JPH0753592A - エレファマイシン耐性変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 伸長因子Ｔｕのエルファマイシン耐性変異体
を利用してエルファマイシン産生放線菌、特にモシマイ
シン産生ストレプトミセスのエルファマイシン感受性を
低下させる。 【構成】エルファマイシンの制限因子をたんぱく質ＥＦ
−Ｔｕをコードする遺伝子ｔｕｆをエルファマイシン耐
性のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲをコードする遺伝子ｔｕｆ
Ｒに変異させることにより除去する。 【効果】遺伝子ｔｕｆＲを発現する宿主細胞はエルファ
マイシンに対する耐性の増加を示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明はエルファマイシン産生放
線菌、エルファマイシン産生放線菌のたんぱく質ＥＦ−
Ｔｕ（伸長因子Ｔｕ）、該たんぱく質をコードするＤＮ
Ａ配列ｔｕ、該ＤＮＡ配列を含む複製可能なベクターお
よび該ベクターでトランスホームした放線菌に関する。

【従来の技術】エルファマイシンは一群の抗生物質であ
り、モシマイシン（またはキロマイシンとして知られて
いる）、ジヒドロモシマイシン、Ｎ−メチルモシマイシ
ン（オーロドックスとしても知られている）、キロスリ
シン、アズジマイシン、エフロトマイシンおよびパルボ
マイシンなどが属する。これらは放線菌目に属するバク
テリアから産生される。特に英国特許１３２５２００の
対象物質である抗生物質モシマイシンは、ストレプトミ
セスコリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉ
ｎｕｓ）、ストレプトミセスジアスタトクロモゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセスフラジェ（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）および特に
ストレプトミセスラモシシマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）などストレプトミセ
ス属に属するバクテリアによって産生される。実際に
は、上記バクテリアによるエルファマイシン、特にモシ
マイシンの産生レベルは極めて低く、これらの商業的利
用を魅力のないものにしている。モシマイシンを含むエ
ルファマイシンの抗生作用はＥＦ−Ｔｕの阻害によるも
のであることが知られている（Ｈ．ウォルフ（Ｗｏｌ
ｆ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ、７５（１９７８）５３２４−５３２８）。ポリペプ
チド鎖伸長因子（ＥＦ）は細胞のたんぱく質合成に必須
である。ＥＦ−Ｔｕと呼ばれるものは、大腸菌などのグ
ラム陰性菌や放線菌目に属するものなどのグラム陽性菌
を含む全ての原核細胞で生産されている。生物種が異な
るとそのＥＦ−Ｔｕは似てはいるが同じものではない。
ＥＦ−ＴｕをコードするＤＮＡ配列はｔｕｆ遺伝子と呼
ばれる。さらにＣ．グロックナー（Ｇｌｏｅｃｋｎｅ
ｒ）およびＨ．ウォルフ（Ｗｏｌｆ）（ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２５（１９８
４）１２１−１２４）によりストレプトミセス属のテス
トした全てのモシマイシン産生株が無細胞たんぱく質合
成系において比較的低濃度のエルファマイシンに感受性
を示すことが発見された。一方この著者等はキロスリシ
ン産生ストレプトミセスシナノメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｎｏｍｅｕｓ）およびエフロト
マイシン産生ストレプトミセスラクタムデュランス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）
（最近ノカルジアラクタムデュランス（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓと改名された）から単離
したＥＦ−Ｔｕは内在する抗生物質ばかりでなくモシマ
イシンに対しても耐性であることを発見し、エルファマ
イシン産生株のＥＦ−Ｔｕの自分自身のエルファマイシ
ンに対する感受性がそれらの産生能の制限因子となって
いることを示した。彼等は、ストレプトミセスシナモメ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｎｏｍｅ
ｕｓ）およびストレプトミセスラクタムデュランス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）
などの株は細胞内の高レベルの抗生物質に耐性であるこ
とから生産性の高い変異体を作製するのに適していると
推定した。本来エルファマイシン感受性のＥＦ−Ｔｕを
エルファマイシンに対する耐性が増加したＥＦ−Ｔｕに
する化学的変異化合物を用いた突然変異誘発はＦ．フィ
ッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）等により、膜透過性を変化
させた大腸菌の実験株について報告されており（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４（１９７
７）４３４１−４３４５）、またＪ．Ａ．Ｍ．ウァン・
デ・クランデルト（Ｖａｎ ｄｅ Ｋｌｕｎｄｅｒｔ）
等によっても報告されている（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ
ｓ８１（１９７７）３０３−３０７）。前者の著書はこ
の大腸菌変異体は元の大腸菌と比べて増殖能力（エルフ
ァマイシン非存在下）を欠失していることを報告してい
る。大腸菌ＥＦ−Ｔｕのエルファマイシン耐性の増加に
導く変異は、部位３７５のアラニンのバリンまたはスレ
オニンのいずれかへの置換によるものであることが分っ
た（Ｆ．Ｊ．デュイスターウィンケル（Ｄｕｉｓｔｅｒ
ｗｉｎｋｅｌ）等、ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）１１３
−１２０）。その他にエルファマイシン耐性ＥＦ−Ｔｕ
たんばく質は別のグラム陰性菌からは報告されていな
い。グラム陽性菌枯草菌のエルファマイシン耐性ＥＦ−
Ｔｕが同定されたが分子レベルでの特徴は分っていない
（Ｉ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびＰ．パレス（Ｐａｒ
ｅｓｓ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３５（１９７
８）１１０７−１１１７）。放線菌、特にストレプトミ
セス特にモシマイシン産生ストレプトミセス、特にスト
レプトミセスラモシシマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）についてそのような変異
に関する報告はない。エルファマイシンに対する耐性の
増加に等く大腸菌の化学的突然変異誘発に関する上記２
つの報告において、大腸菌は２つの別個のｔｕｆ遺伝子
に由来する非常に近い関係にあるが別個の２つのＥＦ−
Ｔｕたんばく質を有していることが示されている。エル
ファマイシンは感受性ＥＦ−Ｔｕをリボゾームに不可逆
的に結合させることによりその活性を阻害するので、大
腸菌のエルファマイシン耐性変異体は２つのＥＦ−Ｔｕ
たんぱく質について両方が変異しかつ活性をもつもの、
あるいは、２つのうち１つが変異し、かつ活性をもつも
のでもう１つが非活性のものであるという理論的基盤に
従っている。このことはインビトロ実験で確認された。
ストレプトミセス、特にストレプトミセスラモシシマス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕ
ｓ）の場合、本発明者は３個の非常に近い関係にあるｔ
ｕｆ遺伝子を同定した。さらに研究することでこれらの
１つは主にストレプトミセスの増殖性菌糸体で発現され
ることが分った。他の両遺伝子のたんぱく質産物は主要
ＥＦ−Ｔｕ種の量の約５パーセントを構成する。このこ
とは特にストレプトミセスラモシシマス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）で観察され
る。同様のたんぱく質パターンがストレプトミセスコリ
ナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）
およびストレプトミセスゴルジニエンシス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ ｇｏｌｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）に見られ
た。大腸菌とは対照的に、ストレプトミセスは胞子形成
に向けて複雑な形態学的および生化学的分化を行う能力
を有している。それゆえ、胞子形成およびひきつづく発
芽の際、少数の不活性なＥＦ−Ｔｕ種は主要な活性ＥＦ
−Ｔｕとなると考えられる。この分化的発現は発生的に
調節される遺伝子群の転写を指令する枯草菌（Ｒ．ロシ
ック（Ｌｏｓｉｃｋ）等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ２０（１９８６）６２５−６９９）およびＳ．コ
リカラー（Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）（Ｍ．
Ｊ．バトナー（Ｂｕｔｔｎｅｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３（１９８９）１６５３−１
６５９）で観察される種々のシグマ因子の発現と類似し
ている。ＥＦ−Ｔｕコード遺伝子の分化的発現には発生
相の特定の必要事項に翻訳機械を適用することが要求さ
