赖性脂肪酸合成途径重定向到丙二酰辅酶A 依赖性脂肪酸合成途径的遗传修饰
如上所述，本发明的某些方面涉及经遗传修饰为经由丙二酰辅酶A依赖性途径产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物，其中丙二酰辅酶A依赖性途径也是丙二酰ACP非依赖性途径。本发明的该方面可与通过一种或多种遗传修饰抑制微生物的丙二酰ACP依赖性脂肪酸合酶途径结合使用，以便降低由微生物的丙二酰ACP依赖性脂肪酸合酶系统中的一种或多种基因编码的酶的活性。可以在本发明的方法和系统中使用所述组合物。
在微生物的许多细胞中，脂肪酸合酶系统包含具有以下酶活性的多肽：丙二酰辅酶A-酰基载体蛋白(ACP)转酰酶活性、3-酮脂酰ACP合酶活性、3-酮脂酰ACP还原酶活性、3-羟酰ACP脱水酶活性、3-羟酰ACP脱水酶活性以及烯酰ACP还原酶活性。在各种实施例中，可引入编码这些多肽的温度敏感型的核酸序列来代替天然酶；并且在将这类经遗传修饰微生物置于高温下培养时(在这些温度下，蛋白结构改变或蛋白完全变性，所以这些不耐热多肽被部分或完全灭活)，观察到丙二酰辅酶A依赖性途径的通量增加，而丙二酰ACP依赖性途径的通量减小。
大肠杆菌中的这些温度敏感性突变基因可包括fabIts(S241F)、fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)。在其他实施例中，可执行其他类型的遗传修饰，从而以其他方式调节(比如降低)这些多肽中的一种或多种的酶活性。在各种实施例中，此类遗传修饰的结果是改变丙二酰辅酶A的利用率，从而减少丙二酰辅酶A经由天然途径向脂肪酸的转化，继而减少总生物质，并成比例增大碳源经由丙二酰辅酶A依赖性途径(在一些情况下，经由丙二酰ACP非依赖性途径)向包括脂肪酸或脂肪酸衍生产物在内的化学产物转化的转化率。在各种实施例中，微生物产生化学产物的比生产率高得出乎意料。另外，可以在某些实施例中执行额外的遗传修饰，以便(例如)增大丙二酰辅酶A的产量。
烯酰-酰基载体蛋白还原酶(EC No.1.3.1.9，也称烯酰ACP还原酶)这种酶，是由丙二酰辅酶A生物合成脂肪酸会用到的关键酶。大肠杆菌中的这种酶(FabI)由基因fabI编码(参见“Enoyl-Acyl Carrier Protein(fabI)Plays a Determinant Role in CompletingCycles of Fatty Acid Elongation in Escherichia coli，”Richard J.Heath andCharles O.Rock,J.Biol.Chem.270:44,pp.26538-26543(1995)(“烯酰基-酰基载体蛋白(fabI)在完成大肠杆菌的脂肪酸延伸循环中发挥决定性作用”，Richard J.Heath和Charles O.Rock，《生物化学杂志》，第270期，第44卷，第26538-26543页，1995年)，该论文中论述fabI和脂肪酸合酶系统的章节以引用方式并入本文)。
本发明可利用微生物，这种微生物的核酸序列(多核苷酸)编码的多肽具有可以在发酵事件期间调节的烯酰ACP还原酶活性。例如，可提供编码温度敏感性烯酰ACP还原酶的核酸序列来替代天然的烯酰ACP还原酶，以便可通过升高培养温度来降低酶活性，继而改变丙二酰辅酶A的利用率，得到所需的化学产物。一种这样的序列是大肠杆菌的突变型温度敏感性fabI(fabITS)或fabIts(S241F)(SEQ ID NO 141)。这种酶在温度高于30℃时可表现出酶活性降低，但在30℃时表现出正常的酶活性。因此，将培养温度升至(例如)34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃，便可降低烯酰ACP还原酶的酶活性。在这种情况下，更多的丙二酰辅酶A在30℃时经由本发明的非天然途径转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物或另一种化学产物；其中，由于烯酰ACP还原酶活性下降，便阻碍了丙二酰辅酶A经由其天然脂肪酸途径向脂肪酸转化。
应当理解，在已知的基因组学数据库比如BLASTN和BLASTP中进行同源性搜索，便很容易获得大肠杆菌以外物种的烯酰ACP还原酶的核酸和氨基酸序列。本文描述了获得其他物种中的同源物和功能等同序列的方法。因此，应当理解，本领域技术人员可以对许多有商业价值的微生物物种实施本发明。
可使用本领域技术人员熟悉的除利用温度敏感性烯酰ACP还原酶之外的方法，例如但不限于将天然的烯酰ACP或烯酰辅酶A还原酶替换为包含这种酶的诱导型启动子的核酸序列，使得初始诱导后无需再诱导，从而在达到选择的细胞密度后降低烯酰ACP或烯酰辅酶A还原酶的酶活性。例如，可执行遗传修饰以降低烯酰ACP还原酶基因(例如大肠杆菌中的fabI)的酶活性。在该例中，可以在本文所述方法的第一阶段期间诱导启动子(例如用异丙基-μ-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导)，并在IPTG耗尽、将其除去或稀释掉后，可以开始降低烯酰ACP还原酶活性的第二步骤。可使用其他方法(例如本文所述的方法和/或本领域技术人员已知的方法)控制酶的表达和活性。例如，可使用那些响应于磷酸盐耗尽而开启的启动子可控制地表达所需基因。这种启动子可包括大肠杆菌(E.coli)中的yibD或pstS基因启动子。
不囿于特定理论，据信降低微生物中烯酰-ACP还原酶(和/或脂肪酸合酶系统的其他酶)的酶活性将导致丙二酰辅酶A(一种酶的上游代谢中间产物)积累和/或进入其他代谢途径，并且由于微生物细胞中包含一种能利用丙二酰辅酶A的代谢途径，随后可将这种丙二酰辅酶A转化成一种化学产物。在本发明的一些组合物、方法和系统中，烯酰-ACP还原酶(或者更一般地说，脂肪酸合酶系统)的酶活性的降低是在遗传修饰微生物达到一定的细胞密度后进行的。这种双相培养方法平衡了维持特定生产速率的细胞生物量中生物催化剂的所需量与产量，这一点可部分地归因于当烯酰-ACP还原酶活性(和/或脂肪酸合酶系统的其他酶的活性)降低后，使得更少的碳流向细胞物质。这使得丙二酰辅酶A的净利用率发生变化，从而为所需化学产物提供更多的碳通量。
一旦这种降低所述酶活性的调节生效，相较于天然未调节的酶活性(例如细胞中或分离得到的)，进行过这种调节的各相应酶活性可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。同理，相较于未调节的细胞或其他系统的转化率，丙二酰辅酶A到脂肪酰-ACP分子的转化率可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。同样，相较于未调节的细胞或其他系统的转化率，丙二酰辅酶A通过其天然途径形成脂肪酸分子的转化率可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
F.其他遗传修饰
本文上述遗传修饰可与各种其他遗传修饰结合以进一步提高所需化学产物的产量。这些额外的遗传修饰可带来多种有益的特性，例如提高葡萄糖摄取、减少会产生非期望副产物的替代反应途径中关键中间产物的消耗，以及驱使碳通量流向丙二酰辅酶A。表3中示出了部分此类额外遗传修饰。
表3：遗传修饰
除上述遗传修饰外，在各种实施例中还提供了能够增加辅因子NADPH库及其可用性，并且/或者因此提高NADPH/NADP+比率的遗传修饰。例如，在各种大肠杆菌的实施例中，这可通过提高以下一种或多种基因的活性(如通过遗传修饰)来完成：pgi(突变形式)、过表达的pntAB、gapA:gapN置换/替换，以及可溶性转氢酶(如sthA)的破坏或修饰和/或zwf、gnd和edd中一种或多种的遗传修饰。
本文所述的任何遗传修饰可提供给不具备这种功能，或该功能小于所需水平的菌株。
更一般地说，根据选择用于遗传修饰的微生物的具体代谢途径，可用遗传修饰来降低其细胞生产的发酵产物的任何亚组选自：乙酸酯、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸酯、脂肪酸乙酯、甘油糖脂、脂质、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其他乙酸酯、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸酯、异丁酸酯、2-OH-异丁酸酯、3-OH-丁酸酯、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸酯、衣康酸酯、乙酰丙酸酯、葡糖二酸酯、戊二酸酯、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇和1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸酯、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸和顺丁烯二酸。通常可根据本文公开的内容产生基因缺失，但也可使用其他方法实现所选发酵产物的所需减少的细胞生产。
在一些实施例中，额外遗传修饰与选自下表4至表13中所列的组的基因型或酶相关。这些酶的氨基酸序列示于表14中。
表4：基础菌株大肠杆菌K12 BW25113
(Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.,Acad.Sci.USA 97:6640-6645,2000 (Datsenko K.A.和Wanner B.L.，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第6640-6645页，2000 年))
表5：用于增加产量/去除副产物的宿主修饰
表6：脂肪酸合成(包括用于提高丙二酰辅酶A可用性的温度敏感性等位基因)
表7：丙二酰辅酶A合成以及其他与优化通量有关的基因
表8：糖转运和利用
表9：用于脂肪酸产物的宿主修饰
表10：脂肪酸途径3-酮脂酰辅酶A合酶
表11：硫酯酶
表12：蜡酯合酶
表13：其他
表14：涉及遗传修饰的酶的蛋白质序列。
(以粗体和下划线列出的氨基酸表示对申请人的等位基因作出的修饰)
IV.关于基因、核苷酸序列和氨基酸序列的方法和修饰技术
A.氨基酸序列变体
氨基酸序列中的一些氨基酸可发生变化，而不会显著影响蛋白质的结构或功能。只要所示的酶活性不受到显著的不利影响，包含的变体可含有缺失、插入、倒位、重复和类型置换。关于哪些氨基酸的改变可能发生表型沉默的指导尤其可见于Bowie,J.U.,et al.，“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino AcidSubstitutions，”Science 247:1306-1310(1990)(Bowie,J.U.等人，“破译蛋白序列信息：对氨基酸置换的耐受性”，《科学》，第247卷，第1306-1310页，1990年)中。在各种实施例中，通过表达本发明多核苷酸分子获得的多肽与由本文所述基因和/或核酸序列编码的一种或多种氨基酸序列可具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述一种或多种氨基酸序列用于脂肪酸或脂肪酸衍生产物耐受性相关的生物合成途径。
本领域技术人员应当理解，与本文所述氨基酸同源的氨基酸也在本发明的范围之内。应当理解，氨基酸“同源性”包括保守置换，也就是说，用另一种特征相似的氨基酸置换多肽中的给定氨基酸的那些取代。典型地，把以下替换视作保守置换：将如Ala、Val、Leu和Ile的脂族氨基酸替换为另一种脂族氨基酸；用Thr替换Ser，反之亦然；将如Asp或Glu的酸性残基替换为另一种酸性残基；将如Asn或Gln的含有酰胺基的残基替换为另一种含有酰胺基的残基；将如Lys或Arg的碱性残基替换为另一种碱性残基；将如Phe或Tyr的芳族残基替换为另一种芳族残基。
对于本文提供的所有核酸和氨基酸序列，应当理解，还包括这些序列的保守修饰变体，并且这些变体在本发明的各种实施例的范围内。可包括保守修饰变体和更广泛多样的序列且在本领域普通技术人员的技术范围内的功能等同的核酸和氨基酸序列(功能变体)，以及含有这些序列的微生物，还有包括这种序列和/或微生物的方法和系统，也在本发明各种实施例的范围内。在各种实施例中，编码充分同源的蛋白或其一部分的核酸序列都在本发明的范围内。更一般地讲，编码用于本发明的特定氨基酸序列的核酸序列可由于遗传密码简并性而变化，并且仍然在本发明的范围内。表15提供了对氨基酸之间相似性的汇总，基于这些相似性可进行保守的和较不保守的置换，还提供了反映这种简并性的各种密码子冗余。
表15：氨基酸保守置换
氨基酸 关系 DNA密码子
丙氨酸 N，Ali GCT、GCC、GCA、GCG
脯氨酸 N CCT、CCC、CCA、CCG
缬氨酸 N，Ali GTT、GTC、GTA、GTG
亮氨酸 N，Ali CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG
异亮氨酸 N，Ali ATT、ATC、ATA
甲硫氨酸 N ATG
苯丙氨酸 N，Aro TTT、TTC
色氨酸 N TGG
甘氨酸 PU GGT、GGC、GGA、GGG
丝氨酸 PU TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC
苏氨酸 PU ACT、ACC、ACA、ACG
天冬酰胺 PU，Ami AAT、AAC
谷氨酰胺 PU，Ami CAA、CAG
半胱氨酸 PU TGT、TGC
天冬氨酸 NEG，A GAT、GAC
谷氨酸 NEG，A GAA、GAG
精氨酸 POS，B CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG
赖氨酸 POS，B AAA、AAG
组氨酸 POS CAT、CAC
酪氨酸 Aro TAT、TAC
终止密码子 TAA、TAG、TGA
说明：侧基及其他相关特性：A＝酸性；B＝碱性；Ali＝脂族；Ami＝胺；Aro＝芳族；N＝非极性；PU＝无电荷极性；NEG＝带负电；POS＝带正电。
此外，当这种核苷酸序列变体和/或部分包含与本文所引用的核酸序列中示出的任意15核苷酸序列相同的15核苷酸序列时，本文引用的特定核酸序列及其编码的氨基酸序列的变体和部分可具有期望的功能，例如所选水平的酶活性，所述任意15核苷酸序列包括但不限于，开始于第1位核苷酸且结束于第15位核苷酸的序列、开始于第2位核苷酸且结束于第16位核苷酸的序列、开始于第3位核苷酸且结束于第17位核苷酸的序列，以此类推。应当理解，本发明还提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含长度大于15个核苷酸(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸)且与本文所引用核酸序列中示出的序列的任何部分相同的核苷酸序列。例如，本发明提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含与本文所引用的任何一个或多个核酸序列(包括它们的任何组合)中示出的任意25核苷酸序列相同的25核苷酸序列，所述任意25核苷酸序列包括但不限于，开始于第1位核苷酸且结束于第25位核苷酸的序列、开始于第2位核苷酸且结束于第26位核苷酸的序列、开始于第3位核苷酸且结束于第27位核苷酸的序列，以此类推。另外的例子包括但不限于，包含长度为50个或更多个核苷酸(例如，100、150、200、250、300或更多个核苷酸)且与本文所公开的任一序列的任何部分相同的核苷酸序列的分离核酸。这种分离的核酸可包括但不限于，包含讨论和/或例子的任一部分中所述的核酸序列的分离核酸，所述讨论和/或例子例如关于脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径、编码脂肪酸合酶系统中的酶的核酸序列、或者脂肪酸或脂肪酸衍生产物耐受性。例如，本发明提供了包含本文所列出的核酸序列的分离核酸，所述核酸序列包含单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或它们的任意组合(例如，同时包含单个缺失与多个插入)。这种分离核酸分子可与本文所列出(即序列表中)的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
另外的例子包括但不限于分离的核酸，所述分离的核酸包含编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列有50个或更多个氨基酸残基(例如，100、150、200、250、300个或更多个氨基酸残基)长且与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的任何部分相同。
此外，本发明提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列具有本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的变化。例如，本发明提供了包含核酸序列的分离的核酸，所述核酸序列编码本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列且包含单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或它们的任意组合(例如，同时包含单个缺失与多个插入)。这种分离核酸分子可含有编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
为保守置换和其他氨基酸置换提供依据的特性的例子示于表15中。因此，本领域技术人员可进行多种置换，以获得具有所需功能的氨基酸序列变体。可使用BLASTP、CLUSTALP和其他比对和比较工具来评估可进行较少置换的高度保守区域(除非涉及改变活性至所选水平，这可能需要多个置换)。可在识别或确信为不涉及活性位点或其他结合或结构基序的区域进行较多的置换。根据表15，例如，可使用一个无电荷极性(PU)氨基酸置换所示序列的无电荷极性氨基酸，任选地考虑尺寸/分子量(即，使用丝氨酸置换苏氨酸)。关于哪些氨基酸的改变可能发生表型沉默的指导尤其可见于Bowie,J.U.,et Al.，“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino AcidSubstitutions，”Science 247:1306-1310(1990)(Bowie,J.U.等人，“破译蛋白序列信息：对氨基酸置换的耐受性”，《科学》，第247卷，第1306-1310页，1990年)中。该参考文献以引用方式并入以用于此类教导内容，所述教导内容也是本领域技术人员普遍已知的。公认的氨基酸保守置换包括(可置换氨基酸紧跟着一组的每个冒号)：ala:ser；arg:lys；asn:gln或his；asp:glu；cys:ser；gln:asn；glu:asp；gly:pro；his:asn或gln；ile:leu或val；leu:ile或val；lys:arg或gln或glu；met:leu或ile；phe:met或leu或tyr；ser:thr；thr:ser；trp:tyr；tyr:trp或phe；val:ile或leu。
应当指出，可使用针对特定物种的密码子偏好和密码子用法表来改造分离的核酸分子，使其利用该特定物种的密码子使用偏好。例如，可将本文提供的分离核酸设计成具有可被所关注的特定微生物优先利用的密码子。许多软件和测序服务可用于这种序列的密码子优化。
本发明提供了包含本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的完整氨基酸序列的多肽。此外，本发明提供了包含本文所列出或以其他方式公开的一部分氨基酸序列的多肽。例如，本发明提供的多肽包含与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列中任意15氨基酸序列相同的15氨基酸序列，所述任意15氨基酸序列包括但不限于，开始于第1位氨基酸残基且结束于第15位氨基酸残基的序列、开始于第2位氨基酸残基且结束于第16位氨基酸残基的序列、开始于第3位氨基酸残基且结束于第17位氨基酸残基的序列，以此类推。应当理解，本发明还提供了多肽，所述多肽包含长度大于15个氨基酸残基(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸残基)且与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的任何部分相同的氨基酸序列。例如，本发明提供的多肽包含与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列中任意25氨基酸序列相同的25氨基酸序列，所述任意25氨基酸序列包括但不限于，开始于第1位氨基酸残基且结束于第25位氨基酸残基的序列、开始于第2位氨基酸残基且结束于第26位氨基酸残基的序列、开始于第3位氨基酸残基且结束于第27位氨基酸残基的序列，以此类推。另外的例子包括但不限于包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列有50个或更多个氨基酸残基(例如，100、150、200、250、300个或更多个氨基酸残基)长且与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的任何部分相同。此外应当理解，根据上述内容，15核苷酸序列将提供5氨基酸序列，使得后者以及更大长度的氨基酸序列可由与本文所提供序列具有同一性的上述核苷酸序列长度限定。
此外，本发明提供的多肽的氨基酸序列具有本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列所示的氨基酸序列变化。例如，本发明提供了包含本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或它们的任意组合(例如，同时包含单个缺失与多个插入)。这种多肽可含有与本文所列出或以其他方式公开的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。具体的变体氨基酸序列可包含任何数量的变化以及变化类型的任意组合。
如本文所指出的那样，具有变体氨基酸序列的多肽可保留酶活性。可使用标准方法，例如定点诱变或各种PCR技术，通过操纵编码多肽的核苷酸序列来生成这种多肽。正如本文所提到的，一种修饰类型包括使用一种或多种氨基酸残基置换具有相似的化学特性和/或生物化学特性的氨基酸残基。例如，多肽可具有如本文所列出或以其他方式公开的包含一种或多种保守置换的氨基酸序列所示的氨基酸序列。
