CN102533808A - 在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组乙醇氧化酶rAOX的表达与纯化的方法。本发明运用分子生物学技术先构建乙醇氧化酶-多聚组氨酸表达载体pPIC9K-AOX-HIS，然后将其线性化后转入毕赤酵母GS115中，从而获得能够表达有活性的重组乙醇氧化酶的毕赤酵母工程菌，且重组乙醇氧化酶可以部分分泌表达。通过对重组乙醇氧化酶表达条件进行优化，该工程菌生产的乙醇氧化酶可达到1862U/L。同时，酶的分泌表达与多聚组氨酸标签的引入简化了重组乙醇氧化酶的纯化工艺。通过测定，该工程菌表达的重组乙醇氧化酶热稳定性较毕赤酵母野生型乙醇氧化酶有很大的提高。本发明的整个过程操作简单，可适合于工业化生产，可带来一定经济效益。

Description

在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法

技术领域

本发明涉及一种重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法。更具体地说，涉及在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法。

背景技术

乙醇氧化酶是甲醇代谢的重要用酶，它可以催化甲醇及其他低级醇类并将其氧化生成其相应的醛类与过氧化氢。乙醇氧化酶的活性形式为一个分子量为600kDa的同源八聚体，并定位于细胞的过氧化物酶体中。乙醇氧化酶的每一个亚基都含有一个黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶。乙醇氧化酶的亚基是在细胞周质中形成，与黄素腺嘌呤二核苷酸结合后进入过氧化物酶体进行八聚体的组装。

乙醇氧化酶可以有效的通过消耗氧气来催化甲醇及其他低级醇类，事实上，很多基于氧电极的乙醇检测器都是利用固定化的乙醇氧化酶作为其主要介质。基于乙醇氧化酶的乙醇生物检测器在发酵，环境及食品工业等方面有重要的应用。该生物检测器存在以下几个优点：(1)对低级醇类的高度亲和，检测精密度高；(2)该酶的活性形式具有高度稳定性，检测寿命长；(3)在发酵工业，环境工程和食品工业方面检测的实用性强。

乙醇氧化酶的商业化应用的两个重要瓶颈因素是酶的大批量生产与酶的纯化工艺。从野生菌毕赤酵母，假丝酵母，汉逊酵母中分离纯化乙醇氧化酶已有报道，但在这些野生菌中，乙醇氧化酶的表达均为胞内表达，胞内表达的酶相较于胞外来说更难纯化，这样会增加乙醇氧化酶的生产成本。仅嗜热子囊菌NBRC31693可以在胞外表达乙醇氧化酶，但其产量很低，仅为133U/L。

从重组表达方面来说，乙醇氧化酶的异源表达已有过报道，例如在酿酒酵母和大肠杆菌中都进行过乙醇氧化酶的重组表达，虽然表达是成功的，但表达的酶却没有活性。其原因主要归结于乙醇氧化酶的活性结构的装配不仅需要黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶，还需要有特殊的装配环境“过氧化物酶体”。

因此，为满足乙醇氧化酶的大量工业化生产及应用，首先需要克服的是乙醇氧化酶的高表达以及其纯化工艺的简化。本发明的目的是提供一种乙醇氧化酶的重组表达与纯化的方法，以期利用该毕赤酵母工程菌大规模的发酵与纯化乙醇氧化酶。

发明内容

针对现有乙醇氧化酶表达及纯化存在的不足之处，本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中重组表达和纯化乙醇氧化酶的方法，利用增加乙醇氧化酶的拷贝数与对发酵条件优化来提高重组乙醇氧化酶的表达量，特别是以麦芽糖为碳源，解除碳源对乙醇氧化酶表达的抑制，使重组乙醇氧化酶的表达量得到提高，且重组乙醇氧化酶可部分分泌到胞外。利用添加的多聚组氨酸融合标签可以达到简化乙醇氧化酶的纯化工艺的目的；另外，多聚组氨酸融合标签的添加提高了重组酶的热稳定性。

该方法通过如下步骤实现的：

1)乙醇氧化酶基因的扩增：根据NCBI上的毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3’，下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3’，在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA；

