KR20140032438A - 수혼화성 화합물의 미생물 생산의 검출 방법 및 조성물 - Google Patents

수혼화성 화합물의 미생물 생산의 검출 방법 및 조성물 Download PDF

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아미리스 인코퍼레이티드
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Abstract

세포, 예를 들어 유전자 변형되지 않은 모 미생물 세포와 비교하여 더 큰 수율로 및/또는 증가된 영속성으로 하나 이상의 화합물을 생산하도록 유전자 변형되는 미생물 세포 내에 화합물 생산을 검출하는데 유용한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화합물을 재조합적으로 생산하는 복수의 세포를 포함하는 용액을 상기 재조합적으로 생산되는 화합물에 직접 결합하는 형광 염료와 접촉시키는 단계; 및 상기 형광 염료를 상기 재조합적으로 생산되는 화합물에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건 하에 검출하는 단계를 포함한다.

Description

수혼화성 화합물의 미생물 생산의 검출 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING MICROBIAL PRODUCTION OF WATER-IMMISCIBLE COMPOUNDS}
1. 관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2011. 3. 13자로 출원된 발명의 명칭 "수혼화성 화합물의 미생물 생산을 감지하기 위한 방법 및 조성물"의 가출원 제 61/486,211 호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본원에 그 전체로서 참조로 포함된다.
2. 기술분야
본원에 제공되는 방법 및 조성물은 일반적으로 미생물의 산업적 이용에 관한 것이다. 특히, 세포, 예를 들어, 유전자 변형되지 않은 모 미생물 세포와 비교하여 더 큰 수율로 및/또는 증가된 영속성으로 하나 이상의 화합물을 생산하도록 유전자 변형되는 미생물 세포 내에 산업적으로 유용한 화합물의 생산을 검출하는데 유용한 방법 및 조성물이 제공된다.
3. 배경기술
상업적으로 유용한 화합물의 생산을 위한 미생물의 이용은 산업적 생명공학의 출현을 가져왔다. 상업적으로 생산적인 균주는 대사 엔지니어링, 즉 숙주 세포 내 대사 플럭스의 유도 변형을 통하여 유도될 수 있다. 대사 엔지니어링의 특정 목적은 가치있는 화합물의 세포내 농도 또는 분비를 증가시키면서 기타 플럭스를 생존률 및 생산성에 최적이 되도록 하는 것이다. 고수율 (기질 그램 당 화합물 그램), 고 생산 (리터 당 그램) 및/또는 고 생산성 (시간 당 리터 당 그램)이 가능한 재조합 균주가 특히 바람직하다. 균주의 원하는 표현형으로의 엔지니어링은 종종 몇몇 라운드의 대사 플럭스의 엔지니어링, 분석 및 모델링을 수반하는 반복 과정으로서 수행된다. 그러나, 모든 대사 엔지니어링 방법은 공통적인 한계, 즉, 개선된 형질에 적합한 스크리닝 방법에의 그들의 의존성을 가진다.
개선된 성능을 가지는 균주의 스크리닝 방법은 이상적으로 (1) 하나의 변형된 집단으로부터 다음으로의 성능의 증가적 개선을 구별하기에 충분히 민감하고; (2) 세포내 함유되어 있거나 주변 매질로 분비되든, 내생 분자를 재조합적으로 생산되는 이종 생산물로부터 구별하기에 충분히 특이적이고; (3) 한번에 변형된 균주의 많은 라이브러리들을 스크리닝하기에 충분히 강건하고; 및 (4) 숙주에 대한 생산의 대사적 영향에 대하여 유용한 정보를 제공한다. 후자와 관련하여, 숙주 내 이종 유전자의 유입 및 발현이 대사적 불균형 및/또는 독성 대사산물의 축적을 초래할 수 있다. 그러한 시나리오에서, 숙주의 감소된 생존률을 희생하고 생산이 이루어지는지 여부를 아는 것이 유용하다. 더욱이, 하나의 생산 집단으로부터 다음으로의 광범위한 바이오매스에 대한 가능성 측면에서, 재조합 생산물을 특이적으로 및 세포 바이오매스로부터의 영향 또는 인풋없이 검출하는 능력은 소정의 균주의 수율, 생산 및/또는 생산성의 보다 정확한 묘사를 제공할 수 있다.
로봇식 마이크로티터 플레이트 분석 또는 형광-관련 세포 분류와 같은 고처리량 스크리닝 방법이 이전에 기재되었다. 그러나, 대사 엔지니어링에 대한 새로운 적용의 개발과 함께, 보다 민감하고, 생산물-특이적이고, 강력한 분석이 요구되며, 특히 원하는 화합물의 생산과 숙주 세포 생존률 사이의 양립가능성의 증거를 제공하는 것들이 요구된다.
