CN105112436A - 一种己二酸的全生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种己二酸的全生物合成方法，其包括，对褐色嗜热裂孢菌进行代谢改造，获得能够产己二酸的突变菌株B6；确认己二酸的合成途径，将该途径的基因导入大肠杆菌中模块化表达，并且平衡异源代谢途径的表达；调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，提高己二酸的积累。本发明己二酸及其前体物的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。

Description

一种己二酸的全生物合成方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种己二酸的全生物合成方法。

背景技术

己二酸(adipicacid或者adipate)又称肥酸，是一种重要的二元羧酸，它能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，并能与二元胺或二元醇缩聚成高分子聚合物。当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6，6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元，产量约为25.6亿公斤，而且还在不断增加，并且近两年新增产能主要在中国。

工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称KA油)进行氧化制取。虽然己二酸化学合成方法已经成熟，但是他们普遍有工艺流程长，副产物较多，工业“三废”排放严重，产品收率不高等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，研究开发新的清洁无害己二酸生产工艺越来越受到人们的重视。微生物转化生产己二酸有几十年的研究经历，不动杆菌、短杆菌、假单胞菌和黄色杆菌等属微生物可以转化苯甲酸、儿茶酚、环己醇、环己烷等化合物生产己二酸(ChengQ，ThomasSM，KostichkaK，ValentineJR，NagarajanV.GeneticanalysisofageneclusterforcyclohexanoloxidationinAcinetobactersp.strainSE19byinvitrotransosition.JBacterio1.2000182(17)：4744-4751.)，这些生物转化不需要化学催化剂、氧化剂以及溶剂，是洁净无害的生产工艺。但是微生物的转化生产能力和效率有待进一步提高。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有化工领域和生物工程领域中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种己二酸的全生物合成方法，以替代传统化学合成己二酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种己二酸的全生物合成方法，其包括，对褐色嗜热裂孢菌进行代谢改造，获得能够产己二酸的突变菌株B6；确认己二酸的合成途径，将该途径的基因导入大肠杆菌中模块化表达，并且平衡异源代谢途径的表达；调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，提高己二酸的积累。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：所述己二酸的合成途径为3-氧代己二酰辅酶A途径。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：包括，

在大肠杆菌中模块化构建3-氧代己二酰辅酶A途径；

平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体-己二酰辅酶A的供给；

基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量；以及，

基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：

所述3-氧代己二酰辅酶A途径中共有5步反应，四个酶，四种酶分别对应的基因为β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因和5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：将3-氧代己二酰辅酶A途径的6个基因被分成两个模块导入大肠杆菌表达，其中5步代谢步骤中的四个酶的基因，经过密码子优化后，放入一个操纵子内，然后连接至pACYCDuet^TM-1，形成上游模块，将该代谢步骤的限制性步骤的酶琥珀酰辅酶A合成酶的基因Tfu_2577，2576经过密码子优化后连接到pETDuet^TM-1，形成下游模块。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：所述平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体-己二酰辅酶A的供给，包括，

1)通过代谢通量分析，预测己二酰辅酶A步骤中不同基因表达量配比；

2)通过增加RNA发卡结构，构建不同稳定性的目的基因mRNA二级结构，平衡异源基因的表达。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：所述基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量，包括，

使用来自噬菌体的组成型启动子P_L-λ；

以该启动子为模板进行易错PCR，获得突变序列；

将突变库中的启动子替换连接到pGLO质粒中的绿色荧光蛋白基因上游，并且将上述质粒库导入大肠杆菌中形成pGLO-P_L-λ质粒库；

将大肠杆菌培养到对数期，利用流式细胞仪,选择荧光强度最弱，中等，最强的三种突变启动子；

分别将上述P_L-λ的三种突变启动子，取代上游模块和下游模块的启动子；

将不同组合的两种质粒导入大肠杆菌中表达，选择具有最佳己二酸生产性能的质粒组合。

作为本发明所述己二酸的全生物合成方法的一种优选方案，其中：所述基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径，包括，

1)通过碳-13同位素标记代谢流量分析方法，获得己二酸积累的全局流量分布；

2)基于全基因组代谢模型理性调整影响己二酸积累的外围代谢途径。

本发明提供了实现己二酸及其前体物生物制造的核心技术，即高性能生产菌株的选育改造，其涉及具有己二酸的生物合成性制备能力的细胞和生物体的设计和产生。本发明研究结果表明代谢途径可以被设计和重组改造，从而在大肠杆菌(Escherichiacoli)和其他细胞或生物体中实现己二酸的生物合成。通过构建具有设计的代谢基因型的菌株可以确认己二酸的生物合成性制备。这些代谢改造的细胞或生物体还可以进行适应进化以进一步增加己二酸的生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。本发明己二酸及其前体物的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。

