CN117467552A - 高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用，属于生物学技术领域。对产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶A诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。本发明提出的基于全局代谢计算的动态代谢途径调控策略可有效提升酿酒酵母生产植物天然产物OA的能力，是一种有效的工程菌改造方法。
Description
技术领域
本发明涉及高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用，属于生物学技术领域。
背景技术
齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）是在女贞子、葡萄、油橄榄、牡丹等植物中存在的一种五环三萜类化合物，有降低血糖、抗癌、抗氧化等生理活性，其保肝作用在临床中应用广泛。目前，OA的主要生产方式是植物提取，存在植物生长占地面积大、生长周期长等局限性。随着生物技术的蓬勃发展，人们已完成植物中OA合成途径的解析，并已通过分子操作手段完成了上述途径基因在微生物细胞中的异源表达，实现了生物法合成齐墩果酸的目标，这种方式具有绿色无污染、成本较低等优势。但是，因植物基因与微生物底盘细胞往往存在表达系统不适配的问题，使得微生物合成OA的产量仍较低，远远达不到产业化生产的要求。经前期调研，发明人发现主要有两方面原因：1）传统代谢优化策略包括功能基因的敲入、旁路非必需基因的敲除、旁路必需基因的表达削弱等“刚性”优化手段，往往会对底盘菌株的生长造成损害，进而影响异源代谢物的生产；2）传统代谢优化更加关注于局部代谢流，无法从全局的角度找寻更佳的基因改造位点。
具体地，已有的可提高细胞生长与异源合成兼容性的代谢改造策略均存在一定的局限性。其中，常用的策略是针对局部代谢通路的静态或动态兼容。例如，想要让工程菌高产一种化合物，往往会对该化合物合成代谢所用的酶对应的基因上游启动子替换为可控的启动子，让菌株先生长，“菌多势众”后再通过控制特定配体的添加或生成诱导该基因的表达，实现先生长后生产的效果。但是，该方法需要研究者通过深刻的经验认知和多次试错后建立。而少量已开发出的理性指导策略虽然可通过矩阵分析与模拟计算实现对细胞全局代谢流量的统筹规划，例如，想让工程菌高产一种化合物，可通过全局代谢网络的代谢流分析算法判断出全细胞水平到底那些基因需要移除，就可以使得目标化合物所在途径的代谢流增大，实现物质提产。但该方法仅适用于细胞内源性产物或短途径外源化合物的产量优化，且给出的策略为基因敲除方案，对细胞生长的负面影响存在周期性累加效应。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，对产齐墩果酸（OA）酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶A诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
优选的，所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株Saccharomycescerevisiae OA07。
优选的，所述靶向基因为fol3、abz2或pha2。
优选的，所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_3A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27606。
优选的，所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_5A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27607。
本发明所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，方法步骤包括：
（1）以产齐墩果酸（OA）酿酒酵母生产菌株为出发菌株，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型（GEM）；
（2）运用全局代谢流优化算法OptKnock对所述模型进行模拟计算确定靶向基因；
（3）以所述靶向基因作为基因沉默位点，构建丙二酰辅酶A诱导的反义转录对出发菌株的基因沉默位点进行阶段性表达沉默，使菌株生长与生产代谢流震荡变化，最终获得高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
优选的，步骤（1）中，基于出发菌株的基因信息，向Yeast8中添加与齐墩果酸相关的代谢反应、转运反应及代谢物信息，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型。