4. 발명의 개요
세포, 예를 들어, 유전적으로 조작되지 않은 모 미생물 세포와 비교하여 더 큰 수율로 및/또는 증가된 영속성으로 하나 이상의 화합물을 생산하도록 유전적으로 조작되는 미생물 세포 내에 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물(WIC)을 검출하는데 유용한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 특히, 본원에 제공되는 방법은 예를 들어, 이에 제한되지 않으나 이소프레노이드, 폴리케티드, 지방산 및 그의 유도체를 포함하는, 산업적으로 유용한 수혼화성 화합물을 생산하도록 조작되는 미생물 균주를 스크리닝하기 위한 높은 처리율, 민감성 및 정량적 수단을 제공한다. 상기 방법은 상기 수혼화성 화합물이 직접 결합할 수 있는 형광 염료의 사용 및 그 바이오매스에 대한 생산되는 화합물의 양에 대한 재조합 세포 집단의 심문을 가능케 하는 선택된 스펙트럼 조건의 이용을 통하여 이종 세포내 또는 분비되는 화합물의 특정 검출을 허용한다.
일 측면에서, 본원에서 용액 내에서, 복수의 세포로부터 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물 (WIC)을 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 WIC에 직접 결합하는 형광 염료를 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 복수의 세포를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 재조합적으로 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건 하에 상기 형광 염료를 검출하는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 WIC는 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 상기 세포로부터 분비된다. 일부 구현예에서, 상기 형광 염료는 나일 레드 (Nile Red)이다. 일부 구현예에서, 상기 형광 염료는 BODIPY 493/503 또는 BODIPY 505/515이다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 세포를 포함하는 용액은 복수-웰 세포 배양판의 웰 내에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 검출 전 적어도 12 시간의 기간 동안 배양된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 WIC:세포 바이오매스 비를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 바이오매스는 상기 WIC에 결합되는 형광 염료로부터 형광을 검출하지 않는 스펙트럼 조건을 이용하여 상기 복수의 세포의 자가형광을 검출하는 단게를 포함하는 방법에 의하여 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 형광염료는 나일 레드이고, 상기 WIC:세포 바이오매스 비를 결정하는 단계는 녹색 대 적색 형광의 비를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 WIC를 특이적으로 검출하는데 적합한 스펙트럼 조건은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수의 세포 집단 및 제2 복수의 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수의 세포들은 스크리닝될 WIC-생산 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 여기 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
여기 파장을 선택하는 단계
를 포함하는 방법에 의하여 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 단계 (b)의 여기 스펙트럼에 대한 방출 파장은 550 nm로 고정된다.
일부 구현예에서, 상기 WIC를 특이적으로 검출하는데 적합한 스펙트럼 조건은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 스크리닝될 WIC-생산 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 방출 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
방출 파장을 선택하는 단계
를 포함하는 방법에 의하여 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 단계 (b)의 방출 스펙트럼에 대한 여기 파장은 290 nm로 고정된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단은 적어도 2 g/L WIC를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 이소프레노이드이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 파르네센이다.
다른 측면에서, 본원에서 용액 내에서, 세포로부터 생산 및 분비되는 파르네센을 검출하는 방법으로서,
(a) 파르네센을 재조합적으로 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 용액을 나일 레드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 약 260 내지 290 nm의 여기 파장 및 약 530 내지 570 nm의 방출 파장에서 나일 레드를 검출하는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시애이다.
다른 측면에서, 본원에서
(a) 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산 및 분비하는 세포;
(b) 상기 세포로부터 분비되는 수혼화성 화합물;
(c) 상기 분비되는 수혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료; 및
(d) 세포 배양 배지
를 포함하는 액체 조성물이 제공된다.
세포, 예를 들어, 유전적으로 조작되지 않은 모 미생물 세포와 비교하여 더 큰 수율로 및/또는 증가된 영속성으로 하나 이상의 화합물을 생산하도록 유전적으로 조작되는 미생물 세포 내에 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물(WIC)을 검출하는데 유용한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 나일 레드로 스테이닝되고, 488 nm의 여기 파장 및 515 nm의 방출 파장에서 검출되는 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제공한다. OD 5, 10, 15, 20 및 25의 순수 효소 세포 집단 및 비세포 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 x-축을 따라 성장 배지 내에 플레이팅하면서, 증가하는 농도의 정제된 파르네센(0, 2, 4, 6, 8 및 10 g/L)을 y-축을 따라 첨가하였다.
도 2는 나일 레드로 스테이닝되고, 500 nm의 여기 파장 및 550 nm의 방출 파장에서 검출되는 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제공한다. (a) OD 5, 10, 15, 20 및 25의 순수 효모 세포 집단 및 비세포 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 x-축을 따라 성장 배지 내에 플레이팅하면서, 증가하는 농도의 정제된 파르네센(0, 2, 4, 6, 8 및 10 g/L)을 y-축을 따라 첨가하였다. (b) 500ex/550em에서 증가하는 세포 밀도를 통한 파르네센 농도 대 형광 단위의 곡선. R2=0.650.
