CN102586347B - 一种两阶段pH控制高产a-酮戊二酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种两阶段pH控制高产α-酮戊二酸的方法，属于发酵工程领域。本发明采用两阶段控制pH调控发酵过程，以解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)CCTCC NO.M207143为生产菌株，发酵前期以CaCO3为pH缓冲剂，后期用NaOH维持pH＝2.5，大量积累α-酮戊二酸，实验室规模α-酮戊二酸产量达到53.4g/L，比恒定pH＝2.5时，α-酮戊二酸产量提高了142.7％；比仅用CaCO3为pH缓冲剂，α-酮戊二酸产量提高了32.5％；发酵后期低pH值能降低染菌的概率，减少NaOH用量，利于下游产品的提取；具有广阔的工业应用前景。

Description

一种两阶段pH控制高产a-酮戊二酸的方法
技术领域
本发明涉及一种高产α-酮戊二酸的发酵策略，特别是一种两阶段pH控制策略。 
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)是一种重要的二元羧酸广泛的用于食品、药品、精细化工等工业生产中。目前，α-酮戊二酸生产方式主要是化学合成法。化学合成法具有副产物过多，副产物中的有毒物质氰化物及残留的有机化合物增加了α-酮戊二酸后提取难度及费用，且限制了α-酮戊二酸的应用范围。微生物发酵法具有高纯度、环境友好等优点，但是发酵法生产α-酮戊二酸生产强度低的现实让工业生产毫无悬念的选择化学合成法。 
此前，国内外的学者从菌株选育，培养基成分优化，培养条件优化等水平研究α-酮戊二酸的积累过程，以期获得高产α-酮戊二酸的菌株和过量积累α-酮戊二酸的培养基和培养条件。我们研究小组从土壤中筛选出一株高产α-酮戊二酸的Y.lipolytica CCTCC NO.M207143，经过一些列的单因素优化发现此菌的生产强度仍然达不到工业化的需求。 
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种两阶段pH控制高产-酮戊二酸的方法。 
本发明的技术方案是以解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)CCTCC NO.M207143为生产菌株，发酵前期添加CaCO3为pH缓冲剂促进菌体生长，发酵后期以NaOH为pH调节剂，维持菌株的最适产酸范围，实现α-酮戊二酸过量积累的方法。解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)CCTCC NO.M207143在201010302441.7专利申请中提交CCTCC保藏。 
详细方案为以CCTCC NO.M207143为出发菌株，接种到种子培养中，28℃培养10天，至分生孢子成熟；无菌水洗下孢子，稀释到107个/L；以4％的体积比转接孢子悬浮液至前培养培养基，28℃，400rpm培养40h；以10％的体积比转接前培养种子至发酵培养基，28℃，400rpm维持通气量1.5vvm，添加20g/L CaCO3为发酵液pH缓冲剂培养至发酵液pH下降至2.5，再以4mol/LNaOH溶液维持发酵液pH＝2.5培养至168h。 
产孢子培养基成分为(g/L)：葡萄糖1，氯化钾1.8，酵母汁2.5，醋酸钠8.2，琼脂15，pH自然。种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5。 
发酵培养基成分为(g/L)：甘油100，硫酸铵3，磷酸二氢钾3，七水硫酸镁1.2，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，盐酸硫胺0.2×10-6。 
细胞干重测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，UV 7500型可见分光光度计，于570nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。 
甘油、丙酮酸和α-酮戊二酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC) 
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(紫外可见检测器、示差择光检测器)； 
色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column； 
流动相：5mM H2SO4； 
流速：0.6mL/min； 
柱温：35℃； 
进样量：5μL； 
紫外检测器波长：210nm。 
样品制备：500μL发酵液在10,000rpm下离心10min，取100μL上清液转入5mL容量瓶中，定容，0.22μm滤膜过滤，滤液备用液相色谱分析。 
本发明以一株能以甘油为唯一碳源，过量积累α-酮戊二酸的Y.lipolytica CCTCC NO.M207143为出发菌株，利用两阶段pH控制策略，前期以20g/LCaCO3为pH缓冲剂过量生长菌体，后期以4mol/LNaOH为发酵液pH调节剂维持产酸最适pH范围。培养168h后，α-酮戊二酸产量达到53.4g/L，比对照组分别提高了142.7％，32.5％；丙酮酸的产量降到21.3g/L，比对照组分别降低了42.3％，33.0％。 
具体实施方式
对照实施例1维持发酵液pH＝4.5积累α-酮戊二酸 
本发明所用菌种为维生素B1缺陷型解脂亚洛酵母(CCTCC NO.M207143)。先将在产孢子培养基上28℃培养10天的解脂亚洛酵母孢子用无菌水洗下，以4％的体积比转接孢子悬浮液至前培养培养基，28℃，400rpm培养40h；以10％的体积比转接前培养种子至发酵培养基，28℃，400rpm维持通气量1.5vvm，用4M NaOH维持pH为4.5培养168h。 
对照实施例2CaCO3为pH缓冲剂积累α-酮戊二酸 
将产孢子培养基上28℃培养10天的解脂亚洛酵母孢子无菌水洗下，以4％的体积比转接孢子悬浮液至前培养培养基，28℃，400rpm培养40h；以10％的体积比转接前培养种子至 发酵培养基，28℃，400rpm维持通气量1.5vvm，添加20g/L CaCO3为发酵液pH缓冲剂，发酵168h。 
实施例1两阶段pH控制策略过量积累α-酮戊二酸 
将产孢子培养基上28℃培养10天的解脂亚洛酵母孢子无菌水洗下，以4％的体积比转接孢子悬浮液至前培养培养基，28℃，400rpm培养40h；以10％的体积比转接前培养种子至发酵培养基，28℃，400rpm维持通气量1.5vvm，添加20g/L CaCO3为发酵液pH缓冲剂培养至发酵液pH下降至2.5，再以4mol/LNaOH溶液维持发酵液pH为2.5培养至168h。 
两阶段pH控制策略与对照组相比：(1)对照实施例1(维持pH4.5)中副产物丙酮酸产量为36.9g/L，对照实施例2(CaCO3作为缓冲剂)中副产物丙酮酸产量为31.8g/L，实施例1(两阶段pH控制)中副产物丙酮酸产量为21.3g/L，比对照组分别降低了42.3％，33.0％；(2)对照实施例1(维持pH4.5)中α-酮戊二酸产量为22.0g/L，对照实施例2(CaCO3作为缓冲剂)中α-酮戊二酸产量为40.3g/L，实施例1(两阶段控制pH)中α-酮戊二酸产量为53.4g/L，比对照组相比分别提高了142.7％，32.5％。 

