JPH0213380A - カルボマイシン生合成遺伝子ｃａｒＥ由来の４”―０―イソバレリル アシラーゼをコードしている組換えＤＮＡベクター - Google Patents
カルボマイシン生合成遺伝子ｃａｒＥ由来の４”―０―イソバレリル アシラーゼをコードしている組換えＤＮＡベクターInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、４°′−〇−イソバレリルアシラーゼ酵素を
コードしているｃａｒ Ｅと命名した新規遺伝子、該ｃ
ａｒ Ｅ遺伝子を用いる方法、該アシラーゼ酵素をコー
ドしている組換えＤＮＡクローニングベクター、該ベク
ターを含有する形質転換体、および該形質転換体によっ
て産生される酵素に関する。
コードしているｃａｒ Ｅと命名した新規遺伝子、該ｃ
ａｒ Ｅ遺伝子を用いる方法、該アシラーゼ酵素をコー
ドしている組換えＤＮＡクローニングベクター、該ベク
ターを含有する形質転換体、および該形質転換体によっ
て産生される酵素に関する。
［従来の技術］
ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）は、１
６員の環状ラクトンと２種類の糖残基ミカロースおよび
ミカミノースからなるマクロライド系抗生物質であるカ
ルボマイシンを産生ずる。カルボマイシンの抗生物質活
性は、池のマクロライド類と同様、カルボマイシンのリ
ポソームへの結合を含む機序によってタンパク質の合成
を阻害することによっている。
ｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）は、１
６員の環状ラクトンと２種類の糖残基ミカロースおよび
ミカミノースからなるマクロライド系抗生物質であるカ
ルボマイシンを産生ずる。カルボマイシンの抗生物質活
性は、池のマクロライド類と同様、カルボマイシンのリ
ポソームへの結合を含む機序によってタンパク質の合成
を阻害することによっている。
カルボマイシンの生合成には、アシラーゼ酵素が介する
ミカロース残基の４”−ＯＨ位へのイソバレリル基（イ
ンバレリル補酵素Ａに由来する）の結合が含まれる。ｃ
ａｒ Ｅ遺伝子は４’’−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ
活性をコードしている。
ミカロース残基の４”−ＯＨ位へのイソバレリル基（イ
ンバレリル補酵素Ａに由来する）の結合が含まれる。ｃ
ａｒ Ｅ遺伝子は４’’−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ
活性をコードしている。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、ストレプトマイセス属およびその他多数の宿
主細胞中で有用なイソバレリルアシラーセをコードして
いる発現ベクターを提供するものである。ストレプトマ
イセス属での組換えＤＮＡ法の開発・展開は、この産業
上重要な微生物の抗生物質産生能力を改善して抗生物質
の収量を増加させる目的だけでなく、新規抗生物質を産
生させる目的でも進められてきた。組換えＤＮＡ法によ
ってストレプトマイセス属を修飾するのに利用すること
ができる抗生物質生合成遺伝子の数が今のところ少ない
ことから、この開発は幾分遅れていた。
主細胞中で有用なイソバレリルアシラーセをコードして
いる発現ベクターを提供するものである。ストレプトマ
イセス属での組換えＤＮＡ法の開発・展開は、この産業
上重要な微生物の抗生物質産生能力を改善して抗生物質
の収量を増加させる目的だけでなく、新規抗生物質を産
生させる目的でも進められてきた。組換えＤＮＡ法によ
ってストレプトマイセス属を修飾するのに利用すること
ができる抗生物質生合成遺伝子の数が今のところ少ない
ことから、この開発は幾分遅れていた。
本発明はそのような利用に適した抗生物質生合成遺伝子
の数を増やすものであり、この点で有用であり、特に重
要である。
の数を増やすものであり、この点で有用であり、特に重
要である。
本発明のベクターは、多種類のストレプトマイセス属細
胞中に導入することができ、またその中で選択され得る
ので特に有用である。ストレプトマイセス属は臨床的に
重要な抗生物質の半分以上を与え、従って産業上重要な
群である。本発明は、この産業上重要な群だけでなく、
その他の抗生物質産生微生物群に対しても有用な新規ベ
クターおよび方法を提供するものであり、発酵において
カルボマイシンの収量を増加させ、また、新規抗生物質
および抗生物質誘導体を製造することを可能にするもの
である。
胞中に導入することができ、またその中で選択され得る
ので特に有用である。ストレプトマイセス属は臨床的に
重要な抗生物質の半分以上を与え、従って産業上重要な
群である。本発明は、この産業上重要な群だけでなく、
その他の抗生物質産生微生物群に対しても有用な新規ベ
クターおよび方法を提供するものであり、発酵において
カルボマイシンの収量を増加させ、また、新規抗生物質
および抗生物質誘導体を製造することを可能にするもの
である。
本明細書中に開示した発明のために以下の語句を定義す
る。
る。
ＡｍＲ：アンビシリン耐性を付与する遺伝子。
抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された修飾を受けた後、他の微生物ま
たは真核細胞の増殖を阻害するかまたは死滅させる物質
。
然に、または限定された修飾を受けた後、他の微生物ま
たは真核細胞の増殖を阻害するかまたは死滅させる物質
。
抗生物質生合成遺伝子ニー次中間代謝物を抗生物質に変
換する生化学的過程を仲介することができる１またはそ
れ以上の活性をコードしているＤＮＡセグメント。
換する生化学的過程を仲介することができる１またはそ
れ以上の活性をコードしているＤＮＡセグメント。
抗生物質生合成経路ニー次中間代謝物を抗生物質に変換
する過程に最小限必要とされる一組の完全な抗生物質生
合成遺伝子群。
する過程に最小限必要とされる一組の完全な抗生物質生
合成遺伝子群。
抗生物質産生微生物：抗生物質を産生ずるか、または発
現したときには抗生物質を産生させる遺伝子を含有して
いるあらゆる微生物であって、アクチノプラネス（Ａｃ
ｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アクチノマズラ（Ａｃｔｉｎ
ｏｍａｄｕｒａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、七
フ７０スボリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ノカルジア
（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびストレプトマイセス属を
含むが、これらに限定はされない。
現したときには抗生物質を産生させる遺伝子を含有して
いるあらゆる微生物であって、アクチノプラネス（Ａｃ
ｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アクチノマズラ（Ａｃｔｉｎ
ｏｍａｄｕｒａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、七
フ７０スボリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ノカルジア
（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびストレプトマイセス属を
含むが、これらに限定はされない。
抗生物質耐性付与遺伝子：ある抗生物質に対する耐性を
付与する酵素またはその他の活性をコードしているＤＮ
Ａセグメント。
付与する酵素またはその他の活性をコードしているＤＮ
Ａセグメント。
ＡｐＲ：アンビシリン耐性を付与する遺伝子。
二官能性クローニングシャトルベク９−：２種類の別の
分類群の微生物で複製することができ、モして／または
組込まれ得る組換えＤＮＡクローニングベクター。
分類群の微生物で複製することができ、モして／または
組込まれ得る組換えＤＮＡクローニングベクター。
ｃａｒＡ ：タイプＡのカルボマイシン耐性付与遺伝子
。
。
ｃａｒＢ ：タイプＢのカルボマイシン耐性付与遺伝子
。
。
ｃａｒＧ ：カルボマイシンの１６員の環状ラクトンを
生成するのに必要な活性をコードしている１またはそれ
以上の遺伝子からなるＤＮＡ配列。
生成するのに必要な活性をコードしている１またはそれ
以上の遺伝子からなるＤＮＡ配列。
ｃａｒＥ ：ストレプトマイセス・サーモトレランスか
ら単離可能な、４パ−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ活性
をコードしているＤＮＡＬＪｌｌ。
ら単離可能な、４パ−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ活性
をコードしているＤＮＡＬＪｌｌ。
クローニング二組換えＤＮＡクローニングベクター中に
ＤＮＡセグメントを導入し、この組換えＤＮＡで宿主細
胞を形質転換する過程。
ＤＮＡセグメントを導入し、この組換えＤＮＡで宿主細
胞を形質転換する過程。
ｃｏｓ ニラムダ（λ）の付着末端配列。
コスミド：ブラスミドと同じように宿主細胞中で複製し
得るだけでなく、ファー２頭部にパッケージングもされ
得る組換えＤＮＡクローニングベクター。
得るだけでなく、ファー２頭部にパッケージングもされ
得る組換えＤＮＡクローニングベクター。
遺伝子：プロモーターと暗号配列からなるＤＮＡ配列で
あって、該プロモーターが該暗号配列を転写させるよう
に設置されているＤＮＡ配列。
あって、該プロモーターが該暗号配列を転写させるよう
に設置されているＤＮＡ配列。
遺伝子ライブラリー：ある特定の微生物の実質的にすべ
てのＤＮＡを構成しているＤＮＡセグメント群がクロー
ニングされた一組の組換えＤＮＡクローニングベクター
。
てのＤＮＡを構成しているＤＮＡセグメント群がクロー
ニングされた一組の組換えＤＮＡクローニングベクター
。
ハイブリダイゼーション：２本の１本鎖ＤＮＡ分子をア
ニーリングして２本鎖ＤＮＡ分子を形成させる過程であ
り、この２本鎖分子は塩基が完全に対になっていてもよ
いし、なっていなくてもよい。
ニーリングして２本鎖ＤＮＡ分子を形成させる過程であ
り、この２本鎖分子は塩基が完全に対になっていてもよ
いし、なっていなくてもよい。
ＮｍＲ：ネオマイシン耐性を付与する遺伝子。
ｏｒｉニブラスミドの複製起源。
ファスミド：ファージとしてふるまうこともあるし、ま
たプラスミドとしてふるまうこともある組換えＤＮＡベ
クター。
たプラスミドとしてふるまうこともある組換えＤＮＡベ
クター。
組換えＤＮＡクローニングベクター；１またはそれ以上
の別のＤＮＡ分子を付加したか、または付加することが
できるＤＮＡ分子からなる、自律的に複製するか、また
は組込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドを含むが
これに限定はされない。
の別のＤＮＡ分子を付加したか、または付加することが
できるＤＮＡ分子からなる、自律的に複製するか、また
は組込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドを含むが
これに限定はされない。
制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成したあらゆる直線状のＤＮＡ分子。
によって生成したあらゆる直線状のＤＮＡ分子。
ｒＲＮＡ：リポソーム性のリボ核酸。
感受性宿主細胞：ある抗生物質の存在下では、その抗生
物質に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがないと
増殖することができない宿主細胞。
物質に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがないと
増殖することができない宿主細胞。
ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性の表現型、またはそれを
付与する遺伝子。
付与する遺伝子。
形質導入体二組換えファージ感染による形質転換を受け
た受容宿主細胞。
た受容宿主細胞。
形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。
形質転換：遺伝子型が変化し、受容宿主細胞が変化する
結果になる、受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。
結果になる、受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。
ｔｓｒＲ：チオストレプトン耐性の表現型、またはそれ
を付与する遺伝子。
を付与する遺伝子。
本明細書に添付した図面は縮尺して描かれているが、観
察される制限フラグメントの大きさが、地図上の距離か
ら計算した大きさと若干具なっていることもある。Ｍｂ
ｏＩなどのいくつかの制限酵素については、便利なよう
に一部の切断部位だけを示した。
察される制限フラグメントの大きさが、地図上の距離か
ら計算した大きさと若干具なっていることもある。Ｍｂ
ｏＩなどのいくつかの制限酵素については、便利なよう
に一部の切断部位だけを示した。
第１図は、プラスミドｐＯＪ１７１の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ３１３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ１５９の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３０の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３５の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ３１３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ１５９の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３０の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３５の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
［課題を解決するための手段］
本発明は、４°′−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ活性を
コードしている新規遺伝子（ｃａｒ Ｅと命名）に関ス
る。このアシラーゼをコードしている組換えＤＮＡ発現
ベクターを用いて抗生物質の収量を増加させることがで
き、また新規抗生物質を産生させることができる。ｃａ
ｒ Ｅ遺伝子の暗号配列は、微生物中の４”−〇−イン
バレリルアンラーゼ活性を増加させる方法において有用
である。この方法は、ｃａｒ Ｅ遺伝子産物の発現をコ
ードしている組換えＤＮＡベクターで微生物を形質転換
し、この形質転換細胞を遺伝子発現に適した条件下で培
養することからなる。
コードしている新規遺伝子（ｃａｒ Ｅと命名）に関ス
る。このアシラーゼをコードしている組換えＤＮＡ発現
ベクターを用いて抗生物質の収量を増加させることがで
き、また新規抗生物質を産生させることができる。ｃａ
ｒ Ｅ遺伝子の暗号配列は、微生物中の４”−〇−イン
バレリルアンラーゼ活性を増加させる方法において有用
である。この方法は、ｃａｒ Ｅ遺伝子産物の発現をコ
ードしている組換えＤＮＡベクターで微生物を形質転換
し、この形質転換細胞を遺伝子発現に適した条件下で培
養することからなる。
アメリカン・タイプ・カルチャー−コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ、 ＲｏｃｋｖｉｌＩｅ、 ＭＤ ２０８５
２）から取得番号ＡＴＣＣ１１４１６のもとて入手可能
な、ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓ、サー
モトレランス）のカルボマイシン産生株からｃａｒ Ｅ
遺伝子を単離した。即ち、Ｓ、サーモトレランスのゲノ
ムＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏｌで部分的に消化し、得られ
たＤＮＡをＨｐａＩ ＢａｍＨＩ消化のコスミドｐＫ
Ｃ４６２Ａ［ノーザン・リージョナル・リサーチ・セン
ター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
５ｅｒｖｉｃｅ、 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｐｅｏｒｉａ、
ＩＬ ６１６０４）から取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５
９７３のもとで入手可能；１９８５年６月３日寄託］に
挿入して、プラスミドｐＯＪ１７１を含む多数のｃａｒ
Ｅ含有プラスミドを得た。プラスミドｐＯＪ１７１（
第１図）は、実施例１記載のようにして、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）Ｋ １２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１（ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１８１６９；１９８７年２月６日寄託）か
ら単離することができる。ｃａｒ Ｅ遺伝子は、プラス
ミドｐＯＪ１７１から〜３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントで単離することができる。
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ、 ＲｏｃｋｖｉｌＩｅ、 ＭＤ ２０８５
２）から取得番号ＡＴＣＣ１１４１６のもとて入手可能
な、ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓ、サー
モトレランス）のカルボマイシン産生株からｃａｒ Ｅ
遺伝子を単離した。即ち、Ｓ、サーモトレランスのゲノ
ムＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏｌで部分的に消化し、得られ
たＤＮＡをＨｐａＩ ＢａｍＨＩ消化のコスミドｐＫ
Ｃ４６２Ａ［ノーザン・リージョナル・リサーチ・セン
ター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
５ｅｒｖｉｃｅ、 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｐｅｏｒｉａ、
ＩＬ ６１６０４）から取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５
９７３のもとで入手可能；１９８５年６月３日寄託］に
挿入して、プラスミドｐＯＪ１７１を含む多数のｃａｒ
Ｅ含有プラスミドを得た。プラスミドｐＯＪ１７１（
