JPH0239889A - ストレプトマイセスおよびその他の生物で使用するためのマクロライド生合成遺伝子 - Google Patents

ストレプトマイセスおよびその他の生物で使用するためのマクロライド生合成遺伝子

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JPH0239889A
JPH0239889A JP1146555A JP14655589A JPH0239889A JP H0239889 A JPH0239889 A JP H0239889A JP 1146555 A JP1146555 A JP 1146555A JP 14655589 A JP14655589 A JP 14655589A JP H0239889 A JPH0239889 A JP H0239889A
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plasmid
gene
dna
antibiotic
streptomyces
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JP1146555A
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Robert J Beckmann
ロバート・ジョン・ベックマン
Karen L Cox
カレン・レイ・コックス
Ramachandra Nagaraja Rao
ラマチャンドラ・ナガラジャ・ラオ
Mark A Richardson
マーク・アラン・リチャードソン
Eugene T Seno
ユージン・トーマス・セノ
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Eli Lilly and Co
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なマクロライド抗生物質生合成遺伝子、
これらの遺伝子によってコードされているポリペプチド
産物、および抗生物質生合成酵素の細胞内濃度を高める
ための該遺伝子の使用方法を包含するものである。本発
明はまた、新規なノ＼イブリッド抗生物質を製造するた
めに使用し得る突然変異生合成遺伝子を含有する微生物
、およびクローニングされたスピラマイシン生合成遺伝
子からこれらの株を作成するための方法を提供する。
関係の深いマクロライド抗生物質であるスピラマイシン
とタイロシンはそれぞれ、ストレプトマイセス・アンポ
ファンエンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ）（Ｎ　ＲＲＬ　１５２６３、受託臼、
１９８３年１月６日）およびＳ、フラジエ（Ｓ、　Ｉ’
ｒａｄｉａｅ）（ＡＴＣＣ１９６０９として誰でも入手
できる）によって産生される。各々は、３個の糖残基を
有する１６員環のラクトンである。スピラマイシンおよ
びタイロシンの抗生物質活性は、その他のマクロライド
の抗生物質活性と同様に、リポソームへの抗生物質の結
合を含むメカニズムによるタンパク合成の阻害による。
本発明は、ストレプトマイセスおよびその他の宿主細胞
において使用するためのマクロライド生合成遺伝子発現
ベクターを提供する。ストレプトマイセスにおける組換
えＤＮＡ技術の開発および発展は、この産業上重要な微
生物の抗生物質産生能を改善し、新規な抗生物質を製造
しようという要求によって推進されてきた。この開発は
、組換えＤＮＡ技術によるストレプトマイセスの修飾に
使用するために現在利用し得る抗生物質生合成遺伝子の
数が少ないために、幾分おくれでいる。本発明は、この
様な用途に好適な抗生物質生合成遺伝子の数を拡大する
という点で有用であり、とりわけ重要である。
本発明のベクターは、このベクターが種々のストレプト
マイセス細胞に導入され、選択され得るので、とりわけ
有用である。ストレプトマイセスは、臨床上重要な抗生
物質の２分の１以上を提供し、従って商業的に重要なグ
ループである。本発明は、この産業上重要なグループだ
けではなくその他の抗生物質産生微生物のための新規か
つ有用なベクターおよび方法を提供し、発酵におけるマ
クロライド抗生物質の収量の増大を可能にし、新規な抗
生物質および抗生物質誘導体の製造を可能にするもので
ある。
本発明の目的のために、本明細書記載の語句を以下の様
に定義する。
ＡｍＲ−アンピシリン耐性付与遺伝子。
抗生物質−天然のまま、またはわずかな修飾によって、
他の微生物または真核細胞の生育を阻害するかまたは殺
滅する、微生物によって産生される物質。
抗生物質生合成遺伝子−一次代謝産物を抗生物質に変換
する生化学的過程において必要なｌまたはそれ以上の活
性をコードしているＤＮＡセグメント。
抗生物質生合成経路−一次代謝産物を抗生物質に変換す
る過程に必要な一連の抗生物質生合成遺伝子全体。
抗生物質産生生物−抗生物質を産生ずるか、または発現
すると抗生物質を産生ずるであろう遺伝子を含有してい
る生物であって、アクチノプラネス（Ａ　ｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎｅｓ）、アクチノマデユラ（ＡＣｔｉｎｏｍａｄ
ｕｒａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セファロス
ポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ミクロモ
ノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベニンリ
ウム（Ｐ　ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ノカルデイア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）およびストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を包含するがこれに限定されない
。
抗生物質耐性付与遺伝子−抗生物質に対するかｊ性を付
与する、酵素的活性またはその他の活性をコードしてい
るＤＮＡセグメント。
ＡｐＲ−アンピシリン耐性付与遺伝子。
三機能性クローニングシャトルベクター−２種類の別の
分類群の微生物中で複製可能な、そして／または該微生
物に組込み可能な組換えＤＮＡクローニングベクター ＢＬｌＲ−プレオマイシン耐性付与遺伝子。
クローニング−組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡのセグメントを挿入し、この組換えＤＮＡで宿主細
胞を形質転換する過程。
Ｃ＋ｎＲ−クロラムフェニコール耐性付与ｉｔ　伝子。
相補性−クローニングされた遺伝子によって突然変異株
がその正常な遺伝表現型に復元すること。
ｃｏｓ−ラムダ粘着末端配列。
コスミドープラスミドと同様に宿主細胞中で複製可能で
あるだけでなく、ファージ頭部に取り込まれ得るプラス
ミドである組換えＤＮＡクローニングベクター 遺伝子−プロモーターがコード配列を転写させ、ターミ
ネータ−か転写を終結させる様に位置する、プロモータ
ー、コード配列、およびターミネータ−を含有するＤＮ
Ａ配列。
遺伝子ライブラリー−ある微生物の実質止金てのＤＮＡ
配列に相当するＤＮＡのセグメントがクローニングされ
た一群の組換えＤＮＡクローニングベクター ハイブリダイゼーション−２本の一本鎖ＤＮＡ分子がア
ニーリングし、完全に塩基対を構成しているか、または
完全には塩基対を構成していない二本鎖ＤＮＡ分子が形
成される過程。
ＮｍＲ−＊オマイシン耐性付与遺伝子。
ｏｒｉ−プラスミドの複製開始点。
プロモーター−転写を開始させるＤＮＡ配列。
組換えＤＮＡクローニングベクター−更に１またはそれ
以上のＤＮＡ分子が付加され得るかまたは付加されたＤ
ＮＡ分子からなる自律的に複製するかまたは組込まれる
物質であって、プラスミドを包含するがそれに限定され
ない。
組換えＤＮＡ法−点突然変異誘発、挿入突然変異誘発、
欠失または再配置によってＤＮＡ配列を変更すること。
制限フラグメンｌ−−１またはそれ以上の制限酵素の作
用によって作成された直線状ＤＮＡ分子。
感受性宿主細胞−耐性を付与するＤＮＡセグメントなし
では、与えられた抗生物質の存在下で生育し得ないかま
たはその生育が阻害される宿主細胞。
Ｓ　ｒｍ遺伝子−スピラマイシン抗生物質の生合成に関
与する生成物をコードしているＤＮＡ配列。
サブクローン−同サイズまたはより大きい他のＤＮＡに
由来する挿入ＤＮＡを有するクローニングベクター ｔａｃプロモーター−リヱおよびｌａｃプロモーターの
ハイブリッド。
ＴｃＲ−テトラサイタリン耐性遺伝子表現型またはそれ
を付与する遺伝子。
ターミネーター−ＤＮＡのＲＮＡへの転写を終結する、
遺伝子のＤＮＡ配列の一部分。
形質導入体−組換えファージ感染によって形質転換され
た受容宿主細胞。
形質転換体−形質転換された受容宿主細胞。
形質転換−遺伝型を変え、受容細胞に変化をもたらす受
容宿主細胞へのＤＮＡの導入。
ｔｓｒＲ−チオストレプトン耐性遺伝表現型またはそれ
を付与する遺伝子。
図面の簡単な記述 第１図は、ストレプトマイセス・アンボファ／エンスの
スピラマインン抗生物質生合成経路の模式図である。
第２図は、コスミドｐＫＣ６４４の〜３２ｋｂ挿入ＤＮ
Ａの制限部位地図である。ｓｒｍ突然変異株に保有され
ている突然変異の地図上の位置を、プラスミ　ドｐＫＣ
６０４、ｐＫＣ６６８、ｐＫＣ１００５およびコスミド
ｐＫＣ５７１の挿入ＤＮＡと一緒に示す。
第３図は、ストレプトマイセス・フラジエにおけるタイ
ロシン抗生物質生合成の模式図である。
第４図は、ｐＫＣ６４４のベクター骨格、プラスミドｐ
ＫＣ４７３の制限部位および機能地図である。
第５図は、プラスミドｐＨＪＬ４０１の制限部位および
機能地図である。
第６図は、プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機
能地図である。
第７図は、プラスミドｐＫＣ６６８の制限部位および機
能地図である。
第８図は、プラスミドｐＫＣ６０４の制限部位および機
能地図である。
第９図は、プラスミドｐＫＣ１００５の制限部位および
機能地図である。
第１０図は、コスミドｐＫＣ６４，４の制限部位および
機能地図である。
第１１図は、コスミドｐＫＣ５７１の制限部位および機
能地図である。
発明の詳細な記述 本発明は、抗生物質の収量を高め、新規な抗生物質を製
造するために使用し得る新規なマクロライド抗生物質生
合成遺伝子を包含する。これらの遺伝子（ｓｒｍＤ、　
ｓｒｍＥ、　ｓｒｍＦＸｓｒｍＧ、およびｓｒｎ＋Ｈ）
は、マクロライド抗生物質、とりわけスピラマイシンの
濃度を高めるための方法に有用である。
この方法は、この遺伝子産物の発現をコードしている組
換えＤＮＡベクターで微生物を形質転換し、この形質転
換細胞をスピラマイシンの産生に好適な条件下で培養す
ることからなる。
マクロライド抗生物質は、非常に分枝したマクロサイク
リックな（大きな環状の）ラクトンであるアグリコンの
存在を特徴とする（一般的には、マーおよびプラクテイ
ス（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｂｉ’ｏｌｏｇｙ　ａｎ
ｄ　Ｐ　ｒａｃｔｉｃｅ）、オームラ（Ｓ、○ｍｕｒａ
）ｌ、アカデミツクｅブレス、ニューヨーク（Ａ　ｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ、ＮＹ）参照）。このアグリ
コンに、■またはそれ以上のデオキシ糖が結合している
。これらの糖は、アシル化することができる。このマク
ロライクリツーりな環は通常、１２−１１４−１または
１６−員環であるが、より大きい環も知られている。
マクロライド抗生物質の作用メカニズムは、タンパク合
成の阻害である。
マクロライド抗生物質は、スタフィロコッカス（Ｓ　ｔ
ａｐｈｙ　１ｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびンプロコノカス
（Ｄ　１ｐｌｏｃｏｃｃｕｓ）の様なダラム陽性菌に対
して非常に活性であり、更に不イセリア辱ゴノロヘア（
Ｎ　ｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｏｈｅａｅ）およ
びメニンギティディス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、
ボルデテラ・ペルランス（Ｂｏｒｄｅｔｅｔｌａ　ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）、およびヘモフィルス・インフルエン
ザ（ＨａｅｍｏｐｈｉＩｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）
の様なダラム陰性閑に対しても活性を有している。オー
ムラ２６頁参照。これらの株は全て、重大な病気の原因
となり得る。スピラマイシンおよびタイロシンを包含す
るマクロライドは、その毒性が低いために、医学および
獣医学分野で臨床的に使用されてきた。オームラ２７頁
参照。
マクロライドはこの様に臨床上有用なので、それぞれの
生合成経路の酵素の産生に関与している遺伝子をクロー
ニングすることは、非常に重要である。これらの遺伝子
を使用して微生物中の酵素濃度を高め、それによって抗
生物質産生効率を高めることができる。ある種の生合成
酵素は“ルーズな”基質特異性を有するので、種々の抗
生物質産生菌間で遺伝子を往来させてハイブリッド抗生
物質を製造することができる（サダカネ等（Ｓａｄａｋ
ａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉ　９８２．　　Ｊ、　　
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　３５：　６８０−６８７）。
また、クローニングした遺伝子は、基質特異性に変化を
導き得る突然変異誘発のための基質として役立ち得る。
遺伝子を更に、本発明の方法による突然変異遺伝子を含
有する株を作成するために使用することもできる。
ストレプトマイセス・アンポファシエンスは、３種類の
糖、即ちミカミノース、ミカロース、およびフォロサミ
ンを含有している１６員環のマクロライドであるスピラ
マイシンを産生じ、その代表的な株は、受託番号ＮＲＲ
Ｌ　Ｉ　５２６３（受託日：　１９８３年１月６日）と
して、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス、ノー
ザン・リージコナル・リサーチ・センター（Ａ　ｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ
、　　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ、　　ＮＲＲＬ）、ペオリア、イ
リノイ、６１６０４（Ｐｅｏｒｉａ、　　Ｉ　Ｌ、　　
６１６０４）から入手し得る。スピラマイシンの生合成
を、第１図に詳細に示す。
本発明は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスゲ
ノムの〜３２ｋｂのスパンに位置する５個のスピラマイ
シン抗生物質生合成遺伝子を包含する。コスミドｐＫＣ
６４，４は、この〜３２ｋｂのスパンを含む挿入ＤＮＡ
を有している。この挿入フラグメントは、Ｓ、アンボフ
ァシエンスＤＮＡの部分的Ｍｂｏｌ消化の産物である。
このＭｂｏＩフラグメントは更に、ヨーロッパ特許公開
第０１５４４３０号に開示されているスピラマイシン抗
生物質耐性付与遺伝子であるｓｒｍＢ遺伝子を含有して
いる。〜３２　ｋｂ　Ｍｂｏ　Ｉフラグメント上のこの
遺伝子の位置を第２図に示す。
ｓｒｍＤ遺伝子は、アグリコンの生合成またはそれへの
３種類の糖の結合に関与している遺伝子産物をコードし
ている。ｓｒｍＤ遺伝子は、コスミドｐＫＣ６４４に含
有されたＳ　アンホファンエンスケノムの〜ｌ　Ｏｋｂ
　ＥｃｏＲＴフラグメントに含有されている。ｓｒｍＤ
の類似体は、ストレプトマイセス・フランエのｔｙｌＡ
遺伝子中に見い出される。ｔｙｌＡ突然変異を有する株
は、糖が結合していないマクロサイクリンクな環である
タイラクトンを蓄積する（タイロンン生合成のダイアグ
ラムとしての第３図、およびホルンおよびセノ（Ｂａｌ
ｔｚａｎｄ　５ｅｎｏ、　　Ｉ　９８１．　　Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ、　　Ａｇｅｒ＋ｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ
、　　２０　：　２１４　２２５）参照）。ｓｒｍＤ遺
伝子は、ｔｙｌＡ突然変異株に欠如している生合成活性
を与える。
アグリコンの生合成またはそれへのミカミノースの結合
は、ｓｒｍＥ遺伝子の産物によって行われる。ｓｒｍＥ
遺伝子は、コスミドｐＫＣ６４４に含有されたＳ　アン
ホファシエンスゲノムの〜１ＯｋｂＥｃｏＲＩフラグメ
ントに含有されている。ｓｒｍＥ遺伝子は、Ｓ。フラジ
エｔｙ＋　Ｂ遺伝子中に対応物を有している。ｓｒｍＥ
遺伝子は、相補性によって、ｔｙ＋　Ｂ突然変異体に欠
如している生合成活性を与えることかできる。ＴｙｌＢ
突然変異株は、タイラクトンを蓄積する。
ｓｒｍＦＳｓｒｍＧ、およびｓｒｍＨ遺伝子も、スピラ
マイシン抗生物質生合成に関与している。ｓｒｍＦ遺伝
子は、コスミドｐＫＣ６４４に含有されたＳアンボファ
シエンスゲノムの〜５．５ｋｂ　Ｘｈｏｌフラグメント
に含まれている。このフラグメントは、第２図において
、ｐＫＣ１００５の挿入ＤＮＡとして示されている。ｓ
ｒｍＦ遺伝子産物は、ラクトン環の形成に続く活性を与
える。ｓｒｍＧ遺伝子は、コスミドｐＫＣ６０４に含有
されたＳ、アンボファシエンスケノムの〜９ｋｂＰｓｔ
ｌフラグメントに含まれている。ｓｒｍＨ遺伝子は、ア
グリコンの形成に関与する。ｓｒｍＨ遺伝子は、コスミ
ドｐＫＣ５４・１に含有されたＳ、アンホファンエンス
ゲノムの〜７ｋｂＫｐｎｌフラグメントに含まれている
。
本発明のスピラマイシン生合成遺伝子は、コスミドｐＫ
Ｃ６４４で形質転換されたＥ、コリ　ＤＫ２２から単離
することができる（第２図）。この微生物は、アグリカ
ルチュラル・リサーチ・サービス、ノーイン・リージョ
ナル・リサーチ・センター（“ＮＲＲＬ”）、ペオリア
、イリノイ、６１６０４から、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ
−１８２３８（受託口　１９８７年７月９日）で入手す
ることかできる。コスミドｐＫＣ６４４は、ストレプト
マイセス・アノポファンエンスＤＮＡのゲノムコスミド
ライブラリーから作成された。当業者は、Ｍｂｏｒの様
な制限酵素によって部分的に消化されたゲノムＤＮＡを
クローニングするための適当な方法は理解しているであ
ろう。代表的な方法は、ラオ等（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、
）の１９８７、メソノズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５３
　：　１．６６ｉ９８（つおよびグロスマン（ＲＷｕ　
ａｎｄ　Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎ）編、アカデミツク０プ
レス、ニューヨーク）に記載されている。挿入ＤＮＡ（
〜３２ｋｂ、第２図）は、上記の５個のマクロライド抗
生物質遺伝子およびｓｒｍＢスピラマイシン耐性遺伝子
を含有している。コスミドｐＫＣ６４４のベクター骨格
（ｐＫＣ４７３）を第４図に示す。
挿入ＤＮＡはコスミドｐＫＣ４７３のＨｉｎｄｕ部位に
クローニングされた。
ｐＫＣ６４４からの挿入ＤＮＡのサブクローンを、個々
の遺伝子を含有するように構築した。本発明は、５個の
ｓｒｍ生合成遺伝子各々のサブクローンをも提供する。
サブクローンを使用し、宿主細胞にサブクローンをトラ
ンスフオームすることによって、個々の生合成遺伝子産
物の細胞内濃度を高めることができる。クローニングさ
れた遺伝子を更に、個々の遺伝子を欠いた突然変異株を
作成するために使用することができ、これもまた本発明
の重要な態様である。
ｓｒｍＤおよびｓｒｍＥ遺伝子は、プラスミドｐＫＣ６
６８から単離することができる（第７図）。プラスミド
ｐＫＣ６６８は、コスミドｐＫＣ６４４を制限酵素Ｅｃ
ｏＲｒで消化し、得られた〜ｌ０ｋｂＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントを単離し、このフラグメントをＥｃｏＲＩ消
化プラスミドｐＨＪＬ４Ｑｌとライゲートすることによ
って作成した（第５図）。
プラスミドｐＨＪＬ４０１は、受託番号ＮＲＲＬＢ１８
２１７（受託口：　１９８７年５月７日）でＮＲＲＬか
ら入手可能であり、ラルソンおよびバーシュバーガー（
Ｌａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ）の１
９８６、プラスミド（Ｐ　ｌａｓｍｉｄ）　ｌ　５°　
１９９−２０９に記載されている。〜１０ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントはベクターｐＨＪＬ４．０１に２方向
でライゲートされたので、本発明は、ｓｒｍＤ遺伝子を
含有する２個の例示プラスミド、ｐＫＣ６６８およびｐ
ＫＣ６６８Ａを提供する。〜１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラ
グメントの方向は、当業者に周知の制限酵素分析によっ
て決定された。
ｓｒｍＦ含有プラスミドは、コスミドｐＫＣ６４４を制
限酵素Ｘｈｏｌで消化し、得られた〜５．５ｋｂＸｈｏ
ｌフラグメントを単離し、これをＳ　ａｉ２Ｉで部分的
に消化したプラスミドｐＯＪＩ６０にライゲートするこ
とによって構築することかできる（ＳａρＩ末端は、Ｘ
ｈｏＩ末端に適合している）。〜５５ｋｂ　Ｘｈｏｌ　
７ラグメントは、Ｓ　ａ（ｌ　Ｉ　ｉｌ肖化しｔコル。
Ｊ　１６０に逆方向にライゲートされることかあるので
、ライゲーションの結果２個のプラスミド、ｐＫＣ１０
０５（第９図）およびｐＫＣ１００５Ａを与える。〜５
．５ｋｂＸｈｏｌフラグメントの方向は、制限酵素分析
によって決定することができる。
プラスミドｐＫＣ６０４（第８図）は、ｓｒｍｃ遺伝子
を含有する、本発明を例示するベクターである。
このプラスミドは、コスミドｐＫＣ６４４を制限酵素Ｐ
ｓｔｌで消化し、得られた〜９ｋｂＰｓｔｌフラグメン
トを単離し、これを、ＰｓｔＴ？ｌ’ｌ化したｐＯＪ１
６０、即ち受託番号ＮＲＲＬＢ−１８０８８（受託口：
　１９８６年７月２９日）でＮＲＲＬから入手可能なプ
ラスミドにライケートすることによって構築された（第
６図）。〜９ｋｂＰｓｔｌフラグメントはベクターに２
方向でライゲートされ、例示したプラスミド、ｐＫＣ６
０４およびｐＫＣ６０４Ａを与えた。〜９ｋｂＰｓｔｌ
フラグメントの方向は、制限酵素分析によって決定する
ことができる。
ｓｒｍＨ遺伝子は、受託番号ＮＲＲＩ、Ｂ−１８２３７
（受託口：　１９８７年７月９日）で入手し得るコスミ
ドｐＫＣ５７１から単離することができる（第２図参照
）。コスミドｐＫＣ５７１は更に、ｓｒｍＤ、ｓｒｍＥ
、およびｓｒｍＧ遺伝子を含有している。
当業者には、種々の方法、即ち制限酵素での部分的消化
によって、ｓｒｍＤ、　ｓｒｍＥ、　ｓｒｍＦ、　ｓｒ
ｍＧ。
およびｓｒｍＨ遺伝子の多数の組合わせを単離し得る様
になることが理解されよう。人手可能な多数のストレプ
トマイセスベクター（第１表）によって、当業者は種々
の要求に適合するように挿入体、ベクターおよび宿主細
胞の組合わせを組み立てることができる。抗生物質耐性
マーカー、復製開始点、および制限酵素部位の様な変更
可能な因子の選択は、ベクターを適当に選択することに
よって適合させることができる。ここに示した個々のベ
クターは単なる例示にすぎず、本発明の範囲を限定する
ものではない。
第１表　ストレプトマイセスのプラスミドプラスミド　
　宿主　　　　　　受託番号Ｓ　ＣＰ　２　　ＳＬｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ　Ａ３（２）　　　１５０４２Ｓ　ＣＰ　２　＊
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬｃｏ
ｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＭＩＩＯ１５０４１ｐ　Ｅ　Ｌ　７
　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＥＬ７　　１２５２３ｐ　Ｕ
　Ｃ６Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬ
ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ　　　　　　　　　　　　　　１　
１　４　３　９ｐ　Ｕ　Ｃ３Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　　　　　Ｎ　ＲＲＬ３０２２Ａ　　　　　　　　　ｌ
　１４４１Ｓ　Ｌ　Ｐ　Ｉ　　５ｔｒｅｐむｏｍｙｃｅ
ｓ　　　　　ＮＣｒ　Ｂ１１ｖｉｄａｎｓ　　　　　　
