CN102177246A

CN102177246A - 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法

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Publication number: CN102177246A
Application number: CN2009801349430A
Authority: CN
Inventors: 泷川里绘; 原吉彦; 野中源; 宅见和浩
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2008-09-08
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: JP5598329B2; EP2336347A4; JPWO2010027045A1; CN102177246B; ES2624913T3; EP2336347A1; KR101627095B1; BRPI0918299A2; EP2336347B1; US20110212496A1; WO2010027045A1; PE20110369A1; BRPI0918299B1; KR20110074521A; US8206954B2

Abstract

用培养基培养属于肠杆菌科、且具有L-氨基酸生产能力的细菌，在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸；其中，所述细菌是固有地具备以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶的活性、但经过修饰而降低了该酶的活性的细菌。

Description

生产L-氨基酸的微生物和L-氨基酸的生产方法

技术领域

本发明涉及使用微生物的L-氨基酸生产方法，特别是L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸等L-氨基酸的生产方法。L-谷氨酸作为调味品、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸作为动物饲料用添加剂、健康食品成分或氨基酸输液等，在产业上是有用的L-氨基酸。

背景技术

L-氨基酸是通过使用各种微生物的发酵方法来进行工业生产的。例如，L-谷氨酸主要是通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)的称为棒状杆菌型细菌中的L-谷氨酸生产菌或其突变株的发酵法来进行生产(参照例如非专利文献1)。作为通过使用其它微生物的发酵法进行的L-谷氨酸生产方法，已知有使用芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉属(Streptomyces)、青霉属(Penicillium)等的微生物(参照例如专利文献1)，假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、假丝酵母属(Candida)等的微生物(参照例如专利文献2)，芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(现称产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))等的微生物(参照例如专利文献3)，大肠杆菌突变株(参照例如专利文献1)等的方法。此外，还公开了使用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)或泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属的微生物的L-谷氨酸生产方法(参照例如专利文献2～4)。

为了通过诸如上述的使用微生物的发酵法生产L-氨基酸等目的物质，可以采用使用野生型微生物(野生株)的方法、使用从野生株衍生的营养缺陷型株的方法、使用从野生株作为各种药物抗性突变株衍生的代谢调节突变株的方法、使用具有营养缺陷型株和代谢调节突变株这两者的性质的菌株的方法等。

而且，近年来在目的物质的发酵生产中采用了重组DNA技术。例如，通过增强L-氨基酸生物合成体系酶编码基因的表达(专利文献5、专利文献6)、或增强L-氨基酸生物合成体系的碳源流入(专利文献7)来提高微生物的L-氨基酸生产力。

葡萄糖脱氢酶大体上可分为NAD(P)依赖型和PQQ(吡咯并喹啉醌)依赖型。进一步，已知PQQ依赖型(EC1.1.5.2)又包括可溶型和膜结合型，且后者在肠杆菌科细菌中存在于周质空间(外膜、内膜间的空隙)，且在肠杆菌科细菌中广泛存在。以下，将这种存在于周质空间的以PQQ为辅酶的葡萄糖脱氢酶也记作“GCD”。

已知大肠杆菌等一部分细菌不具有GCD辅酶PQQ的合成能力，只有通过添加PQQ才会表现GCD活性(非专利文献2)。另一方面，泛菌属细菌等细菌具有PQQ合成能力，其具有GCD全酶。

作为涉及GCD的技术，已知有利用GCD编码基因被缺损的木葡糖杆菌(Gluconobacter xylnus)从葡萄糖生产纤维素的方法(J.Biosci.Bioeng.99(4)，415-422，2005)。此外，还已知利用葡萄糖脱氢酶活性降低的埃希氏菌属细菌、或固有缺失葡萄糖脱氢酶活性的埃希氏菌属细菌生产[5S，6S]-5，6-二羟基-1，3-环己二烯-1-羧酸的方法(专利文献8)。

然而，尚不清楚细菌GCD活性的降低对L-氨基酸生产能力的影响。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开平5-244970号公报

专利文献2：美国专利第3,563,857号说明书

专利文献3：特公昭32-9393号公报

专利文献4：特开2000-189175号公报

专利文献5：美国专利第5168056号说明书

专利文献6：美国专利第5776736号说明书

专利文献7：美国专利第5906925号说明书

专利文献8：国际公开第WO2006/133898号小册子

非专利文献

非专利文献1：明石邦彦等著，アミノ酸発酵，学会出版中心，195～215页，1986年

非专利文献2：FEMS Microbiol.Lett.，24，329-333，1984

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题是：提供提供能够高效生产L-氨基酸的属于肠杆菌科的微生物，以及使用该微生物高效生产L-氨基酸的方法。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对固有地具备GCD活性的肠杆菌科细菌进行修饰以降低GCD活性，能够提高L-氨基酸生产能力，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

(1)一种生产L-氨基酸的方法，其中，在培养基中培养属于肠杆菌科且具有L-氨基酸生产能力的细菌，从而在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸；其中，所述细菌是固有地具备以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶的活性、但经过修饰而降低了该酶的活性的细菌。

(2)前述方法，其中，通过灭活编码所述酶的gcd基因而降低了GCD活性。

(3)前述方法，其中，所述gcd基因是编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA或其变体。

(4)前述方法，其中，所述L-氨基酸选自L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸以及L-半胱氨酸。

(5)前述方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸或L-半胱氨酸。

(6)前述方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸，且所述细菌中选自柠檬酸合酶、甲基柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶中的1种或2种以上的酶的活性得到了增强。

(7)所述方法，其中，所述L-氨基酸是L-半胱氨酸，且所述细菌中选自3-磷酸甘油酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶、硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统中的至少1种或2种以上的活性，和/或yeaS基因的表达得到了增强。

(8)前述方法，其中，所述细菌是属于选自泛菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、摩根氏菌属和耶尔森菌属中的属的细菌。

发明的效果

通过使用本发明的微生物，能够高效地发酵生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、或L-半胱氨酸等L-氨基酸。

附图说明

[图1]显示辅助质粒RSF-Red-TER的结构的图。

[图2]显示辅助质粒RSF-Red-TER的构建的图。

[图3]显示启动子Pnlp的序列的图。

发明的具体实施方式

以下，对本发明进行具体说明。

<1>本发明中使用的属于肠杆菌科的细菌

本发明中使用的细菌是固有地具备GCD活性、且具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌，且该细菌经过了修饰而降低了GCD活性。本发明的细菌可以通过对固有地具备GCD活性、且具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌修饰而降低GCD活性来获得。此外，本发明的细菌还可以通过对固有地具备GCD活性、但经过了修饰而降低了GCD活性的属于肠杆菌科的细菌赋予L-氨基酸生产能力、或者增强所述细菌的L-氨基酸生产能力来获得。

对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举出L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等羟基单氨基羧酸形式的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等酸性氨基酸，特别优选L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸。本发明的微生物可以具有2种以上氨基酸的生产能力。

此外，在本发明中，L-氨基酸包括游离体的L-氨基酸和/或其盐，例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。

在本发明中，具有L-氨基酸生产能力的细菌，是指具有当在培养基中培养时，产生并向培养基中分泌L-氨基酸的能力的细菌。此外，优选的是能够使培养基中蓄积优选为0.5g/L以上、更优选为1.0g/L以上的量的目的L-氨基酸的细菌。

以下，将用于进行修饰以降低GCD活性的、作为本发明的细菌的亲本株使用的细菌以及赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法示例如下。

<2-1>本发明的细菌

本发明的细菌是属于肠杆菌科的细菌。

肠杆菌科中包括属于埃希氏菌(Escherichia)、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、泛菌(Pantoea)、光状杆菌(Photorhabdus)、普罗威登斯菌(Providencia)、拉乌尔菌(Raoultella)、沙门氏菌(Salmonia)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、摩根氏菌(Morganella)、耶尔森菌(Yersinia)等属的细菌。特别是优选根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi·id＝91347)中使用的分类法被分类为肠杆菌科的细菌。

所谓属于埃希氏菌属的细菌没有特别的限制，是指该细菌根据微生物学家所知的分类被归类为埃希氏菌属。作为属于埃希氏菌属的细菌的例子，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)。

属于埃希氏菌属的细菌例如包括Neidhardt等的著作(Neidhardt，F.C.Ed.1996.Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology/SecondEdition pp.2477-2483.Table 1.American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.)中记述的种系的微生物。具体而言，可以列举源自原型野生株K12株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址P.O.Box 1549Manassas，VA 20108，United States of America)通过分售获得。即，对各菌株给予了对应的登录号，可以利用该登录号通过分售获得。各菌株的相应登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。

作为肠杆菌属细菌，可以列举成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。具体而言，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书中示例的菌株。而且，一些成团肠杆菌最近基于16SrRNA碱基序列分析等被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本发明中，只要是分类为肠杆菌科的，可以是属于肠杆菌属或泛菌属中任何一个属的细菌。

作为肠杆菌属的代表株，可以列举出成团肠杆菌ATCC12287株。

作为泛菌属细菌的代表性细菌，可以列举出Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体而言，可以列举出下述菌株。

Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)

Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)

Pantoea ananatis AJ13601株(FERM BP-7207)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)

这些菌株在分离出来时被鉴定为成团肠杆菌，并作为成团肠杆菌保藏。但是，如上所述，现在通过16S rRNA的碱基序列解析等被重新分类为Pantoea ananatis。

作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。具体地，可以列举出下述菌株。

解淀粉欧文氏菌ATCC15580株

胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713株

植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)

植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)

本发明的细菌是诸如上述的肠杆菌科细菌，并且，该细菌是固有地具备GCD活性、且具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌。所谓固有地具备GCD活性的肠杆菌科细菌，是指野生株或gcd基因非修饰株具有GCD活性的细菌。作为这样的属于肠杆菌科的细菌，可以列举出属于泛菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、摩根氏菌属、以及耶尔森菌属、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、变形杆菌属(Proteus)等属的细菌。更具体地，可以列举出Int.J.Syst.Bacteriol.，39(1)，61-67，1989中描述的细菌。

大肠杆菌携带gcd基因，能够产生GCD脱辅酶，但其不具备PQQ产生能力，未添加PQQ的条件下其不具有GCD活性。然而已经知道，如果使其表达某外源基因，则会生成代替PQQ的物质，从而表现GCD活性(WO2006/133898)。这样，像埃希氏菌属细菌那样通常不具有GCD活性、但处于表现GCD活性的状态的细菌，包含于本发明所称的“固有地具备GCD活性的肠杆菌科细菌”中。关于GCD活性，参见后述。