优选的，步骤（2）中，在OptKnock计算前，删除通量为零的反应、与基因不相关的反应和对细胞生长必需的反应。
优选的，步骤（3）中，在出发菌株中引入了丙二酰辅酶A相关的转录因子FapR，该转录因子为丙二酰辅酶A诱导型启动子PTDH3-BS23的抑制型反式作用元件，其调控作用受丙二酰辅酶A的抑制；然后，在丙二酰辅酶A合成基因ACC1的3’端反向插入启动子PTDH3-BS23，构建丙二酰辅酶A诱导的反义转录操作元件，使ACC1的合成受丙二酰辅酶A抑制；最后，在出发菌株基因沉默位点的3’端也反向插入启动子PTDH3-BS23，构建得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
本发明所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株在生产齐墩果酸中的应用。
有益效果
本发明提供的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，基于OptKnock算法对出发菌株细胞全局代谢流模拟计算，获得可使目标产物提产的靶向基因，然后通过基于诱导调控的反向转录方式对这些基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，从而实现目标产物阶梯式积累的目的。
相较于出发菌株OA07，本发明构建的菌株R_3A、R_5A在摇瓶级别分批补料发酵时的OA产量提升极为显著，高密度发酵至第4天，R_3A的OA积累量高达1232.19±36.75 mg·L-1，为目前报道的最高产量菌株。
本发明提出的基于全局代谢计算的动态代谢途径调控策略可有效提升酿酒酵母生产植物天然产物OA的能力，是一种有效的工程菌改造方法。
本发明建立了一个基于底盘细胞全基因组代谢网络的约束性计算方法，通过理论设计与实验测试，实现了细胞生长与长或短异源途径产物生产动态偶联的效果。进一步地，利用该方法实践操作，理性构建出了可稳定高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，证明了该方法在指导细胞工厂分子构建的可行性。
附图说明
图1为菌株S. cerevisiaeOA07发酵实验的生理生化数据图。
图2为细胞比生长速率µ、乙醇比吸收速率V eth和齐墩果酸比生产速率V OA曲线。
图3为菌株EK1-1-EK7发酵的细胞干重与齐墩果酸产量数据图。
图4为菌株OA07、EK1-3、EK1-5、EK1-6分批补料发酵的细胞干重和生产齐墩果酸产量图。
图5为菌株R_3A、R_5A、R_6A发酵生产齐墩果酸产量数据图。
图6为菌株R_3A、R_5A、R_6A中胞内的丙二酰辅酶A含量图。
图7为菌株OA07、R_3A、R_5A、R_6A分批补料发酵的细胞干重和生产齐墩果酸产量图。
图8为菌株R_3A的高密度发酵的生长、葡萄糖及乙醇消耗及齐墩果酸产量曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明选用一株具备OA合成能力的酿酒酵母工程菌株Saccharomycescerevisiae OA07作为操作对象，依据其遗传特性与生理生化参数建立该菌株的GEM——Yeast8-OA07，通过OptKnock模拟计算出可实现OA产率提升的7个基因敲除策略，结合分子实验筛选出能有效提高OA产量的方案，共3个；然后，分析可行方案对应的代谢通路，结合关于转录调控的文献报道，建立了针对靶点基因的自主动态基因沉默的方案；最后，通过分子实验构建了相应的3株动态调控菌株——R_3A、R_5A、R_6A，实现了OA生产能力及生产稳定性的显著提升。
1、模型的构建方法
在网站https://github.com/SysBioChalmers/yeast-GEM下载Yeast8模型，针对于酿酒酵母（S. cerevisiae）OA07的基因信息，参考京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）和酿酒酵母数据库（SGD）中的信息，对Yeast8进行修改。具体地：首先向Yeast8中添加相应的代谢反应以及代谢物的基础信息，即通过在反应列表（Reaction List）中添加4个与OA合成相关的代谢反应、2个与OA转运相关的转运反应（表1），在代谢物列表（MetaboliteList）中加入相应的代谢物信息（表2），最终形成了S. cerevisiae OA07的GEM模型Yeast8-OA07。需要说明的是，为保证模型中OA合成途径的代谢通量不为0，β-香树脂醇的合成反应下限在模型中直接被设定为0.0001。然后以葡萄糖为碳源，设定比吸收速率为1 mmol·gDW-1·h-1，对模型进行代谢流平衡分析（Flux balance analysis, FBA），得出细胞比生长速率值为f=0.878 h-1。
表1Yeast8中添加的齐墩果酸相关代谢反应信息