　１１４１７ｐＮ　Ｍ　１００　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬｖｉｒｇ＋ｎ１ａｅ　　　
　　　ｌ　５１５６ｐＥ　Ｌ　１０３　　Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　　　　　Ｎ　ＲＲＬｇｒａｎｕｌｏｒｕ
ｂｅｒ　　　　　Ｉ　２５４９Ａ３９９１２．１３／［
）ＥＬ］、０３ｐｌ　Ｊ　７０２　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　　　　　ＡＴＣＣ２１ｉｖｉｄａｎｓ　　　
　　　　　３９１５５１：ナショナル・コレクンヨン・
オブ・インクストリアル・ハタテリア（ＮＣＩＢ）、ト
リー・リサーチ・ステーンヨン、ポスト・オフィス・ホ
ックス３１．１３５　アヘイ・ロード、アバディーンＡ
Ｂ９８ＤＧ、スコツトランド、イギリス（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩ　Ｂ）、　Ｔｏｒｒ
ｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、　　Ｐｏ５ｔ
　０ｆｆｉｃｅ　ＢＯＸ３１．１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒ
ｏａｄ、　　Ａｂｅｒｄｅｅｎ　Ａ　Ｂ　９８　ＤＧ。
５ｃｏｔｌａｎｄ　　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）
２：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン、
ロックビル、メリーランド２０８５２（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　　ＭＤ　　２０８５２）従って、
本発明は、本発明の抗生物質遺伝子を含有している特定
のベクターに限定されるものではなく、むしろ、組換え
宿主細胞に生合成遺伝子を導入するためにいかなるベク
ターが使用されようとも、その生合成遺伝子を包含する
ものである。
当業者には、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２３８で入
手し得るｐＫＣ６４４からのｓｒｍＤ、　ｓｒｍＥ。
ｓｒｍＦ、　ｓｒｍＧ、および５ｎｎＨ配列を使用し、
その池の生合成遺伝子含有セグメント、とりわけマクロ
ライド生合成遺伝子をコードしているセグメントを得る
のに使用するためのＤＮＡプローブを作成し得るという
ことが理解されるであろう。また、天然および研究室の
両者においてストレプトマイセス・アンボファシエンス
株が多様であるため、本発明のｓｒｍ遺伝子含有化合物
があれば、容易に単離され得るｓｒｍ遺伝子の種々のア
レル変異体が存在するであろう。ｓｒｍ遺伝子産物のア
ミノ酸残基配列とは異なるアミノ酸残基配列を有する遺
伝子産物をコードしているこれらのアレル変異体は、本
発明のｓｒｍ遺伝子と機能的に同等であり、従って、こ
れらは本明細書で使用されるｓｒｍ遺伝子という語句に
包含されるものとする。
また、遺伝コードの縮重により、当業者は、天然の遺伝
子配列の活性と同一または機能的に同一の活性をコード
し得るＤＮＡ配列の合成法は熟知している。同様に、当
業者は、天然の配列と同一または実質」二同−のポリペ
プチド活性をコードしている新規な配列を作成するため
に、遺伝子配列を修飾または突然変異させるための方法
を熟知している。従って、遺伝子のこれらの合成的突然
変異体および修飾形態およびこれらの遺伝子の発現産物
もまた、本発明に包含されるものとする。
マクロライド抗生物質遺伝子を単離し得る株を例示する
リストを、その株によって産生される抗生物質と一緒に
第２表に示す。また、第２表に例示した株は、新規な抗
生物質を製造するためにｓｒｍ遺伝子を導入するのに好
適な宿主微生物である。
第２表　マクロライド、リンコサミド、およびストレプ
トグラミン抗生物質産生微生物微生物　　　　　　　抗
生物質 Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ　　　　　　　ロサラマイゾンＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ １ｂｕｓ ａｌｂｕｓ　　ｖａｒ。
ｃｏｉ　１ｍｙｃｅＬｉｃｕｓ ａｍｂｏｒａｃｉｅｎｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ｂｒｕｎｅｏｇｒ＋ｓｅｕｓ ｃａｅｌｅｓｔｉｓ ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｃｉｒｒａｔｕｓ ｅｌｔａｅ ｄｊａｋａｒｔｅｎｓ＋５ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ カルボマインン ミコノマイシン アルボマイセチン コレイマイシン スピラマイシンおよび フォロマシジンＤ オレアンドマイシン アベルメクチン類 チャルコマインン アルボサイクリン Ｍ２Ｂ５および セレスチセチン シラマイシンＢ シラマイシン デルタマイシン類 ニダマイシン エリスロマイシン類 メチマイシン Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ ｆ’ａｓｃｉｃｕｌｕｓ ｆｅｌｌｅｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｆ　ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ｒｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ ｇｒｉｓｅｏｒａｃｉｅｎｓ ｇｒｉｓｅｏｆｌａｂｕｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ　ｉｓ ｇｒｌｓｅｌｌｓ アンゴラマイシン アクマイシン アルコマイシンおよび ビクロマインン アクマイシン アクマイシンおよび ノンコマイレン類 タイロシン Ａ−１８１ ニスピノマイシン類 ミデカマインン バンダマイ／ン ＰＡ１３３ＡおよびＢ アクマイシン フンドリン グリセオマインン レロマイシン ボレリジン Ｓｊｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｌｓｅＬｌｓ　　ＳＳｐ ｓｕｌｐｈｕｒｕｓ ｈａｌｓｔｅｄｉ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｓｕｂｓｐａｕｒｅｏｌ
ａｃｒｉｍｏｓｕｓ ｋｉｔａｓｔｏｅｎｓｉｓ ａｖｅｎｄｕｌａｅ １ｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ ｏｉｄｅｎｓｉｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｍａ＋ｚｅｕｓ ｍｙｃａｒｏｒａｃｉｅｎｓ ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ パフィロマイシン類 カルボマイジンおよび ロイカニシシン タイロシン ミルベマイシン類 ロイコマイシンＡ３および ジョサマイシン アルコマイシン リンコマイシン ベルナマイシンΔおよヒＢ カルホマインン イングラマイノン アセチル−ロイコマイシン およびニスピノマイシン ジョサマイシンおよび ナルポマイシン Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ。
ｊｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｒ＋ｍｏｓｕｓ ｒｏｃｈｅｉ ｒｏｃｈｅｉ　　ｖａｒ。
ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ ｓｐ＋ｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ ｅｎｄａｅ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ロイコマイシンＡ３および ジョサマイシン オレアンドマイシン プラテノマイシン タイロ／ンおよび ノイトラマインン ランカンジンおよび ボレリジン アルボサイクリン アルボサイクリン ｖａｒ。
クジマインン類 力ルポマイシン カルポマインン メチマイノン類 ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ　　　　ランカンジ類およ
びランカンジン 本発明は、ｌまたはそれ以上のスビラマイノン生合成遺
伝子を含有している組換えプラスミドを、生合成遺伝子
か発現し得る条件下、宿主細胞にトランスフオームする
ことによる、微生物の抗生物質生合成能を高めるための
方法を提供する。所望により、高コピー数プラスミドを
用い、生合成酵素を高収量で得ることができる。本発明
のベクターを使用して、種々の微生物を形質転換し、微
生物のスピラマイシン産生能を高めることができる。
また、新規な抗生物質の製造を目的とし、種々の抗生物
質産生微生物、とりわけマクロライド抗生物質産生微生
物を形質転換するためにこの遺伝子を使用することかで
きる。前記の表は、新規な抗生物質を産生させるかまた
は抗生物質の産生を高めるためにｓｒｍＤ、　ｓｒｍＥ
、　ｓｒｍＦ、　ｓｒｍＧ、　ｓｒｍ［（遺伝子を使用
し得る、種々の抗生物質産生微生物の代表的なサンプル
を示す。
スピラマイシン生合成遺伝子は、ストレプトマイセス・
アンボファシエンスおよびＳ、フラジエ中でとりわけよ
く機能する。例えばストレプトマイセスのプロモーター
がＥ、コリの様な与えられた微生物中で機能しなかった
ために、もとのスピラマイシン生合成遺伝子がその微生
物中で発現しなかった場合でも、本発明のｓｒｍＤＳｓ
ｒｍＥＳｓｒｍＦＳｓｒｍＧ、ｓｒｍＨコード配列を、
適当なプロモーターおよびリポソーム結合部位を含有し
ているＤＮＡ配列にライゲートし、選択した宿主中でＳ
ｒｍＤ、　ｓｒｍＥＳｓｒｍＦ、　ｓｒｍＧ、　ｓｒｍ
Ｈ遺伝子を発現させることができよう。
スピラマイシン以外の生合成経路においてもｓｒｍ遺伝
子を使用することができる。代表的な用途の１つは、ス
トレプトマイセス・フラジエにおけるタイロシンの産生
を高めることである。タイロシンは、ストレプトマイセ
ス・フラジエによって産生される抗生物質である。これ
は、ラクトン環のＣ−９位にフォロサミンが欠如し、Ｃ
−２３ヒドロキフル基にマイシノースが存在し、Ｃ−４
ヒドロキシル基にアンル化か欠如していることを包含す
る幾つかの点でスピラマイシンと異なる。
突然変異Ｓ、フラシエｔｙｌＡ株Ｇ５１４（ＮＲＲＬ１
２１８８、受託日用９８１年１月３１日；別称Ｓ、フラ
ジエＡ　２５２．５）は、３個の糖全ての形成が妨害さ
れている。ｔｙｌＢ突然変異株Ｇ５５Ｑ（ＮＲＲＬ　１
２２０Ｌ受託日：１９８１年１月３１日；Ｓ、フラジエ
Ａ２５２．６）およびＰＭ７３は、ミカミノースの合成
または結合が妨害されている。ｔｙｌＡおよびｔｙｌＢ
突然変異は、その他のタイロシン生合成経路突然変異株
との共発酵に対する異なった応答によって、別々の遺伝
子に存在することが示された（ボルフ（Ｂ　ａｌｔｚ）
およびセ／　（Ｓ　ｅｎｏ）、前掲）。ｓｒｍＤおよび
ｓｒｍＥ遺伝子は、それぞれ、ｔｙｌＡおよびｔｙｌＢ
活性を与える。
本発明で例示したプラスミドｐＫＣ６６８は、ｓｒｍＤ
およびｓｒｍＥ遺伝子を含有している。プラスミ　ドｐ
ＫＣ６６８を、ＮＲＲＬ　１２１８８（ｔｙｌＡ突然変
異株）およびＮＲＲＬ　１２２０１（ｔｙｌＢ突然変異
株）の両者にトランスフオームした。固形質転換株はタ
イロシンを産生じたので、ｓｒｍＤおよびｓｒｍＥ遺伝
子産物はそれぞれｔｙｌＡおよびｔｙ＋Ｂ遺伝子の代り
をすることができる。同様の結果を達成し得る株は、第
２表に見い出される。
本発明の例示ベクターは、クローニングベクター中の制
限部位に適合する制限部位を両端に持っていない場合で
も、構築され得る。本発明の例示ベクターを構築するた
めに使用される制限フラグメントは、ライゲーションを
容易にするために、当業者に周知の方法によって１ｒ飾
することができる。例えば、特定のスピラマイシン遺伝
子含有制限フラグメント、またはベクターの複製または
組込み機能を含有しているＤＮＡに、分子リンカ−をつ
けることができる。この様にして、次のライゲーション
のための特異な部位を都合よく構築することかできる。
また、種々のスピラマイシン生合成遺伝子含有制限フラ
グメント、′ｆｒｉ製開始点、またはベクターの染色体
組込みを可能にする配列は、その特性を変えたり、ある
いはライゲーションのための種々の制限部位を付与する