可通过选择较不保守的置换和/或可能更关键的序列区域的置换获得更具实质性的改变，例如选择在下列项的维持效果方面具有更显著的差异的残基：(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构象；(b)靶位点处多肽的电荷或疏水性；或(c)侧链体积。通常预期会产生最大的多肽功能改变的置换是：(a)亲水残基(如丝氨酸或苏氨酸)置换(或置换为)疏水残基(如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或置换为)任何其他残基；(c)具有正电性侧链的残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换(或置换为)负电残基(如谷氨酸或天冬氨酸)；或(d)具有大体积侧链的残基(如苯丙氨酸)置换(或置换为)不具有侧链的残基(如甘氨酸)。对于具有酶活性的多肽而言，这些氨基酸置换(或其他缺失或添加)的影响可通过如下方式评估：分析该多肽催化与相关天然多肽相同的底物转化为与相关天然多肽相同的产物的能力。因此，本发明提供了具有5、10、20、30、40、50个或更少的保守置换的多肽。
B.测定氨基酸序列同一性
在实际情况中，无论任何特定多肽与本文所述任何多肽的任何参考氨基酸序列(其可与本文所述特定核酸序列对应)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％还是99％的同一性，通常都可使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包(用于Unix)，第8版，遗传学计算机组，大学研究园，威斯康星州麦迪逊市Science Drive 575号，邮编53711(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711))来测定这种特定多肽序列。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序测定特定序列与根据本发明的参考序列是否具有例如95％的同一性时，对参数进行设置以使得根据参考氨基酸序列全长来计算同一性百分比，并且允许存在同源性最大达到参考序列总氨基酸残基数的5％的空位。
例如，在一个具体实施例中，可根据Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)(《计算机在生物科学中的应用》，第6卷，第237-245页，1990年))的算法，使用FASTDB计算机程序测定参考序列(查询序列，即本发明的一个序列)和目标序列之间的同一性，也称为全局序列比对。在一个狭义理解同一性的具体实施例中，FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：评分方案＝PAM(可接受突变百分比(Percent Accepted Mutations))0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机组长＝0，截止得分＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列长度，取其中较短者。根据该实施例，如果由于N端或C端缺失而非由于内部缺失，使得目标序列短于查询序列，将对结果进行手动校正，以考虑FASTDB程序在计算全局同一性百分比时未计入目标序列的N端和C端截短的事实。对于相对于查询序列在N端和C端截断的目标序列，通过计算侧向于目标序列N端和C端且未与对应目标残基匹配/对齐的查询序列的残基数来校正同一性百分比，以查询序列总残基的百分比计。关于残基是否匹配/对齐的测定取决于FASTDB序列比对的结果。然后，从使用指定参数通过FASTDB程序计算的同一性百分比中减去这一百分比，得到最终的同一性百分比的得分。此最终同一性百分比的得分即是用于本实施例的得分。仅考虑将那些不与查询序列匹配/对齐的目标序列N端和C端的残基用于手动调整同一性百分比得分。也就是说，仅考虑将目标序列最远N端和C端残基之外的查询残基位置用于此手动校正。例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列比对，以测定同一性百分比。在目标序列N端发生缺失，因此FASTDB比对不显示N端前10个残基的匹配/对齐。10个未配对的残基代表序列的10％(不匹配的N端和C端残基数/查询序列的总残基数)，因此要从FASTDB程序计算的同一性百分比得分中减去10％。如果剩余90个残基完全匹配，那么最终的同一性百分比为90％。在另一个例子中，将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这时缺失为内部缺失，因此目标序列的N端或C端不存在与查询序列不匹配/对齐的残基。在这种情况下，由FASTDB计算的同一性百分比无需手动校正。再次，如FASTDB比对所显示的，仅对目标序列的N端和C端外的与查询序列不匹配/对齐的残基位置进行手动校正。
C.用于进行遗传修饰和制备核酸构建体的技术
可根据本发明使用各种方法和技术来修饰微生物。要实现本发明的实施例，需要向宿主微生物中引入表达载体，其中所述表达载体包含编码酶的核酸序列，所述酶通常存在于宿主微生物中或通常不存在于宿主微生物中。
对宿主细胞进行遗传修饰的能力对于任何经遗传修饰(重组)的微生物的生产而言至关重要。转基因技术的模式可通过电穿孔、接合、转导或天然转化实现。可使用多种多样的宿主接合质粒和药物抗性标记。根据可在宿主中发挥功能的抗生素抗性标记的性质，为宿主微生物设计克隆载体。另外如本文所公开的，经遗传修饰(重组)的微生物可包括除通过质粒引入以外的其他修饰，包括对其基因组DNA的修饰。
更一般地说，可制备包含分离的多核苷酸的核酸构建体，该分离的多核苷酸编码具有酶活性的多肽，所述分离的多核苷酸有效连接至在与控制序列相容的条件下引导微生物(如大肠杆菌)中编码序列的表达的一个或多个(数个)控制序列。可操纵该分离的多核苷酸，从而得到多肽的表达。在插入载体前对多核苷酸序列的操纵可以是所需的或必要的，具体取决于表达载体。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域沿用已久的。
控制序列可以是适当的启动子序列，一种被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变、截断和杂交启动子，并且可得自与宿主细胞同源或异源的编码胞外或胞内多肽的基因。引导核酸构建体(特别是在大肠杆菌宿主细胞中)转录的合适启动子的例子为lac启动子(Gronenborn,1976,Mol.Gen.Genet.148:243-250(Gronenborn，1976年，《分子遗传学与普通遗传学》，第148卷，第243-250页))、tac启动子(DeBoer et a/.,1983,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 80:21-25(DeBoer等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第21-25页))、trc启动子(Brosius et al,1985,J.Biol.Chem.260:3539-3541(Brosius等人，1985年，《生物化学杂志》，第260卷，第3539-3541页))、T7RNA聚合酶启动子(Studierand Moffatt,1986,J.MoI.Biol.189:113-130(Studier和Moffatt，1986年，《分子生物学杂志》，第189卷，第113-130页))、噬菌体启动子pL(Elvin et al.,1990,Gene 87:123-126(Elvin等人，1990年，《基因》，第87卷，第123-126页))、tetA启动子(Skerra,1994,Gene151:131-135(Skerra，1994年，《基因》，第151卷，第131-135页))、araBAD启动子(Guzman etal.,1995,J.Bacteriol.177:4121-4130(Guzman等人，1995年，《细菌学杂志》，第177卷，第4121-4130页))和rhaPBAD启动子(Haldimann et al.,1998,J.Bacteriol.180:1277-1286(Haldimann等人，1998年，《细菌学杂志》，第180卷，第1277-1286页))。其他启动子在“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American,1980,242:74-94(“来自重组细菌的有用蛋白”，《科学美国人》，1980年，第242卷，第74-94页)；以及Sambrook and Russell，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，”Third Edition2001(volumes 1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y(Sambrook和Russell，“分子克隆实验指南”，第三版，2001年(第1-3卷)，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)中有所描述。
控制序列还可以是合适的转录终止子序列，一种被宿主细胞识别用于终止转录的序列。终止序列有效连接至编码多肽的核苷酸序列的3'端。在大肠杆菌细胞中发挥功能的任何终止子都可用于本发明。也可能有利的是添加调控序列，该调控序列可调节与宿主细胞生长有关的多肽的表达。调控系统的例子是那些响应于化学或物理刺激(包括在存在调控化合物的情况下)而开启或关闭基因表达的调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。
对于本发明的各种实施例，遗传操作和/或修饰可被描述为包括各种遗传操作，其包括涉及改变在任何相应途径中鉴定的酶或酶活性的调控，并因此改变酶的最终活性的那些操作。此类遗传修饰以及本文引用的任何调节基因的操作可涉及转录、翻译和翻译后修饰，这些操作会使得酶活性和/或选择性在选定和/或确定的培养条件下改变，以及/或者涉及提供其他核酸序列，例如以便增大与脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产相关的酶的拷贝数和/或突变体。实现此类遗传修饰和/或调节的具体方式和方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于：提高内源性遗传因子的表达；减弱阻遏子基因的功能；引入异源遗传因子；增大编码多肽的核酸序列的拷贝数，该多肽催化酶转化步骤以生成脂肪酸或脂肪酸衍生产物；使遗传因子突变以提供突变蛋白来增大酶的比活性；过表达；低表达；过表达伴侣；敲除蛋白酶；改变或修饰反馈抑制；提供酶变体，其包含一个或多个用于结合阻遏子和/或竞争性抑制因子的受损结合位点；敲除阻遏子基因；进化、选择和/或其他提高mRNA稳定性的方法以及使用具有有效拷贝数和启动子的质粒实现有效改善程度的方法。可实施随机诱变以提供遗传修饰，所述遗传修饰可分成这些或其他规定方法中的任何方法。遗传修饰和/或调节广义上还分成所关注的核酸中一个或多个核酸的添加(包括插入)、缺失(例如，通过突变实现)和置换。在各种实施例中，遗传修饰和/或调节导致改善的酶比活性和/或酶代谢转换数。不受限制地，可通过以下中的一者或多者来测量变化：KM、Kcat和K亲合力。
在各种实施例中，为了更有效地发挥功能，微生物可包含一个或多个基因缺失。例如，在大肠杆菌中，编码乳酸脱氢酶(ldhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的基因可能被破坏(包括缺失)。此类基因破坏(包括缺失)并不意味着进行限制，并且可在各个实施例中以各种组合实现。基因缺失可以通过突变的基因缺失的方法实现，和/或从这些酶中一者或多者的表达降低或不表达的突变株着手，和/或本领域技术人员已知的其他方法。可通过多种已知的具体方法中的任何方法来实现基因缺失，所述方法包括但不限于使用基因桥公司(Gene Bridges)(德国萨克森州德累斯顿的基因桥公司(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany)，<<www.genebridges.com>>)出售的试剂盒和其他试剂进行的RED/ET方法。
更具体地讲，后一种方法，即，使用Red/ET重组的方法，是本领域的普通技术人员已知的，并在授予Stewart等人的美国专利No.6,355,412和No.6,509,156中有所描述，所述专利以引用方式并入本文，用于该方法的教导内容。上述方法所用的材料和试剂盒可得自基因桥公司(Gene Bridges)(德国萨克森州德累斯顿的基因桥公司(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany)，《www.genebridges.com》)，并且可按制造商的说明执行该方法。该方法涉及在λ噬菌体的重组酶的作用下进行同源重组，从而将靶基因替换为选择性标记。用编码选择性标记的线状DNA产物转化表达λ-Red重组酶的宿主微生物，所述选择性标记两侧是与靶基因同源的末端区域(一般含～50bp，或者至多含约～300bp)。随后该标记可通过由携带FLP重组酶或另一种重组酶(如，Cre)的质粒载体执行的另一重组步骤除去。
可定向去除微生物染色体DNA的部分或向微生物染色体添加外来遗传物质，以改变宿主细胞的代谢，从而减少或消除非预期代谢产物的生成。在这种一般例子中，这可与其他遗传修饰(例如本文所述的遗传修饰)联合使用。该具体实施方式参考了多种实施例和附图，在附图中以举例说明的方式示出了具体的示例性实施例，本发明可通过这些实施例实施。这些实施例已进行了充分详细的描述，使本领域的技术人员能够实施本发明，并且应当理解，技术人员可对所公开的各种实施例作出修改。
多肽和编码多肽的核酸可通过标准的DNA诱变技术(例如，M13引物诱变)制备。Sambrook and Russell,2001(Sambrook和Russell，2001年)中提供了这些技术的细节。核酸分子可包含编码区的变化，以符合其中将引入该分子的特定微生物的密码子使用偏好性。
或者，利用遗传密码的简并性，使得在核酸序列大幅改变时，其编码的多肽仍然具有与天然氨基酸序列相同或基本上类似的氨基酸序列，可通过这种方式改变编码序列，以此改变编码区。例如，在开放阅读框中，核苷酸三联体密码子GCT编码丙氨酸。由于遗传密码的简并性，其他三个核苷酸三联体密码子(GCA、GCC和GCG)也编码丙氨酸。因此，在该位置处，开放阅读框的核酸序列可改变为这三种密码子中的任一种，而不影响所编码的多肽的氨基酸序列或该多肽的特性。基于遗传密码的简并性，可使用本文所述的标准DNA诱变技术或者通过合成核酸序列，从本文所公开的核酸序列获得核酸变体。因此，对于各种实施例，本发明涵盖了编码相同多肽却因遗传密码的简并性而具有不同核酸序列的核酸分子。
本发明还提供了分离的核酸，所述分离的核酸有至少约12个碱基长(例如，至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基长)，并在杂交条件下将其与具有本文所列出或以其他方式公开的序列的核酸的正义链或反义链杂交。所述杂交条件可为适度或高度严格的杂交条件。
V.发酵工艺
根据本发明，通过本文所述的生物生产途径，本文所述的微生物被用于生产所需化学产物(如脂肪酸或脂肪酸衍生物)的发酵工艺中。不受限制地，可通过向容器(如培养皿或生物反应器容器)中加入以下组合物来举例说明这种工艺：(1)生物生产培养基，(2)营养培养基，例如本领域技术人员已知的基本培养基，以及(3)经遗传修饰的微生物的接种物，用于获得这种微生物(例如细菌，更具体地讲是肠杆菌科的成员，如大肠杆菌)的群体。根据本发明的一个方面，所述经遗传修饰的微生物具有将丙二酰辅酶A转化成所选化学产物的代谢途径。在容器中培养接种物，以使得细胞密度增至适于达到脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产水平的细胞密度，所述生产水平符合所需的整体生产率指标。在各种可供选择的实施例中，可在第一制备容器中将这些经遗传修饰的微生物群培养至达到第一细胞密度，然后将其转移到所述容器中，以获得所选的细胞密度。多种多容器培养策略是本领域的技术人员已知的。
A.生物生产培养基(碳源)
在本发明中用于重组微生物的生物生产培养基可包含适于预期代谢途径的碳源或底物，所述重组微生物具有脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物合成途径。合适的底物可包括但不限于：单糖，如葡萄糖和果糖；低聚糖，如乳糖和蔗糖；多糖，如淀粉、纤维素或它们的混合物，以及来自可再生原料(如去蛋白干乳酪清、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽)的未纯化混合物。此外，碳底物也可为一碳底物，如二氧化碳、一氧化碳或甲醇，已证明这些一碳底物能被代谢转化为关键生化中间产物。除了一碳和二碳底物，已知甲基营养微生物还利用多种其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种参与代谢活动的氨基酸。
虽然预期所有上述碳底物及其混合物均适合在本发明中作为碳源，但常见的用作碳源的碳底物是各种单体糖和低聚糖，例如葡萄糖、果糖和蔗糖，以及任何这些糖的混合物。其他合适的底物包括木糖、阿拉伯糖、其他纤维素基C5糖、高果糖玉米糖浆，以及各种可商购获得的其他糖类和糖类混合物。可从诸如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其他水果以及甜高粱等原料获得蔗糖。葡萄糖和右旋糖可通过使淀粉基原料(包括谷物，如玉米、小麦、裸麦、大麦和燕麦)糖化来获得。另外，在一些实施例中，全部或一部分碳源可为甘油。或者，可将甘油作为附加碳源排除在外。
在一个实施例中，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油，以及它们的混合物。碳源中这些组分的量可各自不同且独立地大于该碳源的约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或者更多，最高至100％或者基本上100％。
此外，已知甲基营养微生物利用多种其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种参与代谢活动的氨基酸。例如，已知甲基营养型酵母利用来自甲胺的碳生成海藻糖或甘油(Bellion et al.,Microb.Growth C1 Compd.(Int.Symp.),7th(1993),415-32.Editor(s):Murrell,J.Collin；Kelly,Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK(Bellion等人，《微生物在C1化合物中的生长》(国际学术研讨会论文集)，1993年第7版第415-432页。编辑：Murrell,J.Collin；Kelly,Don P。出版者：英国安多弗Intercept公司))。类似地，假丝酵母属的各种菌种将代谢丙氨酸或油酸(Sulter et al.,Arch.Microbiol.153:485-489(1990)(Sulter等人，《微生物学文献集》，1990年第153卷第485-489页))。因此，预期本发明的实施例中利用的碳源可涵盖多种含碳底物。
此外，可通过如例如美国专利公布No.2007/0031918A1所述的预处理和糖化工艺，从纤维素类和木质纤维素类生物质获得可发酵性糖，该专利公布以引用方式并入本文。生物质是指任何纤维素或木质纤维素材料，包括含有纤维素、并且任选地还含有半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可来自单一来源，或者生物质可包含来自一个以上来源的混合物；例如，生物质可包含玉米穗轴和玉米秸秆的混合物，或者禾草和树叶的混合物。生物质包括但不限于：生物能源作物、农业残余物、城市固体废弃物、工业固体废弃物、造纸污泥、庭院废弃物、木材和林业废弃物。生物质的例子包括但不限于：玉米籽粒、玉米穗轴、作物残余物如玉米苞叶、玉米秸秆、禾草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、由碾磨谷物获得的组分、树木、树枝、根、叶、木片、木屑、灌木和草丛、蔬菜、水果、花和畜肥。可在生物生产方法或系统中利用任何此类生物质来提供碳源。将纤维素类生物质分解成更多可用且可利用的碳分子(包括糖)的混合物的各种方法包括：在存在浓酸或稀酸(如<1％的硫酸)的情况下加热；用氨处理；用离子盐处理；酶促降解；以及这些方法的组合。这些方法通常在机械分离和碾磨之后进行，然后则实施适当的分离过程。
在各种实施例中，向例如在包含反应器容器的工业系统中的微生物提供多种糖(包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纤维素或半纤维素)中的任一种，可在该反应器容器中混合确定成分培养基(例如低盐培养基，包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基，以及许多其他培养基或这些培养基的变化形式)、提供一种或多种脂肪酸或脂肪酸衍生生物合成替代途径的微生物接种物、以及碳源。碳源进入细胞并且通过熟知且常见的代谢途径发生分解代谢，产生常见的代谢中间产物，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。(参见Molecular Biology of the Cell,3rd Ed.,B.Alberts et al.GarlandPublishing,New York,1994,pp.42-45,66-74(《细胞分子生物学》第3版，B.Alberts等人，纽约加兰出版社，1994年，第42-45页，第66-74页)，该书以引用方式并入，涉及糖的基础代谢分解途径的教导内容；Principles of Biochemistry,3rd Ed.,D.L.Nelson&M.M.Cox,Worth Publishers,New York,2000,pp 527-658(《生物化学原理》第3版，D.L.Nelson和M.M.Cox，纽约沃斯出版社，2000年，第527-658页)，该书以引用方式并入，涉及主要代谢途径的教导内容；以及Biochemistry,4th Ed.,L.Stryer,W.H.Freeman and Co.,New York,1995,pp.463-650(《生物化学》第4版，L.Stryer，W.H.弗里曼公司，纽约，1995年，第463-650页)，该书也以引用方式并入，涉及主要代谢途径的教导内容)。