도 3a는 550nm의 방출 파장에서 250 내지 520 nm의 여기 스펙트럼을 제공한다. <◇) 세포없이, 10 g/L 파르네센; (□) 파르네센없이, OD25의 순수 효모 세포; 및 (△) 10g/L 파르네센 플러스 OD 25의 순수 효모 세포.
도 3b는 290nm의 여기 파장에서 330 내지 710 nm의 방출 스펙트럼을 제공한다. <◇) 세포없이, 10 g/L 파르네센; (□) 파르네센없이, OD 25의 순수 효모 세포; 및 (△) 10g/L 파르네센 플러스 OD 25의 순수 효모 세포.
도 4는 나일 레드로 스테이닝되고, 290 nm의 여기 파장 및 550 nm의 방출 파장에서 검출되는 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제공한다. (a) OD 5, 10, 15, 20 및 25의 순수 효모 세포 집단 및 비세포 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 x-축을 따라 성장 배지 내에 플레이팅하면서, 증가하는 농도의 정제된 파르네센(0, 2, 4, 6, 8 및 10 g/L)을 y-축을 따라 첨가하였다. (b) 290ex/550em에서 증가하는 세포 밀도를 통한 파르네센 농도 대 형광 단위의 곡선. R2=0.918.
도 5는 350nm의 여기 파장에서 430 내지 750 nm의 방출 스펙트럼을 묘사한다. <◇) 세포없이, 10 g/L 파르네센; (□) 파르네센없이, OD 25의 순수 효모 세포; 및 (△) 10g/L 파르네센 플러스 OD 25의 순수 효모 세포.
도 6은 나일 레드로 스테이닝되고, 490 nm의 여기 파장 및 350 nm의 방출 파장에서 검출되는 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제공한다. (a) OD 5, 10, 15, 20 및 25의 순수 효모 세포 집단 및 비세포 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 x-축을 따라 성장 배지 내에 플레이팅하면서, 증가하는 농도의 정제된 파르네센(0, 2, 4, 6, 8 및 10 g/L)을 y-축을 따라 첨가하였다. (b) 350ex/490em에서 증가하는 파르네센 농도를 통한 세포 밀도 대 형광 단위의 곡선. R2=0.955.
6. 구현예들의 상세한 설명
6.1 정의
본원에 사용되는 용어 "메발로네이트 경로" 또는 "MEV 경로"는 아세틸-CoA를 IPP로 전환시키는 생합성 경로를 의미한다. 상기 MEV 경로는 도 1A에 개략적으로 예시된다.
본원에 사용되는 용어 "디옥시자일룰로오스 5-포스페이트 경로" 또는 "DXP 경로"는 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트를 IPP 및 DMAPP로 전환시키는 경로를 의미한다. 상기 DXP 경로는 도 1B에 개략적으로 예시된다.
본원에 사용되는 문구 "이종 뉴클레오티드 서열"은 (a) 그 숙주 세포에 이질적 (즉, 그 세포에 "외생적"); (b) 그 숙주 세포 내에 자연적으로 발견되나 (즉, "내생적") 그 세포 내 비자연적 양으로 존재 (즉, 그 숙주 세포 내 자연적으로 발견되는 양보다 크거나 적게); 또는 (c) 그 숙주 세포 내에 자연적으로 발견되나 그 자연적 위치 외부에 위치할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "영속적"은 유전자 변형된 미생물 세포에 의한 이소프레노이드의 생산과 관련하여, 상기 유전자 변형된 미생물 세포가 유전자 변형되지 않은 모 미생물 세포와 비교하여 산업적 발효에서 더 장시간에 걸쳐 이소프레노이드 화합물을 생산할 수 있는 능력을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "모(parent)"는 본원에 기재되는, 예를 들어, 그 세포 내에서 수혼화성 화합물, 예를 들어, 이소프레노이드, 폴리케티드 또는 지방산의 증가된 생산 및/또는 증가된 수준을 실행하도록 유전자 변형된 미생물 세포의 생성을 초래하나, 상기 유전자 변형된 세포의 모든 유전자 변형을 포함하지는 않는 유전자 변형의 도입을 위한 출발 지점으로서 역할을 하는 세포를 의미한다.