附图说明

图1为具有RNA发卡结构的mRNA设计流程示意图；

图2为筛选功能启动子文库流程示意图；

图3为碳-13同位素标记流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

如本文所公开的，描述了使用葡萄糖/玉米芯粉作为碳底物的己二酸合成的不同的途径。对于所有最大产率计算，在给定途径中缺少的反应加入至SimPheny中的大肠杆菌化学计算网络中，其类似于以前所述的一种网络(Reed等，GenomeBiol.4：R54(2003))。己二酸在生理条件下是一种带电分子，并且其被假设需要以基于质子的同向转运系统形式的能量以被分泌出网络。如果在中性或接近中性pH下进行发酵，则此转运系统在热力学上是可行的。低pH己二酸形成将需要ATP-依赖性输出机制，例如，与质子同向转运相反的ABC系统。这些途径中的反应和实现这些途径的方法描述在实施例1和2中。

如本文所使用来说明本发明的微生物生物体或微生物时，意在指微生物生物体具有至少一个在参照物种的天然存在株中正常情况下不存在的遗传改变，所述天然存在株包括参照物种的野生株。遗传改变包括，例如，引入可表达的编码代谢多肽的核酸的修饰，其他核酸添加，核酸缺失和/或微生物遗传材料的其他功能性破坏。此类修饰包括，例如，参照物种的异源多肽、同源多肽或异源多肽和同源多肽两者的编码区和其功能片段。其他的修饰包括，例如，非编码调控区，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括己二酸生物合成途径内的酶。

如本文所使用，术语“CoA”或“辅酶A”意在指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白部分)，其存在是许多酶(脱辅基酶)的活性形成活性酶体系所必需的。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或其他酰基转移和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和在其他乙酰化中发挥作用。

本发明所采用的微生物生物体可以含有稳定的遗传改变，其指微生物可以培养5代以上而没有丢失所述改变。通常，稳定的遗传改变包括持续10代以上的修饰，特别稳定的修饰将持续约25代以上，并且更特别地，稳定的遗传修饰将为50代以上，包括无限期。

本领域技术人员将会理解，遗传改变，参照适当的宿主生物体诸如大肠杆菌和它们相应的代谢反应或适合于所需的遗传物质诸如所需代谢途径的基因的来源生物体进行描述。然而，鉴于多种多样的生物体的全基因组测序和基因组学领域中的高技术水平，本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他生物体。例如，本文例举的大肠杆菌代谢改变可以通过掺入来自参照物种以外的物种的相同的或类似的编码核酸而容易地应用于其他物种。此类遗传改变包括，例如，物种同源物的遗传改变，通常和特别地，直向同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)或非直向同源(nonorthologous)基因置换。

直向同源物是通过垂直遗传而相关并且在不同的生物体中负责基本上相同或同一功能的一种基因或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶可以被认为是环氧化物水解的生物学功能的直向同源物。例如，当基因共享足以表明它们是同源的量的序列相似性时，它们是通过垂直遗传而相关的，或由共同祖先进化而相关。如果基因共享足以表明它们已从共同祖先进化至一级序列相似性不可鉴定的程度的量的三维结构但不必然具有这样的量的序列相似性，它们也可被认为是直向同源物。直向同源的基因可以编码具有约25％ˉ100％氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。如果其三维结构也显示相似性，则编码共享小于25％的氨基酸相似性的蛋白质的基因也可以被认为由垂直遗传而产生。丝氨酸蛋白酶家族的成员，包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶，被认为从共同祖先通过垂直遗传而产生。

直向同源物包括基因或它们编码的基因产物，它们通过，例如，进化，已经在结构上或总体活性上发生了趋异。例如，在一个物种编码显示两种功能的基因产物的情况下以及在此类功能已经在第二物种中分离入不同基因的情况下，这三种基因和它们相应的产物被认为是直向同源物。对于生物化学产物的产生，本领域技术人员将理解具有待引入或待破坏的代谢活性的直向同源基因被选择用于构建非天然存在的微生物。显示可分离的活性的直向同源物的实例是在两个或多个物种之间或单个物种内不同的活性已经分离入不同的基因产物的情况。具体的实例是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分离入不同分子。第二个实例是支原体5’-3’外切核酸酶和果蝇(Drosophila)DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶或两者的直向同源物，且反之亦然。