表2 Yeast8中添加的齐墩果酸相关代谢物信息
然后，测定S. cerevisiae OA07的生长与生产能力参数，用于模型优化，具体操作如下：
在含有酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD培养基）的摇瓶中对S. cerevisiae OA07分批培养，在培养至4、12、24、48、72、96、120小时时取样测定干重、葡萄糖和乙醇残留量、OA含量。如图1所示，发酵体系中的葡萄糖在12小时内消耗殆尽，这一阶段乙醇开始积累，在12小时时达到峰值，但OA的含量较低；在12~96小时阶段，S. cerevisiae OA07开始消耗乙醇，OA大量积累；在96小时之后，细胞生长和OA生产趋于稳定。上述结果表明菌株合成OA时主要以乙醇为碳源。因此，为了更好地模拟OA生产阶段的全局代谢流，将Yeast8-OA07中葡萄糖交换反应r_1714的流量下限重新设定为0，而乙醇的交换反应r_1761的流量下限则基于实验所得的乙醇比消耗速率数据（图2）进行调整。如图2所示，利用逻辑斯蒂方程对OA07第12~120小时生长阶段（即乙醇消耗阶段）的细胞干重、乙醇含量、OA含量数据进行非线性拟合，然后对拟合数据求导与单位换算，获得细胞比生长速率μ（h-1）、乙醇比吸收速率Veth(mmol·gDW-1·h-1)、OA合成速率VOA（mmol·gDW-1·h-1）随时间变化的曲线。基于上述实验数据，将Yeast8-OA07中乙醇交换反应r_1761的约束下限设定为S. cerevisiae OA07最大比生长速率(µ=0.03674 h-1)对应时间点的乙醇比吸收速率Veth=0.647 mmol·gDW-1·h-1。在该输入条件下，Yeast8-OA07模拟数据（细胞比生长速率值f=0.0178 h-1、OA比合成速率vOA=0.0001 mmol·gDW-1·h-1）与S. cerevisiae OA07实验数据（µ=0.03674 h-1、VOA=0.000162 mmol·gDW-1·h-1，图2）相对接近。因此，可以认为以乙醇为唯一碳源的Yeast8-OA07能较好地模拟OA生产菌株OA07的全局代谢流分布情况。
2、OptKnock计算
Yeast8-OA07中反应众多，但其中较多反应不能被删除，即不能成为OptKnock的待选反应，因此在OptKnock计算之前需要通过对于模型进行预处理以确定一个待选反应集合。其过程主要包括以下几步：
（1）删除所有通量为零的反应，即对于Yeast8-OA07进行通量平衡分析（FBA）运算，得到所有反应的通量，删除v=0的反应；
（2）删除与基因不相关的反应，比如转运反应、交换反应、以及在模型中没有基因信息相关的反应，因为这些反应在实际实验中是无法通过基因敲除的形式被去除的；
（3）删除对于细胞生长必需的反应，这些反应删除后会使得模型比生长速率f=0，通过运行singleGeneDeletion函数可以找到这些必需反应。
通过上述三步筛选，获得的待选反应集合包含了172个代谢和转运反应，显著降低了OptKnock运算时对内存与时长的需求，便于计算。
然后，在Python的集成开发环境Pycharm中进行Yeast8-OA07的OptKnock计算，通过COBRApy软件包、StrainDesign软件包结合Gurobi求解器、Cplex求解器进行模型读取和策略计算，首先用cobra.io.load_matlab_model进行模型Yeast8-OA07的读取，利用straindesign.fba进行FBA运算；将 sd.SDModule函数中的inner_objective设置为生物量方程，outer_objective设置为OA交换反应，sd.compute_strain_designs函数中的max_cost=1，即将删除反应个数设置为1，来进行OptKnock的双层优化计算。待选反应参数selectedRxnList设定为之前筛选到的172个反应集合，同时保证生长率必须有初始值的50%以上，得到删除一个反应的输出方案之后，在selectedRxnList中删去相应反应，继续进行OptKnock计算，持续迭代，直至出现OA比生产速率低于Yeast8-OA07中初始值的状态。
最终，共获得9种删除单反应的方案，将获得的9种途径优化方案分别命名为K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9（表3）。其中，方案K1~K7均预测出OA产率有比较大提升、比生长速率较出发菌株略低，而K8、K9在模拟计算中OA产率并没有提升，所以K8和K9策略不作后续线下实验验证。
表3 Yeast8-OA07运行OptKnock输出的删除反应列表
3、OptKnock输出方案的验证-基因敲除菌株的构建与发酵（对比例）