본원에 사용되는 문구 "재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물", "이종 수혼화성 화합물" 및" WIC"는 적어도 4 개의 탄소 원자를 가지는 유전자 변형된 세포 또는 미생물로부터 생산되는 물과 혼화성인 화합물을 의미한다. 상기 적어도 4 개의 탄소 원자를 가지는 화합물은 분지쇄, 직쇄 또는 시클릭일 수 있으며, 임의로 하나 이상의 이종 원자 (예를 들어, 질소, 산소 및 황) 및 하나 이상의 치환체 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, -OH, -NH2, -COOH, -C(H)=O, -NO3, -NH-, -C(=O)- 등)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 오일이다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 소수성이다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물의 예시적 재조합적으로 생산되는, 즉, 이종 수혼화성 화합물은 이에 제한되지 않으나, 이소프레노이드, 폴리케티드, 및 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는, 즉 이종 수혼화성 화합물은 4 탄소 원자 내지 40 탄소 원자 길이 범위의 탄소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는, 즉, 이종 수혼화성 화합물은 5 내지 30, 10 내지 25, 또는 15 내지 20 탄소 원자의 탄소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는, 즉, 이종 수혼화성 화합물은 5, 10, 15 또는 20 탄소 원자 이상의 탄소 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는, 즉, 이종 수혼화성 화합물은 40 탄소 원자 미만의 탄소 사슬을 포함한다.
본원에 사용되는 문구 "선택적으로 검출하다" 또는 "선택적으로 검출하는"은 표본 내 기타 분자 종으로부터의 형광을 대부분 제거하는 선택된 스펙트럼 조건 하에 표본 내 형광 종의 검출을 의미한다. 일부 구현예에서, 세포 내 복수 분자 종에 결합되는 형광 염료는 그 염료에 의하여 결합되는 종의 서브세트만이 검출될 수 있도록 특정 여기/방출 파장에 놓여질 수 있다.
본원에 사용되는 문구 "스펙트럼 조건"은 이에 제한되지 않으나, 여기 파장, 방출 파장 및 여기/방출 파장 쌍을 포함하는 광학 패러미터를 의미한다. 여기 파장은 표본, 예를 들어 WIC에 결합되는 형광 영료를 포함하는 용액 내 형광을 자극하는ㄴ데 사용되는 방사선의 파장이다. 방출 파장은 측정되는 표본, 예를 들어 형광 염료에 의하여 방출되는 방사선의 파장이다.
6.2 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물의 검출 방법
제1 측면에서, 용액 내에서, 복수의 세포로부터 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물 (WIC)을 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 WIC에 직접 결합하는 형광 염료를 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 복수의 세포를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 재조합적으로 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건 하에 상기 형광 염료를 검출하는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
6.2.1 용액 내 WIC -생산 세포 접촉
일부 구현예에서, WIC는 예를 들어 세포 배양 용기와 같은 배양 용기 내에 함유되는, WIC를 재조합적으로 생산하는 세포를 포함하는 용액 내에서 형광 염료와 접촉될 수 있다. 상기 배양 용기는 이에 제한되지 않으나, 검출 분석 수행에 특별히 사용될 배양 접시 또는 복수웰 플레이트, 예를 들어 96-웰 플레이트의 웰을 포함하는 임의의 용기일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐클로라이드, 또는 기타 유사한 고체 폴리머 기질로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 세포를 포함하는 용액은 블랙 96-웰 폴리스티렌 편평 바닥 분석 플레이트 내에 함유된다.
일부 구현예에서, 상기 용액은 WIC를 생산하는 미생물 세포 배양에 적합한 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탄소 공급원은 모노사카라이드 (단순 당), 디사카라이드, 폴리사카라이드, 비-발효성 탄소 공급원, 또는 하나 이상의 이들의 조합이다. 적합한 모노사카라이드의 비제한적 예는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프럭토오스, 리보오스 및 이의 조합을 포함한다. 적합한 디사카라이드의 비제한적 예는 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 및 이의 조합을 포함한다. 적합한 폴리사카라이드의 비제한적 예는 전분, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴 및 이의 조합을 포함한다. 적합하나 비-발효성 탄소 공급원의 비제한적 예는 아세테이트 및 글리세롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 배지는 예를 들어 유도 물질 (예를 들어, 유전자 산물을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 조절 하에 있을 때), 리프레서 (예를 들어, 유전자 산물을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 억제 프로모터의 조절하에 있을 때), 또는 선택 제제 (예를 들어, 유전자 변형을 포함하는 미생물 세포를 선택하기 위한 항생제)와 같은 하나 이상의 부가적 제제로 보충된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 이종 수혼화성 화합물 생산에 적합한 조건 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 형광 염료와 접촉 전에 적어도 12 시간의 기간 동안, 12 내지 24 시간의 기간 동안, 적어도 24 시간의 기간 동안, 또는 약 36, 48, 60, 72, 96 또는 96 시간 이상의 기간 동안 배양된다. 고처리량 적용에 유용한 일부 구현예에서, 상기 세포는 96-웰 플레이트 내에서 성장하고, 상기 플레이트는 증발로 인한 부피 손실을 방지하고 충분한 산소 전달을 허용하여 호기 배양을 유지하도록 배양 기간 동안 통기성 막으로 밀봉된다. 복수 세포 플레이트가 인큐베이터 내에 스태킹되는 다른 구현예에서, 상기 플레이트들은 위치상 치우침을 최소화하기 위하여 1 cm 고무 가스켓에 의하여 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 배양 기간 전체 동안 진탕된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 1000 RPM에서 진탕된다.