可根据多种方法(包括但不限于ASTM D6866，或各种其他技术)辨别生物基碳与石油基碳。例如，生物基碳源与石油基碳源相比，其碳14和碳12比例不同，其中生物基碳源中的碳14比例更高。在各种实施例中，碳源不是石油基的，或者不是石油基为主的。在各种实施例中，非石油基的碳源比例为大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％，或者更多。在各种实施例中，碳源的碳14与碳12比例为约1.0×10-14或更大，例如，2.0×10-14或更大、3.0×10-14或更大、4.0×10-14或更大、5.0×10-14或更大、6.0×10-14或更大、7.0×10-14或更大、8.0×10-14或更大、9.0×10-14或更大，或者10.0×10-14或更大。
任何实施例的碳源包括C6碳源或C3碳源。任何实施例的碳源包括一种或多种纤维素糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖，或者它们的任意组合。任何实施例的碳源包含按质量计小于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的甘油。
B.接种物(微生物)
根据本发明的发酵生物生产过程可利用接种物，该接种物包含上文所述的经遗传修饰微生物中的任一种。可在选自本文列表的微生物或另一种合适的微生物中提供本文所述并受权利要求书保护的特征，所述微生物还具有一种或多种天然的、引入的或增强的脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物生产途径。因此，在一些实施例中，所述微生物具有内源性脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径(在一些此类实施例中，该途径可被增强)，而在其他实施例中，所述微生物不具有内源性脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径。
各种各样的这些经遗传修饰微生物可具有遗传修饰和/或其他系统变化，正如可能在本发明人中一位或多位的其他专利申请和/或被转让给本发明专利申请所有者的其他专利申请中所描述的那样。
例子描述了对某些细菌和酵母微生物的具体修改形式和评估。本发明的范围并不意味着局限于这些物种，而是普遍适用于多种合适的微生物。一般来讲，用于本发明的微生物可选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
对于一些实施例，最初为所选化学产物的生物生产而选定的微生物宿主应当也能高效率地利用糖类，包括葡萄糖。大多数细菌能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效利用碳水化合物，因此对于葡萄糖或其他碳水化合物作为主要附加碳源的实施例而言，这些环境微生物不适合作为宿主。
随着各种物种的基因组为人们所知，本发明可容易地应用于越来越多的合适微生物。另外，考虑到遗传测序的成本相对较低，可容易地测定所关注物种的遗传序列，使本发明所述方面的应用更易于实现(基于遗传修饰能容易地应用于具有已知基因组序列的微生物)。
更具体地讲，根据本文所述的各种标准，用于化学产物的生物生产的合适微生物宿主通常可包括但不限于：任何革兰氏阴性微生物，更具体地讲肠杆菌科的成员，如大肠杆菌、食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)或假单胞菌属物种(Pseudomononassp.)；任何革兰氏阳性微生物，例如枯草芽孢杆菌、乳杆菌属物种(Lactobaccilus sp)或乳球菌属物种(Lactococcus sp)；酵母，例如酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)或树干毕赤酵母(Pichia stipitis)；以及其他种群或微生物物种。更具体地讲，用于脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物生产的合适微生物宿主通常包括但不限于这些属的成员：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属以及酵母属。可特别关注的宿主包括：食羧寡养菌(如菌株OM5)、大肠杆菌、富养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)(钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator))、地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母。
更具体地讲，用于脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物生产的合适微生物宿主通常包括但不限于这些属的成员：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属以及酵母属。
可特别关注的宿主包括：食羧寡养菌(如菌株OM5T)、大肠杆菌、富养产碱菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母。另外，可将这些物种的任何已知菌株用作起始微生物，如可以是以下物种中的任一种，包括其各自的菌株：巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)、肯彭贪铜菌(Cupriavidus campinensis)、吉拉迪贪铜菌(Cupriavidus gilardi)、Cupriavidus laharsis、耐重金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)、草酸盐贪铜菌(Cupriavidus oxalaticus)、偶发贪铜菌(Cupriaviduspauculus)、Cupriavidus pinatubonensis、呼吸系统贪铜菌(Cupriavidus respiraculi)以及台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)。
在一些实施例中，重组微生物为革兰氏阴性菌。在一些实施例中，重组微生物选自这些属：发酵单胞菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属和克雷伯氏菌属。在一些实施例中，重组微生物选自这些种：大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食羧寡养菌和恶臭假单胞菌。在一些实施例中，重组微生物为大肠杆菌菌株。
在一些实施例中，重组微生物为革兰氏阳性菌。在一些实施例中，重组微生物选自这些属：梭菌属、沙门氏菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属以及短杆菌属。在一些实施例中，重组微生物选自这些种：地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌以及枯草芽孢杆菌。在特定实施例中，重组微生物为枯草芽孢杆菌菌株。
在一些实施例中，重组微生物为酵母。在一些实施例中，重组微生物选自这些属：毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克雷伯氏菌属、伊萨酵母属(Issatchenkia)以及酵母属。在特定实施例中，重组微生物为酿酒酵母。
根据本发明，还应当理解，上述微生物中的任一种都可以用于生产除脂肪酸或脂肪酸衍生产物以外的化学产物。
对宿主细胞进行遗传修饰的能力对于任何重组微生物的生产而言至关重要。转基因技术的模式可通过电穿孔、接合、转导或天然转化实现。可使用多种多样的宿主接合质粒和药物抗性标记。根据可在宿主中发挥功能的抗生素抗性标记的性质，为宿主微生物设计克隆载体。
C.发酵营养培养基和培养条件
除了合适的碳源(例如选自本文所公开类型之一)以外，生物生产培养基还必须包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其他组分，这些组分是本领域技术人员已知的，适于培养物生长，并适用于促进本发明化学产物生物生产所必需的酶途径。
本发明的另一方面涉及培养基和培养条件，所述培养基和培养条件包含本发明的经遗传修饰的微生物和任选的补充物。
细胞通常在约25℃至约40℃的温度范围内生长于合适的培养基中，对于嗜热微生物来说，温度也可高至70℃。本发明中的合适生长培养基为常见的商业制备培养基，例如Luria Bertani(LB)肉汤、Terrific肉汤(TB)、M9基本培养基、Sabouraud右旋糖(SD)肉汤、酵母培养基(YM)肉汤、(Ymin)酵母合成基本培养基，以及如本文所述的基本培养基，如M9基本培养基。也可使用其他确定成分的或合成的生长培养基，并且用于特定微生物生长的合适培养基将是微生物学或生物生产科学领域的技术人员已知的。在各种实施例中，可开发并使用一种基本培养基，该基本培养基不包含各种组分或包含低添加水平的各种组分，例如小于10、5、2或1g/L的复合氮源，所述复合氮源包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粉、玉米浆或酪蛋白。这些基本培养基也可具有有限补充的维生素混合物，所述维生素混合物包括生物素、维生素B12和维生素B12衍生物、硫胺素、泛酸以及其他维生素。基本培养基也可具有有限的简单无机营养物源，所述简单无机营养物源包含：小于28、17或2.5mM的磷酸盐，小于25或4mM的硫酸盐，以及小于130或50mM的总氮。
用于生物生产的合适pH范围为pH 3.0至pH 10.0，其中pH 6.0至pH 8.0为初始条件的典型pH范围。例如，pH可为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0。然而，这些pH范围并非意在限制用于特定实施例的实际培养条件。
生物生产可在有氧条件、微氧条件或无氧条件下进行，伴随或不伴随搅拌。
在各种实施例中，还可向包含此类微生物群体的生物反应器容器中加入特定补充物，以进一步改进所述方法和系统。
D.生物生产反应器和系统
利用根据本发明的方法和/或组合物的发酵系统也在本发明的范围之内。
可将如本文所述和/或提及的任何重组微生物引入工业生物生产系统，在该系统中，微生物通过商业上可行的操作将碳源转化为脂肪酸或脂肪酸衍生产物。生物生产系统包括将此类重组微生物引入生物反应器容器(该生物反应器容器具有适合该重组微生物生长的碳源底物和生物生产培养基)，并且将该生物生产系统维持在合适的温度范围内(并且如果反应在有氧或微氧条件下进行，还要将生物生产系统维持在合适的溶解氧浓度范围内)持续合适的时间，以获得将底物分子的一部分转化为所选化学产物的期望结果。工业生物生产系统及其操作是化学工程和生物工艺工程领域的技术人员所熟知的。
生物生产可在有氧条件、微氧条件或无氧条件下进行，伴随或不伴随搅拌。为实现有氧、微氧和无氧条件而对培养物和微生物群体进行的操作是本领域已知的，并且可以监控包含营养培养基和此类微生物群体的液体培养物的溶解氧水平，以维持或确认所需的有氧、微氧或无氧条件。当使用合成气作为原料时，可利用有氧、微氧或无氧条件。当使用糖时，可在各种实施例中实现厌氧、有氧或微氧条件。
可将如本文所述和/或提及的任何重组微生物引入工业生物生产系统，在该系统中微生物通过商业上可行的操作将碳源转化为选定化学产物。生物生产系统包括将此类重组微生物引入生物反应器容器(该生物反应容器具有适合该重组微生物生长的碳源底物和生物生产培养基)，并且将该生物生产系统维持在合适的温度范围内(并且如果反应在有氧或微氧条件下进行，还将生物生产系统维持在合适的溶解氧浓度范围内)持续合适的时间，以获得将底物分子的一部分转化为选定化学产物的期望结果。
在各种实施例中，向例如在包含反应器容器的工业系统中的微生物提供合成气组分或糖，可在该反应器容器中混合确定成分培养基(例如包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基以及许多其他培养基或这些培养基的变型形式的基本盐培养基)、提供本文所提出生物合成途径的实施例的微生物接种物和碳源。碳源进入细胞并且通过熟知且常见的代谢途径发生分解代谢，产生常见的代谢中间产物，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或乙酰辅酶A。(参见Molecular Biology of the Cell,3rd Ed.,B.Alberts etal.Garland Publishing,New York,1994,pp.42-45,66-74(《分子细胞生物学》第3版，B.Alberts等人，纽约加兰出版社，1994年，第42-45页，第66-74页)，该书以引用方式并入，涉及糖的基础代谢分解途径的教导内容；Principles of Biochemistry,3rd Ed.,D.L.Nelson&M.M.Cox,Worth Publishers,New York,2000,pp.527-658(《生物化学原理》第3版，D.L.Nelson和M.M.Cox，纽约沃斯出版社，2000年，第527-658页)，该书以引用方式并入，涉及主要代谢途径的教导内容；以及Biochemistry,4th Ed.,L.Stryer,W.H.Freemanand Co.,New York,1995,pp.463-650(《生物化学》第4版，L.Stryer，W.H.弗里曼公司，纽约，1995年，第463-650页)，该书也以引用方式并入，涉及主要代谢途径的教导内容)。
此外对于各种类型的工业生物生产而言，本发明的各种实施例可使用分批式的工业生物反应器。经典的分批生物反应器系统被认为是“封闭”的，意味着在相应的生物生产事件开始时培养基组成就已确定，并且在随生物生产事件结束而基本结束的这段时间内，不人为改变培养基组成或添加培养基。因此，生物生产事件开始时，用所需的一种或多种微生物接种培养基，然后生物生产即可在不向系统中添加任何物质的情况下进行。但是，“分批”式生物生产事件通常分批添加碳源，并且经常试图控制例如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组合物不断变化，直到生物生产事件停止。在分批培养物内，细胞从静态停滞期缓慢上升到高速生长对数期，最终达到稳定期，此时生长速率减缓或停止。如果不加处理，稳定期中的细胞将最终死亡。对数期的细胞一般负责产生大部分的所需终产物或中间体。
标准分批系统的变型形式是补料分批系统。补料分批生物生产工艺也适用于本发明并且包括典型的分批系统，不同的是随着生物生产的进行递增地添加营养物质(包括底物)。当分解代谢物抑制趋于抑制细胞的代谢并且人们期望在培养基中维持有限量底物的情况下，补料分批系统是有用的。可例如通过在不同时间分析样品直接测定补料分批系统中的实际营养物质浓度，或根据可测定因素(例如pH、溶解氧和废气(例如CO2)的分压)的变化来估计补料分批系统中的实际营养物质浓度。分批方法和补料分批方法是本领域中常用且熟知的方法，其例子可见于如下文献：Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbookof Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,Mass(Thomas D.Brock，《生物技术：工业微生物学教材》第2版，1989年，由位于马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates有限公司出版)、Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992)(Deshpande和Mukund V，《生物技术与应用生物化学》，第36卷，第227页，1992年)以及Biochemical Engineering Fundamentals,2ndEd.J.E.Bailey and D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986(《生物化学工程基础》第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，纽约麦格劳-希尔出版社，1986年)，这些文献均以引用方式并入本文，用于生物生产的一般性指导。
尽管本发明的实施例可用分批模式或补料分批模式进行，但设想本发明将适用于连续生物生产方法。连续生物生产被视为“开放”系统，在该系统中，将确定成分的生物生产培养基连续加入生物反应器中，同时移出等量的条件培养基以供加工。连续生物生产一般将培养物维持在可控的密度范围内，在这种情况下细胞主要呈对数期生长。连续生物反应器操作有两种类型，包括恒化器，其中将新鲜培养基送入容器，同时以相同速率移出容器内容物。这种方法的局限性在于会损失细胞，并且一般不能达到高细胞密度。实际上，通常人们可通过补料分批工艺获得高得多的细胞密度。另一种连续生物反应器采用灌注培养，灌注培养类似于恒化器方法，不同之处在于用分离技术处理从容器中移出的料流，通过该分离技术将活细胞回收至容器中。这种类型的连续生物反应器操作经证实能产生显著高于补料分批的细胞密度，并且可以连续操作。连续生物生产特别有利于工业操作，因为其节省了与进行下一次生物生产事件所需的排空、清洁和准备设备相关的停工时间。此外，相对于以分批模式运行下游的单元操作(例如，蒸馏)而言，连续操作通常更经济。
连续生物生产允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何数目的因素。例如，一种方法将限制性营养物质(例如，碳源或氮水平)维持在固定速率，并允许适度调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。调节连续生物生产工艺中的营养物质和生长因素的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物领域熟知的，Brock(见上文)详述了多种方法。
设想可通过分批、补料分批或连续工艺来实施本发明的实施例，并且任何已知的生物生产模式均适用。设想可将细胞固定在惰性支架上作为全细胞催化剂并且经受适合生物生产化学产物的生物生产条件，或可在容器(例如培养容器)中的液体培养基中培养细胞。因此，此类工艺中所用的实施例以及使用这些工艺的生物生产系统中所用的实施例包括，本发明的经遗传修饰的微生物群体、在培养基(包含用于此类群体的营养物质)中包含此类群体的培养系统以及制备选定化学产物的方法。
本发明的实施例包括在生物生产系统中制备选定化学产物的方法，其中一些方法可包括在此类生物生产事件后获得脂肪酸或脂肪酸衍生产物。例如，制备脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方法可包括：向培养容器提供包含合适营养物质的培养基；向培养容器提供包含本文所述遗传修饰的经遗传修饰微生物的接种物，使得微生物从合成气和/或糖分子中产生选定化学产物；以及将培养容器维持在合适的条件下，以便经遗传修饰微生物产生选定化学产物。
在生物生产方法和系统(包括用于产生选定化学产物的工业生物生产系统)中，产生经遗传工程改造的重组微生物并利用其来修饰一个或多个方面，从而相比于缺少该一种或多种修饰的对照微生物，使化学产物的生物产量有效增加至少20％，这也在本发明的范围之内。
在各种实施例中，本发明涉及用于生物生产如本文所述化学产物的系统，所述系统包括：适用于微生物细胞培养的发酵罐、用于将内容物从发酵罐排放至萃取和/或分离容器的管线以及适用于从细胞培养废液中移出化学产物的萃取和/或分离容器。在各种实施例中，该系统包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心器、反萃取塔、混合容器或它们的组合。
以下已发表资源以引用方式并入本文，其相应教导内容表示这些相关领域中的技术水平，并且根据需要为如下公开内容提供支持，所述公开内容指导如何在工业系统中于本发明生产条件下由糖源工业生物生产化学产物的制备和使用方法，所述工业系统可用于通过本发明的任何重组微生物来实现这种转化(Biochemical EngineeringFundamentals,2nd Ed.J.E.Bailey and D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986(《生物化学工程基础》第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，纽约麦格劳-希尔出版社，1986年)，全书用作指示性目的并且第9章第533-657页特别涉及生物反应器设计；Unit Operations ofChemical Engineering,5th Ed.,W.L.McCabe et al.,McGraw Hill,New York 1993(《化学工程单元操作》第5版，W.L.McCabe等人，纽约麦格劳-希尔出版社，1993年)，全书用作指示性目的并特别涉及对处理和分离技术的分析；Equilibrium Staged Separations,P.C.Wankat,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ USA,1988(《平衡级分离》，P.C.Wankat，美国新泽西州恩格尔伍德克利夫斯普伦蒂斯霍尔出版社，1988年)，全书涉及分离技术教导内容)。
F.生产指标
在一些实施例中，该遗传修饰使微生物合成选定脂肪酸或脂肪酸衍生化学产物的速率或滴度增加超过缺少所述至少一种遗传修饰的对照微生物产生选定化学产物的速率或滴度。在一些实施例中，该遗传修饰能有效增加酶转化成选定化学产物的转化率，相比于缺少该遗传修饰的对照微生物的酶转化率增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约50％。在各种实施例中，例如使用本文所公开的方法之一，选定化学产物的生物产量可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50克/升的滴度。
由于本文所公开的进展涉及选定化学产物的商业发酵，可通过理解这些进展来实现本发明的实施例，因此可将本发明的实施例与其他遗传修饰和/或方法或系统调节结合，以便获得能有效产生化学产物(例如，脂肪酸或脂肪酸衍生物)的微生物(以及相应的方法)，所产生的化学产物为每升最终发酵液(例如，用过的发酵液)至少10、至少20、至少30、至少40、至少45、至少50、至少80、至少100或至少120克，该产率用本文所公开的比生产率和/或体积生产率实现。生物生产培养基中所产生的化学产物量一般可采用本领域已知的多种方法来测定，例如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)或气质联用法(GC/MS)。
经遗传修饰微生物群体的比生产率的意外增加可通过以下方法和系统来实现，其中，微生物除了具有增加的丙二酰辅酶A依赖性脂肪酰辅酶A生产途径的活性之外，还具有从丙二酰辅酶A转化为选定化学产物的微生物生产途径，以及降低的脂肪酸合酶系统的选定酶(更具体地讲，为其丙二酰-ACP依赖性脂肪酸延长酶)的酶活性。
