CN116179385A - 一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法，具体涉及采用重组酿酒酵母进行发酵生产，该重组酿酒酵母至少表达了香树脂醇合酶CrMAS、香树脂醇C‑28位氧化酶CrAO和细胞色素‑NADPH‑还原酶AtCPR1，敲除了苹果酸合酶MLS1，并强化表达了醇脱氢酶ADH2、乙酸盐‑辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1以及香树酯醇合酶CrMAS。

Description

一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
熊果酸(Ursolic acid,UA)及其同分异构体齐果酸(Oleanolic acid,OA)是具有抗癌和抑菌效果的五环三萜化合物。市场对于熊果酸和齐墩果酸的需求量远大于目前采用的植物提取法所能获得的熊果酸和齐墩果酸。并且植物提取法存在耗时长、回收率低以及成本高等问题。通过对合成熊果酸和齐墩果酸的代谢途径进行系统优化，利用微生物细胞工厂生产熊果酸和齐墩果酸成为一种有前途的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用微生物细胞工厂生产熊果酸和齐墩果酸的方法，通过引入合成基因为物质生产提供基础，随后通过敲除、强化表达等手段提高熊果酸和齐墩果酸的产量，效果显著优于现有报道。
本发明的第一个目的是提供一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的酿酒酵母，所述酿酒酵母表达了香树脂醇合酶CrMAS、香树脂醇C-28位氧化酶CrAO和细胞色素-NADPH-还原酶AtCPR1，敲除了苹果酸合酶MLS1，并强化表达了醇脱氢酶ADH2、乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1以及香树酯醇合酶CrMAS。
进一步地，所述酿酒酵母采用启动子PHXT1替换羊毛甾醇合酶ERG7的原启动子PERG7。
进一步地，所述酿酒酵母表达了融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1。
进一步地，所述酿酒酵母强化表达了NADH激酶POS5。
进一步地，所述酿酒酵母至少增加一个拷贝数的醇脱氢酶ADH2、乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1、融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1和NADH激酶POS5。
进一步地，所述酿酒酵母至少增加两个拷贝数的香树酯醇合酶CrMAS。
进一步地，所述香树脂醇合酶CrMAS的Gene ID为JN991165.1，所述香树脂醇C-28位氧化酶CrAO的Gene ID为AEX07772.1，所述细胞色素-NADPH-还原酶AtCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述苹果酸合酶MLS1的Gene ID为855606。
进一步地，所述醇脱氢酶ADH2的Gene ID为855349，所述的乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1的Gene ID为851245，所述的醛脱氢酶ALD6的Gene ID为856044，所述鲨烯环氧酶ERG1的Gene ID为853086，所述NADH激酶POS5的Gene ID为855913，所述的融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1的核苷酸序列如中SEQ ID NO.1所示。本文中所述的Gene ID均指NCBI平台。
进一步地，通过启动子PGAL1强化表达醇脱氢酶ADH2、香树酯醇合酶CrMAS以及融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1。
进一步地，通过启动子PGAL7强化表达乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6以及NADH激酶POS5。
进一步地，通过启动子PTEF1强化表达鲨烯环氧酶ERG1。
本发明的第二个目的是提供一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的方法，包括应用上述重组酿酒酵母进行发酵的步骤。
进一步地，将所述酿酒酵母在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，将酿酒酵母在25～35℃下在种子培养基中活化，得到种子液，将种子液以1-5％的接种量接入发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养。
进一步地，所述种子培养基为YPD培养基。
进一步地，所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种提高酿酒酵母合成熊果酸和齐墩果酸产量的方法。本发明首先通过敲除苹果酸合酶MLS1，强化醇脱氢酶ADH2、乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1以及醛脱氢酶ALD6，增加前体乙酰辅酶A的供应；其次，增加了鲨烯环氧酶ERG1以及香树酯醇合酶CrMAS的拷贝数；随后，采用启动子PHXT1替换羊毛甾醇合酶ERG7启动子PERG7，并进一步表达融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1以及NADH激酶POS5，使得重组酿酒酵母在3-L发酵罐中可以合成1132.9mg/L的熊果酸和433.9mg/L的齐墩果酸。
附图说明
图1为S6酿酒酵母菌株3-L发酵罐发酵生产熊果酸和齐墩果酸情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
SD HIS平板：YNB培养基1.7g/L，葡萄糖20g/L，L-亮氨酸50mg/L，L-色氨酸50mg/L，尿嘧啶50mg/L，琼脂粉15g/L。