以下，就赋予如所述的细菌以L-氨基酸生产能力的方法、或增强如所述的细菌的L-氨基酸生产能力的方法进行示例说明。

为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变株、L-氨基酸的类似物抗性株或代谢调节突变株，创建L-氨基酸生物合成系统酶表达得到增强的重组菌株等等(参见《アミノ酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日首次出版发行，第77-100页)。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。此外，营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予可以与生物合成系统酶的增强组合来进行。

具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或紫外线照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；然后从所得的突变菌株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且具有L-氨基酸生产能力的菌株。

此外，可以通过进行基因重组来增强酶活性从而赋予或增强L-氨基酸生产能力。酶活性的增强，可以列举出例如通过修饰细菌从而增强编码参与L-氨基酸的生物合成的基因的表达的方法。用于增强基因的表达的方法可以这样来实现：导入通过将包含这些基因的DNA片段导入适当的质粒(例如至少包含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体)而形成的扩增质粒；或者，通过接合、基因转移等使这些基因在染色体上多拷贝化；抑或在这些基因的启动子区域导入突变(参考国际公开小册子WO95/34672号)。

当向上述扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达这些基因的启动子可以是能够在属于肠杆菌科的细菌中发挥功能的任何启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适当地选择在L-氨基酸生产菌中强力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表达量的调节。如上所述的增强酶基因表达的方法，在WO00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等中有记载。

下面，就赋予细菌以L-氨基酸生产能力的具体方法、以及被赋予了L-氨基酸生产能力的细菌进行示例。以下的描述主要涉及埃希氏菌属细菌，但以下方法也适用于本发明中使用的肠杆菌科细菌。

L-苏氨酸生产菌

作为具有L-苏氨酸生产能力的微生物优选实例可以列举出L-苏氨酸生物合成系统酶的1种或2种以上的活性得到了增强的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举出天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号里为该基因的简写符号(下同)。这些酶中特别优选天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶以及苏氨酸合酶。也可以将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受到抑制的细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，例如可以列举出苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH6菌株(特开2001-346578号)。

L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受最终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生产菌合成系统基因进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构，苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。这种修饰可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现(参照Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，and Gardner，J.F.J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；国际公开第02/26993号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。

苏氨酸操纵子的上游存在固有启动子，但可以用非天然启动子来取代它(参考WO98/04715号小册子)，也可以构建苏氨酸操纵子使得参与苏氨酸生物合成的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物(repressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。此外，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来实现。

对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主内的拷贝数有所提高、或者是其连接于强启动子而表达量有所增加。除了通过使用质粒的扩增来提高拷贝数之外，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组中转移苏氨酸操纵子来提高拷贝数。

理想的是，除了L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强与糖酵解系统、TCA循环或呼吸链相关的基因或调控基因表达的基因，或者糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例可以列举出，转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或者芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。

此外，强化赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或对宿主赋予L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是合适的。作为给予抗性的基因的实例，可以列举出rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)、yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可以参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子中所记载的方法。

作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举：大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利第5,175,107号、美国专利第5,705,371号)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美国专利第5,631,157号)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利第5,939,307号)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利第5,474,918号)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利第5,376,538号)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner et al.，Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。

TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation)。该菌株的rhtA基因也有赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性的突变。B-3996菌株携带pVIC40，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010来源的载体中而获得的。这种突变的thrA基因编码基本上已对苏氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-UnionScientific Center of Antibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Nagatinskaya Street 3-A，117105 Moscow，Russia)，保藏号为RIA 1867。该菌株也在1987年4月7日于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)进行了国际保藏，保藏号为B-3996。

还可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株。B-5318菌株是异亮氨酸原养型的，并且pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域被置换为温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)进行了国际保藏，保藏号为VKPM B-5318。

编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的大肠杆菌thrA基因已经阐明(核苷酸编号337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间。大肠杆菌的编码高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸编号2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。大肠杆菌的编码苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所述3个基因全部作为一个单独的苏氨酸操纵子发挥功能。为增强苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子中将影响转录的弱化子区域去除(WO2005/049808，WO2003/097839)。

编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以以一个操纵子的形式从存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996菌株中的公知的pVIC40质粒获得。pVIC40质粒在美国专利5,705,371中有详述。

rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的18min处，靠近编码谷氨酰胺转运系统的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸编号764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)相同，位于pexB与ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白的单元称为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸抗性)。此外，已经证明rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置用G→A取代(ABSTRACTS of the 17 th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting

大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且可以根据该基因的碱基序列制备引物通过PCR来获得(参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))。其它微生物的asd基因可以通过类似方式获得。

此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸编号983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以通过类似方式获得。

L-赖氨酸生产菌

属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例可以列举出对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制在当L-赖氨酸共存于培养基中时会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例可以列举出、但不限于，氧代赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。这些对赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来得到。可用于L-赖氨酸生产的菌株的具体实例可以列举出大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRLB-12185；参见美国专利第4,346,170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，天冬氨酸激酶已经对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。

作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株，可以列举出L-赖氨酸生物合成系统酶的1种或者2种以上的活性得到了增强的菌株。相关的酶包括，但不限于：二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利第6,040,160号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶(dapE)以及天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A)。在这些酶中，特别优选为二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶。此外，亲本株中下述基因的表达水平可以得到增强：与能量效率相关的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利第5,830,716号)、ybjE基因(WO2005/073390)、或所述基因的组合。

作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-氨基酸生产菌的亲本株的例子，还可以列举催化通过从L-氨基酸生物合成途径改道而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性减少或者缺损的菌株。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外的化合物的反应的酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5,827,698号)和苹果酸酶(WO2005/010175)。

作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2(WO2006/078039)。该菌株是通过在编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因被破坏了的WC196株中导入美国专利第6040160记载的质粒pCABD2而得到的菌株。WC196株是由大肠杆菌K-12来源的W3110株出发，用突变型lysC基因(美国专利第5,661,012号)替换W3110株染色体上的野生型lysC基因后赋予AEC抗性而选育得到的菌株(美国专利第5,827,698号)，所述突变型lysC基因编码第352位的苏氨酸被替换成异亮氨酸从而对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III。WC196株被命名为大肠杆菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-14690；并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-5252(美国专利第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldc本身也是优选的L-赖氨酸生产菌。pCABD2包含：编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型lysC基因、编码大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、以及编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。

L-半胱氨酸生产菌

细菌的L-半胱氨酸生产能力可以通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶的活性，或增强参与该途径的底物化合物如L-丝氨酸等的生成的酶，例如3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙酰转移酶等的活性来提高。3-磷酸甘油酸脱氢酶受丝氨酸的反馈抑制，通过使细菌携带编码该反馈抑制被减弱或解除的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因，可以增强该酶活性。

此外，丝氨酸乙酰转移酶受L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使细菌携带编码该反馈抑制被减弱或解除的丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因，可以增强该酶活性。作为编码大肠杆菌的SAT的基因，cysE已经从野生株以及L-半胱氨酸分泌突变株中被克隆出来，其碱基序列已经阐明(Denk，D.and Boeck，A.，J.General Microbiol.，133，515-525(1987))。该碱基序列以及该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：37和38所示。

此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半胱氨酸生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统蛋白质群由cysPTWA基因簇编码(特开2005-137369号公报，EP1528108号说明书)。

此外，细菌的L-半胱氨酸生产能力还可以通过提高yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)的表达来提高。yeaS基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：39和40所示。已知在细菌中，除了ATG以外，还会使用GTG等各种密码子作为起始密码子(http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm)。在SEQ IDNO：39和40中标出的是与最初的密码子gtg对应的氨基酸Val，但实际上很可能是Met。

具有L-半胱氨酸生产能力的埃希氏菌属细菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，例如，用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)，具有过表达编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110(美国专利5,972,663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)，等等。

细菌的L-半胱氨酸生产能力可以通过进行修饰降低yhaM基因编码的蛋白质(以下也记作“YhaM”)的活性来加以提高。yhaM基因与ECK3099、b4470、yhaN基因同义，以前也称作b3109或b3108。

作为具有L-半胱氨酸生产能力的泛菌属细菌，可以列举出：经过修饰而降低了半胱氨酸脱巯基酶活性的Pantoea ananatis菌株，以及再进一步一具有编码L-半胱氨酸反馈抑制减弱的突变型丝氨酸乙酰转移酶的基因的Pantoea ananatis菌株。作为用于这样的L-半胱氨酸生产菌的选育的亲本株，可以列举出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株以及SC17(0)株。AJ13355株是作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌株，而SC17株是从AJ13355株出发作为粘液质低生产突变株选择出来的菌株(美国专利第6,596,517号)。AJ13355株于平成10年2月19日保藏在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：邮政编码305-8566，茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-16644，并于平成11年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6614。SC17(0)株是为了对Pantoea ananatis进行基因破坏，作为对λRed基因产物具有抗性的菌株而构建的菌株(参照参考例1)。

SC17株的内部编号是AJ416，其于平成21年2月4日国际保藏在产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-11091。此外，SC17(0)株于2005年9月21日国际保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(地址：Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd.1)，保藏号VKPM B-9246。

细菌生产的L-半胱氨酸在培养基中通过二硫键部分转化为L-胱氨酸。此外，如后述，有时L-半胱氨酸通过和培养基中含有的硫代硫酸反应生成S-磺酸半胱氨酸(Szczepkowski T.W.，Nature，vol.182(1958))。进一步，细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸有时还和细胞中存在的酮或醛、例如丙酮酸缩合，以硫代半酮缩醇(hemithioketal)为中间体生成噻唑烷(thiazolidine)衍生物(参考日本专利第2992010)。这些噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇有时作为平衡混合物存在。因此，在本发明中，L-半胱氨酸生产能力，不仅限于在培养基中或者菌体内蓄积L-半胱氨酸的能力，还包括在培养基中蓄积除L-半胱氨酸之外，L-胱氨酸或其衍生物，例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物或硫代半酮缩醇或者它们的混合物的能力。

L-亮氨酸生产菌

L-亮氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物如β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。

