CN102071154B

CN102071154B - 一种产α-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN102071154B
Application number: CN 201010578594
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 殷晓霞; 周景文; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: CN102071154A

Abstract

本发明公开了一种产a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明采用分子手段，将来源于小鼠中编码ATP-柠檬酸裂解酶ACL基因过量表达于发酵法生产a-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolyticaWSH-Z06中，获得了一株ATP-柠檬酸裂解酶活性提高的酵母工程菌Y.lipolyticaACL。与出发菌株相比：本发明提供的基因工程菌能以甘油为唯一碳源，在胞内积累0.89mM/gDCW的乙酰辅酶A，ACL活性提高了7.5倍（3.56U/mgprotein）；a-酮戊二酸产量达到45.3g/L，是出发菌株的1.29倍；丙酮酸产量降低到17.2g/L，是出发菌株的68.8%，具有广阔的应用前景。

Description

一种产α-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法，尤其是一种通过过量表达ATP-柠檬酸裂解酶基因以生产a-酮戊二酸的工程菌，属于遗传工程领域。

背景技术

a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)，又称a-胶酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸。分子式为C₅H₆O₅, 相对分子量为146.1，a-KG为白色或类白色的结晶或结晶性粉末，无色，易溶于水。a-KG在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。a-KG在食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中都有着广泛应用。

辅因子工程所涉及到的辅因子主要有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺、辅酶A及其衍生物、维生素和微量元素。目前研究主要集中在调节ATP/ADP/AMP、NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺和辅酶A及其衍生物等辅因子在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。然而，对辅酶A如何影响工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布的研究则鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产a-酮戊二酸酵母工程菌。

所述工程菌过量表达ATP-柠檬酸裂解酶基因。

所述ATP-柠檬酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述ATP-柠檬酸裂解酶基因克隆于载体pINA1269。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种产a-酮戊二酸酵母工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1）根据小鼠ATP-柠檬酸裂解酶基因序列设计引物克隆ACL基因；

2）利用In-Fusion PCR技术将ACL基因与载体连接得到重组表达载体；

3）将得到的重组表达载体转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)后得到酵母工程菌。

以下是本发明技术方案的详细描述。

目的基因ACL扩增与表达质粒的构建：

以带有ACL基因的质粒为模板，PCR扩增得到ACL目的片段（大小约为3500bp）。利用In-Fusion PCR技术将ACL基因与经Pml I和BamH I酶切后的质粒pINA1269连接，得到ACL基因表达载体pINA1269-ACL。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) WSH-Z06 △leu2菌株的构建：

本发明的出发菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06是由本实验的周海岩等人在2007年筛选出来的，现保藏与中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M20714，专利号为CN 101215529A。

根据NCBI网站上Y. lipolytica的LEU2基因序列，设计两对引物（L1,L2和R1,R2）分别扩增LEU2基因上下游约1000bp的片段。另外，以pUG66质粒为模板，PCR扩增两端带有loxP序列的Ble基因片段(大小约为1000 bp)，利用三个片段之间的同源序列进行融合PCR后与pMD18-T simple vector（Takara）连接，得到重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109，挑取能在Amp平板上生长的菌落以L1和R2为引物进行菌落PCR鉴定，得到大约为3000bp大小的条带。菌落PCR验证正确的转化子提取质粒，以质粒上的通用引物进行测序，测序结果与预期一致，表明融合片段构建正确。质粒经BamH I酶切，胶回收大小约为3000bp的片段，得到LEU2基因敲除框，醋酸锂法转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞。将能在Zeocin平板上生长的菌落，提取全基因组作为模板，L1和R2为引物PCR扩增得到约3000bp大小的片段，表明该转化子为亮氨酸营养缺陷型菌株。将质粒pUB4-CRE醋酸锂法转化亮氨酸营养缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生长的菌落，分别连续点种与YPD、YPD+Hyg和YPD+Zeocin平板上。由于pUB4-CRE质粒表达的CRE能通过Cre-loxP系统将Ble基因从酵母基因组上剪除，而pUB4-CRE质粒本身不稳定，在转接若干代后会自动消除。因此，转接后能在YPD平板上生长，而不能在YPD+Hyg和YPD+Zeocin平板上生长的菌落即为不带Ble抗性的亮氨酸营养缺陷型菌株Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2。