2)重组表达载体的构建：将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS，将该重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS转化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定；

3)将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中：在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3-5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3-6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时，根据Invitrogen公司的《毕赤酵母表达手册》制备毕赤酵母GS115感受态，取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3μg上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于28-30℃条件下培养2-4天；

上述酵母膏胨葡萄糖培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖，pH7.0；上述最小葡萄糖培养基平板为：13.4g/L无氨基酵母氮源、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂粉；

4)多拷贝转化子的筛选：将最小葡萄糖培养基平板上的转化菌落点在含抗生素G418的酵母膏胨葡萄糖培养基选择平板上，筛选出抗生素G418浓度为2.0-4.0mg/ml的菌株；

5)重组菌株的诱导表达：将步骤4)筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中，在200转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为1∶100，在200转/分钟转速、30℃下培养24小时；在1500-3000转/分钟转速、室温下离心5分钟，收获酵母沉淀，用体积浓度1％-5％甲醇的缓冲复合甲醇培养基或YPM培养基悬浮酵母，使菌体细胞浓度＝1-2，每隔24小时添加体积浓度1％-5％的甲醇，诱导表达48-96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液；

上述缓冲复合甘油培养基为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM(毫摩尔)，pH6.0磷酸钾缓冲液，13.4g/L无氨基酵母氮源，体积浓度1％甘油；上述缓冲复合甲醇培养基为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM，pH6.0磷酸钾缓冲液，13.4g/L无氨基酵母氮源；上述YPM培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10-50g/L碳源，pH5.0-9.0，碳源为葡萄糖，麦芽糖，淀粉，蔗糖或甘露糖；

6)胞外重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33％丙酮在-20℃下沉淀，然后，在4℃、13000转/分钟转速下离心，得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4℃、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，再用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白；

上述的平衡缓冲液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脱液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑；

7)胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬，然后用超声波进行破碎，超声条件：功率300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复60次，超声波破碎的溶液在4℃，13000转/分钟条件下离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱；用5倍柱体积的上样缓冲液平衡凝胶层析柱。然后加入上述洗脱液并使其在柱内平衡，用上样缓冲液对凝胶层析进行洗脱，得到纯化的胞内重组乙醇氧化酶蛋白；

上述的平衡缓冲液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脱液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑；上述的上样缓冲液pH8.0，成分为0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄，500mM NaCl。

本发明的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶AOX的表达与纯化，与现有技术相比有以下优点：

1)本发明成功克隆获得了毕赤酵母完整的乙醇氧化酶的基因序列，并保证表达获得乙醇氧化酶的活力，且重组乙醇氧化酶的比活力与野生型来源的相近。

2)本发明通过聚合酶链式反应技术使乙醇氧化酶基因带上6个组氨酸标签并克隆于pPIC9K质粒载体的EcoR I和Not I位点之间，使重组乙醇氧化酶得以快速纯化，且纯化所得酶纯度高，纯化过程的回收率高。

3)本发明通过对重组菌乙醇氧化酶拷贝数筛选与摇瓶发酵条件的优化，使重组乙醇氧化酶的产量得到提高；特别以麦芽糖为碳源，解除了碳源对乙醇氧化酶表达的抑制，使重组乙醇氧化酶的表达量得到大幅度提高，其总产量最高可以达到1862U/L。

4)此重组乙醇氧化酶可部分分泌表达于胞外，有利于该酶的快速纯化。

5)本发明所得到的重组乙醇氧化酶在50℃下的半衰期为50分钟，相较于毕赤酵母野生型乙醇氧化酶的37℃下的半衰期10分钟有很大的提高。本发明的产品稳定性好，特别适合于检测用途。

附图说明

图1为本发明构建的重组乙醇氧化酶表达质粒pPIC9K-AOX-HIS。

图2a和图2b为重组乙醇氧化酶(rAOX)在毕赤酵母中的表达；其中图2a是SDS-PAGE电泳图谱；图2b是蛋白质印迹图；1-重组酵母胞内蛋白；2-重组酵母胞外蛋白；Marker：蛋白分子量标准。