用于本发明的细菌可以是已通过增加参与L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达得到改良的。这样的基因的实例可优选例举以编码解除了L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因(美国专利第6,403,342号)为代表的leuABCD操纵子中的基因。此外，本发明的细菌可以是已通过增加一种以上编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达而得以改良的。这样的基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。

L-组氨酸生产菌

L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌24株(VKPM B-5945、RU2003677)、大肠杆菌80株(VKPM B-7270、RU2119536)、大肠杆菌NRRL B-12116-B12121(美国专利第4,388,405号)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)以及H-9343(FERM BP-6676)(美国专利第6,344,347号)、大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利第6,258,554号)，等等。

L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括编码L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达已得到增强的菌株。相关基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导可赋予对反馈抑制的抗性的突变，来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。

具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例包括导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体的大肠杆菌FERM-P 5038和5048(特开昭56-005099号)，导入了氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)，等等。

L-谷氨酸生产菌

L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)VL334thrC⁺(EP 1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中有突变(美国专利4,278,765)。利用可在野生型大肠杆菌菌株K-12(VKPM B-7)细胞中增殖的噬菌体P1，通过常规转化方法来转入thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC⁺(VKPM B-8961)。

L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于L-谷氨酸生物合成系统酶中的1种或2种以上的活性得到增强的菌株。作为所述基因的例子，可以列举：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)等。所述酶中，优选谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合酶。

作为经过了修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增加的菌株的例子，可以列举EP1078989A、EP955368A以及EP952221A中公开的菌株。

细菌的L-谷氨酸合成能力可以通过提高参与呼吸链的酶、例如氰抗性呼吸终端氧化酶(cioA，cioB)的活性来提高。

作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举下述酶的活性降低或缺损的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径改道而合成L-谷氨酸以外的化合物，或者催化分解或消耗L-谷氨酸的反应。作为这样的酶的例子，可以列举：异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)、γ-谷氨酰基转移酶(ggt)、γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(gshA)、γ-谷氨酸腐胺合成酶(ycjK)等。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺损、或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于埃希氏菌属的细菌及其获取方法在美国专利第5,378,616号和第5,573,945号中有记载。

作为具体例子，可以列举出如下。

大肠杆菌W3110sucA::Kmr

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

大肠杆菌W3110sucA::Km^r是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(以下也称“sucA基因”)而得到的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺损。

作为L-谷氨酸生产菌的其它例子，可以列举属于埃希氏菌属、且对天冬氨酸代谢拮抗物质有抗性的菌株。所述菌株可以是缺损α-酮戊二酸脱氢酶的，例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利第5,908,768号)，以及还降低了L-谷氨酸分解能力的FFRM P-12379(美国专利第5,393,671号)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利第6,110,714号)等。

作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌的例子，可以列举出所述Pantoea ananatis AJ13355株。

此外，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举α-酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)活性缺损、或者αKGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。作为这样的菌株有：缺损AJ13355株的αKGDH-E1亚基基因(sucA)而得到的AJ13356(美国专利第6,331,419号)，以及从AJ13355株出发作为粘液质低生产突变菌株选择出来的SC17株衍生的sucA基因缺损株SC17sucA(美国专利第6,596,517号)。AJ13356于1998年2月19日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-16645，并于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6616。AJ13355以及AJ13356在上述保藏机构是作为成团肠杆菌保藏的，但是在本说明书中，将其描述为Pantoea ananatis。此外，SC17sucA株的内部编号为AJ417，已于2004年2月26日保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-08646。

而且，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株以及NA1株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株是在SC17sucA株中导入大肠杆菌来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株出发作为低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的抗性的菌株而选择出的菌株。此外，如实施例所述，NP106株是AJ13601株脱去质粒RSFCPG+pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株于1999年8月18日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-17516，并于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-7207。此外，携带将所述RSFCPG的gltA基因替换为prpC而得到的RSFPPG(WO2008/020654，参照后述实施例)的NP106株也是优选的L-谷氨酸生产菌。

L-苯丙氨酸生产菌

L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物缺损的大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)(WO03/044191)，携带编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利第5,354,672号)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)、大肠杆菌NRRLB-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146以及NRRL B-12147(美国专利第4,407,952号)等。此外，也可以使用携带编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)以及命名为AJ 12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作为亲本株(EP 488424 B1)。此外，还可使用增加了由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473号以及2003/0157667、WO 03/044192)。

L-色氨酸生产菌

L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制性的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用增强了由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。

作为L-色氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(aroA，5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1种或2种以上酶的活性增强的菌株。预苯酸脱水酶和分支酸变位酶以双功能酶(CM-PD)的形式被pheA基因编码。所述酶之中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒pGH5(WO 94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。

L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。

L-脯氨酸生产菌

作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，可以列举ilvA基因缺损、且能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(EP1172433)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。

本发明中使用的细菌可以通过增加一种以上参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达来进行改良。作为L-脯氨酸生产菌所优选的基因的例子，可以列举编码解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。而且，本发明中使用的细菌，可以通过增加一种以上编码从细菌细胞中分泌L-氨基酸的蛋白质的基因的表达来进行改良。作为这样的基因，可以列举b2682基因和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

作为具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的例子，可以列举：NRRL B-12403以及NRRL B-12404(英国专利第2075056号)、VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295)、德国专利第3127361号所述的质粒突变体、Bloom F.R等(The 15th Miami winter symposium，1983，p.34)所述的质粒突变体等大肠杆菌株。

L-精氨酸生产菌

L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公开2002/058315A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请2001112869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生产株(EP1170361A1)，等等。

L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括编码L-精氨酸生物合成系统酶的1种以上基因的表达增加的菌株。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。

L-缬氨酸生产菌

L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。优选将衰减作用所必需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。

L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1 Dorozhny Proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号为VKPM B-4411。

此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺乏H+-ATP酶的突变株(WO96/06926)作为亲本株。

L-异亮氨酸生产菌

L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用经过编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase)等)的基因转化的重组菌株作为亲本株(特开平2-458号，FR0356739，和美国专利第5,998,178号)。

L-酪氨酸生产菌

作为酪氨酸生产菌，可以列举出具有不受酪氨酸的抑制的脱敏型预苯酸脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌(欧洲专利申请公开1616940号公报)。

在通过基因重组来选育上述L-氨基酸生产菌时，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，还可以使用这些基因的变体，即以不损害所编码的蛋白质的功能为限，该基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因。具体地说，还可以是下述基因，所述基因编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或数个位置上的一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白质。

这里，所谓“一个或数个”因氨基酸残基的种类或其在蛋白质的立体结构中的位置而异，但具体地是指优选1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个。作为保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。保守突变的代表是保守取代，作为可视作保守取代的取代，具体地可以列举：从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于基因所来源的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因例如可以这样获得：采用定点突变法对公知基因的碱基序列进行修饰，使得被编码的蛋白质的特定部位处的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或增加。

而且，具有如上所述的保守突变的基因还可以是编码下述蛋白质的基因：就编码的氨基酸序列全长而言，其与野生型蛋白质具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性，且具有与野生型蛋白质等同的功能。而且，在本说明书中，有些情况下“同源性”(homology)”是指“同一性”(identity)。

此外，可以将基因序列中各自的密码子替换为易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。

具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等常规突变处理中使用的方法来获得。

此外，基因还可以是下述DNA，所述DNA与公知基因序列的互补序列或可由所述互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有与公知基因产物等同的功能的蛋白质。这里，“严格条件”，是指所谓特异性杂交体形成但非特异性杂交体不形成的条件。举例说明：在具有高同源性的DNA之间、例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性低于上述的DNA之间则不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度、温度下，洗涤1次更优选2～3次的条件。

作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这种探针可以通过PCR制备，其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡核苷酸为引物，以包含这些碱基序列的DNA片段为模板来进行。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1％SDS。

上述的关于基因的变体的描述，同样适用于下述的gcd基因。

<2-2>GCD活性的降低

接下来，针对使属于肠杆菌科的细菌的GCD活性降低的修饰进行说明。

GCD活性是指催化下述反应的活性。

β-D-葡萄糖+氧化型PQQ→D-δ-葡糖酸内酯+还原型PQQ

GCD活性例如可以通过采用600nm的吸光度测定检测基于以下反应生成的还原型DCPIP，来测定(特开2007-129965)。

D-葡萄糖+氧化型PMS→D-葡糖酸-1，5-内酯+还原型PMS

还原型PMS+氧化型DCPIP→氧化型PMS+还原型DCPIP

PMS：吩嗪甲基硫酸酯(phenazine methosulfate)

DCPIP：2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenol-indophenol)

“经过修饰而降低了GDC活性”是指：与非修饰株、例如野生型的属于肠杆菌科的菌株相比，平均每个细菌细胞的GCD活性变低。例如，相当于平均每个细胞的GCD分子数降低或平均每个分子的GCD活性降低等情况。平均每个细胞的GCD活性的比较，可以通过例如，比较相同条件下培养的细菌的细胞抽提液中所含的GCD活性来进行。而且，活性的“降低”也包括活性完全消失的情况。用于比较的对照的野生型泛菌属细菌包括例如Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)等。

GCD活性的降低可以通过使编码GCD的基因(gcd)失活来实现。使gcd基因“失活”，是指通过基因重组对该基因进行修饰或者向该基因导入突变，使得该基因编码的GCD的活性降低或消失。

作为gcd基因，可以列举出具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列的Pantoea ananatis的gcd基因。该gcd基因编码的GCD的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。gcd基因可以通过基于这些序列合成合成寡核苷酸，并以Pantoea ananatis的染色体为模板进行PCR反应来克隆。此外，在通过同源重组缺损gcd基因的情况下，也可以使用与染色体上的gcd基因具有一定程度以上的同源性、例如80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的基因。此外，还可以使用与染色体上的gcd基因在严格条件下杂交的基因。作为严格条件，可以列举出例如：在与60℃、1×SSC、0.1％SDS优选0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度下，进行1次更优选2～3次洗涤的条件。

使gcd基因失活具体地可以通过例如，使染色体上的gcd基因的编码区域的一部分或全部缺失，或者在编码区域中插入其它序列来实现。这些方法也称作基因破坏。

此外，通过对gcd基因的启动子或shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰而降低gcd基因的表达，也可以使gcd基因失活。表达的降低包括转录的降低和翻译的降低。此外，通过对表达调节序列以外的非翻译区域进行修饰，也能够降低基因的表达。

