CN112725212A - 高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用 - Google Patents

高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用，该重组酵母菌株是以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为底盘细胞，通过敲除靶基因PDC1和ADH1，得到一突变型酵母菌株，实现了乙醇合成途径的弱化。在此基础上，异源表达来自梭菌的7α‑HSDH和7β‑HSDH编码基因，旨在实现将CDCA为底物生物合成UDCA。目前，底物CDCA的转化率达到90％。

Description

高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构 建与应用
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用。
背景技术
熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。
熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid,UDCA)是传统的中药的有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，在治疗胆结石、促进肝移植、胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化和药物诱发的肝炎，有非常好的疗效，市场用量很大。目前，制备UDCA主要有活熊取胆汁和人工合成两种方法，天然来源是活熊取胆或熊胆汁，活熊受到动物保护法的保护，提取来源受到限制造成天然熊胆的来源日趋减少。人工合成是指使用能够大量获取的牛、鹅胆汁提取的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)化学法合成UDCA，通过氧化还原的方法使7-OH发生构型反转，但是存在着反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题，尤其是保护和脱保护过程中需要有毒和危险试剂，严重限制了化学法的工业化应用。目前使用化学法生产的UDCA约占到市场份额的30％，而且制备高纯度较低，约80％左右，还远不能满足市场对UDCA的用量及质量的需求。
与化学差向异构化相比，CDCA生物合成UDCA具有高效性和相对环境友好性。微生物转化或生物酶催化主要围绕7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)展开，利用产7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和谐梭菌、巴氏梭菌和嗜麦芽黄单胞菌，实现了CDCA向UDCA的生物转化，UDCA的生物酶催化反应过程如图1所示。
然而，高浓度的CDCA抑制细胞生物量的积累，在产品回收和纯化过程中存在困难。此外，以往的研究表明，随着培养时间的延长，中间体的产量增加，UDCA降低，无法实现工业化生产。
Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(Appl Environ Microbiol,1982,43(5):1057-1063)，但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135)，发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680)，重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。
综上，目前仅有报道有关7α-HSDH和7β-HSDH在大肠杆菌中的表达，而该酶在其他菌株中能否实现同样的表达，尚不明确，需要科研工作者的进一步探索研究。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用，利用乙醇合成途径弱化的酵母细胞作为底盘细胞，实现7α-HSDH和7β-HSDH的异源表达，得到高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的一个目的是，提供一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，该重组酵母菌株是以突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1为出发菌株，转入含有7α-HSDH和7β-HSDH基因的重组表达质粒获得的工程菌，其中突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1是以购自欧洲EUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html)的酿酒酵母菌株S.cerevisiaeCEN.PK2-1C为出发菌株，经基因敲除技术敲除乙醇合成途径第一个酶丙酮酸脱羧酶PDC1的编码基因和第二个酶乙醇脱氢酶ADH1的编码基因后，获得的工程菌株即为突变型酵母菌株，命名为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1。所述酿酒酵母敲除靶基因PDC1和ADH1核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
进一步的，所述7α-HSDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述7β-HSDH的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，敲除了乙醇合成途径的关键基因PDC1和ADH1，所述基因敲除技术为Cre-LoxP技术。
进一步的，所述重组酵母菌株名称为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh17α-HSDH↑7β-HSDH↑。
本发明的另一个目的是，提供一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株的构建方法，以乙醇合成途径弱化的酿酒酵母底盘细胞菌株S.cerevisiaeCEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1为出发菌株。根据7α-HSDH基因的核苷酸序列和7β-HSDH的核苷酸序列，委托基因公司合成全基因序列，进而将7α-HSDH和/或7β-HSDH基因插入穿梭载体pY15TEF1和pYX212，对应的得到重组表达质粒pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH，之后，将所述重组表达质粒转化入所述突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1中，得到重组酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh17α-HSDH↑7β-HSDH↑。
进一步的，重组酵母菌株所用培养基为YNB培养基。
本发明的另一个目的是，提供上述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株在生产熊去氧胆酸中的应用。
本发明的另一个目的是，提供上述的应用生产所得的熊去氧胆酸。
有益效果：本发明提供的高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用，与现有技术相比，具有以下优势：