SD Ura平板：YNB培养基1.7g/L，葡萄糖20g/L，L-亮氨酸50mg/L，L-色氨酸50mg/L，L-组氨酸50mg/L，琼脂粉15g/L。
YPD固体平板：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
熊果酸和齐墩果酸产量的测定：
使用Agilent 1260进行高效液相色谱检测，色谱柱为C18 ODS(5μm,250×4.6mm,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。流动相：水(0.5％乙酸铵，0.04mol/L羟丙基-β-环糊精)：纯乙腈＝3：7，流速1mL/min，柱温25℃，波长为210nm，进样体积为20μL。
下述实施例中所涉及的酿酒酵母UO2菌株的制备如下：
1、构建酿酒酵母菌株UO1
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段Pgal1-CrMAS-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
以酿酒酵母Y6(出自专利CN113502235A)基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物416d-UP-F、416d-UP-R扩增得到基因片段416d-UP；
用引物416d-DOWN-F、416d-DOWN-R扩增得到基因片段416d-DOWN；
以质粒pMHyLp-LEU(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)为模板，采用引物416d-loxLEU-F、416d-loxLEU-R扩增得到416d-loxLEU片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段Pgal1-CrMAS-TCYC1、416d-UP、416d-DOWN、416d-loxLEU采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段416d-Pgal1-CrMAS-TCYC1。
(3)将步骤(2)中的融合基因片段转化入酿酒酵母Y6菌株感受态中，在SD LEU平板上于28-30℃培养2-3天，使用下表所述的引物YZ-416d-F、YZ-416d-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒(专利CN113502235A中核苷酸序列SEQ ID NO.3)质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD LEU、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的重组酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母UO1。
UO1相关引物序列
416d-DOWN-F gctcgaaggctttaatttgcggcctgctccttcactattttaacatgtggaattcttg
416d-DOWN-R atatccacatcaatggctaatggcaaaac
416d-loxLEU-F ctatatgttgataattagcgttgcctcatcaggaaacagctatgaccatgattacg
416d-loxLEU-R tggatatgtatatggtggtaatgccatgttaaaacgacggccagtgccaa
416d-UP-F ggccttttgaaaagcaagcataaaagatctaaac
416d-UP-R gtaatcatggtcatagctgtttcctgatgaggcaacgctaattatcaacatatagattg
YZ-416d-F ttgctatttgggaaccacctgttc
YZ-416d-R caataatctatatgctcaccaatcagatttactctgc
2、构建酿酒酵母菌株UO2
(1)人工合成基因片段Pgal1-CrAO-TTDH3-Pgal10-AtCPR1-TCYC1(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示)；
以酿酒酵母Y6基因组为模板，用引物208a-UP-F、208a-UP-R扩增得到基因片段208a-UP；
用引物208a-DOWN-F、208a-DOWN-R扩增得到基因片段208a-DOWN；
以质粒pMHyLp-LEU为模板，采用引物208a-loxLEU-F、208a-loxLEU-R扩增得到208a-LEU片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段Pgal1-CrAO-TTDH3-Pgal10-AtCPR1-TCYC1、208a-UP、208a-DOWN、208a-LEU采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段208a-Pgal1-CrAO-TTDH3-Pgal10-AtCPR1-TCYC1。
(3)将步骤(2)中的基因片段转化入UO1菌株感受态中，在SD LEU平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-208a-F、YZ-208a-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD LEU、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株UO2。
UO2相关引物序列
208a-DOWN-F gacgctcgaaggctttaatttgcggccgatcacgacggcaatgacaaaaact
208a-DOWN-R gaggcctgcacagacacttg
208a-UP-F gctaaacatgccgtctccgaag
208a-UP-R catggtcatagctgtttcctggagcactttacacagtgcaggaac