第１図）は、実施例１記載のようにして、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）Ｋ １２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１（ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１８１６９；１９８７年２月６日寄託）か
ら単離することができる。ｃａｒ Ｅ遺伝子は、プラス
ミドｐＯＪ１７１から〜３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントで単離することができる。
また、このｃａｒ Ｅ遺伝子は、多数の微生物における
遺伝子マーカーとして有用なカルボマイシン耐性付与遺
伝子（ｃａｒ Ｂと命名）を含有しているプラスミドｐ
ＯＪ１５９から単離することもできる。
遺伝子マーカーとして有用なカルボマイシン耐性付与遺
伝子（ｃａｒ Ｂと命名）を含有しているプラスミドｐ
ＯＪ１５９から単離することもできる。
プラスミドｐＯＪ１５９（第４図）は、実施例２記載の
ようにして、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）Ｃ５８１／ｐＯＪ １５９（ＮＲＲＬ １８０９０
； １９８６年７月２９日寄託）から単離することが
できる。
ようにして、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）Ｃ５８１／ｐＯＪ １５９（ＮＲＲＬ １８０９０
； １９８６年７月２９日寄託）から単離することが
できる。
プラスミドｐＯＪ１５９は、ストレプトマイセス・サー
モトレランスのゲノムＤ Ｎ Ａ ヲ制限酵素Ｍｂ。
モトレランスのゲノムＤ Ｎ Ａ ヲ制限酵素Ｍｂ。
■で部分的に消化し、得られたＤＮＡをＢｇｌｌｌ？Ｍ
化のプラスミドｐＩ Ｊ ７０２（Ａ、ＴＣＣ３９１５
５）に挿入し、そしてカルボマイシン耐性のストレプト
マイセス形質転換体を同定することによって構築した。
化のプラスミドｐＩ Ｊ ７０２（Ａ、ＴＣＣ３９１５
５）に挿入し、そしてカルボマイシン耐性のストレプト
マイセス形質転換体を同定することによって構築した。
しかし、プラスミドｐＯＪ１５９も本発明のＣａｒＥ遺
伝子を含有している。ｃａｒ Ｅ遺伝子はストレプトマ
イセス・サーモトレランスから単離されているので、こ
のｃａｒＥ遺伝子は、ｃａｒＥ遺伝子のプロモーターが
機能するＳ、サーモトレランスおよびその他の宿主細胞
中でアシラーゼ活性を発現させる。Ｓ、サーモトレラン
スの無傷のｃａｒＥ遺伝子を用い、多種の宿主細胞、特
にストレプトマイセス属のあらゆる種において４”−０
−イソバレリルアシラーゼ活性を生成させることができ
ることは当業者の認めるところであろう。
伝子を含有している。ｃａｒ Ｅ遺伝子はストレプトマ
イセス・サーモトレランスから単離されているので、こ
のｃａｒＥ遺伝子は、ｃａｒＥ遺伝子のプロモーターが
機能するＳ、サーモトレランスおよびその他の宿主細胞
中でアシラーゼ活性を発現させる。Ｓ、サーモトレラン
スの無傷のｃａｒＥ遺伝子を用い、多種の宿主細胞、特
にストレプトマイセス属のあらゆる種において４”−０
−イソバレリルアシラーゼ活性を生成させることができ
ることは当業者の認めるところであろう。
ｃａｒ Ｅ遺伝子の配列を、暗号配列の上流の５′末端
を先頭にして、以下に示す。この５′非暗号配列は、本
発明の別の重要な態様であるｃａｒ Ｅ遺伝子のプロモ
ーターを含有している。ｃａｒ Ｅ遺伝子の解読鎖の配
列だけを示すが、非解読鎖の配列は周知の塩基対の規則
（ＡがＴと対になり、ＣがＧと対になる）によって得る
ことができる。また、ｃａｒ Ｅ遺伝子産物のアミノ酸
残基配列も、アミノ末端を先頭にして、以下に示す。各
アミノ酸残基はその残基をコードしているＤＮＡの下に
示す。
を先頭にして、以下に示す。この５′非暗号配列は、本
発明の別の重要な態様であるｃａｒ Ｅ遺伝子のプロモ
ーターを含有している。ｃａｒ Ｅ遺伝子の解読鎖の配
列だけを示すが、非解読鎖の配列は周知の塩基対の規則
（ＡがＴと対になり、ＣがＧと対になる）によって得る
ことができる。また、ｃａｒ Ｅ遺伝子産物のアミノ酸
残基配列も、アミノ末端を先頭にして、以下に示す。各
アミノ酸残基はその残基をコードしているＤＮＡの下に
示す。
ＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列の両者には、本発明
の理解を容易にするため番号を付した。
の理解を容易にするため番号を付した。
ｃａｒＥ遺伝子のヌクレオチド配列およびｃａｒＥ遺５
’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴ ＧＧ
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Ｌｅｕ 工１ｅ Ｖａｌ ｎｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
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ＣＡＴＴＧＧＣＣＣＧ ＧＧ−３’ 上記の配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグ
アニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ａｌａ
はアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパラギ
ン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシスティン、Ｇ
ｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグ
リシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはインロイシン、
Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメチオニ
ン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓ
ｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔｒｐはトリプト
ファン、Ｔｙｒはチロシン、そしてＶａｌはバリンであ
る。
ＣＴＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＴＣＡＴＣＴＡ
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アニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ａｌａ
はアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパラギ
ン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシスティン、Ｇ
ｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグ
リシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはインロイシン、
Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメチオニ
ン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓ
ｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔｒｐはトリプト
ファン、Ｔｙｒはチロシン、そしてＶａｌはバリンであ
る。
本発明の種々のベクターは、プラスミドｐＯＪ１７１ま
たはｐＯＪ１５９のどちらかを出発物質として容易に構
築することができる。無傷のｃａｒＥ遺伝子を含有する
ベクターはストレプトマイセス属で用いるのに特に好ま
しい。例えば、プラスミドｐＯＪ１７１の〜３．８ｋｂ
のｃａｒ Ｅ遺伝子含有のＥｃｏＲＩ制限フラグメント
を単離し、ＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐＯＪ１６０
（第２図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８０８８； １９８６年
７月２９日寄託）に挿入してプラスミドｐＯＪ３１３（
第３図）およびｐＯＪ３１３Ａを得た（これらのプラス
ミドは、〜３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フラグメントの
配向だけが異なっている）。プラスミドｐｏ Ｊ ３１
３およびｐＯＪ３１３Ａの構築プロトコールを実施例３
に示す。
たはｐＯＪ１５９のどちらかを出発物質として容易に構
築することができる。無傷のｃａｒＥ遺伝子を含有する
ベクターはストレプトマイセス属で用いるのに特に好ま
しい。例えば、プラスミドｐＯＪ１７１の〜３．８ｋｂ
のｃａｒ Ｅ遺伝子含有のＥｃｏＲＩ制限フラグメント
を単離し、ＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐＯＪ１６０
（第２図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８０８８； １９８６年
７月２９日寄託）に挿入してプラスミドｐＯＪ３１３（
第３図）およびｐＯＪ３１３Ａを得た（これらのプラス
ミドは、〜３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フラグメントの
配向だけが異なっている）。プラスミドｐｏ Ｊ ３１
３およびｐＯＪ３１３Ａの構築プロトコールを実施例３
に示す。
本発明のプラスミドｐＯＪ２３０（第５図）は、実施例
４記載のようにして、プラスミドｐＯＪ１５９の〜２．
４ｋｂのｃａｒ Ｅ遺伝子含有のＢａｍＨＩ制限フラグ
メントをＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＯＪ１６０にラ
イゲートすることにより、プラスミドｐＯＪ１５９から
誘導した。このフラグメントは２つの配向で挿入するこ
とができるので、このライゲートによって、〜２．４ｋ
ｂのｃａｒ Ｅ含有のＢａｍＨＩ制限フラグメントの配
向だけが異なっている２種類のプラスミド（ｐＯＪ２３
０およびｐ。
４記載のようにして、プラスミドｐＯＪ１５９の〜２．
４ｋｂのｃａｒ Ｅ遺伝子含有のＢａｍＨＩ制限フラグ
メントをＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＯＪ１６０にラ
イゲートすることにより、プラスミドｐＯＪ１５９から
誘導した。このフラグメントは２つの配向で挿入するこ
とができるので、このライゲートによって、〜２．４ｋ
ｂのｃａｒ Ｅ含有のＢａｍＨＩ制限フラグメントの配
向だけが異なっている２種類のプラスミド（ｐＯＪ２３
０およびｐ。
Ｊ２３１と命名）が得られた。
無傷のｃａｒ Ｅ遺伝子を含有している本発明のベクタ
ーは、カルボマイシンあるいはその他のマクロライド系
抗生物質を生合成している微生物において４°′−ｏ−
インバレリル トランスフェラーゼ活性を増加させる際
に用いるのに好ましい。従って、ストレプトマイセス属
、特に、ミカロースあるいはその関連の糖を含有する抗
生物質を産生ずる種が、無傷のｃａｒ Ｅ遺伝子を含有
する本発明のベクターにとって好ましい宿主細胞となる
。あらゆる宿主細胞においてｃａｒ Ｅ遺伝子産物を産
生させる目的で、組換えＤＮＡ法を用いてｃａｒ Ｅ遺
伝子を再構築することができるのは勿論である。
ーは、カルボマイシンあるいはその他のマクロライド系
抗生物質を生合成している微生物において４°′−ｏ−
インバレリル トランスフェラーゼ活性を増加させる際
に用いるのに好ましい。従って、ストレプトマイセス属
、特に、ミカロースあるいはその関連の糖を含有する抗
生物質を産生ずる種が、無傷のｃａｒ Ｅ遺伝子を含有
する本発明のベクターにとって好ましい宿主細胞となる
。あらゆる宿主細胞においてｃａｒ Ｅ遺伝子産物を産
生させる目的で、組換えＤＮＡ法を用いてｃａｒ Ｅ遺
伝子を再構築することができるのは勿論である。
無傷のｃａｒＥ遺伝子を用いて微生物の４″′−Ｏ−イ
ソバレリルアシラーゼ活性を増加させることの例を示す
目的で、本発明の例示ベクターをストレプトマイセス・
アンポファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔ。
ソバレリルアシラーゼ活性を増加させることの例を示す
目的で、本発明の例示ベクターをストレプトマイセス・
アンポファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔ。
ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ； Ｓ 、アン
ボファシエンス）に導入した。Ｓ、アンボファシエンス
は、スピラマイシンおよび他の種々スピラマイシン関連
化合物（４“’−ＯＨ基とともにミカロース残基を含む
）を産生ずる。Ｓ、アンボファシエンスは、天然には４
”−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ活性を産生じない。実
施例５記載のように、プラスミドｐ。
ボファシエンス）に導入した。Ｓ、アンボファシエンス
は、スピラマイシンおよび他の種々スピラマイシン関連
化合物（４“’−ＯＨ基とともにミカロース残基を含む
）を産生ずる。Ｓ、アンボファシエンスは、天然には４
”−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ活性を産生じない。実
施例５記載のように、プラスミドｐ。
Ｊ１５９、ｐＯＪ１７１、ｐｏ Ｊ ２３０、ｐＯＪ２
３１、およびｐｏ Ｊ ３１３を用いてＳ、アンボファ
シエンスを形質転換した。得られた形質転換体は、アシ
ラーゼをコードしている組換えＤＮＡベクターが存在す
ることにより、インバレリルスピラマイシンを産生じた
。
３１、およびｐｏ Ｊ ３１３を用いてＳ、アンボファ
シエンスを形質転換した。得られた形質転換体は、アシ
ラーゼをコードしている組換えＤＮＡベクターが存在す
ることにより、インバレリルスピラマイシンを産生じた
。
同様に、プラスミドｐＯＪ１５９およびｐＯＪ３１３を
用いてストレプトマイセス・リビダンスＴ Ｋ ２３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ
２３ ： Ｎ ＲＲＬ １５８２６；１９８４年７月
２７日寄託）を形質転換したときには、得られた形質転
換体は、比較的高レベルのスピラマイシンの存在下で増
殖することができるだけでなく（ｃａｒＢ遺伝子産物に
よる）、スピラマイシンをインバレリルスピラマイシン
に変換した。Ｓ、リビダンスの形質転換プロトコールを
実施例６で説明する。
用いてストレプトマイセス・リビダンスＴ Ｋ ２３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ
２３ ： Ｎ ＲＲＬ １５８２６；１９８４年７月
２７日寄託）を形質転換したときには、得られた形質転
換体は、比較的高レベルのスピラマイシンの存在下で増
殖することができるだけでなく（ｃａｒＢ遺伝子産物に
よる）、スピラマイシンをインバレリルスピラマイシン
に変換した。Ｓ、リビダンスの形質転換プロトコールを
実施例６で説明する。
このように、本発明のベクターは、スピラマイシンおよ
びカルボマイシンなどのマクロライド系抗生物質のミカ
ロース残基をアシル化するのに一般的に有用である。ス
トレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｆｒａｄｉａｅ）は、ミカロース残基を含有する別
のマクロライド系抗生物質であるタイロシンを産生ずる
。米国特許第４．０９２．４７３号には、タイロシンの
ミカロース残基を４′″アシル化して重要な抗生物質で
あるインバレリルタイロシンを得ることが記載されてい
る。米国特許第４．６５６゜２５８号には、インバレリ
ルマクロシンの製造が記載されている。タイロシンまた
はその中間体ではミカロースの４゛−ＯＨ基はアシル化
されていないが、本発明の組換えＤＮＡベクターを用い
てタイロシン産生細胞を、４゛−アシル化タイロシンお
よび４゛°−アシル化タイロシン中間体を産生ずる細胞
に形質転換することができる。
びカルボマイシンなどのマクロライド系抗生物質のミカ
ロース残基をアシル化するのに一般的に有用である。ス
トレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｆｒａｄｉａｅ）は、ミカロース残基を含有する別
のマクロライド系抗生物質であるタイロシンを産生ずる
。米国特許第４．０９２．４７３号には、タイロシンの
ミカロース残基を４′″アシル化して重要な抗生物質で
あるインバレリルタイロシンを得ることが記載されてい
る。米国特許第４．６５６゜２５８号には、インバレリ
ルマクロシンの製造が記載されている。タイロシンまた
はその中間体ではミカロースの４゛−ＯＨ基はアシル化
されていないが、本発明の組換えＤＮＡベクターを用い
てタイロシン産生細胞を、４゛−アシル化タイロシンお
よび４゛°−アシル化タイロシン中間体を産生ずる細胞
に形質転換することができる。
ストレプトマイセス−サーモトレランスから単離した無
傷のｃａｒ Ｅ遺伝子は、Ｓ、アンボファシエンスおよ
びＳ、リビダンス中でよく発現した。元のｃａｒ Ｅ遺
伝子が大腸菌などのある与えられた微生物中で発現しな
い場合であってもぐ例えば、ｃａｒＥのストレプトマイ
セス属プロモーターが該微生物中で機能しないなどの理
由で）、本発明のｃａｒ Ｅ暗号配列を、適切なプロモ
ーター、リポソーム結合部位あるいはその他の調節要素
を含有しているＤＮＡフラグメントにライケートして、
選択した宿主中でｃａｒ Ｅ遺伝子を発現させることが
できる。
傷のｃａｒ Ｅ遺伝子は、Ｓ、アンボファシエンスおよ
びＳ、リビダンス中でよく発現した。元のｃａｒ Ｅ遺
伝子が大腸菌などのある与えられた微生物中で発現しな
い場合であってもぐ例えば、ｃａｒＥのストレプトマイ
セス属プロモーターが該微生物中で機能しないなどの理
由で）、本発明のｃａｒ Ｅ暗号配列を、適切なプロモ
ーター、リポソーム結合部位あるいはその他の調節要素
を含有しているＤＮＡフラグメントにライケートして、
選択した宿主中でｃａｒ Ｅ遺伝子を発現させることが
できる。
この方法を、ｐＯＪ２３５と命名した本発明の大腸菌発
現ベクターの構築を例にとって説明し、後記でさらに詳
細に説明する。
現ベクターの構築を例にとって説明し、後記でさらに詳
細に説明する。
プラスミドｐＯＪ１５９、ｐＯＪ１７１、ｐＯＪ２３０
、ｐＯＪ ２３１ ｐＯＪ ３１３、およびｐ。
、ｐＯＪ ２３１ ｐＯＪ ３１３、およびｐ。
Ｊ３１３Ａは無傷のｃａｒ Ｅ遺伝子、即ち、（１）タ
ンパク質の暗号配列の転写を導くプロモーター；（２）
ｍＲＮＡに転写されたときに、その転写体の翻訳を導（
配列；（３）タンパク質の暗号配列；および（４）転写
ターミネータ−；を含有している。
ンパク質の暗号配列の転写を導くプロモーター；（２）
ｍＲＮＡに転写されたときに、その転写体の翻訳を導（