本发明以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C为底盘细胞，通过敲除靶基因PDC1和ADH1，实现了乙醇合成途径的弱化，将工程菌株命名为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1，即为突变型酵母菌株。在此基础上，异源表达来自梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因，旨在实现将CDCA为底物生物合成UDCA。目前，底物CDCA的转化率达到90％。
附图说明
图1为UDCA的生物酶催化反应过程示意图；
图2为突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1中丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶活性的变化，(a)PDC(b)ADH；
图3为突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1的发酵曲线，(a)菌体生长(b)残糖(c)乙醇(d)丙酮酸。
图4为UDCA的LC-MS图谱。(a)UDCA标准品的液相色谱图谱；(b)重组酵母菌株发酵液的液相色谱图谱；(c)UDCA标准品的质谱图谱；(d)重组酵母菌株发酵液的质谱图谱。
图5为底物CDCA的转化率随时间的变化。
具体实施方式
如图1所示的UDCA的生物酶催化反应过程，本发明通过在酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1C中敲除靶基因PDC1和ADH1，实现了乙醇合成途径的弱化，得到的工程菌株即为突变型酵母菌株，命名为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1。异源表达来在梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因，得到的重组酵母菌株名称为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1 7α-HSDH↑7β-HSDH↑，提高了底物转化效率。
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1菌株构建
利用Cre-LoxP技术敲除PDC1基因：
以带有HIS标记的质粒pUG27为模板，PDC1-F、PDC1-R为引物(引物序列如SEQ.NO.05-SEQ.NO.06所示)，PCR扩增得到1544bp的用于敲除PDC1基因的HIS敲除盒，包括HIS基因以及与PDC1基因上下游各有45bp的核苷酸同源序列。用LiAc转化方法转化酿酒酵母野生型菌株CEN.PK2-1C，涂布SD-His平板，30℃培养箱培养3d。将获得的转化子在SD-His平板划线纯化2-3d，再接入SD-His液体培养基中过夜培养至饱和，提基因组进行PCR验证，所用引物A(PDC1)、BM(PDC1)、CM(PDC1)和D(PDC1)，对应的序列分别为SEQ.NO.07-10。突变后得到S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1。
利用Cre-LoxP技术敲除PDC1和ADH1双基因：
在敲除了PDC1基因的基础上，以携带有HIS标记的质粒pUG27为模板，ADH1-F、ADH1-R引物(引物序列如SEQ.NO.11-SEQ.NO.12所示)，PCR扩增得到1604bp的用于敲除ADH1基因的HIS敲除盒，包括HIS基因以及与ADH1基因上下游各有75bp的核苷酸同源序列，用LiAc转化方法转化酿酒酵母pdc1缺失株，涂布SD-His平板，30℃培养箱培养4d。将获得的转化子在SD-His平板划线纯化2-3d，再接入SD-His液体培养基中过夜培养至饱和，提基因组进行PCR验证，所用引物为A(ADH1)、BM(ADH1)、CM(ADH1)和D(ADH1)，对应的序列分别为SEQ.NO.13-16。
本实施例所用的酿酒酵母野生型菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C购自欧洲EUROSCARF，具体可参见：http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html。获得的突变型酵母菌株为S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1。
进一步的，通过测定丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的活性，验证PDC1和ADH1敲除后对酿酒酵母积累乙醇的影响。突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1中丙酮酸脱羧酶(PDC)和乙醇脱氢酶(ADH)活性的变化如图2所示，其中，(a)PDC，(b)ADH。可以看出，相较于原始出发菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C，经过敲除相关基因后，丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的活性大大降低，从而弱化了乙醇的合成途径，有利于维持7α-HSDH和7β-HSDH酶的稳定性和调节酵母细胞胞内氧化还原平衡。
如图3所示，突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1的发酵曲线，(a)菌体生长(b)残糖(c)乙醇(d)丙酮酸。
实施例2转化鹅去氧胆酸工程酵母的构建
以pY15TEF1和pYX212为表达质粒，构建pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH过量表达载体。具体方法为：带有限制性酶切位点的基因产物7α-HSDH和7β-HSDH由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，之后，将上述基因产物7α-HSDH和7β-HSDH和质粒pY15TEF1、pYX212同时用XbaI和BamHI、EcoRI和BamHI(引物序列如SEQ.NO.17-SEQ.NO.20所示)双酶切，用T4 DNA连接酶连接，5μL连接产物转化到50μL大肠杆菌感受态细胞，涂布LA平板，获得的转化子通过菌落PCR及酶切验证其正确性，用XbaI和BamHI、EcoRI和BamHI双酶切验证，并通过测序验证正确的转化子，得到重组质粒pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH。
将质粒电击转化入实施例1所得的突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1中，在抗性平板上挑出转化子，用引物对7α-HSDH-F和7α-HSDH-R，7β-HSDH-F和7β-HSDH-R(表1)进行菌落PCR验证，成功构建重组菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1 7α-HSDH↑7β-HSDH↑。
表1引物序列
Figure BDA0002901235720000061
实施例3转化鹅去氧胆酸工程酵母的发酵
酿酒酵母培养条件：从-80℃菌种保藏管取菌在YPD(含营养标记质粒的转化子在对应的SD缺陷培养基)平板上进行活化，30℃培养3d；挑取活化的单菌落接种到装有YPD(含营养标记质粒的转化子在对应的SD缺陷培养基)培养基的3mL试管中，30℃、220rpm过夜培养至饱和。
