CN114072492A - 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产L‑酪氨酸的微生物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因，以及利用该微生物生产L‑酪氨酸的方法。

Description

生产L-酪氨酸的微生物及利用其生产L-酪氨酸的方法
技术领域
本公开涉及生产L-酪氨酸的微生物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸(prephenate)脱水酶的基因，以及利用该微生物生产L-酪氨酸的方法。
背景技术
L-酪氨酸是氨基酸中的一种，且是用于制药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂等的重要材料。为了生产L-酪氨酸和其它有用的材料，正在进行各种研究以开发高效生产的微生物和用于发酵工艺的技术。
通过微生物生产L-酪氨酸的过程始于糖酵解的中间体磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)(PEP)与磷酸戊糖途径的中间体赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-Phosphate)(E4P)的聚合反应生成3-脱氧-D-阿拉伯型-庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)(DAHP)。然后，通过共同的芳香族生物合成途径从分支酸(chorismate)到预苯酸生物合成DAHP，并通过L-酪氨酸生物合成途径最终转化为L-酪氨酸。在此过程中，分支酸可以分枝成L-色氨酸，且预苯酸可以分枝成L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。因此，当共同的芳香族生物合成途径得到加强以增加L-酪氨酸的产生量时，可以预期L-色氨酸和L-苯丙氨酸的产生也将同时增加。即为了生产L-酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸作为副产物也一起产生，因此必须进行诸如基因重组、纯化等各种研究。同时，已知L-色氨酸的产生根据微生物产生L-色氨酸的浓度，由阻遏物和弱化子调节(韩国专利号10-0792095B1)。
发明内容
[技术问题]
在这些情况下，本发明人进行了广泛的努力，以开发能够高效生产L-酪氨酸的微生物，且结果，他们已经确认了当生产L-苯丙氨酸的基因被生产L-色氨酸的操纵子的启动子调节时，L-酪氨酸的生产产率
Figure BDA0003261033510000011
增加到高水平，从而完成了本公开。
[技术手段]
本公开的一个目的是提供生产L-酪氨酸的微生物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
本公开的另一目的是提供生产L-酪氨酸的方法，其包括在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收L-酪氨酸。
本公开的又一目的是提供表达盒，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
本公开的又一目的是提供使用trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因来调节预苯酸脱水酶活性的方法。
本公开的又一目的是提供用于L-酪氨酸生产的生产L-酪氨酸的微生物的用途。
本公开的又一个目的是提供用于L-酪氨酸生产的表达盒的用途。
本公开的又一个目的是提供用于L-酪氨酸生产的组合物的用途。
[有益效果]
本公开的生产L-酪氨酸的微生物包括编码预苯酸脱水酶的基因和trp操纵子调节区，在不影响细胞生长的同时，最小化了L-苯丙氨酸的积累，并且能够高效地产生L-酪氨酸。
具体实施方式
本公开详细描述如下。同时，本公开中公开的各个描述和实施方式也可应用于其它描述和实施方式。即，在本公开中公开的各种要素的所有组合落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不能被认为受到以下具体描述的限制。
为实现上述目的，本公开的一个方面提供了生产L-酪氨酸的微生物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
如本文所用，术语“L-酪氨酸”是20种α-氨基酸中的一个，并分类为亲水性氨基酸或芳香族氨基酸。酪氨酸是作为药物、黄酮类、生物碱等的前体使用的商业上重要的氨基酸。
如本文所用，术语“色氨酸操纵子(Trp操纵子)”是指编码参与从分支酸(chorismic acid；chorismate)合成色氨酸的酶的一组基因，并且包括结构基因和表达调节区(或调节区，regulatory region)。具体地，色氨酸操纵子可以是源自棒杆菌属(genusCorynebacterium)微生物的色氨酸操纵子，或源自埃希氏菌属(genus Escherichia)微生物的色氨酸操纵子，但只要其能够调节本公开的pheA基因，则可以不受限制地包括各种来源的色氨酸操纵子。具体地，棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，且埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌(E.coli)，但微生物不限于此。另外，色氨酸操纵子可以具有已知的核苷酸序列，且本领域技术人员可以容易地从诸如NCBI或Kegg等数据库中获得色氨酸操纵子的核苷酸序列。通常色氨酸操纵子被积极转录，以产生细胞所需的足够量的色氨酸，但是当细胞中存在足够的色氨酸时，阻遏物结合色氨酸并使色氨酸操纵子失活，从而抑制转录。在本公开中，上述术语可与色氨酸操纵子、trp操纵子等互换使用。
如本文所用，术语“trp操纵子调节区”是指存在于构成trp操纵子的结构基因的上游并能调节结构基因表达的区域。棒杆菌属的微生物中构成trp操纵子的结构基因可能由trpE、trpG、trpD、trpC、trpB和trpA基因组成，且埃希氏菌属的微生物中构成trp操纵子的结构基因可能由trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因组成。trp操纵子调节区可能存在于trp操纵子结构基因的5’位置处的trpE的上游。具体地，它可以包括不包含可能构成trp操纵子的结构基因的trp调节子(trp R)、启动子(trp启动子)、操纵子(trp操纵子)、trp先导肽(trp L)和trp弱化子。更具体地，它可以包括启动子(trp启动子)、操纵子(trp操纵子)、trp先导肽(trp L)和trp弱化子(trp弱化子)。在本公开中，trp操纵子调节区可包括但不限于位于编码预苯酸脱水酶的pheA基因上游的任何调节区，并可调节pheA基因的表达。在本公开中，trp操纵子调节区可与trp操纵子调节因子、trpE启动子、trp操纵子启动子、trpE调节区、trpE调节因子、和trpE调节序列互换使用。
例如，trp操纵子调节区可以包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，但不限于此。SEQ IDNO:1的序列可以从NCBI的GenBank(已知的数据库)中确认。
具体地，trp操纵子调节区可以由SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的核苷酸序列组成。此外，明显地，只要其核苷酸序列具有这种同源性或同一性，并且具有对应于该调节区的功能，具有部分序列的缺失、修饰、取代或添加的调节区也落入本公开的范围内。
本文所用，术语“同源性”和“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并可以用百分比来表示。术语“同源性”和“同一性”经常彼此互换使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可与由正在被使用的程序建立的默认空位罚值(default gap penalty)一起使用。基本上，通常预期同源性或同一性序列在中等或高度严格的条件下与全部序列或序列全长的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％杂交。在多核苷酸杂交中也考虑含有代替密码子的简并密码子的多核苷酸。
多肽或多核苷酸序列的同源性或同一性可以根据例如文献的BLAST算法[参见：Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或根据Pearson的FASTA(参见：Methods Enzymol.,183,63,1990)来确定。基于算法BLAST，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见：www.ncbi.nlm.nih.gov)。进一步，任何氨基酸或多核苷酸序列是否彼此具有同源性、相似性或同一性，其可以通过在限定的严格条件下在Southern杂交实验中通过比较序列来鉴定，并且限定的适当杂交条件在本领域技术的范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法来确定(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology)
