CN102719378B - 一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法,属于生物工程技术领域。外消旋体2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(以下简称(±)γ-内酰胺)。本发明方法利用从土壤中筛选获得的具有高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株,鉴定为戴尔福特菌(Delftiasp.),保藏号为CGMCCNo.5755;在水相体系中立体选择性水解(±)γ-内酰胺,制备(-)γ-内酰胺。在200g/L底物浓度条件下,产物(-)γ-内酰胺经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(-)γ-内酰胺的光学纯度95.0%-99.9%,化学纯度为95%-99%。该微生物催化不对称水解(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率和高产物浓度的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微生物立体选择性水解外消旋体(±) γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
光学纯(-)-γ-内酰胺是重要的医药中间体。抗艾滋病药(-)abacavir和(-)carbovir均能以(-)-γ-内酰胺为原料进行合成,以(-)-γ-内酰胺为光学中间体,还可以合成抗流感药物帕拉米韦[王建军等:微生物学报,50(8):988-994,2010]。由于上述手性药物的需求量不断增加,作为重要手性中间体的光学纯(-)-γ-内酰胺制备研究越来越受到人们的关注。目前已有的制备方法包括化学合成法和生物拆分法。化学法制备(-)γ-内酰胺的主要问题为副产物多、产率低、制备成本高、步骤繁琐等,从而使得最终的产品含量低,不能满足制药要求。生物拆分(±) γ-内酰胺主要是利用具有立体选择性的酶对(±) γ-内酰胺选择性拆分而得到(-)γ-内酰胺,具有反应条件温和,立体选择性好,产物光学纯度高,且不污染环境等诸多优点,有广泛的应用前景。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶的产生菌株。Brabban和Mahmoudian等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,筛选得到了产(+)γ-内酰胺酶菌株荧光假单胞菌,将来源于该菌的(+)γ-内酰胺酶进行了分离纯化[Mahmoudian M, et al,:Tetrahedron:Asymmetry 10,1201-1206,1999;AD Brabban et al,:Journal of industrial Microbiology 16,8-14,1996];Toogood等在超高温古菌Sulfolobus solfatarius中分离出了(+)γ-内酰胺酶,该酶的热稳定性较好,具有绝对选择性,只专一性水解(+)γ-内酰胺,而不会水解(-)γ-内酰胺 [Toogood,et al,:Tetrahedron 60,711–716,2004]。国内相关研究较少,李海泉等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,筛选出了一株产γ-内酰胺酶的微杆菌氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans) [李海泉等:微生物学报,46(4):57l-575,2006];但该菌株能耐受的底物浓度较低(0.5 g/L-20 g/L) [郑国钧等:CN 101113423A],尚未达到工业化生产的要求;后来他们对该菌种进行了诱变 [郑国钧等:CN 101240257A],使酶活提高了11倍。并对诱变菌株进行了细胞固定化研究,提高了细胞的稳定性,可重复使用[郑国钧等:CN 101285059A],尽管酶活有了很大的提高,但是能耐受的底物浓度仍不高,不利于工业化生产的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物立体选择性水解外消旋体2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(以下简称(±) γ-内酰胺),制备(-)γ-内酰胺的方法。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:从土壤中筛选获得具有高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株-戴尔福特菌(Delftia sp.)CGMCC No.5755,利用该微生物菌株立体选择性水解外消旋底物(±) γ-内酰胺,制备(-)γ-内酰胺。步骤如下:
(1)微生物菌株的筛选:
将从本地化工厂附近采集的20多份土样,用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基,将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基,20-30℃培养2-3天,挑取单菌落,进行活性测定。