过量表达ACL的Y. lipolytica酵母工程菌的筛选：

将重组质粒pINA1269-ACL经Not I酶切，纯化后，醋酸锂法转化Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2感受态细胞。将能在MM平板上生长的菌落，在MM平板上连续转接三代，得到遗传稳定的酵母工程子。挑取阳性酵母工程子若干提基因组，利用引物ACL-F和ACL-R进行PCR验证，得到大约3500bp的片段，表明ACL基因已成功整合到Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2基因组中。所得酵母工程菌命名为Y. lipolytica ACL。该菌在以甘油为碳源的培养基上生长时，ACL酶活为3.56 U/mg protein，是出发菌株的7.5倍。

微生物菌株的种子培养与发酵：

种子培养基(g/L)：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂20 g(斜面用)，pH 5.5，自来水定容至1 L。

发酵培养基(g/L)：甘油100 g，硫酸铵3 g，磷酸二氢钾3 g，七水硫酸镁1.2 g，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.1 g，盐酸硫胺 0.2 mg，碳酸钙20 g(摇瓶时添加)，自来水定容至1L。

种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121 ℃，15 min。维生素等热敏性材料配制后0.22 mm 膜过滤除菌，接种前加入。

将实验菌株接种到种子培养基中，500 ml 摇瓶装液50 ml，于28℃，200 rpm 条件下培养20-24 h。

按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200 rpm 条件下培养144 h。

细胞干重的测定：10 mL容量瓶中，加2 mL 盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10 mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于570 nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。

甘油、丙酮酸和a-KG 浓度的测定：高效液相色谱（HPLC）

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪（配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站），色谱条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column

流动相：5mM H₂SO₄

流速：0.6 mL/min

柱温：35 ℃

进样量：5 μL

紫外检测器波长： 210 nm（检测丙酮酸和a-KG）

示差折光检测器：检测甘油

样品制备：500 μL 发酵液在10000 rpm 下离心10 min，取上清液移入1.5 mL离心管中测甘油、丙酮酸和a-KG的含量。取100 μL 上清液移入5 mL 容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经 0.45 μm 滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。

本发明通过过量表达ATP-柠檬酸裂解酶基因，改变胞内辅因子之一—乙酰辅酶A的存在形式和浓度，提供了一种辅因子调控碳代谢流实现a-酮戊二酸(a-KG)过量积累的方法。与出发菌株相比：本发明提供的基因工程菌能以甘油为唯一碳源，在胞内积累0.89 mM/ g DCW的乙酰辅酶A，ACL活性提高了7.5倍（3.56 U/mg protein）；在发酵144 h后，a-酮戊二酸产量达到45.3 g/L，是出发菌株的1.29倍；丙酮酸产量降低到17.2 g/L，是出发菌株的68.8%，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例1解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) WSH-Z06 △leu2菌株的构建与鉴定

根据NCBI网站上Y. lipolytica的LEU2基因序列（GenBank: M27209.1），设计两对引物（L1,L2和R1,R2，见表1）分别扩增LEU2基因上下游约1000bp的片段。另外，以pUG66质粒为模板，Ble-F和Ble-R为引物（见表1），PCR扩增两端带有loxP序列的Ble基因片段，利用三个片段之间的同源序列进行融合PCR后与pMD18-T simple vector连接，得到重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109，挑取能在Amp平板上生长的菌落以L1和R2为引物进行菌落PCR鉴定，得到大约为3000bp大小的条带。菌落PCR验证正确的转化子提取质粒，以质粒上的通用引物进行测序，测序结果与预期一致，表明融合片段构建正确。质粒经BamHI酶切，胶回收大小约为3000bp的片段，得到LEU2基因敲除框，醋酸锂法转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞。将能在Ble平板上生长的菌落，提取全基因组作为模板，L1和R2为引物PCR扩增得到约3000bp大小的片段，表明该转化子为亮氨酸营养缺陷型菌株。将质粒pUB4-CRE醋酸锂法转化亮氨酸营养缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生长的菌落，分别连续点种与YPD、YPD+Hyg和YPD+Ble平板上。由于pUB4-CRE质粒表达的CRE能通过Cre-loxP系统将Ble基因从酵母基因组上剪除，而pUB4-CRE质粒本身不稳定，在转接若干代后会自动消除。因此，转接后能在YPD平板上生长，而不能在YPD+Hyg和YPD+Ble平板上生长的菌落即为不带Ble抗性的亮氨酸营养缺陷型菌株Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2。