本文所用的，术语“预苯酸脱水酶”是生物合成L-苯丙氨酸所必要的蛋白质中的一种。编码蛋白质的基因可以是例如pheA基因，但不限于此。该蛋白质也可称为双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶。由于预苯酸脱水酶是从分支酸或预苯酸产生L-苯丙氨酸的途径中的酶，并且是与酪氨酸生物合成途径竞争的步骤中的酶，因此它通常被选为使产生酪氨酸的菌株产生失活的目的基因。然而，当预苯酸脱水酶被失活时，存在生产性大大降低的问题，因为它影响了菌株的生长。
在本公开中，已经被基因修饰使得pheA基因由trp操纵子调节区调节的微生物，具体地，其中将trp操纵子的调节区应用于用于调节pheA的启动子区域的微生物使苯丙氨酸的积累最小化，同时对细胞生长没有影响，并且有效地提高酪氨酸的生产。
另外，pheA基因(其是编码预苯酸脱水酶的基因)可能具有存在于pheA结构基因上游的部分或全部调节序列的缺失。为了本公开的目的，pheA结构基因的上游区域可以被trp操纵子调节区取代，或者可以将trp操纵子调节区插入到pheA结构基因的上游区域中，以包括能够通过trp操纵子调节区对pheA基因编码的蛋白的表达进行调节的pheA结构基因。如本文所用，术语“pheA基因”可以与“编码预苯酸脱水酶的基因”和“pheA结构基因”互换使用。
如本文所用，术语“生产L-酪氨酸的微生物”是指自然具有L-酪氨酸产生能力的微生物，或向其不具有L-酪氨酸产生能力的亲本菌株赋予L-酪氨酸产生能力的微生物。具体地，微生物可以是包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的生产L-酪氨酸的微生物，但不限于此。
具体地，“生产L-酪氨酸的微生物”包括所有野生型微生物和自然或人工基因修饰的微生物，且其可以是为了期望的L-酪氨酸产生而具有遗传修饰或增强活性的微生物，所述微生物可以是其中由于外源基因的插入或内源性基因的活性的加强或失活而使特定机制减弱或加强的微生物。为了本公开的目的，生产L-酪氨酸的微生物包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因，并且具有增加的L-酪氨酸产生能力，并且可以是遗传修饰的微生物或重组微生物，但不限于此。
更具体地，本公开中具有L-酪氨酸产生能力的微生物是指通过包括本公开的trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因，或者通过转化到包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的载体中，而具有增强的L-酪氨酸产生能力的重组微生物。
在本公开中，“包括基因的微生物”可以意指“遗传修饰的微生物”、“经过修饰以表达基因的微生物”、“表达基因的重组微生物”或“具有基因编码的蛋白质的活性的重组微生物”，但不限于此。
例如，它可以是i)包括本公开的trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的微生物，ii)被修饰以表达trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的微生物，iii)表达trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的重组微生物，和iv)以包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的载体转化而具有增强的L-酪氨酸产生能力的重组微生物，但不限于此。
“具有增强L-酪氨酸产生能力的微生物”可指与亲本菌株或转化前未修饰的微生物相比具有增强的L-酪氨酸产生能力的微生物。“未修饰的微生物”可以是天然菌株本身或尚未以包括编码多核苷酸和目标蛋白的基因的载体转化的微生物。
作为用于本公开目的的微生物，可以包括通过包含trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因而能够产生L-酪氨酸的所有微生物。在本公开中，“能够产生L-酪氨酸的微生物”可以与“生产L-酪氨酸的微生物”和“具有L-酪氨酸产生能力的微生物”互换使用。
该微生物可以是例如，属于肠杆菌属(genus Enterbacter)的微生物、属于埃希氏菌属(genus Escherichia)的微生物、属于欧文氏菌属(genus Erwinia)的微生物、属于沙雷氏菌属(genus Serratia)的微生物、属于普罗威登斯菌属(genus Providencia)的微生物、属于棒杆菌属的微生物和属于短杆菌属(genus Brevibacterium)的微生物，但不限于此。
具体地，微生物可以是属于棒杆菌属的微生物。在本公开中，“属于棒杆菌属的微生物”可以具体为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。
本公开的另一方面提供了生产L-酪氨酸的方法，其包括在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收L-酪氨酸。
在上述方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行，但不特别限于此。特别地，关于培养条件，可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)将培养物的pH调节到合适的pH(例如，pH 5至9，具体地，pH 6至8，和最具体地，pH 7.0)，但不特别限于此。另外，为了维持好氧状态，可以将氧或含氧气体混合物注入到培养物中。培养温度可维持在20℃至45℃下，具体地在25℃至40℃下，且培养可进行约10小时至160小时，但培养不限于上述条件。由培养产生的氨基酸可以被分泌到培养基中，或可保留在细胞中。
进一步，作为用于待用培养基的碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、向日葵油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)可以单独或组合使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮的有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)可以单独或组合使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等可以单独使用或组合使用，但磷源不限于此。此外，培养基中可能含有诸如其它金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素的必须促生长物质。
在本公开的用于回收在培养步骤中产生的氨基酸的方法中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养溶液中收集目标氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收目标氨基酸。
此外，回收步骤可以进一步包括纯化过程，并且其可以使用本领域已知的适当方法来执行。因此，回收的氨基酸可以处于纯化状态或含有氨基酸的微生物发酵液的形式(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。进一步，在培养步骤之前和之后，以及在回收步骤之前和之后，通过进一步进行本领域已知的适当方法，可以有效地回收目标氨基酸。
本发明的又一方面提供了表达盒，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
在本公开中，术语“表达盒”可以是基因构建单元，其包括可操作地连接到基因的必要调节元件，使得当引入的基因存在于个体的细胞中时表达。表达盒可以是例如表达载体的形式，但不限于此，并且可以包括具有能够表达待引入的目标基因的最小单元的所有基因构建体。
表达盒可以用标准的重组DNA技术制备和纯化。只要它能够在各种宿主细胞(如原核细胞和真核细胞)中起作用以表达期望的基因，并且只要它能够起作用以产生期望的蛋白，则任何类型的表达盒都可以使用而没有特别的限制。表达盒可包括启动子、起始密码子、编码目标蛋白的基因、或终止密码子。此外，它可以适当地包括编码信号肽的DNA、增强子序列、目标基因的5’和3’端的非翻译区域、选择标记区域、或可复制单元等。此外，表达盒可以包括包含编码一个蛋白质的多核苷酸的单顺反子载体，或包括编码两个或更多重组蛋白质的多核苷酸的多顺反子载体，但不限于此。
如本文所用，术语“载体”可指含有编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接到合适的调节序列，使得目标蛋白能够在适当的宿主中表达。调节序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列、以及调节转录和翻译终止的序列。在被转化到合适的宿主细胞中后，载体可以与宿主基因组无关地被复制或起作用，或者可以被整合到宿主基因组本身中。
本公开中使用的载体只要其能够在宿主细胞中表达则不受特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的那些载体。具体地，可以使用载体pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC等，但不限于此。
可用于本公开中的载体不受特别限制，且可以使用已知的表达载体。另外，编码目标蛋白的基因或多核苷酸可以通过载体被插入到染色体中用于细胞内染色体插入。多核苷酸插入到染色体中可以通过本领域已知的任何方法(例如，通过同源重组)进行，但是不限于此。另外，载体可以进一步包括选择标记用于确认插入到染色体中与否。选择标记用于选择已经以载体转化的细胞，即，确认是否已经插入了目标多核苷酸，且可以使用能够显示抗药性、辅源营养(营养缺陷，