일부 구현예에서, 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 세포를 포함하는 용액은 세포 전처리 없이, 예를 들어 형광 염료 흡수를 증진시킬 수 있는 세포의 화학적 또는 열적 투과화없이 형광 염료와 접촉된다. 다른 구현예에서, 세포는 예를 들어 상기 세포를 DMSO와 접촉시키거나 상기 세포를 염료와 접촉 전에 열처리함으로써, 염료 흡수를 증진시키도록 처리된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포를 포함하는 용액을 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료와 접촉시키는 단계, 및 상기 용액 내에서 상기 형광 염료를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 형광 염료는 용제변색(solvatochromic) 염료이다. 형광 용제변색 염료는 그 분자 주위의 용매의 극성에 따라 색상을 변화하고, 예를 들어 생물학적 분자, 특히 지질 분자의 역학의 고민감성 실시간 관찰에서 프로브로서 사용되는 염료이다. 그 색상 변화 메커니즘은 직접 결합을 통하여 달성되고, 특정 화학적 종과의 접촉을 요하지 않는다. 그러한 형광 용제변색 염료는 NBD, Dansyl, DASPMI, Prodan, Dapoxyl, 4-DMAP, 4-아미노-1,8-나프탈이미드 유도체, Reichardt's 염료 및 나일 레드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 용액은 BODIPY 형광단(fluorophore) 유도체와 접촉된다. BODIPY 형광단 유도체는 비극성 구조 및 장파장 흡수 및 형광, 작은 형광 스토크스 이동, 전형적으로 80,000 cm-1M-1 이상의 흡광 계수 및 물 내에서 감소되지 않는 높은 형광 양자 수율을 특징으로 한다. BODIPY 염료는 중성 지질에 대한 착색제로서 및 오일 및 기타 비극성 지질에 대한 트레이서로서 적용 가능성을 가진다. BODIPY 493/503 염료로 스테이닝은 유세포분석에 의하여 나일레드로 스테이닝보다 세포 지질 소적에 더 특이적인 것으로 보여졌다. 나아가, BODIPY 493/503 염료의 낮은 분자량 (262 달튼)은 막 내 비교적 빠른 확산 속도를 가지는 프로브를 초래한다. 상기 BODIPY 493/503 염료는 또한 마이크로칩 채널 분리 장치 내 중성 화합물 검출에 사용되어 왔다. BODIPY 505/515는 살아있는 제브라피쉬 배아의 세포막을 투과하고 세포질 난황소판을 선택적으로 스테이닝하는 것으로 보고되었다.
일부 구현예에서, 상기 용액은 형광 염료 나일 레드와 접촉된다. 나일 레드는 예를 들어 포유동물 세포, 박테리아, 효모 및 미세조류를 포함하는 동물 세포 및 미생물의 지질 함량을 평가하기 위하여, 형광 현미경법 및 유동 시토플루오메트리에 의한 세포내 지질 소적 검출에 사용되어 왔다. 나일 레드는 본원에 기재되는재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물의 고처리량 검출에 이상적이 되도록 하는 몇몇 고유의 특성을 가진다. 예를 들어, 나일 레드는 소수성 환경 내에 매우 형광성이고, 친수성 환경 내에 퀀칭되고, 용제변색성(solvatochromism)을 나타낸다, 즉 그 여기 및 방출 스펙트럼이 그 환경의 특성과 함께 스펙트럼 위치, 형상 및 강도에 있어서 변화한다. 나일 레드의 용제변색성은 포스포- 및 극성 지질에 결합되는 나일 레드와 중성 지질에 결합되는 것의 부분적 구별을 허용한다. 포스포리피드 세포마고가 같은 극성 지질 내에서, 나일 레드는 ~590 nm의 최대 형광 방출을 가진다. 이와 대조적으로, 중성 지질, 예를 들어 탄화수소 생성물 (예를 들어, 파르네센)의 존재 하에, 상기 스펙트럼은 550 nm의 최대 방출로 청색 이동된다. 따라서, 본원에 기재되는 방법의 특정 구현예에서, 이상적 생산 세포 (예를 들어, 순수 파르네센) 및 완전한 비-생산 세포 간의 녹색 대 적색 형광 비를 최대화하기 위하여 검출 동안 스펙트럼의 녹색 (525+/-20 nm) 및 적색 (670+/-20 nm) 영역 내 광학 필터가 사용된다. 형광 데이터를 녹색 및 적색 스펙트럼 모두에서 포획할 수 있으며, 녹색 대 적색 형광 비를 이용하여 용액 내 세포 바이오매스의 양에 대하여 정규화된 용액 내에 수혼화성 화합물의 양을 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 제공되는 방법은 유리하게 나일 레드와 같은 용제변색 염료를 이용하여, (a) 세포 집단에 의하여 생산되는 수혼화성 화합물의 양; 및 (b) 그 집단의 세포 바이오매스를 동시에 결정한다. 세포 바이오매스의 별도 결정을 위한 요구 조건을 제거함으로써, 예를 들어 세포 집단을 세포벽 또는 핵 특이적 균주로 카운터 스테이닝하거나 또는 세포 집단의 광학 밀도를 측정함으로써, 기타 스크리닝 방법과 비교하여 고처리량 및 효율성이 달성될 수 있다.