在一些实施例中，使用本文所述的经遗传修饰微生物来进行微生物化学生物生产事件(即使用培养的微生物群体来进行的发酵事件)，其中比生产率为每克微生物细胞(以干重计)每小时产生0.01和0.60克之间的选定化学产物(g化学产物/g DCW-hr)。在各种实施例中，比生产率大于0.01、大于0.05、大于0.10、大于0.15、大于0.20、大于0.25、大于0.30、大于0.35、大于0.40、大于0.45或大于0.50g化学产物/g DCW-hr。在特定的微生物化学生产事件中，可在2、4、6、8、12或24小时内评估比生产率。更具体地讲，化学产物的比生产率介于0.05g和0.10g之间、0.10g和0.15g之间、0.15g和0.20g之间、0.20g和0.25g之间、0.25g和0.30g之间、0.30g和0.35g之间、0.35g和0.40g之间、0.40g和0.45g之间或0.45g和0.50g之间的化学产物/g DCW-hr、0.50g和0.55g之间或0.55g和0.60g之间的化学产物/gDCW-hr。各实施例均包括表现出这种生产率的培养系统。
另外，在本发明的各种实施例中，所达到的体积生产率可为约0.25g脂肪酸(或其他化学产物)/升/小时(g(化学产物)/L-hr)，可大于约0.25g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约0.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约1.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约1.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约2.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约2.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约3.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约3.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约4.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约4.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约5.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约5.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约6.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约6.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约7.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约7.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约8.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约8.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约9.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约9.50g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr，可大于约10.0g脂肪酸(或其他化学产物)/L-hr。
在一些实施例中，24小时的发酵(培养)时间内所测得的比生产率可大于约0.01g、0.05g、0.10g、0.20g、0.5g、1.0g、2.0g、3.0g、4.0g、5.0g、6.0g、7.0g、8.0g、9.0g、10.0g、11.0g或12.0g化学产物/g DCW的微生物(基于24小时结束时的最终DCW)。
在本发明的各个方面和各种实施例中，微生物的比生产率获得了大幅度的增加，这推动了微生物化学生产(例如，脂肪酸(但不限于脂肪酸))在发酵领域中的发展并提高了其商业经济可行性。
换言之，在各种实施例中，比生产率超过(至少为)0.01g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.05g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.10g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.15g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.20g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.25g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.30g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.35g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.40g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.45g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.50g化学产物/g DCW-hr，超过(至少为)0.60g化学产物/g DCW-hr。根据本发明的某些实施例，化学产物为脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
更一般地说，基于本文所述的遗传修饰的各种组合，可选地结合本文所述的补充剂，本文所述的脂肪酸或脂肪酸衍生产物以及其他化学产物的比生产率值可超过0.01g化学产物/g DCW-hr，可超过0.05g化学产物/g DCW-hr，可超过0.10g化学产物/g DCW-hr，可超过0.15g化学产物/g DCW-hr，可超过0.20g化学产物/g DCW-hr，可超过0.25g化学产物/gDCW-hr，可超过0.30g化学产物/g DCW-hr，可超过0.35g化学产物/g DCW-hr，可超过0.40g化学产物/g DCW-hr，可超过0.45g化学产物/g DCW-hr，并且可超过0.50g或0.60g化学产物/g DCW-hr。在特定的微生物化学生产事件中，可在2、4、6、8、12或24小时内评估这种比生产率。
通过本发明的实施例实现的改进可由与缺少本文所提出的特定遗传修饰组合的合适对照微生物(含有或不含有本文所提出的补充剂，该补充剂被添加至含有该微生物群体的容器中)相比时，比生产率增加的百分比或体积生产率增加的百分比来确定。对于具体实施例和具体实施例组而言，这种比生产率和/或体积生产率改进为超过此类合适对照微生物的相应比生产率和/或体积生产率至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％和至少500％。
以引用方式并入的特定方法、说明书教导内容和/或引用的参考文献可并入实例中。另外，在各种实施例中，化学产物的产量可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/L的滴度。
这些指标可适用于任何组成部分，例如产生化学产物的经遗传修饰微生物、方法，以及系统(例如，利用本文所公开的经遗传修饰微生物和/或方法的发酵系统)。
应当理解，使用本文所提供的策略和方法以及基于途径和途径部分的相互关系的发现而产生的迭代改进，可在生物生产事件结束时获得甚至更大的化学产物生物产量。
VI.所产生的产物―化学产物
本文所述的新型生物生产途径、发酵工艺和经遗传修饰微生物经工程改造用于产生各种所关注的化学产物。其中一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的脂肪酸。这组化学产物包括：丁酸盐或丁酸、戊酸盐或戊酸、己酸盐或己酸、庚酸盐或庚酸、辛酸盐或辛酸、壬酸盐或壬酸、癸酸盐或癸酸、十一酸盐或十一酸、十二酸盐或十二酸、十三酸盐或十三酸、十四酸盐或十四酸、十五酸盐或十五酸、十六酸盐或十六酸、十七酸盐或十七酸、十八酸盐或十八酸、十九酸盐或十九酸、二十酸盐或二十酸。这些脂肪酸产物可利用脂肪酰辅酶A硫酯酶或蜡酯合酶的活性由脂肪酰辅酶A中间体产生。或者，这些脂肪酸还可如下由脂肪酰辅酶A中间体产生：首先利用脂肪酰辅酶A磷酸转移酶的协同活性产生脂肪酰基磷酸酯，然后利用脂肪酸激酶的活性由脂肪酰基磷酸酯产生脂肪酸。
另一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的脂肪醛。这组化学产物包括：丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十二醛、十三醛、十四醛、十五醛、十六醛、十七醛、十八醛、十九醛和二十醛。这些醛产物可利用脂肪酰辅酶A还原酶或酰基辅酶A还原酶的活性由脂肪酰辅酶A中间体产生。形成脂肪酸的生产菌株也可用于产生脂肪醛。
另一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的脂肪醇。这组化学产物包括：丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇和二十醇。这些脂肪酸产物可利用醛还原酶的活性由脂肪醛产生。形成脂肪酸的生产菌还可用于通过表达编码将脂肪酰辅酶A或游离脂肪酸转化为脂肪醇的酶的基因来产生脂肪醇。这些酶的例子包括形成醇的酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.-)、长链脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)或醛脱氢酶(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶的组合。不动杆菌属物种ADP1的fabG基因(登录号为YP_047869)提供了具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的多肽。家蚕(Bombyx mori)的FAR-N_SDR_e基因(登录号为BAC79425)提供了具有脂肪酰还原酶活性的多肽。嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2的ALDH基因(登录号为YP_001125970)提供了具有醛脱氢酶的多肽。大肠杆菌的yqhD基因(登录号为AP_003562.1)提供了具有醇脱氢酶活性的多肽。这些活性的其他来源是本领域已知的，并且可结合用于生成产生脂肪醇的生产菌株。
另一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的α-烯烃。
另一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的烷烃。
另一种化学产物可以是从4个到大于18个碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子或更多碳原子)的任意链长的二元酸。这些脂肪酸衍生产物可利用本领域已知的酶所催化的ω-氧化作用或末端氧化作用由脂肪酸产生。
这些产物中的任何一者都可在本文中描述为选定化学产物或所关注的化学产物，或描述为脂肪酸产物、脂肪酸衍生物或脂肪酸产物衍生物。另外，以上列出的任何分组(包括任何子组)可被认为是“选定化学产物”、“所关注的化学产物”等等所指代的内容。对于这些化学产物中的任何一者，微生物可固有地包括合成这种化学产物的生物合成途径，以及/或者可需要添加一种或多种异源核酸序列，以提供或完成这种生物合成途径，以便获得这种化学产物的所需产量。
VII.所公开的实施例为非限制性的
虽然本文已经示出并描述了本发明的多个实施例，但应强调的是，此类实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的前提下，可对本文的各种实施例进行多种变型、改变和替换。特别地，无论出于何种理由，对于本文在列表、表中所述或以其他方式提出的化合物、核酸序列、包括特定蛋白(包括功能酶、代谢途径酶或中间体)的多肽、元素、其他组合物或所述浓度的分组，或其他分组(例如，在方案中示出的代谢途径酶)，除非另有明确说明，否则每个此类分组的意图是为各子集实施例提供依据，以及用于鉴别各子集实施例，其中所述子集实施例从广义上说包括这些分组中的每个子集，但排除单独说明的分组的一个或多个成员(或子集)。此外，除非另有明确说明，否则本文所述的任何范围包括其中的所有值和其中的所有子范围。
另外，更广义地讲，根据本文的公开内容、讨论、实例和实施例，可采用本领域的技术范围内常规的分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有充分的说明。(参见，例如Sambrook and Russell，“Molecular Cloning:A LaboratoryManual，”Third Edition 2001(volumes 1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(Sambrook和Russell，《分子克隆实验指南》第3版，2001年，第1-3卷，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社)；Animal Cell Culture,R.I.Freshney,ed.,1986.(《动物细胞培养》，R.I.Freshney编辑，1986年)。)这些已发表资源以引用方式并入本文，涉及文中可找到的标准实验室方法的相应教导内容。这种并入至少用于具体教导内容和/或其他目的，本文在引用这些参考文献时可对这些目的加以说明。如果未对具体教导内容和/或其他目的加以说明，那么专门并入这些已发表资源用于该参考文献的标题、摘要和/或综述中的一者或多者所表明的教导内容。如果专门指定的教导内容和/或其他目的的相关性不大，那么并入这些已发表资源是为了更全面地描述本发明所属领域的情况，以及/或者提供可适用领域的技术人员公知的教导内容。但是，需要特别说明的是，本文中已发表资源的引用不应理解为承认这些发表资源为本发明的现有技术。另外，如果一篇或多篇引入的发表资源与本申请不同或矛盾(包括但不限于所定义的术语、术语的用法、所述的技术等等)，以本申请为准。实例中的主题未体现的部分并入本节内容。
实例
实例1―NphT7突变体
酶NphT7为3-酮脂酰辅酶A合酶，在以乙酰辅酶A作为引物和以丙二酰辅酶A作为延伸供体的情况下，该酶被激活以生成3-酮基-C4-辅酶A产物；该天然酶在较长链的引物上不具有可检测的活性。对NphT7进行残基修饰，以改变酰基辅酶A结合口袋，使其接受链长大于或等于4个碳的底物。这些修饰为单个氨基酸变化、单个氨基酸变化的组合以及靶向的结构环修饰，可允许链长大于或等于4个碳的酰基辅酶A(例如，C4-辅酶A和C6-辅酶A)与丙二酰辅酶A发生缩合反应。根据以下标准进行修饰：
(a)检查来源于结核分支杆菌的相关酶fabH的晶体结构(蛋白数据库中为结构1U6S)，鉴定表16中接触酰基链的残基。基于同源性鉴定NphT7中对应的残基。
表16：与底物中的酰基链接触的mtFabH残基
1U6S(mtFabH)
Asn B81
Thr B82
Leu B142
Thr B145
Phe B157
Ile B189
Ser B276
Val B205
Gln A86
Thr A87
Ile A196
Tyr 304
(b)盖交换突变体。对mtFabH和NphT7之间的序列和结构同源性进行比较，结果表明NphT7中预测的L9环包含第167至201位残基。氨基酸序列：GGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMD，其构成与酰基辅酶A盖对应的L9环结构。盖的饱和突变(盖中每个氨基酸转化为每个其他氨基酸以及盖内突变的组合)可改变盖结构，以接受更大的酰基辅酶A链。
突变体nphT7基因通过寡核苷酸定向突变来构建，所有突变体通过DNA测序验证为正确的。将亲本和突变体nphT7基因克隆到pET28b载体中并与6个His残基一起位于读框内，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃下将培养物在含有35μg/ml卡那霉素的Terrific肉汤中孵育至OD600为0.4。加入0.1mM IPTG诱导表达。在18℃下孵育细胞18小时，然后在4000rpm和4℃下离心10分钟收获细胞。-80℃下保存细胞团，以备裂解之用。制备溶胞产物：在50mL裂解缓冲液(25mM pH 8.0的Tris、300mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇和全能核酸酶)中重悬细胞，并用微流化器裂解(裂解两遍)。在12,000RPM和4℃下离心30分钟，分离可溶性级分。用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)和抗His蛋白质印迹(4μg可溶物/泳道，保持可溶/不溶级分体积相同)分析表达。用Ni-NTA层析法纯化NphT7酶。环突变体mtloop1和mtloop2额外地用DEAE-琼脂糖凝胶层析法纯化。
使用5,5'-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)试剂测定游离辅酶A-SH的释放，并测定作为供体底物的丙二酰辅酶A和各种引物底物(乙酰辅酶A、C4-辅酶A、C6-辅酶A或C10-辅酶A)，以此监测3-酮脂酰辅酶A合酶的活性。使用37℃下和412nm处的吸光度增加(TNB产物形成；在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，□＝14.14mM-1cm-1)来测定酶活性。通过纯化的PaFabG和NADPH将3-酮脂酰辅酶A的产生与3-羟酰辅酶A产物的随后形成结合，也可监测3-酮脂酰辅酶A合酶的活性。反应在室温下进行30分钟，然后加入乙腈至20％并在冰上孵育15分钟以终止反应，通过UPLC-MS/MS分析反应。
表17示出了各种经工程改造的NphT7突变体的比活性。另外，通过用UPLC-质谱测定反应产物，证明了具有I147T和F217V突变的NphT7变体使用丙二酰辅酶A作为延伸供体从C4-辅酶A产生3-酮基-C6-辅酶A、从C6-辅酶A产生3-酮基-C8-辅酶A以及从C10-辅酶A产生3-酮基-C12-辅酶A(见图15；PaFabG将NphT7的反应产物转化为3-OH-酰基辅酶A，以便通过UPLC-MS进行定量分析)。如从这些结果中所见，对NphT7的选定残基进行修饰使底物偏好从在野生型酶中几乎只偏好乙酰辅酶A改变为偏好对C4-辅酶A有显著活性的变体(例如，变体I147F、F217V和I147S、F217V)。
表17：各种NphT7突变体的比活性
“ND”＝未测定
实例2―鉴定3-酮脂酰辅酶A合酶候选物的策略
NphT7是制定鉴定其他3-酮脂酰辅酶A合酶候选物的策略的理想出发点，因为不同于使用丙二酰-ACP作为延伸物的II型FAS 3-酮脂酰ACP合酶(KAS)，NphT7能使用丙二酰辅酶A进行靶向反应，因此NphT7的同源物很可能保持对丙二酰辅酶A的特异性。另外，已通过晶体结构和生化检测对不同生物体的KAS III进行了表征，确定其底物结合位点和底物特异性。与NphT7不同的是，不同生物体的KAS III对长链或支链酰基辅酶A表现出不同的特异性。有相似信息可供KAS I和KAS II使用，但与利用酰基辅酶A作为底物进行缩合反应的KASIII不同的是，KAS I和KAS II需要酰基-ACP作为底物。因此，已知KAS III的晶体结构以及其生化数据可在鉴定识别酰基辅酶A的保守残基时提供指导，并且有助于鉴定利用更长链的酰基辅酶A的NphT7同源物。
表18：不同生物体的KAS III的底物特异性汇总
a由酶活性所测定的底物特异性
*底物包括支链酰基辅酶A
Okamura et al.(PNAS,2010)(Okamura等人，《美国国家科学院院刊》，2010年)确定了NphT7的生化功能，并且将其氨基酸序列与其他NphT7同源物和大肠杆菌KAS III FabH(ecFabH)进行比较。充分表征的ecFabH主要用于描述所有NphT7(NphT7和6个NphT7同源物)之间的相似性以及与KAS III的主要区别。Okaramura等人提供的信息以及描述其他KASIII的其他报告将用于确定鉴定可能的3-酮脂酰辅酶A候选物的规则。
使用以下5个策略来鉴定3-酮脂酰辅酶A候选物：
1.BLASTp，用于鉴定NphT7同源物
基本原理：
a.最可能利用丙二酰辅酶A作为延伸物进行缩合反应
2.鉴定含有(A/G)GGSR序列基序的同源物
基本原理：
a.NphT7同源物中预测的L9环与额外的序列一起插入，它们共用(A/G)GGSR序列基序
b.Okamura等人表明(A/G)GGSR基序可用作识别位点之一，用于识别延伸底物丙二酰辅酶A的辅酶A部分
c.未在KAS III同源物中发现(A/G)GGSR基序和额外的序列，从而表明该序列基序对NphT7同源物是特异的
d.参考文献
i.Okamura et al.,PNAS 2010(Okamura等人，《美国国家科学院院刊》，2010年)
3.选择不含有STPDXPQ序列基序的NphT7同源物
基本原理：
a.在NphT7同源物中，用Gln替换在ecFabH(KAS III)中指示引物底物特异性的Phe87残基。
b.所有NphT7同源物共用STPDXPQ序列基序，其中Gln是该序列基序的一部分。
c.KAS III同源物不具有保守STPDXPQ基序。
d.参考文献
i.Okamura et al.,PNAS 2010(Okamura等人，《美国国家科学院院刊》，2010年)
4.鉴定在底物结合位点只包含疏水残基的同源物
基本原理：
a.ecFabH的Phe87、Leu142、Phe157、Leu188和Leu205形成用于识别乙酰辅酶A的乙酰甲基基团的疏水袋，这些氨基酸在NphT7同源物中不保守
i.NphT7中3/5的氨基酸为疏水残基
b.大多数疏水残基在KAS III同源物中是保守的
c.参考文献
i.Okamura et al.,PNAS 2010(Okamura等人，《美国国家科学院院刊》，2010年)
ii.Qui et al.,Protein Science 2005(Qui等人，《蛋白质科学》，2005年)