配列；（３）タンパク質の暗号配列；および（４）転写
ターミネータ−；を含有している。
これら要素のそれぞれは独立して有用であり、組換えＤ
ＮＡ法によりこれらから極めて多様な組換え遺伝子を得
ることができる。先に挙げたｃａｒＥ遺伝子のＤＮＡ配
列によってｃａｒ Ｅの暗号配列の位置が明らかにされ
ており、従って、他のプロモーター、例えば大腸菌のｔ
ｒｐ、 １ｐｌ）％およびｌａｃプロモーター、ハイブ
リッドのｔａｃプロモーター、λｐＬプロモーター、並
びにバシラス属のｖｅｇプロモーターなどをｃａｒＥの
暗号配列とともにリーディング相内に設置することが可
能である。適切なプロモーターを選択することによって
、あらゆる宿主細胞においてｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発
現させるベクターを構築することができる。ストレプト
マイセス・サーモトレランスのｃａｒ Ｅ遺伝子のプロ
モーターはそれ自体有用である。ｃａｒＥ遺伝子のプロ
モーターおよびその他の調節要素をあらゆる暗号配列に
結合させて有用な組換え遺伝子を得ることができる。従
って、ｃａｒ Ｅ遺伝子の個々の要素、プロモーターお
よび暗号配列の両者は本発明の重要な成分を構成してい
る。
ＮＡ法によりこれらから極めて多様な組換え遺伝子を得
ることができる。先に挙げたｃａｒＥ遺伝子のＤＮＡ配
列によってｃａｒ Ｅの暗号配列の位置が明らかにされ
ており、従って、他のプロモーター、例えば大腸菌のｔ
ｒｐ、 １ｐｌ）％およびｌａｃプロモーター、ハイブ
リッドのｔａｃプロモーター、λｐＬプロモーター、並
びにバシラス属のｖｅｇプロモーターなどをｃａｒＥの
暗号配列とともにリーディング相内に設置することが可
能である。適切なプロモーターを選択することによって
、あらゆる宿主細胞においてｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発
現させるベクターを構築することができる。ストレプト
マイセス・サーモトレランスのｃａｒ Ｅ遺伝子のプロ
モーターはそれ自体有用である。ｃａｒＥ遺伝子のプロ
モーターおよびその他の調節要素をあらゆる暗号配列に
結合させて有用な組換え遺伝子を得ることができる。従
って、ｃａｒ Ｅ遺伝子の個々の要素、プロモーターお
よび暗号配列の両者は本発明の重要な成分を構成してい
る。
ｃａｒ Ｅ遺伝子のプロモーターは、前記のｃａｒＥ遺
伝子配列のヌクレオチド１〜５８０中に含まれている。
伝子配列のヌクレオチド１〜５８０中に含まれている。
また、この配列は５’−ＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧ−３’な
る配列を含んでおり（ヌクレオチド番号５７０近辺の配
列を参照）、これは多数の抗生物質生合成遺伝子および
抗生物質耐性付与遺伝子の中に存在している。配列５”
−ＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧ−３’、およびこれに密接に関
連している５°−ＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧ−３°などの
配列は上記の遺伝子群の調節に重要であると考えられ、
これを抗生物質生合成遺伝子および抗生物質耐性付与遺
伝子を検出するためのプローブとして用いることができ
る。
る配列を含んでおり（ヌクレオチド番号５７０近辺の配
列を参照）、これは多数の抗生物質生合成遺伝子および
抗生物質耐性付与遺伝子の中に存在している。配列５”
−ＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧ−３’、およびこれに密接に関
連している５°−ＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧ−３°などの
配列は上記の遺伝子群の調節に重要であると考えられ、
これを抗生物質生合成遺伝子および抗生物質耐性付与遺
伝子を検出するためのプローブとして用いることができ
る。
取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８１６９およびＮＲＲＬ
１８０９０のもとで寄託されているｃａｒＥ配列を用い
て、他の生合成遺伝子含有ＤＮＡセグメン、ト、特にマ
クロライド生合成遺伝子群をコードしているセグメント
を得るのに有用なりＮＡプローブを調製することが可能
であることは当業者の認めるところであろう。さらに、
天然および実験室の両方におけるストレプトマイセス・
サーモトレランス株の多様性により、単離が容易かつ本
発明のｃａｒ Ｅ遺伝子含有化合物を与えることができ
る、ｃａｒ Ｅ遺伝子の多種のアレル変異体が存在する
であろう。ｃａｒ Ｅ遺伝子産物のアミノ酸残基配列と
は異なるアミノ酸残基配列を有する遺伝子産物をコード
しているこれらのアレル変異体は、機能的に本発明のｃ
ａｒ Ｅ遺伝子と等価である。
１８０９０のもとで寄託されているｃａｒＥ配列を用い
て、他の生合成遺伝子含有ＤＮＡセグメン、ト、特にマ
クロライド生合成遺伝子群をコードしているセグメント
を得るのに有用なりＮＡプローブを調製することが可能
であることは当業者の認めるところであろう。さらに、
天然および実験室の両方におけるストレプトマイセス・
サーモトレランス株の多様性により、単離が容易かつ本
発明のｃａｒ Ｅ遺伝子含有化合物を与えることができ
る、ｃａｒ Ｅ遺伝子の多種のアレル変異体が存在する
であろう。ｃａｒ Ｅ遺伝子産物のアミノ酸残基配列と
は異なるアミノ酸残基配列を有する遺伝子産物をコード
しているこれらのアレル変異体は、機能的に本発明のｃ
ａｒ Ｅ遺伝子と等価である。
例えば、米国特許Ｎ ｏ、 ４．５２２．９１９に記載
されているストレプトマイセス・サーモトレランスの改
良型の生物学的変換株ＮＲＲＬ １５２７０（１９８
３年１月２０日寄託）由来のｃａｒＥ遺伝子を、後記の
ようにして〜２．４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメント
で単離することができる。ＮＲＲＬ １５２７０株か
ら単離したゲノムＤＮＡからＢａｍＨＩ制限フラグメン
トを得、これをＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＯＪ１６
０中に挿入した。この操作によりＳ、サーモトレランス
ＮＲＲＬ １５２７０のゲノムライブラリーが得られ
、このライブラリーを大腸菌に導入し、得られた形質転
換体を、プラスミドｐＯＪ２３０の〜２．４ｋｂ ｃａ
ｒＥ含有ＢａｍＨ１制限フラグメントをハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼ
ーションによってプローブ検索した。この操作でハイブ
リダイズしたコロニーから単離したプラスミドＤＮＡは
、Ｓ、サーモトレランスＮＲＲＬ１５２７０の〜２．４
ｋｂ ｃａｒＥ含有ＢａｍＨＩ制限フラグメントを含
有していた。Ｓ、サーモトレランスＮＲＲＬ １５２
７０のｃａｒＥ遺伝子およびこの遺伝子の暗号配列は本
発明の重要な化合物であるが、これは、ＮＲＲＬ １
５２７０株のｃａｒ Ｅ遺伝子産物が野生型Ｓ、サーモ
トレランスのｃａｒＥ遺伝子産物とは別の基質特異性を
有するものと考えられているからである。同様の方法に
より、ｃａｒ ＥをコードしているＤＮＡを含有するあ
らゆる微生物からｃａｒ Ｅ含有ＤＮＡを得ることがで
きる。
されているストレプトマイセス・サーモトレランスの改
良型の生物学的変換株ＮＲＲＬ １５２７０（１９８
３年１月２０日寄託）由来のｃａｒＥ遺伝子を、後記の
ようにして〜２．４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメント
で単離することができる。ＮＲＲＬ １５２７０株か
ら単離したゲノムＤＮＡからＢａｍＨＩ制限フラグメン
トを得、これをＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＯＪ１６
０中に挿入した。この操作によりＳ、サーモトレランス
ＮＲＲＬ １５２７０のゲノムライブラリーが得られ
、このライブラリーを大腸菌に導入し、得られた形質転
換体を、プラスミドｐＯＪ２３０の〜２．４ｋｂ ｃａ
ｒＥ含有ＢａｍＨ１制限フラグメントをハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼ
ーションによってプローブ検索した。この操作でハイブ
リダイズしたコロニーから単離したプラスミドＤＮＡは
、Ｓ、サーモトレランスＮＲＲＬ１５２７０の〜２．４
ｋｂ ｃａｒＥ含有ＢａｍＨＩ制限フラグメントを含
有していた。Ｓ、サーモトレランスＮＲＲＬ １５２
７０のｃａｒＥ遺伝子およびこの遺伝子の暗号配列は本
発明の重要な化合物であるが、これは、ＮＲＲＬ １
５２７０株のｃａｒ Ｅ遺伝子産物が野生型Ｓ、サーモ
トレランスのｃａｒＥ遺伝子産物とは別の基質特異性を
有するものと考えられているからである。同様の方法に
より、ｃａｒ ＥをコードしているＤＮＡを含有するあ
らゆる微生物からｃａｒ Ｅ含有ＤＮＡを得ることがで
きる。
多種の既知ストレプトマイセス属レプリコンをｃａｒＥ
遺伝子との関係において用い、本発明の発現ベクターを
構築することができる。第１表は、ストレプトマイセス
属レプリコンを得ることができるストレプトマイセス属
プラスミドを挙げるものであるが、これらは例示であっ
てすべてではない。レプリコンの機能が破壊されない限
り、これらプラスミドの全部または一部を用いて本発明
のｃａｒ Ｅ遺伝子を含有するベクターを構築すること
ができることは当業者も認めるであろう。プラスミドを
含有する宿主、および寄託の取得番号も第１表に挙げる
。
遺伝子との関係において用い、本発明の発現ベクターを
構築することができる。第１表は、ストレプトマイセス
属レプリコンを得ることができるストレプトマイセス属
プラスミドを挙げるものであるが、これらは例示であっ
てすべてではない。レプリコンの機能が破壊されない限
り、これらプラスミドの全部または一部を用いて本発明
のｃａｒ Ｅ遺伝子を含有するベクターを構築すること
ができることは当業者も認めるであろう。プラスミドを
含有する宿主、および寄託の取得番号も第１表に挙げる
。
第１表ストレプトマイセス属プラスミドプラスミド
宿 主 取得番号５ＣＰ２＊
ストレプトマイセス・コエリカラー ＭＩＩＯＮ
ＲＲＬ １５０４１ｐｔｌｃ３ スト
レプトマイセス ３０２２Ａ
ＩＩＲＲＬ １１４４１＊ ナシ逼ナル・コレ
クシ３ン・オブ・インダストリアル・バクテリア（ＮＣ
ＩＢ）： ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ
、 Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎ
、 Ｐｏ５ｔ ０ｆＴｉｃｅ Ｂｏｘ ３１．
１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ。
宿 主 取得番号５ＣＰ２＊
ストレプトマイセス・コエリカラー ＭＩＩＯＮ
ＲＲＬ １５０４１ｐｔｌｃ３ スト
レプトマイセス ３０２２Ａ
ＩＩＲＲＬ １１４４１＊ ナシ逼ナル・コレ
クシ３ン・オブ・インダストリアル・バクテリア（ＮＣ
ＩＢ）： ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ
、 Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎ
、 Ｐｏ５ｔ ０ｆＴｉｃｅ Ｂｏｘ ３１．
１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ。
人ｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ｇＤＣ，５ｃｏｔｌａｎｄ
、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ本発明の例示ベ
クターの構築に用いる制限フラグメントを常法により修
飾してライゲーションを容易にすることができる。例え
ば、分子リンカ−を、特定のｃａｒ Ｅ生合成遺伝子含
有の制限フラグメントに、またはベクターの複製あるい
は組込み機能を含有するＤＮＡに付与することができる
。
、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ本発明の例示ベ
クターの構築に用いる制限フラグメントを常法により修
飾してライゲーションを容易にすることができる。例え
ば、分子リンカ−を、特定のｃａｒ Ｅ生合成遺伝子含
有の制限フラグメントに、またはベクターの複製あるい
は組込み機能を含有するＤＮＡに付与することができる
。
即ち、後のライゲーション用の特異的な部位を常法によ
って構築することができる。さらに、あるベクターの複
製あるいは染色体組込みを付与する種々のｃａｒ Ｅ生
合成遺伝子含有制限フラグメントまたは配列を、一部ヌ
クレオチドの付加、削除あるいは置換により修飾してそ
の性質を変え、ＤＮＡのライゲーションのための種々の
制限部位を得ることができる。当業者ならヌクレオチド
の化学および遺伝暗号を知っており、従って、どのヌク
レオチドが交換可能であるか、およびどんなりＮＡ修飾
が特定の目的に対して望ましいかを知っている。このよ
うに、ｃａｒＥ遺伝子産物をコードしている無数のＤＮ
Ａ配列を構築することができる。
って構築することができる。さらに、あるベクターの複
製あるいは染色体組込みを付与する種々のｃａｒ Ｅ生
合成遺伝子含有制限フラグメントまたは配列を、一部ヌ
クレオチドの付加、削除あるいは置換により修飾してそ
の性質を変え、ＤＮＡのライゲーションのための種々の
制限部位を得ることができる。当業者ならヌクレオチド
の化学および遺伝暗号を知っており、従って、どのヌク
レオチドが交換可能であるか、およびどんなりＮＡ修飾
が特定の目的に対して望ましいかを知っている。このよ
うに、ｃａｒＥ遺伝子産物をコードしている無数のＤＮ
Ａ配列を構築することができる。
また、ベクターをコントロールする必須の機能が損なわ
れない限り、ｃａｒ Ｅ生合成遺伝子含有の制限フラグ
メントはクローニングベクターの特定の位置に限定され
ないことにも注意すべきである。
れない限り、ｃａｒ Ｅ生合成遺伝子含有の制限フラグ
メントはクローニングベクターの特定の位置に限定され
ないことにも注意すべきである。
当業者なら、ベクターのどの部位が特定のｃａｒ Ｅ遺
伝子含有制限フラグメントのライゲーション、即ち挿入
に都合がよいかを知っているか、または容易に決定する
ことができる。
伝子含有制限フラグメントのライゲーション、即ち挿入
に都合がよいかを知っているか、または容易に決定する
ことができる。
ｃａｒ Ｅ遺伝子または暗号配列を用いてプラスミド以
外のベクターを構築することができるのは勿論である。
外のベクターを構築することができるのは勿論である。
ファージφＣ３１は周知のストレプトマイセスファージ
であり、本発明をさらに例示する組込み型ｃａｒＥ遺伝
子含有ベクターを構築するための出発物質の優れた供給
源である。ファージφＣ３１の誘導体であるファスミド
ｐＫＣ３３１はそのような組込み型ベクターの構築に特
に好ましく、大腸菌に１２ ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１
（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８２８； １９８４年８月３日寄
託）から得ることができる。φＣ３１型のファージは組
込み型のベクターであり、容易に修飾を行ってｃａｒ
Ｅ遺伝子を導入し、こうしてストレプトマイセス属に４
”−ｏ−インバレリルアシラーゼ活性を付与することが
できる。プラスミドの染色体外維持を与えるレプリコン
を含有するプラスミドであっても、通常はレプリコン配
列の欠失を伴って、宿主細胞のゲノム中に組込まれるこ
ともある。従って、本発明は、ｃａｒ Ｅ遺伝子または
暗号配列を標的宿主細胞に導入するために用いるベクタ
ーの型によっても、また、導入が為されたときのｃａｒ
Ｅ遺伝子または暗号配列の位置によっても限定されな
い。
であり、本発明をさらに例示する組込み型ｃａｒＥ遺伝
子含有ベクターを構築するための出発物質の優れた供給
源である。ファージφＣ３１の誘導体であるファスミド
ｐＫＣ３３１はそのような組込み型ベクターの構築に特
に好ましく、大腸菌に１２ ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１
（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８２８； １９８４年８月３日寄
託）から得ることができる。φＣ３１型のファージは組
込み型のベクターであり、容易に修飾を行ってｃａｒ
Ｅ遺伝子を導入し、こうしてストレプトマイセス属に４
”−ｏ−インバレリルアシラーゼ活性を付与することが
できる。プラスミドの染色体外維持を与えるレプリコン
を含有するプラスミドであっても、通常はレプリコン配
列の欠失を伴って、宿主細胞のゲノム中に組込まれるこ
ともある。従って、本発明は、ｃａｒ Ｅ遺伝子または
暗号配列を標的宿主細胞に導入するために用いるベクタ
ーの型によっても、また、導入が為されたときのｃａｒ
Ｅ遺伝子または暗号配列の位置によっても限定されな
い。
ストレプトマイセス属に好ましい本発明のベクターは、
ストレプトマイセス属レプリコンおよびｃａｒＥ遺伝子
含有の制限フラグメントを含有している。プラスミドの
増幅および操作はストレプトマイセス中でよりも大腸菌
中での方がより早くかつ効率的に行われるので、大腸菌
中での複製をも可能にするＤＮＡ配列を加えるのが好都
合である。
ストレプトマイセス属レプリコンおよびｃａｒＥ遺伝子
含有の制限フラグメントを含有している。プラスミドの
増幅および操作はストレプトマイセス中でよりも大腸菌
中での方がより早くかつ効率的に行われるので、大腸菌
中での複製をも可能にするＤＮＡ配列を加えるのが好都
合である。
即ち、大腸菌プラスミド（例えば、ｐＵｃ３、ｐＵＣ１
８、ｐＵｃ１９、ｐＢ Ｒ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８など）由来の、機能的なレ
プリコンを含有し、抗生物質耐性を付与する制限フラグ
メントを加えるのが極めて好都合であり、本発明の例示
ベクターの全般的な用途を増加させる。
８、ｐＵｃ１９、ｐＢ Ｒ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８など）由来の、機能的なレ
プリコンを含有し、抗生物質耐性を付与する制限フラグ
メントを加えるのが極めて好都合であり、本発明の例示
ベクターの全般的な用途を増加させる。
本発明は、大腸菌レプリコンを含有しているだけでな（
組換え大腸菌ｃａｒ Ｅ遺伝子をも含有している４”−
Ｏ−イソバレリルアシラーゼ発現ベクターを提供するも
のである。組換え大腸菌ｃａｒＥ遺伝子は、ｃａｒ Ｅ
遺伝子産物を発現させるように設置された大腸菌中で機
能するプロモーターを含有している。本発明の例示プラ
スミドｐｏ Ｊ ２３５（第６図）は実施例７記載のよ
うにして構築することができる。プラスミドｐｏ Ｊ
２３５は大腸菌中でｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発現させ、