基于Optknock计算出得途径优化策略K1~K7，利用同源重组构建7株基因敲除菌株。将成功敲除相关基因的7株菌EK1-1、EK1-2、EK1-3、EK1-4、EK1-5、EK1-6、EK1-7分别接种于YPD培养基中，初始OD600为0.1，30℃、200rpm培养120小时，每组实验设置三组平行。发酵结束后，取少量菌液测定菌浓，另取500 μL的菌液，加入适量的混合型玻璃珠珠打破碎，然后在破碎后的菌液中加入600 μL乙酸乙酯，漩涡震荡萃取再离心后，将上层的乙酸乙酯层收集，重复两次。乙酸乙酯层的液体再经过旋转蒸发仪浓缩至600 μL转移至液相小瓶中，再用旋转蒸发仪蒸干，然后加入200 μL现配的烷基化试剂，然后在80℃水浴30分钟，最后将样品转移至套管中，将所有样品利用气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP2010 Ultra，岛津公司，日本）配备弱极性色谱柱SH-Rxi-5Sil MS （30 m×0.25 mm×0.25 µm）进行定量分析。
截至发酵结束时（图3），工程菌株OA07、EK1-1、EK1-2、EK1-3、EK1-4、EK1-5、EK1-6、EK1-7的细胞干重积累量分别为8.75±0.30 gDW·L-1、9.16±0.38 gDW·L-1、8.32±0.52gDW·L-1、11.75±0.42 gDW·L-1、8.83±0.35 gDW·L-1、9.95±0.25 gDW·L-1、8.85±0.21gDW·L-1、4.65±0.12 gDW·L-1。其中，EK1-3和EK1-5的细胞生长情况显著性高于出发菌株OA07，而EK1-7的细胞干重显著低于出发菌株OA07，仅为OA07的53%。工程菌株OA07、EK1-1、EK1-2、EK1-3、EK1-4、EK1-5、EK1-6、EK1-7的OA产量分别为72.62±1.75 mg·L-1、65.18±7.27 mg·L-1、70.13±4.50 mg·L-1、116.45±2.73 mg·L-1、85.45±3.84 mg·L-1、105.28±3.31 mg·L-1、92.45±1.65 mg·L-1、9.13±1.52 mg·L-1。其中，基因敲除fol1的EK1-1、基因敲除fol2的EK1-2和基因敲除abz1的EK1-4的OA产量与OA07相比没有显著性差异（p＞0.05），而分别敲除基因fol3、abz2、pha2的菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6的OA产量分别提升了60.73%、45.58%、27.33%。另外，菌株EK1-7的OA产量相较于出发菌株OA07显著降低（p＜0.05），这可能与细胞生长能力大幅削弱有关。
4、分批补料培养验证基因敲除突变株的生产稳定性（对比例）
工程菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6是以OA07为出发菌株，分别敲除了参与叶酸合成的fol3、abz2和参与苯丙氨酸合成的pha2后获得的。理论上讲，YPD培养基营养丰富，分批发酵5天中，上述基因缺失菌可通过吸收培养基中已有的叶酸、苯丙氨酸及其前体化合物完成胞内各种分解或合成代谢；相较之下，OA07的基因表达相对冗余。然而，在工业生产中，为提高收入产出比，发酵体系大多不是分批式的，而是连续或半连续的，补料时往往不会大量添加富营养培养基，因此，相对“残缺”的工程菌EK1-3、EK1-5、EK1-6在长周期发酵中可能不具备OA生产的优势。为了验证EK1-3、EK1-5、EK1-6的生产稳定性，进行分批补料培养。
将基因敲除工程菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6接种于YPD培养基中，初始OD600为0.1，在30℃、200 rpm 的条件下进行分批补料培养。初始葡萄糖浓度为20 g·L-1，补料策略是分别在24 h处补加10 g·L-1的葡萄糖，在120 h和168 h处分别补加5 g·L-1的乙醇。然后在24 h、48 h、120 h、168 h、216 h处分别取样进行生长与生产检测。
如图4所示，从细胞生长情况上来看，OA07的细胞干重随着时间的推移逐步增加，在96 h后趋于平稳，但是基因敲除突变株EK1-3、EK1-5、EK1-6的细胞生长随着时间的推移显现出其不稳定性，在120小时后菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6的细胞干重均出现了下降的趋势。如图4b所示，EK1-3、EK1-5、EK1-6的OA产量在120 h处达到了最高值，分别是120.93±3.03 mg·L-1、102.70±4.93 mg·L-1、110.87±2.52mg·L-1，均高于对照菌株OA07的OA产量100.06±2.24 mg·L-1。但是在120 h后，随着两次乙醇补料，OA07中的OA积累量逐渐提升，达到了118.12±6.63 mg·L-1，但是基因敲除菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6中OA的含量逐渐下降，最终只有92.84±1.53 mg·L-1、84.42±3.39 mg·L-1、65.47 mg·L-1。上述结果表明，基于OptKnock的K3、K5、K6策略构建的敲除株可能无法应用于大规模高密度连续发酵生产。