れる。成長菌糸体における２つのマイナーＥＦ−Ｔｕの
発現レベルが低くても大腸菌における状態に類似してメ
ジャーＥＦ−Ｔｕたんぱく質がエルファマイシン耐性と
するとしてもこれらのマイナーＥＦ−Ｔｕがエルファマ
イシン感受性を優性としてしまう。したがってエルファ
マイシン耐性の発現型が明確な場合のエルファマイシン
感受性ＥＦ−Ｔｕ対エルファマイシン耐性ＥＦ−Ｔｕの
相対的レベルは分らない。しかし、本発明の目的に関す
るストレプトミセス、特にストレプトミセスラモシシマ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍ
ｕｓ）は１つのメジャーＥＦ−Ｔｕを有すると考えられ
ている。現在、エルファマイシン産生放線菌、特にモシ
マイシン産生放線菌、より特別にはストレプトミセスラ
モシシマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｃｉ
ｓｓｉｍｕｓ）に属するもののエルファマイシン感受性
ＥＦ−Ｔｕを修正してこのたんばく質にこのバクテリア
によって生産されるエルファマイシンに対する耐性を付
与することが可能であることが分った。このことは突然
変異誘発によって行うことが可能である。特に、本発明
者はエルファマイシン感受性ＥＦ−Ｔｕをコードする本
来のｔｕｆ遺伝子をエルファマイシンに対する耐性を増
加した新しいたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲをコードする新し
いｔｕｆＲ遺伝子に修正する部位特異的突然変異誘発技
術を用いた突然変異誘発を行った。それゆえ本発明はエ
ルファマイシン産生放線菌から誘導され、かつ突然変異
誘発、特に突然変異誘発によってエルファマイシン耐性
としたことを特徴とするたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲを提供
する。さらに本発明は前記たんぱく質ＥＦ−ＴｕＲをコ
ードする種々のＤＮＡ配列ｔｕｆＲを提供する。またさ
らに本発明は前記ＤＮＡを含むベクターを提供する。こ
れらのベクターは複製可能であり、および、またはエル
ファマイシン産生放線菌の染色体ＤＮＡ配列に組込み得
る。さらに本発明はＤＮＡ配列ｔｕｆの代りにＤＮＡ配
列ｔｕｆＲを含むエルファマイシン産生放線菌を提供す
る。この放線菌は実質的にエルファマイシン耐性が増加
している。エルファマイシンに対するＥＦ−Ｔｕたんぱ
く質の耐性の増加はエルファマイシン産生における制限
因子を除去する。エルファマイシン耐性ｔｕｆ遺伝子の
発現はトランスホームした株の増殖に影響することが分
った。さらに本発明は前記ＤＮＡ配列、ベクターおよび
放線菌の調製法を提供する。 〔発明の詳細な説明〕エルファマイシン産生種は放線菌
に見られる。ストレプトミセスを用いることが好まし
い。モシマイシン産生ストレプトミセスの例としてはス
トレプトミセスコリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトミセスジアスタトクロ
モゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセスフラジ
ェ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ）および
ストレプトミセスラモシシマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）がある。Ｓ．ラモシ
シマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）を用いるのが最も
好ましい。 伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）は多くの方法
で単離し得る。たとえば段階的硫酸アンモニウム沈殿、
ゲル濾過、およびイオン交換クロマトグラフィーなど当
分野でよく知られている一般的たんぱく質精製技術を組
合せて使用し得る。ＥＦ−Ｔｕたんぱく質の精製に関す
るこの方法の採用はＤ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）および
Ｈ．ウェイスバック（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）（Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４１（１９７
０）２６−３７）、Ｋ．−Ｉ．アライ（Ａｒａｉ）等
（Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２４７（１９７２）７０２
９−７０３７）およびＲ．レバーマン（Ｌｅｂｅｒｍａ
ｎ）等（Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４（１９８
０）２９−３６）に報告されている。ＥＦ−Ｔｕの好ま
しい単離操作を以下に示す。Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍ
ｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）の培養後遠心で菌糸体を回収す
る。この菌糸体を懸濁し超音波処理する。リボゾームを
除く分両遠心後、たんぱく質をアフィニティークロマト
グラフィーでさらに精製する（Ｇ．ヤコブソン（Ｊａｃ
ｏｂｓｏｎ）およびＪ．ローゼンバッシュ（Ｒｏｓｅｎ
ｂｕｓｃｈ）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．７９（１９７７）
８−１０）。この目的にはＧＤＰ−ＡＨ−セファロース
が特に有用である。精製後このたんぱく質のＧＤＰ交換
分析（Ｈ．ウェイスバック（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）等、
Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３７
（１９７０）２６２−２６９）および、たとえばＣ．グ
ロックナー（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ）およびＨ．ウォルフ
（Ｗｏｌｆ）（上述）によって報告されている無細胞抽
出物におけるＥＦ−Ｔｕ依存ペプチド合成を促進する能
力による特徴を明らかにした。さらにアミノ酸組成およ
び（部分的）アミノ酸配列の決定による特性化を行っ
た。単離ＥＦ−Ｔｕのエルファマイシン感受性はエルフ
ァマイシン結合実験（Ｇ．チナリ（Ｃｈｉｎａｌｉ）
等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５（１９７７）５
５−６５）およびＥＦ−Ｔｕ依存ペプチド合成（Ｃ．グ
ロックナー（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ）およびＨ．ウォルフ
（Ｗｏｌｆ）上述）に関する実験でテストした。また別
の直接的エルファマイシン結合検定が開発された。これ
は非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
によりエルファマイシンの存在下ＥＦ−Ｔｕたんばく質
の移動度の変化によりＥＦ−Ｔｕたんぱく質のエルファ
マイシン結合能を観察し得るものである。エルファマイ
シンがＥＦ−Ｔｕ、ＧＤＰに結合すると、ＥＦ−Ｔｕ、
ＧＤＰ二者複合体よりもさらに負に荷電した三者複合体
が形成する（Ｂ．クラール（Ｋｒａａｌ）等１９８９、
“グアニンヌクレオチド結合たんぱく質”、１２１−１
２９、プレナムプレス、ニューヨーク）、結果的にたと
えばオーロドックスを用いた大腸菌野生型ＥＦ−Ｔｕへ
のエルファマイシンの結合は非変性ポリアクリルアミド
ゲル中での移動距離を増加させる。エルファマイシン結
合によるペプチド合成阻害およびその直接的観察を用い
たこれら両方法はＥＦ−Ｔｕ機能に関するエルファマイ
シン結合の効果を測定するよい方法である。もし、ＥＦ
−Ｔｕのエルファマイシン耐性が確立されねばならない
ならこれらの検定法は重要である。エルファマイシンに
対する耐性を増加させたＥＦ−Ｔｕ変異体を得るにはい
くつかの方法がある。これはたとえばエチルメタンスル
ホネートやＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンなどの化学物質、またはＵＶ照射により行ない
得る。高エルファマイシン耐性物の選択で高エルファマ
イシン耐性のＥＦ−Ｔｕを含む株を得る。このことは、
該たんぱく質の単離およびそのエルファマイシン結合実
験、および先に述べたＥＦ−Ｔｕ依存ペプチド合成実験
で行い得る。突然変異誘発を行う別の方法はＥＦ−Ｔｕ
をコードする遺伝子のクローニングを行うものである。
この方法では化学的（Ｒ．メイヤース（Ｍｙｅｒｓ）
等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）２４２−２４
７）または酵素的手法（Ｐ．レトバラ（Ｌｅｈｔｏｖａ
ａｒａ）等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
２（１９８８）６３−６８）により本遺伝子をランダム
に変異させることも、また本遺伝子の１つ以上の特異的
領域／ヌクレオチドに突然変異誘発を集中させることも
可能である（部位特異的突然変異誘発）。部位特異的突
然変異誘発は本発明の好ましい態様である。ＥＦ−Ｔｕ
をコードする遺伝子をクローニングするには関連するエ
ルファマイシン産生種から染色体ＤＮＡを単離し、適当
なベクターに挿入する。ベクターにはプラスミド、ファ
ージ、およびコスミドなどが使用し得る。必要ならば発
現ベクターも使用できる。ｔｕｆ遺伝子を含むクローン
はあらかじめ決定されているたんぱく質またはその一部
の配列に従って合成した合成プローブとのハイブリダイ
ゼーションで選択し得る。２つの遺伝子に十分な類似性