Figure BDA0003261033510000071
)、对细胞毒性剂的抗性或提供可选择表型(如表面蛋白的表达)的标记。在选择剂处理的环境中，只有能够表达选择标记的细胞才可以存活或者表达其它的表型性状，且因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”是指将包括编码目标多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这样的方式由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它可以被插入到宿主细胞的染色体中并位于其中，或者位于染色体外，且两种情况可以都被包括。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入到宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入到宿主细胞中，表达盒是包括自主表达所需的所有元件的基因构建体。转化方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行。例如，转化可以经由电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、醋酸锂-DMSO技术等进行，但方法不限于此。
进一步，如本文所用，术语“可操作地连接”是指上述多核苷酸序列与启动子序列或调节区之间的功能连接，启动子序列启动和介导编码本公开的目标蛋白的多核苷酸的转录。可操作的连接可以通过本领域已知的基因重组技术制备，并且可以使用已知的裂解酶、连接酶等执行位点特异性DNA切割和连接，但这些不限于此。
本发明的又一方面提供了用于生产L-酪氨酸的组合物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
用于生产L-酪氨酸的组合物包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因，并且可以进一步不受限制地包括能够操作该基因或操纵子调节区的构型。编码预苯酸脱水酶和trp操纵子调节区的基因可以是被包括在载体内的形式，使得能够在引入的宿主细胞中表达可操作地连接的基因。pheA基因——其是编码预苯酸脱水酶的基因——的表达可以受trp操纵子调节区调节。
本公开的又一方面提供了使用trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因来调节预苯酸脱水酶的活性的方法。
本公开的又一方面提供了用于生产L-酪氨酸的生产L-酪氨酸的微生物的用途。
本公开的又一方面提供了用于生产L-酪氨酸的表达盒的用途。
本公开的又一方面提供了用于L-酪氨酸生产的组合物的用途。
[实施发明的方式]
在下文中，将参考以下实施例详细描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：生产L-酪氨酸的菌株的构建
虽然野生型谷氨酸棒杆菌具有产生L-酪氨酸的能力，但它不会产生过量的L-酪氨酸以被释放到培养基中。根据本公开的目的，为了鉴定增加L-酪氨酸产生能力的遗传性状，使用了具有增加的L-酪氨酸产生能力的菌株而不是野生型菌株。因此，基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869菌株，通过增强L-酪氨酸生产所必需的基因，构建了生产L-酪氨酸的菌株。
首先，为了增强作为L-酪氨酸前体的赤藓糖-4-磷酸(E4P)的供应，tkt基因被过表达。同时，删除将L-酪氨酸引入到细胞中的芳香族氨基酸导入基因(importer gene)aroP。
为了进行遗传操作，首先获得了待将tkt基因通过取代插入其中的aroP基因的下游和上游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的引物获得了在aroP基因的下游区域中的基因片段，并利用SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5的引物获得了在aroP基因的上游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
另外，为了获得包括tkt启动子的tkt基因，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物，获得了包括tkt启动子的tkt基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合150秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
使用Gibson装配(组装，
Figure BDA0003261033510000082
)方法(DG Gibson等人,NATURE METHODS,VOL.6NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)克隆了aroP启动子的扩增的上游和下游区域、包括tkt启动子的tkt基因片段、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ(韩国专利号10-0924065)，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔaroP::Pn-tkt。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
用于构建各个载体的引物序列如下表1中所示。
[表1]
Figure BDA0003261033510000081
Figure BDA0003261033510000091
通过电穿孔将构建的pDZ-ΔaroP::Pn-tkt载体转化到谷氨酸杆菌ATCC 13869菌株中，以及然后进行二次交换(交叉，
Figure BDA0003261033510000093
)，以获得缺失aroP基因同时将包括tkt启动子的tkt基因插入其中的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的引物(能分别扩增插入对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0001。
[表2]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
8 ACGCGCCAAGTCGGACG
9 CGCACGATGTTTACCTGCG
为了强化L-酪氨酸途径，将谷氨酸棒杆菌所具有的接受通过L-酪氨酸的反馈调节的tyrA基因替换为包括强gapA启动子的源自大肠杆菌(E.coli)的不接受反馈调节的变体tyrA。已知，在源自大肠杆菌的tyrA蛋白中，当第53位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，且第354位的丙氨酸突变为缬氨酸时，解除(释放，
Figure BDA0003261033510000092
)反馈，并且使用了这种形式的蛋白质(SEQID NO:10)(Appl.Microbiol.Biotechnol.75,103-110(2007))。
为了遗传操作，首先获得待将tyrA基因通过取代插入其中的tyrA基因的上游区域和下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的引物获得了tyrA基因的上游区域中的基因片段，并利用SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14的引物获得了tyrA基因的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
另外，为了获得包括gapA启动子的源自大肠杆菌的变体tyrA基因，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，获得了gapA启动子片段，并基于源自大肠杆菌的变体的tyrA合成的DNA为模板，通过PCR利用SEQID NO:17和SEQ ID NO:18的引物，获得了源自大肠杆菌的变体tyrA基因片段。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
用Gibson装配方法克隆了tyrA基因的扩增的上游和下游区域、包括gapA启动子的源自大肠杆菌的变体tyrA基因片段、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
用于各个构建载体的引物序列如下表3中所示。
[表3]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
11 TTCGAGCTCGGTACCCTATCAAAACCGAGTTCTTCC
12 GTCGTTTTTAGGCCTCCTGACAAGTGTGGCACATAC
13 TGACAATCGCCAGTAATTTTATCGGCTGATGATTCT
14 ACTCTAGAGGATCCCCAACGCGATTGCATTCGGCTC
15 GTGCCACACTTGTCAGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