iii.Scarsdale et al.,JBC 2001(Scarsdale等人，《生物化学杂志》，2001年)
iv.Qui et al.,JBC 1999(Qui等人，《生物化学杂志》，1999年)
5.鉴定NphT7同源物的不同家族
基本原理：
a.由满足以上要求的NphT7同源物的多重序列比对(MSA)构建的系统发育树将用于选择候选物，该候选物代表由不同祖先进化而来的NphT7同源物的最多样化群组。
i.该多样化使找出NphT7同源物的可能性最高，所述同源物由于由不同祖先进化而来而具有不同的特异性
结果/成果
下文总结了鉴定上文概述的3-酮脂酰辅酶A候选物的5个策略的结果：
1.NphT7的同源性检索
a.以NphT7作为参考序列，最大序列目标设为10,000，不设E值的截止值，进行BLAST检索。
i.BLAST检索获得7141个NphT7的同源物
2.选择具有(A/G)GGSR基序的NphT7同源物
a.309个NphT7同源物具有(A/G)GGSR基序。
3.去除具有STPDXPQ序列基序的同源物
a.288个NphT7同源物不具有STPDXPQ基序
4.基于底物结合袋中的疏水残基的保守性进行选择
a.288个同源物中，144个NphT7同源物在KAS III之间保守的5个残基处具有疏水残基
5.基于NphT7和已知KAS III的进化距离进行选择
a.由具有(A/G)GGSR序列基序的NphT7同源物、NphT7、ecFabH、mtFabH、bsFabH1、bsFabH2、saFabH、spFabH的MSA构建的系统发育树表明，NphT7同源物分为6个不同的家族(表17)。
b.选择涵盖所有6个家族的22个3-酮脂酰辅酶A合酶候选物
i.10个3-酮脂酰辅酶A合酶候选物
1.具有(A/G)GGSR序列基序
2.不具有STPDXPQ序列基序
3.具有保守的疏水残基
ii.11个3-酮脂酰辅酶A合酶候选物
1.具有(A/G)GGSR序列基序
2.不具有STPDXPQ序列基序
iii.1个3-酮脂酰辅酶A合酶候选物
1.具有(A/G)GGSR序列基序
3-酮脂酰辅酶A合酶候选物列表
列出了根据上述标准选择的3-酮脂酰辅酶A合酶。另外，将每个合酶与NphT7、ecFabH、mtFabH和saFabH进行比对，以确定序列同一性、相似性和空位的百分比。基于满足所有标准选择合酶1至合酶10。基于满足所有标准(除了保守的疏水残基外)选择合酶11至合酶21。基于具有(A/G)GGSR序列基序选择合酶22
表19 3-酮脂酰辅酶A合酶列表
实例3―组合使用NphT7变体和/或fabH同源物与硫酯酶，以产生具有特定链长的脂肪 酸
虽然NphT7的突变体经工程改造为能够延长链长C4、C6和C10的酰基辅酶A，但是这些酶的比活性对于较长链长来说相对较低。将酰基辅酶A延长2个碳长度而形成3-酮脂酰辅酶A，这个反应也可利用酮脂酰辅酶A合酶(称为KASIII酶，由fabH基因同源物编码)来进行。许多这类基因同源物由商业DNA合成供应商(DNA2.0)使用在大肠杆菌中最适表达的密码子来合成，并且在N端与6个His残基融合，以便通过亲和层析对蛋白进行纯化。基因在大肠杆菌中表达并使用DTNB测定法测定KAS活性，具体分析丙二酰辅酶A和不同链长的酰基辅酶A缩合引起的辅酶A-SH的释放。表20列出了酶同源物，这些酶同源物具有足够高水平的KAS活性，可使这些酶延长表中所注明的不同链长的酰基辅酶A。如从表20中的结果可见，不同来源的FabH酶具有不同的底物链长偏好。
表20：高水平KAS活性
另一种实现链长特异性的方法是，可靶向脂肪酸从酰基辅酶A前体的释放。编码各种硫酯酶的基因由商业DNA合成供应商(DNA2.0)使用在大肠杆菌中优化表达的密码子来合成，并且表达所述基因。基于N端的6个His亲和标签，通过亲和层析对酶进行纯化。评估各种硫酯酶作用于不同链长的酰基辅酶A的活性(图16)。因此，虽然硫酯酶PA2801TE具有从C6-辅酶A到C16-辅酶A的广谱特异性，但是硫酯酶'tesA对短于C10的酰基辅酶A没有可检测的活性，并且对C10-辅酶A几乎没有活性。
因此，将NphT7变体、具有表20所示的所需特异性的FabH以及图16所示的合适硫酯酶以及包含经工程改造脂肪酸途径的酶结合到重组生物体中，使靶向生产具有特定链长的脂肪酸成为可能。
实例4―摇瓶生产游离脂肪酸(FFA)
评估多种经遗传修饰的大肠杆菌菌株的游离脂肪酸产量。这些菌株包括基于菌株BW25113而被工程改造的宿主，并且具有以下额外遗传修饰：ΔldhA::frt、ΔpflB::frt、ΔmgsA::frt、ΔpoxB::frt、Δpta-ack::frt；fabI的温度敏感等位基因(fabIts S241F)；以及额外修饰：Δtig::frt、ΔatoDAEB::frt和ΔfadD::frt，这些修饰可将酰基辅酶A底物或脂肪酸产物的转移降至最低。质粒上还提供有编码NphT7、一种或多种硫酯酶、酮基辅酶A还原酶(KCR)、3-羟酰辅酶A脱水酶(3HDh)以及烯酰辅酶A还原酶(EnCr)的基因。表21示出了存在于样品1至样品5中的基因。
表21：存在于样品1至样品5中的基因
图17示出了由这些样品产生C8至C18 FFA的速率，图18示出了C6至C18 FFA产量的滴度。图19示出了用菌株样品3产生的链长特异性的分布，其中36％的产物为C14至C16FFA。这些结果表明，这些经工程改造的菌株增加了脂肪酸的产量，其中样品3的滴度为4.07g/L。
可供选择的KCR、3HDh和EnCr酶可用于提供必要活性，用于将NphT7、NphT7突变体或fabH的同源物的酮脂酰辅酶A产物转化为延长2个碳的完全饱和产物，即通过KCR将酮脂酰辅酶A还原为3-羟酰辅酶A、通过3HDh将3-羟酰辅酶A脱水为烯酰辅酶A以及通过EnCr将烯酰辅酶A还原为酰基辅酶A。例如，可供选择的KCR包括FadIJ、Hbd和FadB。FadB作为KCR的活性足够高，直至C16也有活性(见下表22)。
表22：FadB对不同链长的3-羟酰辅酶A的活性
底物 比活性(U/mg)
3-OH-C4-辅酶A 0.4321
3-OH-C6-辅酶A 0.585
3-OH-C8-辅酶A 0.1255
3-OH-C10-辅酶A 0.1777
3-OH-C12-辅酶A 0.1935
3-OH-C14-辅酶A 0.2564
3-OH-C16-辅酶A
测试了可供选择的3HDh(包括双功能的FadB、FabG、FadJ和Hbd)的活性和产物特异性。图20示出了测试结果，结果表示为用最偏好底物所得的活性百分比。
为了防止脂肪酸产物的消耗并维持链长特异性，可能需要额外的宿主遗传修饰来除去硫酯酶。这些修饰包括tesB、yciA、fadM、ybgC和ybfF的缺失或调节。
实例5.3-酮基-C5-辅酶A的产量
已证明，使用本发明的经遗传修饰酶和方法可产生奇数链长的脂肪酸。具体地讲，证明了在以丙酰辅酶A作为引物和以丙二酰辅酶A作为延伸供体的情况下，酶NphT7和NphT7突变体被激活以生成C5酮脂酰辅酶A。本文所述的NphT7变体和fabH将进一步延伸C5酮脂酰辅酶A，以形成更长链的奇数脂肪酸产物。
新纯化的His6-NphT7、His6-NphT7(I147T,F217V)、His6-NphT7(I147S,F217V)和His6-Hbd用于本实例中的所有实验。NphT7反应物(200μL)包含100mM Tris-HCl(pH 8)、5mMMgCl2、1mM丙二酰辅酶A、1mM引物辅酶A(C2-或C3-辅酶A)以及不同浓度的野生型NphT7或突变酶。同时也进行了不含有任何引物辅酶A、但含有丙二酰辅酶A的反应。37℃下，在303nm处监测Mg2+-3-酮脂酰辅酶A加合物的形成，持续15分钟。NphT7-Hbd偶联反应物(200μL)包含100mM Tris-HCl(pH 8)、0.75mM NADH、1mM丙二酰辅酶A、1mM引物辅酶A(C2或C3-辅酶A)、10μg部分纯化的Hbd以及不同浓度的野生型NphT7或突变酶。同时也进行了不含有任何引物辅酶A、但含有丙二酰辅酶A的反应。然后在37℃下，在340nm处进行NADH的氧化反应，持续15分钟。在15分钟酶反应结束时，从每个反应物中移出100μL样品，并立即与25μL乙腈混合，终止酶反应。将混合物在冰上孵育至少15分钟，然后在3,220×g和4℃下离心15分钟。保留上清液以供通过UPLC-MS/MS分析检测3-酮脂酰辅酶A和3-OH-C4辅酶A以及C5-辅酶A。在某些实验批次中，也使用Hbd酶来确定所产生的酮基辅酶A是否可被还原为羟酰辅酶A。表23示出了实验结果。
表23：实验中所用底物和酶的汇总
只有在C3-辅酶A和丙二酰辅酶A同时存在的情况下，可由NphT7产生3-酮基-C5-辅酶A(表23中的实验批次2)。当NphT7偶联到Hbd时，大部分3-酮基-C5-辅酶A被还原为3-OH-C5-辅酶A。这些结果表明，野生型NphT7在合成3-酮基-C5-辅酶A中能够利用C3-辅酶A作为引物，而来源于丙酮丁醇梭杆菌的Hbd能够还原3-酮基-C5-辅酶A。
使用NphT7(I147T,F217V)或NphT7(I147S,F217V)突变体的反应结果与在野生型NphT7反应中获得的结果相似。这两种突变体都可使用C3-辅酶A作为引物来产生3-酮基-C5-辅酶A，在Hbd和NADH存在的情况下，产生的3-酮基-C5-辅酶A进一步被还原为3-OH-C5-辅酶A(表23中的实验批次7至18)。在乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A共同存在或丙二酰辅酶A单独存在的情况下，通过这些酶只生成了3-酮基-C4-辅酶A。在NphT7(I147T,F217V)或NphT7(I147S,F217V)中检测到更高浓度的产物，因为在这两个反应中使用的酶多于野生型NphT7的反应中使用的酶。
根据3-酮基-C5-辅酶A浓度与每个反应中的酶量的关系作图，NphT7、NphT7(I147T,F217V)和NphT7(I147S,F217V)的比活性(15分钟内的平均值)分别为0.3、0.2和0.27U/mg。
可通过构建重组菌株来产生奇数链脂肪酸(例如，长度为C5、C7、C9、C11、C13、C15和C17的脂肪酸)，所述重组菌株携带表达以下蛋白的基因：NphT7和/或NphT7突变体、具有所需链长特异性的fabH、KCR、3HDh和EnCr以及终止酶(例如，具有所需链长特异性的硫酯酶或酯合酶)，所述重组菌株还提供作为引物的丙酰辅酶A和作为延伸物的丙二酰辅酶A的来源。
实例7.C4和C6脂肪酸的产量
已证明，使用本发明的经遗传修饰酶和方法可产生C4和C6脂肪酸。具体地讲，证明了可通过经遗传修饰而编码某些NphT7突变酶以及PA2801TE硫酯酶的微生物来产生C4和C6脂肪酸。这些氨基酸修饰可使酰基辅酶A(C4-辅酶A和C6-辅酶A)与丙二酰辅酶A发生缩合反应。具体地讲，经遗传修饰微生物包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，这些合酶选自野生型NphT7、具有I147T和F217V突变的NphT7变体、或具有I147S和F217V突变的NphT7变体以及它们的任意组合，并且包含以下中的至少一者：a)异源KCR，例如fadB；b)异源3HDh，例如fadB；c)异源EnCr，例如ter；以及d)硫酯酶PA2801TE。
评估以下经遗传修饰的大肠杆菌菌株的游离脂肪酸产量：
表24：测试菌株的遗传修饰
30℃下，单个菌落在150ml SM11(含有35μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素)中孵育20小时。将培养物转移至50mL锥形管中，4,000RPM下离心15分钟。在新配制的SM11(含磷酸盐)培养基中重悬细胞团，使其光密度为20。合并每个菌株的重悬液，使用2.5ml(5％)合并的重悬液接种50ml不含磷酸盐的SM11培养基。将培养物在30℃下孵育4小时，然后将温度改变为37℃。再孵育20小时后，取出样品并分析其中存在的游离脂肪酸量。图21示出了所产生的C4、C6脂肪酸量和总游离脂肪酸(测定为C4至C18)量。另外，温度改变后第18个小时将样品取出，分析游离脂肪酸的分布。图22示出了该分析的结果。
实例8.C4、C6和C8脂肪酸的产量
使用本发明的经遗传修饰酶和方法产生C4、C6和C8脂肪酸。具体地讲，可通过经遗传修饰而编码某些NphT7突变酶以及硫酯酶的微生物来产生C4、C6和C8脂肪酸。这些氨基酸修饰可使酰基辅酶A(C2-辅酶A、C4-辅酶A和C6-辅酶A)与丙二酰辅酶A发生缩合反应。经遗传修饰微生物包含一种或多种异源3-酮脂酰辅酶A合酶，这些合酶选自野生型NphT7、或具有I147S和F217V突变的NphT7变体以及它们的任意组合，并且包含以下中的至少一者：a)异源KCR，例如fadB；b)异源3HDh，例如fadB；c)异源EnCr，例如ter；以及d)硫酯酶'tesA。
评估以下经遗传修饰的大肠杆菌菌株的游离脂肪酸产量：
表25：测试菌株的遗传修饰
coaA*表示抗反馈抑制的coaA(泛酸激酶)的等位基因。使用实例7中概述的相同方法，但将培养物在温度改变后发酵68小时，取出样品并分析其中存在的游离脂肪酸量。图23示出了所产生的C4、C6和C8游离脂肪酸量，图24示出了所产生的总脂肪酸(C4至C18)量。图25示出了各种菌株所产生的游离脂肪酸的分布。这些结果表明，菌株J和K产生了具有高特异性的C6脂肪酸。
可通过构建重组菌株来产生链长大于C8的脂肪酸(例如，长度为C10、C12、C14、C16和C18的高特异性脂肪酸)，所述重组菌株携带表达以下蛋白的基因：NphT7和/或NphT7突变体、具有所需链长特异性的fabH、KCR、3HDh和EnCr以及终止酶(例如，具有所需特异性的硫酯酶或酯合酶)，所述重组菌株还提供作为引物的乙酰辅酶A和作为延伸物的丙二酰辅酶A的来源。
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是，此类实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员可以进行多种修改、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代形式来实施本发明。

Claims (42)

1.一种经遗传修饰生物体，所述经遗传修饰生物体包含编码3-酮脂酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A还原酶、羟酰辅酶A脱水酶或烯酰辅酶A还原酶的异源核酸序列；并且其中所述微生物能够产生具有C4或更大碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包括NphT7。
3.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包含与SEQID NO 1-120中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述酮脂酰辅酶A还原酶选自3-酮丁酰辅酶A还原酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、3-酮戊酰辅酶A还原酶和3-羟戊酰辅酶A脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的经遗传修饰生物体，其中所述酮脂酰辅酶A还原酶包含与SEQID NO 183和SEQ ID NO 271中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述羟酰辅酶A脱水酶选自3-羟丁酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶。
7.根据权利要求6所述的经遗传修饰生物体，其中所述羟酰辅酶A脱水酶包含与SEQ IDNO 183和SEQ ID NO 272中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述烯酰辅酶A还原酶为反式-2-烯酰还原酶。
9.根据权利要求8所述的经遗传修饰生物体，其中所述烯酰辅酶A还原酶包含与SEQ IDNO 275具有至少70％同源性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包括经修饰的NphT7多肽，所述多肽包含一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自将第86至89位氨基酸从PDRP置换为HFLQ，F217A、F217E、F217G、F217I、F217L、F217M、F217P、F217S、F217T、F217V、F217W、G288S、G309S、I147A、I147C、I147D、I147E、I147F、I147G、I147H、I147K、I147L、I147M、I147N、I147P、I147Q、I147R、I147S、I147T、I147V、I147W、I147Y、V157F、V196G和Y144L。
11.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包括经修饰的NphT7多肽，所述多肽包含两个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E以及I147M和F217K。
12.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包括经修饰的NphT7多肽，所述多肽包含三个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自Y144L、I147T和F217V；I147T、F217V和HFLQ；I147T、V147F和F217V；以及Y144L、I147T和V157F。
13.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述3-酮脂酰辅酶A合酶包括经修饰的NphT7多肽，所述多肽在选自下列的位置具有一种或多种氨基酸置换：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147和Phe217。
14.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述酮脂酰辅酶A还原酶选自3-酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟酰辅酶A脱氢酶。
15.根据权利要求14所述的经遗传修饰生物体，其中所述酮脂酰辅酶A还原酶包含与SEQ ID NO 183和SEQ ID NO 271中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述羟酰辅酶A脱水酶选自3-羟酰辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶。
17.根据权利要求16所述的经遗传修饰生物体，其中所述羟酰辅酶A脱水酶包含与SEQID NO 183和SEQ ID NO 272中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，其中所述烯酰辅酶A还原酶为反式-2-烯酰还原酶。
19.根据权利要求18所述的经遗传修饰生物体，其中所述烯酰辅酶A还原酶包含与SEQID NO 275具有至少70％同源性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，还包含编码硫酯酶或蜡酯合酶的异源核酸序列。
21.根据权利要求1所述的经遗传修饰生物体，还包含编码终止酶的异源核酸序列，所述终止酶催化脂肪酸衍生产物的产生，所述脂肪酸衍生产物选自脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烃、脂肪酰胺、脂肪烷烃和脂肪二酸。
22.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶为酰基辅酶A酯酶，并且所述生物体能够产生脂肪酸。
23.根据权利要求22所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自tesA、'tesA、tesB、yciA、ybgC、ybfF、fadM、AtTE、CpTE、CperfTE、LpTE和PA2801TE。
24.根据权利要求22所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶包含与SEQ ID NO277、SEQ ID NO 278、SEQ ID NO 279、SEQ ID NO 280、SEQ ID NO 281、SEQ ID NO 282、SEQID NO 283、SEQ ID NO 284、SEQ ID NO 285、SEQ ID NO 286、SEQ ID NO 287和SEQ ID NO288中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
25.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中所述蜡酯合酶选自Maq1、Pcry1、Rjos1和Abork1，并且其中所述生物体能够产生脂肪酯。
26.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中所述蜡酯合酶包含与SEQ ID NO289、SEQ ID NO 290、SEQ ID NO 291和SEQ ID NO 292中任一序列具有至少70％同源性的氨基酸序列，并且其中所述生物体能够产生脂肪酯。
27.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)所述3-酮脂酰辅酶A合酶为NphT7；
b)所述酮基辅酶A还原酶选自hbd和fadB；
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶选自crt和fadB；
d)所述烯酰辅酶A还原酶为ter；以及
e)所述硫酯酶选自CpTE、fadM、PA2801TE、tesB、ybgC、ybfF和yciA，
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生四碳或五碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
28.根据权利要求27所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自tesB和yciA。
29.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)一个或多个3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V和NphT7I147T、F217V；
b)所述酮基辅酶A还原酶为fadB；