があるならハイブリダイゼーションプローブとして別の
種から単離したｔｕｆ遺伝子も使用し得る。たんぱく質
レベルで８０％の一致があるならハイブリダイゼーショ
ンよる相同遺伝子の検出に十分なＤＮＡレベルでの一致
があると考えられる。ハイブリダイゼーションにより発
見されかつ伸長因子活性を有するたんぱく質をコードす
る別の種も本発明の範囲に含まれる。発現ベクターにお
けるクローニングではＥＦ−Ｔｕに対して特異的抗体を
用いて得られるＤＮＡライブラリーのスクリーニングも
可能である。Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍ
ｕｓ）の染色体ＤＮＡを単離し（Ｄ．ホップウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）等、（１９８５）“ストレプトミセスの
遺伝子操作”、ラボラトリーマニュアル、ジョンインス
ファンデーション、ノルウェー）ｐＵＣ８またはｐＵＣ
１８などのプラスミドにクローン化することが好まし
い。１つのｔｕｆ遺伝子の選択はハイブリダイゼーショ
ンプローブとして大腸菌ｔｕｆＡ遺伝子のＨｐａＩ／Ｎ
ｒｕＩフラグメントを用いて行う（Ｔ．ヨコタ（Ｙｏｋ
ｏｔａ）等、Ｇｅｎｅ．３３（１９８０）２５−３
１）。最近ではプローブとして最初のＳ．ラモシシマス
（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ｔｕｆ遺伝子を用いた。
このようにして３個のｔｕｆ遺伝子が検出、クローン化
され、ついでサンガー法でシーケンシングされた（Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９
７７）５４６３−５４６７）。ノーザンブロッティング
実験で、これら３個の配列から誘導される特異的プロー
ブを用いることにより、Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃ
ｉｓｓｉｍｕｓ）の増殖の際に唯一のｔｕｆ遺伝子の転
写が検出された。この主要な機能性Ｓ．ラモシシマス
（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ｔｕｆ遺伝子（Ｓｒｔｕ
ｆ１）は２．８ｋｂＢｇｌ ＩＩ染色体制限フラグメン
トに局在することが分った。さらに特異的抗体を用い
て、Ｓｒｔｕｆ１遺伝子によってコードされているたん
ぱく質は他の２つの遺伝子にコードされているたんぱく
質より約２０倍も多いことが発見された。後者の遺伝子
はＳｒｔｕｆ２およびＳｒｔｕｆ３と呼ばれ各々３．０
ｋｂＢａｍＨＩフラグメントおよび４．２ｋｂＰｓｔＩ
フラグメントにコードされている。ＳｒＥＦ−Ｔｕ１の
エルファマイシン耐性の改良を試すため、Ｓｔｕｆ遺伝
子の部位特異的突然変異誘発を行った。別の種のＥＦ−
Ｔｕ配列との比較からどのアミノ酸が重要か予測するこ
とができる。これを行う別の方法にはこのたんぱく質の
三次元構造の解析、インヒビター実験または酵素的メカ
ニズム実験がある。このようにして得られた情報から特
定の変異を提案し得る。先に述べたエルファマイシン耐
性大腸菌株について大腸菌ＥＦ−Ｔｕたんぱく質の部位
３７５のアミノ酸アラニンのバリンまたはスレオニンに
よる置換でエルファマイシンに対する耐性が増加したＥ
Ｆ−Ｔｕ分子が生成することが発見された（Ｆ．ドゥイ
スターウィンケル（Ｄｕｉｓｔｅｒｗｉｎｋｅｌ）等、
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ１３（１９８１）８９−９３、
Ｆ．ドゥイスターウィンケル（Ｄｕｉｓｔｅｒｗｉｎｋ
ｅｌ）等、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）１１３−１２
０）。Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）
のＥＦ−Ｔｕたんぱく質をコードするＤＮＡに同様の変
異を導入するのにいくつかの方法を採用できる。好まし
い態様では、ギャップ二本鎖突然変異誘発（Ｗ．クレー
マー（Ｋｒａｍｅｒ）等、Ｎｕｃｌ、Ａｃｉｄ、Ｒｅ
ｓ．１２（１９８４）９４４１−９４５６）と組合せて
ｐＭａ−Ｃベクター系および大腸菌宿主ｗｋ６およびｗ
ｋ６ｍｕｔｓ株（Ｐ．スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎ
ｓ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１９８
９）４４４１−４４５４）を用いた。特別に合成したオ
リゴヌクレオチドプローブを設計し、Ｓ．ラモシシマス
（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）由来のＥＦ−Ｔｕの部位
３７８のアラニンをバリン（Ａ３７８Ｖ）、スレオニン
（Ａ３７８Ｔ）、プロリン（Ａ３７８Ｐ）またはフェニ
ルアラニン（Ａ３７８Ｆ）に変異するのに用いた。別の
変異としては部位３７８における別のアミノ酸の導入ま
たは部位３６０のグルタミン酸のフェニルアラニンへの
変異がある。修正したたんぱく質を得るため適当な宿主
中で変異遺伝子を発現させる。例としては大腸菌および
Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）におけ
る発現がある。ＳｒＥＦ−Ｔｕ変異体Ａ３７８Ｖおよび
Ａ３７８Ｔのエルファマイシンに対する感受性はインビ
トロ実験でテストした。各クローン化遺伝子のエルファ
マイシン耐性ＥＦ−Ｔｕをコードする大腸菌株へのトラ
ンスホーメーション後、Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃ
ｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−Ｔｕおよびその変異体を発現さ
せた。これらトランスホーマントの無細胞抽出物をＣ．
グロックナー（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ）およびＨ．ウォル
フ（Ｗｏｌｆ）（上述）の方法の修正法を用いて翻訳装
置のエルファマイシン耐性についてテストした。ＳｒＥ
Ｆ−Ｔｕ変異体Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔはエルファ
マイシン濃度１６０ｍｇ／ｌで５０％の残存活性を示し
た。親ＳｒＥＦ−Ｔｕはすでに１．６ｍｇ／ｌで５０％
残存活性に到達した。それゆえ、上記検定法でテストし
た場合、エルファマイシン耐性ＥＦ−Ｔｕたんぱく質は
少なくとも２ｍｇ／ｍｌのエルファマイシン濃度で残存
活性５０％のたんぱく質であると考えられる。得られた
全てのＥＦ−Ｔｕ変異体をエルファマイシン結合による
非変性ＰＡＧＥによる移動度変化で観察する直接的結合
実験でテストした。この検定において各ＥＦ−Ｔｕ変異
体（Ａ３７８Ｖ、Ａ３７８Ｔ、Ａ３７８ＰおよびＡ３７
８Ｆ）はエルファマイシンを結合し得ないことが分っ
た。この変異遺伝子をモシマイシン産生宿主に導入し
た。好ましい態様における宿主はＳ．ラモシシマス（ｒ
ａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）である。この変異遺伝子は染
色体に組込まれることが望ましい。この目的のため、ｔ
ｕｆ遺伝子座とホモロジーがある組込みベクターを使用
し得る。この遺伝子座で組込みが起これば親遺伝子と変
異遺伝子が置き換わる。また変異遺伝子は選択した別の
遺伝子座、好ましくはコードされるたんぱく質の発現レ
ベルが高い遺伝子座で染色体に挿入することも可能であ
る。このたんぱく質の高発現レベルのためにはプラスミ
ド上での存在も可能であり、有利なこともある。後者２
つの場合（ｔｕｆ遺伝子とは別の遺伝子座でのｔｕｆＲ
遺伝子の挿入およびプラスミドにコードされるｔｕｆ
Ｒ）、親遺伝子がたとえばその全部または一部の欠失ま
たはその調節遺伝子配列の欠失などの変異で失活してい
ることが重要である。染色体Ｓｒｔｕｆ１遺伝子がｔｕ
ｆＲと置換したＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉ
ｍｕｓ）株は成長菌糸体増殖相においてエルファマイシ
ン耐性レベルが５倍以上増加していることが分った。さ
らに、胞子化および胞子の発芽の際の外来エルファマイ
シンに対する耐性も等しく増加していた。エルファマイ
シン耐性ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）とはその胞子が少なくとも０．２ｇエルファマイシ
ン／ｌ、好ましくは０．２〜１．０ｇエルファマイシン
／ｌの条件下、酵母抽出物４ｇ／ｌ、麦芽抽出物１０ｇ
／ｌおよびグルコース４ｇ／ｌを含むＹＭＧ培地中で発
芽、増殖することを特徴とする株と定義する。大腸菌と
は対照的に、エルファマイシン耐性ストレプトミセスラ
モシシマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｃｉ
ｓｓｉｍｕｓ）の増殖速度に関するＥＦ−Ｔｕ変異の促
進効果は見られなかった。ここに示されているように、
本発明のＥＦ−ＴｕＲたんぱく質は高エルファマイシン
耐性の株に生成する。エルファマイシン産生は増加する
であろうし、少なくともエルファマイシン産生が増加し
ていると見積られればこの修正たんぱく質を含む株はエ
ルファマイシン産生を増加し得るであろう。以下に示す
実施例は本発明を説明するものであり、その範囲を制限
するものではない。特定しないかぎり実施例においては
宿主として大腸菌を用いた組換えＤＮＡの作製および操
作に関する全ての方法は、Ｔ．マニアチス（Ｎａｎｉａ
ｔｉｓ）等によって報告されている標準的方法で行った
（１９８２、モレキュラークローニング、ラボラトリー
マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．）。

