JPS619282A - 遺伝子組換え菌の培養方法 - Google Patents
遺伝子組換え菌の培養方法Info
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- JPS619282A JPS619282A JP12747284A JP12747284A JPS619282A JP S619282 A JPS619282 A JP S619282A JP 12747284 A JP12747284 A JP 12747284A JP 12747284 A JP12747284 A JP 12747284A JP S619282 A JPS619282 A JP S619282A
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- Japan
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- promoter
- gene
- microorganism
- trp
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は動物、植物及び微生物等から得た目的遺伝子ケ
導入した微生物により目的遺伝子の産物ケ大量に効率よ
く生産する方法に関するものである。
導入した微生物により目的遺伝子の産物ケ大量に効率よ
く生産する方法に関するものである。
し°発明の背景〕
最近、宿主微生物のベクタープラスミドに有用物質の生
産情報ケ有する遺伝子を組込んだ複合プラスミドを保持
する宿主微生物會用いて、該微生物に上記有用物質を大
量生産させる遺伝子組換え技術が発展してきた。この技
術により既にヒトインターフェロンやインスリン等が生
産されつつあり、大腸菌は宿主微生物として利用されて
いる。
産情報ケ有する遺伝子を組込んだ複合プラスミドを保持
する宿主微生物會用いて、該微生物に上記有用物質を大
量生産させる遺伝子組換え技術が発展してきた。この技
術により既にヒトインターフェロンやインスリン等が生
産されつつあり、大腸菌は宿主微生物として利用されて
いる。
しかし、目的遺伝子荀保持する遺伝子組換え菌、？用い
て目的の生産物ケ大量に工業生産する方法はまだ開発さ
れておらず、遺伝子組換え菌の効率的な培養方法の開発
が急がれている。
て目的の生産物ケ大量に工業生産する方法はまだ開発さ
れておらず、遺伝子組換え菌の効率的な培養方法の開発
が急がれている。
本発明の目的は遺伝子組換え菌の培養方法に関し、とく
にｔｒｐグロモータ下流に連結した目的遺伝子ケ有する
複合ブラスミドケ保持した大腸菌の効率的な培養方法ケ
提供するにある。
にｔｒｐグロモータ下流に連結した目的遺伝子ケ有する
複合ブラスミドケ保持した大腸菌の効率的な培養方法ケ
提供するにある。
本発明者らは遺伝子組換え菌の培養方法を開発するに当
り、ｔｒｐプロモータとβ−ｇａｔ （β−ガラクトシ
ダーゼ）遺伝子？連結した複合プラスミドＰ’ｌ’Ｒｇ
ＺＩを造成した。つぎにその造成方法紫述べる。
り、ｔｒｐプロモータとβ−ｇａｔ （β−ガラクトシ
ダーゼ）遺伝子？連結した複合プラスミドＰ’ｌ’Ｒｇ
ＺＩを造成した。つぎにその造成方法紫述べる。
ｔｒｐプロモータケゼするプラスミドＰ’ｌ’ｌＩは大
腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＩ、（リー
ダペブタイド）及びｔｒｐＥ （アントラニル酸合成酵
素）の先端部分の一部？含む約５００ ｂｐ（ｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ ）のＤＮＡ断片ｅＰＢＲ３２２プ２スミ
ドのＥｃｏＲＩ部位に挿入したものである。
腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＩ、（リー
ダペブタイド）及びｔｒｐＥ （アントラニル酸合成酵
素）の先端部分の一部？含む約５００ ｂｐ（ｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ ）のＤＮＡ断片ｅＰＢＲ３２２プ２スミ
ドのＥｃｏＲＩ部位に挿入したものである。
ｔｒｐブｏ モータノ向’ＩＪはＰＢＲ３２２（７）Ｔ
ｃｒ（テトラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、贅
たｔｒｐプロモータの上流側のＥｃｏＲＩ部位はＬ）
Ｎ Ａポリメラーゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下
流側のＥｃｏＲＩ部位のみに改良したものである。第１
図にｔｒｐグロモータ下流域の塩基配列ケ示す。ｔｒｐ