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶为fadB；
d)所述烯酰辅酶A还原酶为ter；以及
e)所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生六碳或七碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
30.根据权利要求29所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。
31.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7I147T和F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S和F217V以及合酶III；
b)所述酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；
d)所述烯酰辅酶A还原酶为ter；以及
e)所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生八碳或九碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
32.根据权利要求31所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自PA2801TE、tesB和yciA。
33.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7I147T和F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S和F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；
b)所述酮基辅酶A还原酶选自fadB和fabG；
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和ech2；
d)所述烯酰辅酶A还原酶为ter；以及
e)所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生十碳或十一碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
34.根据权利要求33所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自tesB和yciA。
35.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7I147T和F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S和F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；
b)所述酮基辅酶A还原酶选自fadB、fabG和fadJ，
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB、ech和fadJ；
d)所述烯酰辅酶A还原酶为ter；以及
e)所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生十二碳或十三碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
36.根据权利要求35所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA。
37.根据权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中
a)一种或多种3-酮脂酰辅酶A合酶选自NphT7、NphT7 I147T、NphT7 F217V、NphT7I147T和F217V、Npth7 I147S、Npth7 I147S和F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；
b)所述酮基辅酶A还原酶选自fadB和fadJ；
c)所述3-羟酰辅酶A脱水酶选自fadB和fadJ；
b)所述烯酰辅酶A还原酶选自ter、ydiO和fadE；以及
e)所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，
并且其中由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生碳链长为至少14个碳的脂肪酸。
38.根据权利要求37所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自fadM、tesA、tesB和yciA，并且由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生十四碳或十五碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
39.根据权利要求37所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、Pa2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生十六碳或十七碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
40.根据权利要求37所述的经遗传修饰生物体，其中所述硫酯酶选自AtTE、fadM、tesA、tesB、ybfF、ybgC、yciA，并且由所述多核苷酸编码的所述蛋白质能够产生十六碳或十七碳的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
41.根据权利要求1或权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中所述生物体能够将乙酰辅酶A用作引物，将丙二酰辅酶A用作延伸分子，产生具有选自4、6、8、10、12、14、16、18和20的碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
42.根据权利要求1或权利要求20所述的经遗传修饰生物体，其中所述生物体能够将丙酰辅酶A用作引物，将丙二酰辅酶A用作延伸分子，产生具有选自5、7、9、11、13、15、17、19和21的碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
CN201480051860.6A 2013-07-19 2014-07-18 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 Pending CN106795483A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361856652P 2013-07-19 2013-07-19
US61/856,652 2013-07-19
PCT/US2014/047320 WO2015010103A2 (en) 2013-07-19 2014-07-18 Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106795483A true CN106795483A (zh) 2017-05-31

Family

ID=52346854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480051860.6A Pending CN106795483A (zh) 2013-07-19 2014-07-18 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10337038B2 (zh)
EP (1) EP3022310B1 (zh)
JP (1) JP6603658B2 (zh)
CN (1) CN106795483A (zh)
BR (1) BR112016001026A2 (zh)
WO (1) WO2015010103A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109517811A (zh) * 2018-11-29 2019-03-26 滨州医学院 一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
MX2015001780A (es) 2012-08-10 2015-09-28 Opx Biotechnologies Inc Microorganismos y métodos para la producción de ácidos grasos y productos derivados de ácidos grasos.
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
EP2970086B1 (en) 2013-03-15 2018-11-07 Cargill, Incorporated Recovery of 3-hydroxypropionic acid
CN106795483A (zh) 2013-07-19 2017-05-31 嘉吉公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
US11408013B2 (en) * 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
EP3926038A3 (en) * 2015-11-18 2022-03-16 Industrial Microbes, Inc. Functional expression of monooxygenases and methods of use
EP4194563A1 (en) * 2016-04-19 2023-06-14 Kapa Biosystems, Inc. Transposase competitor control system
EP3488006B1 (en) * 2016-07-25 2023-06-07 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods utilizing biotin producing mutant hosts for the production of 7-carbon chemicals
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018144701A2 (en) 2017-02-02 2018-08-09 Cargill Incorporated Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives
WO2019236819A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Cargill, Incorporated Methods and genetically modified cells for producing c8 fatty acids and fatty acid chain products
WO2020005495A1 (en) * 2018-06-28 2020-01-02 Cargill, Incorporated Methods and cells for producing fatty acids and fatty acid chain products
CN109609427B (zh) * 2019-01-25 2021-11-12 中国科学院水生生物研究所 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法
CN111621435B (zh) * 2020-05-28 2022-01-04 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一株粘细菌及其应用
CN111647537B (zh) * 2020-06-18 2022-04-26 浙江工业大学 一种耐盐辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法
CN111793663B (zh) * 2020-07-22 2022-09-27 江南大学 一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用
WO2023178211A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of fatty acid derivatives with reduced levels of byproducts
WO2023178197A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Genomatica, Inc. Recombinant microbes for production of trans-2 unsaturated fatty acids and derivatives thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1301304A (zh) * 1997-06-05 2001-06-27 卡尔金有限责任公司 脂酰辅酶a∶脂肪醇酰基转移酶
US20100285549A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Recombinant microorganism having butanol production capacity and butanol production method
WO2012129450A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Opx Biotechnologies, Inc. Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems
CN102869768A (zh) * 2010-03-02 2013-01-09 麻省理工学院 生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程
WO2013019647A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Ls9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof having improved aliphatic chain length and saturation characteristics
WO2013039563A1 (en) * 2010-09-15 2013-03-21 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
EP2594633A1 (en) * 2007-03-28 2013-05-22 LS9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives

Family Cites Families (266)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2408889A (en) 1946-10-08 Production of organic compounds
US2464768A (en) 1946-02-13 1949-03-15 American Cyanamid Co Preparation of esters of acrylic acid
US2469701A (en) 1946-02-13 1949-05-10 American Cyanamid Co Preparation of acrylic acid
US2798053A (en) 1952-09-03 1957-07-02 Goodrich Co B F Carboxylic polymers
US3687885A (en) 1970-04-15 1972-08-29 Du Pont Water base paints having an improved balance of anti-drip and leveling qualities
US3872037A (en) 1970-12-11 1975-03-18 Polysar Ltd Improved carboxylic latex for paper coating utilizing butadiene-styrene-acrylic acid-acrolein tetrapolymers
GB1349586A (en) 1970-12-11 1974-04-03 Polysar Ltd Latex composition and process for producing the same
US3904685A (en) 1973-07-20 1975-09-09 Celanese Corp Polyacrylic acid having high chelation value and its production
US3891591A (en) 1973-08-13 1975-06-24 Du Pont Coating compositions
US3915921A (en) 1974-07-02 1975-10-28 Goodrich Co B F Unsaturated carboxylic acid-long chain alkyl ester copolymers and tri-polymers water thickening agents and emulsifiers
US4029577A (en) 1975-11-17 1977-06-14 Betz Laboratories, Inc. Polymers for use in water treatment
DE2757329C2 (de) 1977-12-22 1980-02-07 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur Herstellung von Polymerisaten der Acrylsäure oder Methacrylsäure
US4268641A (en) 1979-04-24 1981-05-19 Union Carbide Corporation Acrylic acid-acrylate copolymer thickening agents
US4431547A (en) 1981-08-24 1984-02-14 Nalco Chemical Company Use of acrylamide/acrylic acid copolymers for prevention of fouling by Ca3 (PO4)2
US4985518A (en) 1981-10-26 1991-01-15 American Colloid Company Process for preparing water-absorbing resins
JPS58180233A (ja) 1982-04-19 1983-10-21 Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co Ltd 吸収剤
US4685915A (en) 1984-04-06 1987-08-11 The Procter & Gamble Company Disposable diaper having density and basis weight profiled absorbent core
US4734478A (en) 1984-07-02 1988-03-29 Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co., Ltd. Water absorbing agent
US4708997A (en) 1985-07-22 1987-11-24 The Dow Chemical Company Suspending agent for the suspension polymerization of water-soluble monomers
DE3544770A1 (de) 1985-12-18 1987-06-19 Stockhausen Chem Fab Gmbh Verfahren und vorrichtung zum kontinuierlichen herstellen von polymerisaten und copolymerisaten der acrylsaeure und/oder methacrylsaeure
US5009653A (en) 1988-03-31 1991-04-23 The Procter & Gamble Company Thin, flexible sanitary napkin
US5135677A (en) 1988-04-11 1992-08-04 Nippon Shokubai Co., Ltd. Process for producing acid-type maleic acid polymer and water-treating agent and detergent additive containing said polymer
US4952505A (en) 1988-08-08 1990-08-28 Florida State University Fermentation of trichoderma reesei and apparatus therefor
US5487989A (en) 1988-08-31 1996-01-30 Bioenergy International, L.C. Ethanol production by recombinant hosts
IT1229506B (it) 1989-01-26 1991-09-03 Sigma Prodotti Chimici Srl Polimero dell'acido acrilico esente da solventi residui e procedimento per la sua preparazione.