208a-loxLEU-F gttcctgcactgtgtaaagtgctccaggaaacagctatgaccatgattacg
208a-loxLEU-R gctgtatagctcatatctttccctttaaaacgacggccagtgcca
YZ-208a-F tggaaattgctaattctaaagctcctggtg
YZ-208a-R gaagatggttttcagacaaactcctacaca
实施例1构建酿酒酵母菌株S1
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段
PGAL1-ADH2-TCYC1-PGAL7-ALD6-TADH1-PGAL7-ACS1-TTDH3(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物MLS1-UP-F、MLS1-UP-R扩增得到基因片段MLS1-UP；
用引物MLS1-DOWN-F、MLS1-DOWN-R扩增得到基因片段MLS1-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS(专利CN113502235A中核苷酸序列SEQ ID NO.2)为模板，采用引物MLS1-loxHIS-F、MLS1-loxHIS-R扩增得到MLS1-loxHIS片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段
PGAL1-ADH2-TCYC1-PGAL7-ALD6-TADH1-PGAL7-ACS1-TTDH3、MLS1-UP、MLS1-DOWN、MLS1-loxHIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段MLS1-PGAL1-ADH2-TCYC1-PGAL7-ALD6-TADH1-PGAL7-ACS1-TTDH3。
(3)将步骤(2)中的融合基因片段转化入酿酒酵母UO2菌株感受态中，在SD HIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用表1所述的引物YZ-MLS1-F、YZ-MLS1-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒(专利CN113502235A中核苷酸序列SEQ ID NO.3)质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的重组酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母S1。
表1引物序列
MLS1-DOWN-F ccgctgtatagctcatatctttccctttctcccttgccccagtgtacac
MLS1-DOWN-R ttaaggatggctatcaacatcctttgaagtttccatta
MLS1-loxHIS-F aagtagtaaaagcacataaaagaattaagaaacaggaaacagctatgaccatgattacg
MLS1-loxHIS-R agctgtttcctgtttcttaattcttttatgtgcttttactactttgtttagttcaaaac
MLS1-UP-F tgtctaatgcgaaggtacttttatttttttcagattca
MLS1-UP-R agctgtttcctgtttcttaattcttttatgtgcttttactactttgtttagttcaaaac
YZ-MLS1-F ttctagaatttacgttcaagaaggtatttacgacga
YZ-MLS1-R ttgttggtctttctataaaccaagacgtgtc
实施例2构建酿酒酵母菌株S2
(1)人工合成基因片段PTEF1-ERG1-TTDH3-PGAL1-CrMAS-TCYC1(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，用引物1021b-UP-F、1021b-UP-R扩增得到基因片段1021b-UP；
用引物1021b-DOWN-F、1021b-DOWN-R扩增得到基因片段1021b-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物1021b-loxHIS-F、1021b-loxHIS-R扩增得到1021b-HIS片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PTEF1-ERG1-TTDH3、1021b-UP、1021b-DOWN、1021b-HIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段1021b-PTEF1-ERG1-TTDH3-PGAL1-CrMAS-TCYC1。
(3)将步骤(2)中的基因片段转化入实施例1制备得到的S1菌株感受态中，在SDHIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-1021b-F、YZ-1021b-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株S2。
表2引物序列
1021b-DOWN-F cgaaggctttaatttgcggccggcattatgagttaagagataatacgcac
1021b-DOWN-R gagaaaggacttaatccgtacacaatga
1021b-UP-F ttggtaacagaagatggcagtatttcca
1021b-UP-R gcgtaatcatggtcatagctgtttcctgggagatgcgacgaattactggc
1021b-loxHIS-F gccagtaattcgtcgcatctcccaggaaacagctatgaccatgattacgc
1021b-loxHIS-R aaaaaaggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgcca
YZ-1021b-F acctagacttcagcgaccgt
YZ-1021b-R agagtgggaggaacaagatgct