相反，旁系同源物是通过例如，复制然后通过进化趋异而相关的同源物，并且具有相似的或共有的、但不相同的功能。旁系同源物可以源自或来自，例如，相同的物种或不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源物，因为它们代表从共同祖先共同进化的两种不同的酶，它们在相同的物种中催化不同的反应并且具有不同的功能。旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著的序列相似性的蛋白质，表明它们是同源的，或通过从共同祖先共同进化而相关。旁系同源蛋白家族的组包括HipA同源物、萤光素酶基因、肽酶等。

非直向同源基因置换是来自一个物种的非直向同源基因可以替代不同物种中的参照基因功能。置换包括，例如，能够在来源物种中执行与不同物种中的参照功能相比基本上相同或相似的功能。尽管通常非直向同源置换将可被鉴定为与编码参照功能的已知基因结构上相关，然而结构上不太相关但功能上相似的基因和它们相应的基因产物将仍然落在该术语的范围内，如其在本文中所使用的那样。与编码寻求替代的功能的基因相比，功能相似性需要，例如，非直向同源基因产物的活性位点或结合区中的至少一些结构相似性。因此，非直向同源基因包括，例如，旁系同源物或不相关基因。

因此，在鉴定和构建本发明的具有己二酸生物合成能力的非天然存在的微生物生物体时，本领域技术人员将理解，将本文提供的教导和指导应用于具体物种，使得代谢修饰的鉴定可以包括直系同源物的鉴定和包含或失活。就编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的旁系同源物和/或非直向同源基因置换存在于参照微生物中这一程度而言，本领域技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。

本发明所述的一种己二酸的全生物合成方法，包括对一株嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)进行代谢改造，通过生物信息学和转录组学的研究，确定己二酸的合成途径，将合成途径的6个基因分成两个模块导入大肠杆菌中表达，通过RNA发卡结构和功能启动子库手段，调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，平衡异源代谢途径的表达，防止代谢负担，高效率积累己二酸，

以上所述的己二酸的全生物合成方法，第一步：在大肠杆菌中模块化构建3-氧代己二酰辅酶A途径。

在之前的研究中，申请人通过菌种改造获得了一株褐色嗜热裂孢菌B6(ThermobifidafuscaB6)，该菌株能够积累0.2g/L己二酸。通过生物信息学和转录组学的研究，申请人确定了己二酸的合成途径为3-氧代己二酰辅酶A途径(3-oxoadipyl-CoApathway)。为了实现己二酸从头合成，将3-氧代己二酰辅酶A途径5个代谢步骤中的四个酶的基因：β-酮硫解酶基因(β-ketothiolase),3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase),3-羟基己二酰脱氢酶基因(3-hydroxyadipyl-CoAdehydrogenase)和5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(5-carboxy-2-pentenoyl-CoAreductasedehydrogenase)，经过密码子优化后，放入一个操纵子(Operon)内，然后连接至pACYCDuet^TM-1,形成上游模块。该模块催化的终产物是己二酰辅酶A(Adipyl-CoA)。由于琥珀酰辅酶A合成酶是该代谢途径的限制性步骤，所以将此酶的基因Tfu_2577,2576经过密码子优化后连接到pETDuet^TM-1，形成下游模块，该模块催化产物是己二酸。上述两个模块可以同时在大肠杆菌中表达。

以上所述的己二酸的全生物合成方法，第二步：平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体-己二酰辅酶A的供给。

1)通过代谢通量分析，理性预测己二酰辅酶A步骤中不同基因表达量配比。

由于己二酰辅酶A是己二酸的前体，增加其供给量能够大幅度提高己二酸的产量。申请人将基于大肠杆菌的全基因组代谢模型，进行代谢通量平衡分析(Fluxbalanceanalysis,FBA)。在最优化己二酰辅酶A的情况下，预测上游模块中四个催化步骤的最佳代谢流量比，然后据此来调整四个基因的不同表达量。