【実施例】

【実施例１】 Ｓ．ラモシシマス由来の伸長因子Ｔｕ（ＳｒＥＦ−Ｔ
ｕ）の単離および特性 Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ
１９０．６９を液体Ｓ培地（Ｍ．オカニシ（Ｏｋａｎｉ
ｓｈｉ）等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ８０（１
９７４）３８９−４００）中３０℃で７２時間培養し
た。遠心で菌糸体を収穫し、氷冷標準バッファ（１０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．８、６０ｍＭ ＮＨ_４Ｃ
ｌ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、０．１
％ＰＭＳＦ）に懸濁した。このサスペンジョンを０℃で
４５秒間１０回の超音波処理を行った。処理の間に１５
秒間の冷却を行った。超音波処理サスペンジョンを３０
０００ｇで１５分間遠心した。このＳ−３０抽出物中に
なお存在するリボゾームを１００００ｇ３時間の遠心で
ペレット化した。この遠心の上清をＳ．ラモシシマス
（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）菌糸体のＳ−１００フラ
クションとした。ＳｒＥＦ−ＴｕはＧＤＰ−ＡＨ−セフ
ァロースのアフィニティークロマトグラフィーで精製し
た（Ｇ．ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）およびＪ．ロ
ーゼンバッシュ（Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ）、上述）。こ
の操作でＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一と判断される成分たん
ぱく質調製物が得られる。このたんぱく質は見かけ上、
５０ｋＤの分子量の移動度を示すが、大腸菌ＥＦ−Ｔｕ
は４５ｋＤの移動度を示す。この精製たんぱく質はＧＤ
Ｐ交換実験（Ｈ．ワイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）
等、上述）によるたんぱく質の分析および大腸菌リボゾ
ームを用いたＥＦ−Ｔｕ依存のポリ（Ｕ）依存ポリフェ
ニルアラニン合成の促進能によりＳ．ラモシシマス（ｒ
ａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−Ｔｕ（ＳｒＥＦ−Ｔ
ｕ）と同定された。エルファマイシン結合実験（Ｇ．チ
ナリ（Ｃｈｉｎａｌｉ）等、上述）およびＳｒＥＦ−Ｔ
ｕに依存するインビトロポリ（Ｕ）翻訳システムのエル
ファマイシン添加による阻害は両方ともＳｒＥＦ−Ｔｕ
がエルファマイシン感受性であることを示している（実
施例５、およびＣ．グロックナー（Ｇｌｏｅｃｋｎｅ
ｒ）およびＨ．ウォルフ（Ｗｏｌｆ）上述参照）。この
精製ＳｒＥＦ−Ｔｕを用い標準法に従ってウサギのポリ
クローナル抗体を調製した。

【実施例２】 Ｓ．ラモシシマスｔｕｆ遺伝子の同定、単離および特徴 Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ
１９０．６９染色体ＤＮＡを単離するのに用いた操作は
基本的にＤ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）等（上
述）によって報告されたものである。制限酵素で切断し
たこのＤＮＡのサザンブロッティング実験は、大腸菌ｔ
ｕｆＡプローブ（ＨｐａＩ／ＮｒｕＩフラグメント、
Ｔ．ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）等、上述）が約３．０ｋｂ
のＢｇｌＩＩフラグメントに強くハイブリダイズするが
３．０ｋｂＢａｍＨＩフラグメントおよび４．２ｋｂＰ
ｓｔＩフラグメントには強くはないが非常に特異的にハ
イブリダイズすることを示した。強くハイブリダイズす
るＤＮＡフラグメントをクリーニングするために、Ｓ．
ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）染色体ＤＮ
ＡをＢｇｌＩＩで完全に消化し、各々ＢａｍＨＩ消化し
たプラスミドｐＵＣ８（Ｖ．ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）
およびＪ．メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）Ｇｅｎｅ１９
（１９８２）２５９−２６８）およびｐＵＣ１８（Ｃ．
ヤニッシュ−ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）
等、Ｇｅｎｅ．３３（１９８５）１０３−１１９）とラ
イゲーションした。トランスホーメーション用宿主には
大腸菌ＪＭ１０１株を用いた（Ｊ．メシング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ
ｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ２（１９７９）４３−４
８）。ｓｉｂ選択操作を用いてＳ．ラモシシマス（ｒａ
ｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ｔｕｆ配列の存在についてトラ
ンスホーマントプールのスクリーニングを行った。この
操作ではサザンハイブリダイゼーションによる最初の選
択をトランスホーマントプールから単離したプラスミド
について行った。ポジティブプールのサイズを順次減ら
し、各ステップでそのプールの全プラスミド集団をサザ
ンハイブリダイゼーションでスクリーニングする。最終
的に単一トランスホーマントから単離したプラスミドを
解析する。Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕ
ｓ）ｔｕｆ遺伝子を単離するためのｓｉｂ選択操作で、
各々５０〜７０個のトランスホーマントの１１個のプー
ルからプラスミドＤＮＡを単離しアガロースゲルで電気
泳動した。これらＤＮＡ調製物の大腸菌ｔｕｆＡプロー
ブによるサザンハイブリダイゼーションで１つのポジテ
ィブプールが明らかになった。プールサイズの連続的減
少で２．８ｋｂのＢｇｌＩＩ挿入物を含む１つのポジテ
ィブ組換えプラスミドｐＵＣ１８が得られた（第２ａ
図） 完全な２．８ｋｂフラグメントはサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）等（上述）のチェーンターミネーション法およびベ
クターとしてＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９ファ
ージ（Ｃ．ヤニッシュ−ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎ）上述）を用いて両鎖ともシーケンシングし
た。その配列解析でＮ末端メチオニンを含む３９７個の
アミノ酸からなるたんぱく質をコードする１１９１ｂｐ
のオープンリーディングフレームが明らかになった（第
１図、ＳＥＱＩＤ１）。このオープンリーディングフレ
ームに由来するたんぱく質配列は大腸菌ＥＦ−Ｔｕと７
４％のホモロジーを示した。ｐＵＳｒＴ１にクローン化
した遺伝子はＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍ
ｕｓ）ＥＦ−Ｔｕをコードする遺伝子ＳｒｔｕｆＩであ
ると考えた。同様に、ハイブリダイゼーションプローブ
としてＳｒｔｕｆ１遺伝子を用いてＳｒｔｕｆ２遺伝子
を有する３．０ｋｂＢａｍＨＩフラグメントおよびＳｒ
ｔｕｆ３遺伝子を有する４．２ｋｂ ＰｓｔＩフラグメ
ントをクローン化し、そのコード領域のヌクレオチド配
列を決定した。Ｓｒｔｕｆ２およびＳｒｔｕｆ３のコー
ド配列およびそれらから誘導される産物ＳｒＥＦ−Ｔｕ
２およびＳｒＥＦ−Ｔｕ３のアミノ酸配列を各々ＳＥＱ
ＩＤ２およびＳＥＱＩＤ３としてリストした。ＳｒＥＦ
−Ｔｕ２は大腸菌ＥＦ−Ｔｕと同じアミノ酸残基を７４
％の割合で持ち、またＳｒＥＦ−Ｔｕ３は６４％の割合
で有していた。

【実施例３】 大腸菌におけるＳｒｔｕｆ１遺伝子の異種発現 Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−
Ｔｕたんばく質の独立した同定および特性化のため、ク
ローン化したＳｒｔｕｆ１遺伝子を大腸菌ＪＭ１０１で
発現させた。発現は大腸菌プラスミドｐＵＣ１８上の誘
導可能なｌａｃプロモーターの下流にＳｒｔｕｆ遺伝子
を置くことにより可能となる。Ｓｒｔｕｆ遺伝子を含む
ｐＵＳｒＴ１のＮｖｕＩ／ＸｂａＩフラグメントを単離
し、ＳｍａＩ／ＸｂａＩ消化ｐＵＣ１８とライゲーショ
ンしてから大腸菌ＪＭ１０１にトランスホーメーション
してプラスミドｐＵＳｒＴ１−１を得る（第２ｂ図）。
ｐＵＳｒＴ１−１でトランスホームした大腸菌ＪＭ１０
１の増殖およびｌａｃプロモーターの誘導は、１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．５ｍＭ ＩＰＴＧを補
ったＬＢ培地中３７℃で１６時間このトランスホーマン
トを培養することにより行った。これらの細胞の全たん
ぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。これでこのトラ
ンスホームした大腸菌中に新しいたんぱく質種が存在す
ることが明らかになった。このたんぱく質は精製したＳ
ｒＥＦ−Ｔｕと共に泳動し、かつウエスタンブロッティ
ング実験でＳｒＥＦ−Ｔｕ抗体（実施例１参照）と強く
反応する。このようにしてこの実験でｐＵＳｒＴ１−１
上に存在する遺伝子が同定され、Ｓｒｔｕｆ１遺伝子
は、ＳｒＥＦ−Ｔｕ１と呼ばれるたんぱく質をコードし
ていることが明らかになった。ＳｒＥＦ−Ｔｕ１の精製
のため、大腸菌ＪＭ１０１／ｐＵＳｒＴ１−１細胞のＳ
−１００フラクションを調製し（実施例１）、２５μＭ
となるようにＧＤＰを添加して安定化してからＧＤＰ−
ＡＨセファロースカラムに通した。このような条件下で
大腸菌ＥＦ−Ｔｕはこのカラムに結合し、一方ＳｒＥＦ
−Ｔｕ１たんぱく質は通過する。ついでこのＧＤＰ安定
化溶出物をタイマトリックスＲＥｄ−Ａカラム（アミコ
ン）にかけた。非結合たんぱく質の除去後、このカラム
に０〜１．５Ｍ ＮａＣｌの直線塩濃度勾配を流し、約
０．４５Ｍ ＮａＣｌのところでＳｒＥＦ−Ｔｕ１を溶
出させた。