16 TCAATTCAGCAACCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
17 TTAGAGGAGACACAACATGGTTGCTGAATTGACCGC
18 TCATCAGCCGATAAAATTACTGGCGATTGTCATTCG
将构建的pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm载体通过电穿孔转化到CM06-0001菌株中，以及然后进行二次交换，以获得缺失tyrA基因同时将包括gapA启动子的源自大肠杆菌的变体tyrA基因插入其中的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物(能分别扩增插入对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0002。
[表4]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
19 GCCCACTAGTCGAATCCC
20 CTGTCCGCAACCTGTGCG
为了增加L-酪氨酸的生产，将参与共同芳香族生物合成途径的第一步的aroG基因通过向源自大肠杆菌的反馈调节解除的变体aroG添加强启动子而被增强。已知，在源自大肠杆菌的aroG蛋白中，当在第150位的脯氨酸被亮氨酸取代时，反馈被解除，并且使用了这种形式的蛋白质(SEQ ID NO:68)(Appl.Environ.Microbiol.63,761-762(1997))。
为了遗传操作，获得了aroG待被进一步插入其中的下游和上游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物获得了BBD29_14470基因的上游区域中的基因片段，并利用SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:24的引物获得了BBD29_14470基因的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了变体aroG待被进一步插入其中的扩增的上游和下游区域、和通过SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔBBD29_14470。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
另外，为了获得包括gapA启动子的源自大肠杆菌的变体aroG基因，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26的引物，获得了gapA启动子片段，并基于源自大肠杆菌的反馈解除变体aroG合成的DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，获得了源自大肠杆菌的变体aroG基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
用Gibson装配方法克隆了包括gapA启动子的扩增的突变aroG基因片段、和由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ-ΔBBD29_14470，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
用于构建各个载体的引物序列如下表5中所示。
[表5]
Figure BDA0003261033510000111
Figure BDA0003261033510000121
将构建的pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm载体通过电穿孔转化到CM06-0002菌株中，以及然后进行二次交换，以获得包括gapA启动子的源自大肠杆菌的反馈解除变体aroG基因被插入其中的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物(能分别扩增插入对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0003。
[表6]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
29 TTGATATGACCGCAGCCTGA
30 CTGCATTCTCATCGATCTTG
实施例2：生产L-酪氨酸的菌株的生产能力评价
为了确认实施例1中构建的菌株的L-酪氨酸产生能力，按以下方式对菌株进行培养和评价。将各菌株接种到含有25mL的以下的种子培养基的250-mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养了20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有25mL的以下的生产培养基的250-mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养了24小时。培养后通过HPLC测量了L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生产量。
<种子培养基(pH7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、和2000μg烟酰胺(每升蒸馏水)
<生产培养基(pH 8.0)>
30g葡萄糖、15g(NH4)2SO4、1.2g MgSO4·7H2O、1g KH2PO4、5g酵母提取物，900μg生物素、4500μg盐酸硫胺素、4500μg泛酸钙和30g CaCO3(每升蒸馏水)。
[表7]
Figure BDA0003261033510000131
野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869、CM06-0001、CM06-0002和CM06-0003的L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸生产结果如表7中所示。
从野生型菌株中通过缺失芳香族氨基酸导入基因制备的增强前体E4P供应的菌株CM06-0001中不产生L-酪氨酸，其中tyrA反馈抑制在CM06-0001中被进一步解除的CM06-0002中也未检测到L-酪氨酸。
在CM06-0003菌株中确认了L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的产生，其中通过解除CM06-0002菌株中的aroG的反馈抑制增强了共同芳香族化合物产生途径。另外，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的产生较先前菌株显著增加，但L-色氨酸产生显示无显著变化。
实施例3：生产L-酪氨酸的菌株中pheA基因的缺失
确认了在实施例2中增强了共同芳香族产生途径时，产生了最大量的L-苯丙氨酸，接着是L-酪氨酸的产生，以及产生了少量的L-色氨酸。因此，可以预期，如果L-苯丙氨酸产生途径被缺失，则L-酪氨酸和L-色氨酸的产生将增加。
为了缺失L-苯丙氨酸产生途径，缺失了参与从预苯酸分支出的第一步的基因pheA。为了这样的基因缺失，首先获得了pheA基因的上游和下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物获得了pheA基因的上游区域中的基因片段，并利用SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的引物获得了pheA基因的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了pheA基因的扩增的上游和下游区域、和由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔpheA。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
用于构建各个载体的引物序列如下表8中所示。
[表8]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
31 TTCGAGCTCGGTACCCCCGACCAGGCCACACGCG
32 AATAATCCGGCCGGCCATGGGGTTACACAGCTTAACCCGC
33 CGGGTTAAGCTGTGTAACCCCATGGCCGGCCGGATTATT
34 CGACTCTAGAGGATCCCCGCTGACAACAGCAACGTCG
将构建的pDZ-ΔpheA载体通过电穿孔转化到CM06-0003菌株中，以及然后进行二次交换，以获得其中缺失pheA的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的引物(能分别扩增缺失对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0004。
[表9]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
35 CCAGCGATGATCGCGCCG
36 ATCGCCGTGGAGCCAGCC
实施例4：其中缺失pheA基因的生产L-酪氨酸的菌株的生产能力评价
为了确认实施例3中构建的菌株的L-酪氨酸产生能力，使用实施例2中描述的方法和培养基组成培养了菌株。
[表10]
Figure BDA0003261033510000141