2)通过增加RNA发卡结构(hairpinstructure)，构建不同稳定性的目的基因mRNA二级结构，平衡异源基因的表达。

大肠杆菌细胞中存在RNA内切酶(RNAendonuclease，如RNaseE)，该酶能够剪切mRNA，所以mRNA都具有一定的半衰期。通过延长或者缩减半衰期，可以达到调节基因表达量的目的。如果在目的基因5’上游非编译区(5’UTR)插入不同的RNA发卡结构(RNAhairpinstructure),就能够不同程度阻止RNA内切酶的剪切，增加mRNA的稳定性。

本项目将利用ThemfoldWebServer设计一组RNA发卡结构序列(如图1A所示)。然后将该组的发卡结构序列连接到绿色荧光蛋白基因上游，并且插入pACYCDuet^TM-1质粒中。按照理性预测所得到基因表达量比，通过流式细胞仪(Flowcytometry)筛选符合表达强度要求的RNA发卡结构序列。在选中的发卡结构的上游连接RNaseE的酶切位点，形成RNA发卡结构原件。最后将筛选得到的不同RNA发卡结构原件对应的DNA序列分别连接到上游模块中对应的基因的5’上游(图1B)。含有RNA发卡结构原件序列的基因均采用直接合成的方法获得，然后所有包含RNA发卡结构原件的基因以及pACYCDuet^TM-1质粒通过GibsonAssembly的方法在体外直接环化，构建新的质粒(图1B)。由于转录得到的mRNA的上游具有RNaseE的识别位点，因此位于同一操纵子内的基因在转录后经过RNaseE剪切(图1C)，不再连接在一起，而是独立存在于细胞内(图1D)。并且由于有不同的RNA发卡结构，因此它们的mRNA量也不同。

以上所述的己二酸的全生物合成方法，第三步：基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量。

由于己二酰辅酶A和己二酸合成是在不同的模块中进行的，而且都是依靠启动子T7_lac启动转录，因此两模块的表达量基本相同。但是T7lac的-10和-35区相对固定，所以调整该启动子的操作余地不大。为了调整启动子的强度，申请人将使用来自噬菌体(bacteriophage)的组成型启动子P_L-λ。以该启动子为模板进行易错PCR(error-pronePCR)，获得大量突变序列。随后然后将上述的突变库中的启动子替换连接到pGLO质粒中的绿色荧光蛋白基因上游，并且将上述质粒库导入大肠杆菌中形成pGLO-P_L-λ质粒库。将大肠杆菌培养到对数期，利用流式细胞仪(Flowcytometry),选择荧光强度最弱，中等，最强的三种突变启动子(如图2所示)。然后分别将上述P_L-λ的三种突变启动子，取代上游模块和下游模块的启动子，最后将9种不同组合(3x3)的两种质粒导入大肠杆菌中表达，选择具有最好己二酸生产性能的质粒组合。

以上所述的己二酸的全生物合成方法，第四步：基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径

1)通过碳-13同位素标记代谢流量分析方法，获得己二酸积累的全局流量分布。

为了精确的了解具有上游和下游模块的基因工程菌的代谢流量分布情况，将碳-13标记过的葡萄糖加入到大肠杆菌的发酵培养基中，培养该菌到对数生长期，然后获取细胞，随后将细胞迅速在液氮中冷却，停止所有细胞代谢。之后用乙腈对上述得到的细胞进行抽提，提取物则进行GC-MS以及NMR等代谢组学的分析。最后全局分析影响己二酸积累的代谢流量分布(如图3所示)。

2)基于全基因组代谢模型理性调整影响己二酸积累的外围代谢途径。

将得到的同位素标记的数据导入到大肠杆菌的全基因组代谢模型中分析，利用OptKnock预测在最优化己二酸的条件下，哪些基因需要敲除。然后利用λ-Red系统,逐个的敲除影响己二酸积累的基因，从而使碳流集中流向己二酸合成途径。

实施例1：

将50mL野生褐色嗜热裂孢菌野生菌(WT)和代谢改造后的突变菌(B6)置于500mL的具塞锥形瓶中培养进行预培养，转速200rpm，培养24小时。发酵试验中，取200mL预培养的发酵液接种到5L发酵罐中，将玉米芯粉碎至颗粒大小为200ˉ250μm，并且高压蒸汽处理1.5小时，加入到培养基中，细胞培养条件为：温度为55℃，时间42-68小时，微好氧环境培养。