【実施例４】 Ｓｒｔｕｆ１の部位特異的突然変異誘発 Ｓｒｔｕｆ１遺伝子の部位指定突然変異誘発のため、ｐ
Ｍａ−ｃベクターシステムおよび大腸菌宿主株ＷＫ６お
よびＷＫ６ｍｕｔＳ（Ｐ．スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓ
ｅｎｓ）等、上述）をギャップ二本鎖突然変異誘発操作
（Ｗ．クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）等、上述）と組合せ
て用いた。ｐＵＳｒＴ１をＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、Ｓｒｔｕｆ遺伝子を含むフラグメント
をＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ ＩＩＩ消化ｐＭａ６およ
びｐＭｃ６にライゲーションして各々プラスミドｐＭａ
ＳｒＴ１およびｐＭｃＳｒＴ１を得た（第３図）。ｐＭ
ａ６およびｐＭｃ６はβ−ラクタマーゼ遺伝子内のＰｓ
ｔＩ部位を欠くｐＭａ５−８およびｐＭｃ５−８（Ｐ．
スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）等、上述）の誘導
体である。突然変異誘発および変異体選択の操作は基本
的にＰ．スタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）等（上
述）の方法に従がいプラスミドｐＭａＳｒＴ１およびｐ
ＭｃＳｒＴ１を用いて行った。簡単に云うと、ファージ
Ｍ１３Ｋｏ７でｐＭｃＳｒＴ１含有大腸菌ＪＭ１０１を
感染させることによりプラスミドｐＭｃＳｒＴ１から一
本鎖ＤＮＡを調製した。ギャップ二本鎖を作るため、一
本鎖ｐＭｃＳｒＴ１をｐＭａＳｒＴ１の大きい方のＭｌ
ｕＩ／ＸｂａＩフラグメントおよび合成オリゴヌクレオ
チド１（ＳＥＱ ＩＤ４）または合成オリゴヌクレオチ
ド２（ＳＥＱＩＤ５）のいずれかと合わせＳｒＥＦ−Ｔ
ｕ１たんぱく質の部位３７８（アラニン）をバリンもし
くはスレオニンに変異させた。この変異たんぱく質を各
々ＳｒＥＦ−ＴｕＡ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔと命名し
た。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント）およ
びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたギャップ充填およびライ
ゲーション後このサンプルを大腸菌ＷＫ６ｍｕｔＳにト
ランスホームし、アンピシリン耐性で選択した。次にプ
ラスミドＤＮＡをプールしたＷＫ６ｍｕｔＳトランスホ
ーマントから単離し、大腸菌ＷＫ６株に導入した。さら
に個々のアンピシリン耐性ＷＫ６トランスホーマントを
上述した方法でＭ１３Ｋｏ７に感染させ一本鎖のプラス
ミドＤＮＡを得た。ヌクレオチド配列解析（実施例２）
を用いて目的の変異を含むクローンを同定し、また突然
変異誘発の際にギャップ内に二次的変異が導入されてい
ないことを確認した。各々の目的変異を含むプラスミド
を回収し、ｐＭａＳｒＴ１ＶおよびｐＭａＳｒＴ１Ｔと
命名した（第３図）。同様に各々変異オリゴヌクレオチ
ド３（ＳＥＱ ＩＤ６）および４（ＳＥＱＩＤ７）を用
いて変異Ａ３７８Ｐ（プロリン）およびＡ３７８Ｆ（フ
ェニルアラニン）を導入した。これらの実験で得たプラ
スミドはｐＭａＳｒＴ１ＰおよびｐＭａＳｒＴ１Ｆと命
名した。

【実施例５】 インビトロペプチド合成検定におけるＳｒＥＦ−Ｔｕ変
異体Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔの性質 変異体Ｓｒｔｕｆ遺伝子を発現させるためｐＵＳｒＴ１
−１の大きい方のＭｌｕＩ／ＸｂａＩフラグメントをｐ
ＭａＳｒＴ１ＶまたはｐＭａＳｒＴ１Ｔの小さい方のＭ
ｌｕＩ／ＸｂａＩフラグメントとライゲーションし、各
々プラスミドｐＵＳｒＴ１Ｖ−１およびｐＵＳｒＴ１Ｔ
−１を得た。プラスミドｐＵＳｒＴ１−１、ｐＵＳｒＴ
１Ｖ−１およびｐＵＳｒＴ１Ｔ−１を大腸菌ＰＭ１４５
５（ｔｕｆＡ、ｔｕｆＢｉ：Ｍｕ、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ
５６；Ｐ．ファンデルメイデ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｉ
ｄｅ）等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０（１９
８３）４０９−４１７）にトランスホームした。この株
はエルファマイシン耐性ＥＦ−Ｔｕをコードする唯１つ
の活性ｔｕｆ遺伝子を有している。各大腸菌ＰＭ１４５
５トランスホーマントを実施例３で述べたように増殖さ
せ、基本的に実施例１に述べた方法でＳ−３０抽出物を
調製した。この抽出物１ｍｌを１５〜２０ｃｍ長（１０
ｍｌピペット）の１０ｍｌセファデックスＧ−２５カラ
ム（２ｇセファデックスＧ−２５）にかけた。このカラ
ムを標準バッファ（実施例１）で溶出し、５滴づつのフ
ラクション（５００〜７００μｌ）を採取した。２６０
ｎｍに吸収をもつ最初の４フラクションを回収した。こ
の粗プールフラクションを以下に示すようにインビトロ
ポリ（Ｕ）依存ポリ（Ｐｈｅ）合成の促進に使用した。
０℃で４０ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．６、１０ｍＭ酢酸マ
グネシウム、６０ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、５ｍＭβ−メルカプ
トエタノール、１ｍＭ ＡＴＰ、０．０２５ｍＭ ＧＴ
Ｐ、２．５ｍＭホスホフェノールピルベート、０．２５
μｇ／ｍｌピルベートキナーゼ、０．８ｍｇ／ｍｌｔＲ
ＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌポリ（Ｕ）、９５μＭフェニル
アラニン、および３μＣｉ／ｍｌ^３Ｈ−フェニルアラニ
ン（５７Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）を含むインキュベーション
混合物を調製した。このインキュベーション混合物０．
６ｍｌに０．１２ｍｌの粗抽出物を加えた。つづいて、
５０μｌのサンプルを３７℃でインキュベートした。こ
のインキュベート混合物を以下に示すように処理した。
１５０μｌの１００ｍＭ ＮａＯＨを加え、さらに３７
℃で５分間インキュベーションを続けた。次に、８００
μｌの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、このサン
プルを０℃で５分間冷やした。沈殿をＧＦＣフィルター
（ワットマン）で濾過し、５％ＴＣＡで３回洗浄し、次
に９６％エタノールで１回洗浄した。このフィルターを
８０℃で３０分間乾燥し、各フィルターに２ｍｌのキシ
レンシンチレーション液を添加した。^３Ｈ−フェニルア
ラニンの取込みを液体シンチレーションカウンターで分
析した。別の実験では、第４図に示したようにエルファ
マイシン濃度またはインキュベーション時間を変化させ
た。最初の実験結果を第４ａ図に示す。先に述べたＳ−
３０抽出物を用いたパラレルポリ（Ｕ）合成実験におい
て、インキュベーション混合物に量を変化させてモシマ
イシンを添加した。反応時間は１０分間一定とした。Ｓ
ｒＥＦ−Ｔｕ変異株Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔは両方
とも１６０ｍｇ／ｌモコマイシン存在下のインビトロポ
リ（ｐｈｅ）合成において５０％の残存活性を示した
が、一方、Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕ
ｓ）ＣＢＳ１９０．６９由来の親ＳｒＥＦ−Ｔｕは１．
６ｍｇ／ｌモシマイシン濃度ですでに５０％の残存活性
が見られた（第４ａ図）。第２の実験では１６ｍｇ／ｌ
モシマイシン濃度で４０分間にわたりポリ（Ｐｈｅ）合
成を調べた。このインキュベーション間にＳｒＥＦ−Ｔ
ｕ変異体Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔ両方によって行な
われた^３Ｈ−フゥニルアラニン取込みはモシマイシンを
含まないパラレルインキュベーションに比べて８０％の
効率で進行することが分った。コントロール実験では親
ＳｒＥＦ−Ｔｕを含むＳ−３０抽出物は１６ｍｇ／ｌの
モシマイシン存在下で無モシマイシン反応の２０％の最
高効率を示した（第４ｂ図）。

【実施例６】 非変性ＰＡＧＥによるＳｒＥＦ−Ｔｕ変異株Ａ３７８
Ｖ、Ａ３７８Ｔ、Ａ３７８ＰおよびＡ３７８Ｆのエルフ
ァマイシン結合の観察 エルファマイシン結合能の直接的観察のため、基本的に
実施例３で示した方法で変異たんぱく質を大腸菌ＪＭ１
０１で発現させた。つづいてＧＤＰ安定化Ｓ−３０、Ｓ
−１００または精製ＳｒＥＦ−Ｔｕサンプルを調製し、
３７℃で１５分間、２５μＭオーロドックスとインキュ
ベートした。これらのサンプルおよびオーロドックスを
含まないコントロールサンプルを非変性１０％ポリアク
リルアミドゲルにより電気泳動した。ＳｒＥＦ−Ｔｕの
検出はＳｒＥＦ−Ｔｕ抗体を用いたウェスタンブロッテ
ィング法で行った（実施例１）。野生型Ｓ．ラモシシマ
ス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−Ｔｕはゲル中で
の三者複合体による移動度増加で示されるようにエルフ
ァマイシンに結合するようであるが（第５図）、変異体
ＳｒＥＦ−Ｔｕたんぱく質Ａ３７８Ｖ、Ａ３７８Ｔ、Ａ
３７８ＰおよびＡ３７８Ｆはエルファマイシンとの前処
理によってその移動度に変化はなかった。このように本
実験でエルファマイシン耐性はおそらく変異体ＳｒＥＦ
−Ｔｕたんぱく質へのエルファマイシンの結合の減少に
よるものであることが確められた。