λｐＬプロモーター（これ自身はプラスミドにコードさ
れている感温性のｃ１８５７遺伝子産物によって調節さ
れている）の支配下にあるｃａｒ Ｅの暗号配列を含ん
でいる。
組換え大腸菌ｃａｒ Ｅ遺伝子をも含有している４”−
Ｏ−イソバレリルアシラーゼ発現ベクターを提供するも
のである。組換え大腸菌ｃａｒＥ遺伝子は、ｃａｒ Ｅ
遺伝子産物を発現させるように設置された大腸菌中で機
能するプロモーターを含有している。本発明の例示プラ
スミドｐｏ Ｊ ２３５（第６図）は実施例７記載のよ
うにして構築することができる。プラスミドｐｏ Ｊ
２３５は大腸菌中でｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発現させ、
λｐＬプロモーター（これ自身はプラスミドにコードさ
れている感温性のｃ１８５７遺伝子産物によって調節さ
れている）の支配下にあるｃａｒ Ｅの暗号配列を含ん
でいる。
ｃａｒ Ｅ遺伝子、その暗号配列、およびそのプロモー
ターのそれぞれを種々の他のＤＮＡ化合物と組合せて、
有用な４’’−Ｏ−インバレリルアシラーゼおよび本発
明の他の発現ベクターを創製できることは当業者の認め
るところである。例えば、ストレプトマイセス・サーモ
トレランスはｃａｒＡおよびｃａｒ Ｂと命名されてい
る２種類のカルボマイシン耐性付与遺伝子を含んでいる
。これら２種類のカルボマイシン耐性遺伝子は共奏して
作用してストレプトマイセス・サーモトレランスに高レ
ベルの耐性を引き起こすことができる。本発明は、ｃａ
ｒ Ｅ遺伝子、並びにｃａｒＡおよびｃａｒ Ｂ遺伝子
のどちらかあるいは両方を含有するベクターをも提供す
るものである。例えば、プラスミドｐＯＪ１７１はｃａ
ｒＥとｃａｒ Ｂ遺伝子の両方を含有している。
ターのそれぞれを種々の他のＤＮＡ化合物と組合せて、
有用な４’’−Ｏ−インバレリルアシラーゼおよび本発
明の他の発現ベクターを創製できることは当業者の認め
るところである。例えば、ストレプトマイセス・サーモ
トレランスはｃａｒＡおよびｃａｒ Ｂと命名されてい
る２種類のカルボマイシン耐性付与遺伝子を含んでいる
。これら２種類のカルボマイシン耐性遺伝子は共奏して
作用してストレプトマイセス・サーモトレランスに高レ
ベルの耐性を引き起こすことができる。本発明は、ｃａ
ｒ Ｅ遺伝子、並びにｃａｒＡおよびｃａｒ Ｂ遺伝子
のどちらかあるいは両方を含有するベクターをも提供す
るものである。例えば、プラスミドｐＯＪ１７１はｃａ
ｒＥとｃａｒ Ｂ遺伝子の両方を含有している。
また、プラスミドｐＯＪ１７１は、Ｓ、サーモトレラン
スにおけるカルボマイシンのラクトン環の生合成に関係
している活性をコードしているｃａｒＧをもコードして
いる。
スにおけるカルボマイシンのラクトン環の生合成に関係
している活性をコードしているｃａｒＧをもコードして
いる。
本発明のクローニングベクターおよび形質転換体は遺伝
子のクローニングを提供するものであり、現在ストレプ
トマイセス属およびその関連細胞で製造されている種々
の産物の収量を変え、改善するものである。そのような
産物の例には、カルボマイシン、タイロシン、エリスロ
マイシンなどが含まれるが、これらに限定はされない。
子のクローニングを提供するものであり、現在ストレプ
トマイセス属およびその関連細胞で製造されている種々
の産物の収量を変え、改善するものである。そのような
産物の例には、カルボマイシン、タイロシン、エリスロ
マイシンなどが含まれるが、これらに限定はされない。
また、本発明は、種々の有用なりＮＡ配列をクローニン
グし、その特徴を調べ、再構築するのに有用な選択可能
なベクターをも提供するものである。
グし、その特徴を調べ、再構築するのに有用な選択可能
なベクターをも提供するものである。
本発明のストレプトマイセス属形質転換体は、いくつか
の別種培地のいずれかを用いる多数の方法で培養するこ
とができる。培養培地中の好ましい炭水化物供給源には
、例えば、糖蜜、グルコース、デキストリン、およびグ
リセリンが含まれる。
の別種培地のいずれかを用いる多数の方法で培養するこ
とができる。培養培地中の好ましい炭水化物供給源には
、例えば、糖蜜、グルコース、デキストリン、およびグ
リセリンが含まれる。
窒素供給源には、例えば、大豆粉、アミノ酸混合物、お
よびペプトンが含まれる。また、栄養無機塩も加えるが
、これにはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、リン酸、塩酸、硫酸などのイオンを生成しつる
通常の塩が含まれる。
よびペプトンが含まれる。また、栄養無機塩も加えるが
、これにはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、リン酸、塩酸、硫酸などのイオンを生成しつる
通常の塩が含まれる。
他の微生物の成長および増殖に必要であるように、必須
の微量元素も加える。通常、この微量元素は、他の成分
の培地への添加に付随する不純物として供給される。
の微量元素も加える。通常、この微量元素は、他の成分
の培地への添加に付随する不純物として供給される。
ストレプトマイセス属は、好気性培養条件下、約５〜９
の比較的広いｐＨ範囲、約１５〜４０°Ｃの温度で増殖
する。プラスミドの安定性および維持のためには、ｐＨ
約７．２の培養培地から始め、培養温度約３０°Ｃに保
つのが望ましい。
の比較的広いｐＨ範囲、約１５〜４０°Ｃの温度で増殖
する。プラスミドの安定性および維持のためには、ｐＨ
約７．２の培養培地から始め、培養温度約３０°Ｃに保
つのが望ましい。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。試薬ある
いは装置の供給元は便利なように挙げただけである。方
法の説明および実際に行った操作は適当な箇所に記載し
た。
、本発明はこれらに限定されるものではない。試薬ある
いは装置の供給元は便利なように挙げただけである。方
法の説明および実際に行った操作は適当な箇所に記載し
た。
（以下、余白）
実施例１ プラスミドｐＯＪ１７１の単離Ａ、大大腸Ｋ
１２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１の培養プラスミドｐ
ＯＪ１７１は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・セ
ンターから取得番号ＮＲＲＬＢ−１８１６９のもとで入
手することができる大腸菌に１２ ＳＦ８から得るこ
とができる。大腸菌に１２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１の
凍結乾燥品を、２００μｇ／ｘＱのアブラマイシンを含
むし一寒天プレートで培養し、この菌株の単一コロニー
単離体を得た。このコロニーを２００ ａ９／ ｘＱア
ブラマイシン含有のしブロス（約５００３１１２）に接
種し、細胞が定常期に達するまで、得られた培養物を曝
気しながら３７°Ｃでインキュベートした。
１２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１の培養プラスミドｐ
ＯＪ１７１は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・セ
ンターから取得番号ＮＲＲＬＢ−１８１６９のもとで入
手することができる大腸菌に１２ ＳＦ８から得るこ
とができる。大腸菌に１２ ＳＦ８／ｐＯＪ １７１の
凍結乾燥品を、２００μｇ／ｘＱのアブラマイシンを含
むし一寒天プレートで培養し、この菌株の単一コロニー
単離体を得た。このコロニーを２００ ａ９／ ｘＱア
ブラマイシン含有のしブロス（約５００３１１２）に接
種し、細胞が定常期に達するまで、得られた培養物を曝
気しながら３７°Ｃでインキュベートした。
マニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、１
９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ］によって修正が加えられた以下の方法に従って、
細胞からプラスミドＤＮＡを得、該プラスミドＤＮＡを
プラスミドｐＯＪ３１３の構築に用いた。
９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ］によって修正が加えられた以下の方法に従って、
細胞からプラスミドＤＮＡを得、該プラスミドＤＮＡを
プラスミドｐＯＪ３１３の構築に用いた。
縮小スケールで行ったことと、超遠心工程をフェノール
抽出とそれに続（クロロホルム抽出に代えたこと以外は
、上記と同一の方法を用いて、大腸菌に１２ ＲＲＩ△
Ｍ１５／ｐＯＪ：３１３形質転換体の同定に用いるプラ
スミドＤＮＡを調製した。
抽出とそれに続（クロロホルム抽出に代えたこと以外は
、上記と同一の方法を用いて、大腸菌に１２ ＲＲＩ△
Ｍ１５／ｐＯＪ：３１３形質転換体の同定に用いるプラ
スミドＤＮＡを調製した。
４℃、４０００Ｘ１Ｆで１０分間遠心することによって
、定常期の大腸菌／ｐＯＪ１７１細胞（約５００酎）を
集め、その上清を捨てた。細胞ペレットを水冷のＳＴＥ
緩衝液［０，ＩＭ ＮａＣＱ： １０ｍＭトリスーＨＣ
ｌ２（ｐＨ７，８）：およびＩＩＩＭＥＤＴＡ］（１０
０，ｗｉ２）で洗浄した。細胞ペレットを洗浄した後、
このペレットを、ｌｉｙ／ｚｆｆリソチーム含有の溶液
１［５０１Ｍグルコース；２５肩ＭトリスーＨＣｌ２（
ｐＨ８，０）：およびｌＯ＋ＭＥＤＴＡ］（１０１１２
）に再懸濁し、室温で１０分間放置した。
、定常期の大腸菌／ｐＯＪ１７１細胞（約５００酎）を
集め、その上清を捨てた。細胞ペレットを水冷のＳＴＥ
緩衝液［０，ＩＭ ＮａＣＱ： １０ｍＭトリスーＨＣ
ｌ２（ｐＨ７，８）：およびＩＩＩＭＥＤＴＡ］（１０
０，ｗｉ２）で洗浄した。細胞ペレットを洗浄した後、
このペレットを、ｌｉｙ／ｚｆｆリソチーム含有の溶液
１［５０１Ｍグルコース；２５肩ＭトリスーＨＣｌ２（
ｐＨ８，０）：およびｌＯ＋ＭＥＤＴＡ］（１０１１２
）に再懸濁し、室温で１０分間放置した。
次いで、リソチーム処理した細胞に溶液２［’０．２Ｎ
ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ］（２０ｆｆｉ２）を加え、
この溶液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を
氷上で１０分間インキュベートした。
ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ］（２０ｆｆｉ２）を加え、
この溶液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を
氷上で１０分間インキュベートした。
この溶菌細胞混合物に水冷の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，８）（１５ｍｌを加え、溶液を反転混合した。この
溶液を水上で６０分間インキュベートした。この３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液は、同量の３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナトリ
ウムとを混合して調製した。
４，８）（１５ｍｌを加え、溶液を反転混合した。この
溶液を水上で６０分間インキュベートした。この３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液は、同量の３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナトリ
ウムとを混合して調製した。
この溶菌細胞混合物を、超遠心型中、４°Ｃｌ２Ｏ，０
０Ｏｒｐｍで２０分間遠心した。上清（約３６ｘＱ）を
回収し、エタノール（２，５容量）を加えて混合し、得
られた溶液を氷上に１５分間放置した。
０Ｏｒｐｍで２０分間遠心した。上清（約３６ｘＱ）を
回収し、エタノール（２，５容量）を加えて混合し、得
られた溶液を氷上に１５分間放置した。
室温、１２，０００Ｘ９で３０分間遠心することによっ
てプラスミドＤＮＡを集めた。上清を捨て、ＤＮＡペレ
ットを７０％エタノールにより室温で洗浄した。エタノ
ール洗液をデカンテーションし、ペレットを真空デシケ
ータ−中で乾燥した。次いで、このペレットをＴＥ緩衝
液［１０ｍＭトリスーＨＣ（（ｐＨ８，０）および１
ｚＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ］（８ｘｆ２）ｌ：再懸濁した。
てプラスミドＤＮＡを集めた。上清を捨て、ＤＮＡペレ
ットを７０％エタノールにより室温で洗浄した。エタノ
ール洗液をデカンテーションし、ペレットを真空デシケ
ータ−中で乾燥した。次いで、このペレットをＴＥ緩衝
液［１０ｍＭトリスーＨＣ（（ｐＨ８，０）および１
ｚＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ］（８ｘｆ２）ｌ：再懸濁した。
ＤＮＡ溶液にＣｓＣｌ２（８９）を加えた。各１０ｘＣ
のＣ５ＣＱ−ＤＮＡ溶液に１０ ｍｙ／ ｄの臭化エチ
ジウム水溶液（約０．８ｍのを加えた。最終の溶液密度
は約０．７６１ ｉｉ／ｘ（！であり、臭化エチジウム
濃度は約８００μ９／ｚ（ｌであった。この溶液を超遠
心管に移し、その上部を０．７６１９／＋ｖＣのＣｓＣ
ｇを含有するＴＥ緩衝液で満たし、封をし、そして２０
°Ｃ１４５，ＯＯＯｒｐｍで２４時間遠心した。遠心後
、常光のもとて２つのＤＮＡバンドが見え、Ｕ■光では
さらに顕著となった。管からキャップを取った後、遠心
管の側部から挿入した＃２１皮下注射針の注射器を用い
て低い方のＤＮＡバンドを取った。
のＣ５ＣＱ−ＤＮＡ溶液に１０ ｍｙ／ ｄの臭化エチ
ジウム水溶液（約０．８ｍのを加えた。最終の溶液密度
は約０．７６１ ｉｉ／ｘ（！であり、臭化エチジウム
濃度は約８００μ９／ｚ（ｌであった。この溶液を超遠
心管に移し、その上部を０．７６１９／＋ｖＣのＣｓＣ
ｇを含有するＴＥ緩衝液で満たし、封をし、そして２０
°Ｃ１４５，ＯＯＯｒｐｍで２４時間遠心した。遠心後
、常光のもとて２つのＤＮＡバンドが見え、Ｕ■光では
さらに顕著となった。管からキャップを取った後、遠心
管の側部から挿入した＃２１皮下注射針の注射器を用い
て低い方のＤＮＡバンドを取った。
水飽和の１−ブタノールで数回抽出することによってプ
ラスミドＤＮＡの溶液から臭化エチジウムを除去し、Ｔ
Ｅ緩衝液に対して透析することによってＣｓＣｇを除去
した。緩衝フェノール、次いでクロロホルムで抽出した
後、ＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、そ
して乾燥した。この方法によって、約０．５ａ＋ｙのプ
ラスミドｐＯＪ１７１ＤＮＡを得ることができた。プラ
スミドｐＯＪ１７１の制限部位および機能地図を添付の
第１図に示す。
ラスミドＤＮＡの溶液から臭化エチジウムを除去し、Ｔ
Ｅ緩衝液に対して透析することによってＣｓＣｇを除去
した。緩衝フェノール、次いでクロロホルムで抽出した
後、ＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、そ
して乾燥した。この方法によって、約０．５ａ＋ｙのプ
ラスミドｐＯＪ１７１ＤＮＡを得ることができた。プラ
スミドｐＯＪ１７１の制限部位および機能地図を添付の
第１図に示す。
実施例２ プラスミドｐＯＪ１５９の単離ストレプトマ
イセス・グリセオフスカスＣ５８１／ｐＯＪ １５９（
ＮＲＲＬ １８０９０）の約ＩＯ＠の胞子を、２５μ
９／ｘ（ｌチオストレプトンを含有するトリブチカーゼ
・ソイ・ブロス（Ｔ Ｓ Ｂ）［２１０３１メアリーラ
ンド、コカイスビル、ピー・オー・ボックス２４３のパ
ルティモア・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｂａｌ
ｔｉｍｏｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）（ＢＢＬ）からＴＳＢを入手して３０９／
ＱのＴＳＢを作った］（ｌ ＯｘＱ＞中に接種し、培養
物が初期定常期になるまで２９°Ｃで増殖させた。次い
で、この培養物をホモジナイズし、ホモジナイズされた
培養物（５肩のを用いて、チオストレプトンを含有する
ＴＳＢ（１００＋＆）に接種した。ストレプトマイセス
・グリセオフスカスＣ５８１／ｐＯＪ１５９細胞が定常
期に達するまで、培養物（１００ｊ１１２）を２９°Ｃ
でインキュベートした。
イセス・グリセオフスカスＣ５８１／ｐＯＪ １５９（
ＮＲＲＬ １８０９０）の約ＩＯ＠の胞子を、２５μ
９／ｘ（ｌチオストレプトンを含有するトリブチカーゼ
・ソイ・ブロス（Ｔ Ｓ Ｂ）［２１０３１メアリーラ
ンド、コカイスビル、ピー・オー・ボックス２４３のパ
ルティモア・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｂａｌ
ｔｉｍｏｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）（ＢＢＬ）からＴＳＢを入手して３０９／
ＱのＴＳＢを作った］（ｌ ＯｘＱ＞中に接種し、培養
物が初期定常期になるまで２９°Ｃで増殖させた。次い
で、この培養物をホモジナイズし、ホモジナイズされた
培養物（５肩のを用いて、チオストレプトンを含有する
ＴＳＢ（１００＋＆）に接種した。ストレプトマイセス
・グリセオフスカスＣ５８１／ｐＯＪ１５９細胞が定常
期に達するまで、培養物（１００ｊ１１２）を２９°Ｃ
でインキュベートした。
Ｂ、プラスミドの単離 ４
細胞を集めて、１０．３％スクロース溶液で１回洗浄し
た。次いで、１０．３％スクロース（２４Ｘａ＞に細胞
を懸濁し、５Ｘ リソチーム溶液［１２５ｇＭ）リス−
ＨＣｇ（ｐＨ８） ： １２５ ｙＭ Ｎａ！ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）； １０ｍ９／ｘ（ｌリソチーム；および１
０．３％スクロース］（６ｘｅ）を添加した。この溶液
を混合し、次いで、３０°Ｃで３０〜６０分間インキュ
ベートした。次いで、５０℃に予熱した０゜３Ｍ Ｎａ
ＯＨ，１％ＳＤＳの溶液（約１８３＋のを加えて混合し
、そして得られた混合物を８０’Ｃで１０分間インキュ
ベートした。次いで、混合物を室温まで冷却し、Ｈ＝Ｏ
（２００ＪＩρ）にフェノール（５００ｇ）およびｃＨ
ｃｃ、＋（５００９）を混合して得た溶１（ｆｆｉ（１
２１Ｒ＆）を加えて、細胞抽出物と充分に混合した。６
０００〜８０００ｒｐｍで１０分間遠心することによっ
て相分離させ、得られた上層（約４５順）を清浄なびん
に移した。
た。次いで、１０．３％スクロース（２４Ｘａ＞に細胞
を懸濁し、５Ｘ リソチーム溶液［１２５ｇＭ）リス−
ＨＣｇ（ｐＨ８） ： １２５ ｙＭ Ｎａ！ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）； １０ｍ９／ｘ（ｌリソチーム；および１
０．３％スクロース］（６ｘｅ）を添加した。この溶液
を混合し、次いで、３０°Ｃで３０〜６０分間インキュ
ベートした。次いで、５０℃に予熱した０゜３Ｍ Ｎａ
ＯＨ，１％ＳＤＳの溶液（約１８３＋のを加えて混合し
、そして得られた混合物を８０’Ｃで１０分間インキュ
ベートした。次いで、混合物を室温まで冷却し、Ｈ＝Ｏ
