CN105368884A - 一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用，属于发酵工程技术领域。本发明通过在光滑球拟酵母菌株中定位表达线粒体丙酮酸载体蛋白于细胞膜上，加强丙酮酸出细胞的速率和缓解丙酮酸对糖酵解途径关键酶的反馈抑制作用，进而提高丙酮酸的产量和生产强度，通过基因工程技术，将来源于酿酒酵母的MPC1和信号肽序列Shrew1p定位整合到pY26表达载体上，构建酵母重组表达质粒pY26-Shrew1p-MPC1，并将其电转进受体菌TgU-中获得一株一株高产丙酮酸的工程菌株TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)，相对于对照菌株TgU^-(pY26)，工程菌TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度相对于对照菌(TgU^-(pY26))分别提高了58.3％、68.1％、154.4％和152.6％。

Description

一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如：是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非常重要的酮酸之一。由于丙酮酸是多种物质的合成前体，目前社会对丙酮酸的需求量日益增加，其广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。

丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有酒石酸法、乳酸乙酷空气氧化法、经基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酮酸的生产正在以前的化工合成转向通过微生物发酵制备。微生物发酵法相对于化工合成有更多的优点，如原料的转化率高，污染小，成本低等优点。

目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。目前对高产丙酮酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶进行过表达和一些旁路途径进行敲出。

目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。目前对高产丙酮酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶进行过表达和一些旁路途径进行敲出。对通过怎么去加强丙酮酸出细胞的研究，则鲜有文献报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过定位表达线粒体丙酮酸载体于细胞膜上，加强丙酮酸出细胞的速率而缓解丙酮酸对糖酵解途径中关键酶的抑制作用，从而提高丙酮酸发酵产量和发酵强度。

本发明的第一个目的是提供一种产丙酮酸重组菌，所述重组菌过表达线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1基因，所述MPC1基因连接有序列为SEQIDNO.1的信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是NCBI上GeneID:852800的MPC1。

所述重组菌是以缺失了Ura基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，表达连接有信号肽的NCBI上GeneID:852800的MPC1。

在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是以酿酒酵母菌株N85基因组为模板扩增得到的。

所述过表达是以酵母表达质粒pY26(购自德而宝公司)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽和MPC1基因通过BamHI酶切位点连接。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCCM202019为宿主、pY26为载体表达连接有信号肽的NCBI上GeneID:852800的MPC1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建：

(1)将目的片段MPC1经过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，并将MPC1定向克隆到表达质粒pY26中，得到重组酵母表达质粒pY26-MPC1；

(2)将序列为SEQIDNO.1的信号肽Shrew1p用BamHI和XmaI双酶切消化后连接到被BamHI和XmaI双酶切消化的pY26-MPC1上将，得到重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1；

(3)重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1电转化受体菌T.glabrataCCTCCM202019(TgU^-)，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到重组菌TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母表达质粒pY26为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为amp^r，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。

本发明的第二个目的是一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，是在丙酮酸生产菌株中过表达连接有序列如SEQIDNO.1的信号肽的线粒体丙酮酸载体蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是表达NCBI上GeneID:852800的线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1。

本发明的第三个目的是提供所述重组菌在发酵生产丙酮酸方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基1L中含有：葡萄糖120g，尿素3.86g，MgSO₄.7H₂O0.8g，KH₂PO₄2g，CH₃COONa3g，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5；所述微量元素液：MnCl₂·4H₂O12g，FeSO₄·7H₂O2g，CaCl₂·2H₂O2g，CuSO₄·5H₂O0.05g，ZnCl₂0.5g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L；所述维生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

在本发明的一种实施方式中，所述接种的接种量为10％。

本发明还要求保护所述重组菌生产的丙酮酸在日化、食品、制备药物、农业领域的应用。

有益效果：

本发明方法可提高丙酮酸产量和生产强度的；由于胞内高浓度的丙酮酸对糖酵解途径中的关键酶存在反馈抑制作用，本发明通过定位表达线粒体丙酮酸载体蛋白于细胞膜上，加强丙酮酸出细胞的速率，缓解丙酮酸的反馈抑制作用，来达到提高丙酮酸发酵的生产强度和产量。相对于对照菌株(TgU^-(pY26))，本发明构建的重组菌株TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度分别提高了58.3％、68.1％、154.4％和152.6％。

具体实施方式

菌株和质粒：光滑球拟酵母(T.glabrataCCTCCM202019，TgU^-)其为烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶5种营养缺陷型菌株(即在T.glabrataCCTCCM202019的基础上敲除了Ura基因)，已进行保藏。酵母表达质粒pY26为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为amp^r，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。