取6mL细胞培养液于双倍体积的细菌RNA保护液中，短暂漩涡分离，在室温下静置至少5分钟(不超过2小时)，将样品离心，移去上清液，将下层至于800ˉ1000uL的RNA裂解液中重新悬浮，将混合物转移到抨击珠裂解管中，以大于12，000xg/min转速离心1ˉ2min。将大约400-500μl上层液转移到Zymo-Spin^TMIIIC管中，再次离心，转速8，000xg，时间30秒，加入0.8倍体积的95-100％的乙醇，混合均匀，将混合物转移到Zymo-Spin^TMIIC管中离心，以大于12，000xg/min转速离心30秒，剩余步骤按照试剂盒规定操作。

用于重组工作的酶来自于新英格兰生物实验室。用于Tfu_1647蛋白基因扩增的正向引物为：CGCggatccATGAGTGACTTCGACCTCTA，反向引物为：ATAGTTTAgcggccgcTCACTTCTTCAAGAGCTGCCG。从BamHI-NotI点切断纯化的Tfu_1647蛋白基因扩增产物和pET-28a(+)质粒，通过连接酶联接，然后通过化学方法将上述基因片段导入到大肠杆菌DH5α中，通过菌落聚合酶链锁反应筛选转化株，T7标准引物为TAATACGACTCACTATAGGG和GCTAGTTATTGCTCAGCGG。利用试剂盒分离大肠杆菌质粒，通过基因测序确定Tfu_1647蛋白的插入点，测定结果为质粒pET-28a-1647。羧基端带有标签的Tfu_1647蛋白通过表达质粒pET-28a-1647在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达，使用镍螯合亲和色谱纯化，当LB培养基的OD值达到0.3-0.4时，向其中加入IPTG，诱导6小时。

野生褐色嗜热裂孢菌野生菌(WT)和代谢改造后的突变菌(B6)均在摇瓶中生长至对数期，收集1L细胞培养液，10，000g转速离心10分钟，用磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗细胞三遍，清洗过程以12，000g转速离心15分钟。细胞均已溶解，再次离心，转速10，000g，离心5分钟，收集上清液。向细胞溶解产物1中加入10mg/L的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，然后将细胞混合物置于具有橡胶塞的小管中培养12小时，培养温度为50℃。培养结束后，上清液用来测定己二酸的产量。在第二份细胞溶解产物中加入10mg/L的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，额外加入0.04mg/mL的Tfu_1647蛋白质，同样条件培养12小时。上清液用来测定己二酸的含量为0.022mg/L。

经过以上研究进行分批发酵实验，将代谢改造后的突变菌(B6)在以葡萄糖为碳源的培养基上进行培养，浓度为50g/L的葡萄糖溶液，培养3天，突变菌(B6)几乎可以耗尽所有碳源，最终测得己二酸浓度为2.23g/L，产率为0.0446g/g。

实施例2：

将50mL野生褐色嗜热裂孢菌野生菌(WT)和代谢改造后的突变菌(B6)置于500mL的具塞锥形瓶中培养进行预培养，转速200rpm，培养24小时。发酵试验中，取200mL预培养的发酵液接种到5L发酵罐中，将玉米芯粉碎至颗粒大小为200-250μm，并且高压蒸汽处理1.5小时，加入到培养基中，细胞培养条件为：温度为55℃，时间42-68小时，微好氧环境培养。

取6mL细胞培养液于双倍体积的细菌RNA保护液中，短暂漩涡分离，在室温下静置至少5分钟(不超过2小时)，将样品离心，移去上清液，将下层至于800ˉ1000uL的RNA裂解液中重新悬浮，将混合物转移到抨击珠裂解管中，以大于12，000xg/min转速离心1ˉ2min。将大约400-500μl上层液转移到Zymo-Spin^TMIIIC管中，再次离心，转速8，000xg，时间30秒，加入0.8倍体积的95-100％的乙醇，混合均匀，将混合物转移到Zymo-Spin^TMIIC管中离心，以大于12，000xg/min转速离心30秒，剩余步骤按照试剂盒规定操作。

用于重组工作的酶来自于新英格兰生物实验室。用于Tfu_1647蛋白基因扩增的正向引物为：CGCggatccATGAGTGACTTCGACCTCTA，反向引物为：ATAGTTTAgcggccgcTCACTTCTTCAAGAGCTGCCG。从BamHI-NotI点切断纯化的Tfu_1647蛋白基因扩增产物和pET-28a(+)质粒，通过连接酶联接，然后通过化学方法将上述基因片段导入到大肠杆菌DH5α中，通过菌落聚合酶链锁反应筛选转化株，T7标准引物为TAATACGACTCACTATAGGG和GCTAGTTATTGCTCAGCGG。利用试剂盒分离大肠杆菌质粒，通过基因测序确定Tfu_1647蛋白的插入点，测定结果为质粒pET-28a-1647。羧基端带有标签的Tfu_1647蛋白通过表达质粒pET-28a-1647在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达，使用镍螯合亲和色谱纯化，当LB培养基的OD值达到0.3-0.4时，向其中加入IPTG，诱导6小时。