Figure BDA0003261033510000151
生产L-酪氨酸的菌株CM06-0003和CM06-0004的培养物中L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸产生结果示于上表10中。其中缺失pheA的CM06-0004菌株随着L-苯丙氨酸的产生显著下降而将L-酪氨酸作为主要产物产生，与实施例2中一样，观察到了L-色氨酸的生产无显著变化。
然而，由于CM06-0004菌株不能产生L-苯丙氨酸，其只能依靠培养基的酵母提取物中含有的L-苯丙氨酸来生长，且显示了与其中未缺失pheA的菌株相比糖消耗仅为约1/3。即确认了当在微生物中缺失pheA基因时，其对菌株的生长有很大影响，从而使菌株不能被利用用于生产目标产物的目的。
实施例5：其中pheA基因被取代的生产L-酪氨酸的菌株的构建
根据实施例2和4的结果，可以预测L-色氨酸浓度被精确地调节，使得L-色氨酸在培养期间始终维持低浓度的同时细胞的生长不受干扰。文献中也已知L-色氨酸的产生由根据L-色氨酸浓度的弱化子和启动子同时调节(Appl.Environ Microbiol 59 791,1993)。
因此，L-苯丙氨酸产生基因pheA经受L-色氨酸的调节机制，从而pheA基因可以根据L-色氨酸的浓度被调节。
特别地，作为对照，除了允许pheA被L-色氨酸浓度调节的trpE调节区之外，还构建并比较了插入有允许pheA被L-异亮氨酸浓度调节的ilvB启动子、和允许pheA被L-亮氨酸浓度调节的leuA启动子和leuC启动子的菌株。
为了允许pheA基因被trpE基因的调节区所调节，获得了待将基因插入其中的上游区域、trpE调节区、和待将基因插入其中的下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物获得了待将基因插入其中的上游区域中的基因片段；利用SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物获得了trpE调节区中的基因片段；利用SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的引物获得了待将基因插入其中的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合150秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了待将基因插入其中的扩增的上游和下游区域、trpE调节区、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔPpheA::PtrpE。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
为了允许pheA基因被ilvB基因的启动子调节，获得了待将基因插入其中的上游区域、ilvB基因的启动子区域、和待将基因插入其中的下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:43的引物获得了待将基因插入其中的上游区域中的基因片段；利用SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的引物获得了ilvB基因的启动子区域中的基因片段；利用SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:42的引物获得了待将基因插入其中的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了待将基因插入其中的扩增的上游和下游区域、ilvB基因的启动子区域、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔPpheA::PilvB。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
为了允许pheA基因被leuA基因的启动子调节，获得了待将基因插入其中的上游区域、leuA启动子区域、和待将基因插入其中的下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:47的引物获得了待将基因插入其中的上游区域中的基因片段，利用SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的引物获得了leuA启动子区域中的基因片段，利用SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:42的引物获得了待将基因插入其中的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了待将基因插入其中的扩增的上游和下游区域、leuA基因的启动子区域、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔPpheA::PleuA。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
为了允许pheA基因被leuC启动子调节，获得了待将基因插入其中的上游区域、leuC启动子区域、和待将基因插入其中的下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:51的引物获得了待将基因插入其中的上游区域中的基因片段，利用SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的引物获得了leuC启动子区域中的基因片段，利用SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:42的引物获得了待将基因插入其中的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了待将基因插入其中的扩增的上游和下游区域、leuC基因的启动子区域、以及由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔPpheA::PleuC。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
将构建的pDZ-ΔPpheA::PtrpE、pDZ-ΔPpheA::PilvB、pDZ-ΔPpheA::PleuA、和pDZ-ΔPpheA::PleuC载体通过电穿孔转化到CM06-0003菌株中以及然后进行二次交换，以获得其中pheA基因被允许受trpE调节区或ilvB、leuA或leuC的启动子的调节的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物(能分别扩增插入对应调节区或启动子的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的基因操作。其中trpE调节区被插入到pheA上游的所得菌株命名为CM06-0005，其中ilvB启动子被插入的所得菌株命名为CM06-0006，其中leuA启动子被插入的所得菌株命名为CM06-0007，且其中leuC启动子被插入的所得菌株命名为CM06-0008。
用于构建各个载体的引物序列如下表11中所示。
[表11]
Figure BDA0003261033510000171
Figure BDA0003261033510000181
实施例6：生产L-酪氨酸的菌株的pheA基因启动子取代菌株的生产能力评价
为了确认实施例5中构建的菌株的L-酪氨酸产生能力，使用实施例2中所述方法和培养基组成培养了菌株。
[表12]
Figure BDA0003261033510000182
生产L-酪氨酸的菌株CM06-0003、CM06-0004、CM06-0005、CM06-0006、CM06-0007和CM06-0008的培养物中L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸产生结果如上表12中所示。
对于其中缺失pheA的CM06-0004菌株，L-酪氨酸以5.08％的产率生产。因此，在其中允许L-苯丙氨酸途径被L-色氨酸浓度调节的CM06-0005菌株的情况下，它在少量产生L-苯丙氨酸的同时产生了L-酪氨酸，因此，与其中L-苯丙氨酸途径未被调节的CM06-0003菌株相比，可以预期L-酪氨酸的更高产率，而与其中缺失L-苯丙氨酸途径的CM06-0004菌株相比，可以预期其更低产率。然而，与预期的相反，CM06-0005菌株与CM06-0004菌株相比显示了提高的生产能力，从而以5.37％的产率生产L-酪氨酸。CM06-0005的L-酪氨酸生产与其亲本菌株CM06-000相比3增加了283％，且与CM06-0004菌株相比增加了144％。
从以上结果可以确认，当允许pheA通过L-色氨酸浓度被调节时，L-酪氨酸的生产可以被显著增加到意想不到的水平。此外，作为类似于将L-色氨酸调节机制引入到pheA的对照，与其中允许pheA被L-异亮氨酸浓度调节的CM06-0006菌株以及其中允许pheA被L-亮氨酸浓度调节的CM06-0007和CM06-0008菌株相比，L-酪氨酸的产生被显著增加。因此，确认了将L-色氨酸调节机制引入到pheA中与pheA的缺失或其它调节机制的引入相比对L-酪氨酸产生具有更大的协同效果。
实施例7：非-PTS(non-PTS)的生产L-酪氨酸的菌株的pheA基因被缺失且启动子被 取代的菌株的构建