图3-A、图3-B和图3-C为重组乙醇氧化酶表达的培养条件优化结果图；其中图3-A是YPM培养基碳源优化图；图3-B是YPM培养基碳源添加量优化图；图3-C是YPM培养基初始pH值优化图。

图4-A、图4-B和图4-C为重组乙醇氧化酶表达的诱导条件优化结果图；其中图4-A是诱导时机优化图；图4-B是诱导剂量的优化图；图4-C是诱导时间的优化图。

图5为胞内及胞外的重组乙醇氧化酶rAOX纯化的SDS-PAGE电泳图谱；1-胞外的蛋白；2-经丙酮沉淀后得到的蛋白；3-亲和层析柱未吸附的蛋白；4-纯化的乙醇氧化酶；5-胞内的蛋白；6-亲和层析柱未吸附的蛋白；7-亲和层析柱洗脱的蛋白；8-经凝胶层析纯化得到的乙醇氧化酶；Marker：蛋白分子量标准。

图6为重组乙醇氧化酶的热稳定性图；□表示42℃；△表示50℃；○表示55℃。

具体实施方式

以下通过步骤进一步对本发明进行描述：

步骤1、毕赤酵母基因组提取方法：

1)接种毕赤酵母GS115到5ml酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养基，30℃，培养16～18小时，取1.5ml酵母培养液，室温下，5000转/分钟离心5-10分钟收集菌体；

2)菌体用灭菌水洗1次，5000转/分钟离心5分钟；菌体用200μL TE缓冲液重悬，加入30μL 10mg/ml溶菌酶37℃温浴1小时；加入100μL 2％十二烷基硫酸钠(SDS)混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入150μL 5mol/L，pH8.9的醋酸钾轻轻混匀，然后10000转/分钟离心5分钟；

3)将上清转移到一新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5分钟后12000转/分钟离心10分钟，除去上清，将沉淀溶解在300μLTE缓冲液中，加入6μL 10mg/ml的RNA酶，37℃温浴30分钟；加入饱和酚和氯仿各150μL充分混匀，然后10000转/分钟转速下离心5分钟；

4)转移上清到新的1.5ml离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L，pH7.5的醋酸铵和等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟后12000转/分钟转速下离心10分钟；除去上清，加入300μL 70％乙醇漂洗沉淀一次，10000转/分钟离心5分钟

5)风干除去乙醇，用20μL，pH8.0TE缓冲液溶解酵母DNA

上述TE缓冲液为pH8.010mmol/L的Tris-Hcl和pH8.0，10mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。

步骤2、构建pPIC9K-AOX-HIS工程菌

1)乙醇氧化酶基因的获得：

a)根据购于Invitrogen公司的pPIC9K的多克隆位点序列特点和NCBI数据库上面提供的毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的序列，按照引物设计原则，设计一对引物，用于扩增乙醇氧化酶全长序列，其中在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加6个组氨酸标签基因；

上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3’

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTATTAGATCTAGCAAGACCGGTC-3’

其中，酶切位点用下划线表示，组氨酸标签基因用双下划线表示；

b)利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA：该反应程序如下：预变性94℃，5分钟；变性95℃，30秒；复性58℃，30秒；延伸72℃，2分钟，共30个循环，最后一次反应延伸时间为10分钟。取聚合酶链式反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用购于Qiagen公司的胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的乙醇氧化酶的DNA；

2)构建乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS：

a)将乙醇氧化酶基因用EcoR I和Not I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收乙醇氧化酶基因片段，pPIC9K空质粒同样用这两个酶进行酶切后回收双酶切过的质粒片段；

b)将回收的乙醇氧化酶基因片段和酶切过的质粒片段按浓度比4∶1的比例加入200μl小离心管中，用T4连接酶在16℃下连接过夜；

c)以上连接产物10μl转化200μl CaCl₂法制备的DH5α感受态细胞，然后，加入37℃预热的LURIA-BERTANL培养基1ml后置于37℃摇床，在180转/分钟转速下振荡1小时。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，弃去1ml上清，剩余溶液用移液器轻轻吹打混匀后涂布在含有氨苄霉素和卡那霉素的LURIA-BERTANL平板，并置于37℃培养箱培养12小时以上；

e)随机挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，然后用EcoR I和Not I进行双酶切鉴定，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS；