发酵培养条件：从平板上挑取活化的单菌落接种到种子培养基，30℃、220rpm摇瓶培养24h至饱和。以起始OD＝0.2转接到发酵培养基摇瓶中，30℃、220rpm培养。将细胞培养至稳定期(48h)，离心收集细胞，在0.1M的PBS溶液中重悬，加入2％的CDCA溶液，30℃恒温水浴反应4h。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母氮源1.7，(NH4)2SO4 5，10×AA 100mL/L(缺5种氨基酸的氨基酸混合物)，100×Ura 10mL/L，100×His 10mL/L，100×Leu 10mL/L,100×Arg 10mL/L,100×Trp 10mL/L，pH 6.8-7.0每250mL三角瓶中装液25mL，121℃灭菌20min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母氮源3.4，(NH4)2SO4 5，10×AA 100mL/L(缺5种氨基酸的氨基酸混合物)，100×Ura 10mL/L，100×His 10mL/L，100×Leu 10mL/L,100×Arg 10mL/L,100×Trp 10mL/L，pH 6.8-7.0，每500mL三角瓶装液50mL，121℃灭菌20min。
其中，氨基酸混合液10×AA：含有缬氨酸1.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.3g、苯丙氨酸0.5g、苏氨酸2g、色氨酸0.4g、酪氨酸0.3g、甲硫氨酸0.2g、异亮氨酸0.3g、硫酸腺嘌呤0.2g的氨基酸混合物5.9g用去离子水定容至1L。100×Ura：去离子水溶2g Uracine定容至1L；100×His：去离子水溶2g Histidine定容至1L；100×Leu：去离子水溶10g Leucine定容至1L；100×Arg：去离子水溶10g Arginine定容至1L；100×Trp：去离子水溶10g Tryptophane定容至1L。
实施例4产物验证
采用液相色谱图谱和质谱图谱对实施例3的发酵产物进行测定，测定方法为：
标准品及制备：精密称取UDCA(98％)和CDCA(98％)标准品100mg到10mL容量瓶，甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后，将其用甲醇稀释2500倍，制成4mg/L备用。样品用甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后备用。
LC-MS:色谱柱为5cm HypersilGold C18柱，柱温30度，C是乙腈，D是0.1％甲酸水，采用梯度洗脱的方式(表2)，质谱采用负离子模式全扫200-500。
表2梯度洗脱条件
保留时间(min) 流速(mL/min) C(％) D(％)
1 0.000 0.300 40.0 60.0
2 0.000 0.300 40.0 60.0
3 1.000 0.300 40.0 60.0
4 4.000 0.300 99.0 1.0
5 5.000 0.300 99.0 1.0
6 5.100 0.300 40.0 60.0
7 8.000 0.300 40.0 60.0
图谱测定结果如图4所示，其中，(a)是UDCA标准品的液相色谱图谱，(b)是重组酵母菌株发酵液的液相色谱图谱；(c)是UDCA标准品的质谱图谱，(d)是重组酵母菌株发酵液的质谱图谱。说明成功发酵得到了UDCA。
实施例4：转化率测定
底物CDCA余量及UDCA产量测定方法：
标准品的标准曲线：精密称取UDCA(98％)和CDCA(98％)标准品100mg到10mL容量瓶，甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后，将其用甲醇稀释2500倍，制成4mg/L备用，进一步将其稀释到0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L，根据实施例3中的LC色谱条件，采用外标法制作标准曲线。
对底物及产物进行测试，反应体系包括0.1M pH8.0的PBS缓冲液，2％的辅酶NADP+，反应温度为38℃，加入重组酵母细胞，分别在反应进行到3h、6h、9h、12h、15h和18h取样测定底物CDCA余量及UDCA产量，反应12h后，底物CDCA的量大大减少，而相应的合成了大量的UDCA，CDCA转化率高达90％(如图5所示)，充分说明CDCA得到高效转化。
综上，本发明以突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1为出发菌株，转入含有7α-HSDH和7β-HSDH基因的重组表达质粒，获得了重组酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1 7α-HSDH↑7β-HSDH↑，与目前通常使用的以大肠杆菌作为底盘细胞进行7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的异源表达的方法相比，本发明选择酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1CΔpdc1Δadh1菌株为宿主，异源表达了来源于梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH，产品更具有安全性，克服了大肠杆菌产毒素的潜在安全问题，同时，酵母不会被噬菌体浸染，有利于工业化的生产，取得了出乎预料的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用
<141> 2021-01-15
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> PDC1
<400> 1
atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120
gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180
tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240
gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300
gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420
gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480
agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540
ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600
attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660
tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720
ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780
ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840
ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900
tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960
ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020
gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080
gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140
ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200
ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260
gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320
ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380
ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440
cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500
actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560
ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620
ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680
gctaagcaat aa 1692
<210> 2
<211> 1047
<212> DNA
<213> ADH1
<400> 2
atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60
tacaaagata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaaatac 120
tctggtgtct gtcacactga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180
ctaccattag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240
aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300
tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360
acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420
cctcaaggta ccgacttggc ccaagtcgcc cccatcttgt gtgctggtat caccgtctac 480
aaggctttga agtctgctaa cttgatggcc ggtcactggg ttgctatctc cggtgctgct 540
ggtggtctag gttctttggc tgttcaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600
attgacggtg gtgaaggtaa ggaagaatta ttcagatcca tcggtggtga agtcttcatt 660
gacttcacta aggaaaagga cattgtcggt gctgttctaa aggccactga cggtggtgct 720
cacggtgtca tcaacgtttc cgtttccgaa gccgctattg aagcttctac cagatacgtt 780
agagctaacg gtaccaccgt tttggtcggt atgccagctg gtgccaagtg ttgttctgat 840
gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctct attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900
gacaccagag aagctttgga cttcttcgcc agaggtttgg tcaagtctcc aatcaaggtt 960
gtcggcttgt ctaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020
agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047
<210> 3
<211> 789
<212> DNA
<213> 7α-HSDH
<400> 3
atgaaaagat tagaaggaaa agtcgcaata gtaacatcat ctactagagg aataggacgt 60
gcatctgcag aagcattagc aaaagaaggt gctttagtat atctagcagc acgttcagag 120
gaattagcta atgaagttat agcagatata aaaaagcaag gtggagtagc taagtttgtt 180
tactttaatg ctagagaaga agaaacttac acttcaatgg tagaaaaagt tgctgaagct 240
gaaggcagga tagatatatt agttaataac tacggtggaa caaatgttaa tttagataag 300
aacttaactg ctggagatac agatgaattc tttagaatat taaaagataa cgttcaaagt 360
gtatacttac cagcaaaagc tgctatacca catatggaaa aagtaggcgg tggaagcata 420
gttaatatct caactatagg atcagttgtt ccagatatat caagaatagc ttactgtgta 480
tcaaaatccg ctataaactc tttaactcaa aacatagcat tacaatatgc aagaaagaat 540
atcagatgta atgcagtatt acctggttta ataggaacta gagcagcact cgaaaatatg 600
actgatgaat ttagagactc attcttagga catgttcctt taaatagagt aggaagacca 660
gaagatatag caaatgcagt tttatactat gcctctgatg attcaggtta tgtaacagga 720
atgattcatg aagttgcagg aggttttgca ttaggaactc ctcaatattc agaatactgt 780
ccaagataa 789
<210> 4
<211> 786
<212> DNA
<213> 7β-HSDH
<400> 4
atgaatttta gagaaaaata tggacaatgg ggaattgttt taggggcaac agaaggaatt 60
ggtaaagcta gtgcttttga attagctaaa agagggatgg atgttatttt agttggaaga 120
agaaaagaag cattagaaga gttagctaag gcaatacatg aagaaacagg aaaagaaatc 180
agagtattac cacaagattt atctgaatat gatgctgcag aaagattaat agaagcaact 240
aaagatttag atatgggagt cattgagtat gttgcatgtc tacatgcaat gggacaatat 300
aataaagttg actacgctaa atatgaacaa atgtatagag ttaatataag aacattctca 360