Claims (5)

1.一种两阶段pH控制高产α-酮戊二酸的方法，其特征在于以解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica）CCTCC NO.M207143为生产菌株，发酵前期以CaCO3为pH缓冲剂，后期用NaOH维持pH在2.5；所述发酵前期以CaCO3为pH缓冲剂，是添加20g/L CaCO3为发酵液pH缓冲剂培养至发酵液pH下降至2.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体步骤为以解脂亚洛酵母为出发菌株，接种到产孢子培养基，28℃培养10天至分生孢子成熟；生理盐水洗下分生孢子，以4%的体积比转接至前培养培养基，28℃，400rpm培养40h；以10%的体积比转接至发酵培养基，28℃，400rpm，通气量1.5vvm，添加20g/L CaCO3为发酵液pH缓冲剂培养至发酵液pH下降至2.5，再以4mol/L NaOH溶液维持发酵液pH在2.5培养至168h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是产孢子培养基成分(g/L)：葡萄糖1，氯化钾1.8，酵母汁2.5，醋酸钠8.2，琼脂15，pH自然。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是前培养培养基成分(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征是发酵培养基成分(g/L)：甘油100，硫酸铵3，磷酸二氢钾3，七水硫酸镁1.2，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，盐酸硫胺0.2×10-6。
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