野生褐色嗜热裂孢菌野生菌(WT)和代谢改造后的突变菌(B6)均在摇瓶中生长至对数期，收集1L细胞培养液，10，000g转速离心10分钟，用磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗细胞三遍，清洗过程以12，000g转速离心15分钟。细胞均已溶解，再次离心，转速10，000g，离心5分钟，收集上清液。向细胞溶解产物1中加入10mg/L的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，然后将细胞混合物置于具有橡胶塞的小管中培养12小时，培养温度为50℃。培养结束后，上清液用来测定己二酸的产量。在第二份细胞溶解产物中加入10mg/L的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，额外加入0.04mg/mL的Tfu_1647蛋白质，同样条件培养12小时。上清液用来测定己二酸的含量为0.022mg/L。

经过以上研究进行分批发酵实验，将代谢改造后的突变菌(B6)在玉米芯粉为为碳源的培养基上进行培养，将玉米芯粉粉碎至颗粒大小为200μm-250μm，以5g/L的微晶纤维素浓度培养突变菌(B6)24小时诱导纤维素酶和半纤维素酶表达。再以10％的培养液接种到19.38g/L的干燥玉米芯粉培养基中进行培养。培养3天时间，最终测得61％的玉米芯粉被溶解吸收，而己二酸的浓度为0.22g/L。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种己二酸的全生物合成方法，其特征在于：包括，

对褐色嗜热裂孢菌进行代谢改造，获得能够产己二酸的突变菌株B6；

确认己二酸的合成途径，将该途径的基因导入大肠杆菌中模块化表达，并且平衡异源代谢途径的表达；

调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，提高己二酸的积累。

2.根据权利要求1所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：所述己二酸的合成途径为3-氧代己二酰辅酶A途径。

3.根据权利要求2所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：包括，

在大肠杆菌中模块化构建3-氧代己二酰辅酶A途径；

平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体-己二酰辅酶A的供给；

基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量；以及，

基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径。

4.根据权利要求2或3所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：

所述3-氧代己二酰辅酶A途径中共有5步反应，四个酶，四种酶分别对应的基因为β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因和5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因。

5.根据权利要求4所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：将3-氧代己二酰辅酶A途径的6个基因被分成两个模块导入大肠杆菌表达，其中5步代谢步骤中的四个酶的基因，经过密码子优化后，放入一个操纵子内，然后连接至pACYCDuet^TM-1，形成上游模块，将该代谢步骤的限制性步骤的酶琥珀酰辅酶A合成酶的基因Tfu_2577，2576经过密码子优化后连接到pETDuet^TM-1，形成下游模块。

6.根据权利要求2或3所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：所述平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体-己二酰辅酶A的供给，包括，

1)通过代谢通量分析，预测己二酰辅酶A步骤中不同基因表达量配比；

2)通过增加RNA发卡结构，构建不同稳定性的目的基因mRNA二级结构，平衡异源基因的表达。

7.根据权利要求2或3所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：所述基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量，包括，

使用来自噬菌体的组成型启动子P_L-λ；

以该启动子为模板进行易错PCR，获得突变序列；

将突变库中的启动子替换连接到pGLO质粒中的绿色荧光蛋白基因上游，并且将上述质粒库导入大肠杆菌中形成pGLO-P_L-λ质粒库；

将大肠杆菌培养到对数期，利用流式细胞仪,选择荧光强度最弱，中等，最强的三种突变启动子；

分别将上述P_L-λ的三种突变启动子，取代上游模块和下游模块的启动子；

将不同组合的两种质粒导入大肠杆菌中表达，选择具有最佳己二酸生产性能的质粒组合。

8.根据权利要求2或3所述的己二酸的全生物合成方法，其特征在于：所述基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径，包括，

1)通过碳-13同位素标记代谢流量分析方法，获得己二酸积累的全局流量分布；

2)基于全基因组代谢模型理性调整影响己二酸积累的外围代谢途径。