而且，还可以将包含染色体上的目标基因前后的序列在内的目标基因整体缺失。此外，gcd基因的灭活还可以这样实现：向染色体上的gcd基因的编码区域导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一～二个碱基的移码突变(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997)Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 955511-5515(1998)，Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839(1991))。

各基因的修饰优选通过基因重组来进行。作为基于基因重组的方法，具体可以列举出：利用同源重组，使染色体上目标基因的表达调节序列、例如启动子区域或编码区域或非编码区域的一部分或全部缺损，或者在所述区域中插入其它序列。

表达调节序列的修饰优选是1个碱基以上，更优选是2个碱基以上，特别优选是3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要各基因产生的蛋白质的功能降低或缺失即可，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编码区域。通常，缺失的区域长能够切实地使目标基因失活。此外，缺失区域的上游和下游的读码框优选是不一致的。

在编码区域中插入其他序列时，插入的位置可以为目标基因的任何区域，但插入的序列长能够切实地使目标基因失活。插入部位的前后序列优选读码框不一致。对于其他序列没有特殊限制，只要是能够降低或缺损目标基因编码的蛋白质的功能即可，可以列举例如携带抗生素抗性基因或对L-氨基酸生产有用的基因的转座子等。

为了如上所述地修饰染色体上的目标基因，可以通过下述方法实现：例如，制作缺失目标基因的部分序列从而不产生发挥正常功能的蛋白质的经修饰的缺失型基因，用含有该基因的DNA转化细菌，使缺失型基因和染色体上的目标基因之间发生同源重组，将染色体上的目标基因替换为缺失型基因。由缺失型目标基因编码的蛋白质即使产生，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，其功能降低或消失。

如上所述的基于利用同源重组的基因替换的基因破坏已经确立，包括下述方法：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))相结合的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含有温度敏感复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法，等等(美国专利第6303383号说明书或特开平05-007491号公报)。

目标基因转录量的降低可以通过将从目标基因转录的mRNA的量与野生株或非修饰株进行比较来确认。评价mRNA量的方法包括例如Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。转录量的降低只要是与野生株或非修饰株相比降低即可，可以是任何形式的降低，理想的是例如，与野生株、非修饰株相比，降低至至少75％以下、50％以下、25％以下或10％以下，特别优选完全不表达。

目标基因所编码的蛋白质的量降低可以通过使用与该蛋白质结合的抗体进行western印迹来确认(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。蛋白质量的降低只要是与野生株或非修饰株相比降低即可，可以是任何形式的降低，理想的是例如，与野生株、非修饰株相比，减少至至少75％以下、50％以下、25％以下或10％以下，特别优选完全不产生蛋白质(活性完全消失)。

除了上述基因操作方法以外，为了降低GCD的活性，还可以列举出例如下述方法：对于泛菌属细菌等肠杆菌科细菌，利用紫外线照射，或者利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等等常规的突变处理中使用的突变剂进行处理，然后选择GCD的活性降低的菌株。

GCD的活性的降低还可以通过降低PQQ的合成能力来进行。PQQ的合成能力可以通过例如，缺失PQQ生物合成所必需的操纵子pqqABCDEF的一部分或全部来降低(J.S.Velterop，P.W.Postma，J.Bacteriology 177(17)：5088-5098(1995))。

在大肠杆菌、棒状杆菌型细菌等不具有GCD活性的微生物中，葡萄糖是利用称作葡萄糖PTS(糖磷酸转移酶系统)或葡萄糖通透酶的转运蛋白来摄取的。PTS是与PEP(磷酸烯醇丙酮酸)转化为Pyr(丙酮酸)的反应相偶联以葡萄糖6-磷酸的形式摄入细胞内的。葡萄糖6-磷酸转变为果糖6-磷酸，通过所称的糖酵解系统(EMP：Embden-Meyerhof途径)代谢，而生成丙酮酸。

另一方面，在具有GCD活性的微生物中，葡萄糖在周质空间中暂时转变为葡糖酸后，在葡糖酸通透酶的作用下被摄入，通过磷酸化反应而生成6-磷酸葡糖酸。

6-磷酸葡糖酸通过戊糖磷酸循环或Entner-Doudoroff(ED)途径代谢，生成甘油醛3-磷酸、丙酮酸等。

已知醋酸菌等具有GCD的微生物具备特有的糖代谢特性，即：将一部分葡萄糖在周质中暂时转变为葡糖酸后加以摄入。细胞内的EMP途径、ED途径、戊糖磷酸循环的容量因微生物而异，因此预想若缺损GCD而改变糖代谢，其下游的代谢模式会发生变化。

对于Pantoea ananatis而言，认为在通常的培养温度例如34℃下，并非全部的葡萄糖都通过GCD途径同化，而是存在相当量通过PTS途径同化的葡萄糖。另一方面，若在高温例如38℃下进行培养，则可以预想到因为GCD的最适温度高，GCD活性提高，由此GCD途径的糖消费增加。Pantoea ananatis中不存在ED途径，因而6-磷酸葡糖酸由6-磷酸葡糖酸脱氢酶脱氢化，通过戊糖磷酸循环代谢。在被6-磷酸葡糖酸脱氢酶脱氢时，一分子的6-磷酸葡糖酸释放一分子的二氧化碳，因此，可以预想若GCD路径的糖消费增加，则氨基酸生成量降低。此外还可以推断，当高温培养中GCD途径的糖消费增加时，戊糖磷酸循环的容量出现不足，溢出的代谢物流向副产物方向，结果是L-氨基酸收率降低。可以认为，在本发明中，通过降低GCD活性，特别是在高温培养时，消除了二氧化碳的释放和向戊糖磷酸循环的溢出，从而L-氨基酸生产力提高。

此外，可以推断，是在导入了ED途径的Pantoea ananatis(特开2003-274988)中，若GCD路径的糖消费增加，也会因基于6-磷酸葡糖酸脱氢酶的6-磷酸葡糖酸脱氢反应中二氧化碳的释放、以及ED途径、戊糖磷酸循环的容量不足，而导致L-氨基酸收率降低。因此，可以认为，在导入了ED途径的Pantoea ananatis中，通过降低GCD活性，也能够提高L-氨基酸生产力。

本发明中使用的细菌可以是降低了GCD活性、且强化了糖的摄入活性的细菌。为了提高糖的摄入活性，例如可以提高葡萄糖PTS或葡萄糖通透酶的活性。此外，还已知半乳糖通透酶(Flores et al.J Mol Microbiol Biotechnol 2007；13：105-116)、木糖通透酶(EP1807445A1)、阿拉伯糖通透酶等易化扩散载体超家族(Major Facilitator superfamily(MFS))(Griffith，J.K.et al，Curr.Opin.Cell Biol.4(4)；684-95(1992))成员的转运蛋白也具有摄入葡萄糖等的活性。因此，在GCD活性降低的细菌中，通过强化这些转运蛋白的活性，也能够提高葡萄糖等糖的摄入，从而提高L-氨基酸生产力。

<2>本发明的L-氨基酸的生产方法

可以通过用培养基培养本发明的微生物，在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸，并且从该培养基收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。

用于培养的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类以及视需要的氨基酸、维生素等有机微量营养元素的常规培养基。可以使用合成培养基或者天然培养基。培养基中使用的碳源和氮源可以是任意种类的，只要所培养的菌株能够利用即可。

碳源可以使用糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，此外也可以单独使用或者与其它碳源组合使用有机酸，如乙酸和柠檬酸，以及醇，如乙醇。作为氮源，可以使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵或乙酸铵，或者使用硝酸盐。作为有机微量营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，以及包含这些营养物的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，并且在使用生长要求氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，优选补充所需要的营养物。

特别地，当使用调整为能够使L-谷氨酸析出的条件的液体培养基时，在培养基中添加泛酸，能够更有效地晶析(WO2004/111258号小册子)。无机盐类可以使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

培养优选控制在发酵温度20～45℃、pH 3-9的条件下进行通气培养。当培养中pH下降时，可以例如添加碳酸钙，或用氨气等碱来中和。在这样的条件下，优选通过进行10～120小时左右的培养，在培养液中蓄积目的氨基酸。

在本发明中，通过在适于细菌生长的温度下进行培养，能够高效地生产L-氨基酸，特别是在高温进行培养时，效果显著。例如，对于Pantoea ananatis等泛菌属细菌而言，通常34℃左右是生长优选的温度，GCD活性降低的细菌与非修饰株相比在该培养温度下的L-氨基酸生产能力更高，而在例如36℃或38℃，L-氨基酸生产能力进一步提高。

此外，可以使用调整为能够析出L-谷氨酸的条件的液体培养基，在使L-谷氨酸在培养基中析出的同时进行培养。作为L-谷氨酸析出的条件，可以列举出例如pH 5.0～4.0、优选pH 4.5～4.0、更优选pH 4.3～4.0、特别优选pH 4.0。

此外，当使L-谷氨酸在培养基中析出时，预先添加L-谷氨酸、L-赖氨酸晶体作为晶种，能够更有效地进行晶析(欧洲专利1233069号、欧洲专利申请公开1624069号)。

作为从培养结束后的培养液中收集L-氨基酸的方法，可以采用公知的回收方法来进行。例如，可以采用从培养液中除去菌体后进行浓缩晶析的方法，或者通过离子交换色谱等来收集。当在能够使L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，析出到培养液中的L-谷氨酸可以采用离心分离或过滤等来收集。这种情况下，可以在使溶解在培养基中的L-谷氨酸晶析后，一并进行分离。

而且，在生产碱性氨基酸时，可以采用通过下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸的方法来进行生产：将培养中的pH调控为6.5～9.0、将培养结束时的培养基的pH调控为7.2～9.0，将发酵中发酵罐内压力调控为正，或者向培养基中供给二氧化碳气或含二氧化碳气的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子至少为2g/L以上的培养期，将所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的抗衡离子(参照特开2002-065287号、美国专利申请公开第2002025564号)。

本发明中收集的L-氨基酸除了含有作为目标的L-氨基酸之外，还可以含有微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。收集的L-氨基酸的纯度为50％以上，优选为85％以上，特别优选为95％以上(US5,431,933，JP1214636B，US4,956,471，US4,777,051，US4946654，US5,840358，US6,238,714，US2005/0025878)。