Ｅポリペブタイド遺伝子中のＥｃｏＲＩ部位に外来遺伝
子ケ連結することでｔｒｐＥポリペブタイドのＮ末端側
８個のアミノ酸と融合した形で外米遺伝子の発現が可能
である。
ｃｒ（テトラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、贅
たｔｒｐプロモータの上流側のＥｃｏＲＩ部位はＬ）
Ｎ Ａポリメラーゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下
流側のＥｃｏＲＩ部位のみに改良したものである。第１
図にｔｒｐグロモータ下流域の塩基配列ケ示す。ｔｒｐ
Ｅポリペブタイド遺伝子中のＥｃｏＲＩ部位に外来遺伝
子ケ連結することでｔｒｐＥポリペブタイドのＮ末端側
８個のアミノ酸と融合した形で外米遺伝子の発現が可能
である。
一方、β−ｇａｔ遺伝子はＰＭＣＩ ４０３ （Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４３． Ｐ９７１〜９８０．１
９８０）紫用いた。これは、ＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
とＳ ａｔ１部位間に６．２ ｋｂ（Ｋｉｌｏｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ） （Ｄβ−ｇａｔ遺伝子１ ｔａｃ Ｚ
＋ｌａｃ Ｙ ） ｋ挿入したものである。
９８０）紫用いた。これは、ＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
とＳ ａｔ１部位間に６．２ ｋｂ（Ｋｉｌｏｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ） （Ｄβ−ｇａｔ遺伝子１ ｔａｃ Ｚ
＋ｌａｃ Ｙ ） ｋ挿入したものである。
第２図にｔｒｐプロモータの下流にβ−ｇａｔ遺伝子が
連結されたＰＴＲ，ＥＺＩの造成方法？示す。
連結されたＰＴＲ，ＥＺＩの造成方法？示す。
ＰＴＲＥＩから切り出したｔｒｐプロモータ紮含む４．
２１ｋｂのＤＮＡ断片とＰＭＣ１４０３から切り出した
５、２ｋｂのβ−ｇａｔ遺伝子とをＤＮＡリガーゼで連
結して１Ｏ１２１ｋｂの複合プラスミドＰＴＲＥＺＩ紫
造成した。
２１ｋｂのＤＮＡ断片とＰＭＣ１４０３から切り出した
５、２ｋｂのβ−ｇａｔ遺伝子とをＤＮＡリガーゼで連
結して１Ｏ１２１ｋｂの複合プラスミドＰＴＲＥＺＩ紫
造成した。
遺伝子の発現はプロモータと称する遺伝子領域により調
節されている。ｔｒｐグロモータの場合ハＲＮＡ合成酵
素がｔｒｐプロモータに結合し、この酵素が１０モータ
下流に移動しＤＮＡ塩基塩基配列再転写ことによりＲＮ
Ａが合成される。そして、ここで合成されたＲＮＡの情
＠ｔリボンームが翻訳することによりポリベグタイドが
合成される。
節されている。ｔｒｐグロモータの場合ハＲＮＡ合成酵
素がｔｒｐプロモータに結合し、この酵素が１０モータ
下流に移動しＤＮＡ塩基塩基配列再転写ことによりＲＮ
Ａが合成される。そして、ここで合成されたＲＮＡの情
＠ｔリボンームが翻訳することによりポリベグタイドが
合成される。
一方、細胞内のトリプトファン濃度が増加するとトリプ
トファンがりプレツサに結合し、これ？活性化させ、リ
プレッサがオペレータと称する領域に結合する。この結
果、ＲＮＡ合成酵素がプロモータ部分に結合できなくな
り、ＲＮＡが合成されずポリペブタイドの生成が停止す
るのである。この場合、トリプトファンは抑制物質とし
て働く。
トファンがりプレツサに結合し、これ？活性化させ、リ
プレッサがオペレータと称する領域に結合する。この結
果、ＲＮＡ合成酵素がプロモータ部分に結合できなくな
り、ＲＮＡが合成されずポリペブタイドの生成が停止す
るのである。この場合、トリプトファンは抑制物質とし
て働く。
そこで、本発明者らはｔｒｐプロモータにおける遺伝子
発現調節を利用して効率的なポリペブタイド、つまりβ
−ｇａｌの生産方法全説明したのでめる。
発現調節を利用して効率的なポリペブタイド、つまりβ
−ｇａｌの生産方法全説明したのでめる。
複合プラスミドＰＴＲＥＺＩ−保持する大腸菌（供で研
萌そ扇７６タパ２ Ｍ １８２ ａ、ｋ ） リグトファンが極〈微量捷た
は存在しない培地、例えはＭ９−カザミノ酸培地で培養
するとβ−ｇａｌが培養初期から生産される。この場合
画体の増殖が少いため培誉液当りのβ−ｇａｔの生産鍛
は低い。
萌そ扇７６タパ２ Ｍ １８２ ａ、ｋ ） リグトファンが極〈微量捷た
は存在しない培地、例えはＭ９−カザミノ酸培地で培養
するとβ−ｇａｌが培養初期から生産される。この場合
画体の増殖が少いため培誉液当りのβ−ｇａｔの生産鍛
は低い。