ために、定のヌクレオチドを加えたり、削除したり、あ
るいは置換したりして修飾することができる。当業者は
、ヌクレオチド化学および遺伝子暗号を理解しており、
特定の目的のためにはどのヌクレオチドを置き換え得る
か、どのＤＮＡＩ飾が望ましいかを理解している。スピ
ラマイシン生合成遺伝子含有制限フラグメントは、重要
な、ベクター制御機能が破壊されない限り、クローニン
グベクター上の特定の位置に限定されない。当業者は、
ベクター上のとの部位が特定のスピラマイシン遺伝子含
有制限フラグメントのライゲーションまたは挿入に有利
であるかを理解し、容易に決定することができる。
もちろん、本発明のスピラマイシン生合成遺伝子を使用
し、プラスミド以外のベクターを構築することもできる
。ファージφＣ３１は、周知のストレプトマイセスファ
ージであり、これは、本発明を更に例示する組込みベク
ターを構築するための出発物質の優れた供給源である。
ファージφＣ３１の誘導体、ファスミドｐＫＣ３３１は
、この様な組込みベクターを構築するためにとりわけ好
ましく、Ｅ、コリに１２　　ＢＥ４４７／、ｐＫＣ３３
１（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８２８、受託臼：１９８４年
８月３日）から人手することができる。φＣ３１タイプ
のファージは組込みベクターであり、スピラマイシン生
合成遺伝子を組み込み、それによってストレプトマイセ
スにスピラマイシン生合成活性を与えるように容易に修
飾することができる。
本発明は、標的宿主細胞にスピラマイシン生合成遺伝子
を導入するために使用されるベクターの種類によって限
定されないだけでなく、導入が起こった後のスピラマイ
シン生合成遺伝子の位置１：　ヨっても限定されない。
本発明のベクターは、１またはそれ以上のスピラマイジ
ン抗生物質生合成遺伝子をコードしているＤＮＡを含有
している。プラスミドの増幅および操作はストレプトマ
イセス中よりＥ、コリ中でより速く、より効率的に行わ
れるので、Ｅ、コリ中での′ｆＭ製を可能にするＤＮＡ
配列を更に加えるのが都合よい。従って、例えばｐＵｃ
８、ｐＵｃ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢ　Ｒ３２２、ｐＡｃ
Ｙｃ１８４、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８等の様な、Ｅ
、コリプラスミド由来の機能的レプリコン含有制限フラ
グメントおよび抗生物質耐性付与制限フラグメントの付
加が非常に有利であり、本発明の例示ベクターの一般的
な有用性を増す。
本発明のクローニングベクターおよび形質転換体は、ス
トレプトマイセスおよび関連細胞中で現在生産されてい
る種々の産物の収量を高めるための遺伝子のクローニン
グを可能にする。本発明はまた、種々の有用なりＮＡ配
列をクローニングし、特性化し、再構築するのに有用な
選択可能なベクターを提供する。
本発明の遺伝子およびベクターは、新規な抗生物質を製
造するための手段を提供する。とりわけ好適な宿主は、
抗生物質生合成経路における中間体を蓄積する突然変異
株である。この様な株は、本発明の１またはそれ以上の
遺伝子で形質転換するとよい。するとその遺伝子産物は
、中間体を新規なハイブリッド抗生物質に生体内変換し
てくれスピラマイノン抗生物質突然変異株は、新規な抗
生物質を製造するのに有用である。ハイブリッド抗生物
質は、突然変異株に新しい基質を供給するかまたはマク
ロライド抗生物質生合成遺伝子で株を形質転換すること
によって製造し得る。本発明は、この様な突然変異株を
提供する。ｓｒｍ突然変異株は、欠失、ニトロソグアニ
ジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミンの様な化学物質で誘
発される点突然変異、および挿入突然変異誘発を包含す
るがこれに限定されない多数の通常の組換えＤＮＡ技術
によって、■またはそれ以上のクローニングされたｓｒ
ｍ遺伝子を突然変異させることによって作成し得る。挿
入突然変異誘発は、マーカー遺伝子の挿入を選択し得る
ので、好ましい方法である。
突然変異させた遺伝子を宿主細胞にトランスフオームし
、次いで、ホモローガスな組換えによって染色体に挿入
し、突然変異株を得ることができる。
代表的な例は、ｓｒｍＦ、　ｓｒｍＧ、およびｓｒｍＨ
の突然変異株である。
本発明によって提供される、例示したｓｒｍＦ突然変異
株は、ｓｒｍ−１２と呼ばれる。ｓｒｍ−７およびｓｒ
ｍ−８は、非機能的なｓｒｍＧ遺伝子を有する２個の別
個の突然変異株である。ｓｒｍＨ突然変異株のクラスは
更に、ｓｒｍ）（中に２個の別個の挿入物を含有し、ｓ
ｒｍ−１４およびｓｒｍ−２２と呼ばれる。
第２図は、各々の挿入の図式である。各遺伝子は、挿入
突然変異のために不完全である。点突然変異とは異なり
、挿入突然変異は、野生型の状態に戻らない。本発明に
よって提供される突然変異株は、非常に安定である。突
然変異株は、Ｔｎｌ　Ｏホッピング株に特定のベクター
をトランスフオームし、次いでクローニングされたＤＮ
Ａをトランスポソン突然変異誘発することによって作成
される。次いで、このクローニングされたＤＮＡをマク
ロライド抗生物質産生宿主細胞にトランスフオームし、
ホモローガスな組換えによって、突然変異ＤＮＡを宿主
細胞ゲノムに挿入する。
新規なハイブリッド抗生物質を製造するために、幾つか
の方法で突然変異株を使用することかてきる。第１に、
これらは、それ自身、抗生物情性を有する中間体を蓄積
することができる。第２に、前記の如く、好適な宿主細
胞が外来遺伝子で形質転換された時、中間体は生体内変
換される有効な基質となり得る。第３に、突然変異体に
独特の基質を補足することにより、新規な抗生物質を製
造することができる。本発明は、この様な例を提供する
。例示のｓｒｍ−１４およびｓｒｍ−２２突然変異株（
ｓｒｍＨ突然変異株）にタイラクトン、即ちタイロジン
経路における前駆体を供給すると、スピラマイシン以外
の抗生物質か合成される。
ｓｒｍＦ突然変異株（ｓｒｍ−１２）をｓｒｍＨ突然変
異株（ｓｒｍ−１４およびｓｒｍ−２２）と−緒に共発
酵すると、スピラマイシンを産生ずる。ｓｒ＋ｎＨ突然
変異株はタイラクトンの補足に答えてくれるが、ｓｒｍ
Ｆ突然変異株は応答しない。ｓｒｍＧ突然変異株（ｓｒ
ｍ−７およびｓｒｍ　　８）はこれらの突然変異株と一
緒に共発酵しないだけではなく、これらは補足に対して
応答しない。この突然変異株は、実施例１０１３の記載
のようにして作成することかできる。
本発明は更に、変化したマクロライド生合成遺伝子を持
った突然変異株の作成方法を提供する。
この方法は、クローニングされたスピラマイシン生合成
遺伝子ＤＮＡのイン・ビボにおけるトランスボゾン突然
変異誘発、次いでマクロライド産生ストレプトマイセス
染色体への突然変異ＤＮＡの導入を利用する。クローニ
ングされたスピラマイシン挿入ＤＮＡを、受託番号ＮＲ
ＲＬ　　Ｂ−１８７３２（受託臼：　１９８８年６月３
日）でＮＲＲＬから人手し得るＥ、コリＴｎｌ　Ｏホッ
ピング株ＢＥ１９９７に導入する。
ホッピング株は、（ｉ）選択可能なマーカーとしてＮｍ
ＲおよびＢ（Ｒを含有しているＴｎｌ　Ｏエレメントを
含有するＦ”エレメント；（ｉｉ）ＴＰＴＧ誘発可能な
ｔａｃプロモーターの制御下にあるトランスフオーゼ遺
伝子を含有するＴｃＲプラスミドｐＡｃＹｃ１８４；お
よび（ｉｉｉ　）熱誘導により、ｐＫＣ６４４またはい
ずれかのコスミドを取り込むであろう不完全なラムダフ
ァージｃＩ８５７を含有している。得られた株をまず、
］ｍＭＩＰＴＧで処理し、耐性遺伝子のランダムな転移
を起こす。
４５°Ｃで熱誘発すると、ｃ１８５７リブレ９．サーの
抑制を解除し、クローニングされた挿入ＤＮＡ中に挿入
を伴った組換えベクターＤＮＡを有しているファージ粒
子が得られる。ファージリゼートを調製し、通常のλ−
感受性Ｅ、コリ株に導入する。アブラマイシンおよびプ
レオマイシン上で選択を行う。クローニングされたＤＮ
Ａへの挿入を確認するために、これらの形質導入体から
のプラスミドＤＮＡを制限酵素消化によって分析する。
次に、突然変異ＤＮＡを、マクロライド抗生物質産生ス
トレプトマイセスにトランスフオームする。二重交差に
よるホモローカスな組換えは、識別および単離し得る微
生物を与える。組換えベクターは、その骨格上に抗生物
質耐性マーカー遺伝子およびクローニングされたＤＮＡ
に挿入されたネオマイシン耐性遺伝子を有している。二
重交差は、染色体にネオマイシン耐性遺伝子を残し、ベ
クター骨格を切除する。従って、ネオマイシン耐性につ
いて選択すると、染色体か少なくとも１回の組換えを経
た微生物が得られるであろう。望ましい第２の交差は、
ヘクター骨格上の抗生物質耐性マーカーに対する感受性
についてスクリーニングすることによって示される。こ
のことは、ベクター骨格が宿主染色体中に全く存在しな
いであろうことを保証する。得られた細胞は、元のニス
ミド上に含有された遺伝子による突然変異体となるであ
ろう。当業者には、本発明が、本明細書に例示された明
記された抗生物質耐性遺伝子に限定されないことが理解
されるであろう。
この方法は、スピラマイシ生合成株に対し突然変異した
株を単離するのにとりわけよく適合している。抗生物質
生合成遺伝子中の突然変異体は、常法により、抗生物質
産生の欠如によって選択される。スピラマイシン抗生物
質生合成において不完全な本発明の突然変異株は、実施
例９−１２に詳述した本発明方法によって単離された。
この方法はまた、突然変異配列のクローニングを容易に
し得、野生型遺伝子のクローニング法を提供する。
本発明は、変化させた抗生物質生合成遺伝子を含有して
いる宿主細胞の製造法であって、該方法は、（１）スピ
ラマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列を組換えＤ
ＮＡ法によって変化させ、（２）ステップ（１）の該遺
伝子を抗生物質産生宿主細胞に導入し、（３）ホモロー
ガスな組換えプロセスによって、ステップ（１）の変性
した遺伝子を組み込んだステップ（２）の形質転換細胞
を確認することからなる方法を提供するものである。
ストレプトマイセスは、幾つかの異なる培地のいずれか
を使用し、多数の方法で培養することかできる。培地中
の好ましい炭水化物供給源には、例えば糖蜜、グルコー
ス、テキストリンおよびグノセロールかある。窒素供給
源には、例えばダイズ粉、アミノ酸混合物およびペプト
ン類がある。
栄養無機塩類を含有させてもよく、ナトリウム、カリウ
ム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、塩化物、硫酸
塩等のイオンを生じ得る通常の塩を包含する。他の微生
物の増殖および生育に必要である様に、必須微量元素も
加えられる。
以下に実施例を挙げ、本明細書に開示した発明を更に詳
細に例示し、説明する。本発明は、以下のいずれの実施
例によっても範囲が限定されるものではない。試薬の供
給源または装置は参考までに記載したものであり、いか
なる意味においても本発明を限定しない。本発明を構成
するための説明や実際の方法は、適所に記載されている
。
実施例１　コスミドｐＫＣ６４４の単離コスミドｐＫＣ
６４４（第１０図）は、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８
２３８で、ノーイソ・リージョナル・リサーチ・センタ
ー（ＮＲＲＬ）、ペオリア、イリノイ６１０４に寄託さ
れているＥ、コリ（大腸菌）Ｋ１２　　ＤＫ２２から入
手することができる。
このｐＫＣ６４４コスミドＤＮＡを使用し、本発明の遺
伝子を単離し、スピラマイシン生合成突然変異株を作成
した。アブラマイシン２００μ９／ｆｆｃを含有してい
るし一アガープレート（１（２当たり、トリプトン１０
ｇ、ＮａＣＱｌｏｙ、酵母エキス５７および寒天１５２
）にＥ、コリに１２　　ＤＫ２２／ｐＫＣ６７１４の凍
結乾燥菌を蒔き、この株の単一コロニー単離物を得た。
このコロニーを使用し、アブラマイジン２００μｇ／ｆ
ｆｃを含有しているしブロス（寒天を含まないＬアガー
）（約５００　ｍ（１）に接種し、得られた培養物を細
胞が静止期に達するまで、空気を吹き込みなから３０’
Ｃでインキュ゛ベートした。
ラオ等（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、）の方法［１，９８７、
メソッズ・イン・エンザイモロジー、１５３：１６６１
９８、アール・つ（Ｒ，Ｗｕ）およびグロスマン（Ｌ　
、　　Ｇ　ｒｏｓｓｍａｎ）ｆｆｉ、アカデミツク・プ
レス、ＮＹ］に従い、以下の様にして細胞からコスミド
ＤＮＡを得た。