由于L-酪氨酸的生产始于作为前体的PEP和E4P，使用非磷酸转移酶系统(PTS)可以允许增强的PEP的供应，且因此可以预期L-酪氨酸的高产(Nature biotechnol 14 620,1996)。因此，将该菌株的PTS基因ptsG移除，并引入了源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)ATCC 10988的非-PTS基因glf。
为了缺失ptsG和插入glf，获得了待将源于运动发酵单胞菌的glf插入其中的上游和下游区域。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA为模板，通过PCR利用SEQ IDNO:57和SEQ ID NO:58的引物获得了在ptsG基因的上游区域中的基因片段，和利用SEQ IDNO:59和SEQ ID NO:60的引物获得了在ptsG基因的下游区域中的基因片段。SolgTM Pfu-XDNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，并在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
另外，为了获得包括公知的cj7启动子(SEQ ID NO:61,韩国专利号10-0620092)的glf基因，基于合成cj7启动子DNA作为模板，通过PCR利用SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的引物获得cj7启动子片段，并基于运动发酵单胞菌ATCC10988染色体DNA作为模板，通过PCR用SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的引物获得了glf基因片段。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶被用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟，然后30个循环(在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，并在72℃下聚合60秒)，然后在72℃下聚合5分钟。
利用Gibson装配方法克隆了ptsG基因的扩增的上游和下游区域、包括cj7启动子的glf基因片段、以及由ScaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ，以获得重组质粒，其命名为pDZ-ΔptsG::pcj7-glf。通过将Gibson装配试剂和各基因片段按计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行了克隆。
实施例中使用的引物序列如下表13中所示。
[表13]
SEQ ID NO: 序列(5'->3')
57 TTCGAGCTCGGTACCCGAGGGCTCACTGACGTTGA
58 CGCTGGGATGTTTCTACCGGATTCGATTCCTCAG
59 CGCTCCCAGAAGTAGGCTCAAACCTTGCCCATAAC
60 CTCTAGAGGATCCCCCTCCCCCAAACCACGCTTTT
62 GGAATCGAATCCGGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
63 TACTTTCAGAACTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGG
64 ACGAAAGGAAACACTCATGAGTTCTGAAAGTAGTC
65 GGGCAAGGTTTGAGCCTACTTCTGGGAGCGCCACA
将构建的pDZ-ΔptsG::pcj7-glf载体通过电穿孔转化到CM06-0003菌株中，以及然后进行二次交换，以获得包括cj7启动子的源自运动发酵单胞菌的glf基因被插入其中的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的引物(能分别扩增插入对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0009。
[表14]
SEQ ID NO: 序列(5'-3')
66 ACATTAAGTGGTAGGCGCTGA
67 CATAACAGGGCAGAACAAAC
将实施例3中构建的pDZ-ΔpheA载体通过电穿孔转化到以上构建的CM06-0003菌株中，以及然后进行二次交换，以获得其中缺失pheA基因的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的引物(能分别扩增缺失对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作，并将所得菌株命名为CM06-0011。
将实施例5中构建的pDZ-ΔPpheA::PtrpE、pDZ-ΔPpheA::PilvB、pDZ-ΔPpheA::PleuA、和pDZ-ΔPpheA::PleuC载体通过电穿孔转化到以上构建的CM06-0009菌株中以及然后进行二次交换，以获得其中将调节区或启动子中的每种插入pheA基因的上游的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物(能分别扩增插入对应调节区或启动子的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的基因操作。在pheA基因上游插入trpE调节区的所得菌株命名为CM06-0010，插入ilvB启动子的所得菌株命名为CM06-0012，插入leuA启动子的所得菌株命名为CM06-0013，且插入leuC启动子的所得菌株命名为CM06-0014。
实施例8：非-PTS生产L-酪氨酸的菌株的pheA基因被缺失且启动子被取代的菌株 的生产能力的评价
为了确认实施例7中构建的菌株的L-酪氨酸产生能力，使用实施例2中所述方法和培养基组成培养了菌株。
[表15]
Figure BDA0003261033510000211
生产L-酪氨酸的菌株CM06-0003、CM06-0009、CM06-0011、CM06-0010，CM06-0012、CM06-0013和CM06-0014的培养物中L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸生产结果如上表15中所示。
如预期，确认了L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的产生在CM06-0009中增加，与CM06-0003(其是PTS菌株)相比，非-PTS菌株能够增强PEP供应。同样，在这种情况下，没有观察到L-色氨酸产生的显著增加。
在基于非-PTS菌株的其中缺失pheA的CM06-0011菌株的情况中，确认了虽然L-酪氨酸以5.85％的产率生产与亲本菌株比增加了，但最终L-酪氨酸生产量与亲本菌株相比减少了，并且由于显著低的糖消耗率而降低了生产性。与实施例6一样，可以预期CM06-0010菌株可以以更低产率产生L-酪氨酸。然而，事实上，CM06-0010产生了产率为7.06％的L-酪氨酸，其与CM06-0011菌株相比增加了20.7％。另外，CM06-0010菌株的L-酪氨酸生产量与其亲本菌株CM06-0009相比增加了45％，且与CM06-0011菌株相比增加了多达91％。进一步，与其中允许pheA被L-异亮氨酸浓度调节的CM06-00012菌株以及其中允许pheA被L-亮氨酸浓度调节的CM06-00013和CM06-00014菌株相比，L-酪氨酸的生产被显著增加，从而确认了将L-色氨酸调节机制引入到pheA中与pheA的缺失或其它调节机制的引入相比对L-酪氨酸产生具有更大的协同效果。
实施例9：对L-酪氨酸类似物有抗性的微生物的筛选
在该实施例中，基于谷氨酸杆菌ATCC 13869为亲本菌株，为了解除通过L-酪氨酸的反馈抑制，利用人工突变方法进行了实验以选择对L-酪氨酸异羟肟酸(hydroxamate)(其是L-酪氨酸类似物)有抗性的菌株。
具体地，利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(以下简称NTG)通过人工诱变方法诱导了突变。将ATCC 13869菌株在种子培养基中培养18小时并接种到4mL的种子培养基中，以及然后培养直到OD660达到约1.0。离心培养基以回收细胞后，细胞用50mM Tris-苹果酸缓冲液(pH 6.5)洗涤了两次，并悬浮在最终体积为4mL的相同缓冲液中。向细胞悬液加入了NTG溶液(2mg/mL在0.05M Tris-苹果酸缓冲液(pH 6.5)中)至终浓度150mg/L，且允许所得物在室温静置20分钟以及然后离心以收集细胞，并用相同的缓冲液洗涤细胞2次以除去NTG。最终洗涤的细胞悬浮在4mL的20％甘油溶液中，且在-70℃下保存直到使用。将经NTG处理的菌株在含0.5g/L的L-酪氨酸异羟肟酸的基本培养基上进行平皿接种，并通过这个过程获得了100株对L-酪氨酸异羟肟酸有抗性的菌株。
实施例10：对L-酪氨酸异羟肟酸有抗性的菌株的L-酪氨酸产生能力的评价
对实施例9中获得的100株对L-酪氨酸异羟肟酸有抗性的菌株的L-酪氨酸产生能力进行了确认。将实施例9中获得的100株菌株各自接种到含有25mL种子培养基的250-mL角挡板烧瓶中，以及然后在30℃下以200rpm振荡培养了20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有24mL生产培养基的250-mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养了48小时。