实施例3构建酿酒酵母菌株S3
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGAL1-CrMAS-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表3所述的引物序列，用引物1309a-UP-F、1309a-UP-R扩增得到基因片段1309a-UP；
用引物1309a-DOWN-F、1309a-DOWN-R扩增得到基因片段1309a-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物1309a-loxHIS-F、1309a-loxHIS-R扩增得到1309a-HIS片段。
(2)将步骤(1)中的片段PTEF1-ERG1-TTDH3、1309a-UP、1309a-DOWN、1309a-HIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段1309a-PGAL1-CrMAS-TCYC1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例2制备得到的S2菌株的感受态中，在SD HIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-1309a-F、YZ-1309a-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株S3。
表3引物序列
1309a-DOWN-F ctcgaaggctttaatttgcggccaggtctactactccatcgtaaagcc
1309a-DOWN-R ccattgaataacaacggtcttaccatct
1309a-loxHIS-F tcaactactacgagagagggaccaggaaacagctatgaccatgattacgc
1309a-loxHIS-R aaaaaaggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgcca
1309a-UP-F gcagatgtgaccataaccctgg
1309a-UP-R gcgtaatcatggtcatagctgtttcctggtccctctctcgtagtagttgatatccc
YZ-1309a-F tgatgaagccgtcagccaagg
YZ-1309a-R gcagtgaaggcaagacgagtt
实施例4构建酿酒酵母菌株S4
具体步骤如下：
(1)以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表4所述的引物序列，用引物HXT1-F、HXT1-R扩增得到基因片段PHXT1(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表4所述的引物序列，用引物HXT1-UP-F、HXT1-UP-R扩增得到基因片段308a-UP；
用引物HXT1-DOWN-F、HXT1-DOWN-R扩增得到基因片段HXT1-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物HXT1-loxHIS-F、HXT1-loxHIS-R扩增得到HXT1-HIS片段。
(2)将步骤(1)中的片段PHXT1、HXT1-UP、HXT1-DOWN、HXT1-HIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段HXT1-PHXT1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例3制备得到的S3菌株的感受态中，在SD HIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-HXT1-F、YZ-HXT1-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株S4。
表4引物序列
Figure BDA0004075657400000101
Figure BDA0004075657400000111
实施例5构建酿酒酵母菌株S5
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGAL1-PLN1-CrAO-AtCPR1-TTDH3(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表5所述的引物序列，用引物308a-UP-F、308a-UP-R扩增得到基因片段308a-UP；
用引物308a-DOWN-F、308a-DOWN-R扩增得到基因片段308a-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物308a-loxHIS-F、308a-loxHIS-R扩增得到308a-HIS片段。
(2)将步骤(1)中的片段PGAL1-PLN1-CrAO-AtCPR1-TTDH3、308a-UP、308a-DOWN、308a-HIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段308a-PGAL1-PLN1-CrAO-AtCPR1-TTDH3；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例4制备得到的S4菌株的感受态中，在SD HIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-308a-F、YZ-308a-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株S5。
表5引物序列
Figure BDA0004075657400000112
Figure BDA0004075657400000121
实施例6构建酿酒酵母菌株S6
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGAL7-POS5-TTDH3(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；