如图1，此图为将乙醇氧化酶的目的基因定向克隆进同样经EcoRI和Not I双酶切过的毕赤酵母常用表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS。其中的Sac I为线性化位点。具体可参见Invitrogen公司的《毕赤酵母表达手册》(Invitrogen Pichia Expression Kit)。

3)构建生产重组乙醇氧化酶的工程菌：

a)在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3-5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3-6小时，进行重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS的线性化；

b)同时，根据Invitrogen公司的《毕赤酵母表达手册》(Invitrogen PichiaExpression Kit)制备毕赤酵母GS115感受态；

c)取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3μg上述的线性化重组质粒混合，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，用电转仪在1500V，25μF条件下进行电转化；

d)电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后分别取50μl，100μl，150μl，200μl涂于最小葡萄糖培养基(MD)平板上，于28-30℃条件下培养2-4天，观察转化子的生长；

4)筛选多拷贝的乙醇氧化酶工程菌：将最小葡萄糖培养基(MD)平板上的转化菌落点在含有G418浓度为0，0.5，1.0，2.0，和4.0mg/ml的酵母膏胨葡萄糖培养基的选择平板上，筛出G418浓度为2.0-4.0mg/ml的菌株；

步骤3、乙醇氧化酶工程菌的诱导表达

1)将步骤2筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中，在200转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油(BMGY)培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为1∶100，在200转/分钟转速、30℃下培养24小时；

2)在1500-3000转/分钟转速、室温下离心5分钟，收获酵母沉淀，用体积浓度1％-5％甲醇的缓冲复合甲醇(BMMY)培养基或YPM培养基悬浮酵母，使菌体细胞浓度＝1-2，每隔24小时添加体积浓度1％-5％的甲醇，诱导表达48-96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液；

3)并在0，24，36，72，96小时等时间点取500ul发酵液，并用胶浓度为12％SDS-PAGE电泳及蛋白质印迹鉴定分析胞内及胞外的重组表达产物，结果见蛋白电泳图(图2a)与蛋白质印迹图(图2b)；

步骤4、乙醇氧化酶活力的测定

1)乙醇氧化酶活力测定是在0.2ml的反应体系内，反应液中含有2.5％甲醇，6mM 4-氨基安替比林，6mM苯酚，1U过氧化物酶和5uL酶液，反应在25℃下测定，采用酶标仪进行反应的在线测定；

2)该方法主要是通过检测生成的过氧化氢的含量来确定酶的活性，酶活定义为：在25摄氏度下，1分钟生成1μmol过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

步骤5、重组乙醇氧化酶发酵条件优化

在摇瓶发酵环境通过单因素实验设计，改变培养过程中的一个因素，其他因素不变，优化表达重组乙醇氧化酶的基因工程菌发酵条件。重组乙醇氧化酶发酵条件优化的因素包括YPM培养基的碳源，YPM培养基的碳源添加量，YPM培养基初始pH值，诱导过程的诱导时机，诱导剂甲醇的体积浓度和诱导时间；

1)YPM培养基碳源的优化：在250ml的摇瓶中配置30ml的YPM培养基，其中的碳源用20g/L的葡萄糖，麦芽糖，淀粉，蔗糖，甘露糖，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳碳源，结果见图3-A；从图上可以看出，分别以20g/L的葡萄糖，麦芽糖，淀粉，蔗糖，甘露糖为碳源来培养毕赤酵母工程菌，其中麦芽糖为其最适碳源，因为以麦芽糖为碳源所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

2)YPM培养基的碳源添加量的优化：在250ml的摇瓶中配置30ml的YPM培养基，其中的碳源用麦芽糖，麦芽糖的添加量分别为10，20，30，40，50g/L，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳碳源添加量，结果见图3-B；从图上可以看出，分别以10，20，30，40，50g/L的麦芽糖为碳源来培养毕赤酵母工程菌，其中麦芽糖的添加量为50g/L时，毕赤酵母工程菌所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