（２００ＪＩρ）にフェノール（５００ｇ）およびｃＨ
ｃｃ、＋（５００９）を混合して得た溶１（ｆｆｉ（１
２１Ｒ＆）を加えて、細胞抽出物と充分に混合した。６
０００〜８０００ｒｐｍで１０分間遠心することによっ
て相分離させ、得られた上層（約４５順）を清浄なびん
に移した。
次に、この上清に３Ｍ Ｎａ０Ａｃ（４，５＋０および
インプロパツール（５０Ｊｌｅ）を加え、この溶液を混
合し、室温で３０分間放置した。次いで、溶液を８００
Ｏｒｐｍで３０分間遠心し、その上清を捨てた。Ｃ５
Ｃｆｆ（９，５９）を含有しているＴＥ緩衝液［１０＋
Ｍトリス−ＨＣρ（ｐＨ８）およびｌｘＭＥＤＴ Ａ］
（−１０ｘ（１”）にベレットを再懸濁した。この溶液
に５ ｘｓ／ ｚＱ臭化エチジウム溶液（約１１）を添
加し、最終容量を１２．５＋１２にした。次いで、この
溶液を、角度を固定した超遠心ローター中、２０°Ｃ１
５２，ＯＯＯｒｐｍで４８時間遠心した。プラスミドバ
ンドを含有する分画を、２０Ｘ ＳＳＣ［０゜３ＭＮａ
ＣＱおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムコで飽和したイ
ソプロパツールで５回抽出し、臭化エチジウムを除去し
た。抽出の後、試料をＨ，０（１０００容量）に対して
、次いでＴＥ緩衝液（１５００容１りに対して透析した
。この方法によって、〜０．２μ９７μｇの濃度のプラ
スミドｐＯＪ１５９ ＤＮＡ（約１００μ９）が得う
レ、コレを４°Ｃで貯蔵した。プラスミドｐＯＪ１５９
の制限部位および機能地図を添付の第４図に示す。
インプロパツール（５０Ｊｌｅ）を加え、この溶液を混
合し、室温で３０分間放置した。次いで、溶液を８００
Ｏｒｐｍで３０分間遠心し、その上清を捨てた。Ｃ５
Ｃｆｆ（９，５９）を含有しているＴＥ緩衝液［１０＋
Ｍトリス−ＨＣρ（ｐＨ８）およびｌｘＭＥＤＴ Ａ］
（−１０ｘ（１”）にベレットを再懸濁した。この溶液
に５ ｘｓ／ ｚＱ臭化エチジウム溶液（約１１）を添
加し、最終容量を１２．５＋１２にした。次いで、この
溶液を、角度を固定した超遠心ローター中、２０°Ｃ１
５２，ＯＯＯｒｐｍで４８時間遠心した。プラスミドバ
ンドを含有する分画を、２０Ｘ ＳＳＣ［０゜３ＭＮａ
ＣＱおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムコで飽和したイ
ソプロパツールで５回抽出し、臭化エチジウムを除去し
た。抽出の後、試料をＨ，０（１０００容量）に対して
、次いでＴＥ緩衝液（１５００容１りに対して透析した
。この方法によって、〜０．２μ９７μｇの濃度のプラ
スミドｐＯＪ１５９ ＤＮＡ（約１００μ９）が得う
レ、コレを４°Ｃで貯蔵した。プラスミドｐＯＪ１５９
の制限部位および機能地図を添付の第４図に示す。
実施例３ プラスミドｐＯＪ３１３およびｐＯＪ３１３
Ａの構築 Ａ、プラスミドｐＯＪ１６０の単離 プラスミドｐＯＪ１６０は、ノーザン・リージョナル・
リサーチ・センターから取得番号ＮＲＲＬＢ−１８０８
８のもとて入手可能な大腸菌に１２ ＪＭ１０９から
得ることができる。大腸菌に１２ ＪＭ１０９／ｐＯ
Ｊ １６０の凍結乾燥品を、２００μｇ／ＩＩＩＱアブ
ラマイシン含有のし一寒天プレートで培養し、この菌株
の単一コロニー単離体を得た。このコロニーを２００μ
９／ ｙｒ（ｌアプラマイシン含有のＬグロス（約５０
０ｊ１ｇ）に接種し、細胞が定常期に達するまで、この
培養物を曝気しながら３７℃でインキュベートした。
Ａの構築 Ａ、プラスミドｐＯＪ１６０の単離 プラスミドｐＯＪ１６０は、ノーザン・リージョナル・
リサーチ・センターから取得番号ＮＲＲＬＢ−１８０８
８のもとて入手可能な大腸菌に１２ ＪＭ１０９から
得ることができる。大腸菌に１２ ＪＭ１０９／ｐＯ
Ｊ １６０の凍結乾燥品を、２００μｇ／ＩＩＩＱアブ
ラマイシン含有のし一寒天プレートで培養し、この菌株
の単一コロニー単離体を得た。このコロニーを２００μ
９／ ｙｒ（ｌアプラマイシン含有のＬグロス（約５０
０ｊ１ｇ）に接種し、細胞が定常期に達するまで、この
培養物を曝気しながら３７℃でインキュベートした。
上記実施例１の方法に従って、細胞からプラスミドＤＮ
Ａを得て、このプラスミドＤＮＡをプラスミドｐＯＪ３
１３の構築に用いた。この方法によって、プラスミドｐ
ＯＪ １６０ ＤＮＡ（約０．５ｘ９）を得ることが
できた。プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機能
地図を添付の第２図に示す。
Ａを得て、このプラスミドＤＮＡをプラスミドｐＯＪ３
１３の構築に用いた。この方法によって、プラスミドｐ
ＯＪ １６０ ＤＮＡ（約０．５ｘ９）を得ることが
できた。プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機能
地図を添付の第２図に示す。
Ｂ、プラスミドｐＯＪ３１３およびｐＯＪ３１３Ａの最
終的な構築 ブラＸミ）’ｐＯＪ １６０ ＤＮＡ（約１０ｕ９；
１０μ（２）を、１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液［１，０Ｍト
リス−ＨＣ（２（ｐＨ７，５）： ０．５Ｍ ＮａＣｌ
２； ５０＊ＭＭ ｇ ＣＱ ｔ ；および１１９／贋
ジＢ Ｓ Ａ］（２μの、Ｈ２Ｃ（６μの、および制限
酵素ＥｃｏＲＩ Ｅ２ｔＩＱ ： 〜３０単位（本明細
書中の単位の定義は、特記しない限り、０１９１５−９
９９０マサチユーセツツ、ビバリー、トウザー・ロード
３２番の二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の定義と一致する
）］に加えた。得られた反応液を３７°Ｃｔ’２時Ｍイ
ンキュベートした。反応混合物の酢酸ナトリウム（Ｎａ
ＯＡｃ）濃度を０．３０Ｍに調節し、エタノール（２，
５容量）を添加し、反応混合物を一７０’Ｃに冷却し、
そして遠心して沈澱したＤＮＡをペレットにすることに
よって、ＥｃＯＲ１消化のプラスミドｐＯＪ １６０
ＤＮＡを集めた。このＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＯ
Ｊ１６０ＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液［ＩＱｘＭトリ
ス−ＨＣ１２（ｐＨ８，０）およびｌｘＭ ＥＤＴＡ］
（４００μのに再懸濁した。ＤＮＡ溶液に細菌アルカリ
ホスファターゼ［０６５０６コネチカツト、ニュー・ヘ
イブン、ピー・オー・ボックス１５６５のインターナシ
ョナル・バイオテクノロジー・インコーホレイテッド（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、 Ｉｎｃ、）］（約１μｇ、０．１単位）を添
加し、この反応液を６゜５°Ｃで１時間インキュベート
した。反応混合物をフェ／−ル：クロロホルム（１：
１）溶液（４００μので抽出し、次いで、クロロホルム
（４００μＱ）で抽出した。上記のエタノール沈澱およ
び遠心に従って、ＥｃｏＲＩ消化して脱ホスホリル化し
たプラスミドｐＯＪ １６０ ＤＮＡを回収し、この
ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（１０μのに再懸濁した。
終的な構築 ブラＸミ）’ｐＯＪ １６０ ＤＮＡ（約１０ｕ９；
１０μ（２）を、１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液［１，０Ｍト
リス−ＨＣ（２（ｐＨ７，５）： ０．５Ｍ ＮａＣｌ
２； ５０＊ＭＭ ｇ ＣＱ ｔ ；および１１９／贋
ジＢ Ｓ Ａ］（２μの、Ｈ２Ｃ（６μの、および制限
酵素ＥｃｏＲＩ Ｅ２ｔＩＱ ： 〜３０単位（本明細
書中の単位の定義は、特記しない限り、０１９１５−９
９９０マサチユーセツツ、ビバリー、トウザー・ロード
３２番の二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の定義と一致する
）］に加えた。得られた反応液を３７°Ｃｔ’２時Ｍイ
ンキュベートした。反応混合物の酢酸ナトリウム（Ｎａ
ＯＡｃ）濃度を０．３０Ｍに調節し、エタノール（２，
５容量）を添加し、反応混合物を一７０’Ｃに冷却し、
そして遠心して沈澱したＤＮＡをペレットにすることに
よって、ＥｃＯＲ１消化のプラスミドｐＯＪ １６０
ＤＮＡを集めた。このＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＯ
Ｊ１６０ＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液［ＩＱｘＭトリ
ス−ＨＣ１２（ｐＨ８，０）およびｌｘＭ ＥＤＴＡ］
（４００μのに再懸濁した。ＤＮＡ溶液に細菌アルカリ
ホスファターゼ［０６５０６コネチカツト、ニュー・ヘ
イブン、ピー・オー・ボックス１５６５のインターナシ
ョナル・バイオテクノロジー・インコーホレイテッド（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、 Ｉｎｃ、）］（約１μｇ、０．１単位）を添
加し、この反応液を６゜５°Ｃで１時間インキュベート
した。反応混合物をフェ／−ル：クロロホルム（１：
１）溶液（４００μので抽出し、次いで、クロロホルム
（４００μＱ）で抽出した。上記のエタノール沈澱およ
び遠心に従って、ＥｃｏＲＩ消化して脱ホスホリル化し
たプラスミドｐＯＪ １６０ ＤＮＡを回収し、この
ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（１０μのに再懸濁した。
１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液（１３μの、Ｈ３０（１３μ＋
２）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（４μ１２；〜６０単位
）に、ＴＥ緩衝液（１００μｍ２）中のプラスミドｐＯ
Ｊ１７１（約１０μ９）を添加した。得られた反応液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。上記のようにし
て、反応混合物を抽出し、ＤＮＡを回収した。−ＤＮＡ
ペレットを再溶解し、アガロースゲルにかけ、プラスミ
ドｐＯＪ１７１の、所望の〜３．８ｋｂ、ｃａｒＥ含有
ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（約〜０，５μｇ）をこの
ゲルから精製し、ライゲーションの準備をした。
２）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（４μ１２；〜６０単位
）に、ＴＥ緩衝液（１００μｍ２）中のプラスミドｐＯ
Ｊ１７１（約１０μ９）を添加した。得られた反応液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。上記のようにし
て、反応混合物を抽出し、ＤＮＡを回収した。−ＤＮＡ
ペレットを再溶解し、アガロースゲルにかけ、プラスミ
ドｐＯＪ１７１の、所望の〜３．８ｋｂ、ｃａｒＥ含有
ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（約〜０，５μｇ）をこの
ゲルから精製し、ライゲーションの準備をした。
〜３．８ｋｂ ＥｃｏＲｒ制限フラグメント（１０Ｉｉ
ρ；〜０．５μ９）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液［６６０Ｋ
ＭトリスーＨＣ（２（＋）Ｈ８）； ６６ｘＭ ＭｇＣ
（２ｔ； １０ｘＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、お
よびＩＯ肩ＭＡＴＰ］（２μｆ２）およびＨｔＯ（６ｕ
（１）に、ＥｃｏＲＩ消化の脱ホスホリル化プラスミド
ｐＯＪ １６０ ＤＮＡ（１μＱ）を添加した。この
ＤＮＡの溶液にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（約１μｇ；〜
１００単位）を添加し、得られた反応液を１５°Ｃで一
夜（〜１６時間）インキュベートした。ライゲートした
ＤＮＡは、所望のプラスミドｐＯＪ３１３を含有してい
た。プラスミドｐｏ Ｊ ３１３の制限部位および機能
地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐＯＪ１７１の
〜３．８ｋｂのｃａｒ Ｅ遺伝子含有ＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントは２つの配向のどちらででもプラスミドｐＯ
Ｊ１６０に挿入することができるので、このライゲーシ
ョンによって、プラスミドｐｏ Ｊ ３１３とはｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有するＥｃｏＲｆ制限フラグメントの配向
だけが異なっているプラスミドｐＯＪ３１３Ａも得られ
る。
ρ；〜０．５μ９）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液［６６０Ｋ
ＭトリスーＨＣ（２（＋）Ｈ８）； ６６ｘＭ ＭｇＣ
（２ｔ； １０ｘＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、お
よびＩＯ肩ＭＡＴＰ］（２μｆ２）およびＨｔＯ（６ｕ
（１）に、ＥｃｏＲＩ消化の脱ホスホリル化プラスミド
ｐＯＪ １６０ ＤＮＡ（１μＱ）を添加した。この
ＤＮＡの溶液にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（約１μｇ；〜
１００単位）を添加し、得られた反応液を１５°Ｃで一
夜（〜１６時間）インキュベートした。ライゲートした
ＤＮＡは、所望のプラスミドｐＯＪ３１３を含有してい
た。プラスミドｐｏ Ｊ ３１３の制限部位および機能
地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐＯＪ１７１の
〜３．８ｋｂのｃａｒ Ｅ遺伝子含有ＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントは２つの配向のどちらででもプラスミドｐＯ
Ｊ１６０に挿入することができるので、このライゲーシ
ョンによって、プラスミドｐｏ Ｊ ３１３とはｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有するＥｃｏＲｆ制限フラグメントの配向
だけが異なっているプラスミドｐＯＪ３１３Ａも得られ
る。
プラスミドｐＯＪ１６０のＥｃｏＲ１部位はポリリンカ
ー内に存在しており、このリンカ−はそれ自体が１ａｃ
Ｚ α−フラグメントをコードしているＤＮＡ配列部
分を形成している。大腸菌６Ｍ１５株、例えば大腸菌に
１２ ＲＲＩ△Ｍ１５（ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０；
１９８３年５月２７日寄託）において１ａｃＺ α
−フラグメントが発現すると、機能的なβ−ガラクトシ
ダーゼ酵素を産生ずるこの菌株の能力が回復する。した
がって、プラスミドｐＯＪ１６０は、大腸菌に１２
ＲＲＩ△Ｍ１５菌株にβ−ガラクトシダーゼ活性を復活
させることができる。しかし、プラスミドｐＯＪ３１３
を構築するときのように、プラスミドｐＯＪ１６０のポ
リリンカーの制限部位にＤＮＡを押入すると、１ａｃＺ
α−フラグメントの暗号配列が破壊され、同時に、
ΔＭ１５突然変異を補足するプラスミドｐＯＪＩ６０誘
導体の能力が破壊される。
ー内に存在しており、このリンカ−はそれ自体が１ａｃ
Ｚ α−フラグメントをコードしているＤＮＡ配列部
分を形成している。大腸菌６Ｍ１５株、例えば大腸菌に
１２ ＲＲＩ△Ｍ１５（ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０；
１９８３年５月２７日寄託）において１ａｃＺ α
−フラグメントが発現すると、機能的なβ−ガラクトシ
ダーゼ酵素を産生ずるこの菌株の能力が回復する。した
がって、プラスミドｐＯＪ１６０は、大腸菌に１２
ＲＲＩ△Ｍ１５菌株にβ−ガラクトシダーゼ活性を復活
させることができる。しかし、プラスミドｐＯＪ３１３
を構築するときのように、プラスミドｐＯＪ１６０のポ
リリンカーの制限部位にＤＮＡを押入すると、１ａｃＺ
α−フラグメントの暗号配列が破壊され、同時に、
ΔＭ１５突然変異を補足するプラスミドｐＯＪＩ６０誘
導体の能力が破壊される。
β−ガラクトシダーゼは、無色化合物であるＸ−ガル、
即ち５〜ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドをインジゴ色の生成物に加水分解
することができ、したがって、出発プラスミドｐＯＪ１
６０を含有する形質転換体と、プラスミドｐＯＪ３１３
のようなプラスミドｐＯＪ１６０誘導体を含有する形質
転換体とを識別する好都合なスクリーニング法を可能に
する。
即ち５〜ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドをインジゴ色の生成物に加水分解
することができ、したがって、出発プラスミドｐＯＪ１
６０を含有する形質転換体と、プラスミドｐＯＪ３１３
のようなプラスミドｐＯＪ１６０誘導体を含有する形質
転換体とを識別する好都合なスクリーニング法を可能に
する。
形質転換に対してコンピテントである大腸菌Ｋ１２ Ｒ
ＲＩ△Ｍ１５細胞を調製するため、ＮＲＲＬから人手し
た大腸菌に１２ ＲＲＩ△Ｍ１５の凍結乾燥品を復元し
て単一のコロニーを単離した。ＲＲＩ△Ｍ１５の単一コ
ロニー単離体１個をＬブロス（１０，ｗ１２）に接種し
、この培養物を曝気しながら３７°Ｃで一部インキユベ
ートした。この−夜培養物をＬブロス（２００ＭＱ）に
接種し、約０゜１の○Ｄ、ｓｏｎを有する培養物を得た
。Ｏ，Ｄ、、。。
ＲＩ△Ｍ１５細胞を調製するため、ＮＲＲＬから人手し
た大腸菌に１２ ＲＲＩ△Ｍ１５の凍結乾燥品を復元し
て単一のコロニーを単離した。ＲＲＩ△Ｍ１５の単一コ
ロニー単離体１個をＬブロス（１０，ｗ１２）に接種し
、この培養物を曝気しながら３７°Ｃで一部インキユベ
ートした。この−夜培養物をＬブロス（２００ＭＱ）に
接種し、約０゜１の○Ｄ、ｓｏｎを有する培養物を得た
。Ｏ，Ｄ、、。。
が約０．６になるまで、この培養物を曝気しながら３７
℃でインキコベートした。４°Ｃ，４０００Ｘ９で１０
分間遠心することによって培養物を集め、冷５０ｙ、Ｍ
ＣａＣ（２ｔ（１００ｘＱ）中に再懸濁し、氷上で１
５〜３０分間インキュベートした。
℃でインキコベートした。４°Ｃ，４０００Ｘ９で１０
分間遠心することによって培養物を集め、冷５０ｙ、Ｍ
ＣａＣ（２ｔ（１００ｘＱ）中に再懸濁し、氷上で１
５〜３０分間インキュベートした。
遠心して細胞をもう一度集め、２０％グリセリンを含有
する冷５ Ｑ ｘＭ ＣａＣＱｔ（１０ｆｆ１２）中に
再懸濁した。上記で調製したライゲートＤＮＡに細胞の
一部（２００μのを添加した。細胞−ＤＮＡ混合物を氷
上で１時間インキュベートし、遠心し、容ｆｆ１１．！
Ｍ２の管中で細胞ペレットをＬブロス（０゜５ ＩｔＱ
）に再懸濁し、曝気しながら３７°Ｃで半時間インキュ
ベートした。
する冷５ Ｑ ｘＭ ＣａＣＱｔ（１０ｆｆ１２）中に
再懸濁した。上記で調製したライゲートＤＮＡに細胞の