其中：

YPD培养基（g/L）

葡萄糖 20 g，Tryptone 20 g，Yeast extract 10 g，固体培养基添加20 g琼脂。

Hyg抗性平板（g/L）

YPD+100mg潮霉素，固体培养基添加20 g琼脂。

Zeocin抗性平板（g/L）

YPD+100mg博莱霉素，固体培养基添加20 g琼脂。

质粒pUB4-CRE由法国农业生物技术中心的Catherine Madzak教授所赠 (Fickers et al., 2003)，质粒pUG66本实验保藏(GenBank: AF298794.1)。

Fickers, P., Le Dall, M.T., Gaillardin, C., Thonart, P., and Nicaud, J.M. (2003). New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55, 727-737.

引物名称	序列（5’端→3’端）
		L1	GGATCCATGCATTGCTTATTACGAAGACTACCCGTTGCTAT
L2	ATACATTATACGAAGTTATGAAGTCGCCGCCGAGAAGAACAATC
		R1	TGTATGCTATACGAAGTTATGACTTGTTGCCAACAAGGTCAAGGA
R2	GGATCCAATTCATGTCACACAAACCGATCTTCGCCTCAAGG
		Ble-F	TTCTTCTCGGCGGCGACTTC ATAACTTCGTATAATGTATGCTAT
Ble-R	CAACGGTTGTTCCAGTTCCTATAACTTCGTATAGCATACATTATA
		ACL-F	ACCACACACATCCACATGTCAGCCAAGGCAATTTCAGAGC
ACL-R	TTCCGTAGTTGGATCCTACATGCTCATGTGTTCTGGAAGAAC

表1 本发明中所用到的引物序列

实施例2酵母工程菌的构建及鉴定

以小鼠的cDNA为模板， ACL-F和ACL-R（见表1）为引物，PCR扩增得到ACL目的片段（大小约为3500bp）。利用In-Fusion PCR技术将ACL基因与经Pml I和BamH I酶切后的质粒pINA1269连接，得到ACL基因表达载体pINA1269-ACL，构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将重组质粒pINA1269-ACL经Not I酶切，纯化后，醋酸锂法转化Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2感受态细胞。将能在MM平板上生长的菌落，在MM平板上连续转接三代，得到遗传稳定的酵母工程子。挑取阳性酵母工程子若干提基因组，利用引物ACL-F和ACL-R进行PCR验证，得到大约3500bp的片段，表明ACL基因已成功整合到Y. lipolytica WSH-Z06 △leu2基因组中。所得酵母工程菌命名为Y. lipolytica ACL。该菌在以甘油为唯一碳源的培养基上生长时，能在胞内积累0.89 mM/ g DCW的乙酰辅酶A，ACL活性达到3.56 U/mg protein，是出发菌株的7.5倍。

其中：

基本培养基MM（g/L）

葡萄糖 20 g，Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and ammonium sulfate 1.7 g，硫酸铵 5 g，固体培养基添加 20 g琼脂。

质粒pINA1269由法国农业生物技术中心的Catherine Madzak教授所赠（Madzak et al., 2004）。

Madzak, C., Gaillardin, C., and Beckerich, J.M. (2004). Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol 109, 63-81.

