CN110004081A - 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（＋）γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用 - Google Patents

一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（＋）γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能拆分(+/‑)γ‑内酰胺得到(+)γ‑内酰胺的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018862。本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22分离自艾溪湖，具有较高(+)γ‑内酰胺酶活性。菠萝泛菌物浓度条件下，产物(+)γ‑内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ‑内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ‑内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。本发明还提供菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22在制备(+)γ‑内酰胺和生产(+)γ‑内酰胺酶中的应用。

Description

一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌及 其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用。
背景技术
γ-内酰胺的两个光学对映体都是许多碳环核苷类似物合成的手性前体。趋化因子受体抗结剂MK-0812和糖尿病候选药物美格列汀，可由(+)γ-内酰胺合成。产物(+)γ-内酰胺经溴化进行骨架重排生成(-)γ-内酰胺，以光学纯的(-)γ-内酰胺为起始化合物的酶化学合成方法，是合成阿巴卡韦和帕拉米韦这两种治疗艾滋病和禽流感及甲流感的特效药物的最简便、经济的方法。
在发现微生物能选择性拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺之前，文献报道的制备光学纯的(+)γ-内酰胺一般采用化学不对称合成的方法。使用这种方法的缺点在于：原料昂贵，步骤烦琐，成本较高，且会造成较严重的环境污染，同时产物中通常含有金属杂质。与此形成鲜明对比的是，用微生物进行催化合成光学纯的(+)γ-内酰胺具有反应条件温和效率高，产物纯度高及对环境友好的特点。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的生产菌株，暂无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明提供一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，所述菠萝泛菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018862。
较佳地，所述菠萝泛菌能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌。
本发明还提供一种上述所述菠萝泛菌在制备(+)γ-内酰胺中的应用，采用所述菠萝泛菌，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。
具体地，所述以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺的具体步骤如下：
(1)取微生物菌株：为所述菠萝泛菌Y22；
(2)先将步骤(1)中所述的菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应。
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、蒸发浓缩、冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺。
较佳地，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH为4～10，浓度为0.01～0.5mol/L。
较佳地，所述步骤(4)中菌体终浓度为0.5～100g/L湿菌体，反应温度为20～60℃，反应时间为1～24h，摇床转速为100～300rpm。
较佳地，所述步骤(5)中在20～80℃下蒸发浓缩、1～4℃下冷却结晶。
较佳地，所述步骤(6)中所述(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
本发明还提供一种上述菠萝泛菌在生产(+)γ-内酰胺酶中的应用。
本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22具有以下优点：
(1)本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22分离自艾溪湖，具有较高(+)γ-内酰胺酶活性。菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺，在300g/L底物浓度条件下，产物(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ-内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。
(2)本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22能够抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌的生长，在抑制人类致病菌中具有开发利用价值。
本发明的菠萝泛菌Y22，保藏日期为2018年12月5日，保藏编号为CCTCC NO：M2018862，分类命名为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22菌落形态图；
图2为金黄色葡萄球菌抑菌实验结果图；
图3为痢疾杆菌抑菌实验结果图；
图4为白色念珠菌抑菌实验结果图；
图5为粪肠杆菌抑菌实验结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株的筛选
从艾溪湖底取污泥，筛选得到能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，具体步骤如下：
(1)初培养：从艾溪湖底取污泥，用无菌水稀释后涂布于培养基上，30℃培养2d；
初筛培养基为：NH4Cl 2.0g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO4 1.5g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，(+/-)γ-内酰胺2g，微量元素100μL，琼脂粉20g；其中微量元素按照每升加入量计算包括：CaCl2·2H2O 3.6g，ZnO 2.0g，CuCl·2H2O 0.85g，NaMoO·2H2O 4.8g，MnCl2·4H2O 2.0g，FeCl3.6H2O 5.4g，CoCl2·6H2O 2.4g；
(2)挑取单菌落再次在筛选培养基上划线分离纯化单菌落；
挑取单菌落形态特征为：菌落圆形，表面光滑，边缘平整，黄色，菌落质地粘稠，湿润，革兰氏染色呈阴性；
(3)发酵产酶培养：先将步骤(2)中挑取出来的单菌落继续进行发酵产酶培养1～3d，发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5g，NH4Cl 2.0g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 7g，MgSO40.4g，CaCl2 0.01g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO4 0.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用；