一部（２００μのを添加した。細胞−ＤＮＡ混合物を氷
上で１時間インキュベートし、遠心し、容ｆｆ１１．！
Ｍ２の管中で細胞ペレットをＬブロス（０゜５ ＩｔＱ
）に再懸濁し、曝気しながら３７°Ｃで半時間インキュ
ベートした。
アブラマイシン（２００μ９／ｊ！Ｑ）、Ｘ−ガル（４
０ｐｉ／ ｚ１２）、およびＩＰＴＧ（４０μ９／籾）
を含有するＬ−寒天プレートで形質転換混合物の一部を
培養した。Ｉ ＰＴＧは、プラスミドｐＯＪ１６０に存
在するＩａｃプロモーターを抑制解除するように働く。
０ｐｉ／ ｚ１２）、およびＩＰＴＧ（４０μ９／籾）
を含有するＬ−寒天プレートで形質転換混合物の一部を
培養した。Ｉ ＰＴＧは、プラスミドｐＯＪ１６０に存
在するＩａｃプロモーターを抑制解除するように働く。
このプレートを３７°Ｃで一部インキユベートした。大
腸菌Ｋ１２ ＲＲＩ△Ｍ１５／ｐＯＪ１６０のように
、挿入が為されていないプラスミドを含有しているコロ
ニーはプレート上で青く見える。大腸菌Ｋ１２ ＲＲ
Ｉ△Ｍ１５／ｐＯＪ３１３のように、挿入が為されたプ
ラスミドを含有しているコロニーは白色である。いくつ
かのアブラマイシン耐性の白色コロニーを選択し、次い
で、これらプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってス
クリーニングした。ＡｈａｌｌｌおよびＸｂａＩのよう
な制限酵素による消化によって、不要なベクターと、プ
ラスミドｐｏ Ｊ ３１３およびｐｏ Ｊ ３１３Ａと
を区別した。これらの部位は、プラスミドｐＫＣ４６２
Ａから誘導されたプラスミドｐＯＪ１７１の部分には存
在するが、ｐＯＪ１７１のストレプトマイセス・サーモ
トレランスＤＮＡ挿入部分には全（存在せず、ｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有している。上述のプラスミドｐＯＪ１６
０ＤＮＡを１１する方法に従い、大腸菌に１２ ＲＲＩ
△Ｍ１５／ｐｏ Ｊ ３１３形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを得た。下記実施例５および６の記載に従い、プ
ラスミドｐＯＪ３１３ ＤＮＡを用いてストレプトマ
イセスを形質転換することができる。
腸菌Ｋ１２ ＲＲＩ△Ｍ１５／ｐＯＪ１６０のように
、挿入が為されていないプラスミドを含有しているコロ
ニーはプレート上で青く見える。大腸菌Ｋ１２ ＲＲ
Ｉ△Ｍ１５／ｐＯＪ３１３のように、挿入が為されたプ
ラスミドを含有しているコロニーは白色である。いくつ
かのアブラマイシン耐性の白色コロニーを選択し、次い
で、これらプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってス
クリーニングした。ＡｈａｌｌｌおよびＸｂａＩのよう
な制限酵素による消化によって、不要なベクターと、プ
ラスミドｐｏ Ｊ ３１３およびｐｏ Ｊ ３１３Ａと
を区別した。これらの部位は、プラスミドｐＫＣ４６２
Ａから誘導されたプラスミドｐＯＪ１７１の部分には存
在するが、ｐＯＪ１７１のストレプトマイセス・サーモ
トレランスＤＮＡ挿入部分には全（存在せず、ｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有している。上述のプラスミドｐＯＪ１６
０ＤＮＡを１１する方法に従い、大腸菌に１２ ＲＲＩ
△Ｍ１５／ｐｏ Ｊ ３１３形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを得た。下記実施例５および６の記載に従い、プ
ラスミドｐＯＪ３１３ ＤＮＡを用いてストレプトマ
イセスを形質転換することができる。
実施例４ プラスミドｐＯＪ２３０およヒｐＯＪ２３１
の構築 プラスミドｐＯＪ１６０のｌａｃ Ｚ α−フラグメ
ントをコードしているＤＮＡ中のポリリンカーは、Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素開裂部位を含んでいる。制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１でプラスミドｐＯＪ１６０を消化し、アルカリホス
ファターゼで処理し、プラスミドｐＯＪ１５９の〜２．
４ ｋｂＳｃａｒＥ含有ＢａｍＨＩ制限フラグメントと
ライゲートした。このライゲーションによって、プラス
ミドｐｏ Ｊ ２３０（第５図）およびｐＯＪ２３１が
得られた。実施例３記載のように、ライゲートされたＤ
ＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換体を分析し
た。
の構築 プラスミドｐＯＪ１６０のｌａｃ Ｚ α−フラグメ
ントをコードしているＤＮＡ中のポリリンカーは、Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素開裂部位を含んでいる。制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１でプラスミドｐＯＪ１６０を消化し、アルカリホス
ファターゼで処理し、プラスミドｐＯＪ１５９の〜２．
４ ｋｂＳｃａｒＥ含有ＢａｍＨＩ制限フラグメントと
ライゲートした。このライゲーションによって、プラス
ミドｐｏ Ｊ ２３０（第５図）およびｐＯＪ２３１が
得られた。実施例３記載のように、ライゲートされたＤ
ＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換体を分析し
た。
実施例５ ｃａｒＥ遺伝子を含有するベクターによる
ストレプトマイセス・アンボファシエンスの形質転換 Ａ、溶液のリスト 以下に示した溶液は実施例中で引用されるものであり、
ここに明示する。
ストレプトマイセス・アンボファシエンスの形質転換 Ａ、溶液のリスト 以下に示した溶液は実施例中で引用されるものであり、
ここに明示する。
１、Ｐ培地（〜ｔｏｏｘｃ）：
成 分 量スクロース
１０．３９に、Ｓ○、
０．０２５９微量元素溶液（下
記２参照）０，２戻ＱＭ ｇ ＣＱ ｔ・６Ｈｔ○
０．２０３９水
８ｏ靜オートクレーブで滅菌した後、下
記成分を追加する。
１０．３９に、Ｓ○、
０．０２５９微量元素溶液（下
記２参照）０，２戻ＱＭ ｇ ＣＱ ｔ・６Ｈｔ○
０．２０３９水
８ｏ靜オートクレーブで滅菌した後、下
記成分を追加する。
ＫＨｔＰＯ４（０，５％） １ｍ１２Ｃ
ａＣＬ ・２ＨｒＯ（３−６８％） １０ｚｆｆ［
Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルー２−アミ
ノエタンスルポン 酸コ、”ＴＥＳ″緩衝液、０．２５Ｍ （ｐＨ７，２） １０＋（１２、
微量元素溶液（〜１の： 成 分 １ＺｎＣＱ＊
４０ｍ９ ＦｅＣＱ３・６ＨｔＯ２００’９ ＣｕＣＩ２ｓ” ２１（ｔｏ １０Ｔ１ｒ９Ｍｎ
Ｃｆｆｔ ・ ４ Ｈｔｏ
１ ０ ｍ９ＮａｔＢ４０７−１０ＨｔＯ
Ｉ Ｏｙ９（ＮＨ４）８ＭＯ？Ｏｔ４・４Ｈｔｏ １
０１１９Ｈ！Ｏ１１ ３、Ｒ２再生培地（〜１ｇ）： 成 分 量 ・スクロ
ース １０３９Ｋ ｔ ｓ ｏ
−０，２５９ 微量元素溶液 ２舷Ｍ ｇ Ｃ
（１１・６Ｈ，０１０，ｌ ２９グルコース
１０ｇＬ−アスパラギン・ＩＨ，０２
，０９ カザミノ酸 ０．１９寒天
２２９これに水を加えて
全量を７００＋Ｑとする。
ａＣＬ ・２ＨｒＯ（３−６８％） １０ｚｆｆ［
Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルー２−アミ
ノエタンスルポン 酸コ、”ＴＥＳ″緩衝液、０．２５Ｍ （ｐＨ７，２） １０＋（１２、
微量元素溶液（〜１の： 成 分 １ＺｎＣＱ＊
４０ｍ９ ＦｅＣＱ３・６ＨｔＯ２００’９ ＣｕＣＩ２ｓ” ２１（ｔｏ １０Ｔ１ｒ９Ｍｎ
Ｃｆｆｔ ・ ４ Ｈｔｏ
１ ０ ｍ９ＮａｔＢ４０７−１０ＨｔＯ
Ｉ Ｏｙ９（ＮＨ４）８ＭＯ？Ｏｔ４・４Ｈｔｏ １
０１１９Ｈ！Ｏ１１ ３、Ｒ２再生培地（〜１ｇ）： 成 分 量 ・スクロ
ース １０３９Ｋ ｔ ｓ ｏ
−０，２５９ 微量元素溶液 ２舷Ｍ ｇ Ｃ
（１１・６Ｈ，０１０，ｌ ２９グルコース
１０ｇＬ−アスパラギン・ＩＨ，０２
，０９ カザミノ酸 ０．１９寒天
２２９これに水を加えて
全量を７００＋Ｑとする。
本酵母エキス ５９オート
クレーブ滅菌の前にｐＨを７．２に１節し、滅菌後に以
下の成分を追加する。
クレーブ滅菌の前にｐＨを７．２に１節し、滅菌後に以
下の成分を追加する。
ＫＨ，ＰＯ，（０，０５９／１００酎）１００ｊｌ１２
−ＣａｌＪ−（２，２２９／ １００ｊｌＣ）
１００ｘＱＴＥＳ緩衝液（５，７３９／ １００ｍ
Ｃ）（ｐＨ７，２） １００ｙ
ｔＱ本ストレプトマイセス・アンボファシェンス形質転
換体にのみ用いた。
−ＣａｌＪ−（２，２２９／ １００ｊｌＣ）
１００ｘＱＴＥＳ緩衝液（５，７３９／ １００ｍ
Ｃ）（ｐＨ７，２） １００ｙ
ｔＱ本ストレプトマイセス・アンボファシェンス形質転
換体にのみ用いた。
４、軟栄養寒天（ＳＮＡ、〜１り）；
成 分 量デイフコ・バ
クト・栄養ブロス ８ｇ寒天
５゜５、Ｒ２ＹＥ培地は２５％酵母エキス
２０ｘσを培地１１２当たりに添加したＲ２培地である
。
クト・栄養ブロス ８ｇ寒天
５゜５、Ｒ２ＹＥ培地は２５％酵母エキス
２０ｘσを培地１１２当たりに添加したＲ２培地である
。
６゜酵母二キスー麦芽エキス（ＹＥＭＥ、〜１の成
分 量酵母エキス
３ｇペプトン
５９麦芽エキス ３ｇグル
コース １０９７、ＹＥＭＥ−
１−３４％スクロース液体完全培地はスクロース３４０
ｙ／Ｑを含有するＹＥＭＥである。
分 量酵母エキス
３ｇペプトン
５９麦芽エキス ３ｇグル
コース １０９７、ＹＥＭＥ−
１−３４％スクロース液体完全培地はスクロース３４０
ｙ／Ｑを含有するＹＥＭＥである。
８、ＹＭＸ培地（〜ＩＱ）：
成 分 量酵母二キス
３９麦芽エキス
３ｇグルコース
２９寒天 ２０９９、Ｙ
ＭＸ寒天は０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、
０．２％デキストロースおよび２．０％寒天からなる。
３９麦芽エキス
３ｇグルコース
２９寒天 ２０９９、Ｙ
ＭＸ寒天は０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、
０．２％デキストロースおよび２．０％寒天からなる。
１０、Ｃ３Ｉ培地く〜１１２）：
成 分 量大豆粗びき
粉 １５ｇカゼイン
１９セレロース（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ）
２５ ｇ廃糖みつ
３９ＣａＣＯｓ ２．
５９チヤベツク・ミネラル混合ｉｆｔ ２ｍＱ
脱イオン水 １ｇ滅菌前にｐＨを
７．２に調節する。
粉 １５ｇカゼイン
１９セレロース（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ）
２５ ｇ廃糖みつ
３９ＣａＣＯｓ ２．
５９チヤベツク・ミネラル混合ｉｆｔ ２ｍＱ
脱イオン水 １ｇ滅菌前にｐＨを
７．２に調節する。
１１、チャペック（Ｃｚａｐｅｋ）・ミネラル混合液（
〜ＩＱ）： 成 分 １ＫＣ１２１０
０ｇ ＭｇＳＯ，−７Ｈ，０１００９ 脱イオン水 ９００酎濃塩酸２ｊｌ
＆を含有する脱イオン水１００ＪＩＱにＦｅ５０．・７
Ｈ−０（２９）を溶解する。この溶液を上記ＫＣｆ２／
Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ溶液に添加してチャベック・ミネ
ラル混合液を調製する。
〜ＩＱ）： 成 分 １ＫＣ１２１０
０ｇ ＭｇＳＯ，−７Ｈ，０１００９ 脱イオン水 ９００酎濃塩酸２ｊｌ
＆を含有する脱イオン水１００ＪＩＱにＦｅ５０．・７
Ｈ−０（２９）を溶解する。この溶液を上記ＫＣｆ２／
Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ溶液に添加してチャベック・ミネ
ラル混合液を調製する。
１２、ペンネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）寒天（〜ＩＱ）：
成 分 １脱イオン水
１００１００Ｏばれいしょデキスト
リン ｌ０９Ｎ−ＺアミンＡ
２９ギブゴ・バクト寒天
１５９ギブゴ・牛肉エキス
２ｇ酵母エキス １９チヤ
ペツク・ミネラル混合液２！ＩＱ １３、ＡＳＩ（１１２）： 成 分 ｌ酵母エキス
１９Ｌ−アラニン
０．２ｇＬ−アルギニン（遊離塩基）
０．２ｙＬ−アスパラギン
０．５ｇ可溶性デンプン ５９Ｎ
ａＣｆ２ ２．５９Ｎａｔ
Ｓ ０４ １０９ミーア・寒
天 ２０９これにＨ，Ｏを加えて全
型を１ｇとし、ＮａＯＨによってｐＨを７．５に調節す
る。
成 分 １脱イオン水
１００１００Ｏばれいしょデキスト
リン ｌ０９Ｎ−ＺアミンＡ
２９ギブゴ・バクト寒天
１５９ギブゴ・牛肉エキス
２ｇ酵母エキス １９チヤ
ペツク・ミネラル混合液２！ＩＱ １３、ＡＳＩ（１１２）： 成 分 ｌ酵母エキス
１９Ｌ−アラニン
０．２ｇＬ−アルギニン（遊離塩基）
０．２ｙＬ−アスパラギン
０．５ｇ可溶性デンプン ５９Ｎ
ａＣｆ２ ２．５９Ｎａｔ
Ｓ ０４ １０９ミーア・寒
天 ２０９これにＨ，Ｏを加えて全
型を１ｇとし、ＮａＯＨによってｐＨを７．５に調節す
る。
実質的に後述の方法に従って、プラスミドｐＯＪ１５９
、ｐＯＪ １７１ ｐＯＪ２３０ＳｐＯＪ ２３１およ
びｐＯＪ３１３を個々に用いて、ストレプトマイセス・
アンボファシエンスを形質転換した。
、ｐＯＪ １７１ ｐＯＪ２３０ＳｐＯＪ ２３１およ
びｐＯＪ３１３を個々に用いて、ストレプトマイセス・
アンボファシエンスを形質転換した。
ペンネット寒天上でストレプトマイセス・アンボファシ
エンスを培養し、３０°Ｃで約７２時間インキュベート
した。胞子をプレートからけずり取り、これをｒｓＢ（
１０１１Ｃ）に接種した。この培養物を空気−振盪イン
キュベーター中、３０°Ｃで〜３０時間インキュベート
した。この培養物ヲホモシナイズし、次いで、この培養
物（：Ｍ）を０．４％グリ／ン含有のＴＳＢ（１７ｘｄ
）に接種した。培養物を空気−振盪インキュベーター中
、３０’Ｃで約１６時間インキュベートした。この培養
物を再度ホモジナイズし、次いで、この培養物（３ｘｆ
２）を０．４％グリシン含有のＴＳＢ（１７，Ｗ＆）に
接種した。この培養物を３０’Ｃで約１６時間インキュ
ベートした。この培養物を再度ホモジナイズし、次いで
、菌糸体フラグメントを集めて、１０．３％スクロース
溶液で洗浄した。ｌａｙ／ｘ１２リソチーム含有のＰ培
地（２０ｍ１２）にこの菌糸体フラグメントを再懸濁し
、得られた溶液を室温で約１〜１゜５時間インキュベー
トした。このプロトプラスト化工程中は、ピペットによ
る吸い上げと戻しを行って細胞凝集を分散させた。プロ
トプラストを集めて、Ｐ培地で２回洗浄した。次いで、
このプロトプラストをＰ培地（ｌ ＯＭＱ＞に懸濁した
。通常、この方法により溶液２００μＱ当たり２〜５Ｘ
ＩＯ’のプロトプラストが得られる。
エンスを培養し、３０°Ｃで約７２時間インキュベート
した。胞子をプレートからけずり取り、これをｒｓＢ（
１０１１Ｃ）に接種した。この培養物を空気−振盪イン
キュベーター中、３０°Ｃで〜３０時間インキュベート
した。この培養物ヲホモシナイズし、次いで、この培養
物（：Ｍ）を０．４％グリ／ン含有のＴＳＢ（１７ｘｄ
）に接種した。培養物を空気−振盪インキュベーター中
、３０’Ｃで約１６時間インキュベートした。この培養
物を再度ホモジナイズし、次いで、この培養物（３ｘｆ
２）を０．４％グリシン含有のＴＳＢ（１７，Ｗ＆）に
接種した。この培養物を３０’Ｃで約１６時間インキュ
ベートした。この培養物を再度ホモジナイズし、次いで
、菌糸体フラグメントを集めて、１０．３％スクロース
溶液で洗浄した。ｌａｙ／ｘ１２リソチーム含有のＰ培
地（２０ｍ１２）にこの菌糸体フラグメントを再懸濁し
、得られた溶液を室温で約１〜１゜５時間インキュベー
トした。このプロトプラスト化工程中は、ピペットによ
る吸い上げと戻しを行って細胞凝集を分散させた。プロ
トプラストを集めて、Ｐ培地で２回洗浄した。次いで、
このプロトプラストをＰ培地（ｌ ＯＭＱ＞に懸濁した
。通常、この方法により溶液２００μＱ当たり２〜５Ｘ
ＩＯ’のプロトプラストが得られる。
１回の形質転換に対してプロトプラスト溶液約１５０μ
Ｑを用いた。このプロトプラストに、ライゲーションま
たはＴＥのいずれかの緩衝液（１０μｇ）中の形質転換
ＤＮＡ（約１μ９）を加え、次いで、Ｐ培地中５０％ポ
リエチレングリコール１０００（シグマ）（約１００μ
Ｑ）を加えてプロトプラストと混合した。細胞−ＤＮＡ
ｉ合物を渦動させ、次いで、Ｐ２培地（実施例５Ａ３）
で培養し、各プレートにＲ２修飾した軟寒天［１＆当た
りスクロース１０３９．０．５％寒天、ＭｇＣ（ｈ １
０ 、 ｌ ２９、ＣａＣｌ２，２．２２９およびＴ
Ｅ Ｓ ５．７２ｇ（ｐＨ７，２）］（〜３Ｉのと混合
した細胞（約０．ｌｘ＆）を接種した。
Ｑを用いた。このプロトプラストに、ライゲーションま
たはＴＥのいずれかの緩衝液（１０μｇ）中の形質転換
ＤＮＡ（約１μ９）を加え、次いで、Ｐ培地中５０％ポ
リエチレングリコール１０００（シグマ）（約１００μ
Ｑ）を加えてプロトプラストと混合した。細胞−ＤＮＡ
ｉ合物を渦動させ、次いで、Ｐ２培地（実施例５Ａ３）
で培養し、各プレートにＲ２修飾した軟寒天［１＆当た
りスクロース１０３９．０．５％寒天、ＭｇＣ（ｈ １
０ 、 ｌ ２９、ＣａＣｌ２，２．２２９およびＴ
Ｅ Ｓ ５．７２ｇ（ｐＨ７，２）］（〜３Ｉのと混合
した細胞（約０．ｌｘ＆）を接種した。
このプレートを３０°Ｃで一夜（〜１６時間）インキュ
ベートし、次いで、充分量のアブラマイシンまたはチオ
ストレプトンを含有するＲ２修飾の軟寒天（〜３ｘ（り
をかぶせ、拡散後の最終濃度２５μｇ／ Ｊ！１２を得
た。次いで、プレートを３０℃で約４日間インキュベー
トすると、コロニーが肉眼で見えるようになった。
ベートし、次いで、充分量のアブラマイシンまたはチオ
ストレプトンを含有するＲ２修飾の軟寒天（〜３ｘ（り
をかぶせ、拡散後の最終濃度２５μｇ／ Ｊ！１２を得
た。次いで、プレートを３０℃で約４日間インキュベー
トすると、コロニーが肉眼で見えるようになった。
Ｃ，プレート−プラグ検定
プラスミドｐＯＪ１５９、ｐＯＪ １７１ ｐＯＪ２３
０、ｐＯＪ２３１’１ｉｔｐＯＪ３１３を含有するスト
レプトマイセス・アンボファシエンス形質転換体を、Ｒ
２寒天再生プレートからＡＳＩおよび２５μ９／ｙ（ｌ
アブラマイシンを含有するプレートに移し、コロニーが
直径〜５ｊ！ＪＩとなるまで、３０℃で２〜３日間イン
キュベートした。次いで、滅菌移送管［スペクトラム・
メディカル・インダストリアル・インコーホレイテッド
（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｔ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌ、 Ｉｎｃ、）、ロス・アンジエルス、カリフォ
ルニア９００５４］を用いてコロニーをプラグ化し、こ
のプラグ（ｐｌｕｇ）をミクロコツカス・ルテウス（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ） Ｘ １６０
（Ａ Ｔ ＣＣ９３４１）を含有する軟寒天栄養ブロス
（デイフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン４
８２３２）を予め塗布しておいたトリジティカーゼ０ソ