当采用本发明的方法生产L-半胱氨酸时，得到的L-半胱氨酸可以用来生产L-半胱氨酸的衍生物。L-半胱氨酸的衍生物包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteine)、磺酸半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。

此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中积累时，从培养基中采集噻唑烷衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之间的反应平衡向L-半胱氨酸一侧移动，从而可以生产L-半胱氨酸。此外，当S-磺酸半胱氨酸在培养基中积累时，例如可以使用二硫苏糖醇等还原剂通过进行还原转化得到L-半胱氨酸。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。

〔参考例1〕λRed基因产物抗性的Pantoea ananatis菌株的构建

为了在Pantoea ananatis中进行基因缺损，构建了用于高效率地进行称作“Red驱动整合”或“Red介导整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000))的受体菌。

首先，构建了表达λ的gam、bet和exo诸基因(以下称“λRed基因”)的新辅助质粒RSF-Red-TER(图1)。详细描述见参考例2。

该质粒可以用于具有不同基因背景的广域宿主。理由是：1)其具有在许多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌甚至植物中都能够稳定保持的RSF1010广宿主域质粒的复制子(Scholz，等，1989；Buchanan-Wollaston等，1987)，2)λRed基因、gam、bet和exo基因受到能够被许多细菌的RNA聚合酶识别的PlacUV5启动子的调节(例如Brunschwig，E.和Darzins，A.，Gene，111，1，35-41(1992)；Dehio，M.等，Gene，215，2，223-229(1998))，3)自调节因子P_lacUV5-lacI、以及大肠杆菌rrnB操纵子的ρ非依赖性转录终止子(TrrnB)降低λRed基因的本底表达水平(Skorokhodova，A.Yu等，Biotekhnologiya(俄语)，5，3-21(2004))。而且，RSF-Red-TER质粒包含果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，利用该基因，可以在含蔗糖的培养基中从细胞回收质粒。

在大肠杆菌中，PCR反应生成的DNA片段与由RSF-Red-TER质粒提供的短侧翼区域一起发生整合的频率与使用pKD46辅助质粒(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6640-6645，(2000))时一样高。然而，λRed基因的表达对Pantoea ananatis显示毒性。用RSF-Red-TER辅助质粒转化的细胞在含IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，1mM)和适当抗生素(氯霉素25μg/ml或卡那霉素40μg/ml)的LB培养基上显示非常低的生长速度，λRed介导的重组(λRed-mediated recombination)的效率即使能够观察到，也是非常低的(10^-8)。

选择了对λRed基因的全部3个基因的表达均具有抗性的Pantoea ananatis突变菌株。为此，通过电穿孔将RSF-Red-TER质粒导入Pantoea ananatis SC17株(美国专利第6,596,517号)。培养18小时后，得到了约10⁶个转化株，有10个克隆的菌落尺寸大，其余的菌落都非常小。培养18小时后，大菌落为约2mm，小菌落为约0.2mm。将培养延长至24小时，小菌落不再继续生长，而大菌落继续生长。将对λRed基因的全部3个基因(gam、bet和exo)的表达均具有抗性的大菌落Pantoea ananatis突变菌株中的一个用于进一步分析。

从1个大菌落克隆和数个小菌落克隆中分离出RSF-Red-TER质粒DNA，用其再次转化大肠杆菌MG1655，考察了质粒合成Red基因的活性产物的能力。由所得转化体中Red依赖性整合的对照实验可知，只有从大菌落克隆分离的质粒可引起Red依赖性整合所必需的λRed基因的表达。为了考察所选的大菌落克隆中是否发生Red介导的整合，使用PCR反应生成的下述线性DNA片段进行了电穿孔，所述DNA片段设计为包含Km^R标记和与hisD基因同源的40bp侧翼区域，并且整合到Pantoea ananatis的hisD基因的SmaI识别位点。将2个小菌落的克隆用作对照。Pantoea ananatis的hisD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3。PCR中使用SEQ ID NO：4和5的寡核苷酸作为引物，使用pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒作为模板。使用对λRed基因不具有抗性的2个小菌落的克隆作为对照。pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒的构建在参考例3中详细描述。

RSF-Red-TER质粒能够通过该质粒上的lacI基因诱导Red基因的表达。对两种诱导条件进行了考察。在第1组中，电穿孔1小时前添加IPTG(1mM)；在第2组中，在用于制备可电穿孔细胞的培养开始时添加IPTG。携带来自大菌落克隆的RSF-Red-TER的细胞的后代的生长速度并未显著地低于不带有该质粒的菌株。添加IPTG仅使这些培养物的生长速度有些许降低。另一方面，小菌落克隆的后代在未添加IPTG的条件下生长非常缓慢，而加以诱导后生长基本上停止。对大菌落克隆的后代的细胞进行电穿孔后，有许多Km^R克隆(短诱导时间为18个克隆，延长诱导时间后为约100个克隆)生长。考察的全部100个克隆均具有His^-表现型，通过PCR对20个克隆进行了确认，结果确认了这些细胞的染色体结构与预想的相同。另一方面，对小菌落克隆的后代的细胞进行电穿孔仍未能得到整合的菌株。

使所得大菌落克隆在含7％蔗糖的平板上生长以使质粒脱落，用RSF-Red-TER再次进行转化。将不携带质粒的菌株命名为SC17(0)。

上述再次转化后生长出的全部克隆均与亲本菌株克隆SC17(0)一样具有较大的菌落尺寸。在用RSF-Red-TER质粒再次转化的SC17(0)株中进行了Red介导的整合实验。对于所得的3个独立转化株，使用与前述实验所用的相同的DNA片段进行了考察。采用了短诱导时间(电穿孔1小时前)。在各实验中，生长出超过10个的Km^R克隆。测试的全部克隆均具有His^-表现型。这样，选择出突变菌株，将其命名为对λRed基因的表达具有抗性的SC17(0)。该菌株可以作为用于对Pantoea ananatis染色体的Red依赖性整合的合适受体菌。

〔参考例2〕辅助质粒RSF-Red-TER的构建

辅助质粒RSF-Red-TER的构建方案如图2所示。

作为构建的最初步骤，设计了RSFsacBPlacMCS载体。为此，分别使用SEQ ID NO：6、7、8、9的寡核苷酸通过PCR扩增了包含pACYC184质粒的cat基因和枯草芽孢杆菌的sacB基因的结构部分的DNA片段。这些寡核苷酸的5′末端分别包含对进一步克隆而言必需且便利的BglII、SacI、XbaI、和BamHI限制酶位点。将所得1.5kb的sacB片段克隆到此前获得的pMW119-P_laclacI载体的XbaI-BamHI位点。该载体是依照与pMW118-P_laclacI载体的相关描述(Skorokhodova，A.Yu等，Biotekhnologiya(俄语)，5，3-21(2004))相同的方法构建的。只是该载体包含来自pMW219而不是pMW218质粒的多接头位点。

接下来，将上述的1.0kb的cat片段用BglII和SacI处理，并克隆到在先步骤中所得的RSF-P_laclacIsacB质粒的BamHI-SacI位点。所得质粒pMW-P_laclacIsacBcat包含PlacUV5-lacI-sacB-cat片段。为了将该片段亚克隆到RSF1010载体，将pMW-P_laclacIsacBcat用BglII消化，并用DNA聚合酶I克列诺片段处理使末端平滑化，然后用SacI切割。从1％琼脂糖凝胶中洗提出pMWP_laclacIsacBcat质粒的3.8kb的BglII-SacI片段，将其与用PstI和SacI处理的RSF1010载体连接。用连接混合液转化大肠杆菌TG1，将其在含氯霉素(50mg/L)的L培养基(纯水1L中包含细菌用胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、琼脂15g而成的培养基，pH7.0)上铺板。对从生长出的克隆中分离的质粒进行限制酶分析，得到了RSFsacB质粒。为了构建RSFsacBP_lacMCS载体，以SEQ ID NO：10以及11的寡核苷酸为引物，以pMW119-P_laclacI质粒为模板，通过PCR扩增了包含P_lacUV5启动子的DNA片段。将所得的146bp片段用SacI和NotI消化，将其与RSFsacB质粒的SacI-NotI大片段连接。然后，以SEQ ID NO：12和13的寡核苷酸为引物，以pKD46质粒(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6640-6645，(2000))为模板，通过PCR扩增了包含λRedαβγ基因和转录终止子tL3的2.3kb的DNA片段。将所得片段克隆到RSFsacBP_lacMCS载体的PvuI-NotI位点。这样，设计了RSFRed质粒。

为了排除Red基因的通读转录，将大肠杆菌rrnB操纵子的ρ-依赖性转录终止子插入到cat基因与P_lacUV5启动子之间。为此，以SEQ ID NO：14和11的寡核苷酸为引物，以大肠杆菌BW3350的染色体为模板，通过PCR扩增了包含P_lacUV5启动子与TrrnB终止子的DNA片段。将所得的这些片段用KpnI处理，并进行连接。然后，以SEQ ID NO：11和15的寡核苷酸为引物，通过使用寡核苷酸的PCR扩增了包含P_lacUV5和TrrnB这两者的0.5kb片段。将所得DNA片段用EcoRI消化，并用DNA聚合酶I克列诺片段处理使末端平滑化，然后用BamHI切割，将其与RSFsacBPlacMCS载体的Ecl136II-BamHI大片段连接。将所得质粒命名为RSF-Red-TER。

〔参考例3〕pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒的构建

pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒通过用pUC4K质粒的卡那霉素抗性基因取代pMW118-attL-Tc-attR(WO2005/010175)质粒中的四环素抗性标记基因来构建。为此，将pMW118-attL-Tc-attR质粒的EcoRI-HindIII大片段与pUC4K质粒的HindIII-PstI(676bp)和EcoRI-HindIII(585bp)这2个片段连接。作为基础的pMW118-attL-Tc-attR是通过连接以下4个片段而得到的。

1)使用引物P1(SEQ ID NO：16)和P2(SEQ ID NO：17)从大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相当于attL的区域通过PCR扩增得到的具有attL(SEQ ID NO：18)的BglII-EcoRI片段(114bp)。这些引物包含BglII和EcoRI的附加识别位点。