배양 용기 내 용액 내에 함유되는 세포 집단의 녹색 대 적색 형광 비(G/R)는 유리하게 세포 집단의 상대적 생산물:바이오매스 비를 결정하는데 이용될 수 있으며, 상기 집단은 이에 따라 등급이 매겨질 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 (a) 비교적 느린 성장/높은 생산 집단을 나타내는 것일 수 있는, 상대적으로 높은 G/R 비; (b) 비교적 빠른 성장/낮은 생산 집단, 비교적 빠른 성장/높은 생산 집단, 또는 비교적 느린 성장/낮은 생산 균주를 나타내는 것일 수 있는 상대적으로 낮은 G/R 비를 가지는 것으로 등급이 매겨질 수 있다. 상기 세포 집단의 G/R 비는 그 녹색 형광 값 단독 (G)과 조합 사용될 수 있으며, 이는 상기 집단을 추가로 규명하기 위하여 상기 집단에 의하여 생산되는 화합물의 양을 나타낸다. 예를 들어, 낮은 G/R 비를 가지나 높은 G 값을 가지는 세포 집단은 비교적 빠른 성장/높은 생산 집단을 나타낼 수 있으며, 낮은 G/R 비를 가지나 낮은 G 값을 가지는 세포 집단은 비교적 느린 성장/낮은 생산 집단 또는 빠른 성장/낮은 생산 집단을 나타낼 수 있다.
따라서, 본원에 제공되는 검출 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 용기 내 세포 바이오매스의 양에 대하여, 배양 용기 내 용액 내 세포 집단의 수혼화성 화합물의 양을 정규화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정규화는 (a) 배양 용기 내 수혼화성 화합물의 형광 수준; 및 (b) 배양 용기 내 세포 바이오매스의 형광 수준을 결정하는 단계; 및 (b)에서 결정되는 것에 대한 (a)에서 결정되는 형광의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 형광 염료는 나일 레드이고, 상기 정규화 단계는 배양 용기 내 수혼화성 화합물의 수준에 상응하는, 녹색 스펙트럼 (예를 들어, 525+/-20 nm) 내 형광 수준을 결정하는 단계, 및 배양 용기 내 세포 바이오매스의 수준에 상응하는, 적색 스펙트럼 (670+/-20 nm) 내 형광 수준을 결정하는 단계, 및 녹색 대 적색 형광 비(G/R)를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 높은 G/R 비를 가지는 세포 집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 높은 수준의 녹색 형광을 가지는 세포 집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 높은 G/R 비 및 높은 녹색 형광 수준을 가지는 세포 집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
6.2.2 검출
세포 또는 세포의 클론 집단으로부터 생산되는 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 유세포 분석, 세포 분류, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화 세포 분류 (MACS), 또는 광학 또는 공초점 현미경법과 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 수혼화성 화합물 생산 세포로부터의 형광이 96-웰 플레이트 형광 분광 광도계 내에서 정량된다.
6.2.2.1 검출을 위한 스펙트럼 조건 선택
복수 세포로부터 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건의 결정은 몇몇 구현예에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, (1) 복수 세포에 의하여 재조합적으로 생산되는 WIC; (2) WIC에 직접 결합하는 형광 염료; 및 (3) 숙주 세포 중 임의의 조합에 대하여, 스펙트럼 조건은 WIC에 결합되는 염료의 특이적 검출을 가능케 하는 여기 파장을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 WIC에 결합되는 염료의 특이적 검출을 가능케 하는 방출 파장을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 WIC에 결합되는 염료의 특이적 검출을 가능케 하는 여기 및 방출 파장 쌍을 확인하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 형광이 검출되지 않도록, WIC에 결합되는 형광 염료의 검출에 충분히 선택적인 여기 및 방출 파장 쌍을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출을 위한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 양립가능한 여기 파장을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 양립가능한 여기 파장은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수의 세포 집단 및 제2 복수의 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수의 세포들은 스크리닝될 WIC-생산 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 여기 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
여기 파장을 선택하는 단계
에 의하여 결정된다.