細胞を８００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心した。上清をデ
カントした後、２５％シュクロース、５０…Ｍトリス・
ＨＣ（！、ｐＨ８，０（７肩のに細胞を再懸濁した。こ
の溶液に、新たに調製したりゾチーム（５ｍ９／　ｒｐ
（ｌ溶液０．２５＋の、および０．５Ｍ　ＥＤＴ　Ａ　
（ｐＨ８）（０，４ｍＱ’）および５　ｍ９／　ｍＱ　
ＲＮ　ａｓ６Ａ（０，０５ｆｆのを加えた。この混合物
を３７°Ｃで１５分間インキュへ一トシた。この混合物
に、トリトン溶菌ミンクス（１５０ｍＭトリス・ＨＣ（
！、ｐｌ（８，０，３％トリンＸ−１００■、２００ｍ
ＭＥＤＴＡ）（０，７５７７のを加え、混合し、水上で
１５分間インキユヘートした。溶菌が完全でない場合は
、これを３７°Ｃで更に約５分間インキュベートした。
混合物を２０．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心した。上清
を取り出し、保存した。ＤＮＡ溶液（３］、　、　−２
ｍ□にＣｓＣｆ２（２８，６５ｇ）を加えることによっ
て、Ｃ５Ｃ（！グラジェント（密度１．５５）を調製し
た。このグラジェント溶液を混合して溶解し、大きな超
遠心チューブに移した。チューブを臭化エチジウム（ｆ
ｏｘｙ／ｘの（〜０，６ｍので満た腰封をして混合した
。
グラジェントを４９．ＯＯＯｒｐｍで１８時間遠心した
。長波ＵＶ光で見えるプラスミドＤＮＡの下方ノハンド
ヲ集めた。イソアミルアルコールで４〜５回抽出するこ
とによって、臭化エチジウムを除去した。ＤＮＡ溶液を
ＴＥバッファー（１０ｍＭトリス・ＨＣＣ１ｐＨ８，０
、ｌ　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）（２リツトル）に対して
透析し、２時間後、新しいＴＥで置き換えた。透析した
溶液をフェノールで２回、クロロホルム；イソアミルア
ルコール（２４：１）で２回抽出した。１０分の１容量
の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３倍容量のエタノールを加
え、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。１０．ＯＯＯｒｐ
ｍで１０分間遠心してＤＮＡを集め、７０％エタノール
次いで１００％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌ＴＥ
（約２５０μ（りに溶解した。２６０および２８０μｍ
で光学密度を測定することによって、濃度および純度を
調べた。ｐＫＣ６４４の挿入ＤＮＡの制限部位および機
能地図を添付の図面の第２図に示す。
実施例２　プラスミドｐＫＣ６６８の構築Ａ、プラスミ
ドｐＨＪＬ４０１の単離 プラスミドｐＨＪＬ４０１（ラルソ７（Ｌａｒｓｏｎ）
およびバーシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ）、
１９８６、プラスミドＩ５：　１９９−２０９）は、Ｎ
ＲＲＬに受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２１７で寄託さ
れたＥ、コリに１２　　ＪＭ］０９から入手することか
できる。プラスミドｐＨＪＬ４０１は、Ｅコリまたはス
Ｉ・レブトマイセス中で複製可能であり、２種の抗生物
質、アンピシリンおよびチオストレプトンに対する耐性
マーカーを含有しているので、有用なベクターである。
チオストレプトンはストレプトマイセス中においてのみ
選択可能であり、アンピシリンはＥ、コリ中において選
択可能である。プラスミドｐＨＪＬ４０１はまた、１ａ
ｃＺ遺伝子中にポリリンカー複数クローニング部位領域
を有している。従って、ＤＮＡ挿入物は、細胞をＸガル
上に蒔いた後、白色コロニーを採取することによって選
択することができる（実施例２Ｂ参照）。Ｅ、コリに１
２μＭＩ０９／＋１１１（ＪＬ４０１の凍結乾燥菌を、
１００μｇ／＋σアンピシリン、４０ａｙＸガル／ｍＱ
および４０μｙｌ　ＰＴＧ／ｍＱを含有しているし一ア
ガープレー！・に蒔き、この味の単一の青色コロニー単
離物を得た。このコ０ニー４使用Ｌ、１００μ９／ｍ（
ｌアンピシリンを含有しているしブロス（約５００ｍの
に接種し、得られた培養物を、細胞が静止期に達するま
で、空気を吹き込みなから３７°Ｃでインキュベートし
た。
細胞からプラスミドＤＮＡを得、これを実質上実施例１
に記載の方法に従い、プラスミドｐＫＣ６６８の構築に
使用した。プラスミドｐＨＪＬ４０１の制限部位および
機能地図を添付の図面の第５図に示す。
Ｂ、プラスミドｐＫＣ６６８の最終構築プラスミドｐＫ
Ｃ６６８は、ｓｒｍＤおよびｓｒｍＥ遺伝子を含有して
いる本発明を例示するベクターである。このプラスミド
を、以下の方法で構築した。１０　Ｘ　ＥｃｏＲ，ｌバ
ッフｙ−（１ＭｈリスーＨＣρ、ｐＨ＝７．５　；　０
．５Ｍ　ＮａＣ＋７；および５０ｍＭＭｇＣρ、）（２
μの、ｒ−ｒ２ｏ（６μの、制限酵素ＥｃｏＲＩ（〜４
０単位；本明細書中、特に断らない限り、単位の定義は
、ニュー・イングランド・バイオラプス（ＮＥＢ）、３
２トザー・ロード、ビバリー、マサチューセソツ０１９
］、５５−９９９０（Ｎｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ　１ｏ
ｌａｂｓ（Ｎ　Ｅ　Ｂ）、　　３２ＴｏｚｅｒＲｏａｄ
、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡＯ１９１５９９９０の定義に従
う）（２μρ）に、プラスミドｐＨＪＬ４０１　ＤＮＡ
（約１０μｇ）（１０μのを加えた。得られた反応物を
３７°Ｃで２時間インキュベートシた。
次いで反応混合物の酢酸ナトｌ）ラム（Ｎ　ａｏ　Ａ　
ｃ）ａ度を０．３０Ｍに調節し、２５倍容量のエタノー
ルを加え、反応混合物を一７０’Ｃに冷却し、遠心して
沈澱したＤＮＡをペレット化することによってＥｃｏＲ
Ｉ−消化プラスミドｐＨＪＬ４０］ＤＮ△を抽出し集め
た。ＥｃｏＲＩ−消化プラスミドｐＨＪ　Ｌ、４０１　
ＤＮＡのペレットをＴＥバッファー（４００μのに再懸
濁した。細菌アルカリホスファターセ（インターナショ
ナル・バイオチクノロノー・インコーホレイテッド（Ｉ
ＢＩ）、ピー・オー・ホックスｌ　５６５、ニュー・ヘ
イフン、コネチカノトＯ６５０６（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　Ｉｎ
ｃ、　（ＩＢＩ）、　　Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ１５６５Ｎｅｗ
　Ｈａｖｅｎ、　　ＣＴＯ６５０６）（約１μの（０，
１単位）をＤＮＡ溶液に加え、この反応物を６５°Ｃで
１時間インキュベートした。反応混合物をフェノール：
クロロホルムのｌ　：　Ｉ　溶１１ｕ（４００μので抽
出し、次にクロロホルム（４００μので抽出した。Ｅｃ
ｏＲ［−消化し、脱ホスホリル化したプラスミドｐＨＪ
Ｌ４０１ＤＮＡを、前記の様にしてエタノール沈澱およ
び遠心によって集め、このＤＮＡペレットをＴＥバッフ
ァー（１０μＱ）に再懸濁した。
ＴＥバッファー（１０μの中コスミドｐＫＣ６４４（約
１０μ９）を、Ｒ２０（７５μの、１ＱＸＥｃ。
Ｒ１バッファー（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５Ｑ
、５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！：および５０　ｍＭ　ＭｇＣＬＸ　
１０μのおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ（５μの（〜１００
単位）に加えた。得られた反応物を３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。前記の様にして反応混合物を抽出し
、ＤＮＡを集めた。ＤＮＡＮレベレをＴＥバッファー（
〜１０μのに溶解した。実質上？−１−アティス等（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ　９８２．　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））の方法
に従い、低融点アガロースゲル（バイオラド、２２００
ライト・アベニュー、リノチモンド、ショーシア９４８
０４（ＢｉｏＲａｄ、２２００Ｗｒｉｇｈｔ　Ａｖｅ、
、　　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　　ＧＡ、　　９４８０４）
）上、このＤ　Ｎ　Ａを電気泳動した。
ＩＸＴＡＥバッファー（４０ｍＭｌ−リス−酢酸、ｐＨ
＝７．５．２ｍＭＥＤＴＡ）中、０．８％低融点アガロ
ース（ｌｏｃａｌのを加熱することによって、ゲルを調
製した。この混合物を３７°Ｃに冷却し、４°Ｃで注い
だ。ＤＮＡ試料に、ローディングバッファー（Ｈ２Ｃ中
、０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％キシ
レンシアツール、３０％グリセロール）（２μのを加え
た。この試料をゲルに負荷した。４°Ｃでゲルに１００
Ｖをかけ、ブロムフェノールブルー染料がゲルの底部に
接近するまで泳動した。ゲルを０５μ９／順臭化エチジ
ウムで染色し、所望の〜ｌ　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ［バンド
を長波Ｕ■蛍光で検出し、切り取った。ゲル切片に、５
倍容量の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）および
１ｍＭＥＤＴＡを加えた。ゲルを６５８Ｃで５分間融解
した。この試料を等容量のフェノールで抽出した。試料
を遠心し、水層を回収し、再抽出し、前記の様にしてＤ
ＮＡを集めた。
ＤＮＡペレットをＴＥバッファー（４０μのに溶解した
ところ、コスミドｐＫＣ６４４の所望の〜］　Ｏｋｂ　
ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（〜２μｙ）を含有してい
た。
ＥｃｏＲＩ？Ａ化し、脱ホスホリル化したプラスミドｐ
）ＬＪ　ＬＪ　０　］、　　ＤＮＡ（１μＱ）を、ｐＫ
Ｃ６４４からのＥｃｏＲＩ制限フラグメント（１０μＱ
）（〜０５μ９）、ＩＯＸリガーゼバッファー（６６０
ｍＭ）ノスーＨＣＱ、　　ｐＨ＝８　　；　　６６ｍＭ
　　ＭｇＣＪ！ｐ；　　ｉ。
ｍＭノチオスレイトール（ＤＴＴ）、および！、ＯｍＭ
ＡＴＰ）（２μＱ）、およびＨ，Ｏ（６μＱ）に加えた
。
Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（約１μの（〜１００単位）を
このＤＮＡ溶液に加え、得られた反応物を１５°Ｃで一
夜（〜１６時間）インキュベートした。ライゲートした
ＤＮＡは、〜１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入フラグメントの
方向のみが異なっている所望のｐＫＣ６６８およびｐＫ
Ｃ６６８Ａを含有していた：ｐＫ０６６８の挿入ＤＮＡ
の制限部位地図を添付の図面の第２図に示す。プラスミ
ドｐＫＣ６６８全体の制限地図を第７図に示す。
プラスミドｐＨＪＬ４０１のＥｃｏＲ１部位は、それ１
１本がｌａｃ　Ｚα−フラグメントをコードしているＤ
ＮＡ配列の一部を構成するポリリンカー内に存在する。
Ｅ、コリに１２　　ＤＨ５αの様なＥコリ△Ｍ１５株に
おいて１ａｃＺα−フラグメントが発現すると、機能的
β−ガラクトシダーセ酵素を産生ずるこの株の活性が回
復される。この様に、プラスミドｐ［（ＪＬ４０１は、
Ｅ、コリに１２　　Ｄ１］５α株にβ−ガラクトシダー
ゼ活性を回復させることかできる。しかしながら、プラ
スミドｐＫＣ６６８の構築の時の様に、プラスミドｐＨ
Ｊ　Ｉ−。
４０１上のポリリンカーの制限部位へＤＮＡか挿入する
と、１ａｃＺα−フラグメントをコードする配列が崩壊
され、付随的に、△Ｍ１５突然変異を相補するプラスミ
ドｐＨＪＬ４０１誘導体の活性が消失する。β−ガラク
トシダーゼは、Ｘ−ガル、即ち、無色の化合物である５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドを加水分解してインディゴ色の生成物を
生じるので、出発物質たるプラスミドｐＨＪＬ４０１を
含有している形質転換体と、プラスミドｐＫＣ５６８の
様なプラスミドｐＨＪＬ４０１誘導体を含有している形
質転換体を区別するための好適なスクリーニング法とな
る。
凍結したコンピテントなり　Ｈ５α細胞（ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド、ビー