将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中,在20-40℃、50-250 r/min下培养48 h后,将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液 (0.01-0.5 mol/L,pH 4-10)中,添加终浓度为5-20 g/L的(±) γ-内酰胺底物,在20-40℃,100-300 r/min下反应12-48 h,取样进行HPLC分析。
富集培养基(g/L):酵母提取物 0.05-2,(±) γ-内酰胺 0.2-10,NH4Cl 0.2-10,NaH2PO4 0.01-0.5,Na2HPO4 0.01-0.5,MgSO4 0.01-0.5,pH 4-10。
平板筛选培养基(g/L):酵母提取物0.01-2,N-乙酰-L-苯丙氨酸0.2-10,NH4Cl 0.2-10,NaH2PO4 0.01-0.5,Na2HPO4 0.01-0.5,MgSO4 0.01-0.5,琼脂粉10-30,pH 4-10。
发酵培养基(g/L):牛肉膏0.3-20,蛋白胨2-50,NaCl 1-25,pH 4-10。在以上培养基50 mL装于250 mL的三角瓶中,121℃、0.15 Mpa灭菌20 min。
筛选得到一株具有较高(+)γ-内酰胺酶活性的微生物菌株JNU-GL,该菌株经鉴定为戴尔福特菌Delftia sp.,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.5755。
(2)一种用所述菌株微生物立体选择性水解外消旋(±) γ-内酰胺,制备(-)γ-内酰胺的方法,采用具有立体选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的微生物菌株,在水相体系中,以(±) γ-内酰胺为底物,进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺,步骤如下:
微生物菌株:戴尔福特菌(Delftia sp.)CGMCC No.5755;
微生物菌株Delftia sp.的发酵培养条件:优化的培养基组成为(g/L):蔗糖 5-100,蛋白胨 5-50,牛肉膏 5-50,乙酰胺 5-150,MgSO4 0.5-5,NaH2PO4 1-10,Na2HPO4 1-10,pH 4-10;培养温度20-40℃;培养时间1-3天,将发酵液离心获得湿菌体;
反应体系的配制:以(±) γ-内酰胺为底物,用pH 4-10、0.01-0.5 M磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为2 g/L-600 g/L;
全细胞生物催化反应:在上述的单一水相反应体系中,加入5 g/L-100 g/L湿菌体,反应温度为25-45℃,反应时间为2-24 h,摇床转速为100-300 rpm;
转化液的处理和分析:微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,上清液采用乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测;
产物的分离提取:采用乙酸乙酯萃取产物,无水硫酸镁干燥,在30-80℃下蒸发浓缩,-20-4℃下冷却结晶,得到高纯度的(-)γ-内酰胺,光学纯度95.0%-99.9%,化学纯度为95%-99%。
分析方法:
(-)γ-内酰胺的对映体过量值(ee)采用手性高效液相色谱法。色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAK AS-H;流动相为异丙醇/乙腈(v/v)=80/20;流速0.5mL/min;检测波长230nm。
本发明的有益效果:本发明利用筛选获得的具有高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶产生菌株戴尔福特菌Delftia sp. CGMCC No.5755,在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺,在200 g/L底物浓度条件下,产物(-)γ-内酰胺的光学纯度(ee值)达到100%,产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(-)γ-内酰胺,产物光学纯度为95.0%-99.9%,化学纯度为95%-99%。该微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。
生物材料样品保藏:一株产高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株,其分类命名为戴尔福特菌(Delftia sp.)JNU-GL,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.5755,保藏日期2012年2月14日。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1:具有内酰胺酶活性的微生物菌株筛选
将从本地化工厂附近采集的20多份土样,用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基,将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基,30℃培养2-3天,挑取单菌落,进行活性测定。