2)从大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相当于attR的区域使用引物P3(SEQ ID NO：19)和P2(SEQ ID NO：20)通过PCR扩增得到的具有attR(SEQ ID NO：21)的PstI-HindIII片段(182bp)。这些引物包含PstI和HindIII的附加识别位点。

3)pMW118-ter_rrnB的BglII-HindIII大片段(3916bp)。质粒pMW118-ter_rrnB是通过连接以下3个DNA片段而得到的。

·pMW118的具有AatII-EcoRI片段的大片段(2359bp)。该片段是通过用EcoRI消化pMW118、并用DNA聚合酶I克列诺片段进行处理、再用AatII进行消化而得到的。

·具有氨苄青霉素抗性(Ap^R)的基因bla的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp)。该片段是使用引物P5和P6(SEQ ID NO：22和23)对pUC19质粒的相应区域进行PCR扩增而得到的。这些引物中包含PstI、AatII和BglII的附加识别位点。

·转录终止子ter_rrnB的BglII-PstI小片段(363bp)。该片段是通过使用引物P7和P8(SEQ ID NO：24和25)对大肠杆菌MG1655染色体的相应区域进行PCR扩增而得到的。这些引物包含PstI、BglII和PstI的附加识别位点。

4)具有四环素抗性基因和ter_thrL转录终止子的pML-Tc-ter_thrL的EcoRI-PstI小片段(1388bp)(SEQ ID NO：26)。pML-Tc-ter_thrL质粒是通过如下的2个步骤获得的。

·将pML-MCS质粒(Mashko，S.V.等，Biotekhnologiya(俄语)，2001，no.5，3-20)用XbaI和BamHI消化，然后将大片段(3342bp)与包含ter_thrL终止子的XbaI-BamHI片段(68bp)连接。该包含ter_thrL终止子的片段是使用引物P9和P10(SEQ ID NO：27和28)对大肠杆菌MG1655染色体的相应区域进行PCR而得到的。这样，得到了pML-ter_thrL质粒。这些引物包含PstI、XbaI和BamHI的附加识别位点。

·将pML-ter_thrL质粒用KpnI和XbaI消化，然后用DNA聚合酶I克列诺片段处理，再与具有四环素抗性基因的pBR322的EcoRI-Van91I小片段(1317bp)连接，从而得到了pML-Tc-ter_thrL质粒。而且，将pBR322用EcoRI和Van91I消化，然后再用DNA聚合酶I克列诺片段进行了处理。

〔参考例4〕谷氨酸生产质粒RSFPPG的构建

构建了L-谷氨酸生物合成系统基因，prpC基因(国际公布2006/051660号小册子)、ppc基因、gdh基因(欧洲申请公布0999282号说明书)被扩增的质粒RSFPPG(WO2008/020654)。

设计了引物1(SEQ ID NO：29)和引物2(SEQ ID NO：30)，用于扩增RSFCPG(欧洲申请公开1233068号说明书)的gltA基因的ORF以外的部分。使用该引物，以RSFCPG为模板进行PCR，获得了约14.9kb的片段。另一方面，对于prpC，使用引物3(SEQ ID NO：31)和引物4(SEQ ID NO：32)，以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板进行PCR，获得了约1.2kb的片段。将两PCR产物分别用BglII和KpnI处理并进行连接，然后转化大肠杆菌JM109株。收集出现的所有菌落，以混合物的形式提取质粒。用该质粒混合物转化柠檬酸合酶(CS)缺损株大肠杆菌ME8330株，将其涂布于含50mg/L尿嘧啶、5mg/L硫胺素-HCl的M9极限培养基(1L纯水中含葡萄糖5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵1g、磷酸氢二钠6g而成的培养基)。收集出现的所有菌落，以混合物的形式提取质粒，用该质粒混合物转化P.Ananatis L-谷氨酸生产菌NP106株。对于出现的克隆，在中性条件下进行试管培养，将显示与G106S株等同的L-谷氨酸收率的菌株作为NA1。此外，从该菌株抽提质粒，将其作为prpC、gdh、ppc强化用质粒RSFPPG。在作为L-谷氨酸生产菌的Pantoea ananatis NP106株中导入所述质粒RSFPPG，构建了L-谷氨酸生产菌NP106/RSFPPG(该菌株称作“NA1株”)。

NP106株是如下述地获得的。将前文例示的Pantoea ananatis AJ13601株在LBGM9培养基中于34℃振荡培养一夜，稀释到每个平板为100～200个菌落，将其涂布在含四环素12.5mg/L的LBGM9平板上，所述LBGM9培养基是在L培养基(细菌用胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、pH7.0)中添加极限培养基成分(葡萄糖5g/L、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钠6g/L)而得到的液体培养基。对于出现的菌落，将其转印到含四环素12.5mg/L和氯霉素25mg/L的LBGM9平板上，选择氯霉素敏感性的菌株，从而获得了pSTVCB脱落的菌株，将其命名为G106S。而且，将G106S株在LBGM9液体培养基中于34℃振荡培养一夜，稀释到每个平板为100～200个菌落，将其涂布在不含药物的LBGM9平板上。对于出现的菌落，将其转印在含四环素12.5mg/L的LBGM9平板和不含药物的LBGM9平板上，选择四环素敏感性菌株，从而获得了RSFCPG脱落的菌株，将其命名为NP106。这样获得的NP106株不再具有AJ13601株所携带的RSFCPG和pSTVCB这2个质粒。

G106S株是像上述那样地在AJ13601株中仅脱落pSTVCB而得到的菌株。

〔实施例1〕基于gcd基因缺损株的L-谷氨酸生产

(1)gcd基因缺损株的构建

采用常规方法合成了SEQ ID NO：33和34所示的2个合成DNA引物。

SEQ ID NO：33所示的引物具有Pantoea ananatis的gcd基因上游的同源序列与λattL-Km^r-λattR的5’端的同源序列相接而成的结构。SEQ ID NO：34的引物具有Pantoea ananatis的gcd基因下游的互补序列与λattL-Km^r-λattR的3’端的互补序列相接而成的结构。通过使用这些引物，以pMW118-(λattL-Km^r-λattR)为模板进行PCR，扩增了约1.5kbp的片段，其中在λattL-Km^r-λattR序列的5’端连接gcd基因上游的同源序列，在λattL-Km^r-λattR序列的3’端连接gcd基因下游的同源序列。

纯化上述PCR片段，将其用于针对Pantoea ananatis染色体的λ依赖性整合。将辅助质粒RSF-Red-TER用作λ噬菌体Red基因的载体。为了得到Pantoea ananatis的电转化感受态细胞，用RSF-Red-TER质粒对SC17(0)株进行转化，然后在含50μg/ml氯霉素的LB培养基上于34℃培养一夜。接下来，将培养液用含50μg/ml氯霉素的新鲜LB培养基稀释100倍，34℃通气下进行生长使得OD₆₀₀为0.3。然后，添加1mM的IPTG，继续培养至OD₆₀₀为0.7。将10mL培养液中的菌体用等量的冷的10％甘油洗涤3次，悬浮在80μl的冷10％甘油中。将上述PCR产物溶解在10μl去离子水中，将PCR片段100-200ng添加到细胞悬浮液中。操作使用细菌电穿孔装置(“BioRad”美国、商品号165-2089，版本2-89)进行。使用的脉冲的参数为电场强度：18kV/cm，脉冲时间：5毫秒。

电穿孔后，立即在细胞悬浮液中添加补充有葡萄糖(0.5％)的LB培养基1ml。然后，使细胞在34℃通气下生长2小时，用含40μg/ml的卡那霉素的L培养基(纯水1L中包含细菌用胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、琼脂15g的培养基，pH7.0)进行选择，获得了约20个菌落作为转化体。使用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的2个合成DNA引物，通过PCR确认了gcd基因区域中插入了卡那霉素抗性基因的片段，将能够确认片段插入的菌株命名为SC17(0)::Δgcd。从该菌株抽提基因组DNA，通过电穿孔转化了NA1株。

将导入了SC17(0)::Δgcd的基因组DNA的NA1株用添加了40mg/L卡那霉素、12.5mg/L四环素盐酸盐和琼脂15g/L的LBGM9培养基平板进行选择，获得了约20个的菌落作为转化体。这些菌株的gcd基因区域中均插入了λattL-Km^r-λattR的片段，选出其中的1个克隆，将其命名为NA1::Δgcd。

(2)gcd基因缺损株的L-谷氨酸生产能力评价

为了研究gcd基因的缺损对L-谷氨酸生产的影响，使用NA1::Δgcd株和NA1株，进行了L-谷氨酸生产培养。

培养分为形成菌体的种子培养和生成L-谷氨酸的主培养这两个阶段进行。

种子培养的培养基组成如下。

120℃、蒸气灭菌20分钟。

将NA1::Δgcd株和NA1株用添加了12.5mg/L四环素和琼脂15g/L的LBGM9培养基平板进行前培养，将相当于1张平板的量接种到装有上述组成的培养基300mL的1L容量的微型罐中，34℃、pH6.0进行约12小时搅拌培养，并进行控制使得通气为1/1vvm、氧浓度为3％以上。添加氨气进行调整使得培养中的pH为6.0。以培养基中的糖的耗尽为指标，结束种子培养。

主培养培养基组成如下。

^*：N-N-N-三甲基甘氨酸

将种子培养所得的菌体60mL注入装有上述组成的培养基240mL的1L容量的微型罐中，温度34℃、36℃或38℃，pH4.9进行培养。在培养基中的葡萄糖全部耗尽的时间点上结束培养。L-谷氨酸浓度通过将培养液上清用水稀释适当倍率后、使用BIOTECHANALYSER(生物技术分析仪)(AS-210SAKURA精机)来测定。

结果如表1所示。可以判定：与比较对照株NA1株相比，gcd缺损株NA1::Δgcd株的L-谷氨酸蓄积提高。

[表1]

表1生成的L-谷氨酸(g/罐)