培养结束后，通过HPLC测量了产生的氨基酸的量。在测试的100株菌株中，显示了优异的L-酪氨酸产生能力的前10名菌株的氨基酸的培养基浓度示于下表16中。通过上述过程鉴定出的10株候选菌株分别命名为ATCC 13869 YAR-1至ATCC 13869 YAR-10。
其中，选择了具有最高L-酪氨酸产生能力的ATCC 13869 YAR-6和ATCC 13869YAR-8菌株。
[表16]
Figure BDA0003261033510000231
实施例11：具有L-酪氨酸异羟肟酸抗性的菌株中pheA基因启动子取代
允许实施例10中选择的ATCC 13869 YAR-6和YAR-8菌株的pheA基因被trp操纵子的调节区所调节。为此，将实施例5中构建的pDZ-ΔPpheA::PtrpE通过电穿孔分别转化到13869 YAR-6和YAR-8菌株中，以及然后进行二次交换，以获得其中允许pheA基因被trpE调节区调节的菌株。通过基因组测序和利用SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物(能分别扩增插入对应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域)的PCR方法，确认了对应的遗传操作。trpE调节区被插入到pheA基因的上游的所得ATCC 13869 YAR-6和YAR-8菌株分别命名为YAR-6P和YAR-8P。
实施例12：其中pheA基因启动子被取代的L-酪氨酸异羟肟酸抗性ATCC 13869菌株 的生产能力的评价
为了确认实施例11中构建的菌株的L-酪氨酸产生能力，使用实施例2中所述方法和培养基组成培养了菌株。
[表17]
Figure BDA0003261033510000241
L-酪氨酸异羟肟酸抗性ATCC 13869菌株和其中pheA基因启动子被取代的菌株的培养物中的L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的产生结果示于上表17中。
如实施例6和8中所示，当允许pheA基因被trpE调节区调节时，可以预期L-苯丙氨酸产生的减少和L-酪氨酸产生的增加。在实际实验结果中，确认了ATCC 13869 YAR-6P和ATCC 13869 YAR-8P菌株显著降低了作为副产物的L-苯丙氨酸的生产，并且与L-苯丙氨酸生产的降低相比以更高水平增加了作为目标产物的L-酪氨酸的生产。基于这些结果，确认了当将L-色氨酸调节机制引入到pheA中时，可以在不降低糖消耗率的情况下，将L-酪氨酸的生成量显著增加到不可预期的水平，并且trp操纵子的调节区与pheA基因的组合对L-酪氨酸的产生具有显著的协同效果。
从以上结果确认，当允许pheA被L-色氨酸浓度调节时，L-酪氨酸的生产被显著增加到预料不到的水平。在具体的实施例中，确认了即使在随机突变的菌株中，以及在经过修饰以增加L-酪氨酸产生能力的菌株中，L-酪氨酸的生产也被显著增加到预料不到的水平。
CM06-0010菌株于2019年4月15日被保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12487P。
从前述，本公开所涉及领域的技术人员将能够理解，本公开可以在不修改本公开的技术概念或必要特征的情况下以其它具体形式体现。就这一点而言，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可包括在如由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其它实施方式。
Figure BDA0003261033510000251
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产L-酪氨酸的微生物及利用其生产L-酪氨酸的方法
<130> OPA20084-PCT
<150> KR 10-2019-0071797
<151> 2019-06-17
<160> 68
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 294
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 操纵子的调节区
<400> 1
taattgagac aagcttccca ctatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc 60
agtcaaagca cccagtggtg gtggcgcgct aactaagcga gcctgacacc tcaagttgtt 120
ttcactttga tgaatttttt aaggctcgta cttcgttcga cgaagaagcg ggccttttgt 180
ggtttttagc ccacaaccgg caagccctgg atcgaatgaa gctcgcagcg agtaattatt 240
tgatgtttcc cagaaaggct tcagccccac aatgatttcc tcggtaggtg cccc 294
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
tcgagctcgg taccctggga acttgtcgac gctat 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
tgttcggcaa gcattgtggt gtgggcaatg atcac 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
attaacggtt aaagtactca ttgtgaggtg gcggg 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ctctagagga tccccggagc tgctgtccaa cgtgg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccacaccaca atgcttgccg aacatttttc ttttc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
cacaatgagt actttaaccg ttaatggagt ccttg 35
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
acgcgccaag tcggacg 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
cgcacgatgt ttacctgcg 19
<210> 10
<211> 1122
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> tyrA 基因
<400> 10
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300
gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540
ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900
cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
gcccactagt cgaatccc 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ctgtccgcaa cctgtgcg 18
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
tcgagctcgg taccccccgg cggtatcgag gtagt 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gacaagttta gtactttaat cacccgcggg gaccc 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ggtgattaaa gtactaaact tgtcccgagg gtgag 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ctctagagga tcccctatca gtcacttccc tgaga 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gcgggtgatt aaagtgaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gttctgataa ttcatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
atgaattatc agaacgacga 20
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
cgggacaagt ttagtttacc cgcgacgcgc tttta 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ttgatatgac cgcagcctga 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ctgcattctc atcgatcttg 20