【実施例７】 遺伝子置換ベクターｐＭＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳ
Ｔ１ＴΔＳの構築 親染色体Ｓｒｔｕｆ遺伝子を置換し得るプラスミドｐＭ
ＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳＴ１ＴΔＳを得るため、
いくつかの中間体構築物を調製した。 ｐＵｔ１８：プラスミドｐＩＪ７０２（Ｅ．カッツ（Ｋ
ａｔｚ）等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９
（１９８３）２７０３−２７１４）をＢｃｌＩで消化
し、チオストレプトン耐性遺伝子を含む１．０５ｋｂフ
ラグメントを精製し、ＢａｍＨＩ−消化したｐＵＣ１８
にライゲーションした。大腸菌ＪＭ１０１へのトランス
ホーメーションで目的のプラスミドｐＵｔ１８を得た
（第６ａ図）。 ｐＳｔＴ１Ｖ−１およびｐＳｔＴ１Ｔ−１：ｐＵｔ１８
をＳｍａＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、チオスト
レプトン耐性遺伝子を含む１．１ｋｂフラグメントを精
製した。ｐＵＳｒＴ１Ｖ−１およびｐＵＳｒＴ１Ｔ−１
をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、変異した
Ｓｒｔｕｆ遺伝子を含む１．９ｋｂフラグメントを精製
した。精製した両フラグメントをｐｖｕＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩで消化したｐＳＰ７０と合わせ、ライゲーション
した後大腸菌ＪＭ１０１にトランスホーメーションし
た。上述の要素３つ全てを含むプラスミドを同定し、各
々ｐＳｔＴ１Ｖ−１およびｐＳｔＴ１Ｔ−１と命名した
（第６ａ図）。 ｐＳｔＴ１ＶΔＳ−１およびｐＳｔＴ１ＴΔＳ：変異Ｓ
ｒｔｕｆ遺伝子の上流領域および５′コード領域をＥｃ
ｏＲＩおよびＳｍａＩによる消化でプラスミドｐＳｔＴ
１Ｖ−１およびｐＳｔＴ１Ｔ−１から欠失させ、それに
つづいてＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）に
よる粘着ＥｃｏＲＩ末端の平滑化、ライゲーション、お
よび大腸菌ＪＭ１０１へのトランスホーメーションを行
った。目的とする構築物が得られ、これらをｐＳｔＴ１
ＶΔＳおよびｐＳｔＴ１ＴΔＳと命名した（第７ａ
図）。 ｐＭＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳＴ１ＴΔＳ：各々ｐ
ＳｔＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴ６６０（Ａ．バーチ（Ｂｉ
ｒｃｈ）およびＪ．クラム（Ｃｕｌｌｕｍ）、Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３１（１９８５）１２９９
−１３０３）のＰｓｔＩ／ＰｖｕＩＩ消化から生じるよ
り大きいフラグメントをライゲーションし大腸菌ＪＭ１
０１にトランスホームした。こうしてプラスミドｐＭＴ
ＳＴ１ＶΔＳが得られる。同様に、ｐＳｔ１ＴΔＳから
出発してプラスミドｐＭＴＳＴ１ＴΔＳを構築した（第
７ｂ図）。

【実施例８】 Ｓ．ラモシシマスｔｕｆ１遺伝子のエルファマイシン耐
性ＥＦ−Ｔｕたんぱく質をコードする変異ｔｕｆ１遺伝
子による置換 元のＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｅ
Ｆ−Ｔｕコード遺伝子を変異エルファマイシン耐性ＥＦ
−Ｔｕ変異体遺伝子Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔで還元
するため、以下の組成：ＮａＮＯ_３０．３ｇ／ｌ、Ｋ_２
ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ０．２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ０．２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．００５ｇ／
１、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／ｌ、ｚｎＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２００．
００５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ０．０４ｇ／ｌ、
Ｌ−メチオニン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／
ｌ、Ｌ−チロシン０．５ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／
ｌ、および寒天２０ｇ／ｌの胞子化培地を用い、Ｓ．ラ
モシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９
０．６９の新鮮な胞子を調製した。Ｓ−培地（実施例
１） での培養から始めてその０．５ｍｌを胞子化プレ
ートに広げ３０℃で５日間インキュベートした。基本的
にＤ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）等（上述）の方
法に従い胞子を単離し、０．５％グリシンを含むＹＭＧ
培地（酵母抽出物４ｇ／ｌ、麦芽抽出物１０ｇ／ｌ、グ
ルコース４ｇ／ｌ）の接種に用いた。この培養物のリゾ
チーム処理でプロトプラストを得、これをＤ．ホップウ
ッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）等（上述）の方法に従がいプラ
スミドｐＭＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳＴ１ＴΔＳで
トランスホームした。つづいてこのトランスホームした
プロトプラストを再生培地にプレーティングし３０℃で
インキュベートした。再生培地は等容量の胞子化培地お
よび安定剤培地を混合して調製した。安定剤培地はＮａ
ＮＯ_３３ｇ／ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ０．０８５ｇ
／ｌ、Ｋ_２ＳＯ_４０．２５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ０．０１ｇ／ｌ、微量元素溶液０．１ｍｌ、トリス
３．０３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．９２ｇ／ｌ、スクロース
１０３ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ_２・６
Ｈ_２Ｏ ５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／ｌ
および寒天２０ｇ／ｌを含み、４Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．
２に調整したもの。微量元素溶液の組成は以下のとおり
である；Ｆｅ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ０．２５ｇ
／ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ
_２・４Ｈ_２Ｏ０．０４ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ
０．０１５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ０．０１５ｇ
／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３０．００５ｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ_４・２
Ｈ_２Ｏ０．００５５ｇ／ｌ、ＫＩ０．０１ｇ／ｌ（４Ｎ
ＨＣｌでｐＨ３．０に調整）。２４時間後、再生プレ
ートに２０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含む３ｍｌ軟
寒天を重層し（Ｄ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）
等、上述）、３０℃で５日間インキュベートした。２μ
ｇチオストレプトンを含む胞子化培地にチオストレプト
ン耐性コロニーをストリークし、個々のコロニーを２μ
ｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＹＭＧ培地中３０℃で
培養した。つづいて各培養物からプラスミドＤＮＡを単
離し、制限酵素地図の解析からトランスホームしたプラ
スミドｐＭＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳＴ１ＴΔＳの
同定および組込みを確認した。好ましくは本来のＳｒｔ
ｕｆ１部位とプラスミド内の変異ＳｒｔｕｆＲ配列の相
同組換えにより、Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓ
ｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９の染色体へのプラスミド
ｐＭＴＳＴ１ＶΔＳの組込みを起こすため温度感受性ｐ
ＭＴ６６０レプリコンを利用した。選択したトランスホ
ーマントをチオストレプトン２μｇ／ｍｌの存在下、３
７℃での液体培地培養および胞子化を数サイクル（少な
くとも３サイクル）繰り返し、細胞由来の遊離して複製
するプラスミドを除き、プラスミドの染色体組込み体を
選択した。この操作で得た胞子を希釈し、プレーティン
グ後３７℃でインキュベーションした。個々のコロニー
をピックアップし、２μｇ／ｍｌチオストレプトンを含
むＹＭＧ中、３７℃で増殖してからプラスミドＤＮＡの
ないことをチェックした。次に全ＤＮＡをプラスミドフ
リーコロニーから単離し、ＢｇｌＩＩＩで消化後サザン
ブロッティングで解析した。組込みは染色体の２．８ｋ
ｂバンドの消失および１．２および９．２ｋｂ両バンド
の出現で観測した（第８ｂ図）。染色体Ｓｒｔｕｆ１遺
伝子座に組込まれた１つのプラスミドコピーを有する株
をチオストレプトンを含まないＹＭＧで増殖し、ついで
非選択胞子化培地にプレーティングした。つづいて２μ
ｇ／ｍｌチオストレプトンを含む胞子化培地への単一コ
ロニーのレプリカプレーティングで染色体の分子内相同
組換え（プラスミド組込みの逆過程）によりプラスミド
配列を失ったチオストレプトン感受性株を同定した。
０．５ｇ／ｌモシマイシンを含む液体ＹＭＧ培地中およ
び０．１ｇ／ｌモシマイシンを含む固体胞子化培地上の
両方でエルファマイシン耐性を示すチオストレプトン感
受性株の選択でＡ３７８Ｖ変異以外は本来のＳ．ラモシ
シマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６
９と同一の染色体Ｓｒｔｕｆを保存しているＳ．ラモシ
シマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株が得られ
た（第８ｃ図）。同様に、プラスミドｐＭＴＳＴ１ＴΔ
Ｓを用いて変異Ａ３７８Ｔ以外本来のＳｒｔｕｆを有す
るＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１
Ｔを得た。