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
US5145906A (en) 1989-09-28 1992-09-08 Hoechst Celanese Corporation Super-absorbent polymer having improved absorbency properties
JP2938920B2 (ja) 1990-01-31 1999-08-25 住友精化株式会社 吸水性樹脂の製造方法
US5350799A (en) 1990-05-31 1994-09-27 Hoechst Celanese Corporation Process for the conversion of fine superabsorbent polymer particles into larger particles
US5342899A (en) 1991-05-16 1994-08-30 The Dow Chemical Company Process for recycling aqueous fluid absorbents fines to a polymerizer
DE4138408A1 (de) 1991-11-22 1993-05-27 Cassella Ag Hydrophile, hochquellfaehige hydrogele
CA2083346A1 (en) 1991-12-13 1993-06-14 Eric G. Lundquist A catalyzed esterification process
US5142023A (en) 1992-01-24 1992-08-25 Cargill, Incorporated Continuous process for manufacture of lactide polymers with controlled optical purity
US5827255A (en) 1992-07-27 1998-10-27 The Procter & Gamble Company Sanitary napkin comprising an absorbent core having a density gradient
US5405913A (en) 1993-03-22 1995-04-11 The University Of Akron Free radical copper(II)-enolate polymerization initiators
US5510307A (en) 1993-04-08 1996-04-23 Isp Investments Inc. Free radical initiator delivery system
US5510526A (en) 1993-06-29 1996-04-23 Cargill, Incorporated Lactic acid production, separation and/or recovery process
CN1179043C (zh) 1993-08-24 2004-12-08 味之素株式会社 突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,其基因,和氨基酸的生产方法
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
US5558656A (en) 1993-12-20 1996-09-24 The Procter & Gamble Company Sanitary napkin having an internal shaping component
PT827541E (pt) 1995-05-18 2010-02-24 Univ Stellenbosch Sequência de ácido nucleico que codifica uma malatopermease de s. pombe e sua utilização
US5723639A (en) 1995-10-16 1998-03-03 University Of Chicago Esterification of fermentation-derived acids via pervaporation
DE19629372A1 (de) 1996-07-20 1998-01-22 Degussa Verfahren zur Herstellung von Malonsäure oder einem Salz derselben
WO1998021339A1 (en) 1996-11-13 1998-05-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms
SK285201B6 (sk) 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
WO1998036078A1 (en) 1997-02-13 1998-08-20 James Madison University Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units
US6087140A (en) 1997-02-19 2000-07-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Microbial production of 1,2-propanediol from sugar
US6143538A (en) 1997-02-20 2000-11-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Fatty acyl-CoA reductase
US7125938B2 (en) 1997-03-11 2006-10-24 Carnegie Mellon University Atom or group transfer radical polymerization
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
BE1011197A3 (fr) 1997-06-06 1999-06-01 Brussels Biotech En Abrege Bb Procede de purification d'acide lactique.
CA2304309A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Dna encoding a ras carboxyl-terminal processing protein
US6306636B1 (en) 1997-09-19 2001-10-23 Arch Development Corporation Nucleic acid segments encoding wheat acetyl-CoA carboxylase
US6229046B1 (en) 1997-10-14 2001-05-08 Cargill, Incorported Lactic acid processing methods arrangements and products
WO1999029837A2 (en) 1997-12-05 1999-06-17 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Novel dna cloning method relying on the e. coli rece/rect recombination system
KR100250830B1 (ko) 1997-12-09 2000-04-01 성재갑 자가분해에 의해 폴리하이드록시알킨산으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산의 제조방법
US20030087381A1 (en) 1998-04-13 2003-05-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
JP4913929B2 (ja) 1998-06-12 2012-04-11 味の素株式会社 核酸系物質の製造法
WO2000008198A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Metabolix, Inc. Polyhydroxyalkanoate production from polyols
AU753132B2 (en) 1998-08-18 2002-10-10 Metabolix, Inc. Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers
WO2000026178A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 Catalytic Distillation Technologies Production of amides and/or acids from nitriles
DE69939048D1 (de) 1998-11-05 2008-08-21 Nippon Catalytic Chem Ind Wasserabsorbierendes Harz und Verfahren zu seiner Herstellung
US6410301B1 (en) 1998-11-20 2002-06-25 Kosan Biosciences, Inc. Myxococcus host cells for the production of epothilones
JP2002533120A (ja) 1998-12-31 2002-10-08 ミレニアム ファーマシューティカルズ インク． Ａ．フミガーツスアセチル補酵素ａカルボキシラーゼの遺伝子およびポリペプチド、ならびにその使用
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US6630603B1 (en) 1999-03-22 2003-10-07 Purac Biochem B.V. Method of industrial-scale purification of lactic acid
EP1169466A4 (en) 1999-03-23 2005-02-23 Univ Michigan State SYNTHESIS OF 1,2,3,4-TETRAHYDROXYBENZOLE AND 1,2,3-TRIHYDROXYBENZOLENE BY MYO-INOSITOL-1-PHOSPHATE SYNTHASE AND MYO-INOSITOL-2-DEHYDROGENASE
AU4211600A (en) 1999-04-10 2000-11-14 Maxygen, Inc. Modified lipid production
US6355412B1 (en) 1999-07-09 2002-03-12 The European Molecular Biology Laboratory Methods and compositions for directed cloning and subcloning using homologous recombination
ATE338139T1 (de) 1999-08-30 2006-09-15 Wisconsin Alumni Res Found Herstellung von 3-hydroxypropionsäure in rekombinanten organismen
US6852517B1 (en) 1999-08-30 2005-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms
US7033781B1 (en) 1999-09-29 2006-04-25 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US20020102672A1 (en) 1999-10-04 2002-08-01 Joseph Mizrahi Process for producing a purified lactic acid solution
AU1231701A (en) 1999-10-25 2001-05-08 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides
US6531291B1 (en) 1999-11-10 2003-03-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antimicrobial activity of gemfibrozil and related compounds and derivatives and metabolites thereof
WO2001038284A1 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Cargill Dow Llc Improved lactic acid processing; methods; arrangements; and, products
NL1013682C2 (nl) 1999-11-26 2001-05-30 Purac Biochem Bv Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur.
US6613553B1 (en) 2000-02-04 2003-09-02 St. Jude Children's Research Hospital Enoyl reductases and methods of use thereof
JP3673137B2 (ja) 2000-02-29 2005-07-20 シスメックス株式会社 精子計数方法及び試薬
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
US6998256B2 (en) 2000-04-28 2006-02-14 Kosan Biosciences, Inc. Methods of obtaining epothilone D using crystallization and /or by the culture of cells in the presence of methyl oleate
US6586229B1 (en) 2000-06-01 2003-07-01 North Carolina State University Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium
EP1305439B1 (en) 2000-07-21 2006-06-07 Metabolix, Inc. Production of polyhydroxyalkanoates from polyols
CA2322105A1 (en) 2000-10-23 2002-04-23 Plant Bioscience Limited Antibiotic production (ii)
AU1981802A (en) 2000-11-20 2002-06-03 Cargill Inc 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds
US6623944B2 (en) 2001-03-14 2003-09-23 Degussa Ag Process for preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof
DE60226229T2 (de) 2001-05-07 2009-05-28 Cargill, Inc., Wayzata Verfahren zur herstellung von carbonsäuren und deren derivaten
MY146503A (en) 2001-08-13 2012-08-15 Malaysian Palm Oil Board Method and compositions for the production of transgenic plants
US6723799B2 (en) 2001-08-24 2004-04-20 E I. Du Pont De Nemours And Company Acid-dyeable polymer compositions
WO2003035873A1 (fr) 2001-10-23 2003-05-01 Ajinomoto Co, Inc Nouveau recepteur de l'acide glutamique et utilisation de celui-ci
MXPA04004194A (es) 2001-11-02 2005-03-31 Rice University Sistema de recirculacion para la manipulacion de disponibilidad de nadh intracelular.
US6844447B2 (en) 2001-12-18 2005-01-18 Metabolix Inc. Methods of making intermediates from polyhydroxyalkanoates
US7309597B2 (en) 2002-01-18 2007-12-18 Cargill, Incorporated Alanine 2,3-Aminomutase
US6709919B2 (en) 2002-05-15 2004-03-23 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Method for making auto-self-aligned top electrodes for DRAM capacitors with improved capacitor-to-bit-line-contact overlay margin
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US7118896B2 (en) 2002-03-01 2006-10-10 Monsanto Technology, L.L.C. Methods and compositions for modification of lipid biosynthesis
AU2003223346A1 (en) 2002-03-25 2003-10-13 Cargill, Incorporated METHODS OF MANUFACTURING DERIVATIVES OF Beta-HYDROXYCARBOXYLIC ACIDS
EP1654373B1 (en) 2002-05-10 2012-08-15 Metabolix, Inc. Bioabsorbable polymer containing 2-hydroxyacid monomers
US7826975B2 (en) 2002-07-10 2010-11-02 The Penn State Research Foundation Method for redesign of microbial production systems
US8027821B2 (en) 2002-07-10 2011-09-27 The Penn State Research Foundation Method for determining gene knockouts
AU2003205041A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
GB0218019D0 (en) 2002-08-05 2002-09-11 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Production of a fermentation product
MXPA05003382A (es) 2002-10-04 2005-06-22 Du Pont Proceso para la produccion biologica de 1,3-propanodiol con alto rendimiento.
EP1556320B1 (en) 2002-11-01 2015-05-13 Novozymes A/S Process for preparation of 1,3-propanediol
US20040152159A1 (en) 2002-11-06 2004-08-05 Causey Thomas B. Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
JP4460533B2 (ja) 2002-12-06 2010-05-12 株式会社カネカ 光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法
MXPA05008857A (es) 2003-02-18 2006-03-09 Metabolic Explorer Sa Procedimiento de preparacion de microorganismos evolucionados que permite la creacion o la modificacion de vias metabolicas.
US7141154B2 (en) 2003-03-06 2006-11-28 Uchicago Argonne Llc Single-stage separation and esterification of cation salt carboxylates using electrodeionization
EP1613746B1 (de) 2003-03-31 2013-03-06 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren
DE10314618A1 (de) 2003-04-01 2004-10-14 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US20040225116A1 (en) 2003-05-08 2004-11-11 Payne Mark S. Nucleic acid fragments encoding nitrile hydratase and amidase enzymes from comamonas testosteroni 5-MGAM-4D and recombinant organisms expressing those enzymes useful for the production of amides and acids
WO2005003074A1 (en) 2003-06-26 2005-01-13 Cargill, Incorporated Process for separating and recovering 3-hydroxypropionic acid and acrylic acid
US7927794B2 (en) 2003-09-29 2011-04-19 The Regents Of The University Of California Methods for identifying a biosynthetic pathway gene product
FR2862068B1 (fr) 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
US7326557B2 (en) 2003-11-14 2008-02-05 Rice University Increasing intracellular NADPH availability in E. coli
DK1706457T3 (da) 2003-12-04 2012-05-21 Novozymes As Fremstilling af 3-hydroxypropionsyre ved anvendelse af beta-alanin/pyruvataminotransferase
US7186214B2 (en) 2004-02-12 2007-03-06 Medtronic, Inc. Instruments and methods for accessing an anatomic space
WO2005093060A1 (ja) 2004-03-26 2005-10-06 Nippon Shokubai Co., Ltd. １，３−プロパンジオール及び／又は３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法
EP1732874A1 (en) 2004-04-02 2006-12-20 Ciba Speciality Chemicals Water Treatments Limited Preparation of acrylic acid derivatives from alpha or beta-hydroxy carboxylic acids
US20070259863A1 (en) 2004-04-28 2007-11-08 Icos Corporation Arylphenylamino-,Arylphenylamide-, and Arylphenylether-Sulfide Derivatives
US20050272135A1 (en) 2004-06-02 2005-12-08 The University Of Chicago Processs for production and purification of fermentation derived organic acids
US7652167B2 (en) 2004-07-19 2010-01-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Process for production of organic acid esters
CA2574280A1 (en) 2004-07-30 2006-03-02 Cargill, Incorporated Alanine 2, 3 aminomutases
US7148051B2 (en) 2004-08-16 2006-12-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of 3-hydroxycarboxylic acid using nitrilase
EP3130676A1 (en) 2004-08-27 2017-02-15 Rice University Mutant e. coli strain with increased succinic acid production
CN101023178A (zh) 2004-09-17 2007-08-22 莱斯大学 高琥珀酸产出细菌
US7987056B2 (en) 2004-09-20 2011-07-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Mixed-library parallel gene mapping quantitative micro-array technique for genome-wide identification of trait conferring genes
BRPI0515994A (pt) 2004-10-12 2008-08-19 Univ Michigan State biossìntese de floroglucinol e preparo de 1, 3-dihidróxibenzeno a partir do mesmo
WO2006044612A2 (en) 2004-10-14 2006-04-27 Carnegie Institution Of Washington Development of sensitive fret sensors and methods of using the same
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7550286B2 (en) 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
DE102004062294A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
TWI529181B (zh) 2005-02-28 2016-04-11 贏創德固賽有限責任公司 以可更新原料為基之吸水聚合物結構及其生產的方法
US20080193937A1 (en) 2005-03-30 2008-08-14 Jitao Zou Identification of a Sterol Acyltransferase Gene
CN101160405B (zh) 2005-04-12 2014-01-01 纳幕尔杜邦公司 处理生物质以获得目标化学物质
US20060247153A1 (en) 2005-04-29 2006-11-02 Mcmahon Robert J Method of improving learning and memory in mammals
US7524660B2 (en) 2005-05-05 2009-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Utilization of fructose in microbial production strains
WO2006125000A2 (en) 2005-05-19 2006-11-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism
US20090298136A1 (en) 2005-07-18 2009-12-03 Basf Ag Methionine producing recombinant microorganisms
WO2007093848A2 (en) 2005-08-03 2007-08-23 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Crystalline enoyl-(acyl-carrier-protein) reductase from heliobacter pylori
EP1752532A1 (en) 2005-08-09 2007-02-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms
US7846688B2 (en) 2005-08-15 2010-12-07 The Regents Of The University Of Colorado Broad host range vectors for shotgun and expression library cloning in Gram negative bacteria
US20070111294A1 (en) 2005-09-09 2007-05-17 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of succinate
US7765029B2 (en) 2005-09-13 2010-07-27 Neurosciences Research Foundation, Inc. Hybrid control device
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
DE102005048818A1 (de) 2005-10-10 2007-04-12 Degussa Ag Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure
WO2007047680A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Cargill, Incorporated Increasing the activity of radical s-adenosyl methionine (sam) enzymes
US7300275B2 (en) 2005-10-26 2007-11-27 Panos Trakas Multi-point nozzle assembly
JP5064761B2 (ja) 2005-12-21 2012-10-31 富士フイルム株式会社 ジエチレントリアミン型金属キレート構造を有する高級脂肪酸トリエステル及びアミド誘導体
US8535916B2 (en) 2006-02-13 2013-09-17 Ls9, Inc. Modified microorganisms and uses therefor
WO2007130745A1 (en) 2006-03-15 2007-11-15 Regents Of The University Of Colorado Enhanced alcohol tolerant microorganism and methods of use thereof
CN101573451B (zh) 2006-03-15 2014-04-30 Dsmip资产公司 利用pufa聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法
US7687661B2 (en) 2006-03-15 2010-03-30 Battelle Memorial Institute Method for conversion of β-hydroxy carbonyl compounds
CA2647150A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US20070219390A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Battelle Memorial Institute Method and apparatus for conversion of beta-hydroxy carbonyl compounds
KR20070096348A (ko) 2006-03-23 2007-10-02 주식회사 엘지화학 1,4―ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ〔１，４―ＢＤＯ〕생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 １，４―ＢＤＯ의 제조방법
WO2007136762A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Ls9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
DK2024504T4 (da) 2006-05-26 2023-02-27 Amyris Inc Fremstilling af isoprenoider
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
WO2008021765A2 (en) 2006-08-08 2008-02-21 Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods for chemical reporter vectors
DE102006039203B4 (de) 2006-08-22 2014-06-18 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von durch Kristallisation gereinigter Acrylsäure aus Hydroxypropionsäure sowie Vorrichtung dazu
US8906667B2 (en) 2006-08-29 2014-12-09 William Marsh Rice University Increasing NADPH-dependent products
WO2008027742A1 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Cargill, Incorporated Beta-alanine/alpha-ketoglutarate aminotransferase for 3-hydroxypropionic acid production
MX2009002835A (es) 2006-09-18 2009-08-07 Univ Arizona Ácidos grasos e hidrocarburos de longitud de cadena media de algas.