菌株	34℃	36℃	38℃
				NA1	13.0	12.4	13.3
NA1::Δgcd	15.4	16.0	16.7

〔实施例2〕基于gcd基因缺损株的L-半胱氨酸生产

(1)L-半胱氨酸生产菌的构建

为了考察在P.Ananatis中gcd基因缺损对L-半胱氨酸生产的效果，构建了L-半胱氨酸生产菌。

(1-1)yeaS基因表达质粒的构建

首先，构建了用于构建上述菌株的质粒。方法如下。

以大肠杆菌MG1655(ATCC No.47076)的染色体DNA为模板，使用P11(agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac：SEQ ID NO：51)和P12(agctgagcatgcttccaact gcgctaatga cgc：SEQ ID NO：52)作为引物，通过PCR获得了含有nlpD基因启动子区域(以下将野生型nlpD基因启动子记作“Pnlp0”)约300bp的DNA片段。在上述引物的5’末端、3’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及PaeI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、55℃20秒、72℃15秒循环25次，最后72℃、5分钟。用SalI以及PaeI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-5JS(特开2008-99668)的SalI-PaeI位点中，得到pMIV-Pnlp0质粒。在该质粒pMIV-Pnlp0中插入的Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：41所示。

随后，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P13(agctgatcta gaaaacagaatttgcctggc ggc：SEQ ID NO：53)和P14(agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc：SEQID NO：54)作为引物，通过PCR获得了含有rrnB基因的终止子区域约300bp的DNA片段。在上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶XbaI以及BamHI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、59℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。用XbaI以及BamHI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点处从而得到pMIV-Pnlp0-ter质粒。

接下来，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P15(agctgagtcgacgtgttcgc tgaatacggg gt：SEQ ID NO：55)和P16(agctgatcta gagaaagcat caggattgcagc：SEQ ID NO：56)作为引物，通过PCR获得了含有yeaS基因的约700bp的DNA片段。在上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及XbaI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、55℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。用SalI以及XbaI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0-ter的SalI-XbaI位点处从而得到pMIV-Pnlp0-YeaS3质粒。由此，在pMIV-5JS载体上构建了按照nlpD启动子、yeaS基因以及rrnB终止子的顺序连接的yeaS的表达单元。

为了通过修饰nlpD启动子的-10区域来得到更强的启动子，采用下述方法进行了-10区域的随机化。在nlpD启动子区域(图3)中存在两个推测为起启动子功能的区域，在图中分别由pnlp1和pnlp2表示。以质粒pMIV-Pnlp0为模板，使用P11以及P17(atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgcacggtnatna ngtcactgg(“n-”表示可以为a，t，g，c中的任意一种)，SEQ ID NO：57)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的3’末端侧的-10区域(记为-10(Pnlp1))随机化而得的DNA片段(图3)。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。

另一方面，同样地以质粒pMIV-Pnlp0为模板，使用P12以及P18(tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg(“n-”表示可以为a，t，g，c中的任意一种)，SEQ ID NO：58)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的5’末端侧的-10区域(记为-10(Pnlp2))随机化而得的DNA片段(图3)。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。

得到的3’末端侧和5’末端侧的片段能够通过在引物P17和P18上设计的BglII位点相连接，从而能够构建2个-10领域被随机化的完整nlpD启动子。以该片段为模板，使用P11以及P12作为引物，通过PCR获得了修饰型完整nlpD启动子的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环12次，最后在72℃下5分钟。

用在引物的5’末端上设计的限制性内切酶SalI以及PaeI处理扩增的片段，并通过将其插入到同样地用SalI以及PaeI处理的质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3中，将质粒上的野生型nlpD启动子位点(Pnlp0)替换成突变型Pnlp。从其中选择了具有如图3所示的启动子序列(Pnlp8)的质粒，并将其命名为pMIV-Pnlp8-YeaS7。插入在该质粒中的Pnlp8启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：42所示。

(1-2)突变型cysE表达质粒的构建

随后，从pMW-Pomp-cysE5(WO2005007841)中，用PaeI、SacI将Pomp-cysE5盒(cassette)的部分切出，插入到pMIV-5JS的相同位点处，从而构建了pMIV-Pomp-CysE5。pMW-Pomp-cysE5为将连接有ompC基因启动子的编码突变型SAT的基因cysE5插入到pMW118中而得到的质粒。从pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403、可从NIIPONGENE公司获得)上，用XbaI、Eco88I将四环素抗性基因切出，将该基因片段通过克列诺片段(Klenow fragment)处理后，插入到pMIV-Pomp-CysE5的PvuI位点处，从而构建了pMT-Pomp-CysE5。接下来，用HindIII酶切pMIV-Pnlp8-YeaS7，并通过克列诺片段进行平滑末端化后，用NcoI进行酶切，将含有Pnlp8-YeaS-rrnB终止子的盒和氯霉素抗性标记的片段切出。将该片段和同样以pMIV-5JS为骨架(backbone)的pMT-Pomp-CysE5的SmaI、NcoI酶切片段分别连接，从而构建了pMT-EY2。pMT-EY2为在同一个质粒上具有Pnlp8-YeaS-rrnB终止子盒和Pomp-CysE5盒的质粒。

(1-3)将cysE5、yeaS导入P.ananatis SC17株

上述的pMT-EY2具备来源于pMIV-5JS(特开2008-99668)的Mu噬菌体附着位点(attachment site)。通过使质粒与具有Mu转座酶(Mu transposase)的辅助质粒pMH10(Zimenkov D.et al.，Biotechnologiya(俄语)，6，1-22(2004))在同一细胞内共存，可以将该pMT-EY2质粒上以被Mu噬菌体的附着位点包夹的形式存在的含有氯霉素抗性标记的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnBterminator(终止子)盒插入到P.ananatis SC17(美国专利6596517)菌株的染色体上。而且，由于在质粒pMT-EY2上存在的氯霉素抗性标记具有夹在2个λ噬菌体的辅助位点(λattR和λattL)之间的结构，可以通过后述的方法将氯霉素抗性标记除去。

首先，将通过电穿孔向SC17菌株中导入了pMH10而得到的菌株在含有20mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基上30℃过夜培养来进行选择。将得到的转化菌株在30℃下培养，并进一步通过电穿孔向该菌株中导入pMT-EY2。将这个用pMH10和pMT-EY2两者转化的菌株在42℃，20分钟的条件下进行热冲击，然后在含有20mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上选择氯霉素抗性菌株的菌落。此时培养温度为39℃。通过上述方法，获得约50个克隆，通过分别在LB琼脂培养基上在39℃下培养48小时，进行pMH10以及pMT-EY2的消除(curing)。获得了因在染色体上插入了盒而显示出氯霉素抗性，且作为消除了两个质粒的结果对卡那霉素以及氨苄青霉素显示敏感性的菌株。随后，以该菌株的染色体DNA为模板，使用P11和P16作为引物，通过PCR确认了得到的菌株的染色体上目的盒的插入。得到的全部克隆分别命名为EY01～EY50，进行EY01～EY50菌株的L-半胱氨酸生产培养。培养通过下述方法进行。结果，筛选出L-半胱氨酸生产最多的克隆EY19菌株。

通过来源于λ噬菌体的切出系统除去EY19菌株中导入的氯霉素抗性标记。具体来说，用携带了λ噬菌体的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)转化EY19菌株，从得到的转化菌株中获得了显示氯霉素敏感性的EY19(s)菌株。

(1-4)由EY19(s)菌株制作cysPTWA基因表达强化菌株

接下来，为了强化cysPTWA基因的表达，将染色体上的在cysPTWA基因簇上游存在的启动子替换为上述的强启动子Pnlp8。首先以pMIV-Pnlp8-YeaS7为模板，使用P11以及P12通过PCR获得含有nlp8启动子约300bp的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、59℃20秒、72℃15秒循环20次，最后在72℃下5分钟。

将扩增得到的含有nlp8启动子的DNA片段利用克列诺片段处理后插入到用XbaI酶切后通过克列诺片段处理的质粒pMW118-(λatt L-KmR-λattR)(WO2006/093322A2)中，从而得到了质粒pMW-Km-Pnlp8。将pMW-Km-Pnlp8作为模板使用，并使用引物P19(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaaggtcatttat cccccaggaa aaattggtta，SEQ ID NO：59)和P20(tttcacaccg ctcaaccgcagggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg，SEQ ID NO：60)进行PCR，扩增得到含有Km-Pnlp8盒的约1.6kb的DNA片段。此时的PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、54℃20秒、72℃90秒循环30次，最后在72℃下5分钟。在两个引物上设计有作为染色体上的靶标用于通过λ依赖性整合(被称为“Red驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645))插入目的片段的序列(这种情况下为cysPTWA启动子附近的序列)。因此，在将得到的DNA片段通过该λ依赖性整合插入到目的菌株中时，在染色体上的cysPTWA基因的紧邻前方插入了Km-Pnlp8，从而形成了nlp8启动子连接cysPTWA基因的结构。在SEQ ID NO：43中显示了cysPTWA基因簇的碱基序列，在SEQID NO：44～46中显示了cysP、cysT、cysW各基因编码的氨基酸序列。SEQ IDNO：47、48分别显示了cysA基因的碱基序列，以及该基因编码的氨基酸序列。

P.ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株是用于高效进行λ依赖性整合的宿主菌株，是在对λRed基因产物抗性的P.ananatis菌株SC17(0)株中导入了表达λ的gam、bet和exo各基因(以下称作“λRed基因”)的辅助质粒RSF-Red-TER而得到的菌株(WO2008/075483)。SC17(0)株于2005年9月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(地址：Russia，117545Moscow，1 Dorozhny proezd.1)，保藏号VKPM B-9246。此外，该RSF-Red-TER质粒的构建方法在WO2008/075483中有详细描述。

在添加IPTG以诱导λRed基因的表达的条件下培养上述SC17(0)/RSF-Red-TER菌株，制备了电穿孔用的细胞。通过电穿孔向这些细胞中导入了上述的目的DNA片段，以卡那霉素抗性为指标，获得了通过λ依赖性整合而在cysPTWA基因上游插入了nlp8启动子的重组菌株。以获得的菌株的染色体DNA为模板，使用P21(ctttgtccct ttagtgaagg：SEQ IDNO：61)、P22(agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac：SEQ ID NO：62)作为引物，通过PCR反应，确认形成了目标Km-Pnlp8-cysPTWA结构，并将该菌株命名为SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株。

接下来，纯化SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株的染色体DNA，将10μg该染色体DNA通过电穿孔法导入到EY19(s)菌株中，获得卡那霉素抗性菌株。以得到的菌株的染色体DNA为模板，使用P21、P22作为引物利用PCR进行扩增，确认了在EY19(s)菌株的染色体上导入了Km-Pnlp8-cysPTWA结构。将通过上述方法获得的菌株命名为EYP197菌株。进一步，使用上述的pMT-Int-Xis2将卡那霉素抗性标记从染色体上除去，将变为卡那霉素敏感性的菌株命名为EYP197(s)菌株。