【実施例９】 Ｓ．ラモシシマスＲ１Ｖ株のエルファマイシン耐性 Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ
株の胞子、菌糸体およびプロトプラストについて増殖に
関する最小モシマイシン阻害濃度を測定した。Ｓ．ラモ
シシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株および
コントロールＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍ
ｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９株の胞子を各々２５ｍｌＹＭ
Ｇ培地および０〜１ｇ／ｌの濃度のモシマイシンを含む
振とうフラスコに５．１０^７胞子／ｍｌとなるよう接種
した。これを３０℃で５日間インキュベーションした。
第１表はこの実験結果を示している。コントロール株の
場合０．１５ｇ／ｌのモシマイシンで胞子の発芽（およ
び／または増殖）が阻害されたがＳ．ラモシシマス（ｒ
ａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株の胞子はモシマイシ
ン濃度０．７５ｇ／ｌまで発芽および増殖を示した。同
様の結果は０〜１ｇ／ｌのモシマイシンを含む固体培地
（ＨＩ寒天、ディフコ）でも得られた。各寒天プレート
当り約２００コロニー形成単位となるようＳ．ラモシシ
マス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株およびＳ．
ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９
０．６９株の胞子を希釈した。このプレートは３０℃で
５日間インキュベートした。コントロールのＳ．ラモシ
シマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６
９株の場合、０．１ｇ／ｌ以上のモシマイシン濃度では
コロニーは出現しなかった。逆に、Ｓ．ラモシシマス
（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株の胞子は少なく
とも０．７５ｇ／ｌまで定量的に発芽しコロニーを形成
した。各株の胞子をモシマイシンを含まないＹＭＧ培地
中で前培養した菌糸体で置換しても基本的に同じ結果が
得られた。１６時間培養物１ｍｌのプレーティングで
Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ
株およびコントロールＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉ
ｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９は各々０．７５およ
び０．１５ｇ／ｌの最小阻害濃度を示すことが分った。
実施例７で述べたように調製したＳ．ラモシシマス（ｒ
ａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９株および
Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ
株のプロトプラストを用いた別のテストを行った。プロ
トプラストは細胞内成分と外部培地間の防御バリヤーを
形成する細胞壁を欠くことからこれらは胞子や菌糸体よ
りもエルファマイシンに対しかなり高い感受性を示す。
そこで０〜０．１ｇ／ｌモシマイシンを含む再生培地
（実施例７）にプロトプラストをプレーティングした。
これらの条件下でＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓ
ｉｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９のプロトプラストはモシ
マイシン濃度０．０２ｇ／ｌ以下でのみ再生し得た。ま
た０．１ｇ／ｌまでのモシマイシン存在下でのＳ．ラモ
シシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖの再生は
モシマイシンなしの条件下と同じ効率で起っている（第
２表）

【実施例１０】 Ｓ．ラモシシマスＲ１Ｖ株から単離したＥＦ−ＴｕＲの
分析 Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ
株は実際に主要ＥＦ−Ｔｕ種として変異Ｓｒｔｕｆ１遺
伝子を発現していることを確認するため基本的に実施例
１で述べられている方法に従がいＳ．ラモシシマス（ｒ
ａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株の培養物からＳ−１
００抽出物を調製した。つづいて、この抽出物を実施例
６に概説されている直接的エルファマイシン結合検定で
試験した。第９図に示したこの実験結果はＳ．ラモシシ
マス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株の主要ＥＦ
−ＴｕはＣＢＳ１９０．６９株のものとは逆に採用した
条件下でエルファマイシンオーロドックスを結合し得な
いことを示した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図式中では以下に示す略号および記号を使用した。 ｂｌａ ：アンピシリン耐性遺伝子（不活性な場合はｂ
ｌａ−） ｂｌａ^＊：ｂｌａ−における翻訳終止コドンの位置 ｃａｔ ：クロラムフェニコール耐性遺伝子（不活性な
場合はｃａｔ−） ｃａｔ^＊：ｃａｔ−における翻訳終止コドンの位置 ｔｓｒ ：チオストレプトン耐性遺伝子 ｏｒｉ３２２：プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製オリ
ジン ｏｒｉｆ１：ファージｆ１由来の複製オリジン ｒｅｐ６６０：プラスミドｐＭＴ６６０由来の複製オリ
ジン Ｓｒｔｕｆ：Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍ
ｕｓ）ｔｕｆ遺伝子、この遺伝子の３′コード領域のみ
が存在する場合はＳｒｔｕｆ３′ ｐｌａｃ ：大腸菌ｌａｃオペロンプロモーター。

【図１】Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕ
ｓ）ｔｕｆ １のＤＮＡ配列およびこれから誘導した
Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−
Ｔｕ１たんぱく質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１で示される） ＥＦ−ＴｕＲは部位３７８のアミノ酸アラニンがバリン
またはスレオニンで置換されていることを特徴とする。
ｔｕｆ Ｒ遺伝子は、部位３７８のアラニンをコードす
るコードがバリン、スレオニン、プロリンまたはフェニ
ルアラニンをコードするコドンに変化したことを特徴と
する。

【図２】Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕ
ｓ）ｔｕｆ １のＤＮＡ配列およびこれから誘導した
Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）ＥＦ−
Ｔｕ１たんぱく質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１で示される） ＥＦ−ＴｕＲは部位３７８のアミノ酸アラニンがバリン
またはスレオニンで置換されていることを特徴とする。
ｔｕｆＲ遺伝子は、部位３７８のアラニンをコードする
コードがバリン、スレオニン、プロリンまたはフェニル
アラニンをコードするコドンに変化したことを特徴とす
る。

【図３】ａ．プラスミドｐＵＳｒＴｌの地図 ｂ．発現プラスミドｐＭａＳｒＴ１の地図。プラスミド
ｐＭａＳｒＴ１Ｖ、ｐＭａＳｒＴ１Ｔ、ｐＭａＳｒＴ１
ＰおよびｐＭａＳｒＴ１Ｆにおいては、Ａｌａ３７８は
各々バリン、スレオニン、プロリン、およびフェニルア
ラニンに置換している。

【図４】ａ．プラスミドｐＭａＳｒＴ１の地図。プラス
ミドｐＭａＳｒＴ１Ｖ、ｐＭａＳｒＴ１Ｔ、ｐＭａＳｒ
Ｔ１ＰおよびｐＭａＳｒＴ１Ｆにおいて、Ａｌａ３７８
は各々バリン、スレオニン、プロリンおよびフェニルア
ラニンに置換している。 ｂ．プラスミドｐＭｃＳｒＴ１の地図。

【図５】種々の濃度のモシマイシン存在下インビトロポ
リフェニルアラニン合成系におけるＳｒＥＦ−Ｔｕおよ
びＳｒＥＦ−Ｔｕ変異体Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔの
残存活性を示すグラフを表す図である。

【図６】１６ｍｇ／ｌモシマイシンの存在下、インビト
ロポリフェニルアラニン合成系におけるＳｒＥＦ−Ｔｕ
およびＳｒＥＦ−Ｔｕ変異体Ａ３７８ＶおよびＡ３７８
Ｔによる^３Ｈ−フェニルアラニン取り込みの時間経過を
示すグラフを表す図である。

【図７】ａ．エルファマイシン結合検定による変異体Ｓ
ｒＥＦ−Ｔｕ１たんぱく質Ａ３７８ＶおよびＡ３７８Ｔ
の電気泳動による分析結果を示す写真である。レーン１
および２：野生型ＳｒＥＦ−Ｔｕ、レーン３および４：
ＳｒＥＦ−ＴｕＡ３７８Ｔ、レーン５および６：ＳｒＥ
Ｆ−ＴｕＡ３７８Ｖ。レーン２、４および６において指
示されたＳｒＥＦ−Ｔｕたんぱく質は２５μＭオーロド
ックスで前処理されている。 ｂ．エルファマイシン結合検定による変異体ＳｒＥＦ−
Ｔｕ１たんぱく質Ａ３７８ＰおよびＡ３７８Ｆの電気泳
動による分析結果を示す写真である。レーン１および
２：野生型ＳｒＥＦ−Ｔｕ、レーン３および４：ＳｒＥ
Ｆ−ＴｕＡ３７８Ｆ、レーン５および６：ＳｒＥＦ−Ｔ
ｕＡ３７８Ｐ。レーン２、４および６において指示され
たＳｒＥＦ−Ｔｕたんぱく質は２５μＭオーロドックス
で前処理されている。

【図８】ａ．プラスミドｐＵｔ１８の地図。 ｂ．プラスミドｐＳｔＴ１−１の地図。プラスミドｐＳ
ｔＴ１Ｖ−１およびｐＳｔＴ１Ｔ−１においてＡｌａ３
７８は各々バリンおよびスレオニンに置換している。