・オー・ボックス６００９、ゲイザーズバーグ、メリー
ランド、２０８７７　（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ４ｅｓ、　　ｒ　ｎｃ、
　（ＢＲＬ）。
Ｐ、○、　Ｂｏｘ６００９．　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、　ＭＤ、　　２０８７７））を、製造業者の指示に
従って形質転換した。細胞を水上で解凍し、１回の形質
転換あたり、１００μＱの細胞を取り出し、未使用の細
胞をドライアイス−エタノール浴中で再凍結した。
細胞（１００μｇ）を、水で５倍希釈したライケーンヨ
ン反応液（１μのに加えた。細胞を氷上で３０分間イン
キュベー１−Ｌ、４２°Ｃで２分間熱ンヨソクを与え、
２−５分間、水にもどした。ＳＯＣ培地１吋を加え、振
盪しながら細胞を３７°Ｃで１時間インキユヘートした
。ＳＯＣ培地は２％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（
ｗ／ｖ）酵母エキス、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ　
ＮａＣＱ、２．５ｍＭ　ＫＣρ、１０ｍＭ　ＭｇＣＬお
よびｌ　ＱｍＭ　ＭｇＳＯ４である。
ｌＯＯμ９アンピシリン／次σ、４０μｇＸ−ガル／ｍ
ρおよび４０μｇＩＰＴＧ／ｚｃを含有している■７−
寒天プレートに形質転換混合物の一部を蒔いた。Ｉ　Ｐ
ＴＧは、プラスミドｐＨＪＬ４０１に存在するＩａｃプ
ロモーターの抑制を解除するのに役立つ。プレートを３
７°Ｃで一部インキユベートした。Ｅ　コリに１２ＤＨ
５α／ｐｉ−ＩＪＬ４０１の様な挿入物を伴わないプラ
スミドを含有しているコロニーはこれらのプレートで青
色を呈する。Ｅ。
コリＫ１．２ＤＨ５α／ｐＫＣ６６８の様な挿入物を伴
ったプラスミドを含有しているコロニーは白色である。
数個のアンピシリン耐性白色コロニーを選択し、次いて
これらのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によってスク
リーニングした。細胞を３０°Ｃではなく３７°Ｃで生
育させ、アブラマイジンではなくアンピシリンを１００
μｇ／ｍＱ含有しているブロス中で生育させる以外、前
記のプラスミドｐＫＣ６４４ＤＮＡを単離するための方
法に従い、Ｅ、コリＫ１２ＤＩ（５α／ｐＫＣ６６８形
質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。プラスミドｐＫ
Ｃ６６８ＤＮＡを使用し、下記の実施例７の記載のよう
にしてストレプトマイセス・フラジｘＧｓ］４（ＮＲＲ
Ｌ１２１８８）、ｓ、フランエＧ５５０（ＮＲＲＬ　１
２２０１）およびＳ　フラジエＰＭ７３突然変異株を形
質転換することができる。
実施例３　プラスミドｐＫＣ６０４の構築Ａ、ベクター
プラスミドｐＯＪ１６０の単離プラスミドｐＯＪ１６０
（第６図）は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ１８０８８で、Ｎ
ＲＲＬから入手し得るＥ、コリＫ１２　　ＪＭ１０９か
ら得ることができる。プラスミドｐＯＪ１６０は、Ｅ、
コリまたはストレプトマイセス中で複製可能であり、２
個の選択可能な抗生物質（アブラマイシンおよびチオス
トレプトン）耐性マーカーを有しているので、有用なベ
クターである。チオストレプトンはストレプトマイセス
においてのみ選択し得るが、アブラマイジンはＥ、コリ
およびストレプトマイセスにおいて選択可能である。プ
ラスミドｐＯＪ１６０は更に、Ｘガル上に蒔いた時に、
白色の形質転換体を採集することによってＤ　Ｎ　Ａ挿
入物の選択を可能にする１ａｃＺ遺伝子中に複数のクロ
ーニング部位を含有している（実施例２Ｂ参照）。プラ
スミドＤＮＡは、実質」一実施例１に記載の手順に従い
、プラスミドｐＫＣ６０４の構築に使用する細胞から得
た。
Ｂ、プラスミドｐＫＣ６０４の最終構築プラスミドｐＫ
Ｃ６０４は、ｓｒｍＧ遺伝子を含有している本発明の代
表的なベクターである。プラスミドｐＫＣ６０４は、ベ
クターとしてＥｃｏＲＩ消化したｐＨＪＬ４０１ではな
く制限酵素Ｐｓｔｌで消化したプラスミドｐＯＪ＋、６
０を使用し、挿入ＤＮＡとしてｐＫＣ６４４の〜ｌ　Ｏ
ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントではなくフスミドｐＫＣ
６４４の〜９ｋｂＰｓｔｌフラグメントを使用した以外
、実質上実施例２Ｂと同様にして構築した。このライヶ
ーンヨンの結果、〜９ｋｂＰｓｌｌフラグメントの方向
のみが異なっている２種のプラスミド、ｐＫＣ６０４お
よびｐＫＣ６０４Ａを得た。ｐＫＣ６０４の制限地図を
第８図に示す。
実施例４　プラスミドｐＫＣｌｏ０５の構築プラスミド
ｐＫＣ１００５は、５ｒｎＦ遺伝子を含有している代表
的なベクターである。このｓｒｍＦ含有プラスミドは、
ベクターフラグメントが、得られたフラグメントか単位
長さとなるように部分的にＳ　ａＱ　Ｉ　ｉＦｉ化した
プラスミドｐＯＪ１６０であり、挿入Ｄ　Ｎ　Ａかコス
ミドｐＫＣ６４，４の〜５５ｋｂＸｈｏｌフラグメント
である以外、実質上実施例２Ｂと同様にして構築するこ
とができる（第２図）。ライゲーシヨンの結果、〜５，
５ｋｂＸｈ。
Ｉフラグメントの方向のみか異なっている２種のプラス
ミド、ｐＫＣｌｏ０５およびｐＫＣｌ、ｏ０５Ａか得ら
れる。ｐＫＣ１００５の制限地図を第９図に示す。
実施例５　コスミドｐＫＣ５７１の単離コスミドｐＫＣ
５７１は、ｓｒｍＨ遺伝子を含有している代表的なベク
ターである。このコスミドｐＫＣ５７１は、受託番号Ｎ
Ｒ，ＲＬ　　Ｂ−１８２３８としてＮＲＲＬから入手す
ることができるＥ。
コリＳＦ８から得られる。コスミドｐＫＣ５７１は、実
質上実施例１に記載の方法に従って単離することができ
る。ｐＫＣ５７１の制限地図を第１０図に示す。
実施例６　ストレプトマイセス・アンボファシエンス（
ＮＲＲＬ　　１５２６３）、Ｓ、フラジエＧＳ　ｌ　４
　（ｔｙｌＡ突然変異株）、Ｓ、フラジエＧ５５０　（
ｔｙｌ　Ｂ突然変異株）およびＳ、フラジエＰＭ７３　
（ｔｙｌ　Ｂ突然変異株）の形質転換Ａ、溶液のリスト 次の溶液を実施例で引用するので、明確にするために以
下に示す。
１、　　Ｐ培地（〜１００ｆｆの； 成分　　　　　　　　　　　　含有量 シュクロース　　　　　　　　１０．３９に、Ｓｏ、　
　　　　　　　　　　０．０２５ｙ微量元素溶液（＃３
参照）　　　　０．２ｘ（ＩＭｇｃｃ２・６Ｈ２００，
２０３ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　８０屑Ｑオートク
レーブ滅菌後以下の成分を加えるＫ　Ｈ２Ｐ○、（０，
５％）　　　　　　］、　ｙｔｔ（１ＣａＣＱ２・２Ｈ
，Ｏ（３，６８％） （Ｎ−トリス−（ヒドロ牛 ジメチル）メチル−２−ア ミノエタンスルホン酸）、 “’Ｔ　Ｅ　Ｓ　”バッファー ０．２５Ｍ、ｐＨ＝７．２ ２　微量元素溶液（〜ＩＬ） 成分 Ｚ　ｎ　Ｃ０，２ ＦｅＣＱ３・６Ｈｔ○ ＣｕＣＱ、・２Ｈ，○ ＭｎＣ（！−・４Ｈ２Ｏ Ｎ　ａ　２　Ｂ　４０　？　・１０　Ｈｔ○（Ｎ　Ｈ、
）８ＭＯ７０２，・４　Ｈ２０Ｈ，０ ３、Ｒ２復元培地（〜ＩＬ）： 成分 シュクロース に２Ｓｏ４ 微量元素溶液 ０ｚ０ １０靜 含有量 ４（１＋ｇ ００Ｒｇ ０ｘｇ ｏｚｇ ＯＮｇ ＩＯ肩ｇ Ｌ 含有１ ０３ｙ ０、２５９ ２ｇ Ｍ　ｇ　ＣＱ　２・６Ｈ，ＯＩ　Ｏ，］、２ｙグルコー
ス　　　　　　　　　　１０９Ｌ−アスパラギン・１Ｈ
２０２，Ｏｙ カザミノ酸　　　　　　　　　　０．１ｇ寒天　　　　
　　　　　　　　２２ｙ 水を加えて７００ｕ（！とする。
オートクレーブ滅菌の前にｐＨをｐＨ＝７．２に調節す
る。オートクレーブ滅菌後、以下の成分を加える ＫＨ２ＰＯ，（０，０５ｇ／１００ｆｆ０　　　１００
ｆｆ（ＩＣａＣＱ−＜２．２２９／１００ｙの　　　　
　１００１ＱＴＥＳバツフアー （５，７３１？／１００ｘＩ２、ｐＨ＝７．２）　　　
１００酎４　軟栄養寒天（ＳＮＡ、〜ＩＬ）： 成分　　　　　　　　　　　　含有量 デイフコ・バクト栄養ブロス　　８９ 寒天　　　　　　　　　　　　　５９ ５、Ｒ２ＹＥ培地は、１リツトル当たり２５％酵母エキ
ス２０嵯を加えたＲ２培地である。
６、酵母エキス−麦芽エキス（ＹＥＭＥ、〜ＩＬ）成分
　　　　　　　　　　　　含有量 酵母エキス　　　　　　　　　　３９ ペプトン　　　　　　　　　　　５ｇ 麦芽エキス　　　　　　　　　　３９ グルコース　　　　　　　　　　１０ｇ７、ＹＥＭＥ＋
３４％シュクロース液体完全培地は、シュクロース３４
０９／Ｌを加えたＹＥＭＥである。
８、ＹＭＸ培地（〜ＩＬ）： 成分　　　　　　　　　　　　含有量 酵母エキス　　　　　　　　　　３ｇ 麦芽エキス　　　　　　　　　　３ｇ グルコース　　　　　　　　　　　２９寒天　　　　　
　　　　　　　２０り ９、ＹＭＸ寒天は、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽
エキス、０．２％デキストロースおよび２．０％寒天で
ある。
１０、タイロ／ン発酵培地 成分　　　　　　　　　　　　含有量 ビート糖蜜　　　　　　　　　　２％ コーン・ミール　　　　　　　　１５％フィッシュ・ミ
ール　　　　　０９％ コーン・グルテン　　　　　　０９％ 塩化ナトリウム　　　　　　　０．１％リン酸アンモニ
ウム　　　　　０．０４％（二塩基性） 炭酸カルシウム　　　　　　　０２％ 粗タイズ浦　　　　　　　　　　３％ この培地のｐＨを１ＮＮａ（］イで７．１に調節した。
１１、Ａｓ１培地（〜ｌＬ脱イオンＨ７Ｏ）成分　　　
　　　　　　　　　含有量 酵母エキス　　　　　　　　　１ｇ Ｌ−アラニン　　　　　　　　０．２Ｌｉ［−一アルギ
ニン（遊離塩基）　　　０．２９Ｌ−アスパラキン　　
　　　　０５９ 可溶性デンプン　　　　　　　５ｇ 塩化ナトリウム　　　　　　　２，５９硫酸ナトリウム
　　　　　　ｌｏｇ メア（Ｍｅｅｒ）寒天　　　　　　２０９１２、スビラ
マイジン発酵培地（〜ＩＬ）灰分　　　　　　　　　　
　　含有竜 酵母エキス　　　　　　　　ｌ０ｙ ＫＣρ　　　　　　　　　　　２．５７ＭｇＳＯ４０，
１９ にト１２ＰＯ４１０９ ＦｅＣＱ、２　　　　　　　　　０．０３ｇＺｎＣ（１
，０，０３ｇ ＭｎＣ（！２　　　　　　　　　　０　、０１９モリブ
デン酸アンモニウム　　０．００５ｇこれらの成分を水
８００ｉ＆に溶解し、オートクレーブ滅菌した。この混
合物に、水２ｏｏｍり中滅菌ポテトデキストリン（１５
ｇ）およびグルコース（］、Ｏｙ）を加えた。
Ｂ　ストレプトマイセスの形質転換 ストレプトマイセスの完全成長−夜培養物（５ｍのをホ
モジナイズおよび超音波処理し、ＴＳＢプラス０．３％
グリシン（２０ｍＣ）に接種した。培養物を３０°Ｃで
２４時間インキュベートした。組織粉砕機でホモジナイ
ズした後、ホモジネート（５肩のを使用し、０．３％グ
リシンを補足した新しいＴＳＢ（２０πのに接種した。
培養物を３０°Ｃで２４時間インキュベートした。培養
物をホモジナイズし、５０ｍＱの滅菌ポリスチレン遠心
チューブに移した。３５００　ｒｐｍで１０分間遠心す
ることによって細胞をペレット化し、Ｐ培地（１０スの
で洗浄し、再びペレット化した。次いで、１．ｖｇ／ｌ
！＆のりゾチームを加えたＰ培地（１５−２０ｍＱ）に
細胞を再懸濁し、室温で１．５時間インキュベートした
。位相差顕微鏡下で少量の試料を調べることによって、
フロドプラストの形成をモニターした。
プロトプラストは球状である。
フロドプラストを前と同様にして遠心し、Ｐ培地中で２
回洗浄した。細胞をｐ培地（２０肩のに再懸濁し、１回
の形質転換につきプロトプラスト（２００μのを１．５
ｍ（エッペンドルフ■チューブに入れた。穏やかにＰ！
、しなから、ｌＯμρまでＤＮＡ溶液を加えた。Ｐ培地
中５０％ポリエチレングリコール１０００（９００μの
を直ちに加えた。
改良Ｒ２ト’ｙプアガー（４ｆｆの中形質転換ミックス
２分のＩＩ＆を、乾燥させた改良Ｒ２プレートに注いた
。プレートを３０’Ｃて２４時間インキュベートした。
次いで、このプレートに適当量の所望の抗生物質を含有
している改良Ｒ２＋−’ｙプアガーを積層した。ｐＨＪ
Ｌ４０１−誘導プラスミドについては、５０μｇ／ｍ（
ｌでチオストレプトンを使用した。ｐＯＪ１６０または
ｐＫＣ４７３誘導プラスミドについては、５０μｇ／ｘ
ρでアブラマイシンを使用した。Ｔｎ５　　ＮｍＲ遺伝
子が存在する時は、１０μｇ／ｍ（ｌでネオマイシンを
使用した。プレートを３０°Ｃでインキュベートすると
、２−３日（Ｓ　フラノ工については７−１０日）後に
形質転換体か見られた。以下に記載の実施例７の方法に
より、適切なプラスミドＤＮＡの存在について形質転換