そ゛こで、培養初期に少量のトリプトファンを加えｔｒ
ｐプロモータの働きケ抑えβ−ｇａｔの生産を低く【７
、菌体の増殖ケ図る。つぎに、培養液中の栄養分が低ド
または無くなった時点で、ｔｒｐプロモータの働きケ開
始させる誘導物質であるＩＡと栄養分ケ添加することで
ｔｒｐブロモ−タケ働かせ、培養液中に添加した栄養分
？大腸菌に利用させてβ−ｇａｔｋ生産させるという培
養方法？発明するに至ったのである。
ｐプロモータの働きケ抑えβ−ｇａｔの生産を低く【７
、菌体の増殖ケ図る。つぎに、培養液中の栄養分が低ド
または無くなった時点で、ｔｒｐプロモータの働きケ開
始させる誘導物質であるＩＡと栄養分ケ添加することで
ｔｒｐブロモ−タケ働かせ、培養液中に添加した栄養分
？大腸菌に利用させてβ−ｇａｔｋ生産させるという培
養方法？発明するに至ったのである。
本発明の方法はｔｒｐプロモータの発現調節機構ケ利用
して、菌体増殖とβ−ｇａｔ生産と紫分離したものであ
り、このような培養方法は現在捷で全く知られていない
。
して、菌体増殖とβ−ｇａｔ生産と紫分離したものであ
り、このような培養方法は現在捷で全く知られていない
。
つぎに、実施例により本発明の遺伝子組換え菌の培養方
法について説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。
法について説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。
実施例 １
Ａｐ（アンビシリフ１に５０ｐｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（
トリプトンｉ ０ ｇ’、酵母エキス５ｇ１グルコ−／
＜１ｇ、ＮａＣｚ５ｇ、水道水１ｔｓ Ｉ）Ｈ７，２）
Ｍ９−カザミノ酸培地（Ｎ Ｈ４Ｃｌ ｌ ｇ ％Ｎ
ａ２ＨＰ Ｏ４６Ｌ ＫＨ２Ｐ ０４３ Ｌ Ｎ ａ
Ｃｌ ５ ｇ ＩＭ ｇ Ｓ ０４−７ Ｈ２００，１
ｇ ｓ Ｃａ ＣＺ２ ・２ Ｈ２０１５ｇ１ｇ、
グルコース５ｇ、カザミノ酸２．５ｇｓ蒸留水ｘｚ、ｐ
Ｈ７，０）にＡ Ｉ） ｋ ５０ ｉｔｇ／ｍｌ添加し
た培養液５０ｍｔｉ入れた綿栓付板ロフラスコに接種し
、３’７Ｃ，ｌＺｏ回／駆で１５時間振とう培養した。
トリプトンｉ ０ ｇ’、酵母エキス５ｇ１グルコ−／
＜１ｇ、ＮａＣｚ５ｇ、水道水１ｔｓ Ｉ）Ｈ７，２）
Ｍ９−カザミノ酸培地（Ｎ Ｈ４Ｃｌ ｌ ｇ ％Ｎ
ａ２ＨＰ Ｏ４６Ｌ ＫＨ２Ｐ ０４３ Ｌ Ｎ ａ
Ｃｌ ５ ｇ ＩＭ ｇ Ｓ ０４−７ Ｈ２００，１
ｇ ｓ Ｃａ ＣＺ２ ・２ Ｈ２０１５ｇ１ｇ、
グルコース５ｇ、カザミノ酸２．５ｇｓ蒸留水ｘｚ、ｐ
Ｈ７，０）にＡ Ｉ） ｋ ５０ ｉｔｇ／ｍｌ添加し
た培養液５０ｍｔｉ入れた綿栓付板ロフラスコに接種し
、３’７Ｃ，ｌＺｏ回／駆で１５時間振とう培養した。
培養終了液ケ遠沈管に入れ１１００００ｒｐで５分間遠
沈し、集菌した菌体全上記のＭ９「 −カザミノ酸培地に懸濁し、綿栓付板ロフラスコに５０
ｍ２になるように入れた。このようにして作成した坂ロ
フラスコ３本にトリプトファンケそれぞれ、２．５μｇ
／ｍ４ ５ｇｇｉｍｔ及び１０ｇｇ／ｍｔになるように
添加し、他の１本にはトリプトファンｒ添加しなカ）つ
た。トリプトファン添加後３７Ｃ，１２０回／ｍｉｎで
振とり培養し、２時間口にｉＡ’ｔ−１５ｇｇ／ｍｌと
栄養分としてカザミノ酸？２、５ ｍｇ／ｍｌになるよ
うに添加してさらに３時間培養した。培養終了後、β−
ｇａ７生座量を測定するために培養液１ｍｔにトルエン
１１５ｍ１添加して３７Ｃで３０分間振とうし、１０〜
１００倍に稀釈した。この液１ｒｎｔ’に採取し、３０
Ｃで５分間振とう後０．２ Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７
，２５）３、５ ｍ ７と０．ＯＩＭＯＮＰＧ（０−＝
トロフェニル−β−■）−ガラクトピラノシド）０．５
ｍｌ加えてｌＯ分間振とうした。溶液１ ｍｌ ｋ採取
し、１ＭＮａ２Ｃｏ３中に入れ反応？停止させた後、水
紮８ｍｔ入れて全量１ ｏｍｚとした。これ全分光光度
計にて４２００ｍの吸光度を測定し、ＯＮＰ ＴＯ−一
トロフェノール）の標準曲線から生成した
−〇ＮＰ量ケ算出した。この場合、１分間に１μｍ
ｏｄｅの０ＮＰＧｋ分解するβ−ｇａｔ活性紫ｌ単位（
Ｕ）とした。
沈し、集菌した菌体全上記のＭ９「 −カザミノ酸培地に懸濁し、綿栓付板ロフラスコに５０
ｍ２になるように入れた。このようにして作成した坂ロ
フラスコ３本にトリプトファンケそれぞれ、２．５μｇ
／ｍ４ ５ｇｇｉｍｔ及び１０ｇｇ／ｍｔになるように
添加し、他の１本にはトリプトファンｒ添加しなカ）つ
た。トリプトファン添加後３７Ｃ，１２０回／ｍｉｎで
振とり培養し、２時間口にｉＡ’ｔ−１５ｇｇ／ｍｌと
栄養分としてカザミノ酸？２、５ ｍｇ／ｍｌになるよ
うに添加してさらに３時間培養した。培養終了後、β−
ｇａ７生座量を測定するために培養液１ｍｔにトルエン
１１５ｍ１添加して３７Ｃで３０分間振とうし、１０〜
１００倍に稀釈した。この液１ｒｎｔ’に採取し、３０
Ｃで５分間振とう後０．２ Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７
，２５）３、５ ｍ ７と０．ＯＩＭＯＮＰＧ（０−＝
トロフェニル−β−■）−ガラクトピラノシド）０．５
ｍｌ加えてｌＯ分間振とうした。溶液１ ｍｌ ｋ採取
し、１ＭＮａ２Ｃｏ３中に入れ反応？停止させた後、水
紮８ｍｔ入れて全量１ ｏｍｚとした。これ全分光光度
計にて４２００ｍの吸光度を測定し、ＯＮＰ ＴＯ−一
トロフェノール）の標準曲線から生成した
−〇ＮＰ量ケ算出した。この場合、１分間に１μｍ
ｏｄｅの０ＮＰＧｋ分解するβ−ｇａｔ活性紫ｌ単位（
Ｕ）とした。
その結果？第３図に示す。培養２時間口（曲線ｌ）では
トリプトファンの添加でｔｒｐプロモータの働きが抑え
られるためにトリプトファンの添加が増えるにしたがい
β−ｇａｔの生産量が低下した。
トリプトファンの添加でｔｒｐプロモータの働きが抑え
られるためにトリプトファンの添加が増えるにしたがい
β−ｇａｔの生産量が低下した。
しかし、２時間口にＩＡ’とカザミノ酸會添加し３時間
培養した時のβ−ｇａ７生産量（曲線２）はトリプトフ
ァン添加量５μｇ／ｍｚの場合が最大で、無添加の場合
の１０％生産性が向上した。
培養した時のβ−ｇａ７生産量（曲線２）はトリプトフ
ァン添加量５μｇ／ｍｚの場合が最大で、無添加の場合
の１０％生産性が向上した。
このように、培養初期にｔｒｐプロモータの抑制物質で
あるトリプトファン？添加し、培養中に誘導物質のＩＡ
と栄養分ケ添加することにより、β−ｇａｔの生産ケ著
しく向上できること全実証した。
あるトリプトファン？添加し、培養中に誘導物質のＩＡ
と栄養分ケ添加することにより、β−ｇａｔの生産ケ著
しく向上できること全実証した。
本発明により遺伝子組換え菌の培養において、目的生産
物の生産の抑制と誘導？任意に行うことができ、遺伝子
組換え菌による目的生産物の工業生産ケ効率的に実施す
ることができる。
物の生産の抑制と誘導？任意に行うことができ、遺伝子
組換え菌による目的生産物の工業生産ケ効率的に実施す
ることができる。
渠１図はりｔｐプロモータ下流域の塩基配列ケ示す配列
図、第２図はＰＴＲＥＺＩ の造成方法ケ示すフロー
図、第３図はトリプトファン添加量とβ−ｇａ７生産量
の関係を示すグラフである。
図、第２図はＰＴＲＥＺＩ の造成方法ケ示すフロー
図、第３図はトリプトファン添加量とβ−ｇａ７生産量
の関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、目的遺伝子、ベクター及びプロモータよりなる複合
プラスミドを細胞内に保持し、かつ目的遺伝子の発現能
を有する微生物を培養し、目的遺伝子を発現させその生
産物を採取するに際し、培地中に抑制物質と誘導物質を
添加してプロモータ活性を制御することにより、該微生
物の培養を行うことを特徴とする遺伝子組換え菌の培養
方法。 ２、特許請求の範囲第１項において、該プロモータがｔ
ｒｐ（トリプトファン）プロモータであることを特徴と
する遺伝子組換え菌の培養方法。 ３、抑制物質がトリプトファンであることを特徴とする
特許請求の範囲第１または２項記載の遺伝子組換え菌の
培養方法。 ４、誘導物質がＩＡ（３−β−インドールアクリル酸）
であることを特徴とする特許請求の範囲第１、２または
３項記載の遺伝子組換え菌の培養方法。 ５、複合プラスミドを保持する微生物が大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）であることを特徴とする
特許請求の範囲第１、２、３または４項記載の遺伝子組
換え菌の培養方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12747284A JPS619282A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 遺伝子組換え菌の培養方法 |
| DE8585107678T DE3585176D1 (de) | 1984-06-22 | 1985-06-21 | Verfahren zum kontrollieren der zuechtung von rekombinanten. |
| EP85107678A EP0165613B1 (en) | 1984-06-22 | 1985-06-21 | Process for controlling culture of recombinants |
| US07/205,603 US5674678A (en) | 1984-06-22 | 1988-06-02 | Process for controlling cultures of recombinants |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12747284A JPS619282A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 遺伝子組換え菌の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619282A true JPS619282A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH0375159B2 JPH0375159B2 (ja) | 1991-11-29 |
Family
ID=14960767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12747284A Granted JPS619282A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 遺伝子組換え菌の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS619282A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114072492A (zh) * | 2019-06-17 | 2022-02-18 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS57122096A (en) * | 1980-08-05 | 1982-07-29 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinant, transformed cell, manufacture and generation of urogasterone |
| JPS58141796A (ja) * | 1982-02-18 | 1983-08-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ペプチドの製造法 |
| JPS6087784A (ja) * | 1983-10-20 | 1985-05-17 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | ＴｒｐＲ保持菌株の培養方法 |
-
1984
- 1984-06-22 JP JP12747284A patent/JPS619282A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS57122096A (en) * | 1980-08-05 | 1982-07-29 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinant, transformed cell, manufacture and generation of urogasterone |
| JPS58141796A (ja) * | 1982-02-18 | 1983-08-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ペプチドの製造法 |
| JPS6087784A (ja) * | 1983-10-20 | 1985-05-17 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | ＴｒｐＲ保持菌株の培養方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114072492A (zh) * | 2019-06-17 | 2022-02-18 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
| CN114072492B (zh) * | 2019-06-17 | 2024-04-30 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0375159B2 (ja) | 1991-11-29 |
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