(4)将上述发酵产酶培养的菌液进行离心获得能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，备用。
最终筛选得到一株具有较高(+)γ-内酰胺酶活性的微生物菌株Y22，该菌株经鉴定为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，具有如SEQ ID:1所示的16s rDNA序列，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018862。菠萝泛菌Y22的菌落形态图如图1所示。
实施例2菠萝泛菌Y22拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺
(1)取微生物菌株：菠萝泛菌Y22；
(2)先将步骤(1)中的菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L的(+/-)γ-内酰胺；磷酸盐缓冲液的pH＝7，浓度为0.5mol/L。
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；菌体终浓度为60g/L湿菌体，反应温度为30℃，反应时间为5h，摇床转速为200rpm。
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAK AS-H250×4.6mm；流动相为异丙醇/乙腈(v/v)＝80/20；流速0.5mL/min；检测波长230nm。
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、在40℃下蒸发浓缩、2℃下冷却结晶，最后得到(+)γ-内酰胺。
分析可知，所得(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
实施例3不同碳源对菠萝泛菌Y22发酵产酶的影响
产酶培养基以2g/l NH4Cl为氮源，按5g/L浓度分别添加下列碳源：乳糖、淀粉、棉子糖、葡萄糖、牛肉膏、柠檬酸、蔗糖、柠檬酸钠、木糖和甘油。30℃、220r/min培养12h的菌体进行拆分转化实验。本实施例中考察不同碳源对菌株菠萝泛菌Y22发酵产酶、产物光学纯度和底物转化率的影响。
表1碳源对发酵产酶的影响
由表1可以看出：碳源对菌体的生物量影响不明显，对Ee值和转化率都影响不大。除了以淀粉为碳源菌体不生长外，其中产酶培养基以乳糖、棉子糖、葡萄糖、牛肉膏、柠檬酸、蔗糖、柠檬酸钠、木糖和甘油为碳源时菌体都生长旺盛，生物量较比较高，转化Ee值均达到100％，转化率达到大于57.1％。
实施例4不同氮源对菠萝泛菌Y22发酵产酶的影响
产酶培养基以5g/l葡萄糖为碳源，按2g/l分别添加下列氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、销酸铵、磷酸氢二铵、硝酸钾、草酸铵、柠檬酸氢二铵和碳酸氢铵。30℃、220r/min培养6h的菌体进行拆分转化实验。本实施例中考察不同氮源对菌株菠萝泛菌Y22发酵产酶、产物光学纯度和底物转化率的影响。结果见表2。
表2氮源对发酵产酶的影响
从表2可以看出：氮源对菌体的生物量影响较大，对Ee值和转化率都有较大影响。其中产酶培养基除了以尿素和碳酸氢铵为氮源时，菌体不生长外，以牛肉膏、蛋白胨、销酸铵、和柠檬酸氢二铵为氮源，菌体生长旺盛，Ee值达到100％，转化率大于为48.3％。
实施例5培养温度对菠萝泛菌Y22发酵产酶的影响
温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要因素，本实施例中考察了不同发酵温度对菠萝泛菌Y22菌株的菌体产量及酶活的影响，结果见表3。
表3培养温度对发酵产酶的影响
表3可以看出：温度对生物量和酶活均有一定的影响，当菌体培养温度为30℃时，生物量和酶活最高，故以30℃为最适发酵温度。
实施例6培养基初始pH对菠萝泛菌Y22发酵产酶的影响
细胞生长以及菌体各种酶的活性都会受到培养基的初始pH的调节作用。为考察初始pH对菠萝泛菌Y22菌株产酶的影响，将发酵培养基调至不同的pH，对培养获得的菌体进行拆分(+/-)γ-内酰胺的实验。
表4培养基初始pH对菌体生长和产酶的影响
结果见表4，从表中可看出：培养基的初始pH对菠萝泛菌的生物量和转化率影响比较大，从pH为4.0～10.0的培养基菌体都能生长，且Ee值和转化率以PH＝7最高。
实施例7转化温度对菠萝泛菌Y22拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
转化温度对菌株拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响结果见表5。
表5转化温度对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
从表5可看出，30℃是最适宜的转化温度，随着温度的逐渐升高，Ee值和转化率都逐渐下降。
实施例8配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的pH值对菠萝泛菌Y22拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的pH值对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响的结果见表6。
表6缓冲液的pH值对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
从表6可见：配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的最适pH＝8，略偏碱性的条件下催化效果最好。过高或过低pH都对转化不利。当pH<6时，Ee值和转化率都非常低。
实施例9产物(+)γ-内酰胺的分离提取
菠萝泛菌Y22湿菌体浓度为40g/L，底物浓度为300g/L，反应体系为2L，在5L的反应釜中进行不对称水解拆分反应。水解拆分反应的温度30℃、pH8.0、200rpm。微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，用1L的二氯甲烷萃取3次，3次萃取液混合在一起用无水硫酸钠干燥。将萃取液进行抽真空旋转蒸发，蒸发温度为30℃，加正己烷冷却结晶温度为4℃将得到的晶体溶于乙酸乙酯，手性HPLC测定(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)大于99.5％，产物化学纯度大于99％。
实施例10菠萝泛菌Y22的抑菌实验
将金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌单菌落分别接种量接种于装有5mLLB培养液体基的试管中，25℃，150rpm/min，培养20h即为各自的菌悬液。Y22菌液按5％的接种量接种于装有5mL发酵产酶培养基的试管中，25℃，150rpm/min培养2d，取500μL菌悬液到1.5mL离心管中，8000g离心5min，取上清备用，即为Y22抑菌原液。
阳性对照为：青链霉素混合液(100×)双抗(青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。)
发酵产酶培养基：CMC-Na 10g、(NH4)2SO44.0g、MgSO47H2O 0.5g、K2HPO42g、牛肉膏5g、蛋白胨10g(PH自然定容到1L)
LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，NaCl 10g/L，调节至pH 7.0。
LB固体培养基:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L调节至pH 7.0。
方法：分别取40μL金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌菌悬液涂布于LB平皿，2h后把灭菌的直径1.4cm圆形新华滤纸贴于平皿上，分别取10μLY22抑菌原液和10μL青链霉素混合液(100×)双抗滴加到滤纸上，25℃，培养1d，测量抑菌圈直径。