(1-5)由EYP197(s)菌株制作携带了突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA348)基因的菌株

通过下述的方法构建了serA348基因，该基因编码来源于Pantoea ananatis的3-磷酸甘油酸脱氢酶作为向L-半胱氨酸生产菌导入的3-磷酸甘油酸脱氢酶，且其编码的是用丙氨酸取代了第348位的天冬酰胺残基的突变型酶(N348A)(J.Biol.Chem.1996；271(38)：23235-8)。

Pantoea ananatis来源的野生型serA基因的序列如SEQ ID NO：49所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示。为了得到导入了上述突变的serA基因的3’侧的DNA片段，进行下述操作，以SC17菌株染色体DNA为模板，使用P23(agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa：SEQ ID NO：63)以及P24(gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc：SEQ ID NO：64)作为引物进行PCR(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃60秒循环25次，最后在72℃下5分钟)。接下来，为了同样地获得导入了突变的5’侧的DNA片段，以SC17菌株染色体DNA为模板，使用P25(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg：SEQ ID NO：65)和P26(aaaaccgccc gggcgttctc ac：SEQ ID NO：66)作为引物进行PCR(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃20秒循环20次，最后在72℃下5分钟)。通过限制性内切酶SmaI处理得到的两个PCR片段之后，通过DNA连接酶进行连接，得到含有目的突变(N348A)的突变型serA基因全长的DNA片段。以该DNA片段为模板，使用P23和P25作为引物，进行PCR扩增(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃75秒循环15次，最后在72℃下5分钟)。利用SalI、XbaI处理在P23和P25引物上设计的SalI、XbaI限制性内切酶位点之后，将其插入到同样用SalI、XbaI处理的pMIV-Pnlp8-ter中，制得pMIV-Pnlp8-serA348。

构建的pMIV-Pnlp8-serA348上携带了来源于pMIV-5JS(特开2008-99668)的Mu的附着位点。如果使用该质粒，则如上所述，通过使用具有Mu转座酶的辅助质粒pMH10，可以将含有氯霉素抗性标记的Pnlp8-serA348-rrnBterminator盒插入到P.ananatis SC17菌株的染色体上。在SC17(0)菌株中导入了质粒pMIV-Pnlp8-serA348以及pMH10，获得了在染色体上插入了Pnlp8-serA348-rrnB terminator盒的菌株。使用引物P11、P25，通过PCR确认了目的盒存在于细胞中。针对得到的50个克隆，测定细胞提取液中的3-磷酸甘油酸脱氢酶的活性，选择出活性最高的菌株，将其命名为SC17int-serA348菌株。接下来，将10μg的SC17int-serA348株的染色体DNA通过电穿孔导入到EYP197(s)菌株中，获得了氯霉素抗性菌株，使用引物P11、P25，通过PCR确认了在EYP197(s)菌株的染色体上与氯霉素抗性标记一起导入了Pnlp8-serA348的结构。将这样得到的菌株命名为EYPS1976株。

通过上述的利用pMT-Int-Xis2的标记清除方法，将氯霉素抗性标记除去，将获得的氯霉素敏感性菌株命名为EYPS1976(s)株。

(1-6)从EYPS1976(s)株出发制作gcd基因缺损株

从实施例1所述的SC17(0)::Δgcd株制备基因组DNA，通过电穿孔将其导入EYPS1976(s)株，以卡那霉素抗性为指标，从EYPS1976(s)株获得了gcd缺损株(EYPS 1976Δgcd株)。

(2)L-半胱氨酸生产菌EYPS1976(s)株与EYPS1976Δgcd株的培养

为了考察gcd基因缺损对L-半胱氨酸以及L-半胱氨酸前体O-乙酰丝氨酸的发酵生产的效果，使用L-半胱氨酸生产菌EYPS1976(s)株及由该菌株衍生的gcd缺损株EYPS1976Δgcd株进行了发酵生产培养，并对生产的L-半胱氨酸和O-乙酰丝氨酸的量进行了比较。培养使用了下述组成的L-半胱氨酸生产培养基。

对于各成分，分别预先制备10倍(成分1)、1000倍(成分2)、100/6倍(成分3)、100倍(成分5)、350g/L(成分6)、1000倍(成分7)、10倍(成分8)的保存溶液，并在使用时混合，并用灭菌水调整至规定量，从而制备成最终浓度。灭菌分别采用110℃、30分钟的高压灭菌(成分1、2、3、5、8)、180℃、5小时以上的干热灭菌(成分4)以及过滤灭菌(成分6、7)。

L-半胱氨酸生产培养按照下述规程进行。将EYPS1976(s)株和EYPS1976Δgcd株在LB琼脂培养基上涂布开，在34℃下进行过夜预培养，然后用10μL大小的接种环(NUNC公司Blueloop)从平板上2次挑取相当于约7cm的菌体，并接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2ml的L-半胱氨酸生产培养基中，使得培养开始时刻的菌体量基本相同。

分别在34℃和38℃下进行振荡培养，24小时后结束培养。确认了此时作为碳源的葡萄糖被完全消耗。按照Gaitonde，M.K.(Biochem J.1967Aug；104(2)：627-33.)中记载的方法对培养基中产生的L-半胱氨酸进行定量。此外，利用HPLC对培养基中产生的OAS(O-乙酰丝氨酸)进行了定量。此时，采用了将样品用200mM的Tris-HCl(pH9.0)稀释，使OAS转化为更稳定的NAS(N-acetylserine，N-乙酰丝氨酸)，再进行检测的方法。HPLC的条件如下。

柱：Inertsil ODS-3(疏水性柱/GL science公司制造)

缓冲液流速：1.0mL/min

柱温度：40℃

检测器：UV210nm

上样量：10mL

缓冲液：0.1M KH₂PO₄·H₃PO₄(pH2.2)、5mM 1-辛磺酸钠。

各菌株均进行了6组平行实验，各平均值和标准偏差如表2所示。由表2可知，gcd缺损在培养温度34℃及38℃均具有增加L-半胱氨酸和O-乙酰丝氨酸的效果。增加的幅度在38℃更为显著，可知，在高温培养中具有特别好的效果。此外，还可知，在38℃具有增加菌量(OD)的效果。

[表2]

表2gcd缺损株的L-半胱氨酸和NAS生产能力

〔序列表说明〕

SEQ ID NO：1：Pantoea ananatis的gcd基因的碱基序列

SEQ ID NO：2：Pantoea ananatis的GCD的氨基酸序列

SEQ ID NO：3：Pantoea ananatis的hisD基因的碱基序列

SEQ ID NO：4：用于将Km^r基因组入hisD基因的片段的扩增用引物

SEQ ID NO：5：用于将Km^r基因组入hisD基因的片段的扩增用引物

SEQ ID NO：6：cat基因扩增用引物

SEQ ID NO：7：cat基因扩增用引物

SEQ ID NO：8：sacB基因扩增用引物

SEQ ID NO：9：sacB基因扩增用引物

SEQ ID NO：10：含PlacUV5启动子的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：11：含PlacUV5启动子的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：12：含λRedαβγ基因以及tL3的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：13：含λRedαβγ基因以及tL3的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：14：含PlacUV5启动子和TrrnB的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：15：含PlacUV5启动子和TrrnB的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：16：attL扩增用引物

SEQ ID NO：17：attL扩增用引物

SEQ ID NO：18：attL的碱基序列

SEQ ID NO：19：attR扩增用引物

SEQ ID NO：20：attR扩增用引物

SEQ ID NO：21：attR的碱基序列

SEQ ID NO：22：含bla基因的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：23：含bla基因的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：24：含ter_rrnB的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：25：含ter_rrnB的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：26：含ter_thrL终止子的DNA片段的碱基序列

SEQ ID NO：27：含ter_thrL终止子的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：28：含ter_thrL终止子的DNA片段扩增用引物

SEQ ID NO：29：用于扩增gltA基因的ORF以外的部分的引物

SEQ ID NO：30：用于扩增gltA基因的ORF以外的部分的引物

SEQ ID NO：31：prpC基因扩增用引物

SEQ ID NO：32：prpC基因扩增用引物

SEQ ID NO：33：gcd缺损用引物

SEQ ID NO：34：gcd缺损用引物

SEQ ID NO：35：gcd缺损确认用引物

SEQ ID NO：36：gcd缺损确认用引物

SEQ ID NO：37：野生型cysE基因的碱基序列

SEQ ID NO：38：野生型cysE编码的丝氨酸乙酰转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：39：野生型yeaS基因的碱基序列

SEQ ID NO：40：野生型YeaS的氨基酸序列

SEQ ID NO：41：Pnlp0的碱基序列

SEQ ID NO：42：Pnlp8的碱基序列

SEQ ID NO：43：cysPTWA基因簇的碱基序列

SEQ ID NO：44：cysP基因编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：45：cysT基因编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：46：cysW基因编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：47：cysA基因的碱基序列

SEQ ID NO：48：cysA基因编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：49：Pantoea ananatis野生型serA基因的碱基序列

SEQ ID NO：50：Pantoea ananatis野生型serA基因编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：51～66：引物P11～P26

Claims

1.一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于在培养基中培养属于肠杆菌科且具有L-氨基酸生产能力的细菌，从而在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸；其中，所述细菌是固有地具备以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶的活性，但经过修饰而降低了该葡萄糖脱氢酶的活性的细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使编码所述葡萄糖脱氢酶(GCD)的gcd基因失活而降低了该葡萄糖脱氢酶的活性。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述gcd基因是编码SEQ IDNO：2的氨基酸序列的DNA或其变体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸中的一种或二种以上的L-氨基酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸或L-半胱氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸，且所述细菌中选自柠檬酸合酶、甲基柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶中的1种或2种以上的酶的活性得到了增强。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-半胱氨酸，且所述细菌中选自3-磷酸甘油酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶和硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统中的至少1种或2种以上的活性和/或yeaS基因的表达得到了增强。

8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述细菌是属于选自泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、摩根氏菌属(Morganella)和耶尔森菌属(Yersinia)中的属的细菌。