BRPI0719792A2 (pt) 2006-10-04 2015-04-07 Cargill Inc Ácidos carboxílicos preparados usando um processo de divisão da molécula de sal
EP2087096A4 (en) 2006-10-20 2009-11-25 Univ Arizona MODIFIED CYANOBACTERIA
KR100971791B1 (ko) 2006-12-15 2010-07-23 바이오퓨얼켐 주식회사 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 이를이용한 부탄올의 제조방법
EP2126042A4 (en) 2007-01-12 2010-08-04 Univ Colorado Regents COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE PRODUCTION TOLERANCE OF ORGANIC CHEMICALS FROM MICROORGANISMS
US8673601B2 (en) 2007-01-22 2014-03-18 Genomatica, Inc. Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid
EP2121946A4 (en) 2007-02-09 2012-08-29 Zeachem Inc ENERGY-EFFICIENT METHOD FOR MANUFACTURING PRODUCTS
WO2008113041A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Ls9, Inc. Process for producing low molecular weight hydrocarbons from renewable resources
WO2008116848A1 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Metabolic Explorer Metabolically engineered microorganism useful for the production of 1,2-propanediol
WO2008133131A1 (ja) 2007-04-16 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
MX2009012867A (es) 2007-06-01 2010-02-15 Evonik Roehm Gmbh Proceso para preparar ácido metacrílico o ésteres metacrílicos.
MY154388A (en) 2007-06-06 2015-06-15 Kao Corp Transparent solid soap
US8198055B2 (en) 2007-06-08 2012-06-12 Coskata, Inc. Process for converting syngas to liquid products with microorganisms on two-layer membrane
WO2009006430A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 The Regents Of The University Of California Host cells and methods for producing fatty acid derived compounds
JP2010263790A (ja) 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
KR20090026230A (ko) 2007-09-09 2009-03-12 김건 임베디드 시스템의 범용 고속 실시간 모니터링 장치
WO2009036095A1 (en) 2007-09-10 2009-03-19 Joule Biotechnologies, Inc. Engineered light-harvesting organisms
JP2009067775A (ja) 2007-09-17 2009-04-02 Rohm & Haas Co ヒドロキシカルボン酸、またはその塩を、不飽和カルボン酸および／またはそのエステルに変換する方法
AU2008304180B2 (en) 2007-09-27 2014-02-27 Genomatica, Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation
CA2704227A1 (en) 2007-11-10 2009-05-14 Joule Biotechnologies, Inc. Hyperphotosynthetic organisms
US8048624B1 (en) 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
US8183028B2 (en) 2007-12-21 2012-05-22 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
US8518678B2 (en) 2007-12-21 2013-08-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production
WO2009089457A1 (en) 2008-01-11 2009-07-16 Novozymes A/S Methods for producing 3-hydroxypropionic acid and compounds thereof
US7803589B2 (en) 2008-01-22 2010-09-28 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
WO2009111513A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Joule Biotechnologies, Inc. Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest
CA2717586C (en) * 2008-03-05 2020-08-11 Genomatica, Inc. Primary alcohol producing organisms
US8598378B2 (en) 2008-03-14 2013-12-03 University Of Hawaii Methods and compositions for extraction and transesterification of biomass components
BRPI0909839A2 (pt) 2008-03-28 2017-06-13 Univ California produção de ácidos dicarboxílicos usando policetídeo sintases
TWI456949B (zh) 2008-04-30 2014-10-11 Thomson Licensing 閘口裝置及其使用方法
WO2009140695A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
EP2620501A3 (en) 2008-05-23 2013-10-02 E. I. du Pont de Nemours and Company DGAT genes from oleaginous organisms for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants
BRPI0909964A2 (pt) 2008-06-04 2017-06-13 Butamax Advanced Biofuels Llc "hospedeiro de produção entérico para a produção de isobutanol e método para a produção de isobutanol"
EA018720B1 (ru) 2008-06-09 2013-10-30 Ланзатек Нью Зиленд Лимитед Способ получения бутандиола с помощью анаэробной микробной ферментации
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
BRPI0913897A2 (pt) * 2008-06-27 2016-11-01 Centre Nat Rech Scient células recombinantes e plantas de ácidos graxos de cadeias muito longas (agcml)
DE102008002715A1 (de) 2008-06-27 2009-12-31 Evonik Röhm Gmbh 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle
US20110190513A1 (en) 2008-07-08 2011-08-04 Lynch Michael D Methods, compositions and systems for biosynthetic bio-production of 1,4-butanediol
US20100021978A1 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Genomatica, Inc. Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid
AU2009273953B2 (en) 2008-07-23 2013-08-29 Opx Biotechnologies, Inc Methods, systems and compositions for increased microorganism tolerance to and production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP)
WO2010017230A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 The Regents Of The University Of Colorado Methods, systems and compositions related to microbial bio-production of butanol and/or isobutanol
US20160362710A9 (en) 2008-08-18 2016-12-15 REG Life Sciences, LLC Systems and methods for production of mixed fatty esters
WO2010031083A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions related to reduction of conversions of microbially produced 3-hydroxypropionic acid (3-hp) to aldehyde metabolites
NZ591972A (en) * 2008-10-03 2013-04-26 Agrisoma Biosciences Inc Production of modified fatty acids in plants
WO2010042664A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Ls9, Inc. Method and compositions for producing fatty aldehydes
EP2366026A2 (en) 2008-12-12 2011-09-21 Celexion, Llc Biological synthesis of difunctional alkanes from alpha ketoacids
JP5670346B2 (ja) 2008-12-23 2015-02-18 マトリックス ジェネティクス， エルエルシー グリコーゲンが低減した、改変された光合成微生物および炭素ベースの生成物を生成することにおけるその使用
US9175234B2 (en) 2008-12-23 2015-11-03 REG Life Sciences, LLC Methods and compositions related to thioesterase enzymes
AU2010224029B2 (en) 2009-03-11 2015-10-22 Sapphire Energy, Inc. Engineering salt tolerance in photosynthetic microorganisms
AU2010232533A1 (en) 2009-04-02 2011-10-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Engineering the pathway for succinate production
CA2758298A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of commercial biodiesel from genetically modified microorganisms
EP2425007A4 (en) 2009-04-27 2013-01-02 Ls9 Inc PREPARATION OF FATTY ACID ESTERS
US20110144377A1 (en) 2009-06-16 2011-06-16 E. I. Du Pont Nemours And Company Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield
US8956834B2 (en) 2009-06-29 2015-02-17 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-ACP thioesterase genes and uses therefor
BRPI1014011A2 (pt) 2009-07-01 2015-10-27 Novozymes North America Inc processo para separar e recuperar ácido 3-hidróxi-propiônico.
CA2774975C (en) 2009-09-25 2019-11-05 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives in recombinant bacterial cells expressing an ester synthase variant
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
BR112012006801A2 (pt) 2009-09-27 2018-04-10 Opx Biotechnologies Inc método para produção de ácido 3-hidroxipropiônico e outros produtos
EP2488652A4 (en) 2009-10-13 2014-04-09 Genomatica Inc MICRO-ORGANISMS FOR THE PREPARATION OF 1,4-BANDANDIOL, 4-HYDROXYBUTANAL, 4-HYDROXYBUTYRYL-COA, PUTRESCIN AND CORRESPONDING COMPOUNDS, AND CORRESPONDING METHODS
PL2491119T3 (pl) * 2009-10-20 2016-12-30 Sposoby i środki do zmiany biosyntezy lipidów przez kierowanie wielu enzymów do domen suborganelli
WO2011063363A2 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Production of an organic acid and/or related chemicals
WO2011063304A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems, and compositions for microbial bio-production of biomolecules using syngas components, or sugars, as feedstocks
AU2010321564A1 (en) 2009-11-23 2012-05-10 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation with electrolyte addition
CA2782690A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Board Of Trustees Of Michigan State University Carboxylic acid recovery and methods related thereto
US20110183382A1 (en) 2009-12-15 2011-07-28 Qteros, Inc. Methods and compositions for producing chemical products from c. phytofermentans
US8530221B2 (en) 2010-01-14 2013-09-10 Ls9, Inc. Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
GB2492256A (en) 2010-01-27 2012-12-26 Opx Biotechnologies Inc Microorganism production of high-valve chemical products, and related compositions, methods and systems
CN101745245B (zh) 2010-02-05 2012-05-23 北京化工大学 一种多级逆流式旋转床反应精馏装置及其应用
WO2011100667A1 (en) 2010-02-14 2011-08-18 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
DK2601292T3 (en) 2010-08-06 2018-07-16 Biopetrolia Ab METHODS AND PRODUCTS FOR MANUFACTURING GROWERS
BR112013003003A2 (pt) 2010-08-06 2016-06-14 Mascoma Corp produção de produtos malonil-coa derivados através de rotas anaeróbicas
CN103249837A (zh) 2010-09-28 2013-08-14 加利福尼亚大学董事会 利用聚酮合酶生产α-烯烃
AU2011317281A1 (en) 2010-10-18 2013-06-06 Zeachem, Inc. Recovery of organic acid using a complex extraction solvent
BR112013012603A2 (pt) 2010-11-22 2016-08-09 Univ Florida Res Foudation Inc engenharia de bacillus coagulans termotolerante para a produção de ácido d(-)-láctico
KR20130119945A (ko) 2010-11-22 2013-11-01 노보자임스 인코포레이티드 3-히드록시프로피온산 생산을 위한 조성물 및 방법
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
WO2012109176A2 (en) 2011-02-07 2012-08-16 William Marsh Rice University Reverse beta oxidation pathway
KR20120108538A (ko) 2011-03-24 2012-10-05 삼성전자주식회사 말로닉 세미알데히드 환원 경로를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법
US20140215904A1 (en) 2011-03-30 2014-08-07 Ls9, Inc. Compositions comprising and methods for producing beta-hydroxy fatty acid esters
US20120264902A1 (en) 2011-04-18 2012-10-18 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP)
WO2012177726A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganism for producing primary alcohols and related compounds and methods related thereto
KR101860442B1 (ko) 2011-06-27 2018-05-24 삼성전자주식회사 3-하이드록시프로피온산의 생산을 위한 유전자 조작
WO2013003608A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Brookhaven Science Associates, Llc Modified plants with increased oil content
JP2014528705A (ja) 2011-08-04 2014-10-30 ダニスコ・ユーエス・インク アセトアセチルＣｏＡシンターゼを用いるイソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産
KR101437308B1 (ko) 2011-08-04 2014-09-03 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질, 이것을 코드하는 유전자 및 그 용도
WO2013048557A1 (en) 2011-09-27 2013-04-04 Exxonmobil Research And Engineering Company Acyl-acp wax ester synthases
US8790901B2 (en) 2011-12-14 2014-07-29 Pronutria, Inc. Microorganisms and methods for producing unsaturated fatty acids
WO2013126855A1 (en) 2012-02-23 2013-08-29 The Regents Of The University Of California Atp driven direct photosynthetic production of fuels and chemicals
ES2786633T3 (es) 2012-04-02 2020-10-13 Genomatica Inc Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos
MX366939B (es) 2012-04-02 2019-07-31 Reg Life Sciences Llc Producción mejorada de derivados de ácidos grasos.
US20130345470A1 (en) 2012-06-20 2013-12-26 Opx Biotechnologies, Inc. Purification of 3-Hydroxypropionic Acid from Crude Cell Broth and Production of Acrylamide
WO2013192453A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Opx Biotechnologies, Inc. Purification of 3-hydroxypropionic acid from crude cell broth and dehydration to acrylic acid
MX2015001780A (es) 2012-08-10 2015-09-28 Opx Biotechnologies Inc Microorganismos y métodos para la producción de ácidos grasos y productos derivados de ácidos grasos.
US9879239B2 (en) 2012-09-14 2018-01-30 REG Life Sciences, LLC Enzyme variants with improved ester synthase properties
EP2946009B1 (en) 2013-01-16 2016-07-27 REG Life Sciences, LLC Acyl-acp reductase with improved properties
WO2014145343A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
CA2905602A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sarah M. Hoyt Flash evaporation for product purification and recovery
US20150044746A1 (en) 2013-03-15 2015-02-12 Opx Biotechnologies, Inc. Method of enhanced bioproduction
EP3008178A1 (en) 2013-06-14 2016-04-20 Technical University of Denmark Microbial production of 3-hydroxypropionic acid
CN106795483A (zh) 2013-07-19 2017-05-31 嘉吉公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
WO2015042626A1 (de) 2013-09-27 2015-04-02 Fts Computertechnik Gmbh Verfahren zum erkennen eines ausfalls eines constituent-systems in einem system-of-systems

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1301304A (zh) * 1997-06-05 2001-06-27 卡尔金有限责任公司 脂酰辅酶a∶脂肪醇酰基转移酶
EP2594633A1 (en) * 2007-03-28 2013-05-22 LS9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20100285549A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Recombinant microorganism having butanol production capacity and butanol production method
CN102869768A (zh) * 2010-03-02 2013-01-09 麻省理工学院 生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程
WO2013039563A1 (en) * 2010-09-15 2013-03-21 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
WO2012129450A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Opx Biotechnologies, Inc. Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems
WO2013019647A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Ls9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof having improved aliphatic chain length and saturation characteristics

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLEMENTINA DELLOMONACO等: "Engineered reversal of the b-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals", 《NATURE》 *
ETHAN I. LAN等: "ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria", 《PNAS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109517811A (zh) * 2018-11-29 2019-03-26 滨州医学院 一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体
CN109517811B (zh) * 2018-11-29 2022-11-11 滨州医学院 一种β-酮脂酰-ACP合成酶突变体

Also Published As

Publication number Publication date
US20160257975A1 (en) 2016-09-08
JP6603658B2 (ja) 2019-11-06
US10337038B2 (en) 2019-07-02
EP3022310B1 (en) 2019-10-16
WO2015010103A3 (en) 2015-04-02
EP3022310A2 (en) 2016-05-25
EP3022310A4 (en) 2017-03-15
JP2016525350A (ja) 2016-08-25
WO2015010103A2 (en) 2015-01-22
BR112016001026A2 (pt) 2017-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106795483A (zh) 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
US10465213B2 (en) Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
CN105051179B (zh) 重组微生物和其用途
US20110124063A1 (en) Methods, Systems, and Compositions for Microbial Bio-Production of Biomolecules Using Syngas Components, or Sugars, as Feedstocks
US20230033275A1 (en) Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
CN109477082A (zh) 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
CN107075464A (zh) 从乙酰‑coa产生烯烃的重组微生物
TW201621045A (zh) 脂肪酸酯類之製造
EP2898082B1 (en) Pathways to adipate semialdehyde and other organic products
CN105112436A (zh) 一种己二酸的全生物合成方法
KR20220139351A (ko) 엑토인의 개선된 생산을 위한 변형된 미생물 및 방법
US8993281B2 (en) Genetically modified Acinetobacter hosts for lipid production
CA3098529A1 (en) Methods for the production of methacrylates
Guo et al. Boosting lipid production in the diatom Phaeodactylum tricornutum by knockdown of the Enoyl CoA hydratase using CRISPR interference
JP2020515293A (ja) 中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有するチオエステラーゼ変種
KR20190029964A (ko) 신규한 재조합 대장균 균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 생산 방법
US20220002356A1 (en) XYLR Mutant For Improved Xylose Utilization Or Improved Co-Utilization Of Glucose And Xylose
TW202307202A (zh) 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法
CN104357467A (zh) 马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因dgat2-4及其应用
CN117693588A (zh) 用于改进乙二醇的生物产生的微生物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170531

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication