JPS62503074A - 不安定な遺伝性レプリコンの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不安定な遺伝性レプリコンの安定化方法技術の概要 遺伝子が安定なことは、個々の細胞のレベルのみならず細胞集団のレベルでも、 細胞生物学上、普遍的な特徴である。

細胞分裂の際に細胞染色体が娘細胞に均等に分配されないと、細胞死に至るか、 少なくとも真核細胞の場合、重篤な細胞障害を起こす可能性が増大するので、こ の均等な分配は、はとんど知られていない多くの制御機ｂｉｔの組合せによって 支配されている。

しかし、真核１ＩＩＩ胞はもとより原核＃ｌ胞の染色体外性遺伝体く本質的には ミニ染色体と考えられる）は、細胞集団内で安定に維持されているので、細胞染 色体の分配だけが厳密に制御されているわけではない。宿主＃Ｉ胞ゲノムとの遺 伝情報の交換によるプラスミドの進化が、自由に複製する分子、特にコピー数／ ｌｌｌ胞もしくは区画（オルガネラ）がごく小さいこれら分子の種の均等な分配 を支配する、遺伝情報の染色体源を示している。かような推定上の染色体の原型 は、可能性はうすいけれども染色体分配の問題に閏！［る同様な目的に役立たな い。

１〜２コビイ／［ｌ菌ゲノムで存在する、天然に生成する細菌プラスミド（例え ばＲ１）は目立って、細菌染色体と重要度が同じの分配の問題に遭遇する。プラ スミドを保有する細胞の生存に好都合な外因性の選択圧がイにくても、集団内の がようなプラスミドの安定した維持を確実に行うために、暗に、厳重な制御Ｖ１ 惰が存在しているにちがいない。

プラスミド複製制御機構は増殖中の細胞内のプラスミドの濃度を調節するが、細 胞分裂時の娘細胞へのプラスミド分子の規則的な分配はない。そして細胞分裂に よってプラスミドのない細胞が生成する可能性があるということは、非常に重要 であり、コビイ数がたった１〜２コビイ／細菌ゲノムで存在するようなプラスミ ドにとっては特に重要である。レプリコンの規則的な分配を支配する維持機能を 、分配久能と命名した。

プラスミドＦのｃｃｄ位置によってエンコードされる、別のレプリコン安定化別 能（□ｇｕｒａおよびＨｉｒａｇａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８０．１９８３．４７８４−４７８８＞が、細胞分裂時 にプラスミドＦの１コビイだけが存在する際には細胞分裂を阻害することが分か った。

真核細胞では、自由に複製する分子に影響する類似の安定機能は、３つの異なる 状態がある。

第一の状態は次のとおりである。真核ｉ［１１胞に感染可能ないくつかの天然に 生成するウィルスのゲノムは、そのウィルス感染の自然の軒路がこのウィルス生 成を阻害するが、プラスミド状態で存在する可能性がある。プラスミドゲノムは 、例えばエプスタイン−バールウィルス、５Ｖ４（＋とポリオーマウィルス類、 乳頭腫ウィルス類およびある種のレトロウィルス類、特に後天性免疫不全症候８ Ｙに関連する（ＨＴＬＶＩ［［）および羊が起源のヴナウイルスが感染した細胞 に見出すことができる。これらのウィルスのいくつかが真核細胞の蒲仏子ベクタ ーとして用いられる。

第２の状態は次のとおりである。例えばヒト起源の真核染色体由来の特殊領域が 自然に発生するのがみとめられる。すなわち増殖中に安定に維持され、コビイ数 がごく少数から数百までの範囲にあって染色体外性遺伝体的に複製するミニ染色 体（ｄｏｕｂｌｅ　ｍ１ｎｕｔｅｓ）である。畳ナツ力ロミセス・セレビシェ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）内では複製できないｌ ｔ？ｆｆｉプラスミドを使って、自主的にＹｉ製する配列（ａｒｓ　＞が、移々 のソース例えば酵母、ショウジヨウバエ（［）　ｒｏｓｏｐｈｉ　Ｉａ　）およ びトウモ［１コシ（７ｃａ　５ａｙｓ　）由来の染色体ＤＮＡの７ラグメントを プラスミドへ挿入するごとによって確認された（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｄ、　 Ｔ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、、　７７゜１９８０、　ｐｐ、４５５９ −４５６３　＞。そしてかような自主的に複製する配列は、広範囲の細胞の新規 なレプリコンを作り出すのに用いられるが、重要なのは、かようなレプリコンが 、外因性の選択圧がなくても細胞集団内でどの程度まで安定に維持されるかであ る。

第３の状態は次のとおりである。２つのタイプのオルガネラ、ミトコンドリアお よび植物の葉緑体は基本的に、自らの厳密に区分されたゲノムを有する基本的に 自己更新性のオルガネラであり、オルガネラが分裂する際に新たに形成されるか 各オルガネラｔよ、機能するためには、オルガネラゲノムの少なくともひとつの コビイをもっている必要がある。大ていのミトコンドリア（１は５〜２０のゲノ ムを有し、したがって、低コビイ数もしくは中位のコビイ数をもつ細菌プラスミ ドと同様のゲノム分配の問題があり、分配が厳密に制御されていなければ、ゲノ ムなしのオルガネラが高頻度で出現し、その結果、非橢能的なオルガネラが出現 すると予想される。不均等なゲノムの分配によるミトコンドリアの予想される脱 落は、はとんどのタイプの細胞が多数のミトコンドリアを有しているという＄実 によって埋合わされている。ある遺伝子ベクターによってミトコンドリアに導入 された遺伝情報をミトコンドリア集団内に安定に維持するのを保証りる医構は、 ある種の植物細胞を遺伝学的に処理しようと試みる場合に有用であることが分か る（ｌｅｖｉｎｇｓｎｌ、　Ｃ，Ｓ。

およびｐｒｉｎｇ、　Ｄ、　Ｒ，、”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ”　、第１版：Ｊ、　Ｋ、　ＳｅｔｌｏｗおよびＡ、　ＨＯＩ　１ａｅｎｄｅｒ 、ｐ　１ｅｎＵｆｌｌＰｒｅｓｓ、　＋９７９．　Ｄｒ）、２０５−２２２）　 、植物葉緑体において、葉緑体ゲノムの数は２〜８０と変化し、すなわら細菌中 の高コピイ数のプラスミドの場合と似ており、さらにほとんどの植物細胞におい て葉緑体の数は多い。しかしクラマイト［ノス（Ｃｈ　Ｉａｍｙｄｏｍｏｎａｓ 　）内には、細胞当り２つしか葉緑体が存在しない。そして各々８０コビイの葉 緑体ゲノムが存在するにもかかわらず、葉緑体ゲノムの安定した維持を確実に行 うために高度の安定性が要求される。高鋳植物を殖伝子的に処理することは、植 物葉緑体を用いれば可能である（Ｂｏｇｏｒａｄ、　Ｌ、、ＱｅｎｅｔｉｃＥｎ ｇｉｎｅｃｒｉｎｑ、　ＩＩＬ　Ｊ、　Ｋ、　ＳｅｔｌｏｗおよびＡ。

Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９７９．　ｐｐ、１８ １−２０４）。

真核細胞内に外来遺伝子を梵現さじるようデザインされたベクターに関心が高ま り、真核細胞集団内にゲノムを維持する制御機構が研究の重要な目標になってい る。

本願発明の発明者らが進めた計画は、プラスミドの安定化法に関連する概念につ いての広範な知識を、イー・コリ（Ｅ、　Ｇｏｌｉ　）の特定の系、１なわちＲ １プラスミドがら引き出し、１）他のレプリコン類、２）他の関連のない細胞お よび３）真核系への外挿を試みることである。

組換え体１）Ｎ△の技術が産業規模で適用される場合、不安定性の問題がしぽし ぽ起こるので、現在、レプリコンの分配搬能に対づる関心が起こフでいる。

原核系では、自然に生成するプラスミド由来のクローニングベクターの１−ザイ ン（ま最初、高ココビイ数を４７１にとに集中したが、この高ココビイ数は、細 胞集団内ひプラスミドを安定に維持覆るのにある程度役に立つ。というのは、プ ラスミド分子のランダム分配によってプラスミドなしの細胞が出現する可能性が 減少するからである。外来１）　Ｎ　Ａを挿入しなければ安定な多くのクローニ ングベクターに、外来ＯＮΔを挿入づると、これらのベクターをＲしく不安定な 紺換え体プラスミドに変換する場合があるということは、真核系はもとより原核 系でもよく報告されていることである。これは＝］ビイ数の減少もしくは挿入Ｄ ＮＡによってエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）される産物の増殖阻害効果が原因であ る。外部からの選択圧ずなわらプラスミドを保有する細胞の積極的な選択を行う 可能性は、産業規模の培養中には、むしろ限定されるので、安定性表現ｙ（のベ クターを処理できることが必須のようである。

宿主細胞中でのプラスミドの安定な維持についての理解が改善されてなされた進 歩は、プラスミド［（１のｐａｒ３領域が、Ｒ１に関連のない不安定な絹換え体 プラスミドを、外部からの選択圧が全くなくても数百世代も、イー・］り集団内 で維持される、安定に遺伝されたプラスミドに変換できるということが分かった ことである（国際特許願第ＰＴＣ／ＤＫ＆３／　０００８６号、同公開第ＷＯ３ ４／　０１１７２号参照）。ｐａｒ［３領域によるプラスミドの安定化法は、大 規模培養中プラスミドを確実に維持するのに外部からの選択圧を全く必要としな いので、遺伝子的に処理された細菌を用いる大規俣牛産に、＋Ｉ７られたベクタ ーを利用することを指摘したのである。

弁明の開示 この発明は、特に、細胞集団内のレプリコンの安定な維持の原因となっている遺 伝情報を有するレブリ：１ンに関する。そしてその情報は、与えられたレプリコ ンに先人的４【ものか、または挿入された単一もしくは複数の核酸フラグメント が保有している。さらにそのレプリコンは、自らと本来関係のないひとつ以上の 挿入ＤＮＡを有していてもよい。

ｐａｒ３の安定化作用は非常に有効なレプリコンの安定化様横であり、その全機 構が一つの同じレプリコンに存在するひとつの塩基配列から発現するという利点 を有する。それ故にこの発明の発明者らは、Ｒ１と同じ安定性の問題を有するプ ラスミド類のｐａｒＢ類似の安定化機能、Ｊ３よびイー・コリと他の真核微生物 はもとより原核微生物との染色体ＤＮＡ中のＲ１プラスミド安定システムの１１ を窓上の原型について研究した。そしてそのＲ終目標は、かような遺伝情報から 、与えられた微生物に有効な安定性制御システムを選択もしくは作製することで ある。下記のこの研究の最初の結果で示すように、ｐａｒＢによる安定化法が、 広範囲の生細胞に確立することが可能な、鶴遍的で非常に効果的な安定化Ｒ構を 示していることが分かった。

この発明は、これらの知見に基いたものであり、ある見地から、細胞に保有され ている場合、その細胞もしくは子孫を殺すことができる産物（又はその産物の前 駆体）を発現し、さらにその致死産物に対するアンタボニス１−（またはそのア ンタゴニストの前駆体）を発現Ｊるレプリコンに関し、そのアンタボニスＩ〜は 、該レプリコンを保有する細胞内の致死産物（又はその致死産物の前駆体）を抑 圧するアンタボニス１〜であるが、該レプリコンが細胞から失われて該アンタボ ニスｌ−（又はぞの前駆体）かもはや連続的に発現されない場合にはアンタゴニ ストの活性が衰退するものであり、このことは、そのレプリコンがグラム陰性菌 内で複製しうるプラスミドである場合に、細胞致死産物とこれに対するアンタゴ ニストがＲ１のｐａｒ３によってエンコードされないならば、現在レプリコンの 存在しない現存細胞中に存在する致死産物（又はその前駆体）がもはやアンタゴ ニストによって抑圧されず細胞死をもたらすことを意味する。

ｐａｒ３領域自体は、例えば国際特許願第ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８６、　同 公開第ＷＯ３４／　０１１７２８ニ、り５ム陰性［）Ｈｉ’ｉＬ’？！ｉ製する 種々のプラスミドの安定な維持を例証しながら、すでに開示されている。口の持 に１［ｉに示されているように、その安定化の効果は、ｐａｒ３領域から発現さ れる分配機能に起因していると彩えられる。この分に！機能は、細胞分裂時にプ ラスミド分子が娘細胞に、規則的に分配されるのを保障する機構によって行われ ると考えられる。ｐａｒ３領域が、迩択圧がないときは細胞集団からごくまれに しか失われない不安定に遺伝された多種類のプラスミドを安定化するのに著しく 有効ひあるということが、最近の研究で示された。さらにその安定化の効果は、 プラスミドの複製、不安定性の理由および大部分のｍ菌宿主とは無関係であるこ とが分かった。

しかし、ｐａｒ３の４ｆＩｉ造や分子ｎ構についてさらに研究した結果、驚くべ きことには新規な安定化の原理が確認されたのである。その原理は、さぎに概略 述べたように、細胞を殺す機能とそれに対抗するアンタゴニストからなるもので ある。下記のハイブリッド形成実験の結果によれば、この新ノ貝な安定化の原理 は、すべてのタイプの細胞ではないとしてもほとんどの細胞について作動し、多 目的に使用できるという利点を有すると考えられるので、この原理は、多くの異 なる理由で不安定に維持されている、異なるタイプの多くのレプリコンを安定化 するのに利用できるということを意味する。

この明細書において、゛レプリコン自体という用品は、与えられたひとつの宿主 細胞または与えられた範囲の宿主細胞中で自主的に複製しうる核酸（ＤＮＡまた はＲＮＡ）のセグメントを示す。したがってレプリコンは、例えば細菌プラスミ ド、細菌ウィルス、ａｌｌ菌染色体、真核プラスミド（ＲＮＡまたはＤＮＡ〉、 真核ウィルス、？！２製の染色体源を有し、自主的に複製する真核配列、真核ミ トコンドリアＤＮＡ分子、または真核葉緑体ＤＮＡ分子であってもよい。

この発明の技術８０発の最も実用的な目的に使用されるレプリコンは、天然のレ プリコンではなくて、そのレプリコンには天然では関係がなく、問題のレプリコ ンや挿入されるべきヌクレオチド配列に必要な任意の組換え体ＤＮＡ技術によっ てレプリコンに挿入される、１以上の挿入されたヌクレオチド配列を有するレプ リコンである（核酸の遺伝子もしくはフラグメントについての°“挿入される” という用殆は、核酸の遺伝子もしくはフラグメン１−が、喰終のレプリコンの製 造中の１段階でレプリコンに導入されたことを示す）。Ｗ数もしくは複数の挿入 されるヌクレオチド配列は例えば、プラスミドのごときレプリコンを有する細菌 のごとき細胞の培養によって産生ずるのを所望される産物を発現する遺伝子を有 するＤＮＡ配列である。かような産物とは、医薬もしくは工業用の広範囲の産物 、特にポリペプチド類と蛋白質類もしくはそのフラグメント、酵素類、および四 通培地内での酵素類とある化合物との反応による非蛋白質の産物であるホルモン 類と他の低分子量産物である。真核遺伝子持に吐乳類の遺伝子の産物は特に重要 である。しかしそのレプリコンも、ベクターとして有用である場合（このベクタ ーには、非天然の遺伝子が、挿入遺伝子を有するレプリコンを保有する細胞の培 養物から問題の遺伝子産物を収稽するために、挿入される）、又はレプリコン自 体が価値ある産物を発現するときの生産レプリコンとして有用である場合には、 その天然状態で予めＩＢＭされたレプリコンではない。

他の系におけるｐａｒ［３に類似の領域の研究によって、予想外のことであるが 、多くの異なるプラスミド、細菌ゲノムおよび真核細胞内にまでも、ｐａｒ３と 相同の配列がｔｉｕａされ、下記安定化効果を裏付（プる分子機構は、次のよう な予測をするのに強固な根拠を与える。１なわち、中央の細胞標的（おそらく全 細胞内に保存されている）が、これら相同の配置からの遺伝子産物（おそらく全 細胞内に保存されている）と、同一もしくは類似の原理にしたがって相互反応し 、その結果、ｐａｒＢと相同の配列が、直接にもしくは比較的１！Ｉｌｌな遺伝 子的処理をしてｐａｒ１３類似の安定化領域を作製した後に用いることができ、 多くの異なる微生物中のいずれのタイプのレプリコンも安定化すると考えられる 。実施例によって、この予測のに１拠を示す。

この明細書において、°゛前駆体゛′という用：！ｊ　％よ、適当な時に＠胞内 で優先する条イ１下、直接もしくは間接に産物を生じ、その産物の存在によって 問題の機能（致死機能もしくはアンタゴニスト機能）が起こる産物を示す。

有毒物質とは、有毒になるために、蛋白質分解開裂反応もしくは官能基（脂肪酸 の残基を含む）の付加によって修飾されねばならないプレプロティンのような、 蛋白質もしくはその前駆体、またはｍＲＮＡの翻訳によって有毒蛋白質を生ずる ｌｌｌＲＮＡである。

アンタゴニストは遺伝子産物であり、ＲＮＡもしくは蛋白質であってもよい。そ してこのアンタゴニストは、有毒物質と直接結合することによって有毒物質の活 性を抑圧するかもしくは細胞中のその標的を妨害することによって有毒物質の活 性を抑圧するか、または前駆体の有毒産物すなわらブレープロティンへの変換も しくはｌｌｌＲＮＡの寅際の有毒産物への翻訳を抑圧する遺伝子産物である。

大部分もしくはすべての生きている細胞には、その産物が実質的に過剰発現され た際、それが細胞に致命的かもしくはその発育を阻害する遺伝子が存在し、それ 故その遺伝子は前記の方法でレプリコン安定化に使用できる。

Ｒ１のｐａｒ［３領域によって行われることが見出された機構は、上記タイプの 致死／アンタゴニストＮ構である。したがってこの機構は、Ｒ１ｐａｒＢ領域内 に存在する次の２つの遺伝子から発現される産物に基づくものである。すなわち 細胞を殺すことができる産物をｌｌ現する第１１目の遺伝子（下記のＲ１ｐａｒ ３ｈｏｋ　’４伝子）と、Ｒ１ｐａｒｂｍ仏子類が発現されるレプリコンを保有 する細胞中のｈｏｋｉ伝子産物子産物する（ａｎｔａ００ｎｉ２℃〉産物を発現 する第２番口の遺伝子（下記のＲ１ｐａｒＢ　ｓｏｋ運伝子）である。一方、例 えばレプリコンの脱落が原因でアンタゴニストの連続的な発現がない場合、アン タゴニストの活性が衰退し、致死産物（１！Ａ胞中での半減期はアンタゴニスト より艮い）はアンタゴニストによってもはや抑圧されない（すなわち致死産物の 遺伝情報を指定するｍＲＮＡの翻訳はもはや阻害されない）。

明らかにこのタイプの機構では、細胞集団には、レプリコンを保有しない増殖細 胞が存在しないことを保障するために、アンタゴニスト機能を発現するレプリコ ンを失なった細胞は死ぬ結果になり、したがってこれらのことは、細ｌｌ２Ｉ集 団の生きていて増殖中の細胞は、レプリコンを保有する細胞であることを示す。

このようにして細胞集団中のレプリコンの安定な維持が確実に行われる。

ｐａｒＢで仲介された安定化作用についてさらに研究した結果、予想外のことで あるが、細胞集団内のレプリコンの安定な維持を支配する門構が宿主細胞の致死 機能の発現を調節していることが見出された。宿主細胞の致死機能の発現の調節 を行う安定化橢構については先に述べたが、公知の例ではすべて、有毒産物をエ ンコードする遺伝子（例えば染色体の遺伝子）からアンタゴニストをエンコード ｊる遺伝子（例えばプラスミドの遺伝子）が分離され、そして致死機能はひとつ もしくはごく少数の生物に限定されていたのである（例えばヨーロッパ特許願第 ８２３０６２０７．０号、同公開第００８０８４８号参照）。

この発明によれば、次に述べる前記原理の例えばＲ１ｐａｒＢプラスミドの安定 化機能は、与えられた細胞集団内で問題のレプリコンを安定に維持する手段どし て、広範囲のレプリコンに利用可能であり、さらに、広範囲の真核と原核の宿主 細胞にも利用できる。

ｐａｒ［３系の２つの態様が、（１）生細胞内のこのタイプの安定化系の一般的 な応用と、（２）非常に広範囲の微生物内では能するｐａｒＢ系に対応する安定 化系を作製ツる可能性について非常に重要である。

１、はとｌυどすべての細菌と種々の頁核微生物内に相同の配列を意外にも見出 したことは、ｈｏｋ産物の致死機能の標的が、すべての生きている細胞ではない にしても、はとんどの細胞に必須なものであるという仮定と合致する。

２、調節機構の唯一の性質は、細胞を有するすべてのプラスミドの生存と、発生 するプラスミドなしの細胞の速やかな致死とを確実に行うことである。遺伝的証 拠によって、実際のｓｏｋでエンコードされた調節物質（５ｏｋ−ｅｎｃｏｄｅ ｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｍａｔｅｒｉａｌ　）は、ｈｏｋでエンコードされたＩ ＩＩＲＮ△ノ翻訳を阻害するＲＮＡ分子であると信じられる。ｓｏｋでエンコー ドされた１’？　ＮΔがｈｏｋでエンコードされたｌ１ｌＲＮＡよりも不安定で あると仮定するならば、ｈｏｋでエンコードされたＩｎＲＮＡの翻訳の６１害は 、ｐａｒ３’プラスミドを失った細胞で（ま徐々に減少し、ｈｏｋでエンコード された蛋白質が結局その細胞を殺ずであろう・これらの仮定に基づいて、次のこ とが考えられる。

（ｉ）　ｐａｒ［３領域もしくはＲ１以外のレプリコン由来のこれに極めて類似 した任意の領域］訳　ｈｏｋとｓｏｋの遺伝子もしくはこれらの類似体を有する が、すべてのタイプの細菌内で、これに挿入されるすべてのタイプのプラスミド を安定に維持づるはずである。このことは次のことから確認された。すなわち多 種のプラスミドがｐａｒ３の挿入後イー・コリ内ぐ１ｏｏ（Ｂ以上も安定化され 、プソイドモナス・プチダ（Ｐｓｃｕｄｏｉｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）のような イー・コリとは系統分類状いもぢるしく異なる細菌内でも、ｐａｒ３はイー・コ リ内ど同様に有効であることが見出されたのである。

Ｏ）イー・コリ以外の細菌由来の、１（１以外のプラスミドは、ｐａｒＢと実質 的に相同の配列をもつことができる。かような配列は、プラスミド安定化の１］ 的に類似のしかたで用いることができる。このことを裏付【ノる理論的根拠は、 ｈｏｋｉ伝了が染色体ｒｅ１３−　ｏｒｆ３選伝子と相同であり、後者の遺伝子 がｈｏｋ遺伝子の産物と同一の活性を有する産物を発現するということである。

このことは、産物が最終的にｐａｒＢ系に発生した場合、遺伝子が染色体からプ ラスミドに転移したという理論を支持している。これによって、Ｉ６１じプロセ スか他のレプリコンにも起こったと仮定することは合理的になる。ハイブリッド 形成実験は、このことが事実であることを強く示している。というのは、Ｒ１と は無関係のいくつかのプラスミドと、イー・コリ以外の細菌由来の染色体ＤＮＡ とがｐａｒ１３と相同の配列を有するからである。

ｈｏｋをコードする領域内にｐａｒ１３と５５％相同の、イー・コリ由来の染色 体配列は、使用されるｐａｒ３プローブとのハイブリッド形成法によってもまだ 検出されていないが、）−１ｏｋ表現型を産出することに注意すべきであり、こ れは前記のことを確み２している。

■まず、プラスミドもしくは染色体からｈｏｋ３１伝子相似体を単離し次いでｐ ａｒ［３内のｓｏｋによって示される遺伝子に類似の調節ループを重ねることに よってｐａｒ３類似の系を作製することができる。そしてその作製は、短かい合 成りＮＡ配列（プロモーターを含む）を挿入することによって行われ、その［） ＮＡ配列は、転写されると、リポソームの結合座位を有するｈｏｋ　−ｍＲＮＡ もしくはｈｏｋ−相似−ｍＲＮ△の一部に相補的な小ざなアンチセンスＲＮ△を 発現する。アンチセンスＲＮＡをｍＲＮＡに対合させると、ｍＲＮＡの翻訳と細 胞死を阻害Ｊ′る。かような天然の調節システムのいくつかくアンチセンスＲＮ ＡがｍＲＮＡの翻訳を阻害する）は、例えばＬ　ｉｇｈｔおよびＭｏｌｉ口。

Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　２．　Ｎｏ　、Ｌ　１９８３　ｐｐ、　９３ 〜９８ニすでに記載されており、前記提起の系のうな人工系でも成功裡に行われ た。したがって提案された方法は理論的かつ現実的であり、例えばすべての公知 の細菌に応用できる。

上記の説明にしたがって、この発明のレプリコンは、細菌プラスミド、細菌ウィ ルス、細菌染色体、真核プラスミド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、真核ウィルス、 複数の染色体源を有する、真核の自主的に複製づ−る配列、真核ミトコンドリア ＤＮＡ分子または真核葉緑体ＤＮＡ分子のごとぎ多種類の細胞に属するレプリコ ンである。同様に致死産物を特定する、レプリコン内の配列として適切なのは、 細菌プラスミド、細菌染色体、真核プラスミド、真核ｆウィルス、複製の染色体 源を有する真核の自主的に複製する配列、真核ミトコンドリアＤ　ＮＡ分子又は 真核葉緑体ＤＮＡ分子のような同様の系由来の配列である。

同様に、致死産物に対するアンタゴニストをエンコードする配列は、細菌プラス ミド、細菌染色体、真核プラスミド、真核ウィルス、複製の染色体源を有する、 真核の自主的に複製する配列、真核ミトコンドリアＤＮＡ分子又は真核葉緑体分 子由来のものでよく、または合成の配列であってもよい。

この発明による５７Ｊ味あるレプリコンは、ｒ＜１ｐａｒｓ系と類似に作用し、 その結果、細胞内に保有されると、細胞又はその子孫を殺すことができる産物を エンコードするメツセンジャーＲＮΔを発現し、さらにその１ノブリコンを保有 する細胞内でのメツセンジャーＲＮＡのｖＡ訳を阻害するアンタボニス１−をざ で現する。そのレプリコンが細胞から失われると、アンタボニス１−（もしくは その前駆体）はもはや連続的には光用されず、その活性は衰退し、その結果、レ プリコンなしの現存の細胞内に存在するメツセンジャーＲＮＡのＩ’ｆｌ訳はも はヤアンタゴニストによって阻害されない。これらのなかで■味あるレプリコン は、細胞致死産物をエンコードするメツセンジャーＲＮＡの少なくとも一部に対 合する塩基を通じて、メツセンジャーＲＮΔの翻訳を阻害するアンタゴニストと して作用するアンチセンスＲＮＡ分子を発現するレプリコンである。

上記したことによれば、この発明の特に興味深い態様は、Ｒ１ｐａｒＢ　ｈｏｋ 渭伝子によって発現される産物（もしくは前駆体）のしかたと同一もしくは類似 のしかたで細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物（もしくはその産物の 前駆体）をエンコードする配列を有するＤＮＡ分子であるレプリコンである。

かようなレプリコンはさらに、Ｒ１ｐａｒＢ　５ｏｉｌ伝子によって発現される アンタゴニストのしかたと同一もしくは類似のしかたで機能するアンタゴニスト をエンコードする配列を有する。

かくしてこの発明によるいくつかのレプリコン類、特に細菌プラスミド内で、Ｒ １ｐａｒＢ領域は、レプリコンを確実に維持するためにそのまま使用するか、ま たは、例えばこれらの遺伝子がそれから転写されるプロモータを適切に変化させ ることによって、問題の宿主ｍ菌内のｈｏｋど５ｏｋｉ伝子の正しい発現を確実 に行うよう適切に改変する。

代りに、前記機構と同一もしぐは類似のしかたで細胞集団内でレプリコンを確実 に維持する機構を発現する核酸のフラグメントは、問題の宿主細胞に密接に関連 するＤＮＡもしくはＲＮＡから部分もしくは全体を得ることができる。推奨され る方法は、与えられた宿主細胞のゲノムまたはその宿主細胞が保有するレプリコ ンのＤＮＡもしくはＲＮＡから、ＲＩｈｏｋｉ伝子（この遺伝子は発現されると 自らが単離された宿主細胞を殺すことができる）に相同か、又はＲｌｈａｋに相 同の遺伝子に相同の核酸配列を選択する方法である。かような配列は、問題の宿 主細胞内の、ｈｏｋとｓｏｋ類似の活性の存在を試験するために計画された実験 に用いることができる。両方の活性が見出された場合は、単離された配列内に有 用なレプリコン安定化領域が存在することを意味する。一方、ｈｏｋＪ伝子様の 活性だけが見出されたならば前記要約の方法によって、必要な調節ループ（すな わちアンタゴニスト）を作製し、それによって潜在的な細胞致死機能を潜在的に 有用なレプリコン安定化機能に変換することができる。

細胞もしくはその子孫を殺ずことができる産物を発現する配列は、アンタゴニス トを発現する配列から別個に挿入されてもよいし、又は２つの配列が、例えばＲ １ｐａｒＢ領域を有するＤＮＡフラグメントの場合があるひとつの核酸フラグメ ントに存在していてもよい。この核酸フラグメントは、問題のレプリコンのタイ プや安定化機能を有する核酸のタイプに適切ないずれの絹換え体ＤＮＡ技術によ ってでも挿入することができる。

したがってこの発明は、ひとつの態様として、前記フラグメントを有するレプリ コンを保有する細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物をエンコードする （又はその産物の前駆体をエンコードする）配列、およびその致死産物のアンタ ゴニストをエンコードする（又はそのアンタゴニストの前駆体をエンコードする ）配列を有するＤＮＡフラグメントに関し、そのアンタゴニストは、前記レプリ コンを保有する細胞内で致死産物（又はその致死産物の前駆体）を抑圧するアン タゴニストであるが、一方前記しブリコンが失われてアンタゴニスト（又はその 前駆体）がもはや連続的に発現されなくなった際にはアンタゴニストの活性が衰 退するものであり、そしてこのことは、前記フラグメントを有するレプリコンが グラム陰性菌内で複製可能なプラスミドである際に、前記ＤＮＡフラグメントが Ｒ１ｐａｒ３領域を有していないならば、現在の、レプリコンなしの現存の細胞 内に存在する致死産物（またはその前駆体）は、もはやアンタゴニストによって 抑圧されず細胞死をもたらすことを意味する。このＦＱ！、様の興味深い例は、 そのフラグメントを有するレプリコンを保有する細胞もしくはその子孫を殺ずこ とのできる産物のメッセンジャーＲＮＡをエンコードする（又はその産物の前駆 体をエンコードする）配列および前記レプリコンを保有する細胞内のメツセンジ ャーＲＮＡの翻訳を阻害するアンタゴニストをエンコードする配列を有するＤＮ Ａフラグメントで構成されている。このレプリコンが細胞から失われると、アン タゴニスト（もしくはその前駆体）はもはや連続的に発現されず、その活性は衰 退し、レプリコンなしの現存細胞内に存在するメツセンジャーＲＮＡの翻訳は、 もはやアンタゴニストによって抑圧されない。

またこの発明は、上記のレプリコンを保有する生きた細胞およびかような生きた 細胞を含有する細胞培養物に関する。その細胞は、細菌、単細胞真核生物、動物 細胞または植物細胞であってもよい。

この発明によって、この発明の安定化原理の容易な利用を確実に行うように、同 じレプリコンに致死機能とこれに対抗するアンタゴニスト機能を与えるのが最も 有利であるが、ｆ−１ｏｋ遺伝子と３ｏｋ遺伝子産物のそれぞれの遺伝情報を指 定する配列又はそれらと相同の配列は、そのレプリコンが宿主細胞に導入された 際この発明の安定化機能が発現されるようなしかたで別個のレプリコンに挿入さ れてもよい。正しい発現を得るために、遺伝子のいずれか一方もしくは両者のプ ロモーター配列を適切に修飾する必要がある場合がある。したがって、もうひと つの態様してこの発明は、Ｒ１ｐａｒＢ　ｈｏｋｉ伝子もしくはそれと相同の配 列を有づるひとつのレプリコンと、Ｒ１ｐａｒ［３５ｏｋＪ伝子もしくはそれと 相同の配列を有するもうひとつのレプリコンとを保有する生きた細胞に関する。

この明細書において、゛それと相同の配列”という用語は、ｐａｒＢ遺伝子類自 体のひとつと相同か、又はｐａｒＢ３Ｎ伝子類の一つと相同な任意の配列と相同 である配列を意味すると解することに注意すべきである。

原則どして、ｈｏｋ３１７伝子と５ｏｋｉ伝子またはその相同配列は、これらの 配列が同じ細胞内で適合して共存できるならば、任意の２つの異なるレプリコン に存在していてもよい。しかし、ｈｏｋ３１１伝子もしくはこれと相同の遺伝子 は、染色体のごとき細胞内でそれ自体安定に維持されるレプリコンに存在するの が好ましく、一方５Ｏｋｉｌ伝子もしくはこれと相同の遺伝子は、安定に維持す ることが要求されるレプリコン、つまり代表的なものとしては所望の遺伝子産物 を発現するレプリコンに挿入するのが最も有利である。それ故にｓｏｋ遺伝子も しくはこれと相同の遺伝子を有するレプリコンは通常、染色体外性で自主的に複 製するヌクオチド配列、例えばプラスミドである。５ｏｋＪ仏子もしくはこれと 相同の遺伝子を有するレプリコンが細胞から失われてその結果ｓｏｋ遺伝子の産 物がもはや連続的に発現されないと、前記原理にしたがって細胞死をおこし、こ のことはこのレプリコンを保有する細胞だけが生存しうるということを意味する 。

またこの発明は、前↓己安定化されたレプリコンの製造方法、すなわち、レプリ コンを保有する細胞もしくはその細胞の子孫を殺しうる産物をエンコードするく またはその致死産物の前駆体をエンコードする）配列と、前記致死産物のアンタ ゴニストをエンコードする（又はそのアンタボニス１〜の前駆体をエンコードす る）配列とをレプリコンに挿入することからなる方法に関し、そのアンタボニス １〜は前記レプリコンを保有する細胞内の致死産物（もしくはその産物の前駆体 ）を抑圧するアンタゴニストであるが、前記レプリコンが細胞から失われその結 果アンタゴニストくもしくはその前駆体）がもはや連続的に発現されないと、そ のアンタゴニスト活性が衰退し、このことは、レプリコンがグラム陽性菌内で複 製しうるプラスミドであって、細胞致死産物とこれに拮抗するアンタボニス１〜 がＲ１ｐａｒＢ領域によってエンコードされないならば、レプリコンなしの現存 細胞内に存在する致死産物（もしくはその前駆体）はもはやアンタゴニストによ って抑圧されず細胞死にいたることを意味する。

上記説明のように、挿入される単一もしくは′ｆ１数の配列は、前記レプリコン に関連する細胞が起源のＤＮＡ　（もしくは利用できるＲＮＡ）の単一もしくし は複数の配列、特にＲ１ｐａｒＢ領域と相同の単一もしくは複数の配列であって もよく、又はその単一もしくは複数の配列は、レプリコンを保有すべき特定のタ イプの細胞に前記配列を適合させるための修飾されたプロモーター機能を有する 、Ｒ１１１１８ｒＢ領域起源のものであってもよい。

またこの発明は、核酸配列によってエンコードされた遺伝子産物の製造方法、ず なわら前記のようなレプリコンを保有する細胞を培養し、次いで前記レプリコン から発現された遺伝子を収穫することからなる製造方法に関する。その培養は、 問題の細胞のタイプに適切な肴通培地、すなわちその細胞タイプに必要な栄養を 含イｊする培地で行うべきである。その培養は通常、その核酸配列によってエン コードされる価値ある産物を充分な生産めで得るために、例えばｉｏｏに１．上 の多世代にわたって行われる。そしてこの培養中、レプリコンの説）茗は、レプ リコン安定化機構が全く利用されない場合に遭遇する脱落に比べて、本願におい て定義されるレプリコン安定化機構によって著しく減少する。かくして、実際に は、安定化されたレプリコンの脱落は、１０′細胞／世代を超えず、通常は１５ −５細胞／世代を超えず、１吋細胞／世代を超えないときが多い。

前記例のすべてにおいて、この発明は、ｐａｒ３もしくはｐａｒ３類似の配列の ようなヌクレオチド配列が、この配列を有するレプリコンの細胞集団内に８３１ ．ノる安定な維持の表現型を仲介する性能に基づいている。この安定化作用を仲 介する配列は、例えばｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝子およびｓｏｋもしくは ｓｏｋ類似の遺伝子によってエンコードされる致死機能とアンタゴニスト機能が 発現されるようなしかたで、レプリコンに挿入されなければならない。そして効 果的に行うために、用いられる宿主細胞のタイプ、例えば細菌、酵母、かび、動 物細胞もしくは植物細胞によって、配列を選ぶのが有利であり、ｓｏｋもしくは ｓｏｋ類似の調節ループのように、正しい調節ループを修飾するかまたは人工的 に再現することが必要である。得られた安定化例構は、上記原理、特にＲｌｐａ ｒＢについて説明した機構と類似のしかたで行われる。レプリコン安定化機構の 要点は、レプリコンを失った細胞はその致死産物例えばｈｏ　ｋ　ｉｌｌｌｌ伝 動産物って殺されるということであるから、この発明は、前記のレプリコンの安 定化機構が、多世代の細胞増殖からなる細胞の大規模培養中、特定の栄養、抗生 物質もしくは細胞の環境に他の変化を付加するなどのいずれの外部からの選択圧 とも無関係なことによって、産業上重要な効用を有する。

この発明のもうひとつの重要な利点は、前記のレプリコン安定化機構が、宿主細 胞と、ヨーロッパ特許願第８２３０６２０７．０号、同公開第０．０８０，８４ ８号に開示の系に必要なレプリコンベクターとのいずれの特定の組合せとも無関 係なことである。それ故にこの発明を技４＋ｉ的に間ｉｆｆる場合には、広範囲 のレプリコン／宿主細胞系のが考えられる。例えばＲｌｐａｒＢ系と同一もしく は類似の系のごときレプリコンを維持する系を作製する一般的な方法をのぺたが 、次に実施例を示ず。

１、グラム陰性菌とダラム陽性菌 細菌宿主細胞内の適切なレプリコンは、例えば、エンテロバクテリア科の細菌［ エンテロバクテリエイシー（（：ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　）　） 内で複製しうるプラスミドの例えばＤＢＲ３２２もしくはＲ１ランアウェイ複製 プラスミド類（ヨーロッパ特許願第８３３０５４３８．０号、同公開第０１０９ １５０号）、または一般にグラム陽性菌内で複製しうるプラスミド、例えばＲ８ Ｆ　１０１０由来のプラスミド類（Ｂ　ａｇｄａｓａｒｉａｎら、Ｇｅｎｅ　１ ６．１９８１゜１）ｐ、　２３７〜２４２）　、またはどイ・サブチリス（３， ５ｕｂｔｉｌｉｓ）のごときグラム陽性菌内で複製しうるプラスミド類例えばｐ Ｃ１９４と　ｐｕ　Ｂ　１１０　（Ｌ　０Ｖｅｔｔ　と）（ｅｇｇｉｎｓ、　Ｍ ｅｔｈ　、ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　６８．１９７９．　ｐｐ、３４２〜３５７） であり、これらはすべて、クローニングベクターとして用いられる際不安定に遺 伝される。かような細菌プラスミドをｐａｒＢ類似の義ｕ４で安定化するために 、Ｒ１ｐａｒＢ領域を有する単一もしくは複数のＤＮＡフラグメントをレプリコ ンに、Ｒｌｈｏｋとｓｏｋの発現がＲ１ｐａｒ３の天然のプロモーターから転写 されるようなしがたで挿入してもよい。Ｒｌｈｏｋとｓｏｋの遺伝子が、例えば イー・コリと他の細菌との間のプロモーター配列の要件の差によって、問題の宿 主細胞内のこれら天然のブ１コモ−ターから転写されない場合、Ｒ１１）ａｒＢ の天然のプロモーター配列は、問題の宿主細胞内にあることが知られているプロ モーターで置換されてもよく、そしてかようなプロモーターは、ビイ・サブチリ ス内で活性な５Ｐ０２フ？−ジブロモ−ターのごとき天然もしくは合成のプロモ ーター類（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（３ｅｎｅ　１６．　＋９８ｔ、　１ｌｌ）、 １９９〜２０６）である。Ｒ１ｈｏｋ３１］伝子産物が量子産物主細胞に対して 致死的でないならば（これはＲ１１１１ａｒＢのレプリコン安定化機能を確立す るための絶対要件である）、Ｒ１ｈｏｋ類似の配列は、問題の宿主細胞（もしく は密接に関連する細菌種）のゲノムまたは問題の宿主細胞（もしくは密接に関連 する細菌種）内に自然に発生するプラスミドから単１１Ｉｌすることができ、次 いで実施例に記載のしかたと類似のしかたで、ＲｌｏａｒＢのひとつのイー・コ リ染色体相同体について細胞致死活性が測定され、次に前記の新たに単離された ｐａｒ３相同体の発現を調節する調節ループが作製され、この作製したループを 問題のレプリコンに挿入すると、使用される宿主細胞に特に適するレプリコン安 定化系が創作される。

かくして細菌内でのｈｏｋ／　ｓｏｋ系もしくはｈｏｋ／　ｓｏｋに類似の系の 使用法には次の工程が含まれる。レプリコンと宿主細胞の適切な選択；選択され た宿主細胞に発現される、ｈｏｋ／　ｓｏｋ系もしくはｈｏｋ／ｓｏｋ系に類似 の糸を有する正しい配列のレプリコンへの挿入；大規枳に生産される１以上の有 用な産物をエンコードする単一もしくは複数の遺伝子の安定化されたレプリコン への挿入；細菌形質転換の標準技術による、細菌宿主への安定化された組換え体 レプリコンの導入；所望の細胞密度に達するのに必要な、例えば１００を超える 世代数を達成するのに必要な栄養を補充した培養基内での前記レプリコンを有す る宿主細胞の培養；ならびに最後の、細胞と培地の収穫およびこれらからの得ら れた産物の単離である。この発明が関連するレプリコン安定化のＩＩは、そのレ プリコンが失われた細胞はレプリコンなしの細胞に発現されたｈｏｋもしくはｈ ｏｋ類似の産物によって殺されるので、細胞集団内の安定化されたレプリコンを 確実に維持するために培養中の培養物を処理する必要が全くないことは強調され るべきである。

２、酵母細胞類 真核系における組換え体ＤＮＡ技術の技術開発は、−次く真核の）遺伝子産物の かような翻訳後の修飾法（特異的な蛋白質分解開裂法、グリオキシル化法など） をえるために望まれているが・このような修飾法は細菌については全くなされて いないか、せいぜい次善の方法でなされているに過ぎない。広く用いられている 真核生物に、酵母のサッカ０ミセス・セレビシェ（５ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）があるが、これの中に天然に生成するプラスミドの２ μのレプリコンは、サツカロミセス・セレごシエ内の２μのレプリコンに天然で は関係のない遺伝子を発現させるためのベクターとして適切なものであった。無 関係のＤＮＡフラグメントの１以上の挿入物を有する２μレブリフンを有する組 換え体ＤＮＡ分子は、酵母細胞内に不安定に遺伝されていることがしばしば見出 される。前記の原理によって、酵母のレプリコン例えば２μレプリコンに挿入さ れるべき塩基配列を単離し構築することは可能で、その配列は、その酵母プラス ミドを安定化するために、Ｒ１１］ａｒＢによるレプリコン安定化の原理を利用 する。

Ｒ１ｈａｋ、！：　ｓｏｋとの遺伝子の天然のプロモーターは、サッカ０ミセス ・セレビシェ細胞内では有効ではないようであるが、多種類の生物内にｈｏｋと 相同の配列の発見によって示された、長期間にわたる進化のｈｏｋ類似の配列の 保存によって、Ｒ１ｈａｋ３仏子とＲｌｈｏｋに関連の遺伝子（例えばｒｃｌ３ −　ｏｒｆ３もしくはｐａｒｌ、又は細菌ゲノム起源で、配列と機能のレベルに おいて、Ｒｌｈｏｋもしくは細菌プラスミド類から単離された類似の遺伝子と相 同性を示す他の遺伝子）の産物の、サツカロミセス・セレビシェのごとき酵母細 胞を殺す能力の試験が現実的なものになっている。実際問題として、このことは 、ｈｏｋ遺伝子もしくはｈｏｋ類似の遺伝子のコードする領域を分離し、次いで そのコードする部分をＴＲＰ１プロモータ（Ｑ　ｏｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．１９８３．　ｐｐ、　２２８７〜２３０２）の ような適切なＦ！ｆ母細胞プロモーターに連鎖させる必要があり、得られたレプ リコンは標準法によって酵母細胞に導入され、ｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝 子の発現の効果が研究される。細胞死が起れば、有用なｈｏｋもしくはｈｏｋ類 似の遺伝子が同定されたのである。

代りに、酵母由来の酵母ＤＮＡ内に同定されかつｐａｒ３もしくはｒｃｌ　Ｂ　 −ｏｒｆ３に相同の配列が単離され、適正な酵母細胞プロモーターに連鎖され、 ２μのレプリコンに挿入され、得られた組換え体レプリコンがサツカロミセス・ セレビシェに導入され、その細胞を殺す能力を試験されてもよい。発現された際 に、例えばサツカロミセス・セレビシェのような酵母類に対して有毒であること を示ｔ　ｈｏｋ３ｉ伝子もしくはｈｏｋ類似の遺伝子から、ＲｌｏａｒＢ系と同 一もしくは類似のレプリコン安定化系が、一般的な方法について討議した際に先 に述べたようにして調節ループを挿入することによって生成する（例えば適当な 酵母プロモーターで調節されたｓｏｋもしくはｓｏｋ類似の遺伝子）。

得られた酵母のｈｏｋ／　ｓｏｋ配列もしくはｈｏ−に／ｓｏｋ類似の配列は、 任意の酵母レプリコン、例えば２μレプリコンもしくはその誘導体に挿入されて もよく、培養中のレプリコンもしくはその誘導体の安定な維持を確実に行うため に、天然では２μのレプリコンに無関係な遺伝子が挿入遺伝子の発現を得るのを 目的として挿入されたのである。このように安定化されたレプリコンは、例えば サツカロミセス・セレビシェ細胞のような酵母細胞に形質転換法もしくは原形質 体融合法によって導入され、選択した後、安定化されたレプリコンを有する細胞 は必要な栄養を補充された適当な培養基内で大規模に培養される。そのレプリコ ンが失われた細胞は、レプリコンのない細胞内に発現されたｈｏｋもしくはｈｏ ｋ類似の産物によって殺されるので、外部からの選択圧は全く必要がない。次い で前記レプリコンを保有する細胞だけで構成されている培養物を収穫し、次いで 該レプリコンから発現されるいずれの有用な産物も、問題の遺伝子と遺伝子産物 の性質によって、酵母ａ１ｍもしくは培養基から単離される。

（以下余白） ３、＠乳類の細胞 特異的な翻訳後の修飾を行うには、細菌もしくは単細胞の真核生物内よりも、ヒ トもしくは動物起源の哺乳類細胞内でのある種の真核遺伝子の発現を要する。真 核細胞内でクローニングベクターとして使用されるレプリコンは、ＤＮＡウィル ス類、例えばＳＶ４０とウシ乳頭腫ウィルスからの、またはＲＮＡウィルス類例 えばレトロウィルス類からの染色体類（ａｒｓレプリコン類）由来のものである 。上記２つのＤＮＡウィルスは、感染細胞中プラスミド状態で維持することがで きるが、はとんどのレトロウィルス類（ＲＮ△含有ウィルス類）は、ウィルスの ＲＮΔゲノムの染色体的に遺伝されたコビイよりも自由に複製するＤ　Ｎ　Ａ分 子として存在づ”るためには遺伝子的に修飾する必要がある。有用な産物の発現 を得るために、天然ではそのレプリコンに無関係の遺伝子が挿入された上記レプ リコンを有する細胞を大規模培養する間に、含有されるレプリコンの安定な維持 について先に検討したのと同じ問題が起こるであろうと予想される。

選択された宿主細胞内でｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の効果を発揮する遺伝子が一 旦同定されれば、ｈｏｋ　／ｓｏｋ系またはｈｏｋ　／ｓｏｋと類似の系を有す る配列は′５９母細胞系について記載したの同様にして作製される。第１段階は 、公知のｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝子類のコーディング配列を、それらの 起源にかがわらず、細菌ゲノムもしくは酵母細胞ゲノムから、ｈｏｋ遺伝子の発 現が発現の誘導期に得られるようなしかたで宿主細胞内で複製しうるレプリコン に挿入する段階である。このことは、ｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の産物は、宿主 細胞内での遺伝子の発現に必要なすべての調節配列を補充されるべきであること を意味する。

ｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝子の上流側へ挿入するのに適するプロモーター 配列は、ステロイドホルモン類によって誘導可能な、マウスの乳癌ウィルスしＴ Ｒ［長繰返し配列Ｂａｎｇｔｅｒｌ！ｆｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　ＳｅｇＵｅｎ Ｃｅ　）　］である。転写が誘導された際に細胞死が起れば、問題の宿主細胞に ついてｈｏｋ遺伝子もしくはｈｏｋ類似の遺伝子が同定されたのであり、このｈ ｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝子から、例えばｓｏｋもしくはｓｏｋ類似のルー プのような調節ループを前記のようにして挿入することによって、レプリコン安 定化系を形成することができる。

細菌もしくは酵母起源の入手可能なｈｏｋもしくはｈｏｋ類似の遺伝子がいずれ も、問題の哺乳類の宿主細胞で毒性効果を発揮しない場合は、新規なｈｏｋ類似 の配列を哺乳類のゲノムから単離し［例えばテトラヒメナ＜Ｔｅｔｒａｈｌ／ｌ １ｌｆ３ｎａ）属のミトコンドリアＤＮＡとヒト細胞ＤＮＡに発見された配列］ 、次いで正しく発現した際のｈｏｋ類似の活性について試験される。新規なｈｏ ｋ類似の配列の検出に推奨される方法は先に要約して述べた。

哺乳類細胞内でのｈｏｋ　／ｓｏｋ類似の安定化機構の使用法には次の工程が含 まれる。ある種のレトロウィルス類について記載したように、自由に複製する分 子として存在しうるし１−〇ウィルスベクターのような適切なレプリコンの選択 Ｊ″３よび挿入されたｈｏｋ　／ｓｏｋ類似遺伝子の発現を調節する実際の配列 による宿主細胞の選択；レプリコンに産生されるべき１以上の所望の産物の遺伝 情報を指定する外来遺伝子の、安定化レプリコンの挿入；ＤＮＡトランスフェク ション法もしくは微量注射法の標準技術による、安定化された＠換え体レプリコ ンの、選択された哺乳類細胞系への導入；前記レプリコンを有する細胞の選択： 有用な産物をエンコードする遺伝子を発現する細胞の大規模培養物を得るために 必要な栄養と成長因子を添加することによって行われる、前記細胞系に適する培 養基内での細胞の培養：ならびに最後の培養物の収穫と所望産物の単離である。

レプリコンに挿入するど安定化機能を発現することを示すいずれのフラグメント についても、その結果得られたレプリコンの安定な維持がこの発明の安定化機構 に起因しているかいないかの試験は次の方法で行うことができるということに注 目されるべきである。

すなわち、安定化機能を発現する被検フラグメントの、与えられたタイプの宿主 細胞内で複製しうるｒｅｐ（ｔｓ）ベクターのごとき条件付きで複製するベクタ ーへの挿入：ベクターはもはや複製しないが、細胞はなお成長して結局ベクター が細胞で稀釈される条件士での、前記ベクター保有の細胞の培養：および前記フ ラグメントを持たない同じベクターを保有する対照の細胞と比較した生存＄Ｉｌ ｌ胞数の測定である。ベクターなしの細胞内でのアンタゴニストが徐々に衰退し た結果、生存数が対照よりも箸しく低い場合は、この発明の安定化機構が同定さ れたのである。コノ試験の手順の例は、Ｇ　ｅｒｄｅｓら、”Ｕｎｉｑｕｅ　ｔ ｙｐｅｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　 ＰＯ３ｔＳｅＯｒｅｇａｔｉｏｎａ＋ｋｉｌｌｉｎｏ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　 −ｆｒｅｅ　ｃｅｌｌｓ”　、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３．１９８Ｇ、　ｐｐ、　３１１６〜３１２ ０１．−記載されている。

この試験を行うのと関連して、ＲｌｐａｒＢもしくはｐａｒ３相同体に対する、 前記フラグメントの可能な相同性について、ハイブリッド形成試験を行うことも できる。

特定のタイプの細胞に適する特定のタイプのレプリコンは先に詳細に検討したが 、この発明の安定化機構を利用する一般原理は、レプリコンおよびそのレプリコ ンを保有する細胞のタイプにかかわらず同じである。すなわら、レプリコンを保 有する細胞内での宿主を殺す機能を抑圧するように、釣合のとれた、宿主致死機 能とアンタゴニスト機能とを同じレプリコンに確立し、かくして細胞集団内でレ プリコンを確実に安定化することである。

図面の説明 この発明をさらに図面を参照して説明する。

第１図は、ｐａｒＢｆｉＥｉ域の欠失地図である。プラスミドＲ１のＥＣ０ＲＩ −Ａフラグメント内のｐａｒＡ領域とｐａｒ３領域の位置を黒色バーで示した。

ＥｃｏＲＩＡフラグメン１へ内の制限酵素座位は、国際特許願第ＰＣ丁／　Ｄ　 Ｋ　８３／　０００８６Ｊ％、ｎ　公Ｅ　第ＷＯ３４／　０１１７２号に記載さ れている。ｐａｒ３領域は、座標の１５゜０〜１６．９によって区分された１、 ９　ｋｂのＰｓｔＩフラグメント内に位置している。そのｐａｒ１３１域はざら に８８０ｂｐのＲｓａエフラグメントの右側の５８０ｂｌ）のところに地図化さ れている。斜線の領域は極小のｐａｒ３を示す。５８０ｂｌ）のｐａｒ３領域内 のｈｏｋおよびｓｏｋ遺伝子の位置も示した。λｐＲプロモーターと、λリプレ ッサー遺伝子のＣｌ８５７対立遺伝子とを有するＢｃｌｌＩ［−３ａｌＩフラグ メントとを、各種ｐａｒ３領域のフラグメントを有するｐＢＲ３２２１ＪＩ体に 挿入した。挿入されたフラグメントとλｐＲからの転写の方向をｐａｒ３領域の 地図の下（矢印）に示す。Ｉ）ＫＧ　６３３．　ｐＫＧ　６３４およびｐＫＧ３ ４ｉ中のλｐＲプロモーターは、ｐａｒ３領域内の左から右方向に読みとれ、一 方１１ＫＧ　１７１内のλ　ρＲプロモーターは右から左方向に読みとれる。制 限酵素座位は、Ｅ　（ＥｃｏＲＩ）、Ｂ　（ＢａｌＩ）　、８２（ＢｏｌＩＩ） 、Ｓ　（ＳａｌＩ）、Ｒ（ＲｓａＩ）およびＰ（ＰＳｔＩ）として示した。

第２図はプラスミドｐＰＲ９５（１３ｋｂ）の地図である。Ｃｏｔ）Ａ　。

ｃｏｐ３はプラスミドＲ１の複製制ｔｌ１３１伝子を示し：ｒｅｐＡはＲ１の複 製に必要な遺伝子を示し；　ｏｒｉは複製の起源である；ｂｌａはプラスミドを 有する細胞にアンピシリン耐性を与える遺伝子を示す；　ｐａｒＢは維持機能を 発現するｈｏｋ３ｉ伝子とｓｏｋ遺伝子を有するＲ１由来の領域を示す；　ｄｅ ｏ　−１ａｃＺ＝はｄｅｏ　Ｃ遺伝子とＩａｃＺ遺伝子間の翻訳融合を示す：　 ＩａｃＺ、Ｙ、ＡはＩａｃオペＯンを示す；Ｃｌ８５７はλＩ）Ｒプロモーター の活性を制御する温度感受性λリプレッサーの遺伝情報を指定する遺伝子を示す 。矢印は転写の方向を示す。黒色バーは、種々の遺伝子の大きさを示す。制限酵 素座位をＳ　（ＳａｌＩ）、Ｂ２（ＢｏｌｌＩ　）　、　Ｂ　（ＢａｍＨＩ　） およびＥ（ＥｃｏＲＩ）で示す。

第３ａ図と第３ｂ図はｐａｒ３領域のヌクレオチド配列を示す。

上方のＤＮＡストランドの５−末端が右に位置している。塩基の番号付けは、第 １図のｐａｒ３領域の座標にしたがっている。

Ｔｅｒは、５０を超えるコドンで構成されるヌクレオチド配列内に存在する読取 り枠の停止コドンを示す。ｆｌｙｌ　ｅｔは読取り枠の出発コドンに相当する。

ｈｏｋ遺伝子産物のアミノ酸配列は、′３ｏ４位置で出発し、ＤＮＡ配列の下に 示した（アミノ酸の略記号は標準命名法のものである）。−１０″と−３５″で 示される配列はｈｏｋとｓｏｋ遺伝子のブロモ−ター構造である。ｐｈｏｋとｐ ｓｏｋはｈｏｋとｓｏｋのプロモーターをそれぞれ示す。ローマ数字は、ステム ・ループ構造を示し、両側に、ステム・ループ構造の配列を示す水平の矢印をつ けた。垂直の矢印はｈｏｌｖＲＮ　Ａの終結を示す。

第４図はｈｏｋｉ伝子がλＩ）Ｒで活性化が誘導された後の宿主細胞の致死状態 を示す。ｐＫＧ６３４（黒記号）もしくはｐＫＧｌｌｌ（白記号）を有する菌株 ＪＣ４１１が、カザミノ酸を補充されたＡ◆Ｂ最小培地内、３０℃で指数関数的 に成長した。時間零で温度を４２℃に変化させ、培養物の成長をＯＤ、と、選択 培地（μｇ／ｌ！ペニシリン含有のＬＢプレート）上での生菌数計算で追跡した 。

第５図は、ＪＣ４１１（１）ＫＧ　６３４）菌株を４２℃に温度をシフトして１ 時間後にサンプリングした細胞の写真である。矢印は、明確に変化した形態を有 する細胞を指摘している。正常の形態を有する細胞も認められる。倍率：ｘ２０ ００第６図は、宿主細胞致死の抑圧を示す。ｌ）Ｆ　６３４のみ（黒記号）また はｐｌ”　６３４プラスＩ）ＰＲ６３３（白色記号）を有するＪＣ４１１菌株は 、カザミノ酸を補充したＡ”　Ｂ最小培地内、３０℃で指数関数的に成長した。

時間零で温度を４２℃にシフトし、培養物の成長を、光学密度（ＯＤ、、　）の 測定と選択培地（１００μｇ／ｌ！カナマイシン含有のＬＢプレート）上での生 菌数計算によって追跡した。

第７ａ図は、ｈｏｋ遺伝子産物とｒｅ＋Ｂ　−ｏｒｆ３遺伝子産物とのアミノ酸 配列の比較図である。保存されたアミノ酸を肉太活字で示し、保存的変化を示す アミノ酸をアンダーラインで示した。

第７ｂ図は、イー・コリｒｅ１３オペＯンのｐａｒＢとｏｒｆ３とのヌクレオチ ド配列の列を示す（３ｅｃｈら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、ｏｕｒｎａｌ　４．１９ ８５．　ｐｐ、　１０５９〜１０６６）。ｐａｒ３配列は上方のストランドであ り、ｒｅ１３−　ｏｒｆ３は下方のストランドであり、第３図におけるのと同じ 座標で示した。垂直のパーは保存されたヌクレオチドを示す。括弧内の数字は、 ３　ｅｃｈらによって与えられたｒｅｌＢヌクレオチド配列の座標である。前記 の２つの配列は、２つの読取り枠の出発コドンが同じ位置になるように一直線に 配列されている。これは　３０４位置のＭｅｔで示されている。２つの読取り枠 の終結コドンは　４６０位置のＴｅｒで示されている。

第８ａ図は、Ｒ１ｐａｒＢプローブを用いるフィルターハイブリッド形成法によ って分析した、イー・コリ菌株由来の、ＥＣ０ＲＩで制限された全ＤＮＡ　（０ ，７５μｇ）を示す。レイン１　：　Ｒｌｄｒｄ−１９；レイン２：Ｒ１００： およびレイン３：Ｒ３８６の各レインは３０分間露出された。レイン４：ＲＰｌ レイン５　：　Ｒ６−Ｋ　：およびレイン６：プラスミドなしのイー・コリの各 レインは５時間露出された。関連の７ラグメントの大きさはキャベース（ｋｂ） で示した。

第８ｂ図は、ｒｅｌ１３−　ｏｒｆ３プローブを用いるフィルターハイブリッド 形成法によって分析したイー・コリ菌株由来のＥＣ０ＲＩで制限されたＤＮＡ　 （０，７５μＱ）を示す。レイン１：Ｒ１００ニレイン２　：　Ｒ３８６，およ びレイン３ニブラスミドなしのイー・コリの各レインは３．５時間露出された。

関連の７ラグメントの大きさはキロベースで示した。

第９図は、Ｒ１ｐａｒＢプローブを用いるフィルターハイブリッド形成法によっ て分析された種々の細菌由来の、ＥＣ０ＲＩで制限された全ＤＮＡ（０，５〜０ ．７５μＱ）を示す。オートラジオグラムは１７時間露出された。同じオートラ ジオグラムの２つの異なる露出時間のものを示す。レイン１：サルモネラ・チヒ ムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　；本明細書では検 討されていない）；レイン２：セラチア・マルセスセンス（Ｓａｒｒａｔｉａ　 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　；レイン３ニブソイトモナス・フルオレスセンス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓ　）　；レイン４ニブソイトモ ナス−プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）　ニレイン５ニブロ チウス・ブルガリス（ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　、本明細書では検討 されていない）；レイン６：エシェリヒア・コリ（［：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ　）　；レイン７：バチルス・サブチリス（３ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）　ニレイン８：バチルス・シルクランス（３ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉ ｒｃｕｌａｎｓ　）　Ｐ　Ｌ　２３６．放射能標識を付したマーカー（Ｈｉｎｄ ｌで制限されたλ）の大きさをキロベースで示した。

第１０図は、ｒｅ１３−　ｏｒｆ３プローブを用いるフィルターハイブリッド形 成法によって分析された種々の細菌由来のＥｃｏＲＩで制限された全ＤＮΔ（０ ，５〜０．７５μｇ）を示す。

オートラジオグラムは１７時間（レイン１９）と７２時間（レイン２〜７）露出 された。レイン１：セラチア・マルセスセンス：レイン２ニブソイトモナス・ス ルオレスセンス；レイン３ニブソイトモナス・プチダ：レイン４：バチルス・サ ブチリス；レイン５：バチルス・シルクランスＰＬ２３６：レイン６と７：ラク トバチルス（ｌ　ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）。放射能で標識されたマーカー（ Ｈｉｎｄｌで制限されたλ）の大きさをキロベースで示した。

第１１図は、ｒｅ１３−　ｏｒ４３　（レイン１〜４）とＲ１１）ａｒＢρｒｏ ｂ　（レイン５〜６）を用いる、真核細胞由来のＤＮＡのフィルターハイブリッ ド形成法による分析結果を示す。ＤＮＡはＥｃｏＲＩ（レイン１〜３と５〜６） 、またはｐ　Ｓｔ工で（レイン４）開裂された。レイン１　：　１．５μｇのテ トラヒメナ・テルモフイラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ）由来の大杉ＤＮＡ　ニレイン２：５μＱの、テトラヒメナ・テルモフイラ由来 の全ＤＮＡ　ニレイン３　：　０．２５　ｕａのビスム・サチブム（ｐ　ｉｓｕ ｍ　ｓａｔｉｖｕｍ＞由来の葉緑体ニレイン５：５μｇの、神経芽細胞腫（ｎｅ ｕｒｏｂｌａｓｔｏｍ）由来の全細胞ＤＮＡ　；レイン６：１０ｆｌの、胎児肝 臓由来の全細胞ＤＮＡ、フラグメントの大きさはキロベースで示す。

第１２図は、広い宿主域のプラスミドｐＦＮＢ　ｐａｒＢ÷の地図である。ｏｒ ｉは複製の起源を示す。：ｌｌ１Ｏｂは、接合性プラスミド（すなわち移動しう る）が同じ細胞内に存在するときに、他のほとんどのグラム陰性菌の種に接合す ることによって、プラスミドを転移させうる配列を示′１Ｊ′；ａｐｈ△はカナ マイシン耐性を与える遺伝子を示す；　１ａｃＺはβ−ガラクトシダーゼをンコ ードする遺伝子である：ｐはプラスミドＲ１由来のｒｅｐＡプロモーターを示す ：　ｐａｒ３は、ｈｏｋとｈｏｂの遺伝子をエンコードする、Ｒ１由来のプラナ ミド維持機能を示す。制限座位は、Ｐ　（ＰｓｔＩ）　、Ｅ　（ＥＣＯＲ工）、 Ｈ＜Ｈｉｎｄ　Ｉｎ）、Ｂ＋　（ＢａｌＱｌ」工）およびＢ２　（Ｂｌ７＋１１ ）で示す。

第１３図は、ｈｏｋ遺伝子の調節のモデルである。細胞分裂の際娘細胞のひとつ が、存在する全ｐａｒＢ’ブンスミドを受ける。

Ａ、ｐａｒＢ’　（ｈｏｋ　＆　、　ｓｏｋ　＊　）をイロする細胞の分裂サイ クルｈｏｋどｓｏｋ遺伝子の産物の両省はそのプラスミドから連続的に産生され る。ｓｏｋの産物はｈｏｋの産物に拮抗しくａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）　、細胞の 生存数に対づ−る影響は全く認められない（１ａ’２ａ）。

Ｂ、プラスミドなしの細胞の分裂ザイクルブラスミドなし細胞内には、１１０に とｓｏｋの産物が存在する。

ｓｏｋ産物はｈｏｋ産物よりもはやく分解しその結果ｈｏｋ産物（３ｂ）を活性 化する。この活性化によって生命の維持に必要な細胞の機能を損傷させ細胞死さ せる（４ｂ）。

第１４図は、１）ＪＥＬ１２４（△）どｐ、ノＥＬ１２６（Ｂ）に基づく翻訳融 合ベクターと転写融合ベクターのｆ１１１限地図を示す。

地図中、Ｃｌ８５７は、λｐＲのプロモーターの活性をｌ１ｌｉｌＩ陣する温度 感受性リプレッサーの遺伝子を示し、ｏｒｉＲｌは複製の起源を示し、ｂｌａは 、プラスミド保有細胞にアンピシリン耐性を与える遺伝子を示し、ＩａｃＺ、Ｙ 、△はｌａｃオペロンを示し、矢印は転写の方向を示し、黒のバーはｐａｒＩ３ 領域からの挿入物の程度を示し、斜線部分はｈｏｋｉ伝子もしくはその一部分を 示し、白抜き領域は５ｏｋＪ伝子もしくはその一部を示し、ｓｏｋ　Ｔは、ｓｏ ｋ遺伝子産物の標的を示し、υ１限酵素座位として、Ｅｌ（ＥｃｏＲＩ）　、Ｂ ｌ　（Ｂａ畦は）および５（Ｓａｌｌ、）を示す。

材料と方法 細菌菌株とプラスミド 次のイーーｍｌリ　Ｋ−１２菌株を用いた。Ｃ３Ｉ−１５０［（Ｉａｃ　−ｐｒ ｏ　）　ｒｐ？１Ｌ］、　ＪＣ４１１（ｍｅｔ　９１ｅｕ　ｈｉｓａｒｇＱ　ｌ ａｃＹｍａｌＡｘｙｌ　ｍｔｌ　ｇａｌ　ｒｐｓＬ　）　、ｌ−２３９２（Ｍｕ ｒｒａｙら、Ｍｏｌ。

（３ｅｎ、Ｑｅｎｅｔ、１５０．１９７７、　ｐ５３　）およびＨＢｌｏｌ（Ｆ 。

［３ｏ１ｉｖａｒおよびに、　Ｂａｃｈｍａｎ、　１ｖｌｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　６８．１９７９゜ｐ２４５　）。ＪＣ４１１を生理学的実験に主と して用いた。Ｃ３Ｈ５０を遺伝子の実験に主として用いた。さらにビイ・サブチ リス菌株Ｂ［）　２２４（ｔｒｐ　（：、　２．　ｔｈｒ　−５，ｒｐｃ　−４ ）　（［）ｕｂｎａｎおよびＣｉｒｉｇｌｉａｎｏ　、　Ｊ、　［３ａｃｔ　、 １１７．１９７４．　ｐ４８８）を、グラム陽性菌での実験に用いた。用いたプ ラスミドを第１表に示した。

ハクテリメファーシスし＋１７　＜Ｗ、△、　ｌｙｌ、１ｏｃｎｅｎ　３３よび Ｗ。

Ｊ　、　Ｂｒａｕｎｎｅｒ　、　Ｇｅｎｅ　８　、１９７９．　ｏｐ、　６９〜 ８０）をブラック・ハイブリダイゼーション法に用いた。

実験の手法としては、微生物遺伝学の分野に採用されている標準法（Ｊ、　Ｍｉ ｌｌｅｒ　、　Ｅｘｐｅｒｉｎｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔ ｉｃｓ　、　Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 、　１９７２）と遺伝子取扱い法（１）ａｖｉｓ、　［３ｏｓｔｓｔｅｉｎとＲ ｏｔｈ　、　ＡＭａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｑｅｎｃｌｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、Ａｄｖａｎｃｅｄ　［３ａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｔｃｓ　、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、１９８０゜ならびにＭａ ｎｉａｔｉｓ　、　Ｆｒ！１Ｓｃ１１ｉ１３よび３μｍｂｒｏｏｋ　、　ｆｖｌ ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａｒｂｏｕ ｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８２）を用いた、 細胞はすべて、０．２％グルコースと１μｇ／ｌ！のチアミン含有のＬＢ培地（ Ｂｅｒｔａｎ５　Ｊ、　Ｂａｃｔ　、　、　６２．　＋９５１．　Ｄ２９３）、 または０．２％グルコースと１％カザミノ酸を補充した△４Ｂ最小培地（Ｃ１ａ ｒｋとＭａａｌφｅ　、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ　、　２３．１９６７゜ｐ ｏ９）を用いた。プレートとしては、ＬＢ培地と１．５％寒天を含有のし△プレ ートを用いた。

マツコンキイ・ラクトース・インジケーター・プレートはメーカーの［）ｉｆｃ ｏの推奨どおりにして作製Ｌ・、Ｘ−ゲルプレー１〜は、２０〜４０μｇ／１１ の５−プロ七−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラク１−シトを、０．２％ のグルコースと１μｑ／１２のチアミンで補充したＡ’　［３８小培地に添加し て作製した。

物理科学的方法 Ｃｌｗｅｌｌどｌ−１ｅｌｔｎｓｋｉ　、　ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｈ　、△ｃｏ ｄ　、　３ｃｔ。

ｔＪｓＡ６２．１９６９．　ｐｐ、　１１５９〜６Ｇに記載の方法によって、透 明な溶解液を作製した。

プラスミドＤＮＡの小規模の作製は、［３ｉｒｎｂｏｉｍら、Ｎｕｃｆ　。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．１９７９．　ｐｏ、　１５１３〜２３の方法によって 行った。

プラスミドＤＮＡの大規模作製と分析は、３　ｔｏｕｇｏａｒｄとＭＯｌｉｎの △ｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１８．　＋９８１．　ｐ　、１８１のダイ・ ボイヤント（ｄｙｅ　ｂｏｙａｎｔ）の密度勾配遠心分離法によって行った。

制限エンドヌクレアーぜは、３７℃で、メーカー（［３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　、 　ｌｙｊａｎｎｈｅｔｍ　ｏｒ　Ｂｌ０ｒａｌｌＳ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ ）の提供する規定にしたがって使用した。２重および３重消化を、最低塩濃度を 要する酵素で出発し、次いでｆｉ衝液を加えて調整してから次の酵素を加えるこ とによって行った。

エキソヌクレアーゼ［３ａ１３１での処理は次のようにして行った。

０．１単位（７）Ｂａ１３１をｓ、ｏｎの線形ＤＮＡに加え、試料を１分、２分 、４分、８分、１重分、３２分および６０分後に採取し７６０ｍＭＥＤＴＡ中に 入れ、フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、２０ｄのＴＥ緩衝液に再分 散させた。その２０通の半量を適当な制限酵素で消化し、アガロースゲルグル電 気泳動法に付して削除されたＤＮＡの削除部分の平均の大きさを測定した。他方 の半量に適切なリンカ−を加え、混合物を過剰のＴ４ＤＮＡリガーゼによって４ ８時間かけて連結させた。

切断されたプラスミドＤＮＡの連結は、プラント末端連結法を除いて、メイ力− に推奨されたのと同様にして行った。

融合プラスミドから発現されるβ−ガラクトシダーゼの測定は、指数関数的に成 長する培養物から、特にＭｉｌｌｅｒの前記文献の記載と同様にしてＩＦ！ｉ造 した。活性度の１重位は、Ｑ［）　４２０／ｍｉｎ　Ｑ［）　４５０／ｘｌ培養 物で示した。リファンピシン（チバーガイギイ社）を高１度（３００μ９／ジオ ）で非透過性菌株のＣＳ　ｌ−１５０に加えた。Ｃ３Ｈ５０（Ｆ　＝　ｌａｃ　 ）の指数関数的に成長する培養物にＩＰＴＧ　（１ｍＭ＞を添加することによっ てｌａｃオペロンを誘導し、同時にリファンピシン（３００μｇ／１１）を添加 したところ、該抗生物質を添加して１分以内に１ａｃＺの合成が停止したことを 示した。

ＲＮ　Ａを製造するため、培養試料（１０ｉｆ）を取り出し、すみやかに０℃に 冷却し、５ｏｒｖａｌｌＳＳ３４ｏ−夕−で回転させ、０．２％ＳＯ８含有のＴ Ｅ緩衝液に再懸濁させ、フェノールで２度、クロロホルムで３度抽出し、エタノ ールで沈澱させ、２００ＡＴ　Ｅ緩衝液に再懸濁させた。

Ｓｌを用いるＲＮＡ末端の地図化を、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記文献に記載され ているのと本質的に同様にして行った。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、２０℃ で一夜、過剰の８１酵素（１００単位）で処理した。ＤＮＡの末端標識付けはｅ ！準法（Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記文献）によって行った。

ｍＲＮＡの半減期のりファンビシン誘導曲線からの計算は、Ｍ、　Ｌ、　Ｐａｔ ｏ　、　Ｐ、　３ｅｎｎｅｔｔ、　Ｋ、　Ｖｏｎ　Ｍｅｙｅｎｂｕｒｇ、　Ｊ。

３ａｃｔ　、１１６．１９７３．　ｆｌｉｔ）、７１０〜７１８によって行った 。蛋白質合成の残余能力（β−ガラクトシダーゼ単位に発現される）は、細胞内 のｍＲＮＡ（すなわち、ｈｏｋ　−−１ａｃＺハイブリツドｆｌｌＲＮＡ）の１ 度に比例するので、前記誘導曲線から最後の平坦域への距離（無限時間に到達す る）として測定した。これらの蛋白質合成の能力値を、時間に対して片対数目盛 でプロットした。この種のプロットは常に直線で得られ、この直線からｍＲＮＡ の半減期を読み取ることができた。

誘導可能なｐａｒ３誘導体類の構築（第１表参照）１）ＫＧ６３３：　λリプレ ッサー遺伝子のｃｌ　８５７Ｑ度感受性対立遺伝子とλρＲプロモーターを含む １）ＯＵ８２の３ａｌＩ−ＢＩＩＩフラグメントを、λＩＩＲプロモーターがｐ ａｒ３領域を左から右へ読取るように、１）ＰＲ６３３のｐａｒ３領域の前に挿 入した（第１図）。類似のしかたで、ＤＯＬＩ８２の５ａｌＩ−ＢａｌＩ［フラ グメントを、ＩＩＰＲ６３４と１ｌＰＲ３４１（いずれもＩ）ＰＲ６３３のＢａ １３１欠失誘導体〉に挿入して１）ＫＧ　６３４とｐＫＧ　３４１を得た。

１）ＫＧ　１７１：　ｐＰＲ１７１にｐＯＵ８２のＳａｌｌ−ＢｇｌＩＩ　７ラ グメントを、反対方向に挿入してｐＫＧ　１７１を得た。挿入されたλｐＲプロ モーターのｈｏｋとｓｏｋの遺伝子に対する位置と方向を第１図に示した。

ＤＦ　６３４：　ｐａｒＢ領域の右の３９０ｂｐの部分とλＩ　８５７−１）Ｒ 誘導可能ブＯモーター系を有する、ｌ１ＫＧ　６３４のＥＣＱＲＩ−８ａｌエフ ラグメントを、プラント末端連結法（プラント末端にされた制限ＤＮＡフラグメ ントを作るために８１ヌクレアーゼを用いた）によってＰＭＬ３１のカナマイシ ン耐性（ａｐｈ　Ａ’　）フラグメント中の唯一のＳａ１工座位に挿入した（Ｄ 、Ｒ。

Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ　、　Ｊ、　Ｂａｃｔ　、１２７．１９７６、　ｐｐ、９８２ 〜９８７）。

Ｒ１由来の翻訳融合ベクターｐＪＥＬ１２［第１４図に示す。

最初の７　コドンを欠いた１ａｃＺ３３１伝子（ＩａｃＺ−）の前にポリリンカ ーを有する１を、ｈｏｋ遺伝子とＩａｃｚ遺伝子との全翻訳融合に用いた。ここ で用いた、Ｒ１に基づく転写融合ベクターと翻訳融合ベクターのコビイ数は約１ ／イー・コリゲノムである。

プラスミド１）ＫＧ　７３３と９ＫＧ　７３２：　ＤＫＧ　７３３は、ｐＰＲ６ ３３のＢａｍＨＩ−３ａｕ３Ａ制限フラグメント（１位置〜３４２位置）を、Ｉ ）ＪＥＬ１２４の３ａｍＨＩ座位に挿入することによって作製した。　３４２の ５ａｕＳＡ座位は、ｈｏｋｌ伝子内にあり、そして１ａｃＺがこの座位に融合す ることによって、Ｉａｃｚ′コーディング領域が続＜　ｈｏｋ３ｉｌ伝子の最初 の１４のアミノ酸からなるハイブリッド読取り枠が形成されるように位置してい る。かくして、翻訳融合プラスミドＩ）ＫＧ　７３３からのβ−ガラクトシダー ゼ活性の発現は、ｈｏｋ遺伝子の発現を通常制御する信号によって制御される。

プラスミド１）ＫＧ　７３２は、１ａｃｔＪ　Ｖ　５プロモーターを有するｐｓ Ｋ８１０ＢのＥｃｏＲＩ−ＢａＩＩＩＨ■フラグメント（１９０ｂｐ　）を、Ｉ ）ＫＧ　７３３の、ｐａｒ３由来挿入物の前に挿入することによって作製される 。

プラスミド１）Ｋ）−１７３４と１１ＫＧ　７３５：　ｐＫＧ　７３４は、１） ＰＲ６３４のＢａ１ｌｌｔ−ＩＩ−５ａＵ３Ａ７ラグメント（１９４〜＋３４２ ）を１）ＪＥＬ１２４の３ａｍ）−は座位に挿入することによって作製した。プ ラスミドｐＫＧ　７３５は、１ａｃＬＪ　Ｖ　５プロモーターを有するＩ）ＳＫ Ｓ　１０６のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（１９０ｂｐ　）を、ＩＩＫ Ｇ　７３４のｐａｒ３由来挿入物の前に挿入することによって作製した。

プラスミド１１ＫＧ　７４１とｐＫＧ　７４２：　ｐＰＲ３４１のＢａＩＩＩＨ ｌ−８ａｕ３Ａフラグメント（’２６８〜ｔ３４２）を１ｌＪＥＬ１２４の１３ Ｂｍｌ−ＩＩ座位に挿入することによって作製した。プラスミド１）ＫＧ　７４ ２は、ｌｌ５Ｋｓ　１０６のＥＣＯＲＩ−ＢＡＮＫＨＩフラグメント（１９０ｂ ｐ　）を、１）ＫＧ　７４１のｐａｒ３由来挿入物の前に挿入することによって 作製した。

プラスミド　ｐＫＧ　７８０とｐＫＧ　７８２：　ｓｏｋ遺伝子と、Ｉａｃｚ− にフレームで融合されたｈｏｋ−３ｉ伝子とをエンコードするＩ）ＫＧ　７３３ のＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩｆｊ限フラグメントを、ｐＰＲ３４５すなわちＢａｍＨ Ｉ　−ＥＣＯＲＩ制限フラグメント上にスミド誘導体（第７図）の３ａ吐（工座 位２つの方向に挿入した。

プロモーター融合プラスミド類：　ｈｏｋとｓｏｋのプロモーターおよびＩａｃ ｚ遺伝子間のプロモーター融合構造体にはすべて、完全なＩａｃＺ道伝子の前に ＥＣ０ＲＩとＢａ１ＩＨＩの制限座位を有する、Ｒ１由来の転写融合ベクターＤ ＪＥＬ１２６（第１４図参照）を用いた。

プラスミドｌ］ＫＧ７３０とｐＫＧ　７３６：　ｐＫＧ　７３２とｐＫＧ７３５ とのＥｃｏＲＩ制限フラグメンｌ−をｐＪＥＬ１２６のＥＣ０ＲＩ座位に挿入す ることによって、ρＫＧ７３０とρＫＧ７３６をそれぞれ得た。

プラスミドｐＵＣ３４１：　ｐＰＲ３４１のＢａｍＨＩ−ＥＣＯＲＩ制限フラグ メノト（２６８〜　５８０）を、ｐ、ノｌ：１１２６の１ａｃＺ遺伝子の前の小 さいＥｃｏＲｌ−Ｂａｍ１−Ｉ　Ｉ制限フラグメン［・で置換して、Ｉ）ＵＣ３ ４１を得た。

微生物学的方法 分配試験■：ｌａｃ◆ベクターが作製されたことによって、非選択的マツコンキ イのラクトースプレー１〜もしくはＸ−Ｇａ１プレート上で単に画線培養するだ けでプラスミドのＰａｒＩ′表現型の測定が可能になった。これらのプラスミド を保有する細菌く△Ｉａｃ　）は、Ｌａ０４表現型を伝達して指示プレート上に 着色コロニイとして容易に出現する。一方ブラスミドなしの細胞はＬＡＣ−衣用 型を有し、無色のコロニイとして出現する。

分配試験ＩＩ：　（ＬａＯ−プラスミド用に用いられる）二選択プレート（抗生 物質含有プレート）から１ｑだコロニイを、別の選択プレート上に画線培養した 。このプレートからのひとつのコロニイを、単一コロニイが形成ザるように画線 １８ａした。ＬＡプレートからのほぼ１０のコロニイを１′Ｉ！の０．９％Ｎａ 　Ｃ１溶液に懸濁させて１０″と１０”とに稀釈した。１０４と１０″の稀釈液 の０，１ｙｌをＬＡプレート上に流延した。これらのプレートから、５０のコロ ニイの耐性パターン（弱い不安定性が予想される場合は２００のコロニイ）を適 当な選択プレート上で試験した。次いで下記式に基づいて脱落の頻度（ＬＦ値） を計算するここでνはプラスミド含有細胞の頻度であり１コ［］ニイが２７世代 成長すると仮定している。この方法には本来大きな統計上の変動がある。

分配試験ｍｘ　ｌａｃ番プラプラスミドａｃ−プラスミドの安定性の定量測定法 。ひとつの完全なコロニイを選択プレートから採取し、１１！の０．９％ＮａＣ １溶液に再懸濁させ濃度を１０”　＠胞／１！にした。１０−３稀釈液０，１ｙ ｔｌの２つをそれぞれ、１０１！のＬＢ培地の２つに接種するのに用いた。接種 は３０℃で振盪しながら行った。約５ｘｉｏ’細胞／Ｈの細胞密度になった時、 培養物ヲ１０４倍と１０　’　ｆｅｔ　ニｍ　ｍ　１．／　ＴＣ０１０’　ｆｔ ｌ’ＪＲＭ（Ｄ　Ｏ，１ｙＪｌ（５Ｘ１０’細胞〉を１０１１の新たに作ったＬ Ｂ培地に接種するのに用い、１０５稀釈液の０．４１７をマツコンキイ・ラクト ース・プレート上に流延し、そのプレートを３０℃で一夜１ａ養した。５ｘｌＯ ’／ｙｆから５ｘ１０２／ｙ、ｆへの稀釈は２０世代の成長（２）に相当するの で、１つの稀釈液から次の液へとプラスミドを有する細胞の頻度がこのように変 化することは２０世代の成長の間に起こる変化に相当する。一般に、ＬＦ値は次 のようにして計算することができる ！＋ νｓ　＝　（Ｉ　ＬＦ）　およびν２＝（１−ＬＦ）’ここでν１とν２はそれ ぞれ、９１と９２の世代数のプラスミド含有細胞の頻度であり、ＬＦは脱落の頻 度／細胞／世代であこの式を用いれば、タイム零における接種細胞の数の変動に よる誤差は回避される。この式のより便利な近似式は次のとおっである。

ＬＦ＝Ｉｎ（νｔ　／ν２）／（ｈ　’ＪＩ）不和合性試験 挿入されたｐａｒ領域を有すると信じられるプラスミドを、同じｐａｒ領Ｍをも ち、そうでな（）れば和合しうる２つのレプリコンは互に和合できず、選択圧が なければ両者のいずれかが失ねれるに至るという知見を利用することによってス クリーニングした。この試験は、被検プラスミドを別のプラスミドを有する細菌 菌株に導入し、両プラスミドを二重選択プレート上で選択することによって行う 。二重選択プレート（ふたつの異なる抗生物質含有のプレート）上に画線培養し た後、不和合性を定量的もしくは定性的に測定した。

定性的不和合性試験の場合は、二重選択プレートから採取したコロニイをＬＡプ レート上に画線培養して単一のコロニイを形成させた。このプレートから採取し た約１０のコロニイをそれぞれ、１１！の０．９％Ｎａ　Ｃ１溶液に再懸濁させ 、それぞれ１０″と１いに稀釈した。１０′と１０４との稀釈液の０．１ｖｌを ＬＡプレート上に流延した。これらのプレートから、５０のコ０ニイ（または弱 い不和合性が予測された場合は２００のコロニイ）を適当な選択プレート上で試 験した。ＬａＣ４プラスミドが試験中に含まれている場合は、マツコンキイ・ラ クトース・インジケーター・プレートを、選択プレートでのレプリカ培養法の代 わりに用いた。ｌａｃ÷プラスミドの場合、スクリーニングは、Ｐａｒをプラス ミドと予想されるプラスミドを、１−ａｃ斗表現型を仲介するＰａｒ’ハイブリ ッドプラスミドをすでに保有している菌株に形質転換することによって行った。

プラスミドの不和合性と、その結果として起こる、入ってくるプラスミドの特異 的なｐａｒ’表現型の証拠は、常在性Ｐａｒプラスミドが不安定化されたこと示 すマツコンキイプレート上のｌ、−ａｃ−コロニイをスクリーニングすることに よって容易に検出できる。このスクリーニング法の実施例は実施例４に記載しで ある。

不和合性の定量的測定は、上記のように、ペテロブラスミド集団を確認した後、 ｌ　ａｃをプラスミドの脱落頻度を測定することによって行った。ＬＦ値は、゛ 分配試験■″で記載したのと同様にして測定した。

染色体ＤＮＡの精製 全ＤＮＡを次のようにして細菌から抽出した。細胞を遠心分離で収穫し、１Ｘ　 Ｔ　Ｅ　Ｎ緩衝液［ＴＥＮ＝１０　ＣＩＭＴＲｌ５（ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥ ＤＴＡ１０．ＩＭＮａ　ＣＩ　Ｅで２回洗い、１ｍｇ＃ｆのリゾチーム含有の１ ／１０容積のＴＥＮ緩衝液に再懸濁させた。３１℃で３０分間の培養の後、その 原形質体をドデシル硫酸ナトリウムを添加して溶解し、最終濃度を１％とし、プ ロテイナーゼＫを０．２５ｍＱ　／ｘｉまで加えた。得られた溶液を３７℃で２ 時間培養し、次いで緩衝フェノールで２回抽出し、クロロホルムで３回抽出した 。酢酸ナトリウムを０．３Ｍ添加し、次いで１容鼠のイソブＣパノールを添加し て［）ＮＡを沈澱させた。

沈澱を９６％と８０％のエタノールで数回洗った。最終的に、得られたＤＮＡを １ｍＭＴＲＩｓ、１ｍＭＥＤＴＡに溶解した。

テトラヒメナ・テルモフイラＢＶＩｒ由来の全ＤＮＡを、Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｈ およびｌ：ｎｇｂｅｒｇ、　Ｊ、：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　１３ｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　８２５　、１９８５．　ｐｐ、　３０〜３８に、よって作製した。テ トラヒメナ・テルモフイラＢＶＩ［由来の大杉を単離しくＣｅｃｈ　、　Ｔ、　 Ｒ。

ら、Ｃｅ１ｌ　２７．１９８１．　Ｄｐ、４８７〜４９６）　、ＤＮＡを抽出し た（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、前記文献　ｐｐ、２８０〜２８１）　。テ トラヒメナ・テルモフィラＢＶＩｒ由来のｒＤＮＡを、［：ｎｇｂｅｒｇ、　Ｊ 。

ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　、１０４．１９７６、　ｐｏ、４５５〜４１０ ）に記載されているのと同様にして作製した。

ビスム・サチブム由来の葉緑体ＤＮＡを、３００ｋｊａｎＳ　、　Ｇら、Ａｎａ ｌｙｔ　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、１４１．１９８４．　ｐｐ、２４４〜２４７によ って単離した。

合法的人工流産による７週間胎児の肝臓を生理的食塩水内で細かくきざみ、ＤＮ Ａを１ｙｊａｎｉａｔｉｓら、１９８２．前記文献１）Ｉ）、２８０〜２８１に よって作製した。同様のしかたで、神経芽細胞腫の患者の腫瘍生検試料からＤＮ Ａを単離した。単離したＤＮＡが数百倍も増幅された染色体領域を有することが 見出され、対応してその腫瘍細胞は、分裂細胞の顕微鏡検査によって多数の染色 体外ミニクロモソームを含有していることが見出された。

放射能標識用ＤＮＡフラグメントの単離１ｏｏμｏ　（７）　Ｉ）ＰＲ９５（！ ：　Ｉ）ＢＤ２７２４のＤＮＡを、ＥＣ０ＲＩとＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［［そ れぞれで消化した。得られたフラグメントを、１％アガロースゲル含有のトリス −硼酸塩緩衝液を用い、５ボルト／口で７時間、電気泳動させて分離した。所望 のフラグメントを、メーカーの推奨法にしたがって、ＮＡ４５膜（３ｃｈｌｅｉ ｃｈｅｒ　＆５ｃｈｉｉｌｌ　）に電気層＠　（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ ）することによって単離した。６５℃の１．５ＭＮａ　Ｃ１内でのフィルターを 溶離することによってフラグメントを回収し、次いでそのフラグメントを、アガ ロース・ゲル・電気泳動法に付し、得られたゲルからＮＡ４５膜で回収して再度 蹟製した。

アガロースゲル電気泳動法 ＤＮＡは、メーカーの推奨法にしたがって適当な制限エンドヌクレアーピで切断 させた。細胞性ＤＮＡに対しては、１０単位／μａ　ＤＮＡを用いた。培養時間 は３７℃で３時間であった。

生成したＤＮＡフラグメントを、０．７％もしくはトリス−酢酸塩緩衝液の０． ７％もしくは１％のアガロースゲルを用い、０．８ボルト／ｃｍで１８時間電気 泳動法に付して分離し、次いでエチジウムプロミド染色法によって視覚化した。

分子量マーカーを次のようにして作製した。ｗｔ／１ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［［で 制限し、フレノウ・ポリメラーゼ（Ｂ　ｏｅｈｒｉｒ＋ｏｅｒ　。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）を用い、メーカーの推奨法によって、α−３２Ｐ−ｄＣ丁 Ｐプラス非放射能性のｄＡＴＰとｄＧＴＰの存在下で末端に標識をつけた。分子 量マーカーとして用いる際、テトラヒメナの大杉ＤＮＡの聞は、試験レインのＤ ＮＡの負加聞に対応して添加した。

ＤＮＡフラグメントのゲルからニトロセルロースフィルターへの移転 ０．２５規定塩酸内、１５分間、室温で部分脱プリン反応に付した後、ゲル内の ＤＮＡを変性させ、中和し、続いてＤＮＡをゲルからＢＡ８５ニトロセルロース フィルター（５ｃｈｌｅｉｃｌ＋ｅｒ　＆５ｃｈｕｌｌ　）に移転させた（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら、１９８２、前記文献、ｐｌ）、２８０〜２８１）。移転が完全 に行われたことは、移転後のゲルをエチジウムプロミド染色法で確認した。

放射能で標識を付けたプローブの製造 ０．３μｇの９００ｂｐ　ｐａｒ　Ｂフラグメントと０．３μｇの３００ｂｐｒ ｅｌＢ　−ｏｒｆ３フラグメントに、ニック翻訳法ＣＭａｎｉａｔｉｓら、１９ ８２、前記文献）により、０．２５μａ＋ｏｌのα−３２Ｐ−デオキシシチジン トリホスフェート（３０００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）を用いて、放射能標識を付けた 。合体されなかった放射性前駆体はエタノール沈澱法を繰り返し除去した。

各製剤に、キャリヤーとしてイー・コリｔＲＮＡを１００μ０添加した。

プローブの比活性はそれぞれ、ｐａｒ３とｒｅ１３−　ｏｒｆ３のμＱ当り２〜 ３Ｘ　１０”および４〜５Ｘ１０’　ｄｐｉであった。

ハイブリッド形成 アガロースゲルから移転された［）ＮＡを含有するフィルターを、プラスチック ・バッグ内でハイブリッド形成溶液（１０ν１／１２０ｃ＋Ｊ）で、１８時間、 ３７℃にて絶えず振盪しながら予備培養した。そのハイブリッド形成溶液は、Ｗ ａｈｌら、ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　７６、１９７９．　ｐｐ、　３６８３〜３８８７のも のを改変したもので、３８％脱イオンホルムアミド、０，７５　ＭＮａ　ｃｌ　 、　５０　ｍＭリン酸ナトリウムおよび１０×デンハート溶液［［）ｅｎｈａｒ ｄｔ　−５ｓｏｌｕｔｉｏｎ　：　５０ｘデンハート溶液は０．２％ウシ血清ア ルブミン、０．２％ポリビニルピロリドンおよび０．２％フィコール（Ｆｉｃｏ ｌｌ　）を含有］を含有している。

予備培養の後、変性し放射能で標識をつけたプローブを適当なフィルターに添加 した。そのｐａｒ３プローブを用いる実験では、ハイブリダイゼーション反応中 のフラグメントの濃度は３１１！Ｉｔ　／１１であり、一方ｒｃｌＢ　−ｏｒｆ ３プローブは１．３ｎＱ／１１の濃度で使用し、２つの場合の、等モル濃度の相 補的塩基配列を得た。

ハイブリッド形成反応は、３７℃でおだやかに振盪しながら１９時間行った。

ハイブリダイズされたフィルターは、０．４×洗浄緩衝液内で２０分間室温で一 回洗浄い最後に、４Ｘ洗浄緩衝液内で３０分間６０℃で２回洗浄した。洗浄［ｉ 液は、０．６ＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５ ０ｎ＋　Ｍリン酸ナトリウムＰＨ６，５を含有している。Ｘ線フィルムを用い、 スクリーンを増感させてオートラジオグラフィに付した。露出時間は図面の説明 に記載した。

゛フィルター・ハイブリッド形成・分析法”　（ｆｉｌｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）という用語は、実施例で用いられ、次の順 序の操作を示す。すなわちＤＮＡフラグメントのアガロースゲル電気泳動法、得 られたフラグメントのニトロセルロースフィルターへの移転、放射能で標識がつ けられた適当なプローブでのハイブリッド形成反応、フィルターの洗浄、および 洗浄後のフィルターのオートラジオグラフィである。実施例に示すデータは、フ ィルターのハイブリッド形成分析法によって得られたオートラジオグラムを示す 。

この明細書の相同性という用語は、分析されている、与えられたプローブと核酸 線との間に任意の程度の相補性が存在づることを示すために用いたものである。

相同性の程度は、分析されている、与えられたプローブと核酸線どの間の形成さ れた２重の核酸分子内の相補塩基のフラクションとして発現される。

検出可能な相同性の最小の度合は、ハイブリッド形成反応に採用される実験条件 と、分析されているプローブと核Ｍ種の特性との関数である。

プローブＤＮＡとフィルターに結合したＤＮＡ種との間の相同性の度合は、１０ ０％相同のフィルターに結合した配列について観察されたシグナル強度と同条件 下で比較した実際のハイブリッド形成シグナルの強度から測定した。

ハイブリッド形成シグナルの強度は、ハイブリッド形成の比率と明確にハイブリ ッド形成バンド内に存在するフィルターに結合したＤＮＡ分子とに主として左右 される。ハイブリッド形成の比率は主として、ハイブリッド形成反応中の相補配 列の濃度、イオンの状態、温度、およびプローブＤＮＡとフィルターに結合した 分子との間の相同性の度合によって測定される。ハイブリッド形成の比率は非相 補の配列の存在によって減少しく３ｏｎｎｅｒ　、　Ｔ、Ｉ　、ら、Ｊ、１ｙｌ ｏｌ、３ｉｏ１．８１．１９７３．　ｐ１２８）またこの存在によって２重ＤＮ Ａの熱安定性を低下する。プローブとフィルターに結合したＤＮＡ間の１％の不 適性によって熱安定性が１度減少することになる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８ べ前記文献、ｐ、３８８＞。それ故ハイブリダイゼーション条件が、不適性のど ちらのレベルが検出しうるシグナルを光するかを決定する。本願の研究で採用し た条件は、フィルターに結合したＤＮＡをプローブで飽和するにいたらなかった ことに注目すべきである。

ハイブリッド形成とフィルターの条件のこの組み合わせによって、ＤＮＡ二重型 を、同じイオン環境において完全に結合した（ｃ＋ａｔｃｈｅｄ　）二重型ＤＮ Ａの平均融点より４０℃低い温度になる。すなわち、それらの条件によって、多 くの対になっていない塩基を有す二重型ＤＮＡからのシグナルの検出が可能にな る。

これらの計算に用いる式は３ｅｌｔｚ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｍｅｔｈ　。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、１００．１９８３．　ｐｐ、２６６〜２８５で検討されている 。

その採用された条件によって、１００％相同性から８０％相同性まで低下した二 重型ＤＮＡから得られる最大ハイブリッド形成シグナルの１００％を検出される が、一方６０％相同性の二重型ＤＮＡからのシグナルは上記最大強度の５０％で あると考えられる（上記参照）。６０％より低い相同性の二重型ＤＮＡはさらに 低いシグナルを発するであろう。

広範囲の不適性をもつ２重型ＤＮＡについては、オートラジオグラムの露出時間 を延長できるか、またはフィルターに結合した相補分子のコビイ数を増加できる ならば、信号は検出可能である。

第１表　プラスミド類 プラス　ベクター　ｐａｒＢｐａｒ［３挿入物　不和合性″ミド　レプリコン　 発現型　の座標　（グループ）（第１図参照） Ｒｌｄｒｄ−１９Ｆｌｌ ｐＰＲ９５Ｒ１”　Ｃｈｏｋφ、　ｓｏｋ”Ｊ　−３００−’５８０ｐｐＲ：１ １１Ｒ１φ（ｈｏｋ”、　ｓｏｋつ　−３００−−５１１０ｐＰＲ６３３ｐＢＲ ：１２２　”　（ｈｏｋｌ、　ｓｏｋφ）　・Ｉ　−”５８０ｐＰＲ６３４ｐＢ Ｒ］２２　−　（ｈｏｋ−）　１９４−　’５８０ｐＰＲ３４＋　ｐＢＲ３２２ −（ｈｏｋｌ）　や２６８−５８０ｐＰＲ＋７１　ｐＢＲ３２２−−３００−’ ４８８ｐＰＲ＋５４　ｐＢＲ３２２−（ｓｏｋ◆）　−３００−’３３０ρＫＧ ６３４ｐＢＲ３２２−（ｈｏｋφ’ｌ　−１９４−’５８０ｐＫＧ３４１　ｐＢ Ｒ：１２２　−　（ｈｏｋｌ）　”２６［１−’５８０ｐＫＧ＋７１　ｐＢＲ３ ２２−−：ｌＯｏ　−会２８８ｐＦ６３４Ｆ−（ｈｏｌｅ−）φ１９４−”５８ ０ｐＯＬ１９４　ｐ＋５　・（ｈｏｋφ、　ｓｏｋリ　−１１００−−７６０Ｐ ＪＥｌｊ２４　Ｒ＋ ＰＪＥＬ１２６　Ｒ１ ｐｓＫｓ＋０６　ＰＭＢ＋ ｐＢＲ３２２ｐＭＢＩ ＰＨ８４ＰＭＢ＋ ｐＰＲ４：ｌ　ｐＭＢＩ　−３００−−５８０ｐＰＲ：１４１　ｐＭＢＩ　ｃｓ ｏｋ）”２６Ｂ　−５１３０ｐＰＲ：１４５　ｐＭＢＩ　（ｈｏｋ−、５ｏｋ− ）　”３５０−　”５８０ｐＰＲ７３７Ｒ＋　（ｈｏｋ’、　ｓｏｋ”）　’１ −　”５８０ｐＰＲ７３１３Ｒ１（ｈｏｋ”、ｓｏｋ’つ　−１９４−−５８０ ｐＬＪｃ３４１　Ｒ１（ｓｏｋ−）　”２６Ｂ　−”Ｓ８０プラス　ベクター　 ｐａｒ３　ｐａｒ３挿入物　不和合性゛′ミド　レプリコン　発現型　の座標　 〈グループ）（第１図参照） ｐＫＧ７３２　Ｒ１（ｈｏｋ’−１ａｃＺｚ　ｚｏｋ”）　”１−０３４２ｐＫ Ｇ７３３　Ｒ１（ｈｏｋ’−１ａｃＺｚ　ｓｏｋ”）　φ１−３４２ｐＫＧ７３ ４　Ｒ１（ｈｏｋ’−／ａｃＺｚ　ｓｏｋ”）　１９４−　◆３４２ｐＫＧ７３ ５　Ｒ１（ｈｏｋ’−Ｉｏｃｚ・、ｓｏｋ”Ｊ　”１９４−”３４２ｐＫＧ７３ ６　Ｒ＋　（ｓｏｋ”）　命＋９４−３４２ｐＫＧ７４１　Ｒ＋　（ｈｏｋ’− １ｏｃ’ｌ”）　”２６Ｂ　−”３４２ｐＫＧ７４２　Ｒ＋　（ｓｏｋ−）　” ２６＋１−　・３４２ｐＫＣ７８０ｐＭＢＩ　（ｈｏｋ−１ｏｃＺ″−、ｓｏｋ 番）　参＋　−０３４２ｐＫＣ，７８２ｐＭＢｌ　（ｈｏｋｌａｃＺ”ｍ　ｓｏ ｋφ）◆１−・３４２ｐｓ１−＋　ｐｕａｎ。

ＰＭＢ＋ ＰＪＫ３−＋　ＰａＣｌ２ ９ＭＢ＋ ”Ｂｕｋｈａｒｉ、　５ｈａｐｉｒｏｔｊよびＡｄｈｙａ　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ 　ｎ５ｅｒｔｉｏｎ　Ｅｌｅｗｌｅｎｔｓ　、　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｎｄ　Ｅ ｐｉｓｏｍｅｓ　、　Ｃ０Ｉ（ｌ　５ｐｒｉｎｏ　ｔ−１ａｒｂ。

ｕｒ、　Ｎｅｗ　’１’ｏｒｋ　、　＋９７７参照（Ｌ・人１＝／：ｆ：　ら　 ） （実施例１） ＰａｒＢｌＪ域の欠失マツピング（第１図参照）ｐＰＲ９５の構築（第２図） ｐＰＲ９５の構築は次のように行なわれた。プラスミドｐＯＵ　９　Ｂ　（Ｇｅ ｒｄｅｓら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６１．１９８５゜ｐｐ２９２−９８） はプラスミドＲ１（第１図）のＥｃｏＲ１−Ａフラグメントから導かれたｐａｒ １３　ｐｓｔｉフラグメントを含むｐＢＲ３２２誘導体である。そのｐｓｔエフ ラグメントは第１図に示すように制限酵素ＲｓａＩにより便利に小さな数フラグ メントに分けられる。通常のクローニング法によりその最も大きいＲｓａＩフラ グメント（ｓ　ｓ　ｏ　ｂｐ）　はｐＢＲ８２２由来のクローニングベクターｐ ＨＰ　３４　（ＰｒｅｎｔｋｉらＧｅｎｅ１７．１９８２．ｐｐ１８９−９６） のＳｍａＩ部位に挿入しｐＰＲｌ　３とした。ｐＨＰ８４のＳｍａ　工部位は２ つのＥｃｏＲＩ部位の両端に代えられ、それによって挿入された８８０塩基対（ ｂｌ））のＲｓａ工７ラグメントは９００塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントに変 換された。そのようにして作られたｐＰｌ　１３　の９００塩基対のＥｃｏＲＩ フラグメントはｍ１ｎｉＲ１由来のｐＯＵ　８２　（国際特許出願筒ＰＣＴ／Ｄ Ｋ８Ｂ１０００８６号、同公開第ＷＯ３４１０１１７２号）のＥｃｏＲＩ部位に クローニング１ＬｐＰＲ９５をｑ％ｆ：。ｐＰ几９５を第２図に示した。　プラ スミドｐＯＵ　８２は分配機能を欠いているために不安定に植え継がレテイル（ 国際特許出願用ＰＣＴ／ＤＫ８８１００８６号同公開第ＷＯ３４１０１１７２号 ）。そして１世代１細胞にっき１０　の頻度で脱落する。

他方ｐＰＲ９５は非常にまれに脱落し１世代１細胞当り１０　をこえない頻度で 脱落する特徴を有する（国際特許出願用ＰＣＴ／ＤＫ８３１００８６号、同公開 第ＷＯ３４１０１１７２号中＋　。

に述べられたように測定された）。それはｐａｒＢ　ｍ１ｎｉＲ１誘導体の特徴 的な脱落頻度である。このようにして完全なｐａｒＢ領域はｍ１ｎｉ几ルプリコ ンを安定化させるフラグメントの能力によって判断されるように８８０塩基対の Ｒ８ａＩフラグメント上に位置する。

ｐａｒＢ領域の詳細な制限酵素マツピングは次のように行なわれた。ｐＰＲ９５ はＢａｍＨＩによって切断され、エキソヌクレアーゼＢａ１３１によって処理さ れ、次いで結合された。その結合の前にＢａｍＨエオリゴヌクレオチドリンカー が付加された。この処理によってｐａｒＢ領域の左側を含む一連の欠失誘導体が 得られる。その欠失の大きさはそのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで 処理した後、アガロースゲル上でＤＮＡフラグメントの大きさを分画することに より決定された。

次にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーの正確な挿入部はΔｉａ　Ｘ　ａｍ とＧ１１ｂｅｒｔによって述べられたヌクレオチド配列決定法によって決められ た（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５　。

１９８０　、ｐｐ４９９−５６６）。このような方法でその領域の非常に詳細な 地図が得られた。さらに各々のプラスミド誘導体に対するｐａｒＢ　表現型（材 料と方法の項に述べられたようにして決められた）は解析された。ｐＰＲ９５の −３２０から０の間の配列の欠失（第１図参照）によって得たｐＰＲ８１１の中 の残る５８０塩基対のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは完全なｐａｒＢ　 領域を含んでいるにちがいない。その領域の中をさらに左から欠失させると完全 に安定化活性を消失する。

ｐＰＲ３１１の５８０塩基対のｐａｒＢフラグメントの右の部分の欠失（第１図 参照）はｐａｒＢ　表現型の消失となる。そのようにｐａｒＢ　領域はこのフラ グメント端に近い位置に存在する。

（実施例２） ｐａｒＢ領域のヌクレオチド配列（第３図参照）第３図に示されたミニマルｐａ ｒＢ　のヌクレオチド配列はΔｉａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ　により述べられ た化学分解法（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５，１９８０．Ｉ）１）４９９〜 ５６６）を用いて決められた。次のようにｐａｒＢ　領域の塩基配列内の必須の 生物学的情報は詳細に記載される。

実施例１で定義されたように５８０塩基対のミニマルｐａｒＢ領域の塩基配列（ 第１図参照）は第３図に描かれる。その領域の中央と左側部分は２回対称性に富 んでいる。その５８０塩基対は５０コドン以上からなる３つのオープンリーブイ ブフレームから成る。これらのリーディングフレームの開始及び終止のコドンは 第３図に示される。その＋３０４位から始まり＋４６０で終わるリーディングフ レームの前にはイー、コリのリポソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒ ｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）２５４，１９７５．１）Ｉ）３４−３８）に似 たＤＮＡ配列（５’−ＡＧＧＡ−３’）が存在する。その部位はｍＲＮＡの翻訳 を開始するリポソームに対する認識部位として作用することが知られている。こ のリーディングフレームのポリペプチド産物は第３図のＤＮＡ配列の下に示され る。

（実施例３） ｐａｒ　Ｂ領域から発現される機能（第４図及び第５図参照）一連のプラスミド が構築され、それからｐａｒ　Ｂ領域内の推定遺伝子（配列から示されるような ）の条件付の発現はλｐＲプロモーター及びλｃＩ８５７遺伝子をもったフラグ メントの挿入によって得られる。これらの挿入部は＠１図に示される。λｐＲ温 度誘発プロモーター系が選ばれた理由は、λｐＲプロモーターの調節遺伝子（Ｃ ｌ８５７遺伝子）とλｐＲは共に単一のＢｇｌＵ−８ａｌＩフラグメント上に位 置しているためである。さらにλリプレッサー遺伝子のＣｌ８５７　対立遺伝子 は高温（４２℃）で挿入プロモーターを誘発出来るようにする。

しかし低温（３０℃）で静止又は静止に近い状態にする。ｐＯＵ８２のＢｇｌＵ −８ａｌＩフラグメントがプラスミドｐＰＲ６８４とｐＰＲ３４１に常法のクロ ーニング法により挿入され、それぞれプラスミドｐＫＧ６１４及びｐＫＧ３４１ を得た（材料と方法の項参照）。

ｐＫＧ６８４とｐＫＧ３４１をもつ細胞はｇｏ’ｃで正常に増殖する。しカルな がら４２℃でλｐＲの誘発は宿主細胞の急速な死を招く。

第４図は、致死速度（生存細胞数測定）とＪＯ４４１（ｐＫＧ６３４）株の４２ ℃へ温度上昇後のＯＤ　４５０で測定される増殖曲線とを示す。生存細胞数は急 速に減少しく半減期２．５分）ＯＤ４５０の増加は止まる。反対方向（ｐＫＧ１ ７１）にｐａｒ　Ｂ領域を転写するλｐ几プロモーターの存在は細胞増殖と生存 性に影響を与えない（第４図、コントロール）。

λｐＲプロモーターの熱誘発後の細胞（ＪＣ４１１／ｐＫＧ６３４）の顕微鏡検 索（位相差）は細胞の変形した形態を示した。はとんどの物質は帯状に明らかに 凝集しており、細胞の残りの部分は透明のままである。この実例は第５図に示さ れる。

その図には正常と変化した細胞を示した。特徴的なｐａｒＢ誘発現象をもった細 胞は次のようにゴースト細胞と名づけられる。

スｐＲプロモーターフラグメントは５２アミノ酸のオープンリーディングフレー ムの開始点のすぐ上流に挿入されたので（実施例２参照）、＋３０４位に開始さ れるオーブンリーディングフレームによってコードされる５２アミノ酸のポリペ プチドは細胞を死に致らせることを強く示唆する。したがってこの遺伝子は次の ようにｈｏｋ　（宿主致死）と呼ばれる。

（実施例４） ｈｏｋ　によって発現される宿主致死効果の抑圧（第６図参照）ひじように毒性 のある生産物が発現される遺伝子は明らかに調節されているにちがいない。それ 故ｈｏｋ　の調節因子も又ｐａｒＢ　領域によってコードされたと仮定された。

この調節ループの性質を調べる最初の試みとしてｈｏｋ　遺伝子の上流にλｃＩ ８５７を含むｐＫＧ６３４のフラグメントがミニＦプラスミドに挿入されｐＫＧ ３４　を作製した。第６図はＪＣ４１１（ｐＫＧ８４）の致死の誘発を表わす。

その図は、ｐＢＲＪ２２に比してＦは低コピー数であるのでｐＫＧ　６３４　の 場合より致死は幾分ゆっくりし、効果的でないことを示す。

第２のｐａｒＢ　プラスミド（ｐＰＲ６３８）　は次ニＪｃ４１１（ｐＫＧ３４ ）株に導入され、この２重のプラスミード株によって誘発実験がくり返された。

第６図に示されるようにトランスに存在するｐａｒ　Ｂ　領域はｈｏｋ遺伝子の 転写活性を充分抑圧する。よってそのｐａｒ　Ｂ領域は宿主致死の抑制因子（ｓ ｏｋ遺伝子）をコードする。この実験企画を１つの検出法として用いながら、ｓ ｏｋ遺伝子の地図は次のような方法で作製された。

ｐＫＧ３４　を含む二重プラスミド株と欠失誘導体のひとつのｐＰＲ６８４，ｐ ＰＲ３４１，ｐＰＲ１５４又はｐＰＲ１７１がそれぞれ作製された。そして４２ ℃におけるこれらの株の増殖様式を追跡することにより、その欠失誘導体のｓｏ ｋ　表現型は温度上昇後の増殖を測定することにより決定された。これらの欠失 誘導体の解析によって、プラスミドｐＰＲ６８４とｐＰＲ１５４はｓｏｋ活性を 発現していることが分かった。それに対しプラスミドｐＰＲ３４１とｐＰＲ１７ １はｓｏｋ活性を検出出来る程度には発現していない。

そのプラスミドは又ｐａｒ　Ｂ　に対して特徴的な不和合性表現型について試験 された（国際特許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８８１０００８６号、同公開第ＷＯ８４１ ０１１７２号参照）。そしてｓｏｋ　活性を発現するプラスミドは又ｐａｒＢ　 特異的な不和合性を示すことが見出された。一方、上述のようにｓｏｋであるプ ラスミ・ドは不和合性を示さない。よってｐａｒＢ　不和合性反応はｓｏｋ活性 の検出法を表わす。

ｈｏｋ遺伝子に対して述べられたと同様にｓｏｋ遺伝子活性に必要な領域はさら に縮められた。マツピングに用いられたｓｏｋの誘導体のひとつｐＰＲ１７１は −３００から＋２８８までに及ぶｐａｒＢ　領域を含む（第１図及び第３図）。

λｃＩ　８５７とλｐＲを含む制限酵素フラグメントは、ｐＰＲ１７１に、ＩＩ ）Ｒプロモーターがそのブラスミ・ドのｓｏｋ領域の中を読むように挿入されｐ ＫＧ　１７１　を作製した（材料と方法の項参照）。

プラスミドｐＫＧ　１７１はｐＯＵ９４を含むＣ３Ｈ５０株に導入された。プラ スミドｐＯＵ９４はプラスミド上にｐａｒＢ領域を有するために完全に安定に植 え継がれるｌａｃ　ｐａｒＢ　ｐ１５誘導体である。その株の中に他のｐａｒ　 Ｂ　プラスミドの導入はｐａｒＢ　から発現される不和合性のためにｐＯＵ９４ 　の不安定化を招く。３０℃においてｐＯＫ１７１の存在は、それほどｐＯＵ９ ４の不安定化を起さないが４２℃では明らかに不安定性が検出された。その故ｐ ＫＧ　１７１のｐａｒＢ領域内の右から左への転写は１ｎｃＢ　領域（すなわち ｓｏｋ遺伝子）の活性化を起こす。

ここで述べられた結果はｓｏｋ遺伝子の領域をさらに狭め、＋１９４（ｌＲ６３ ４）と＋２８８（ｐＰ几１７１）の間に位置しているに違いない。又ｓｏｋ遺伝 子プロモーターは右から左へ（ｈｏｋ遺伝子転写とは逆に）読み、少くとも部分 的に＋２８８（１）Ｐ肌１７１）と＋３３６（ｐＰ几１５４）の間の領域に位置 づりられる。推定の一１０配列（ＴＡＴＣＣＴ）は＋２６２位に位置し一３５配 列（ＴＴＧＣＧＣ）は＋２８５位に位置する（第３図）（ＨａｗｌｅｙとＭｃｃ ｌｕｒｅ　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１．１．１９８３　、ｐｐ　２２３７−２２５５）、これらの配列はＳＯｋ遺伝 子のプロモーターを構成すると仮定される。

（実施例５） ｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子構造の解析とｈｏｋ及びｓｏｋ転写物の間の相互作用 ｓｏｋ遺伝子産物による、翻訳レベルにおけるｈｏｋ遺伝子発現の調節 ｈｏｋ遺伝子の発現を調節する調節ループの中をさらに洞察するためにｈｏｋ遺 伝子と１ａｃＺ遺伝子の間を翻訳及び転写において融合された遺伝子が作製され た（第１４図参照）。翻訳的融合プラスミドｐＫＧ７３３．ｐＫＧ７３４及びｐ ＫＧ７４１から発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性は１単位以下とひじように 低かった（材料と方法に明らかにしたように）。その低い活性は正確に測定出来 ない。それ故に調節可能なｌａｃ　プロモーターをコードするＤＮＡフラグメン トがｐＫＧ７３３　、ｐＫＧ７３４及びｐＫＧ７４１　の中にｐａｒＢ　領域か ら導かれたＤＮＡフラグメントの上流に挿入され、それぞれｐＫＧ７８２゜ｐＫ Ｇ７３５及びｐＫＧ７４２が作られた。これらのプラスミ・ドの行う発現は低い がβ−ガラクトシダーゼの測定可能量を発現する。

プラスミドｐＢＲ３２２及びｐＰＲ１３（ｐＢ几３２２ｐａｒＩ３’）は別々に 翻訳的融合プラスミドＴ）ＫＧ７３２　（＋１から＋３４２のｐａｒＢ　由来挿 入遺伝子）又はｐＫＧ７３５（＋１９４から＋３４２のｐａｒ　、Ｂ挿入遺伝子 ）をもったＣ　Ｓ　Ｉ：Ｉ　５０株に導入された。トランスに存在するｐａｒ１ ３　遺伝子はその融合プラスミドから発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性をｐ ＫＧ７３２の場合６．０から３．０単位に、ｐＫＧ７３５　の場合１４．０から ２．５単位に減少させることが示された。同様の実験が、ｐＫＧ７３２とｐＫＧ ７３５　のような同じ挿入遺伝子をもった転写融合プラスミドであるｐＫＧ７３ ０とｐＫＧ７８６をもったＣ３Ｈ５０によって行なわれた。これらのプラスミド から合成されるβ−ガラクトシダーゼの抑制は観察されなかった。それ故ｈｏｋ 遺伝子発現（ｓｏｋ遺伝子産物）の、ｐａｒＢ　でコードされたリプレッサーは 、転写後の段階、もつともありそうなのは翻訳の段階で作用すると結論すること ができる。（以下を参照）。

ｓｏｋ遺伝子の遺伝子マツピング ｐａｒＢ領域の異なる断片をもったｐＢ几３２２の誘導体は１ａｃｚ　融合蛋白 合成に関する効果が測定された。プラスミドｐＰＲ６８３（＋１〜＋５８０）と ｐＢＲ６３４（＋１９４〜＋５８０）しｐＰＲ３４１（＋２６８〜＋５８０）は 抑制しない。同様にｐＰＲ合成を抑制する。それに対しｐＰＲｌ　７１　（−３ ００〜＋２８８）はそのような効果を有しない。これは活性なリプレッサー遺伝 子は＋１９４（ｐＰ几６３４）から＋３３６（ｐＰＲｌ５４）の間に位置してい ることを示す。ｓｏｋ遺伝子の制限酵素地図はｓｏｋ遺伝子活性の機能アッセイ を用いたリプレッサー遺伝子の地図と一致した（実施例４で述べた）。

ｓｏｋ遺伝子のプロモーターの特徴づけＳＯｋプロモーターの強さ及び方向を測 定するためにｐａｒ　Ｂ領域（第１表）から導かれた異なるＢａｌ　８１調製　 フラグメントは転写融合ベクターｐＪＥＬ１２６の完全なｌａｃ　Ｚ　遺伝子の 前に挿入された。プラスミドｐＰＲ４３８（融合点＋１９４）はβ−ガラクトシ ダーゼを高レベルで発現する。それに対しｐＰＲ３４１（融合点＋２６８）は充 分な活性レベルで発現しなかった。

これはｓｏｋ遺伝子プロモーターがｐＲ８４１中で完全でなかったことを示す。

これらの結果はｓｏｋプロモーターは少くとも部分的には＋１９４と＋２６８の 間の領域に位置していることを示す。プラスミドｐＰＲ４３７（融合点＋１）は ｐＰＲ４８８よりおよそ１０倍低い活性で発現する、それ故ｓｏｋ遺伝子転写物 の９０％が＋１と＋１９４の間で終結したと結論されねばならない。

＋２２６のＦｏｋ　工部位（ラベルされた５′末端）から＋４８２のＳａｕ　９ ６　Ｉ部位までにわたるＤＮＡフラグメントはｐＰＲ６３３（ｐＢＲ８２２−ｐ ａｒＢ）を含むＣ３Ｈ５０株が作ルＲＮＡとハイブリダイズされた。ＤＮＡ−Ｒ ＮＡ　ハイブリッドの８１ヌクレアーゼ処理の後その試料は同じＤＮＡプローブ のＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ反応と共に変性された配列解析ゲル上を泳動させ た。＋２５８の転写開始に対応して弱いバンドが現われた。

ｓｏｋ転写物の５′末端の制限酵素地図は上述のｓｏｋプロモーターの遺伝子地 図と一致した。

＋２６７から＋２６２に位置する推定の一１０配列（５′−ＴＡＴＣＣＴ−３） 及び＋２９０から＋２８５に位置する一３５領域（５’−ＴＴＧＯＧＣ！−８’ ）（Ｈａｗｌｅｙ及びＭｃＣｌｕｒｅの前記文献によるイー・コリプロモーター のコンセンサス配列に従った塩基数）を含む＋２６０の上流の領域内の塩基配列 はイクリックになっている。よって遺伝子的に及び物理的に現在得られるすべて の情報は、これらの配列がｓｏｋ遺伝子プロモーターを構成するという実施例４ の仮定を確証した。ｌａｃ　プロモーター（ｐＫ０７３６）からのβ−ガラクト シダーゼの転写は約３００単位の産生を示した。ｓｏｋプロモーター（ｐＰＲ４ ３８）から転写されたβ−ガラクトシダーゼは１５００単位の収量で得られた。

よってｓｏｋプロモーターはｌａｃプロモーターより約５倍高い活性をもった強 いプロモーターである。

ｓｏｋ遺伝子産物の標的（ｔａｒｇｅｔ）はｓｏｋ遺伝子内に位置する第１４図 に示された翻訳融合プラスミドはｓｏｋ　遺伝子産物の標的（ｓｏｋＴ）　をマ ツプするのに用いられた。ｐＫＧ７３２（＋１から＋３４２挿入遺伝子）とｐＫ Ｇ７８５　（＋１９４から＋３４２挿入遺伝子）にｐＰＲｌ３　を経てトランス にｓｏｋ遺伝子を付けるとこれらのプラスミドによって発現されるｈｏｋ’−１ ａｃ　Ｚ融合蛋白の合成を抑制した。それに対しｐＫＧ　７４２（＋２６８〜＋ ３４２挿入第１４図）の場合にはそのような効果は見られなかった。よって５ｏ ｋＲＮＡ　の遺伝子標的は＋１９４から＋２６８にわたるＤＮＡによって、正確 には５ｏｋＲＮＡそれ自身をコードする領域が重なって、コードされていること が結論される。プラスミドｐＫＧ７４２はｓ　ｏ　ｋ　ＲＮＡを発現しない、し たがってこのプラスミドはｈｏｋ−１ａｃ　Ｚ　融合蛋白を観測される以上に高 産生することが予想された。（以下参照）。

ｈｏｋｍＲＮＡの５末端及び３′末端の８１−ヌクレアーゼ、ツピング ｈｏｋ遺伝子コードフレームの上流のＤＮＡ配列内の明確なプロモータ一様構造 は第８図に示される。この推定プロモーター３）と−３５配列（５’−Ｔ　Ｇ　 Ｇ　Ｔ　ＣＡ　−３’　）を有する。何ら他の明確なプロモータ一様配列はｈｏ ｋ遺伝子のコード領域の上流には見出されない。

ｈｏｋ遺伝子転写物の５′末端は材料と方法の項に述べられたＳ１ヌクレアーゼ 法によって決定された。用いられたプローブは＋２２９位（５末端ラベル）にお けるＦｏｋＩ部位から＋１３の５ｆａＮ工部位にわたる。そのプローブはｐＰ１ １Ｌ６３Ｂ（ｐＢＲ３２２−ｐａｒＢ　）を含むＣ８Ｈ５０株から作られ？、： ＲＮＡにハイブリダイズされた。そしてＳ１ヌクレアーゼで処理され、同じＤＮ ＡプローブのΔ（ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ反応と一緒にポリアクリルアミドゲ ル電気泳動された。さらにそのプローブは又培養液にリファンピシンを加えた後 時間を変えて数回抜きとった培養液サンプルから作られたＲＮＡにハイブリダイ ズされた。

リフアン゛ピシン添加前に＋１３０に開始する転写物に対応するひじように弱い バンドが現われる。これはＤＮＡ配列によって示されるプロモーター構造と正確 に一致して＋１３０に開始する転写物に対応する。リファンピシンの添加はその ＤＮＡプローブと＋１３０に開始されるＲＮＡとの間のハイブリダイゼーション を時間依存的に増加させる。リフアン′ビン・ン添加後２５分にリファンピシン ・添加前より数倍のハイブリダイゼーションが認められた。それ放生たるｈｏｋ 遺伝子転写物は＋１３０の位置に開始することが信じられる。＋１３０に開始す る転写物と用いられたＤＮＡプローブとの間のハイブリダイゼーションのリファ ンビンン誘発時間依存的な増加は１ｈ、ｏｋｍＲＮＡとＤＮＡプローブとの間の ハイブリダイゼーション反応のインヒビターの衰退を反映すると考えられる。こ のインヒビターは５ｏｋＲＮＡでありそうで、それは用いられたＤＮＡプローブ と同じｈｏｋｍＲＮＡの部分に相補的であるからである。

ｈｏｋｍＲＮＡの３末端に相補的なりＮＡプローブとｈｏｋｍＲＮＡとの間のハ イブリダイゼーションの阻害がないことは注目されるべきである。

ｈｏｋｍＲＮＡの３末端もＳｌ−ヌクレアーゼ法によって地図化した。＋３４２ （Ｓａｕ３Ａ部位）から＋５８０　（ＥｃｏＲＩ部位）にわたるＤＮＡフラグメ ントは５ａｕ３Ａの３末端にラベルされ、Ｃ３ｌ（５０（ｐＰＲ６ｉ）から作ら れたＲＮＡにハイブリダイズされた。そしてＳ１ヌクレアーゼ処理し、ＤＮＡプ ローブのＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ反応と一緒にポリアクリルアミドゲル電気 泳動された。ｈｏｋ遺伝子転写物の大部分（８０〜９０％）は＋５６１．＋５６ ２及び＋５６３の位置で終結し、またこれらの位置の上流に小さな転写終結点が 観測された。

＋５６１位の前にはＧＯに富んだステムをもった強いステム−ループ構造があり 、次いで典型的なｒｈｏ非依存性の転写終結構造（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇとＣｏｕ ｒｔ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１３゜１９７９、ｐＩ）８１９−８５３） に似たＵの配列が続く。

よって主なｈｏｋ遺伝子転写物は＋１３１／＋１８２に開始し＋５６２付近で終 結する。

ｈｏｋプロモーターの強さは転写融合プラスミドｐＫ０７３０（第１４図）によ って決められた。それはｌａｅ　プロモーター及び１〕Ｏｋプロモーターを完全 な］、ＯＣＺ遺伝子の前にタンデムに含む◇Ｃ３Ｈ５０の中のｐＫＧ７３０から 発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性は約３００単位である。ｌａｃプロモータ ーからの転写をさけるためにｌａｃ　Ｉ　遺伝子（ｐＢｌ４　”）をもったｐＢ Ｒ３２２誘導株はＣ３Ｈ５０（ｐＫＧ７８０）に導入された。

この二重のプラスミド株は１００単位のβ−ガラクトシダーゼを発現する（　ｌ ａｃ　工遺伝子は多コピープラスミド上にトランスに存在し、ｌａｃプロモータ ーの活性を非抑制状態の活性の１％以下に下げる）。よってｈｏｋプロモーター はｌａｃプロモーターの約５０％又はそれ以下の活性で比較的弱い。ｓｏｋプロ モーターはｌａｃ　プロモーターより約５倍強いので、ｓｏｋプロモーターはｈ ｏｋプロモーターより少くとも１０倍は活性が強いに違いない。

リファンピシンの添加によるｈｏｋｍＲＮＡの翻訳誘発プラスミドｐＫＧ　７８ ０は、ｓｏｋ遺伝子、ｐＫ０７８１から導かれるｈｏｋ’−１ａｃＺハイブリッ ド遺伝子、１ａＣＹ遺伝子の１部及びｈｏｋｍＲＮＡ末端をコードするｐａｒＢ 　領域の部分をもったｐＢｌ　３２２誘導体である。ｐａｒ１３挿入遺伝子の下 流が、ｐＢＲ３２２から導かれたテトラサイクリン遺伝子の終結部分におきかえ られている以外は、プラスミドｐＫ、Ｇ７８２はｐＫＧ７８０と同じである。こ れらのプラスミドは、高コピー数にもかかわらすβ−ガラクトシダーゼの発現レ ベルはひじように低い（両者の場合約１単位）。それは細胞当りβ−ガラクトシ ダーゼ数分子に相当する。

ｐＫＧ７８０又はｐＫＧ　７８２どちらかを含むＣ３Ｈ５０の対数増殖期培養液 にリファンピシン３００μ９／ｍｔ！が加えられた。

そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するためサンプルは抜きとられた。リフ ァンピシン添加後最初の１０分間には活性の増加はなかったが、その後β−ガラ クトシダーゼ産生誘発（ｈｏｋ’−１ａｃＺｍＲＮＡの翻訳）が観察された。両 方の場合ｈｏｋ’−１ａｃｚ融合蛋白の合成は約８０分の間続く、ｈ　ｏ　ｋ’ 　−１ａｃＺ−ｈｏｋ’及びｈｏｋ’−］、ａｃＺ−ｔｅｔ’ｍＲＮＡの半減期 はそれぞれ約２２分と２０分と計算された（材料と方法の項参照）。

よって１ａｃｚ遺伝子の下流にｈｏｋｍＲＮＡ　末端の挿入はｈｏｋ’−１ａｃ ｚハイブリッドｍＲＮＡ　の安定性に著しい増加は起きなかった。

結論 ｐａｒＢ領域から合成された几ＮＡ転写物の検出はｈ　ｏ　ｋｍＲＮＡが＋Ｉｔ ｌ／１３２位で開始し＋５６２あたりで終結し、そして５ｏｋＲＮＡは＋２６０ 位で開始し＋１と＋１９４位の間で終結することを示す。よって５ｏｋＲＮＡは ｈｏｋｍＲＮＡのリーダー配列に相補的である（第３図）。プロモーター及びｈ ｏｋ遺伝子と１ａｃｚ遺伝子の間の融合遺伝子の解析は、ｓｏｋ遺伝子は転写的 に作用するｈｏｋ遺伝子発現のリプレッサーをコードしていることを示す。＋１ ９４から＋３３６の領域は活性なリプレッサー遺伝子をコードし、それはｈｏｋ 遺伝子とは逆方向に転写される。蛋白をコードしたフレームがｓｏｋ遺伝子領域 内に存在する証拠はない、それ故ｓｏｋ遺伝子によってコードされたリプレッサ ーは小さなアンチセンスＲＮＡである。それは相補的ｈｏｋｍＲＮＡにハイブリ ダイズすることによりｈｏｋｍＲＮＡの翻訳を阻害する。この事実は５ｏｋＲＮ Ａ（＋１９４〜＋２６８）に相補的なｈｏｋｍＲＮＡのリーダー配列をコードし た領域に位置するｓｏｋ遺伝子産物（ｓｏｋ−Ｔ）の標的をマツピングすること により支持される。

５ｏｋ−Ｔ領域はｈｏｋｒｎＲＮＡのＳＤ配列の上流に位置し、よって５ｏｋＲ ＮＡによる翻訳のｈｏｋｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによる抑制は、そ の長い領域の効果（おそら＜　ｍＲＮＡの二次構造上の）によってうまく説明さ れることができる。

ｈｏｋｍＲＮＡ（故に５ｏｋ−Ｔ）のリーダー配列をコードする領域は二回対称 性に富む。ｈｏｋｍＲＮＡは第３図のそれぞれＩ（ΔＧ＝−１６Ｋ　ｃａｔ／ｒ ｎｏ、ｌ　）　、　ＩＩ　（ΔＧ＝−２０Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及び■（ΔＧ　＝ −２６Ｋｃ　ａｔ／ｍｏｌ　）のように示される＋１９４〜＋３０３の領域に３ つのステム−ループ構造を作る可能性を有する。ｓｏｋｍＲＮＡはループＩ、ル ープ■の一部しかしループ■ではない所をコードする領域に相補的である。ｈｏ ｋ遺伝子のＳＤ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列は、もしループ■が形成 されるなら、このエネルギーに富んだループのステムの中にかくされる。それ故 ループｍの形成はｈｏｋｍＲＮＡ翻訳の抑制の必要条件である。

ステムループ構造ｔｒと■は重なり、それ放間時に形成されない。もしループ■ が形成されれば、おそら＜ＳＤ配列はｍＲＮＡの二次構造の中にかくされないｔ ごろう。そしてＳＤ配列はリポソームによって自由に翻訳されやすい“解放状態 ”を得るであろう。よって５ＯｋＲＮＡのｈｏｋｍＲＮＡへのハイブリタイゼー ジョンはｍＲＮＡのループ形成の様式を“解放状態”（ループＨの形成）から“ 閉鎖状態社（ループ■の形成）に変え、リポソームによって翻訳されないｍＲＮ Ａを生じると推定される。

ｈｏｋ’−１ａｃｚ遺伝子が１ａｃＵＶ５プロモーターから転写されるｐＫＧ　 ４７２から発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性は意外に低い（２ａ単位）。こ れはこのプラスミドがｓｏｋ　遺伝子を含まないからである。ｐＫＧ７４２　の ＳＤ配列の上流領域は完全なループ■を含んでいるがループエ又は■は含まない 。よってループ■はループエ又は■とは競合することなくしっがりと形成するこ とができる。このことはこのｍ　ＲＮ　Ａ　からのβ−ガラクトシダーゼ発現の 低い理由であろう。

ｈｏｋ’−１ａｃｚハイブリッドｍＲＮＡの合成を引き起こすプラスミドｐＫＧ ７８０又はｐＫＧ７８２を含む細胞へのりファンピシンの添加によって、約２０ 分の半減期でひじように安定化されることがわかった。驚くことにはテトラサイ クリン遺伝子ｍＲＮＡ　（１）ＫＧ　７８２　）の末端を含むハイブリッドｍＲ ＮＡは天然のｈｏｋｍＲＮＡ末端（ｐＫ０７８０）　を含むハイブリッドｍＲＮ Ａ　と同様安定である。この結果は野生型ｈｏｋ−ｍＲＮＡにたやすく外挿出来 ないが、ｈｏｋｍＲＮＡリーダー配列の５′末端（＋１〜＋３４２）はｈｏｋｍ ＲＮＡ分子の安定化を決める重要な決定基をコードしていると結論される。

β−ガラクトシグーゼ合成の最初の時間のずれは、ｈｏｋ’−１ａｃｚ蛋白合成 のインヒビターすなわち５ｏｋＲＮＡ　の衰退の時間を反映していると極めて簡 単に説明される。

ｈｏｋｍＲＮＡと、ｈｏｋｍＲＮＡ　の５′末端をマツプするに用いるＤＮＡプ ローブとの間のハイブリダイゼーション反応がリファンピシン誘発によって時間 依存的に増加することは次のようにたやすく説明されることができる。ＲＮＡは 、ＤＮＡとよりＲＮＡと数倍はやくハイブリダイズすることが知られている（Ｆ ａｖａｌｏｒｏ　ｃ）Ｒｉｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　、 １９８３゜ｐｐ７１８〜７４９）。　それ故５ｏｋＲＮＡの存在（リファンピシ ン添加前）はｈｏｋｍＲＮＡの５末端と相補的ＤＮＡプローブとの間のハイブリ ダイゼーションを阻害する。なぜならｈ　ｏｌａｎＲＮＡはそのＤＮＡプローブ とより５ｏｋＲＮＡと早くハイブリダイゼーション反応をするからである　（ｓ ｏｋＲＮＡとこの実験に用いられたＤＮＡプローブはｈｏｋｍＲＮＡの同じ部分 で相補的である）。新しい転写の形成を阻害するりファンビシン添加後、ｈｏｋ ｍＲＮＡと、ｈｏｋｍＲＮＡの５末端と相補的なりＮＡプローブとの間のハイブ リダイゼーションはやがて大きく増加する。

このハイブリダイゼーションの増加はハイブリダイゼーションの抑制物５ｏｋＲ ＮＡの減衰を反映している。それはｈｏｌａｎＢ、ＮＡと、ｈｏｋｍＲＮＡ　の ３′末端に相補的ＤＮＡプローブとの間のハイブリダイゼーションの阻害がない ことを示す。リファンピシン添加後２５分でさえ細胞内にかなりの量のｈｏｋｍ ＲＮＡが存在することはｈｏｋｍＲＮＡが異常に安定であることを示している。

これらの説明はりファンピシン誘発実験にみられるｈｏｋ’−１ａｃＺ８合蛋白 合成速度と完全に一致する。

前述の細胞分裂の間にｐａｒＢ　をもったプラスミドの脱落を伴なう細胞の死を 説明するモデルが第１３図に示される。細胞内にｐａｒＢをもったプラスミドの 存在はｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子の細胞質産物すなわちｈｏｋｍＲＮＡ及び５ｏｋ ＲＮＡを生じる。

そのｈＯｋｍＲＮＡは半減期２０分以上と安定であるのに対しｈｏｋｍＲＮＡの 翻訳を阻害する５ｏｋＲＮＡは不安定であるが、しかし過剰に存在する。よって そのプラスミドをもった細胞においては５ｏｋＲＮＡはＨＯＫ蛋白の合成を阻害 し細胞は生きたまま残る。他方例えば細胞分裂によってプラスミド分子の一様で ない分配によってプラスミドをもたない細胞が現われた場合、不安定な５ｏｋＲ ＮＡはリポソームによって自由に翻訳されうる安定なｈｏｋｍＲＮＡを残して細 胞内で減衰する。よってＨＯＫ蛋白は合成されプラスミドのない細胞の死が続い て起こる。

１つの重要な試験可能な予見が上に出されたｈｏｋ遺伝子発現の分裂後説抑制モ デルから明らかになる。

すべての不安定に受けつがれるプラスミドはｐａｒＢ　領域によって安定化する ことができる。なぜならその致死機構はプラスミドの脱落に対する実際の理由と は無関係であるからである。

したがってこの発明の発明者らは、ｐａｒＢ　領域は低コピー数プラスミド〔例 、Ｒ１（国際特許出願箱ＰＯＴ／ＤＫ８（１０００８６号、同公開第ＷＯ３４１ ０１１７２号）〕から高コピー数プラスミド（ｐ１５Ａ、ｐＢＲ８２２（国際特 許願第ＰＣＴ／ＤＫ８８１０００８６号、同公開第ＷＯ３４１０１１７２号）及 びＲ８Ｆ１０１０］にわたる（それらのすべては遺伝子操作後不安定になる）多 くの型のレプリコンを安定にすることを示した。

ｏｒｉｃｔ二染色体も又ｐａｒＢ　領域によって安定化される。驚くことにｐａ ｒ　Ｂ　領域はビイ・プチダ（実施例１２参照）中でひじように不安定なＲ８Ｆ １０１０１ａｃＺ　誘導体を安定化させる。

アンチセンスＲＮＡ分子によるｍＲＮＡ種の翻訳の調節を伴なう同様の調節系は すでに報告されている（Ｌｉ’ｇｈｔとＭｏ１ｉｎ。

Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　２，１９８＋、ｐｐ９Ｂ−９８；Ｒ，Ｗ。

８ｌｍｏｎｓとＮ、に１ｅｃｋｎｅｒ、Ｃｅ１ｌ　３４．１９８３　、ｐｐ６８ ：ｌｔ−６９１；ＭｉｚｕｎｏらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、１ ９８４ｔ１９６６−１９７０”）。そして合成配列がｍＲＮＡのリーダー領域に 相補的なアンチセンスＲＮＡに対するコードを挿入された人工的な系でさえ報告 されている（　Ｉ　ｚａｎｔとＷｅｉｎｔｒａｕｂ。

Ｃｅ１ｌ　３６，１９８４．ｐｐｌｏ０？−１０１５）。

（実施例６） イー・コリ染色体上のＲ１ｐａｒＢ相同体の発見（第８ａ図参照） プラスミド進化は、バクテリア染色体と自由に複製するＤＮＡ分子との間の遺伝 情報の広はんな交換を伴なうので、イー・コリ染色体ＤＮＡはＲｌｐａｒＢ　配 列に可能な祖先の配列に関して解析された。

図８ａの６列目にプラスミドをもたないイー・コリＪＯ４１１からの全Ｅｃｏ几 ■開裂ＤＮＡがｐａｒＢ　プローブに対するフィルターハイブリダイゼーション によって解析された（材料と方法の項参照）。２０キロ塩基（ｋｂ）のフラグメ ントはむしろ弱いが明確なシグナルが見られる。このシグナルは同時間露出した 場合イー・コリＤＮＡを含む他の列（４夕＋ｉ　５列）にも又検出出来る。染色 体配列は、ｐａｒＢ　におよそ５５％の相同性があると見られる。その染色体配 列は次のようにｐａｒ　１　と名づけられる。

重要な問題はもちろん、塩基配列のレベルでの相同性の知見が、その相同の領域 によってコードされる産物の機能の類似性に、どの程度反映するのかということ である。１つの見方が実施例７でさらに扱われる。

Ｃ実施例７） ＲｌｐａｒＢのイー・コリ染色体相同体の遺伝的構成及びＲｌｐａｒＢに対する その機能的関係（第７図参照）実施例３で定義されたプラスミドＲ１のｈｏｋ　 遺伝子は５２アミノ酸のポリペプチドをコードする。そのｈｏｋ　遺伝子産物の アミノ酸配列を多数の既知の蛋白配列と比較した。驚くことにイー・コリｒｅｌ Ｂオペロン（Ｂｅｃｈ　らＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４　、１９８５　、 ｐｐ１０５９−１０６６）のｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３　遺伝子によってコードされ る５１アミノ酸のポリペプチドはｈｏｋ産物に顕著な相同性を示した。２つの相 同な蛋白のアミノ酸配列は第７図に表わされる。第７図は、そのアミノ酸の４２ ％（２２個）が前記２つの蛋白において同一であることを示す。アミノ酸の１７ ％（９個）に関しては、１つのアミノ酸が同じ化学的性状（すなわち、疎水性、 荷電等）のアミノ酸によって置換されていることにより、その変化が保存されて おり、したがって全体の相同性は６１％になる。特に荷電アミノ酸は１６位と３ １位のシスティン残基のようによく保存されている（第７図）。

ｈｏｋ遺伝子及びｒｅｌＢ−ｏｒｆ３のＤＮＡ配列も又第７図に示されるように 比較された。次のように用いられた塩基配列位置番号は第３図で示されたｐａｒ Ｂ　配列の通りである。＋２９０位から＋４６０まで、２つの配列の間に５５％ の相同性がある。

保存された領域は、＋３０４から＋４６０に位置する、蛋白をコードする配列の 上流及び下流の塩基を含むと第７図から思われる。そのコード領域の外側の塩基 の保存性は２つの遺伝子の調節様式もまた少くとも部分的に保存されていること を示す。

その配列相同性が機能に類似性を反映していることを示すために、ｒｅｌＢ−ｏ ｒｆ３遺伝子の上流に１Ｌｐｌプロモーターフラグメントをもったプラスミドが 構築された（構築の同様な様式の記載は実施例３のｈ　ｏ　ｋ遺伝子のマツピン グで行なった）。

ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３の中にλｐＲが仲介する転写が誘発されたとき、急速な細胞 死が実施例３に述べられたプラスミドｐＫＧ３４１を含むバクテリアに対し観察 されたと同様の速度で見られる。同時に培養液中のすべての細胞はｈｏｋ性をも った“ゴースト″細胞に形質転換される（第５図参照）。

よってプラスミドＲ１のｈｏｋ遺伝子とイー・コリｒｅｌＢオペロンのｒｅｌＢ −ｏｒｆ３　との間に構造及び機能上に顕著な相同性がある。

（実施例８） 穏々のプラスミド上のｐａｒＢ相同配列（第８ａ図参照）種々のプラスミドをも ったイー・コリの多数の株からＥｃｏＲＩ開裂全ＤＮＡのフィルターハイブリダ イゼーション解析はｐａｒＢグローブを用いて行なわれた（第８ａ図における１ 〜５列）。

プラスミドＲ１ｄｒａ１９は、ｐａｒＢプローブが初めがらクローニングされた Ｒ１プラスミド群の１貝である。Ｒ１ｄｒａ１９は細菌ゲノムにつき２コピー存 在する。イー・コリ１００５／Ｒ１−ｄｒａ１９からのＥｃｏＲＩ切断全Ｉ）Ｎ Ａは第１列に解析されている。１９，５キロ塩基の強くハイブリダイズするフラ グメントがみられる。その大きさは１９．５キロ塩基几ｌプラスミドのｐａｒＢ 機能の遺伝子地図と一致する（国際特許出願箱ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８６号 、同公開第ＷＯ８４１０１１７２号）。

プラスミドＲ１００は几１の１９．５キロ塩基のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントに 等しい領域内に転移因子Ｔｎ　１０　をもつ１１に近い関係にある。そのトラン スポゾンはＥｃｏＲＩの認識配列を含む、そして結果としてさらにＥｃｏＲＩ部 位が凡１様ＥｃｏＲＩＡフラグメントの中に導入され、これをＲ１００の２つの ＥｃｏＲＩＡ及びＥｃｏＲニーＤフラグメントに分割する（Δ１ｉｋｉらＪ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４４　、１９８０　ｐｐ８７〜８９　）。Ｒ１００のこ れらの２つのＥｃｏＲＩフラグメントはへテロデュプレックスマツピングによっ てＦ因子に存在する配列に相同することが見出された（ＳｈａｒｐらＪ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ　７５．１９７３　、ｐ２３５見１２．８キロ塩基の強くハイブリダ イズするフラグメントが第８ａ図２列に見られる。それによってＲ１と几１００ 、及びＦとの間の相同性領域の中心となる凡１００のｐａｒＢ　領域からＲ１０ ０のＥｃｏＲＩ−Ｄフラグメントまで地図化される。

Ｒ１００のＦ相同性領域内のｐａｒＢの位置づけは、不和合性群ＩｎｃＦＩに属 するプラスミド上のｐａｒＢ様配列についての検索をうながした。

ＩｎｃＦ　Ｉプラスミドル３８６をもったイー・コリ株Ｂ２１０／Ｒ８８６から のＥｃｏＲＩ開裂全ＤＮＡは、ｐａｒＢプローブを用いたフィルターハイブリダ イゼーション法によって解析された（第８ａ図、３列）。

Ｆと同じ不和合性群に属するプラスミドＲ３８６は１９，５キロ塩基のＥｃｏＲ Ｉフラグメントに対応するｐａ　ｒＢ　ハイブリダイゼーションシグナルを与え ることが見出された。このプラスミドはゲノム当たり０．５〜１コピー存在する ので、Ｒ１００シグナルの約３分の１のシグナルが見られるということは（第８ ａ図、２列）、ＲｌｐａｒＢとＲ３８６ｐａｒＢ　様配列との間の相同性の程度 は５５〜６０％であることを示唆している。

ｐａｒＢ関連配列検索は他の不和合性群へ広げられた。不和合性群ＩｎｃＰに属 するプラスミドＲＰＩが解析された。

ｐａｒＢ　プローブによって１００５（ＲＰｌ）からの全Ｅｃｏ几工開裂フラグ メントはＥｃｏＲＩで直線化されたプラスミドに対応するハイブリダイゼーショ ンシグナルを与える（第８ａ図、４列）。その他にｐａｒ　１　に対応する２０ キロ塩基のハイブリダイゼーションバンドが見られる。それは実施例５で論述さ れた。

几Ｐ１はグラム陰性バクテリア宿主の広い範囲に安定に維持されているので、几 Ｐ１上のｐａｒＢ　関連配列の発見はイー・コリ及びプソイドモナス・プチダ（ 実施例１１）に働いているＲｌｐａｒＢ　系に似たプラスミド維持系が多数の細 菌宿主に機能している可能性を示す。

さらに他のプラスミドＲ６−Ｋ（ＩｎｃＫ不和合性群）は、ｐａｒＢ　プローブ にハイブリダイズするＲ６にの２５キロ塩基のＥｃｏ几１フラグメントが存在す ることによって証拠づけられるように、およそＲＰＩと同じハイブリダイゼーシ ョン性をもった配列を有することが見出された（第８ａ図、５列）。

Ｒ１ｐａｒ　Ｂ　ハイブリダイズ配列の存在は、Ｒ１ｐａｒ　Ｂに関連する安定 化機構の存在を反映しているかどうかを決めるために低コピー数プラスミドＦは いくらか詳細に解析された。

２つのプラスミドの安定化機能はＦのゲノム内に同定されそしてそれに対応する 遺伝子Ｃ８０ＰＣ８０Ｐ（ＯとＨｉｒａｇａ、Ｃｅ１１３２．１９８３．ｐｐ８ ５１〜３６０）と　ｃｃｄ　（ＯｇｕｒａとＨｉｒａｇａ。

１’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．１９８０　、ｐｐ４ ７８４〜４７８８）］　は４０，３から４９．５の地図位にわたるＥｃｏＲＩフ ラグメントに位置づけられた。

Ｆをもつイー・コリ１００５からの全ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーショ ン解析は、ＲｌｐａｒＢ　関連配列はＦの１０．７キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグ メント（４９，５〜６０．２位にマツプされる）上に存在することがわかった。

ＥｃｏＲ工及び／又はＢａｍＨＩ　によって消化された１００５（Ｆ）ＤＮＡ　 のハイブリダイゼーション解析によって、５５．７〜６０．２位にわたる４．５ キロ塩基のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントにこれらの配列をマツプするこ とが出来る。このことはＦ内に第３のプラスミド安定化機能が存在することを示 す。

Ｒ１ｐａｒＢ　プローブをハイブリダイズするＦの領域は次にバクテリオファー ジスベクター内にクローニングされた。

１００５　（Ｆ）からのＥＣ０ＲＩ　消化ＤＮＡは分取アガロースゲル電気激動 法によってサイズ分画され、９．５から１２キロ塩基のフラグメントは電気泳動 溶出によりゲルから回収された。そのフラグメントはλＬ１４７の左右のアーム のＥｃＯＲＩ部位に結合され、そして試験管内パッケイジングにより感染ファー ジを作った（ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌ ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２．ｐ２５６参照） 。

それは次にイー・コリＬＥ８９２を感染させるのに用いられた。

Ｒ１ｐａｒ　Ｂ　関連の配列を有する組換え体ファージをブラックハイブリダイ ゼーション法で同定した。

ＲｌｐａｒＢ　関連配列を含む１０，７キロ塩基のＥｃｏＲＩ　７ラグメントを もった組換えファージからそのフラグメントは単離され、ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ 　部位に挿入された。１つの得られたプラスミドｐＮＬ１において、その挿入遺 伝子は、ｐＮＬＩＤＮＡのＢａｍＨＩ　による切断がＲ１ｐａｒ　Ｂ　ハイブリ ダイズ配列をもった４、５キロ塩基のフラグメントを切断するように配置された 。

ｐＮＬＩからの４．５キロ塩基のＢａｍＨＩ　フラグメントは単離されＲ１ｐａ ｒ１３プローブをハイブリダイズする領域はフィルターハイブリダイゼーション 解析によって８７０塩基対のＲｓａ　Ｉフラグメントにマツプされた。その８７ ０塩基対のＲｓａＩフラグメントは単離されＭ１８ｍｐ９のＳｍａ　１部位に挿 入された。８７０塩基対の挿入遺伝子上に］１ｔｌｐａｒＢ閲連配列をもった多 数の組換え体ファージはブラックハイブリダイゼーション法によって同定された 。挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列はＳａｎｇｅｒ　らの方法Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１ ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４、ｐｐ　５４６３−５４６７により解析された 。

組換え体ファージｍｐＮＬ１２の１つの一部のヌクレオチド配列はＲｓａ　Ｉ部 位から広がる４０２塩基対からなり、この配列は几１　ｐａｒＢ配列（第３図） の＋１７８〜＋５８０の領域に９０％相同する。またすべての１１ｐａｒＢ　領 域の必須の性質は、Ｆ誘導配列の中に見出される。（１）５０アミノ酸の蛋白を コードするオープンリーディングフレームはＲ１ｈｏｋ遺伝子に対応して存在す る、（２）Ｒｌｈｏｋのリポソーム結合部位は保存されている、（３）ｈｏｋｍ ＲＮＡ安定化に必須であると信じられているＲｌｐａｒＢｍＲＮＡの３′非翻訳 部に対応する領域は高度に保存されている（９０％相同性）、および（４）Ｒ１ −ｓｏｋ　の推定の−１０及び−３５領域も又保存されている。

Ｆ由来の配列内のオープンリーディングフレーム（オープン読取り枠）は、Ｒ１ 特異的ｈｏｋ蛋白とはわずかにのみ異なる５０アミノ酸の蛋白の遺伝情報を指定 する。第１に、Ｒｌｈｏｋ内の２つのコドンすなわちバリン１５セリン２９が欠 失された。

第２に、２つの保存的な置換が生じ、すなわちロイシン１６がバリンに、ヒスチ ジン３９がチロシンに置き換えられている。

明らかに、Ｆ上の、Ｒ１ｈｏｋ遺伝子及びその関連配列は共通の祖先の配列から 派生し、そしてさらにＲｌｈｏｋに対応するコード領域の保存性はコードされた 蛋白がＦの安定化に関係するということを強く示唆する。

Ｆ由来配列のプラスミド安定化性能を試験するために、Ｆｈｏｋ様配列をもった ｐＮＬ　１　からの４．５キロ塩基のＢａｍＨＩ　フラグメントが１世代につき １０　の頻度で脱落する低コピー数プラスミドであるｐＪＥＬ　８２に導入され た（国際特許願第ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８４号、同公開第１Ｗ０８４１０１ １７１号）。

得られたプラスミドｐＪＥＬ８２／ＦはｐＪＥＬ８２と同様、イー・コリＨＢ　 １０１に形質転換された。２つの株は選択圧なしに１６時間の間培養増殖された 。そしてプラスミド含有細胞（アンピシリン耐性、ＡｐＲ）の両分が測定された 。結果は次の通りであった。

プラスミド　アンピシリン耐性細胞の％ｐＪＥＬ８２　３６．５ ｐＪＥＬ　８２／Ｆ　９８．４ それ故Ｒ１ｐａｒＢ関連配列をもった４、５キロ塩基のＢａｍＨＩフラグメント がプラスミド安定化効果を及ぼすことが結論された。もしその安定化がＦフラグ メント内のｈｏｋ　様遺伝子の存在によるならば、ゴース５ト細胞の出現が、選 択圧なしにｐＪＥＬ８２／Ｆをもった細胞を培養増殖させた場合に予想される（ 実施例３参照）。ｐＪＥＬ８２／Ｆを含む細胞の一夜培養液、中には几１　ｈａ ｋ　誘発ゴースト細胞とは区別できないゴースト細胞を約５％含むことが見出さ れた。

フィルターハイブリダイゼーション法によるＲ１ｐａｒＢ関連配列の証明は、Ｆ の場合にも、機能的に同様のプラスミド安定化機構が存在することを示している 。

（実施例９） ｐａｒＢ関連配列に相同するレプリコン安定化配列の検出のための方法としての 段階的ハイブリダイゼーション法（第８ａ図参照） ハイブリダイゼーションの条件は検出できるシグナルを生ずるのに必要なプロー ブとフィルター結合ＤＮＡ種の間の相同性の程度を決定する（材料と方法の項に おける論述参照）。したがって与えられた一連のハイブリダイゼーション条件下 で与えられたプローブによって検出できないでいて、しかしそれにもかかわらず ｈｏｋ様活性をコードしているフィルター結合配列が存在するかも知れない。材 料と方法の中の相同性と機能に関する論述参照。これは次の実験によって例証さ れる。

実施例６に述べられたように、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３は、ｈｏｋ　とｒｅｌＢｏｒ ｆ８の配列比較データと機能類似性にもとづいてＲｌｐａｒＢの染色体相同性を 表わす。プラスミドｐＢＤ２７２４に存在するようなｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３及び フランキング配列は、イー・コリ染色体ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーシ ョン解析におけるプローブとして用いられた。

プラスミドｐＢＤ２７２４は、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３　：］−ド配列（Ｂｅｃｈ らによって１０７０−１３５０と位置づけられた前記文献）を含むイー・コリの ｒｅｌＢ　オペロンがらのＨｉｎｃｌｌ−Ｍ］ｕＩフラグメントを含むｐＢ几３ ２２誘導体である。　第８ｂ図３列に、プラスミドを持たないイー・コリがらの ＥｃｏＲＩ開裂全ＤＮＡが、ｒｅｉＢ−ｏｒｆ　３プローブを用いたフィールタ ーハイブリダイゼーション法によって解析される。さきに同定されたｐａｒｌ配 列（実施例６）に表わされそうな２０キロ塩基のハイブリダイゼーションフラグ メントの他にさらに別の１６キロ塩基のフラグメントが検出される。後者の強度 は２０キロ塩基のシグナルの強度より大きいので、１６キロ塩基のＥｃｏＲエフ ラグメントはハイブリダイゼーションプローブとして用いられたイー・コリｒｅ ｌＢ−ｏｒｆ３　遺伝子をおおっているにちがいない。すなわち１６キロ塩基の シグナルの強度から相同性の程度を見積ることができる。ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３ シグナルの約３分の４であるｐａｒｌハイブリダイゼーションのシグナル強度は 、ｐａｒｌがｒｅｌＢ−ｏｒｆ３に約６５〜７０％の相同性のあることを示唆す る。１６キロ塩基のｒｅｌＢ−ｏｒｆ３　をもったフラグメントはｐａｒＢプロ ーブで検出されない（第８ａ図、６列）ので、ＲｌｐａｒＢはｒｅｌＢ−ｏｒｆ ３　に対し５０％又はそれ以下の相同性がある。

実施例５において、ｐａｒＢプローブは、２０キロ塩基染色体相同体を検出する が前記データに従ってｒｅｌＢ−ｏｒｆ３を表わす１６キロ塩基の相同性を検出 しないことがわかった。実施例６に述べられたように後者は発現された時ｈｏｋ 様活性を与えるので、ｐａｒｌも又ｈｏｋ様活性かｓｏｋ様活性及び／もしくは 正しく発現されたとき両者の活性を発現すると考えられる。

Ｒｌ　ｐａｒ　Ｂ様配列をもったプラスミドＲ１００及びＲ３８６を含むイー・ コリのフィルターハイブリダイゼーション解析において、プローブとしてｒｅｌ Ｂ−ｏｒｆ　３　フラグメントが用いられた（第８ａ図、１列及び２列）。現在 のハイブリダイゼーション条件下では、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３プローブは、２０キ ロ塩基ｐａｒｔおよび１６キロ塩基ｒｅｌＢ−ｏｒｆ８　をもったフラグメント だけがプローブとハイブリダイズすることが見られるので、これらの配列を検出 しなかった（第８ａ図、１列及び２列）。

このことは、ｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を発現する領域からのプローブと与えられ たＤＮＡ１とのハイブリダイゼーションが存在しないことは、問題のＤＮＡ種が 、正しく発現されればｈｏｋ様活性を与えることを除外しないことを示す。した がって問題のＤＮＡ種とｈｏｋ　又はｈｏｋ　様活性を発現する領域との間の相 同性を見出したことは、問題のＤＮＡが正しく発現されればｈｏｋ又はｈｏｋ様 活性を示すだろうことを強く示唆する。

それ故上のデータはｈｏｋ／ｓｏｋ　様活性を与える領域を探索する有用な戦略 であることを示す。ｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子（例えばＲｌｐａｒＢ）から成る 核酸の領域を表わすプローブは、問題のゲノム（例えば染色体ＤＮＡ又はプラス ミドＤＮＡ）内の相同配列（例えばｐａｒ　１　）を検出するのに用いられる。

そのゲノムは次に正しい実験組立ての中でｈｏｋ又はｈｏｋ様活性に対し試験さ れる（ｒｅｌ　Ｂ−ｏｒｆ３領域に対してなされたようにＸそしてもしそのよう な単一もしくは複数の活性がコードされることが示されるならば、次にそれ自身 をプローブとして新規の相同配列を見つけるために第２回目のハイブリダイゼー ションに用いられる。その新規の配列は第１回目のハイブリダイゼーションで用 いられたプローブに対しては関係するかも知れないし関係しないかもしれない（ 例えばＲｌｐａｒＢ）。核酸ハイブリダイゼーションと単離された核酸配列の機 能検定を結びつけるこの段階法は、イー・コリからどんどん分離されるゲノム中 のｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を発現する遺伝子の探索に一般的な戦術として採用さ れることができる。

（実施例１０） 細菌におけるｐａｒＢ関連配列の検出Ｃ第９および１ｏ図参照）前記実施例にお いて１）Ｒ１−ｐａｒＢに関連する配列は、ゲノム陰性菌から単離された細菌プ ラスミドの中に広く分布する、および２）Ｒ１ｐａｒＩ３関連配列はイー・コリ の染色体ＤＮＡの中に存在することが証明された。これらの発見は、これらの生 物に自然に存在する染色体ＤＮＡ又はプラスミドの部分として、ＲｌｐａｒＢ又 は種々の細菌からのＤＮＡ中の染色体の片割れの１つ（イー・コリｒｅｌＢ−ｏ ｒｆ３）に関連する配列の検索をうながした。

セラチア・マルセセンスからのＥｃｏＲＩ開裂ＤＮＡについての１１ｐａｒＢプ ローブを用いたフィルターハイブリダイゼーション！析は、４．１．２．９及び ２．５キロ塩基の３つのフラグメントに強いハイブリダイゼーションを示す（第 ９図、２列）。

４．１キロ塩基のフラグメントだけはｒｅｌＢ−ｏｒｆ３　プローブにもハイブ リッド形成する（第１０図、１列）。ｐａｒＢ　プローブはさらに６つのフラグ メントとハイブリダイズする。これらのシグナルの２つは、イー・コリＩ）ＮＡ におけるｒｅｌＢ−。ｒｆ３をもった１６キロ塩基フラグメントから由来するｐ ａｒＢ　シグナルより強い（第９図、６列）。セラチア・マルセセンスＤＮＡの イー・コリｒｅｌＢ−ｏｒｆ３　プローブとのハイブリダイゼーションは多数の 弱いハイブリダイゼーションシグナルを生じる。アガロースゲル電気泳動ではど れも高コピー数プラスミドであることを示さなかったけれども、２．５．２．９ 及び４．１キロ塩基の強くハイブリダイズするバンドはプラスミド由来である可 能性がある。

プソイドモナス・フルオレセンスはこの種のプラスミドをもたない一員として解 析された。プソイドモナス・フルオレセンスからのＤＮＡのＲｌｐａｒＢとのハ イブリダイゼーション（第９図、３列）は８〜１０個のハイブリダイズするフラ グメントを示す。そのうち４つはＲ１ｐａｒＢ　の染色体片割れの約３３％の強 度のシグナルを表わす（第９図、６列）。また約１８キロ塩基のこれらのフラグ メントの１つのシグナルはおそらくイー・コリｒｅｌＢ−ｏｒｆ８プローブとハ イブリダイズする（第１０図、２列）。さらにｒｅｌＢ−ｏｒｆ８のプローブは 低イシグナル強度だけど５つのフラグメントを明確に同定する。５．５及び５． ６キロ塩基のこれらの２つは、このＤＮＡがｒｅｌＢ−ｏｒｆｌ　プローブを用 いて解析された時（第１０図、３列）プソイドモナス・プチダからのＤＮＡ中に も見られる。そのｒｅｌ　Ｂ−ｏｒｆ３　プローブはプソイドモナス・プチダＤ ＮＡの中の他の５フラグメントにハイブリダイズするが、これらのフラグメント のどれもＲ１ｐａｒＢプローブによっては認識されない（第９図、４列）。プソ イドモナス・プチダＤＮＡにおいてｐａｒ　Ｂ　プローブは低いシグナル強度の 約１０個のフラグメントと約７．３キロ塩基の１個の全く強くハイブリダイズす るフラグメントとを検出する。

グラム陽性菌中でビイ・サブチリス、ビイ・シルクランス（Ｂ、ｃｉｒｃｕｌａ ｎｓ）ＰＬ２’３６及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の２株 は、几１−ｐａｒＢ　又はイー・コリｒｅｌＢ−ｏｒｆ８　に関連する配列の存 在に関して解析された。

ｐａｒＢプローブの場合に、５．２キロ塩基の１個の全く強くハイブリダイズす るフラグメントは、ビイ・シルクランスからのＤＮＡの中に見出された（第９図 、８列）。ビイ・シルクランスＤＮＡのいくつかの他のフラグメントからひじよ うに弱いシグナルが得られた。ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　８プローブによって、限られ た数のハイブリダイゼーションフラグメント示ビイ・サブチリス（第１０図、４ 列）、ビイ・シルクランス（第１０図。

５列）及びラクトバチルス（第１０図、６と７列）からのＤＮＡの中にみとめら れた。ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　８ハイブリダイス゛フラグメントの数は６から１１の 範囲にあり、すべてほとんど同じシグナル強度を有する。ラクトバチリス属の細 菌においてアガロースゲル電気泳動は、少くともいくらかのハイブリダイズ配列 がプラスミド由来である可能性を示唆するプラスミドの存在を証明した。ビイ・ シルクランスＰＬ２３６においてプラスミドの探索は、Ｒ１−ｐａｒＢプローブ とハイブリダイズするビイ・シルクランスＤＮＡ配列が（第９図、８列）染色体 由来であるということについては否定的な示唆を与えた。

上記実験は、ＲｌｐａｒＢ及び又はイー・コリｒｅｌＢｏｒｆ　３に関連する配 列が、細菌種の中に、そのプローブが導かれたエンテロバクテリウム属の細菌だ けでなくグラム陽性菌にも広く分布していることを示す。

（実施例１１） 真核細胞内におけるｐａｒＢ　関連配列の検出（第１１図参照）単細胞真核生物 すなわち繊毛のある原生動物テトラヒメナ・テルモフィラが研究された（第１１ 図）。この生物は、１）細胞当りのミトコンドリアＤＮＡ分子数が多いこと、お よび２）リポソームＲＮＡ遺伝子の約１２０００コピーが自己複製するリポソー ムＤＮＡ分子上に存在することを特徴とする。１ｔｉｐａｒＢプローブもイー・ コリｒｅｌＢ−ｏｒｆ３プローブも、単離された大棟から作られたＤＮＡ中のい かなるフラグメントも検出しない（第１１図、１列）。またそれらプローブは、 単離されたｒＤＮＡの２つのＥｃｏＲＩにもハイブリダイズしない（第１１図、 ３列）。ミトコンドリアＤＮＡを含むテトラヒメナ・テルモフイラからのＥｃｏ ＲＩ切断全ＤＮＡは、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３プローブとハイブリダイズする、６ ．６及び３．３キロ塩基（第１１図、２列）の２つのフラグメントを示す。一方 ｐａｒＢ　プローブはいかなるシグナルも生じなかった。そのハイブリダイズす るフラグメントはミトコンドリアＤＮＡの２つのフラグメントと共に移される。

そのことはＤＮＡトランスファーの前にゲルをエチジウムブロマイドで染色する ことによりたやすく検出される。

えんどう〔ピスム・サチブム（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）　］からの葉緑体 ＤＮＡは制限酵素ＰｓｔＩで開裂され、０，１２μｌがｐａｒＢ　及びｒｅｌＢ −ｏｒｆ３プローブを用いるフィルターハイブリダイゼーション法によって解析 された（第１１図、４列）。

後者のプローブは約１６キロ塩基のフラグメントにハイブリダイズする。

最後にヒト細胞ＤＮＡの２検体が、ＥｃｏＲＩ開裂後フィルターハイブリダイゼ ーション法によって解析された。Ｒ１ｐａｒＢプローブは、神経芽細胞ＤＮＡ（ 第１１図、５列）及び胎児肝ＤＮＡ（第１１図、６列）に弱いハイブリダイゼー ションシグナルを得た。肝組織の高いミトコンドリア含量は、第１１図。

６列に観察されるシグナルがヒトミトコンドリアかう由来していることを示すも のである。他のハイブリダイゼーション解析が染色体外ミー染色体（“ｄｏｕｂ ｌｅ　ｍ１ｎｕｔｅｓ”　）の存在に導く小さな染色体領域の選択的な増幅を示 したので、神経芽細胞ＤＮＡが解析された。第１１図、５列のハイブリダイゼー ションシグナルの起源はわからない。

（実施例１２） ビイ・プチダ及びニス・マルセセンス中のひじように不安定な組換え体プラスミ ドのｐａｒＢ領域による完全な安定化（第１２図参照） プソイドモナス　Ｓｐｐ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ、）中に外来ＤＮ Ａをクローニングした場合、導入されたプラスミドはしばしばひじように不安定 になることが観察される。このプラスミドの不安定性はある方法で外来ＤＮＡを 認識し脱離する知られていない宿主細胞機能の訊導によって起こると仮定された （ＫｉｍとＭｅｙｅｒ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　１５９　、１９８４ 　。

ｐｐ６７８−６８２）プソイドモナスＳｐｐは工業目的には関連が深いので、そ のようなひじように不安定な組換え体プラスミド誘導体上のｐａｒＢ　の効果を 試験することは重要であると考えられた。

プラスミドｐＫＴ　２３０は、　広い宿主域をもつベクターＲ３Ｆ１０１０　（ 広い範囲のグラム陰性菌内に安定に維持されうる）及び天然のｐ１５プラスミド 誘導体ｐＡｃＹｃ　１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ら　Ｇｅｎｅ　１６　、 　１９８１　、ｐｐ　２（７−２４２）から成る統合されたプラスミドである。

プラスミドｐＪＬ２１７（ＬｉｇｈｔとＭｏ１ｉｎ、　ｂｉｏｌ　、　Ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ。

１８７．１９８２　ｐｐ４８６−４９３）のｌａｃ遺伝子を含むＢｇｌＵ　開裂 フラグメントは、ｐＫＴ　２３０の単−ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入されｐＦＮ１ ３を得た。高コピー数をもつプラスミドｐＦＮ１３は１世代ｌ細胞につき１０　 以下の脱落頻度でイー・コリ中で安定に維持される。ビイ・プチダにおいてはし かしながら同じプラスミド誘導体は１世代１細胞につき３０％の脱落頻度である 。ニス・マルセセンス中では脱落頻度は１世代１細胞につき５％である。

ｐａｒＢの効果を試験するためにｐＰＲ９５のｐａｒＢＥｃｏＲＩフラグメント がｐＦＮ１３の単−ＥｃｏＲ１部位に挿入された。

得られたプラスミドはｐＦＮ１３ｐａｒＢ　と称しその地図は第１２図に示され る。プラスミドｐＦＮ１３　は接合プラスミドによってビイ・プチダ及びニス・ マルセセンスに移された両方の場合カナマイシン耐性で選別された。ビイ・プチ ダ及びニス・マルセセンス両者におけるｐＦＮ１３ｐａｒＢ　の脱落頻度は１世 代１細胞につき１０　以下であった。これはビイ・プチダにおいて少くとも１０ 　倍、ニス・マルセセンスにおいて少くともｌＯ倍のプラスミドの安定性の増加 に相当する。

したがってｐａｒ　Ｂ　領域は、イー・コリとはかけはなれた関係にある細菌種 においてさえひじように不安定な組換え体プラスミドを確実に安定にするのに大 変効果があると結論することができる。

（実施例１３） 几１　ｈｏｋ遺伝子がグラム陽性菌、例えばバチルス・サブチリスに細胞致死効 果を与えるかどうか、ビイ・サブチリスプロモーターから正しく発現されるかど うかを解析するためにｐａｒＢ領域はｐＰＲ９５（第２図）からＥｅｏＲＩ　フ ラグメントとして単離された。そのＥｃｏＲＩ部位はフレノウポリメラーゼを用 いてプラント末端を作るためにうめられた。そして次にそのフラグメントはＦｓ ｐ’ｉによって切断される。ｈｏｋ　プロモーターを欠く３００塩基対のＦｓｐ Ｉ　（ＥｃｏＲＩ）７ラグメント（第３図の＋２８６から＋５８０位に及ぶ）が 単離され、５′の一本鎖の突出した末端を除くために８ａｌ　Ｉ　で切断後ナタ マメヌクレアーゼ（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらＭｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１０１　 。

１９８ａ　ｐ１２３）で処理したｐｓＩ−１（ＹａｎｓｕｒａとＨｅｎｎｅｒｌ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　、１９８４　 、　ｐ４３９）に挿入された。その結合混合物はイー・コリＭＣ１０００（Ｃａ ｓａｂａｃｌａｎとＣｏｈｅｎ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、１８Ｂ　。

１９８０　、ｐｐ１７９−２０７）に形質転換される。

この構築では、ｈｏｋリポソーム結合部位を含むｈｏｋ遺伝子は、ビイ・サブチ リス−イー・コリシャトルベクターであるｐｓＩ−１上に存在する合成ビイ・サ ブチリスリボソーム結合部位に近く位置する。挿入遺伝子の発現はｐｓＩ−１上 の５ｐｏ１プロモーターによって支配される。そのプロモーター活性は、プロモ ーターと合成リポソーム結合部位（ｓｐａｃ−１プロモーター、Ｙａｎｓｕｒａ とＪ（ｅｎｎｅｒ　、前記文献）との間に存在するｌａｃオペレーターを経て調 節される。ｐｓＩ−１はさらにｌａｃリプレッサーをコードするＩａｃ　Ｉ遺伝 子を発現する。

イー・コリ形質転換体は、ＩＰＴＯ（イソプロピルチオガラクトシド）に関して 解析される。５ｐｏ１プロモーターがイー・コリ中で活性であるので、ＩＰＴＯ は増殖阻害をひきおこす。

そのスクリーニングはクロラムフェニコールの８μＥ／ｍｌを含ムフレートから 、クロラムフェニコールとＩＰＴＯ（１ｍ八へ）を含むプレートにレプリカ移植 することによって行なわれる。

ＩＰＴＧの存在下増殖の悪いコロニーはその表現型を確認するため液体培養によ りさらに解析される。ＩＰＴＧを１ｍＭまで加えられた場合ゴースト細胞（実施 例３参照）の形成を示す多数の形質転換体が同定される。

その形質転換体は液体培養で０Ｄ６ＱＱ＝０．２までさらに増殖させその時点で ＩＰＴＧが１ｍΔ１まで加えられる。ＩＰＴＯの添加は増殖阻害をひきおこし培 養液中にゴースト細胞の形成をおこす（実施例３参照）。

プラスミドＤＮＡはそのようなＩＰＴＧ感受性イー・コリ形質転換体から単離さ れ、クロラムフェニコール耐性形質転換体に対する選択によって、ビイ・サブチ リスＢＤ２２４に、プロトプラスト形質転換法（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、Ｒｉ ｏｌｅｃ、ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、１６８，１９７９．ｐｉｌｌ）で導入される。

Ｒｌｈｏｋのビイ・サブチリス中の可能な細胞致死効果に関し解析するために、 クロラムフェニコール耐性（Ｃｍ）ビイ・サブチリス形質転換体がＩＰＴＧの１ ｍＭの存在又は非存在下でブレーティングされる。もし増殖停止又は強い増殖阻 害がＩＰＴＧの存在下観測されたらＲｌｈｏｋが正しく発現されている。上に示 したように適当な構築によってｈｏｋｍＲＮＡの翻訳に関しｓｏｋ　様アンチセ ンスＲＮＡ調節を負わせることは可能である。

一 ＮｃＮ 史と旦−６に ６ｅｎ３−６に Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　＾ｒｇ　Ｌｙｓ６１ｕ　Ｐ ｒｏ　６１ｕ　６１ｕ−ＣＯＯＨの ２．０−・ 口・　［＄ｉｋ、、゛ 国際調査報告 瞥・Ｉ−°電１・−＾−１−４１′・”””ＦＣＴ、１ＤＫ８６／（コニ；コイ ：）７０

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞に保有されている場合、細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物 （又はその産物の前駆体）を発現し、さらにこの細胞致死産物に対するアンタゴ ニスト（またはそのアンタゴニストの前駆体）を発現するレプリコンであって、 前記アンタゴニストは該レプリコンを保有する細胞内の致死産物（又はその致死 産物の前駆体）を抑圧するアンクゴニストであるが、該レプリコンが細胞から失 われて該アンタゴニスト（又はその前駆体）がもはや連続的に発現されない場合 にはアンタゴニストの活性が衰退するものであり、このことは該レプリコンがグ ラム陰性菌内で複製しうるブラスミドである場合に、細胞致死産物とこれに対す るアンタゴニストとがＲｌｐａｒＢによってエンコードされないならば、レプリ コンが存在しない現存細胞内に存在する致死産物（又はその前駆体）がもはやア ンタゴニストによって抑圧されず細胞死をもたらすことを意味するものであるレ プリコン。
2. ２．致死産物（又はその前駆体）をエンコードするレプリコンの配列が、細菌ブ ラスミド、細菌染色体、真核ブラスミド、真核ウイルス、複製の染色体源を有す る、真核の自発的に複製する配列、真核ミトコンドリアＤＮＡ分子、又は真核葉 緑体分子由来である請求の範囲第１項のレプリコン。
3. ３．アンタゴニスト（又はその前駆体）をエンコードする配列とレプリコンが、 細菌ブラスミド、細菌染色体、真核ブラスミド、真核ウイルス、複製の染色体源 を有する、真核の自発的に複製する配列、真核のミトコンドリアＤＮＡ分子又は 真核葉緑体分子由来であるか、又は合成の配列である請求の範囲第１項のレプリ コン。
4. ４．天然ではレプリコンに無関係のヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１〜 ３項のいずれかひとつのレプリコン。
5. ５．細胞に保有されている場合、細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物 をエンコードするメッセンジャーＲＮＡを発現し、さらにレプリコンを保有する 細胞内でのメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害するアンクゴニストを発現する上 記請求の範囲のいずれかひとつのレプリコン。
6. ６．アンタゴニストが、細胞致死産物をエンコードするメッセンジャーＲＮＡの 少なくとも一部に塩基対合することによって、このメッセンジャーＲＮＡの翻訳 を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子である請求の範囲第５項のレプリコン。
7. ７．ＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子によって発現される産物（又はその前駆体）と同 一もしくは類似のしかたで細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物（又は その産物の前駆体）をエンコードする配列を有するＤＮＡ分子である上記請求の 範囲のいずれかひとつのレプリコン。
8. ８．細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物（又はその産物の前駆体）を エンコードする配列が、ＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を 有する請求の範囲第７項のレプリコン。
9. ９．ＲｌｐａｒＢｓｏｋ遺伝子によって発現されるアンタゴニストと同一もしく は類似のしかたで機能するアンクゴニストをエンコードする配列を有するＤＮＡ 分子である上記請求の範囲のいずれかひとつのレプリコン。
10. １０．アンタゴニストをエンコードする配列が、ＲｌｐａｒＢｓｏｋ遺伝子もし くはこれと相同の配列を有する請求の範囲第９項のレプリコン。
11. １１．ＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を有するひとつのレ プリコンと、ＲｌｐａｒＢｓｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を有するもう ひとつのレプリコンとを保有する生細胞。
12. １２．ＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を有するレプリコン が染色体である請求の範囲第１１項の生細胞。
13. １３．Ｒ１ｐａｒＢｓｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を有するレプリコン が、染色体外の自発的に複製するヌクレオチド配列である請求の範囲第１２項の 生細胞。
14. １４．レプリコンがブラスミドである請求の範囲第１３項の生細胞。
15. １５．請求の範囲第１〜１０項のいずれかひとつのレプリコンを保有する生細胞 。
16. １６．細菌、単細胞の真核住物、動物細胞または植物細胞である請求の範囲第１ ５項の生細胞。
17. １７．請求の範囲第１６項の生細胞を含有する細胞培養物。
18. １８．そのＤＮＡフラグメントがレプリコンに挿入されると、レプリコンを保有 する細胞もしくはその細胞の子孫を殺すことができる産物をエンコードする（又 はその産物の前駆体をエンコードする）配列と、前記致死産物に対するアンタゴ ニストをエンコードする（又はこのアンタゴニストの前駆体をエンコードする） 配列とを有するＤＮＡフラグメントであって、前記アンタゴニストは該レプリコ ンを保有する細胞内の致死産物（またはその致死産物の前駆体）を抑圧するアン クゴニストであるが、該レプリコンが細胞から失われて該アンタゴニスト（又は その前駆体）がもはや連続的に発現されない場合にはアンタゴニストの活性が衰 退するものであり、このことは該フラグメントを有するレプリコンがグラム陰性 菌内で複製しうるブラスミドである場合に、ＤＮＡフラグメントがＲｌｐａｒＢ 領域を有していないならば、レプリコンが存在しない現存細胞内に存在する致死 産物（又はその前駆体）がもはやアンタゴニストによって抑圧されず細胞死をも たらすことを意味するものであるＤＮＡフラグメント。
19. １９．そのＤＮＡフラグメントがレプリコンに挿入されると、レプリコンを保有 する細胞もしくはその細胞の子孫を殺すことができる産物をエンコードする（又 はその産物の前駆体をエンコードする）メッセンジャーＲＮＡをエンコードする 配列と、レプリコンを保有する細胞内でのメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害す るアンクゴニストをエンコードする配列とを有する請求の範囲第１８項のＤＮＡ フラグメント。
20. ２０．アンタゴニストが、細胞致死産物をエンコードするメッセンジャーＲＮＡ の少なくとも一部に対合することによって、メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害 するアンチセンスＲＮＡ分子である請求の範囲第１９項のＤＮＡフラグメント。
21. ２１．ＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子によって発現される産物もしくは（その前駆体 ）と同一もしくは類似のしかたで、細胞もしくはその子孫を殺すことのできる産 物（もしくはその産物の前駆体）をエンコードする配列を有する請求の範囲第１ ８〜２０項のいずれかひとつのＤＮＡフラグメント。
22. ２２．細胞もしくはその子孫を殺すことができる産物（またその産物の前駆体） をエンコードする配列がＲｌｐａｒＢｈｏｋ遺伝子もしくはこれと相同の配列を 有する請求の範囲第２１項のＤＮＡフラグメント。
23. ２３．ＲｌｐａｒＢｓｏｋ遺伝子によって発現されるアンタゴニストと同一もし くは類似のしかたで機能するアンタゴニストをエンコードする配列を有する請求 の範囲第１８〜２０項のいずれかひとつのＤＮＡフラグメント。
24. ２４．アンタゴニストをエンコードする配列が、ＲｌｐａｒＢｓｏｋ遺伝子もし くはこれと相同の配列を有する請求の範囲第２３項のＤＮＡフラグメント。
25. ２５．レプリコンを保有する細胞もしくはその細胞の子孫を殺すことができる産 物をエンコードする（又はその産物の前駆体をエンコードする）配列と、前記致 死産物に対するアンタゴニストをエンコードする（又はそのアンタゴニストの前 駆体をエンコードする）配列とを、レプリコンに挿入することからなり、前記ア ンタゴニストは該レプリコンを保有する細胞内の致死産物（又はその致死産物の 前駆体）を抑圧するアンタゴニストであるが、該レプリコンが細胞から失われて 該アンタゴニスト（又はその前駆体）がもはや連続的に発現されない場合にはア ンタゴニストの活性が衰退するものであり、このことは該レプリコンがグラム陰 性菌内で複製しうるブラスミドである場合に、細胞致死産物とこれに対するアン タゴニストとがＲｌｐａｒＢによってエンコードされないならば、レプリコンが 存在しない現存細胞内に存在する致死産物（又はその前駆体）がもはやアンタゴ ニストによって抑圧されず細胞死をもたらすことを意味するものである、請求の 範囲第１項のレプリコンを製造する方法。
26. ２６．請求の範囲第１５項のＤＮＡフラグメントが挿入される請求の範囲第２５ 項の方法。
27. ２７．レプリコンが、細菌ブラスミド、細菌染色体、真核ブラスミド、真核ウイ ルス、複製の染色体源を有する、自発的に複製する真核配列、真核ミトコンドリ アＤＮＡ分子または真核葉緑体分子である、請求の範囲第２５項もしくは第２６ 項の方法。
28. ２８．挿入される単一もしくは複数の配列が、レプリコンに関連する細胞が起源 のＤＮＡ（もしくは応用しうる場合のＲＮＡ）の単一もしくは複数の配列である 請求の範囲第２５〜２７項のいずれかひとつの方法。
29. ２９．単一もしくは複数の配列がＲｌｐａｒＢ領域に相同である単一もしくは複 数の配列である請求の範囲第２８項の方法。
30. ３０．単一もしくは複数の配列がＲｌｐａｒＢ領域が起源の単一もしくは複数の 配列である請求の範囲第２８項の方法。
31. ３１．請求の範囲第１〜１０項のいずれかひとつのレプリコンを保有する細胞を 培養し次いでそのレプリコンから発現される遺伝子産物を収穫することからなる 、核酸配列によってエンコードされる遺伝子産物の製造方法。
32. ３２．培養が、少なくとも１００細胞世代行われる請求の範囲第３１項の方法。
33. ３３．レプリコンの脱落が１０−４／細胞／世代を超えない請求の範囲第３２項 の方法。
34. ３４．レプリコンの脱落が１０−５／細胞／世代を超えない請求の範囲第３３項 の方法。
35. ３５．レプリコンの脱落が１０−６／細胞／世代を超えない請求の範囲第３４項 の方法。