实施例3发酵生产

将基因工程菌及出发菌株接种到种子培养基中，500 ml 摇瓶装液50 ml，于28℃，200 rpm 条件下培养20-24 h。按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200 rpm 条件下培养144 h。

发酵144 h后，酵母工程菌和出发菌比较：(1)出发菌中a-KG产量为35.2 g/L，酵母工程菌中a-KG产量可达45.3g/L，是出发菌的1.29倍；(2)出发菌中丙酮酸含量为25.0 g/L，而酵母工程菌中丙酮酸含量为17.2 g/L，副产物大量减少。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂20 g(斜面用)，pH5.5，自来水定容至1 L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种产a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3276

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

atgtcagcca aggcaatttc agagcagacc ggcaaagaac tcctgtacaa gtacatctgc 60

accacctcgg ccatccagaa ccggttcaag tacgcccggg tgactcccga cacagactgg 120

gcccatctgc tgcaggacca cccgtggctg ctcagccaga gcttggttgt caagccagac 180

cagttaatca aacgtcgagg aaagcttggc ctcgtcgggg tcaatctctc tctggatgga 240

gtcaaatcct ggctaaaacc tcgcctggga catgaagcca ctgtcggcaa ggccaaaggc 300

ttcctcaaga actttctcat tgaacccttc gtcccccaca gtcaggcgga ggagttctac 360

gtgtgcatct atgctacccg ggaaggagac tacgtcctgt tccaccatga agggggtgtg 420

gatgtgggcg atgtggatgc caaagcccag aagctgcttg tgggtgtgga cgaaaagctg 480

aataccgagg acattaagag acacctgttg gtccatgcac ctgaggacaa gaaagaagtc 540

ctggccagct tcatctctgg tctattcaat ttctacgagg atctgtactt cacctacctt 600

gagatcaacc cccttgtggt gaccaaagat ggtgtctaca tccttgactt ggcggccaag 660

gtggatgcca cagctgacta catctgtaaa gtcaagtggg gtgatataga gttccctccc 720

ccctttgggc gtgaggcgta ccccgaggaa gcctacattg cagacctgga tgccaaaagt 780

ggagcaagct tgaagctgac cttgctgaac cccaaggggc ggatctggac catggttgct 840

gggggtggcg cctccgtcgt gtacagtgac accatctgtg atcttggagg tgtcaatgaa 900

ctggcgaatt acggggaata ctcgggtgcc cccagtgaac aacagaccta tgactatgcc 960

aagaccatcc tctcacttat gactcgagag aagcacccag aaggcaagat cctcatcatt 1020

ggaggcagca ttgcaaactt caccaatgtg gccgccacct tcaagggcat tgtgagagcg 1080

attcgagatt accagggtcc cctgaaggag catgaggtca ccatctttgt ccgaagaggt 1140

ggccccaact atcaagaggg attacgagtg atgggagaag ttgggaagac cactgggatc 1200

cccatccatg tctttggcac agaaactcac atgacggcca ttgtgggcat ggccctgggc 1260

caccggccca ttcccaacca gccacccaca gcagctcaca ctgccaactt cctccttaat 1320

gccagcggga gcacatcgac tccagcaccc agtaggacag catctttttc tgagtcccga 1380

gctgatgaag tggcacctgc aaagaaagcc aagccagcta tgccccaagg aaagagtgcc 1440

accctcttca gccgacatac caaggccatc gtgtggggca tgcagacccg ggctgtgcag 1500

ggcatgctgg actttgacta cgtgtgttcc cgagacgagc cctcagtggc tgccatggtc 1560

taccctttca ctggggatca caagcagaag ttttactggg gacacaagga aatcctgatc 1620

cctgtcttca agaacatggc tgacgccatg aagaagcacc cggaggtaga cgtgctgatc 1680

aactttgcgt ctctgcggtc cgcttacgac agcaccatgg agaccatgaa ctatgcccag 1740

atccgcacca tagccatcat agcagaaggt atccctgagg ccctcacacg gaagctcatc 1800

aagaaggccg accagaaggg agtgaccatc attgggccag ctacggttgg gggcattaag 1860

cctggatgct ttaagatcgg gaatactggt ggaatgctgg acaacatcct ggcctccaaa 1920

ctgtaccgcc caggcagcgt ggcctacgtc tcacgttcag gaggcatgtc taatgaactc 1980