将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中,30℃、110 r/min培养48 h。然后将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L,pH 7.0)中,湿菌体浓度50 g/L,底物(±) γ-内酰胺浓度为10 g/L,在30℃、180 r/min下反应,在48 h内取样,转化液经离心除去菌体,取上清液采用乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测。筛选获得一株微生物菌株JNU-GL,表现出较高的立体选择性和转化率,产物的光学纯度(ee值)大于99.5%。该菌株经鉴定为戴尔福特菌Delftia sp.,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,编号为CGMCC No.5755。
富集培养基(g/L):酵母提取物0.1,(±) γ-内酰胺2,NH4Cl 2,NaH2PO4 0.1,Na2HPO4 0.1,MgSO4 0.1,调节pH 7.0。
平板筛选培养基(g/L):酵母提取物0.1,N-乙酰-L-苯丙氨酸2,NH4Cl 2,NaH2PO4 0.1,Na2HPO4 0.1,MgSO4 0.1,琼脂粉20,调节pH 7.0。
实施例2:不同碳源对发酵产酶的影响
以蛋白胨( 10 %)、酵母膏(5 %)为氮源,按3%浓度分别添加下列碳源:葡萄糖、α-乳糖、菊糖、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸、柠檬酸三钠、甘油、玉米浆,作为发酵培养基,并用于外消旋γ-内酰胺的水解反应。微生物催化反应之后的转化液,离心分离菌体,取上清以乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测。考察不同碳源对菌株Delftia sp. CGMCC 5755发酵产酶和产物光学纯度的影响。
由表2可以看出:碳源对菌体的生物量影响不大,对ee有较大影响。采用甘油、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖的ee值可以达到99.5%以上。
表2 碳源对发酵产酶的影响
实施例3:不同氮源对发酵产酶的影响
在以蔗糖为碳源的培养基上,分别以30 g/L的浓度添加酵母浸提物、玉米浆、牛肉浸提物、尿素、蛋白胨、碳酸氢铵、柠檬酸氢二铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸氢二铵作为发酵培养基的氮源,对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的生物量和产酶情况进行研究。结果见表3,采用单一氮源时与对照(牛肉浸取物3 g/L,蛋白胨10 g/L)相比,ee值均较低。因此菌体发酵产酶选择牛肉浸提物和蛋白胨作为复合氮源。
表3 氮源对发酵产酶的影响
“-”表示因生物量太低,未测定ee值和酶活
实施例4:复合氮源的筛选
使用两种或多种的氮源对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的菌体生长和发酵产酶可能更有利。以含有牛肉浸取物和蛋白胨的培养基为对照,向其中添加其他氮源进行复配,保持氮源总量不变,结果见表4,综合生物量、酶活和ee值,最佳复合氮源为乙酰胺。
表4 复合氮源对发酵产酶的影响
实施例5:培养温度对发酵产酶的影响
温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要因素,考察了不同发酵温度对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的菌体产量及酶活的影响(底物浓度50 g/L),结果见表5。可以看出温度对生物量和酶活均有一定的影响,当菌体培养温度为32 ℃时,生物量和酶活最高,故以32℃为最适发酵温度。
表5 菌体培养温度对菌体生长和产酶的影响
实施例6:培养基初始pH对发酵产酶的影响
细胞生长以及菌体各种酶的活性都会受到培养基的初始pH的调节作用。为考察初始pH对Delftia sp. CGMCC 5755菌株产酶的影响,将发酵培养基调至不同的pH,对培养获得的菌体进行(±) γ-内酰胺的转化,并对酶活进行测定。结果如表6所示,当培养基的初始pH值为7.0时酶活最高。确定菌体生长的最适pH值为7.0。
表6 培养基初始pH对菌体生长和产酶的影响
实施例7:转化时间对水解拆分反应的影响
用不同的转化时间进行Delftia sp. CGMCC 5755菌株的γ-内酰胺转化反应,反应温度为35 ℃,摇床转速180 rpm,缓冲液pH 7,底物浓度为200 g/L,湿菌体浓度为150 g/L,微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,取上清以乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测,并计算转化率和ee值。
由表7可以看出:菌株Delftia sp. CGMCC 5755反应8 h之后,ee值和转化率趋于稳定,反应基本达到平衡,ee值最高可达99.7%,转化率68.9%。
表7 转化时间对转化的影响
实施例8:温度对水解拆分反应的影响
Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L、底物浓度为50 g/L,在不同的温度、缓冲液pH为7.0、220 rpm转化,转化约10 h。测定转化率和ee值。
由表8可知,在25℃至35℃温度范围内,随着温度的升高,ee值和转化率也在增加;产物的光学纯度在35℃达到最高,为99.9%,转化率为56.8%。而当温度继续升高至45℃时,光学纯度和转化率几乎没有变化。