3)YPM培养基初始pH值的优化：在250ml的摇瓶中配置30ml初始pH值在4.0-9.0的YPM培养基，其中的碳源用50g/L麦芽糖，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳培养基初始pH值，结果见图3-C；从图上可以看出，毕赤酵母工程菌的培养基初始pH值在4.0-9.0之间，其中当培养基初始pH值为8.0时，毕赤酵母工程菌所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

4)诱导时机的优化：先做出重组毕赤酵母在初始pH值为8.0的YPM培养基，其中的碳源用50g/L麦芽糖下的生长曲线，在重组毕赤酵母菌体生长的不同时期包括菌体细胞浓度0.5，1.0，2.0，4.0和6.0下用1％-5％甲醇诱导48-96小时，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳诱导时机，结果见图4-A；从图上可以看出，在菌体细胞浓度0.5，1.0，2.0，4.0和6.0下对毕赤酵母工程菌进行甲醇诱导，当菌体细胞浓度为1.0时，毕赤酵母工程菌所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

5)诱导剂甲醇的体积浓度的优化：重组毕赤酵母在初始pH值为8.0的YPM培养基，其中的碳源用50g/L麦芽糖下生长到菌体细胞浓度1.0时，分别用体积浓度1％，2％，3％，4％和5％的甲醇诱导48-96小时，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳诱导剂甲醇的体积浓度，结果见图4-B；从图上可以看出，分别用体积浓度1％，2％，3％，4％和5％的甲醇对毕赤酵母工程菌进行诱导，当诱导的甲醇体积浓度为4％时，毕赤酵母工程菌所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

6)诱导时间的优化：重组毕赤酵母在初始pH值为8.0的YPM培养基，其中的碳源用50g/L麦芽糖下生长到菌体细胞浓度1.0时，用体积浓度4％甲醇进行诱导，诱导至乙醇氧化酶表达量下降为止，诱导期间，每隔5小时取一次样，通过酶活测定来分析重组乙醇氧化酶在胞内外的表达情况，确定最佳诱导时间，见图4-C；从图上可以看出，用体积浓度4％的甲醇对毕赤酵母工程菌诱导15-65h，当诱导时间为55小时时，毕赤酵母工程菌所表达的重组乙醇氧化酶产量最高。

另外，实验结果表明，优化过程中胞外部分的重组乙醇氧化酶均占总重组乙醇氧化酶的30％左右；

经过重组毕赤酵母的表达条件优化，得到最佳的培养基条件为：YPM培养基中的碳源用50g/L的麦芽糖来替代，培养基初始pH为8.0。最适的诱导条件为：在菌体长到菌体细胞浓度1.0时进行诱导，诱导剂甲醇的体积浓度为4％，诱导时间为55小时。在此发酵条件下胞内表达的酶活性总和为1300U/L，胞外表达的酶活性总和为562U/L。相较于野生菌所表达的乙醇氧化酶来说，该表达方式的优点在于可部分分泌表达，且表达量相对较高。

步骤6、重组AOX的纯化

1)胞外重组AOX的纯化：

a)将上述步骤5所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33％丙酮在-20℃下沉淀，然后，在4℃、13000转/分钟转速下离心；

b)得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4℃、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；

c)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱；

d)用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白；

e)用胶浓度为12％SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果见图5的1-4列；

上述的平衡缓冲液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脱液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑；

2)胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：

a)将上述步骤5中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬；

b)重悬后菌液用超声波进行破碎，超声条件：超生功率300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复60次，在4℃，13000转/分钟条件下离心；

c)取上清用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱后用洗脱液洗脱；

d)用5倍柱体积的上样缓冲液平衡凝胶层析柱，然后加入上述洗脱液并使其在柱内平衡，用上样缓冲液进行洗脱，得到纯化的胞内重组乙醇氧化酶蛋白；

e)用胶浓度为12％SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果见图5的5-8列；

上述的平衡缓冲液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脱液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑；上述的上样缓冲液pH8.0，成分为0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄，500mM NaCl。