体を分析した。
実施例７　ストレプトマイセスからのプラスミドＤＮＡ
の迅速な単離 実施例６Ｂで説明した様にして、適当な濃度の適当な抗
生物質を補足したＴＳＢ（２５１１＋の中で細胞を生育
させた。細胞を１０．３％ンユクロース中で１回洗浄し
、ペレット化し、リゾチーム溶液（０，３Ｍ／、クロー
ス、２５ｍＭ）リス−ＨＣρ、ｐＨ８，０，２ＳｍＭＥ
ＤＴＡ中５　ｍｇ／　ｍ（ｌ　リゾチーム）（５ｆｆの
に再懸濁した。この混合物を室温で３０分間インキュベ
ートし、アルカリ性溶菌溶液（０，３Ｍ水酸化ナトリウ
ムおよび１％５ＤＳ）（２５次のを加えた。直ちに溶液
を激しく撹拌し、次に５０°Ｃで３０分間インキュベー
トした。次いで、溶液を激しく撹拌し、酸フェノール：
セバグ（クロロホルム：イソアミルアルコール、２４　
：　１）（２ｆｆのを加え、この抽出物を再び激しく撹
拌した。
テーブルトップ遠心機にて遠心し、層を分離した。
水層（〜７ＲＣ）を、３Ｍ酢酸ナトリウム（０，７，ｙ
のを含有しているチューブに移した。等容量の２プロパ
ツールを加え、この混合物を撹拌した。室温で１０分間
インキュベートした。１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠
心することによって、Ｄ　Ｎ　Ａをペレット化した。液
体をデカントし、２０秒間遠心し、最後の微量の液体を
ティッシュペーパーで除去した。
ペレットをＴＥバッファー（０，５，１！ｆ２）に溶解
シ、３Ｍ酢酸ナトリウム（５０μ（２）を含有している
エッペンドルフ［Ｆ］チューブに移した。溶液を、中性
フェノール　セバグで１回、セハグで１回抽出し、等容
量の２−プロパツールで沈澱させた。混合物を２分間遠
心し、全ての液体を前と同様にして除去した。ペレット
をＴＥバッファー（０，５ｚＣ）に再溶解し、０．５Ｍ
　スペルミン・ＨＣ＆（５μｆ２）ヲ加えた。溶液を混
合し、室温で５分間インキュベートし、５分間遠心した
。液体を除去した。ペレットを、７０％エタノール、０
．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭ酢酸マグネシウム
を含有している溶液（ｉｆｆの中で洗浄した。混合物を
室温で５分間インキュベートし、５分間遠心した。液体
を除去し、ペレットを乾燥させた。ペレットをＴＥ（２
５μのに再溶解し、各制限酵素消化のために１−２μＱ
を使用した。
寒楓％Ｉ８　　ストレプトマイセスによる抗生物質産生
の検定 Ａ、プレート−プラグ検定 株が抗生物質を産生じたか否かを調べるために、ストレ
プトマイセス・アンボファ／エンスおよびＳ、フラノ工
の形質転換株または突然変異株を、Ｒ２−寒天復元プレ
ートから、適当な抗生物質を適当な濃度で含有している
ＡＳＩプレートに移し、コロニーが直径５ｉ０ミリメー
トルになるまで、３０’Ｃで２−３日間（Ｓ、　フラノ
工については５７日間）インキュベートした。次いて、
コロニーを滅菌トランスファーチューブ（スペクトラム
・メディカル・インダストリアル・インコーポレイテノ
ド、ロス・アンジエルス、カリフォルニア９００５４　
（Ｓ　ｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｉ　ｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ、　　ｌ　ｎｃ、、　　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅ
ｌｅｓ、　ＣＡ９００５４）で採取しくプラグ）、トリ
ブチカーゼ・ソイ・アガー（ＴＳＡ）プレートに移した
。このプレートは予め、ミクロコツカス・ルテウスＸ１
６０（ＡＴＣＣ９３４１）を含有している軟寒天栄養ブ
ロス（デイフコ・ラボラドリース、デトロイト、ミシガ
ン４８２３２（Ｄ　１ｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ　Ｉ　４８２３２）を積
層しておいたものである。プレートを３７°Ｃで１６−
２４時間インキュベートした。ミクロコツカス・ルテウ
スは、タイロシンおよびスピラマイシンに感受性であり
、アブラマイシンに耐性である。従って、このＭ、ルテ
ウス株は、タイロシンまたはスピラマイシンを産生じて
いるストレプトマイセスを含有するプラグの周囲で生育
することができない。阻止帯は抗生物質の存在を示す。
Ｂ　バイオオートグラフィー ３０°Ｃて適当な時間生育させた所望の微生物を含有し
ているプレート全体からの寒天を、５０ｕＣポリプロピ
レン遠心チユーブ中、ＩＭ）リス−ＨＣ（！（ｐＨ８，
０）（＋、０灰のに浸してふやかした。酢酸エチル（１
０ｍのを加え、この混合物を室温で１２時間以上、数回
激Ｌ＜振盪した。チーフルトップ遠心機で層を分離し、
上部の酢酸エチル層を回収し、皿中で蒸発乾固した。残
留物をメタノール（１叶）に溶解した。メタノール抽出
物（約１２０μのをＴ　Ｌ　Ｃプレートにかけ、乾燥さ
せた。
タイロシンまたはスピラマイシン対照に隣接させ、薄層
クロマトグラフィープレート（メルク、ビーオーボック
ス２０．００．ラーウエイ、ニュー・シャーシー０７０
６５（Ｍｅｒｃｋ、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　２０００゜Ｒａｈ
ｗａｙ、　　Ｎｅｗ　Ｊ　ｅｒｓｅｙ　０７０６５）、
予めコーティングされたシリカゲル＃６０Ｆ−２５４）
で分離を行った。寒天プラグを分析する時は、拡散か起
こるのに十分な時間、プラグをプレート上に放置した；
次いで、プレートを９５：５：５酢酸エチル、ジエチル
アミン：メタノールの上昇Ｍ　体クロマトグラフィーに
かけた。展開したクロマトグラムをヒユームフード中で
少なくとも２時間、完全に乾燥させた。次いて、クロマ
トグラムを、ミクロコツカス・ルテウスＸ１６０を蒔い
たＴＳＡフルートに表を下に向けて〜１５分間置装た。
クロマトグラムをプレートから除去し、プレートを３７
°Ｃで１６−２４時間インキユヘートした。
阻止帯をタイロシンまたはスピラマイシン対照と比較し
た。
Ｃ１発酵 実施例６Ｂで説明した適当１の適当な抗生物質を含有し
ているＡＳＩ培地のスラントで培養増殖を行った。これ
らの培養物をそれぞれ使用し、数個の５０ｍ＆ｊｔＡＳ
ｌ培地、またはタイロシンまたはスピラマイシン発酵培
地に接種した。培地のメタノール抽出物を実質上実施例
８Ｂに従いＴＬＣによって分析した。
実施例９　スピラマイシン突然変異株の作成Ａ、コスミ
ドｐＫＣ６４４挿入Ｄ　Ｎ　Ａのイン・ビトロ突然変異
誘発 実施例１の方法に従い、コスミドｐＫＣ６４４（ＡｍＲ
）を単離した。各々約１０μｇ（ＴＥＩＯμρ中）の２
つの試料を、制限酵素Ｂａｍ）（ＩおよびＳａρＩでそ
れぞれ消化した。この酵素は、マニアティス等の方法（
Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｉ）り、　２８
２　２８５、　　ｌ　９８２．　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））に従い、部分消化を
行うために使用した。最終産物が単位長さの分子となる
様に条件を調節した。各々の分子の制限切断は、ｐＫＣ
６４４挿入ＤＮＡに存在している多数のＳ　ａ（Ｉまた
はＢａｍＨＩ制限部位のいずれか１つであった。試料プ
ールは、かかる種々の切断に相当するものであった。Ｓ
　ａｉ！ＩおよびＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを実施例２Ｂに
従い脱ホスホリル化した。
Ｂａｍｆ（ＩまたはＸｈｏ　Ｉ　（Ｓ　ａ（！　Ｉに適
合する）末端を有するｐＫＩＸＸプラスミド（ファルマ
シア、８００セ／テニアル・アヘ二二一、ビスカッタウ
ェイ、ニュー・シャーン−１０８８５４（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅ、、　　
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　　ＮＪ０８８５４）からのＮ
ｍＲおよびＢＣＲフラグメントを、該ｐＫＩＸＸプラス
ミドをこの２種類の酵素で別個に消化することによって
単離した。実施例２Ｂに従い、各フラグメントを、適合
する末端（ＢａｍＨＩ　−＋ＢａｍＨＴ　、　Ｘｈｏｌ
　→Ｓ　ａｌｌ’　Ｉ　）を有するｔ白化しｔこｐＫＣ
６４４のブール ライゲーション産物を、製造業者によって明示された条
件下、ストラッタジーン（　Ｓ　ｔｒａＬａｇｅｎｅ）
、１１ＣＩ９９Ｎ，　　トレイ・パイン・ロート、ラン
ヨラ、カリフォルニア９２０３７（１　１０９９ＮＴｏ
ｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｄ．、　　Ｌａｊｏｌｌａ，
　　ＣＡ　　９２０３７））からのギガパック（Ｇ　ｉ
ｇａｐａｃｋ）”を使用し、イン・ビトロでパ・、ケー
ジングした。
Ｅ　コリＢＥ１８７９の培養物（ＩＭ）をまず、０，２
％マルトースを補足したＴＹブロス（１す。
トル当たり、１０９トリプトン、５ｇ酵母エキス、１０
９塩化ナトリウム）中で生育させることによっで、ファ
ージ形質導入を行った。細胞を２０００ｒｐｍで１０分
間遠心し、２分の１容量のｌＱｍＭＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４に
再懸濁した。１０ｍＭトリス・ＨＣｌ２、ｐＨ７，５，
１０ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ、中、種々の希釈度のファージを
２００μＱの細胞と一緒に３７°Ｃで２０分間インキュ
ベートした。混合物をＴＹブロスでＩＩＣに希釈し、細
胞を３０’Ｃて２時間増殖させた。細胞を４８°Ｃに維
持したＴＹ軟寒天（０，５％寒天）（３ｍのに加え、５
μｙ／、＊１２プレオマインンおよび１００μｇ／ｍ（
ｌアプラマイ／ンを補足したＴＹプレートに蒔いた。プ
レートを３０°Ｃで一部イソキュヘートした。
Ｂ、　　Ｅ、　　コリからのプラスミドＤＮＡの迅速な
単離 クローニングしたストレプトマイセス・アンボファ／エ
ノスＤＮＡへの挿入を確認するために、数個の形質導入
体を採取し、そのプラスミドＤＮＡを分析した。培養物
（５Ｎのを、１００μｇ／　ｙ（１でアブラマイシンを
補足したＴＹジブロス中３０°Ｃで一夜生育させた。各
−夜培養物Ｃ４１１Ｑ）からの細胞を、テーブル・トッ
プ遠心機でベレット化した。上清をデカントし、細胞ベ
レットを２５ｍＭトリス・ＨＣ（２、ｐＨ８，０，２５
ｍＭ　　ＥＤＴＡ（０５Ｒａ）ｌこ再１び濁した。次い
で、溶液を１．５肩ρ微量遠心チユーブに移した。この
溶液に０．３Ｎ　Ｎａ０）（，２％５ＤＳ（２５０μの
を加え、混合物を十分撹拌した。混合物を７０’Ｃで１
０分間インキユヘートシ、次いで、室温に冷却した。酸
フェノール・セバグ（１００μのを加え、直ちに撹拌し
、次に、微量遠心機で２分間遠心した。上部層を取り出
し、新しいチューブに移した。３Ｍ酢酸ナトノウム（７
０μのを加え、チューブに２−プロパツールを満たし、
撹拌して十分混合した。溶液を室温で５分間インキュベ
ートした。微量遠心機で５分間遠心を行い、上清を除去
した。ペレットを短時間遠心し、残留している液体を除
去した。
ベレｙｌ・をＴＥバッファー（５００μρ）に溶解した
。このＤ　Ｎ　Ａ　ｉ’容ｌ夜に５００ｍＭ　スペルミ
ン・トＩＣ（！（５ｍＭ最終濃度；スペルミン貯蔵１８
液は２０’Ｃで貯蔵する）を加えた。溶液を混合し、室
ＬＦＬで５分間インキュベートシ、次いて５分間遠心し
た。上清を除去し、ペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム
およヒ０．０１　Ｍ　ＭｇＣＬ（３００μのにｒｒ４ｖ
濁した。冷エタノール（７００μρ）を加え、撹拌し、
室温で５分間インキュベートした。このＤ　Ｎ　Ａ含有
溶液を５分間遠心し、」二清を除去し、ペレットを１０
０％エタノールで洗浄し、乾燥させた。ＤＮＡベレット
をＴＥ（１０μのに溶解し、制限酵素分析のためにその
０２−１μＱを使用した。挿入物を含有していることが
証明されたプラスミドＤＮＡを集めた。集められたプラ
スミドＤＮＡは、ＢａｍＨＩまたはＳ　ａ（ｌ　Ｉライ
ケーンヨンから得られた形質導入体から、上記の方法で
調製された。
害ｊ騎生上」−コスミドｐＫＣ６４４挿入ＤＮＡのイン
・ビボ突然変異誘発 Ａ、ｐＫＣ６４４リゼートの調製 コスミドｐＫＣ６４４（ＡｍＲ）を、受託番号Ｂ１８３
７２でＮＲＲＬに寄託されているＴｎｌ　Ｏホッピング
株、Ｅ　コリＫ］２ＢＥ１９９７に導入した。このホッ
ピング株は、（ｉ）Ｆ”エレメント上にＴｎ５　ＮｍＲ
およびＢ　Ｑ　ＲＪ、ｌｔ伝子を含有しているＴｎｌ　