일부 구현예에서, WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출을 위한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 양립가능한 방출 파장을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 양립가능한 방출 파장은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 스크리닝될 WIC-생산 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 방출 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
방출 파장을 선택하는 단계
에 의하여 결정된다.
특정 구현예에서, WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 충분한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 여기 및 방출 파장 모두, 즉 (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고; (ii) OD5 및 OD25의 상기 제2 복수 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인 양립가능한 방출 및 여기 파장 쌍을 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법이 제1 및 제2복수 세포에 대한 여기 스펙트럼을 결정하는 단계를 포함하는 경우, 상기 방출 파장은 일정하게 유지되고, 여기 스펙트럼이 예를 들어 250 nm 내지 500, 또는 그 파장의 서브세트로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, 상기 방출 파장은 얻어지는 여기 스펙트럼의 여기 파장 범위 바로 밖의 파장으로 일정하게 유지된다. 특정 구현예에서, 상기 방출 파장은 550 nm로 일정하게 유지된다. 유사하게, 상기 방법이 제1 및 제2 복수 세포에 대한 방출 스펙트럼을 결정하는 단계를 포함하는 경우, 상기 여기 파장이 일정하게 유지되고, 방출 스펙트럼이 예를 들어 260 nm 내지 720, 또는 그 파장의 서브세트로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 상기 여기 파장은 290 nm로 일정하게 유지된다. 형광 스펙트럼을 얻을 수 있는 당업계에 공지된 임의의 형광광도계를 본원에 기재된 방법에서 사용할 수 있다.
상기 기재한 방법에 유용한 제1 및 제2 복수의 세포 집단은 바람직하게 분석에 배경 형광의 인지가능한 양을 기여하지 않는 액체 배지 내에 함유된다. 예를 들어, 상기 세포들은 세포 배양 또는 세포 기초 분석에 통상적으로 사용되는 수용액, 예를 들어, 생물학적 완충액, 예를 들어, 인산 완충액, 또는 세포 성장을 지지할 수 있는 임의의 배지 내에서 마이크로티터 플레이트의 웰에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 집단의 세포 밀도 x는 600 nm에서 세포 집단의 광학 밀도 (OD600)이다. 예를 들어, 세포 밀도 x를 가지는 제1 세포 집단의 OD600이 1일 경우, 세포 밀도 5x를 가지는 세포 집단의 OD600은 5이다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 복수 세포 집단 각각은 증가하는 세포 밀도의 적어도 두 개의 세포 집단들, 에를 들어 x 및 5x의 세포 집단 (예를 들어, 1 및 5의 OD600), x 및 10x (예를 들어, 1 및 10의 OD600), 또는 2 및 20x (예를 들어, 1 및 20의 OD600)의 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 및 제2 복수 세포 집단은 OD 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 세포 집단들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 복수 세포 집단들은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 형광 스펙트럼이 얻어지는 증가하는 세포 밀도의 12 보다 큰 세포 집단들을 포함하며, 상기 복수 세포집단들은 OD600이 5 및 OD600이 25인 집단들을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 및 제2 복수 세포 집단들은 OD600이 5, 10, 15, 20 및 25인 세포 집단들을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 복수 세포 집단들은 OD600이 1 및 10, 1 및 15, 5 및 20, 10 및 20, 또는 10 및 25인 세포 집단들을 포함한다. 바람직하게, 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x는 소정의 세포 유형에 대하여 600nm에서 분광 검출을 위한 역학적 범위 내이다.
선택적 스펙트럼 조건이 추구되는 수혼화성 화합물 (WIC)에 대하여, 스펙트럼 조건을 결정할 목적으로, 상기 WIC가 예를 들어 정제된 화합물로서 제1 복수 세포들을 포함하는 수성 매질에 첨가될 수 있다. 대안적으로 상기 제1 복수 세포들은 WIC를 생산하도록 변형되는 재조합 세포일 수 있다. WIC를 생산하는 재조합 세포를 이용하는 일부 구현예에서, 세포에 의하여 생산되는 WIC의 양은 예를 들어 수율 (기질, 예를 들어 수크로오스 그램 당 화합물 그램), 생산 수준 (리터 당 그램) 및/또는 생산성 수준 (시간 당 리터 당 그램)으로서 이전에 확립된다. 제1 복수 세포집단이 WIC를 생산하는 재조합 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 상기 세포는 WIC에 특이적인 스펙트럼 조건의 결정 전에 WIC 생산에 충분한 시간 기간 동안 배양된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단 각각은 WIC를 동량으로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단들은 WIC를 다른 양으로 포함한다. 바람직하게, WIC의 양은 접촉 동안 WIC에 결합하는데 유용한 형광 염료의 양을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단 각각은 WIC를 적어도 0.1 g/L의 양으로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단 각각은 WIC를 0.1 g/L 내지 10 g/L의 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 복수 세포 집단 각각은 WIC를 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0 또는 15.0 g/L 보다 큰 양으로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 WIC는 상기 제1 복수 세포 집단 각각에 정제된 WIC로서, 예를 들어 분석에 배경 형광의 감지가능한 양을 기여하지 않는 용매 내에서 첨가된다. 특정 구현예에서, WIC는 상기 제1 복수 세포 집단 각각에 적어도 2 g/L의 농도로 외생적으로 첨가된다.