经分析表明，纯化的重组乙醇氧化酶的纯度可以达到90％以上。通过计算可以得到，蛋白的总回收率为68.9％，比从野生菌中纯化该蛋白的回收率高得多。总蛋白的比活力为12.2U/mg蛋白，与野生菌来源的该酶的比活力相近。

步骤7、重组乙醇氧化酶热稳定性测定

1)将上述纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白以及胞内重组乙醇氧化酶蛋白取三份，分别在42℃，50℃，55℃的温度下保温1小时，每隔5分钟取3-5μl酶液进行残余的酶活力测定。

2)热稳定性分析结果见图6，该重组乙醇氧化酶在50℃下的半衰期为50分钟，而野生型来源的乙醇氧化酶在37℃下的半衰期为10分钟，相比而言，本重组乙醇氧化酶的热稳定性有很大的提高。

Claims (8)

1.在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)乙醇氧化酶基因的扩增：根据毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3’，下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3，在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA；

2)重组表达载体的构建：将目的基因定向克隆进同样经EcoRI和Not I双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS，将该重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS转化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定；

3)将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中：在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3-5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3-6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时制备毕赤酵母GS115感受态，取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3μg上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于28-30℃条件下培养2-4天；

4)多拷贝转化子的筛选：将最小葡萄糖培养基平板上的转化菌落点在含抗生素G418的酵母膏胨葡萄糖培养基选择平板上，筛选出抗生素G418浓度为2.0-4.0mg/ml的菌株；

5)重组菌株的诱导表达：将步骤4)筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中，在200转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为l∶100，在200转/分钟转速、30℃下培养24小时；在1500-3000转/分钟转速、室温下离心5分钟，收获酵母沉淀，用体积浓度1％-5％甲醇的缓冲复合甲醇培养基或YPM培养基悬浮酵母，使菌体细胞浓度＝1-2，每隔24小时添加体积浓度1％-5％的甲醇，诱导表达48-96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液；

6)胞外重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33％丙酮在-20℃下沉淀，然后，在4℃、13000转/分钟转速下离心，得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4℃、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，再用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白；

7)胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬，然后用超声波进行破碎，超声波破碎的溶液离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱；用5倍柱体积的上样缓冲液平衡凝胶层析柱，然后加入上述洗脱液并使其在柱内平衡，用上样缓冲液对凝胶层析进行洗脱，得到纯化的胞内重组乙醇氧化酶蛋白。

2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤3)中所述酵母膏胨葡萄糖培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖，pH7.0；所述最小葡萄糖培养基平板为：13.4g/L无氨基酵母氮源、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂粉。

3.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤5)中所述缓冲复合甘油培养基为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM，pH6.0磷酸钾缓冲液，13.4g/L无氨基酵母氮源，体积浓度1％甘油；所述缓冲复合甲醇培养基为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM，pH6.0磷酸钾缓冲液，13.4g/L无氨基酵母氮源；步骤5)和步骤6)中所述YPM培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10-50g/L碳源，pH5.0-9.0，碳源为葡萄糖，麦芽糖，淀粉，蔗糖或甘露糖。

4.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤6)和步骤7)中所述的平衡缓冲液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，所述的洗脱液pH8.0，其成分为20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑。

5.根据权利要求4所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤7)中所述的上样缓冲液pH8.0，成分为0.1MKH₂PO₄-K₂HPO₄，500mM NaCl。

6.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤7)中超声波破碎的超声条件为：功率300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复60次。

7.根据权利要求6所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤7)中超声波破碎溶液的在4℃，13000转/分钟条件下离心。

8.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，对步骤6)和步骤7)纯化所得的重组乙醇氧化酶重组乙醇氧化酶热稳定性测定：将纯化所得的重组乙醇氧化酶取三份，分别在42℃，50℃，55℃的温度下保温1小时，每隔5分钟取3-5μl酶液进行残余的酶活力测定。

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