Ｏニレメン１−（ＥＣＬ１２）、（ｉｉ）ｐＢ　Ｒ３２
２オリジンに適合するＴｃＲｐＡＣＹＣ１８４フラスミ
ド上のトランスポザーセ遺伝子（Ｅ　９ｔ　Ｉ　３　）
、および（ｉｉｉ）４２°Ｃにおける熱誘導によりコス
ミドｐＫＣ６４４を取り込み得る不完全λｃ１８５７プ
ロフアージを含有している。
コスミドｐＫＣ６４４を含有しているＥ、コリ株ＢＥ］
、９８９（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２３８）を、１００μ
９／１アブラマイシンを補足したＴＹブロス（２５０，
１１のに接種ｌ、た。培養物を、振盪せずに一夜３０°
Ｃに維持シタ。２Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，（２５０μＱ）を加え
、フラスコを炎によって１５分間、４２°Ｃに加熱した
。この誘導の後、フラスコを振盪しながら３７°Ｃで５
時間インキュベートした。細胞を遠心し、］、ＯｍｆＶ
Ｉｈリス・ＨＣ（２、ｐＩ（７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ５
０４（５１１１のに再懸濁した。次いて、溶菌を促進す
るために、細胞をドライアイス−エタノール浴中で凍結
し、３７°Ｃ水浴中で解凍するサイクルに３回付した。
ＤＮａｓｅｌ（Ｌｏｌｌ！９／！の（１０μのを加え、
混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベートし、次に１
０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清（〜２．５
ｍｇ）を取り出し、クロロホルム（２５０μのを加え、
使用するまでこのリゼートを４０Ｃで貯蔵した。
Ｂ　コスミドｐＫＣ６４４のＴｎｌＯ突然変異誘発ＢＥ
］、９９７（ＴｎｌＯホッピング株）を、０．２％マル
トースおよび１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４を補足したＴＹブロ
ス（ＴＹＭＭ）巾、３０℃で一夜生育させた。培養物（
５７のを、２５０πクフラスコ中、１２゜５μｇ／ｍ（
ｌテトラサイクリンおよび２５１１ｙ／ｉ（ネオマイシ
ンを補足したＴＹＭＭ（２０ｆｆρ）に接種した。培養
物を振盪しながら３０°Ｃで１時間インキュベートした
。細胞を遠心し、１０ｍＭ）リス・ＨＣＬｐｌ（−７，
５、ｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４（ｌｘのに再懸濁した。細
胞５００μＱを実施例］、　１．　Ａで調製したｐＫＣ
６４４リゼート（１００μのと混合した。
これを振盪せずに３０°Ｃで１０分間インキュベートし
た。培養にＴＹブロス（２，５＋Ｑ）を加えた。
混合物を３０°Ｃの回転機に１時間置いた。２５０１（
２フラスコ中、１００μ９／村アプラマインン、■２．
５μｙ／ｘＱテトラサイクリンおよび５μ９／ｍσプレ
オマイシンを補足したＴＹ（５Ｏｍのに、３ｍＱを移し
た。これを３０°Ｃで１．５時間インキュベートした。
ｔａｃプロモーターの制御下でトランスボザーゼ遺伝子
の発現を誘発するために、２０Ｍ　ＭｇＣ＋２．（５０
μ＋２）およびＬＭ　　ＩＰＴＧ（５０μのを加え、３
０°Ｃで１時間インキュベー１・を続けた。トランスボ
ザーゼ遺伝子は、ＮｍＲおよびＢ　Ｑ　Ｒ遺伝子を持っ
ているＴｎｌＯｈランスポゾンを染色体および染色体外
エレメントにランタムにトランスポーズさせる。次いで
、４２°Ｃ１１５分間の熱処理によって、コスミドの取
り込みを誘発した。これにより、ラムダリプレッサーを
不活化する。次いで３７°Ｃで３時間インキュベートす
る間、ファージ粒子は蓄積するが、細胞は溶菌しない。
なぜなら、プロファージは溶菌に対して欠損かあるから
である。次いで、細胞を遠心し、１０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｑ、ｐＨ＝７．５、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＳＯ３（３ｆｆＱ
）に再懸濁した。ドライアイス−エタノール浴および３
７°Ｃ水浴中で３回、凍結−解凍サイクルを繰り返した
。ＤＮａｓｅｌ（１０ＭＬｉ／ｍｆｆ）（２１／２μの
を加えた。混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベート
した。次いで、クロロホルム（１００μＱ）を加え、混
合物を撹拌し、細胞残骸を遠心除去した。突然変異リセ
ート上清を回収し、クロロホルム５０μｇを加えた。使
用するまで、リセートを４°Ｃで貯蔵した。
ＣコスミドｐＫＣ６４４の突然変異リセートによるＥ　
コリＢＥ１３７９のインフエクション実質旧実施例１０
　Ａに従い、インフェクションを行った。インフェクト
した細胞１００μＱを、１００μ！？／ｌｌ１２アブラ
マイシンおよび５ｔｔ９／雇Ｑプレオマイ／ンを含有し
ているＴＹ寒天プレートに蒔いた。数百のコロニーを得
た。実施例１０の方法に従い、３個の形質導入体からの
プラスミドＤＮＡを分析し、クローニングしたｐＫＣ６
４４のストレプトマイセス争アンポファシエンスＤＮＡ
への挿入を調べた。多数の形質転換体が、所望の挿入物
を有するプラスミドを含有していることか確認された。
基塩ｆ４１１．λ　ストレプトマイセス・アンポファシ
エンスゲノムへのイン・ビボおよびイン・ビトロで作成
された突然変異の導入 ストレプトマイセス・アンボファシエンスへの突然変異
コスミドの形質転換 形質転換体を１０μｇ／＊Ｑネオマイシンを補足したＲ
２ＹＥ培地に蒔く以外実質上実施例６に従い、イン・ビ
トロ（ＢａｍＨＩブールおよびＳ　ａ（Ｉブール）およ
びイン・ビボ（ＴｎｌＯホッピング株を介して）で作成
した突然変異コスミドＤＮＡをストレプトマイセス・ア
ンボファシエンスブロトブラストに導入した。ＮｍＲ形
質転換体をアブラマイシンに対する感受性について試験
した結果、染色体への突然変異挿入ＤＮＡの二重交差が
起こったことが判明した。実質上実施例８の教示に従い
、スピラマイシンの産生について、これらの形質転換株
を試験した。
’ＪＪＩ！ＩＩβユ　スピラマイシン生合成遺伝子突然
変異株の特性化 Ａ、その他の突然変異株との共発酵 実施例１１の方法で分析した時にスピラマイシンを産生
じないことがわかった株を、ＡＳ＋プレートに線状に蒔
いた。それぞれの突然変異株をその他のあらゆる突然変
異株に交差させた。線引きは垂直に行った。プレートを
３０’Ｃで４日間インキｘヘー１−した。２種の株の交
差する点で寒天のプラグを採取し、この共発酵ペアを実
施例８の方法によってスピラマイシンの産生について分
析した。結果を以下の第３表に示す。
第３表 突然変異株ペア　　産生されたスピラマイシンｓｒｍ−
７、ｓｒｍ−８なし ｓｒｍ＝７　、　ｓｒｍ−１２なし ｓｒｍ−７，ｓｒｍ−１４なし ｓｒｍ−７ｓｒｍ−２２なし ｓｒｍ−８，ｓｒｍ−１２なし ｓｒｍ−８，ｓｒｍ−１４なし ｓｒｍ−８＋　ｓｒｍ−２２なし ｓｒｍ−１２，ｓｒｍ−１４あり ｓｒｍ−１２，ｓｒｍ−２２あり ｓｒｍ−１４，ｓｒｍ−２２なし Ｂ４　　タイラクトンの補足にＺ＝ｊする応答０．１ｍ
Ｍタイラクトンを補足したＡＳＩプレートで５日間生育
させた時の抗生物質の産生について、突然変異株を試験
した。突然変異株を３０’Ｃで５日間生育させ、次いで
、実施例８の方法によって抗生物質の産生について試験
した。結果を第４表に示す。
鼻±者 多人夫圀林　　応答　産生された抗生物質ｓｒｍ４　　
　　なし　　　　　なし ｓｒｍ−８なし　　　　　なし 港−１２なし　　　　　なし ｓｒｍ−１４あり　　　　　　あり ｓｒｍ〜２２　　　　あり　　　　　　ありこの実施例
に記載した実験の結果、突然変異は３個の遺伝子に存す
ることがわがった。ｓｒｍ−］２は、ｓｒｍＦ遺伝子に
突然変異を有する。ｓｒｍ−７およびｓｒｍ−８突然変
異株は、ｓｒｍＧ遺伝子に２個の別個の突然変異を示す
。ｓｒｍＨ遺伝子はまた、２個の別個の突然変異株、ｓ
ｒｍ−１４およびｓｒｍ−２２における突然変異によっ
て表わされる。突然変異を、マニアティス等のサザーン
・ハイブリダイセーションおよび制限分析によってマツ
ピングした（前掲）。突然変異の地図上の位置を第２図
に示す。
本明細書では特定の突然変異株を示したが、当業者には
、本明細書肥載の方法により、この実施例に示された株
と同様に機能する突然変異遺伝子を含有しているその他
の株を作成し得るということは理解されるであろう。従
って、突然変異遺伝子含有味の作成は、本明細書で作成
された特定の突然変異株に限定されると理解されるべき
ではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスの
スピラマイシン抗生物質生合成経路の模式図であり、第
２図は、コスミドｐＫＣ６４４の〜３２ｋｂ挿入ＤＮＡ
の制限部位地図であり、第３図は、ストレプトマイセス
−・フラジエにおけるタイロシン抗生物質生合成の模式
図であり、第４図は、ｐＫＣ６４４のベクター骨格、プ
ラスミドｐＫＣ４７３の制限部位および機能地図であり
、第５図は、プラスミドｐＨＪＬ４０］の制限部位およ
び機能地図であり、第６図は、プラスミドｐＯＪ１６０
の制限部位および機能地図であり、第７図は、プラスミ
ドｐＫＣ６６Ｂの制限部位および機能地図であり、第８
図は、プラスミドｐＫＣ６０４の制限部位および機能地
図であり、第９図は、プラスミドｐＫＣ１００５の制限
部位および機能地図であり、第１０図は、コスミトｐＫ
Ｃ６４４の制限部位および機能地図であり、第１１図は
、コスミドｐＫＣ５７１の制限部位および機能地図であ
る。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニ 代 理 人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、スピラマイシン抗生物質生合成遺伝子を含有する組
    換えＤＮＡ配列。 ２、該抗生物質生合成遺伝子がｓｒｍＤ、ｓｒｍＥ、ｓ
    ｒｍＦ、ｓｒｍＧ、またはｓｒｍＨスピラマイシン抗生
    物質生合成遺伝子から選択される請求項１に記載のＤＮ
    Ａ配列。 ３、組換えＤＮＡベクターである請求項２に記載のＤＮ
    Ａ配列。 ４、プラスミドである請求項３に記載のベクター。 ５、コスミドｐＫＣ６４４、プラスミドｐＫＣ６６８、
    プラスミドｐＫＣ６６８Ａ、プラスミドｐＫＣ６０４、
    プラスミドｐＫＣ６０４Ａ、プラスミドｐＫＣ１００５
    、プラスミドｐＫＣ１００５Ａ、またはコスミドｐＫＣ
    ５７１である請求項４に記載のベクター。 ６、請求項３に記載のベクターで形質転換された組換え
    ＤＮＡ宿主細胞。 ７、ストレプトマイセス・アンボファシエンスまたはス
    トレプトマイセス・フラジエである請求項６に記載の宿
    主細胞。 ８、ストレプトマイセス・アンボファシエンス／ｐＫＣ
    ６４４、Ｓ．アンボファシエンス／ｐＫＣ６６８、Ｓ．
    アンボファシエンス／ｐＫＣ６０４、Ｓ．アンボファシ
    エンス／ｐＫＣ１００５、Ｓ．アンボファシエンス／ｐ
    ｋＣ５７１、Ｓ．フラジエ／ｐＫＣ６４４、Ｓ．フラジ
    エ／ｐＫＣ６６８、Ｓ．フラジエ／ｐＫＣ６０４、Ｓ．
    フラジエ／ｐＫＣ１００５、またはＳ．フラジエ／ｐＫ
    Ｃ５７１である請求項７に記載の宿主細胞。 ９、ｓｒｍＤ、ｓｒｍＥ、ｓｒｍＦ、ｓｒｍＧ、および
    ｓｒｍＨスピラマイシン抗生物質生合成遺伝子からなる
    群から選択される遺伝子によってコードされている遺伝
    子産物。
JP1146555A 1988-06-07 1989-06-06 ストレプトマイセスおよびその他の生物で使用するためのマクロライド生合成遺伝子 Pending JPH0239889A (ja)

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US203387 1980-10-31
US07/203,387 US5098837A (en) 1988-06-07 1988-06-07 Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms

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JPH0239889A true JPH0239889A (ja) 1990-02-08

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EP (1) EP0346000A3 (ja)
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