【図９】ａ．プラスミｐＳｔＴ１ΔＳの地図。プラスミ
ドｐＳｔＴ１ＶΔＳおよびｐＳｔＴ１ＴΔＳにおいてＡ
ｌａ３７８は各々バリンおよびスレオニンで置換されて
いる。 ｂ．プラスミドｐＭＴＳＴ１ΔＳの地図。プラスミドｐ
ＭＴＳＴ１ＶΔＳおよびｐＭＴＳＴ１ＴΔＳにおいて、
Ａｌａ３７８は各々バリンおよびスレオニンで置換され
ている。

【図１０】ａ．Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉ
ｍｕｓ）ＣＢＳ１９０．６９染色体ｔｕｆ遺伝子の地
図。 ｂ．プラスミドｐＭＴＳＴ１ＶΔＳが相同組換えで組込
まれたＳ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）
ｔｕｆ遺伝子の地図。 ｃ．Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ
１Ｖ染色体ｔｕｆＲ遺伝子の地図。

【図１１】エルファマイシン結合に関するＳ．ラモシシ
マス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株由来のＳｒ
ＥＦ−Ｔｕの電気泳動による分析結果を示す写真であ
る。サンプルは以下に示すようにゲルにロードした。レ
ーン１および２：大腸菌ＪＭ１０１〔ｐＵＳｒＴ１−
１〕から単離した野生型ＳｒＥＦ−Ｔｕ、レーン３およ
び４：Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉｍｕｓ）
ＣＢＳ１９０．６９から単離したＳｒＥＦ−Ｔｕ、レー
ン５および６：Ｓ．ラモシシマス（ｒａｍｏｃｉｓｓｉ
ｍｕｓ）Ｒ１Ｖ株から単離したＳｒＥＦ−Ｔｕ。レーン
１、４および６において指示されたたんぱく質は２５μ
Ｍオーロドックスで前処理した。

【手続補正書】

【提出日】平成６年５月３０日

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図６】

【図２】

【図１１】

【図３】

【図４】

【図５】

【図７】

【図８】

【図１０】

【図９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 リヒャルト ケルクマン オランダ国 2021ベーカー ハールレム シェッペルスストラート 60 (72)発明者 レーンデルト ボッシュ オランダ国 2341エルエル ウーヘストヘ ースト ホフブラウケルラーン 56 (72)発明者 エリック ヴェイヘンボーム オランダ国 2651イックスペー ベルケル アン ローデンレイス ローゼノールト 62 (72)発明者 ピーテル ウィルヘルムス ヘンドリック ス ヘインストラ オランダ国 3571イェーハー ユトレヒト エイクマンラーン 241

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エルファマイシン産生放線菌から入手可
   能であり、かつエルファマイシン耐性を提供することを
   特徴とするたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲ。
2. 【請求項２】 前記エルファマイシンがモシマイシン
   （キロマイシン）であることを特徴とする請求の範囲１
   記載のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲ。
3. 【請求項３】 ポリ（Ｕ）依存ポリフェニルアラニン合
   成を目的とした無細胞系でテストする場合モシマイシン
   を１リットル当り少なくとも２ｍｇ、好ましくは１リッ
   トル当り少なくとも１６０ｍｇを含む培地中で５０％の
   残存活性を有することを特徴とする請求の範囲１または
   ２のいずれか１項記載のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲ。
4. 【請求項４】 前記放線菌がストレプトミセス、好まし
   くはストレプトミセスラモシシマス、より好ましくはス
   トレプトミセスラモシシマスＣＢＳ１９０．６９である
   ことを特徴とする請求の範囲１乃至３のいずれか１項記
   載のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲ。
5. 【請求項５】 添付図の第１図記載のアミノ酸配列の少
   なくとも８０％に対応する配列を含む請求の範囲１乃至
   ４のいずれか１項記載のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲ。
6. 【請求項６】 相同的たんぱく質中の部位３７８または
   該部位に相当する前位のアラニンがバリン、スレオニ
   ン、プロリンまたはフェニルアラニンのいずれかに置換
   したことを特徴とする請求の範囲５記載のたんぱく質Ｅ
   Ｆ−ＴｕＲ。
7. 【請求項７】 請求の範囲１乃至６のいずれか１項記載
   のたんぱく質ＥＦ−ＴｕＲをコードするＤＮＡ配列ｔｕ
   ｆＲ。
8. 【請求項８】 相同的遺伝子中部位３７８または該部位
   に相当する部位のアラニンをコードするコドンがバリ
   ン、スレオニン、プロリンまたはフェニルアラニンのい
   ずれかをコードするコドンに置換したことを特徴とする
   第１図に示した請求の範囲７記載のＤＮＡ配列ｔｕｆ
   Ｒ。
9. 【請求項９】 請求の範囲７または８のいずれか１項記
   載のＤＮＡ配列を含むベクターで、好ましくは該ベクタ
   ーがプラスミドであるもの。
10. 【請求項１０】 添付図の第２図、第３図、第６図およ
    び第７図で示されるｐＭａＳｒＴ１Ｖ、ｐＭａＳｒＴ１
    Ｔ、ｐＭａＳｒＴ１Ｐ、ｐＭａＳｒＴ１Ｆ、ｐＵＳｒＴ
    １Ｖ−１、ｐＵＳｒＴ１Ｔ−１、ｐＵＳｒＴ１Ｐ−１、
    ｐＵＳｒＴ１Ｆ−１、ｐＳｔＴ１Ｖ−１、ｐＳｔＴ１Ｔ
    −１、ｐＳｔＴ１ＶΔＳ、ｐＳｔＴ１ＴΔＳ、ｐＭＴＳ
    Ｔ１ＶΔＳまたはｐＭＴＳＴ１ＴΔＳであることを特徴
    とするプラスミドベクター。
11. 【請求項１１】 請求の範囲７または８のいずれか１項
    記載のＤＮＡ配列ｔｕｆＲを含むエルファマイシン産生
    放線菌。
12. 【請求項１２】 前記エルファマイシンがモシマイシン
    であることを特徴とする請求の範囲１１記載のエルファ
    マイシン産生放線菌。
13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡ配列ｔｕｆＲがＤＮＡ配列
    ｔｕｆを置換して染色体中に組込まれていることを特徴
    とする請求項１１または１２のいずれか１項記載のエル
    ファマイシン産生放線菌。
14. 【請求項１４】 ストレプトミセスであることを特徴と
    する請求の範囲１１乃至１３のいずれか１項記載のエル
    ファマイシン産生放線菌。
15. 【請求項１５】 胞子が少なくとも０．２ｇ／ｌ、好ま
    しくは０．２〜１．０ｇ／ｌのモシマイシンの存在下酵
    母抽出物４ｇ／ｌ、麦芽抽出物１０ｇ／ｌおよびグルコ
    ース４ｇ／ｌを含むＹＭＧ培地中で発芽および増殖する
    ことを特徴とするモシマイシン産生ストレプトミセス。
16. 【請求項１６】 ストレプトミセスラモシシマス種に属
    することを特徴とする請求の範囲１５記載のストレプト
    ミセス。
17. 【請求項１７】 変異たんぱく質ＳｒＥＦ−ＴｕＡ３７
    ８Ｖをコードする遺伝子を発現するストレプトミセスラ
    モシシマスＣＢＳ１９０．６９由来のストレプトミセス
    ラモシシマスＲ１Ｖ株。
18. 【請求項１８】 請求の範囲１乃至６のいずれか１項記
    載のエルファマイシン耐性ＥＦ−ＴｕＲを発現するエル
    ファマイシン産生放線菌の作製法で、 （１）エルファマイシン産生放線菌からの遺伝子ｔｕｆ
    のクローニング、 （２）該遺伝子の部位特異的突然変異誘発によるエルフ
    ァマイシン感受性ＥＦ−Ｔｕをコードする遺伝子ｔｕｆ
    のエルファマイシン耐性ＥＦ−ＴｕＲをコードする遺伝
    子ｔｕｆＲへの改変、 （３）遺伝子ｔｕｆＲまたはその一部を含むベクターの
    構築、 （４）該ベクターを導入することによるエルファマイシ
    ン産生放線菌のトランスホーメーション、 （５）染色体のｔｕｆ部位に該ベクターが組込まれたト
    ランスホーマントのエルファマイシン耐性による選択。 以上（１）乃至（５）のステップを含む方法。
19. 【請求項１９】 エルファマイシン産生可能で、かつ少
    なくとも０．２ｇ／ｌ、好ましくは０．２〜１．０ｇ／
    ｌの濃度のエルファマイシンに耐性を示す放線菌の発酵
    を含むエルファマイシンの製造法。
20. 【請求項２０】 前記エルファマイシンがモシマイシン
    であることを特徴とする請求の範囲１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記放線菌がストレプトミセス、好ま
    しくはストレプトミセスラモシシマスであることを特徴
    とする請求の範囲１９または２０のいずれか１項記載の
    方法。