aataacatca tctctcggac cacagatggt gtctatgagg gcgtggccat cggcggggac 2040

aggtaccctg ggtccacatt catggatcac gtgctgcgct accaggacac tccaggagtc 2100

aagatgatcg tagttcttgg ggagataggg ggcacagagg aatataagat ctgccggggc 2160

atcaaggagg gccgcctcac caagccagtg gtctgctggt gtatcgggac ctgtgccacc 2220

atgttctcct ccgaggtcca gtttggccat gctggagctt gtgccaacca ggcttctgaa 2280

actgcagtag ccaagaacca ggccttgaag gaagcaggag tgtttgtgcc ccgaagcttc 2340

gatgagcttg gagaaatcat tcagtctgtg tatgaagatc tggtggccaa aggagccatt 2400

gtacctgccc aggaagtgcc acctccaaca gtgcccatgg actactcttg ggccagagag 2460

ctgggtttga tccgaaaacc tgcctcattc atgaccagca tctgtgatga gcgagggcag 2520

gagctcattt atgcgggcat gcccatcacc gaggtcttca aggaggagat gggcatcggt 2580

ggtgtcctcg gcctcctctg gttccagaga aggttgccca agtattcctg ccagttcatt 2640

gagatgtgtc tgatggtcac agctgatcac gggccagctg tctctggagc ccataacacc 2700

atcatctgtg ctcgggctgg gaaggacctg gtctccagcc tcacctcagg gctgctcacc 2760

attggagacc ggtttggggg tgccttggat gccgcagcaa agatgttcag taaagccttt 2820

gacagcggca tcattcccat ggagttcgtc aacaagatga agaaggaggg gaagctgatc 2880

atgggcatcg gccatcgagt aaaatcgata aacaacccag acatgcgagt gcagatcctc 2940

aaggacttcg tcaaacagca cttccccgcc accccgctgc tcgactatgc cctggaagtg 3000

gagaagatta ccacctccaa gaagccaaat cttatcctga atgtggacgg cttcatcggc 3060

gttgcgtttg tggacatgct caggaactgt ggctccttca cccgggagga agctgatgaa 3120

tatgttgaca ttggagccct caatggcatc tttgtgctag gaaggagtat gggcttcatt 3180

gggcactacc ttgaccagaa gaggctgaag caagggctgt atcgtcaccc ctgggatgac 3240

atttcctatg ttcttccaga acacatgagc atgtag 3276

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 2

ggatccatgc attgcttatt acgaagacta cccgttgcta t 41

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 3

atacattata cgaagttatg aagtcgccgc cgagaagaac aatc 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 4

tgtatgctat acgaagttat gacttgttgc caacaaggtc aagga 45

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 5

ggatccaatt catgtcacac aaaccgatct tcgcctcaag g 41

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 6

ttcttctcgg cggcgacttc ataacttcgt ataatgtatg ctat 44

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 7

caacggttgt tccagttcct ataacttcgt atagcataca ttata 45

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 8

accacacaca tccacatgtc agccaaggca atttcagagc 40

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 9

ttccgtagtt ggatcctaca tgctcatgtg ttctggaaga ac 42

Claims

1.一种产α-酮戊二酸酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）根据小鼠ATP-柠檬酸裂解酶基因序列设计引物克隆ACL基因；

2）构建解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06△leu2菌株；其中解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06的保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M20714；

3）利用In-Fusion PCR技术将ACL基因与载体连接得到重组表达载体；

4）将得到的重组表达载体转化解脂耶氏酵母WSH-Z06△leu2后得到酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述ATP-柠檬酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述ATP-柠檬酸裂解酶基因克隆于载体pINA1269。