以酿酒酵母UO2基因组为模板，采用表6所述的引物序列，用引物CIT2-UP-F、720a-UP-R扩增得到基因片段720a-UP；
用引物720a-DOWN-F、720a-DOWN-R扩增得到基因片段720a-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物720a-loxHIS-F、720a-loxHIS-R扩增得到720a-HIS片段。
(2)将步骤(1)中的片段720a-UP、720a-DOWN、720a-HIS采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段720a；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例5制备得到的S5菌株的感受态中，在SD HIS平板上于28-30℃培养2-3天，使用引物YZ-720a-F、YZ-720a-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于28-30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于28-30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD HIS、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株S6。
表6引物序列
Figure BDA0004075657400000122
Figure BDA0004075657400000131
实施例7S1～S6酿酒酵母菌株发酵制备熊果酸和齐墩果酸
具体步骤如下：
(1)制备种子液
挑取重组酿酒酵母株菌S1～S6于2mL YPD培养基中，25～35℃，220～280rpm条件下培养18-24h。
(2)发酵培养
按1％～5％(v/v)的接种量转接至含有20～40mL大豆蛋白胨培养基的250mL平底烧瓶中，于25～35℃，220～280rpm条件下培养96-120h。
大豆蛋白胨培养基：30～60g/L大豆蛋白胨、15～35g/L蔗糖、15～35g/L葡萄糖，10-25g/L半乳糖，尿嘧啶20-60mg/L。
(2)产物提取
取发酵液1mL，12000rpm离心5min，弃上清，加入1mL甲醇和0.5g玻璃珠进行研磨破碎，于12000rpm离心10min后，取上层甲醇进行熊果酸和齐墩果酸产量的测定。
结果如表7所示。
表7S1～S6菌株产量
Figure BDA0004075657400000132
Figure BDA0004075657400000141
实施例8S6酿酒酵母菌株3-L发酵罐发酵制备熊果酸和齐墩果酸
具体步骤如下：
(1)制备一级种子液
挑取重组酿酒酵母株菌S6于2mL YPD培养基中，25～35℃，220～280rpm条件下培养18-24h。
(2)制备二级种子液
按1％(v/v)的接种量转接至含有150mL大豆蛋白胨培养基的500mL平底烧瓶中，于25～35℃，220～280rpm条件下培养18-24h。
(3)3-L发酵罐培养
按10％(v/v)的接种量转接至含有1.5L大豆蛋白胨培养基的3-L发酵罐中。诱导前以800g/L的葡萄糖为碳源。48h时加入终浓度为15～25g/L的半乳糖作为诱导剂。48h后以790g/L的乙醇作为碳源，维持乙醇浓度低于10g/L。发酵结果如下图1所示。在108h时，3-L发酵罐中可以合成1132.9mg/L的熊果酸和433.9mg/L的齐墩果酸。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达了香树脂醇合酶CrMAS、香树脂醇C-28位氧化酶CrAO和细胞色素-NADPH-还原酶AtCPR1，敲除了苹果酸合酶MLS1，并强化表达了醇脱氢酶ADH2、乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1以及香树酯醇合酶CrMAS。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母采用启动子PHXT1替换羊毛甾醇合酶ERG7的原启动子PERG7。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达了融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母强化表达了NADH激酶POS5。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母至少增加一个拷贝数的醇脱氢酶ADH2、乙酸盐-辅酶A连接酶1ACS1、醛脱氢酶ALD6、鲨烯环氧酶ERG1、融合蛋白PLN1-CrAO-AtCPR1和NADH激酶POS5。
6.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母至少增加两个拷贝数的香树酯醇合酶CrMAS。
7.一种提高熊果酸和齐墩果酸产量的方法，其特征在于：包括应用权利要求1-6任一项所述的酿酒酵母进行发酵的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将酿酒酵母在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将酿酒酵母在25～35℃下在种子培养基中活化，得到种子液，将种子液以1-5％的接种量接入发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述种子培养基为YPD培养基；所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117467552B (zh) * 2023-09-04 2024-06-07 北京理工大学 高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用

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