イ０寒天（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ａｇａｒ
： Ｔ Ｓ Ａ）プレートに移した。このプレートを３
７°Ｃで１６〜２４時間インキュベートした。ミクロコ
ツカス・ルテウス（ＡＴＣＣ９３４１）は、スピラマイ
シンおよびインバレリル・スピラマイシンに対して感受
性であり、アブラマイシンに対して耐性である。したが
って、このミクロコツカス・ルテウス菌株は、スピラマ
イシンまたはインバレリル・スピラマイシンを産生じて
いるストレプトマイセスを含有するプラグの周囲で増殖
することができない。
０、ｐＯＪ２３１’１ｉｔｐＯＪ３１３を含有するスト
レプトマイセス・アンボファシエンス形質転換体を、Ｒ
２寒天再生プレートからＡＳＩおよび２５μ９／ｙ（ｌ
アブラマイシンを含有するプレートに移し、コロニーが
直径〜５ｊ！ＪＩとなるまで、３０℃で２〜３日間イン
キュベートした。次いで、滅菌移送管［スペクトラム・
メディカル・インダストリアル・インコーホレイテッド
（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｔ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌ、 Ｉｎｃ、）、ロス・アンジエルス、カリフォ
ルニア９００５４］を用いてコロニーをプラグ化し、こ
のプラグ（ｐｌｕｇ）をミクロコツカス・ルテウス（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ） Ｘ １６０
（Ａ Ｔ ＣＣ９３４１）を含有する軟寒天栄養ブロス
（デイフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン４
８２３２）を予め塗布しておいたトリジティカーゼ０ソ
イ０寒天（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ａｇａｒ
： Ｔ Ｓ Ａ）プレートに移した。このプレートを３
７°Ｃで１６〜２４時間インキュベートした。ミクロコ
ツカス・ルテウス（ＡＴＣＣ９３４１）は、スピラマイ
シンおよびインバレリル・スピラマイシンに対して感受
性であり、アブラマイシンに対して耐性である。したが
って、このミクロコツカス・ルテウス菌株は、スピラマ
イシンまたはインバレリル・スピラマイシンを産生じて
いるストレプトマイセスを含有するプラグの周囲で増殖
することができない。
ストレプトマイセス・アンボファシエンス形質転換体を
、２５μａのアブラマイシンと０ 、５ ｍ９／ｘ（ｌ
のＬ−ロイシン（アシラーゼに対する基質）を含有する
ＡＳｌに移した。プラグ検定を行い、コロニーがスピラ
マイシンを産生じ始めたか否かを測定した。さらに２〜
３日後、この実施例の下記工程りに記述したバイオオー
トグラフィ用にプラグを採取した。
、２５μａのアブラマイシンと０ 、５ ｍ９／ｘ（ｌ
のＬ−ロイシン（アシラーゼに対する基質）を含有する
ＡＳｌに移した。プラグ検定を行い、コロニーがスピラ
マイシンを産生じ始めたか否かを測定した。さらに２〜
３日後、この実施例の下記工程りに記述したバイオオー
トグラフィ用にプラグを採取した。
このプレート−プラグ検定法を用いて、通常はＡＳＩ培
地にスピラマイシンを産生ずるストレプトマイセス・ア
ンボッ１シエンスの抗生物質産生を調べた。スピラマイ
シンの産生によって、プラグの周囲にミクロコツカス・
ルテウス増殖の抑制ゾーンが得られた。ｃａｒＥ発現ベ
クターを含んでいる培養物中で内生のスピラマイシンが
イソバレリル・スピラマイシンに転換されるためには、
３０′Ｃでさらに数日間インキュベーションすることが
必要であった。プラスミドｐＯＪ１５９で形質転換した
ストレプトマイセス・アンボファシエンスは、チオスト
レプトン（２５μ９／酎）を含有しているＲ２およびＡ
ＳＩ培地で維持したが、ミクロコツカス・ルテウスはチ
オストレプトンに対して感受性であるので、抗生物質の
産生は上記のようにしては測定することができなかった
。ストレプトマイセス・アンボファシエンス／ｐＯＪ１
５９培養物を約６日間インキュベートした後、プラグを
バイオオートグラフィーに用いた。ストレプトマイセス
・アンボファンエンス／ｐＯＪ１５９およびストレプト
マイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐＯＪ１５９培養物を
バイオオートグラフィによって検定するときには、チオ
ストレプトンを標準としてクロマトグラフィープレート
に含有させた。
地にスピラマイシンを産生ずるストレプトマイセス・ア
ンボッ１シエンスの抗生物質産生を調べた。スピラマイ
シンの産生によって、プラグの周囲にミクロコツカス・
ルテウス増殖の抑制ゾーンが得られた。ｃａｒＥ発現ベ
クターを含んでいる培養物中で内生のスピラマイシンが
イソバレリル・スピラマイシンに転換されるためには、
３０′Ｃでさらに数日間インキュベーションすることが
必要であった。プラスミドｐＯＪ１５９で形質転換した
ストレプトマイセス・アンボファシエンスは、チオスト
レプトン（２５μ９／酎）を含有しているＲ２およびＡ
ＳＩ培地で維持したが、ミクロコツカス・ルテウスはチ
オストレプトンに対して感受性であるので、抗生物質の
産生は上記のようにしては測定することができなかった
。ストレプトマイセス・アンボファシエンス／ｐＯＪ１
５９培養物を約６日間インキュベートした後、プラグを
バイオオートグラフィーに用いた。ストレプトマイセス
・アンボファンエンス／ｐＯＪ１５９およびストレプト
マイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐＯＪ１５９培養物を
バイオオートグラフィによって検定するときには、チオ
ストレプトンを標準としてクロマトグラフィープレート
に含有させた。
Ｄ、バイオオートグラフィ
本発明のストレプトマイセス・アンボファシエンスおよ
びストレプトマイセス・リビダンス形質転換体を含有す
るプレートからいくつかのプラグを調製した。スピラマ
イシンおよびイソバレリル・スピラマイシン標準サンプ
ルに次いで、これらのプラグを薄層クロマトグラフィ・
プレート（メルク、ピー・オー・ボックス ２０００、
ラーウエイ、ニュー・シャーシー ０７０６５、プレー
コートされたシリカゲル＃６０ Ｆ−２５４）上に置
いた。拡散するに充分な時間、このプラグをプレート上
に放置し、次いで、プレートを、酢酸エチル：ジエチル
アミン；メタノール（９５： ５ ： ５）（７）上昇
液体クロマトグラフィにかけた。展開したクロマトグラ
ムを、ヒユームフード中で少なくとも２時間完全に乾燥
した。次いで、このクロマトグラムを、ミクロコツカス
・ルテウスＸ１６０を蒔いたＴＳＡプレートに下を向け
て〜１５分間置装た。クロマトグラムをプレートから取
り、プレートを３７°Ｃで１６〜２４時間インキコベー
トした。
びストレプトマイセス・リビダンス形質転換体を含有す
るプレートからいくつかのプラグを調製した。スピラマ
イシンおよびイソバレリル・スピラマイシン標準サンプ
ルに次いで、これらのプラグを薄層クロマトグラフィ・
プレート（メルク、ピー・オー・ボックス ２０００、
ラーウエイ、ニュー・シャーシー ０７０６５、プレー
コートされたシリカゲル＃６０ Ｆ−２５４）上に置
いた。拡散するに充分な時間、このプラグをプレート上
に放置し、次いで、プレートを、酢酸エチル：ジエチル
アミン；メタノール（９５： ５ ： ５）（７）上昇
液体クロマトグラフィにかけた。展開したクロマトグラ
ムを、ヒユームフード中で少なくとも２時間完全に乾燥
した。次いで、このクロマトグラムを、ミクロコツカス
・ルテウスＸ１６０を蒔いたＴＳＡプレートに下を向け
て〜１５分間置装た。クロマトグラムをプレートから取
り、プレートを３７°Ｃで１６〜２４時間インキコベー
トした。
ストレプトマイセス・アンボファシエンス形質転換体か
ら調製したプラグのクロマトグラムは、インバレリル・
スピラマイシン標準と一緒に泳動したクロマトグラム上
の物質に起因する抑制ゾーンを生じた。
ら調製したプラグのクロマトグラムは、インバレリル・
スピラマイシン標準と一緒に泳動したクロマトグラム上
の物質に起因する抑制ゾーンを生じた。
実施例６ ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換
および培養 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３（ＮＲＲＬ
ｔ５８２６）をＲ２寒天に蒔き、このプレートを３０
℃で１６時間インキュベートした。細胞のプラグをプレ
ートから取り、これをＴＳＳ−グリシン［ＴＳＢ中、１
２％スクロースおよび０゜５％グリシン］（１０ｍ１２
＞に接種した。この培養物を曝気しながら３０°Ｃで〜
６５時間インキュベートした。次いで、この培養物をホ
モジナイズし、超音波処理し、遠心して沈澱させ、Ｐ培
地（１０村）で洗浄した。この細胞ペレットを、２ｍ９
／１ｘ（１のリソチームを含有するＰ培地に再懸濁し、
４°Ｃで１５分間インキュベートし、反転混合し、次い
で、４°Ｃで３０分間インキュベートした。得られたプ
ロトプラストをＰ培地で２回洗浄し、次いで、Ｐ培地（
１０ｘｉ２）中に再懸濁した。形質転換ＤＮＡの試料そ
れぞれ（〜５μ９）に対して、２００μｅのプロトプラ
ストを加え、次いで９、この細胞−ＤＮＡ混合物に、Ｐ
培地中２０％ポリエチレングリコール ｌ ＯＯＯ（０
，５ｘｆ２）を加えた。次いで、Ｒ２修飾の重層液［１
（当たリスクＣ：Ｉ−ス（１０３９）、ＭｇＣＲ，（１
０，１２９）、ＣａＣＬ（２，２２ｇ）およびＴＥ Ｓ
（５，７３９）（ｐＨ７，２）コ（〜３酎）を用いて
、細胞を２００μρずつ培養した。このプレートを３０
℃でインキュベートした。
および培養 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３（ＮＲＲＬ
ｔ５８２６）をＲ２寒天に蒔き、このプレートを３０
℃で１６時間インキュベートした。細胞のプラグをプレ
ートから取り、これをＴＳＳ−グリシン［ＴＳＢ中、１
２％スクロースおよび０゜５％グリシン］（１０ｍ１２
＞に接種した。この培養物を曝気しながら３０°Ｃで〜
６５時間インキュベートした。次いで、この培養物をホ
モジナイズし、超音波処理し、遠心して沈澱させ、Ｐ培
地（１０村）で洗浄した。この細胞ペレットを、２ｍ９
／１ｘ（１のリソチームを含有するＰ培地に再懸濁し、
４°Ｃで１５分間インキュベートし、反転混合し、次い
で、４°Ｃで３０分間インキュベートした。得られたプ
ロトプラストをＰ培地で２回洗浄し、次いで、Ｐ培地（
１０ｘｉ２）中に再懸濁した。形質転換ＤＮＡの試料そ
れぞれ（〜５μ９）に対して、２００μｅのプロトプラ
ストを加え、次いで９、この細胞−ＤＮＡ混合物に、Ｐ
培地中２０％ポリエチレングリコール ｌ ＯＯＯ（０
，５ｘｆ２）を加えた。次いで、Ｒ２修飾の重層液［１
（当たリスクＣ：Ｉ−ス（１０３９）、ＭｇＣＲ，（１
０，１２９）、ＣａＣＬ（２，２２ｇ）およびＴＥ Ｓ
（５，７３９）（ｐＨ７，２）コ（〜３酎）を用いて
、細胞を２００μρずつ培養した。このプレートを３０
℃でインキュベートした。
このプレートを３０°Ｃで一夜（〜１６時間）インキュ
ベートし、次いで、拡散後の最終濃度２５μ９／村を得
るのに充分な量のチオストレプトンまたはアブラマイシ
ンを含有するＲ２−修飾寒天［１ｑ当たりスクロース（
１０３９）、Ｍｇ（Ｊ！−（１０，１２９）、ＣａＣ（
−（２，２２１Ｆ）およびＴＢＳ（５，７２９）（ｐＨ
７，２）］（〜３ｊ＋のをかぶせた。次いで、このプレ
ートを３０℃で約４日間インキュベートすると、コロニ
ーを肉眼で見ることができるようになった。
ベートし、次いで、拡散後の最終濃度２５μ９／村を得
るのに充分な量のチオストレプトンまたはアブラマイシ
ンを含有するＲ２−修飾寒天［１ｑ当たりスクロース（
１０３９）、Ｍｇ（Ｊ！−（１０，１２９）、ＣａＣ（
−（２，２２１Ｆ）およびＴＢＳ（５，７２９）（ｐＨ
７，２）］（〜３ｊ＋のをかぶせた。次いで、このプレ
ートを３０℃で約４日間インキュベートすると、コロニ
ーを肉眼で見ることができるようになった。
この形質転換体を、アブラマイシンまたはチオストレプ
トン（２５μｇ／酎）、ロイシン（０，５μｇ／Ｊ１１
２）およびスピラマイシン（１００μ９／酎）を追加し
たＡＳＩ培地に移し、胞子形成および色素形成によって
十分な増殖が示されるまで、数日間増殖させた。次いで
、バイオオートグラフィ用にプラグを採取し、前記実施
例５の記載に従ってバイオオートグラフィを行った。
トン（２５μｇ／酎）、ロイシン（０，５μｇ／Ｊ１１
２）およびスピラマイシン（１００μ９／酎）を追加し
たＡＳＩ培地に移し、胞子形成および色素形成によって
十分な増殖が示されるまで、数日間増殖させた。次いで
、バイオオートグラフィ用にプラグを採取し、前記実施
例５の記載に従ってバイオオートグラフィを行った。
実施例７ プラスミドｐｏ Ｊ ２３５の構築始めに、
プラスミドｐＯＪ２３１（またはプラスミドｐＯＪ２３
０）から暗号配列の５′末端を〜７００ｂｐのＰｓｔ
Ｉ −ＢａｍＨＩ制限フラグメントで単離することによ
って、ｃａｒ Ｅ遺伝子の暗号配列を再構築することが
できる。このフラグメントを純化し、次いで、制限酵素
Ｓ ｆａＮ Ｉで消化した。次いで、この消化によって
得られた〜１ｏｏｂｐｓｒａＮｒ−Ｐｓｔｌ制限フラグ
メントを単離し、純化し、Ｎｄｅｌ−Ｐｓｔｌ消化のプ
ラスミドｐＵｃ１９および下記リンカー： とライゲートした。このライゲーションによりプラスミ
ドｐｏ Ｊ ２３２が得られ、次いで、このプラスミド
ｐＯＪ２３２を、ｃａｒＥ遺伝子の暗号配列の５′末端
をコードする〜１３０ｂｐ Ｎｄｅｌ −ＰｓｔＩ制限
フラグメントの供給源として用いた。
プラスミドｐＯＪ２３１（またはプラスミドｐＯＪ２３
０）から暗号配列の５′末端を〜７００ｂｐのＰｓｔ
Ｉ −ＢａｍＨＩ制限フラグメントで単離することによ
って、ｃａｒ Ｅ遺伝子の暗号配列を再構築することが
できる。このフラグメントを純化し、次いで、制限酵素
Ｓ ｆａＮ Ｉで消化した。次いで、この消化によって
得られた〜１ｏｏｂｐｓｒａＮｒ−Ｐｓｔｌ制限フラグ
メントを単離し、純化し、Ｎｄｅｌ−Ｐｓｔｌ消化のプ
ラスミドｐＵｃ１９および下記リンカー： とライゲートした。このライゲーションによりプラスミ
ドｐｏ Ｊ ２３２が得られ、次いで、このプラスミド
ｐＯＪ２３２を、ｃａｒＥ遺伝子の暗号配列の５′末端
をコードする〜１３０ｂｐ Ｎｄｅｌ −ＰｓｔＩ制限
フラグメントの供給源として用いた。
ｃａｒ Ｅ暗号配列の残りは、プラスミドｐＯＪ２３１
（まタハブラスミトｐＯＪ ２３０）＋７） 〜１．７
ｋｂＢａｍＨＩ −Ｐｓｔ Ｉ制限フラグメントで得る
ことができる。このプラスミドｐＯＪ２３１の〜ｌ 、
７ ｋｂＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ制限フラグメントを、
プラスミドｐＯＪ２３２の〜１３０ｂｐ ＮｄｅＩ−Ｐ
ｓｔ’Ｉ制限フラグメントおよびプラスミドｐｃ Ｚ
Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ−ＢａｍＨＩ制限フ
ラグメントとライゲートして、プラスミドｐＯＪ２３５
を得た。
（まタハブラスミトｐＯＪ ２３０）＋７） 〜１．７
ｋｂＢａｍＨＩ −Ｐｓｔ Ｉ制限フラグメントで得る
ことができる。このプラスミドｐＯＪ２３１の〜ｌ 、
７ ｋｂＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ制限フラグメントを、
プラスミドｐＯＪ２３２の〜１３０ｂｐ ＮｄｅＩ−Ｐ
ｓｔ’Ｉ制限フラグメントおよびプラスミドｐｃ Ｚ
Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ−ＢａｍＨＩ制限フ
ラグメントとライゲートして、プラスミドｐＯＪ２３５
を得た。
プラスミドｐＯＪ２３５は、大腸菌中、〜３７°Ｃ以上
の温度（この温度ではｃＩ８５７ λｐｔ、リプレッ
サーが不活性である）でｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発現さ
せる。
の温度（この温度ではｃＩ８５７ λｐｔ、リプレッ
サーが不活性である）でｃａｒ Ｅ遺伝子産物を発現さ
せる。
ｐｃ Ｚ Ｒ３３６由来の〜５．８ｋｂ ＮｄｅＩ−Ｂ
ａｍＨ■フラグメントは、λｐＬプロモーター、翻訳活
性化配列、ｃ１８５７リブレツサー、プラスミドの複製
起源、およびテトラサイクリン耐性付与遺伝子をコード
しているＤＮＡ配列を含んでいる。
ａｍＨ■フラグメントは、λｐＬプロモーター、翻訳活
性化配列、ｃ１８５７リブレツサー、プラスミドの複製
起源、およびテトラサイクリン耐性付与遺伝子をコード
しているＤＮＡ配列を含んでいる。
プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６は、ヒト成長ホルモンの
暗号配列をも含んでいる。プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３
６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメント
中に含まれているＤＮＡ配列は、以下のようにして構築
することができる。
暗号配列をも含んでいる。プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３
６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメント
中に含まれているＤＮＡ配列は、以下のようにして構築
することができる。
プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅ
ｌ−ＢａｎＨＩ制限フラグメントのＤＮＡの大部分は、
プラスミドｐＣＺＲ１１１から〜５．７５ｋｂ Ｘｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントで単離することができ
る。プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および機能地
図を添付の第７図に示す。プラスミドｐｃＺＲ１１１は
、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２４９（１９８７年８
月１１日に寄託された）のもとでＮＲＲＬから入手可能
な大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ１１１から得る
ことができる。プラスミドｐｃＺＲ１１１は１０μ９／
ｚ（ｌテトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ｃ１ａ
ｌ制限部位を欠いている。
ｌ−ＢａｎＨＩ制限フラグメントのＤＮＡの大部分は、
プラスミドｐＣＺＲ１１１から〜５．７５ｋｂ Ｘｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントで単離することができ
る。プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および機能地
図を添付の第７図に示す。プラスミドｐｃＺＲ１１１は
、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２４９（１９８７年８
月１１日に寄託された）のもとでＮＲＲＬから入手可能
な大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ１１１から得る
ことができる。プラスミドｐｃＺＲ１１１は１０μ９／
ｚ（ｌテトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ｃ１ａ
ｌ制限部位を欠いている。
プラスミドｐｃＺＲ１１１をＸｂａＩおよびＢａ１ｌＩ
Ｈｒ酵素で消化し、アガロースから大きいＸｂａｌ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントを純化した。このプラスミドｐｃ
ＺＲ１１１のＸｂａｌ −ＢａｍＨＩ制限フラグメント
を二本鎖ＤＮＡフラグメントと一緒にライゲートして、
プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅ
Ｉ −ＢａｍＨＩ制限フラグメントを得た。この二本鎖
ＤＮＡフラグメントは以下の配列を有している： ライゲーションに必要とされるＤＮＡフラグメントが少
ないほど、そのライゲーションによって目的のプラスミ
ドが得られる公算が高くなることは当業者の知るところ
である。したがって、プラスミドｐＯＪ２３５の構築プ
ロトコールにおいて、単一の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ
−ＢａｍＨＩフラグメントの代わりにプラスミドｐｃＺ
Ｒ１１１の５．７５ｋｂＸｂａ Ｉ −Ｂ ａｍＨＩフ
ラグメントと上記ＤＮＡフラグメントとを用いることに
よってプラスミドｐＯＪ２３５を構築することもできる
であろうが、目的のプラスミドの収率はおそらく低くな
るであろう。プラスミドｐＯＪ２３５は大腸菌において
ＣａｒＥ遺伝子産物を発現させる。
Ｈｒ酵素で消化し、アガロースから大きいＸｂａｌ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントを純化した。このプラスミドｐｃ
ＺＲ１１１のＸｂａｌ −ＢａｍＨＩ制限フラグメント
を二本鎖ＤＮＡフラグメントと一緒にライゲートして、
プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅ
Ｉ −ＢａｍＨＩ制限フラグメントを得た。この二本鎖
ＤＮＡフラグメントは以下の配列を有している： ライゲーションに必要とされるＤＮＡフラグメントが少
ないほど、そのライゲーションによって目的のプラスミ
ドが得られる公算が高くなることは当業者の知るところ
である。したがって、プラスミドｐＯＪ２３５の構築プ
ロトコールにおいて、単一の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅｌ
−ＢａｍＨＩフラグメントの代わりにプラスミドｐｃＺ
Ｒ１１１の５．７５ｋｂＸｂａ Ｉ −Ｂ ａｍＨＩフ
ラグメントと上記ＤＮＡフラグメントとを用いることに
よってプラスミドｐＯＪ２３５を構築することもできる
であろうが、目的のプラスミドの収率はおそらく低くな
るであろう。プラスミドｐＯＪ２３５は大腸菌において
ＣａｒＥ遺伝子産物を発現させる。
第１図は、プラスミドｐＯＪ１７１の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ３１３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ１５９の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３０の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３５の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
人 弁理士前出 葆 はか１名 ＦＩＧ、１ プラスミドｐＯＪ１７１ （〜４５ ｋｂ） ＦＩＧ、２ プラスミドｐＯＪ１６０ （〜７ ｋｂ） ＦＩＧ、３ プラスミドｐＯＪ３１３ （〜１０．８ ｋｂ） ＦＩＧ、４ プラスミドｐＯＪ１５９ （１０，６５ｋｂ） ＦＩＧ、５ プラスミドｐＯＪ２３０ （〜９．４ ｋｂ） ＦＩＧ、６ プラスミドｐＯＪ２３５ ＦＩＧ、７ プラスミドｐｃＺＲ１１１ （６３９５ｂｐ）
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ３１３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ１５９の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３０の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２３５の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
人 弁理士前出 葆 はか１名 ＦＩＧ、１ プラスミドｐＯＪ１７１ （〜４５ ｋｂ） ＦＩＧ、２ プラスミドｐＯＪ１６０ （〜７ ｋｂ） ＦＩＧ、３ プラスミドｐＯＪ３１３ （〜１０．８ ｋｂ） ＦＩＧ、４ プラスミドｐＯＪ１５９ （１０，６５ｋｂ） ＦＩＧ、５ プラスミドｐＯＪ２３０ （〜９．４ ｋｂ） ＦＩＧ、６ プラスミドｐＯＪ２３５ ＦＩＧ、７ プラスミドｐｃＺＲ１１１ （６３９５ｂｐ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、微生物中の４’’−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ酵
素量を増加させる方法であって、（１）ｃａｒＥ遺伝子
産物の発現をコードしている組換えＤＮＡベクタ−で微
生物を形質転換し、そして （２）工程（１）で形質転換した微生物を遺伝子の発現
が可能な条件下で培養すること、を特徴とする方法。 ２、微生物がストレプトマイセス属である請求項１記載
の方法。 ３、微生物がストレプトマイセス・アンボファシエンス
、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセ
ス・サーモトレランス、あるいはストレプトマイセス・
フラジエからなる群から選ばれる請求項２記載の方法。 ４、４’’−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ酵素をコード
しているＤＮＡ化合物。 ５、ストレプトマイセス・サーモトレランスの４’’−
Ｏ−イソバレリルアシラーゼ酵素をコードしている請求
項４記載のＤＮＡ化合物。 ６、以下のアミノ酸残基配列を有するアシラーゼをコー
ドしている請求項５記載のＤＮＡ化合物【遺伝子配列が
あります】 ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、−ＣＯ
ＯＨはカルボキシ末端、Ｃｙｓはシステイン、Ｇｌｎは
グルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン
、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌ
ｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン
、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐ
ｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン
、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、そして
Ｖａｌはバリンである］。 ７、以下の配列で示される請求項６記載のＤＮＡ化合物
： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルである］。 ８、ストレプトマイセス・サーモトレランスＮＲＲＬ１
５２７０の４’’−Ｏ−イソバレリルアシラーゼ酵素を
コードしている請求項４記載のＤＮＡ化合物。 ９、請求項６記載のＤＮＡ化合物をコードしている組換
えＤＮＡベクター。 １０、第３図に示したプラスミドｐＯＪ３１３、実施例
３Ｂに記載したプラスミドｐＯＪ３１３Ａ、第５図に示
したプラスミドｐＯＪ２３０、実施例４に記載したプラ
スミドｐＯＪ２３１、あるいは第６図に示したプラスミ
ドｐＯＪ２３５からなる群から選ばれる請求項９記載の
組換えＤＮＡベクター。 １１、請求項９記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換
した宿主細胞。 １２、大腸菌、ストレプトマイセス・アンボファシエン
ス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイ
セス・サーモトレランス、あるいはストレプトマイセス
・フラジエからなる群から選ばれる請求項１１記載の宿
主細胞。 １３、抗生物質生合成遺伝子あるいは抗生物質耐性付与
遺伝子の単離方法であって、 ａ）抗生物質産生微生物の遺伝子ライブラリーを調製し
、 ｂ）該ライブラリ−を、５’−ＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧ−
３’あるいは５’−ＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧ−３’から
なる群から選ばれる調節配列プローブでプローブ検索し
、そしてｃ）該調節配列プローブとハイブリダイズする
抗生物質生合成遺伝子あるいは抗生物質耐性付与遺伝子
を単離すること、 を特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US194672 | 1988-05-13 | ||
| US07/194,672 US5068189A (en) | 1988-05-13 | 1988-05-13 | Recombinant dna vectors encoding a 4"-o-isovaleryl acylase derived from a carbomycin biosynthetic gene, designated care, for use in streptomyces and other organisms |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213380A true JPH0213380A (ja) | 1990-01-17 |
Family
ID=22718473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1120233A Pending JPH0213380A (ja) | 1988-05-13 | 1989-05-12 | カルボマイシン生合成遺伝子ｃａｒＥ由来の４”―０―イソバレリル アシラーゼをコードしている組換えＤＮＡベクター |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5068189A (ja) |
| EP (1) | EP0354641B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0213380A (ja) |
| CA (1) | CA1336693C (ja) |
| DE (1) | DE68918532T2 (ja) |
| DK (1) | DK230489A (ja) |
| IL (1) | IL90268A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6211922B1 (en) | 1995-06-12 | 2001-04-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Color video apparatus for displaying hue control states on screen |
| JP2006501863A (ja) * | 2002-10-08 | 2006-01-19 | アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム | スピラマイシンの生合成に関与するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、その使用 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2749616B2 (ja) * | 1988-05-24 | 1998-05-13 | メルシャン株式会社 | マクロライド抗生物質の４”位アシル化酵素をコードする遺伝子 |
| EP0870053A4 (en) | 1995-12-19 | 2002-09-11 | Univ Minnesota | METABOLIC PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF POLYHYDROXYALCANOATE MONOMER SYNTHASES |
| US6265202B1 (en) | 1998-06-26 | 2001-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA encoding methymycin and pikromycin |
| US20030194784A1 (en) * | 2001-04-17 | 2003-10-16 | Sherman David H. | DNA encoding methymycin and pikromycin |
| EP1905833B1 (fr) * | 2002-10-08 | 2015-08-12 | Aventis Pharma S.A. | Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, séquences nucléotidiques codant ces polypeptides et leurs applications |
| US7579167B2 (en) | 2002-10-08 | 2009-08-25 | Aventis Pharma S. | Polypeptides involved in the biosynthesis of spiramycins, nucleotide sequences encoding these polypeptides and applications thereof |
| CN105505954B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 沈阳福洋医药科技有限公司 | 可利霉素生物合成基因簇 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4935340A (en) * | 1985-06-07 | 1990-06-19 | Eli Lilly And Company | Method of isolating antibiotic biosynthetic genes |
| IL83601A0 (en) * | 1986-08-28 | 1988-01-31 | Lilly Co Eli | Method for selecting recombinant dna-containing streptomyces and other host cells |
| US4952502A (en) * | 1987-02-24 | 1990-08-28 | Eli Lilly And Company | Carbomycin biosynthetic gene, designated carG, for use in streptomyces and other organisms |
-
1988
- 1988-05-13 US US07/194,672 patent/US5068189A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-05-10 EP EP89304716A patent/EP0354641B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-10 DE DE68918532T patent/DE68918532T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-11 DK DK230489A patent/DK230489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-05-11 CA CA000599473A patent/CA1336693C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-11 IL IL9026889A patent/IL90268A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 JP JP1120233A patent/JPH0213380A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6211922B1 (en) | 1995-06-12 | 2001-04-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Color video apparatus for displaying hue control states on screen |
| JP2006501863A (ja) * | 2002-10-08 | 2006-01-19 | アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム | スピラマイシンの生合成に関与するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、その使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5068189A (en) | 1991-11-26 |
| IL90268A (en) | 1994-10-07 |
| CA1336693C (en) | 1995-08-15 |
| DK230489D0 (da) | 1989-05-11 |
| EP0354641A2 (en) | 1990-02-14 |
| EP0354641A3 (en) | 1990-05-23 |
| DE68918532T2 (de) | 1995-03-02 |
| DE68918532D1 (de) | 1994-11-03 |
| EP0354641B1 (en) | 1994-09-28 |
| IL90268A0 (en) | 1989-12-15 |
| DK230489A (da) | 1990-01-24 |
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