表8 不同的温度对转化率和ee值的影响
实施例9:底物浓度对水解拆分反应初速度的影响
在不同不同底物浓度条件下,Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L,温度35 ℃,pH为7,180 rpm转化约10 h,微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,取上清以乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测,计算转化率和ee值。
由表9可以看出,由此可以看出,当底物浓度<200 g/L时,酶活随着底物浓度的增加而增加,当底物浓度>225 g/L时,随着底物浓度的增加,酶促反应初速度显著下降。
表9 底物浓度对水解拆分反应初速度的影响
实施例10:菌体浓度对水解拆分反应的影响
不同Delftia sp. CGMCC 5755菌体浓度,温度35 ℃、缓冲液pH为7.0,摇床转速为180 rpm,底物浓度100 g/L的10 ml反应体系中反应8 h。微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,取上清以乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测。测定转化率和ee值。
由表10可以看出,菌体量小于150 g/L时,转化指标随菌体量的增加而快速增长,随后产物的光学纯度基本不再变化。此时,转化率有所上升,说明(-)γ-内酰胺开始被水解。
表10 菌体浓度对水解拆分反应的影响
实施例11:缓冲液pH对水解拆分反应的影响
不同pH的缓冲液中,温度35℃、pH7.2、180rpm,Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L,底物浓度50 g/L的10ml反应体系中反应8h。微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,取上清以乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测。测定转化率和ee值。
由表11可以看出:水解拆分(+)γ-lactam的最适pH为7左右,中性和略偏碱性的条件下催化效果最好。过高或过低pH都对转化不利。当pH<6时,ee值几乎为零,此时酶的立体选择性非常差,酶的活力极低。在pH为8-10范围内,ee值由96.7%急剧下降至11.6%,转化率由52.9%大幅下降至6.2%。这说明酶对强酸和强碱环境非常敏感。
表11 缓冲液pH对水解拆分反应的影响
实施例12:产物的分离提取
Delftia sp. CGMCC No.5755湿菌体浓度为20 g/L,底物浓度为100 g/L,反应体系为500 ml,在1L的反应釜中进行不对称水解拆分反应。水解拆分反应的温度35 ℃、pH7.0、180 rpm。微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,以等体积的乙酸乙酯混合振荡2 min,静置30分钟。将萃取液进行抽真空旋转蒸发,蒸发温度为30 ℃,冷却结晶温度为4℃。将得到的晶体溶于环己烷,手性HPLC测定(-)γ-内酰胺的光学纯度大于99.5%,产物化学纯度大于99%。
Claims (2)
1.一株产高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株,其分类命名为戴尔福特菌(Delftia sp.)JNU-GL,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.5755。
2.一种用权利要求1所述菌株微生物立体选择性水解外消旋(±) γ-内酰胺,制备(-)γ-内酰胺的方法,其特征在于,采用具有立体选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的微生物菌株,在水相体系中,以(±) γ-内酰胺为底物,进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺,步骤如下:
(1)微生物菌株:戴尔福特菌(Delftia sp.)CGMCC No.5755;
(2)微生物发酵培养条件:优化的培养基组成以g/L计为:蔗糖 5-100,蛋白胨 5-50,牛肉膏 5-50,乙酰胺 5-150,MgSO4 0.5-5,NaH2PO4 1-10,Na2HPO4 1-10,pH 7;培养温度20-40℃;培养时间1-3天,将发酵液离心获得湿菌体;
(3)反应体系的配制:以(±) γ-内酰胺为底物,用pH 7、0.01-0.5 M磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为2 g/L-600 g/L;
(4)全细胞生物催化反应:在步骤(3)的单一水相反应体系中,加入5 g/L-100 g/L湿菌体,反应温度为25-45℃,反应时间为2-24 h,摇床转速为100-300 rpm;
(5)转化液的处理和分析:微生物催化反应之后的转化液,离心除去菌体,上清液采用乙酸乙酯萃取,加适量无水硫酸镁干燥后,进行手性HPLC检测;
(6)产物的分离提取:采用乙酸乙酯萃取产物,无水硫酸镁干燥,在30-80℃下蒸发浓缩,-20-4℃下冷却结晶,得到高纯度的(-)γ-内酰胺,光学纯度95.0%-99.9%,化学纯度为95%-99%。
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