细胞干重的测定：取一定量的菌悬液于10mL容量瓶中，加入2mL盐酸(2mol/L)溶解悬液中的碳酸钙，加去离子水定容到10mL，充分混匀，用UV7500型可见光分光光度计，于660nm处测定OD值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。

丙酮酸和葡萄糖的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：AminexHPX-87Hionexchangecolumn，流动相：5mMH₂SO₄，流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样量：10μL，紫外检测器波长：210nm(检测丙酮酸)，示差折光检测器：检测葡萄糖，样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。

培养基：种子培养基(g/L)：葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，固体培养基添加20g琼脂。115℃灭菌15min。发酵培养基(g/L)：葡萄糖120g，尿素3.86g，MgSO₄.7H2O0.8g，KH₂PO₄2g，CH₃COONa3g，微量元素液(过滤除菌)10ml，维生素液(过滤除菌)10ml，于115℃下灭菌15min。40g/L的碳酸钙(单独灭菌)被添加用来调节pH。微量元素液：MnCl₂·4H₂O12g，FeSO₄·7H₂O2g，CaCl₂·2H₂O2g，CuSO₄·5H₂O0.05g，ZnCl₂0.5g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。维生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

实施例1：酿酒酵母MPC1的扩增，信号肽Shrew1p的密码子优化合成与表达质粒的构建

以酿酒酵母基因组为模板，PCR扩增得到目的基因MPC1片段，通过琼脂糖凝胶电泳得到约400bp的特异片段，目的基因MPC1经过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，浓缩纯化，将MPC1基因定向克隆到表达质粒pY26中，得到重组酵母表达质粒pY26-MPC1，将上述重组表达质粒转化到感受态细胞JM109并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上进行扩增。

对来自果蝇细胞的信号肽序列，经过适的密码子优化后与人工合成所得序列如SEQIDNO.1的Shrew1p，经过BamHI和XmaI双酶切消化，浓缩纯化，与经过BamHI和XmaI双酶切消化并浓缩纯化后的重组酵母表达质粒pY26-MPC1在T4-连接酶的作用下进行连接反应，得到酵母重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1。将上述重组表达质粒转化到感受态细胞JM109并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上进行扩增。

实施例2：重组菌的构建与鉴定

由于上述重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1上带有Ura3基因，将重组酵母质粒pY26-Shrew1p-MPC1)电击转化到受体菌TgU^-(即缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCCM202019)，得到在不加尿嘧啶的基础培养基上正常生长的重组菌TgU^--pY26-Shrew1p-MPC1。

实施例3：重组菌与对照菌对照发酵实验

挑取重组菌TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)和含有空质粒pY26的TgU^-的单菌落于种子培养基上活化培养18-24h，以10％的接种量，将上述活化培养好的种子液接种到发酵培养基中，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养。发酵结果如表1所示，重组菌的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度相对于对照菌(TgU^-(pY26))分别提高了58.3％、68.1％、154.4％和152.6％。同时，与对照菌TgU^-(pY26-MPC1)(不含有Shrew1p信号肽)相比，本发明的重组菌的葡萄糖消耗速率、丙酮酸生产强度分别提高了42％、20％。

表1重组菌TgU^-(pY26-Shrew1p-MPC1)与对照菌TgU^-(pY26)的发酵对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种产丙酮酸重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1基因，所述MPC1基因连接有序列为SEQIDNO.1的信号肽。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以缺失了Ura基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，表达连接有信号肽的NCBI上GeneID:852800的MPC1。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述过表达是以酵母表达质粒pY26为载体。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建：(1)将目的片段MPC1经过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，并将MPC1定向克隆到表达质粒pY26中，得到重组酵母表达质粒pY26-MPC1；(2)将序列为SEQIDNO.1的信号肽Shrew1p用BamHI和XmaI双酶切消化后连接到被BamHI和XmaI双酶切消化的pY26-MPC1上，得到重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1；(3)重组质粒pY26-Shrew1p-MPC1电转化尿嘧啶营养缺陷型受体菌，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到重组菌TgU^--pY26-Shrew1p-MPC1。

5.一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，其特征在于，所述方法是在丙酮酸生产菌株中过表达连接有序列如SEQIDNO.1的信号肽的线粒体丙酮酸载体蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是表达NCBI上GeneID:852800的线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1。

7.权利要求1-4任一所述重组菌在发酵生产丙酮酸方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基1L中含有：葡萄糖120g，尿素3.86g，MgSO₄.7H₂O0.8g，KH₂PO₄2g，CH₃COONa3g，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5；所述微量元素液：MnCl₂·4H₂O12g，FeSO₄·7H₂O2g，CaCl₂·2H₂O2g，CuSO₄·5H₂O0.05g，ZnCl₂0.5g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L；所述维生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

10.权利要求1-4任一所述重组菌生产的丙酮酸在日化、食品、制备药物、农业领域的应用。