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ttcgagctcg gtacccccga ccaggccaca cgcg 34
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
aataatccgg ccggccatgg ggttacacag cttaacccgc 40
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cgggttaagc tgtgtaaccc catggccggc cggattatt 39
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cgactctaga ggatccccgc tgacaacagc aacgtcg 37
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ttcgagctcg gtacccggag gggtttccac ctcg 34
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tgggaagctt gtctcaatta tgtctgttgc tcaattagcg 40
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ctaattgagc aacagacata attgagacaa gcttccca 38
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
aattggtgcg tcgctcatgg ggcacctacc gaggaa 36
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ttcctcggta ggtgccccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
cgactctaga ggatcccccc gaagagttcg gctgcg 36
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
cagcgctaat cttggctctg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ctaattgagc aacagacaga gccaagatta gcgctgaa 38
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
aattggtgcg tcgctcatcc gctcaggggc ggcgg 35
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tccgccgccc ctgagcggat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ggggggaact ttggagtttg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ctaattgagc aacagacaaa ctccaaagtt ccccccc 37
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
aattggtgcg tcgctcattg tgttcaacct tcttaaaaag 40
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
ttaagaaggt tgaacacaat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
aaatgtaaga ttcaaagatg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 52
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
ctaattgagc aacagacatc tttgaatctt acatttcata g 41
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
aattggtgcg tcgctcatgg aactcaccgt ccttac 36
<210> 54
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
gtaaggacgg tgagttccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
ttcgagctcg gtacccgagg gctcactgac gttga 35
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
cgctgggatg tttctaccgg attcgattcc tcag 34
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cgctcccaga agtaggctca aaccttgccc ataac 35
<210> 60
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
ctctagagga tccccctccc ccaaaccacg ctttt 35
<210> 61
<211> 318
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> cj7 启动子
<400> 61
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300
caacgaaagg aaacactc 318
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
ggaatcgaat ccggtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
tactttcaga actcatgagt gtttcctttc gttgg 35
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
acgaaaggaa acactcatga gttctgaaag tagtc 35
<210> 65
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
gggcaaggtt tgagcctact tctgggagcg ccaca 35
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
acattaagtg gtaggcgctg a 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
cataacaggg cagaacaaac 20
<210> 68
<211> 1053
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> aroG 基因
<400> 68
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

Claims (9)

1.生产L-酪氨酸的微生物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述trp操纵子调节区位于所述编码预苯酸脱水酶的基因的上游。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述编码预苯酸脱水酶的基因是pheA基因。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述trp操纵子调节区选自trp调节子、trp启动子、trp操纵子、trp先导肽和trp弱化子。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述trp操纵子调节区由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。
6.生产L-酪氨酸的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1至5中任一项所述的微生物；以及从培养的所述微生物或所述培养基中回收L-酪氨酸。
7.表达盒，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因。
8.用于生产L-酪氨酸的组合物，其包括trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因、包括所述trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的表达盒、包括所述trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因的微生物、或其组合。
9.一种方法，所述方法利用trp操纵子调节区和与其可操作地连接的编码预苯酸脱水酶的基因来调节预苯酸脱水酶活性。
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