5、动态调控菌株的构建与发酵（实施例）
为获得稳定高产菌株，利用基于转录调控的基因阶段性沉默手段优化K3、K5、K6策略。首先，在酿酒酵母菌株OA07中引入了丙二酰辅酶A相关的转录因子FapR，该转录因子为丙二酰辅酶A诱导型启动子PTDH3-BS23的抑制型反式作用元件，其调控作用受丙二酰辅酶A的抑制；然后，在丙二酰辅酶A合成基因ACC1的3’端反向插入启动子PTDH3-BS23，构建了丙二酰辅酶A诱导的反义转录操作元件，使ACC1的合成受丙二酰辅酶A抑制；最后，在K3、K5、K6方案给出的关键基因fol3、abz2、pha2的3’端也反向插入启动子PTDH3-BS23，构建对应的动态调控菌株R_3A、R_5A、R_6A。理论上，在这三株菌中丙二酰辅酶A的含量震荡变化，而fol3、abz2、pha2的表达会与胞内丙二酰辅酶A的含量负相关，出现基因表达的阶段性沉默的情况，从而使得工程菌的OA产率震荡式改变，实现全局动态调控。
为验证该操作的可行性，将构建好的菌株R_3A、R_5A、R_6A与菌株OA07用YPD培养基置于30℃摇床内同时进行发酵验证，培养至120 h后收菌。利用酸乙酯萃取发酵产物，采用GC-MS对发酵产物进行定量分析，同时测定干重。如图5所示，发酵结束时，R_3A、R_5A的细胞干重最高，分别为13.24±0.344 gDW·L-1和10.99±0.364 gDW·L-1，其对应的OA产量也最高，说明这两株菌中OA生产与细胞生长建立了一定的偶联关系。菌株R_3A、R_5A、R_6A的OA产量分别为161.21±3.65 mg·L-1、150.12±2.28 mg·L-1、128.21±3.12 mg·L-1，相较于OA07（80.12±4.23 mg·L-1）提升了100.49%、75.36%、60.09%。
6、动态调控菌株的分批补料发酵（实施例）
理论上讲，相较于基因敲除菌株EK1-3、EK1-5、EK1-6，阶段性基因沉默菌株R_3A、R_5A、R_6A具有更强的生长与生产稳定性，也更具有工业生产潜力。为了验证这一点，对其进行分批补料培养。将菌株R_3A、R_5A、R_6A与OA07接种在YPD培养基中，初始OD600为0.1。以转速200 rpm、30℃的条件进行分批补料培养。初始葡萄糖浓度为20 g·L-1，补料策略是分别在24 h处补加10 g·L-1的葡萄糖，在96 h和144h处分别补加5 g·L-1的乙醇。发酵过程中，在 30、54、96、108、120、132、144、156h处取样，分别测定各个时间点不同菌株胞内丙二酰辅酶A的含量（图6）。与理论预期一致，丙二酰辅酶A的含量随着时间推移出现了振荡型的变化，说明构建的丙二酰辅酶A诱导的反义转录操作系统在分批补料发酵过程中依然有效，可引起工程改造菌株中代谢网络的动态调控。
同时，在30 h、54 h、96 h、144 h、196 h处分别取样，测定细胞生长情况，并利用酸乙酯萃取发酵产物测定其OA含量。如图7所示，菌株R_3A、R_5A、R_6A的细胞干重在30 h后均高于对照菌株OA07，细胞干重为是对照菌株的1.49倍、1.45倍和1.46倍。同时，菌株R_3A、R_5A、R_6A的OA产量能够随着补料的进行稳定地积累，192 h处菌株R_3A、R_5A、R_6A的OA产量分别达到了271.55±6.76 mg·L-1、260.65±6.53 mg·L-1、183.84±7.62 mg·L-1，显著高于对照菌株OA07（134.11±2.07 mg·L-1），说明这种动态调控的方式在分批补料发酵中能够有效提升工程菌株OA产量。
7、动态调控菌株R_3A的高密度发酵（实施例）
对摇瓶级别的分批补料发酵实验中OA产量最高的动态调控菌株R_3A进行扩大培养。将R_3A接种至含有高密度培养基（含40g·L-1葡萄糖）的5L自动化发酵罐中，初始12h以300rpm的转速培养，之后串联转速控制溶氧到20%，控制pH值为5.5、温度30℃、通气量3vvm。发酵过程中，监测葡萄糖和乙醇的含量。在12-48h期间流加补充400g葡萄糖，48-72h期间流加补充350g乙醇，流加过程中，需维持乙醇浓度在5g/L以下。
在12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、108h、144h、156h、168h处分别取样，测定细胞浓度、葡萄糖残留量、乙醇浓度，并利用乙酸乙酯萃取发酵产物测定其OA含量。如图8所示，菌株R_3A对碳源的消耗较快，葡萄糖在24h内快速消耗殆尽，此后菌株以乙醇为唯一碳源进行生长；菌株生长较快，在96h进入稳定期，OD600维持在188~191；菌株的OA生产曲线与菌体生长曲线的趋势保持一致，在96h达到产量峰值，为1232.19±36.75 mg·L-1，是目前报道的最高水平。
菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae R_3A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27606，保藏日期为2023年6月12日。
菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae R_5A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27607，保藏日期为2023年6月12日。
上述结果表明，本发明提出的基于全局代谢计算的动态代谢途径调控策略可有效提升酿酒酵母生产植物天然产物OA的能力，是一种有效的工程菌改造方法。
综上所述，发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：对产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶A诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
2. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株Saccharomyces cerevisiae OA07。
3.如权利要求2所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述靶向基因为fol3、abz2或pha2。
4. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_3A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27606。
5. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_5A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27607。
6.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：方法步骤包括：
（1）以产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为出发菌株，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型；
（2）运用全局代谢流优化算法OptKnock对所述模型进行模拟计算确定靶向基因；
（3）以所述靶向基因作为基因沉默位点，构建丙二酰辅酶A诱导的反义转录对出发菌株的基因沉默位点进行阶段性表达沉默，使菌株生长与生产代谢流震荡变化，最终获得高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
7. 如权利要求6所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，基于出发菌株的基因信息，向Yeast8中添加与齐墩果酸相关的代谢反应、转运反应及代谢物信息，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型；所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株Saccharomyces cerevisiae OA07。
8.如权利要求7所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，在OptKnock计算前，删除通量为零的反应、与基因不相关的反应和对细胞生长必需的反应。
9.如权利要求8所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，在出发菌株中引入了丙二酰辅酶A相关的转录因子FapR，该转录因子为丙二酰辅酶A诱导型启动子PTDH3-BS23的抑制型反式作用元件，其调控作用受丙二酰辅酶A的抑制；然后，在丙二酰辅酶A合成基因ACC1的3’端反向插入启动子PTDH3-BS23，构建丙二酰辅酶A诱导的反义转录操作元件，使ACC1的合成受丙二酰辅酶A抑制；最后，在出发菌株基因沉默位点的3’端也反向插入启动子PTDH3-BS23，构建得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
10.如权利要求1~5所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株在生产齐墩果酸中的应用。
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