菠萝泛菌Y22抑菌实验结果如图2至图5所示，图2为金黄色葡萄球菌，图3为痢疾杆菌，图4为白色念珠菌，图5为粪肠杆菌，图中→指示的是菠萝泛菌Y22的抑菌圈，指示的是对照的抑菌圈。结果显示，菠萝泛菌Y22能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌等人类致病菌，抑菌圈直径和滤纸直径比分别达到1.93、1.77、2.54和1.4，双抗原液的抑菌圈直径和滤纸直径比分别达为1.92、2.14、2.14和1.42，具有开发利用价值。
本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22分离自艾溪湖，具有较高(+)γ-内酰胺酶活性。菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺，在300g/L底物浓度条件下，产物(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ-内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。
本发明提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22能够抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌的生长，在抑制人类致病菌中具有开发利用价值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（＋）γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)
<400> 1
ctcgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctgggg atctgcccga tagaggggga 60
taaccactgg aaacggtggc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt 120
cgggcctctc actatcggat gaacccagat gggattagct agtaggcggg gtaacggccc 180
acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca 240
cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 300
tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcggggag 360
gaaggcgata aggttaataa cctcgtcgat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta 420
actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc 480
gtaaagcgca cgcaggcggt ctgttaagtc agatgtgaaa tccccgggct taacctggga 540
actgcatttg aaactggcag gcttgagtct cgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc 600
ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacgaaga 660
ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720
ccgtaaacga tgtcgacttg gaggttgttc ccttgaggag tggcttccgg agctaacgcg 780
ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg 840
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact 900
cttgacatcc acggaatttg gcagagatgc cttagtgcct tcgggaaccg tgagacaggt 960
gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020
aacccttatc ctttgttgcc agcgattcgg tcgggaactc aaaggagact gccggtgata 1080
aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca 1140
cgtgctacaa tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa 1200
gtgcgtcgta gtccggatcg gagtctgcaa ctcgactccg tgaagtcgga atcgctagta 1260
atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgcttaccac 1380
tttgtgattc atgactgggg tgaagtcgta aca 1413

Claims (9)

1.一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，其特征在于：所述菠萝泛菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018862。
2.如权利要求1所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，其特征在于：所述菠萝泛菌能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌。
3.一种如权利要求1或2所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，采用所述菠萝泛菌，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。
4.如权利要求3所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺的具体步骤如下：
(1)取微生物菌株：为所述菠萝泛菌Y22；
(2)先将步骤(1)中所述菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应。
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、蒸发浓缩、冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺。
5.如权利要求4中所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH为4～10，浓度为0.01～0.5mol/L。
6.如权利要求4中所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述步骤(4)中菌体终浓度为0.5～100g/L湿菌体，反应温度为20～60℃，反应时间为1～24h，摇床转速为100～300rpm。
7.如权利要求4中所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述步骤(5)中在20～80℃下蒸发浓缩、1～4℃下冷却结晶。
8.如权利要求4中所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述步骤(6)中所述(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
9.一种如权利要求1或2所述的菠萝泛菌在生产(+)γ-内酰胺酶中的应用。
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