aaattattac atcactatat aggtgaattc aaagaaagag atagaggtgc attcataaca 420
ataggatctt tatcaggatg gacatcatta ccattctgtg cagaatatgc agcagaaaaa 480
gcttatatga tgacagtaac agaaggagtt gcttacgaat gtgcaaatac taatgttgac 540
gtaatgcttt tatcagcggg ttcaacaatc acacctactt ggttaaaaaa taaaccatca 600
gatcctaagg cggttgcagc agcaatgtat ccagaagatg ttataaaaga tggatttgaa 660
caattaggaa agaaatttac ttatttagct ggagagttaa atagagaaaa aatgaaggaa 720
aataatgcaa tggatagaaa tgatttaatt gcaaaactag gaaaaatgtt tgatcatatg 780
gcataa 786
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggctctttca ctctccttgc aatcagattt gggtttgttc cctttcagct gaagcttcgt 60
acgc 64
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ttattgctta gcgttggtag cagcagtcaa cttagcttgt tcaacgcata ggccactagt 60
ggatctg 67
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atattttccg accctttgag tactt 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
catagcctgc ttgaatgcaa tac 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tactatattc cttttcggta gcagc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
attacactaa tgcagtttca gggtt 25
<210> 11
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ccctttcttc cttgtttctt tttctgcaca atatttcaag ctataccaag catacaatca 60
actatctcat atacacagct gaagcttcgt acgc 94
<210> 12
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ttatttagaa gtgtcaacaa cgtatctacc aacgatttga cccttttcca tcttttcgta 60
aatttctggc aaggtaggca taggccacta gtggatctg 99
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gcataaccgc tagagtactt tgaag 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
catagcctgc ttgaatgcaa tac 23
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
tactatattc cttttcggta gcagc 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
aagctcaggt aaggggctag tag 23
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gctctagaat gaaaagatta gaaggaaa 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
cgcggatcct tatcttggac agtattct 28
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
cggattcatg aattttagag aaaaata 27
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
cgcggatcct tatgccatat gatcaaaca 29

Claims (8)

1.一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，其特征在于：该重组酵母菌株是以突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C△pdc1△adh1为出发菌株，转入含有7α-HSDH和7β-HSDH基因的重组表达质粒获得的工程菌，其中突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C△pdc1△adh1是酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C经基因敲除技术对酵母的基因PDC1和ADH1进行敲除后得到的，基因PDC1和ADH1核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，其特征在于：所述7α-HSDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述7β-HSDH的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，其特征在于：敲除了乙醇合成途径的关键基因PDC1和ADH1，所述基因敲除技术为Cre-LoxP技术。
4.根据权利要求1所述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，其特征在于：所述重组酵母菌株名称为S.cerevisiae CEN.PK2-1C△pdc1△adh1 7α-HSDH↑7β-HSDH↑。
5.根据权利要求1-4任一所述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)构建含有7α-HSDH和7β-HSDH基因的重组表达质粒：将7α-HSDH和7β-HSDH基因插入穿梭载体pY15TEF1和pYX212中，得到对应的重组表达质粒pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH；
(2)将所述重组表达质粒转化入所述突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C△pdc1△adh1中。
6.根据权利要求5所述的高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于：重组酵母菌株所用培养基为YNB培养基。
7.如权利要求1-4任一所述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株在生产熊去氧胆酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用生产所得的熊去氧胆酸。
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