바람직하게, 형광 염료에 의하여 결합될 수 있는 내생적 세포 표적의 양 또는 질의 차이를 최소화하도록, 상기 제1 및 제1 복수 세포들은 동일 세포 유형이다. 바람직하게, 상기 제2 복수 세포는 WIC를 포함하지 않는다, 예를 들어, 외생적으로 첨가 또는 재조합적으로 생산된 WIC. 그러나, WIC가 상기 제2 복수 세포 내에 내생적 분자로서 존재하는 경우, 상기 WIC는 또한 상기 제1 복수 세포 내에 내생적 분자로서 존재할 것이다.
일부 구현예에서, WIC의 특정 검출에 대하여 선택된 여기 및/또는 방출 파장에서, 제1 복수 세포 집단 (WIC 포함) 및 동일 세포 밀도를 가지는 제2 복수 세포 집단 (WIC 비포함) 간의 형광 차이는 적어도 80%이다. 일부 구현예에서, 이들 세포 집단들 간의 형광 차이는 적어도 약 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 500% 보다 크다.
일부 구현예에서, WIC의 특이적 검출을 위하여 선택된 여기 및/또는 방출 파장에서, 상기 제1 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x를 가지는 세포 집단 간의 형광 차이는 250% 이하이다. 일부 구현예에서, 이러한 차이는 약 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 20 또는 10% 이하이다.
복수 세포로부터 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료를 선택적으로 검출하기에 충분한 스펙트럼 조건의 결정에 유용한 본원에 제공되는 방법을, 효모 세포의 존재 하에 파르네센에 결합되는 나일 레드의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건의 확인에 적용하였다. 이들 결과는 이하 실시예 2에 제공되며, 파르네센에 결합되는 나일 레드가 세포 바이오매스로부터 형광의 과잉(spillover)이 피하여지는 스펙트럼 조건 하에 검출될 수 있음을 입증한다. 따라서, 다른 측면에서, 용액 내에서, 세포로부터 생산되는 파르네센을 선택적으로 검출하는 방법으로서, (a) 파르네센을 재조합적으로 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 용액을 나일 레드와 접촉시키는 단계; 및 (b) 약 260 내지 290 nm의 여기 파장 및 약 530 내지 570 nm의 방출 파장에서 나일 레드를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가적으로, 나일 레드 형광, 예를 들어 WIC에 결합되는 나일 레드로부터의 형광의 영향없이 세포로부터 자가 형광 검출에 대하여 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법이 제공된다. 자가 형광을 세포 바이오매스에 대한 프록시로서 사용할수 있으며, 따라서, 자가 형광에 대하여 선택적인 스펙트럼 조건이 결정되면, 소정의 WIC-생산 세포 집단에 대한 WIC:세포 바이오매스 비를 두 개의 선택적 여기/방출 파장 쌍을 이용하여 얻을 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 자가형광에 대하여 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수의 세포 집단 및 제2 복수의 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수의 세포들은 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 여기 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
여기 파장을 선택하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 자가형광에 대하여 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은
(a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
(b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 방출 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
(c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
(ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
방출 파장을 선택하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 자가형광에 대하여 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 여기 및 방출 파장 모두, 즉, (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고; (ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인 양립가능한 방출 및 여기 파장 쌍을 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 자가형광의 특이적 검출을 위하여 선택되는 여기 및/또는 방출 파장에서, 제1 복수 세포 집단 (WIC 포함) 및 동일 세포 밀도를 가지는 제2 복수 세포 집단 (WIC 비포함) 간의 형광 차이는 80% 이하이다. 일부 구현예에서, 이들 세포 집단들 간의 형광 차이는 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10% 이하이다.
일부 구현예에서, 세포 자가형광의 특이적 검출을 위하여 선택되는 여기 및/또는 방출 파장에서, 제1 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x를 가지는 세포 집단들 간의 형광 차이는 적어도 250% 이다. 일부 구현예에서, 이러한 차이는 적어도 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 500% 보다 크다.
6.3 스크리닝 방법
다른 측면에서, (a) (a) 상기 WIC에 직접 결합하는 형광 염료를 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 복수의 세포를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (b) 상기 재조합적으로 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건 하에 상기 형광 염료를 검출하는 단계; 및 (c) 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물을 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 선택하는 단계를 포함하는, 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단에 대하여 세포 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 또는 세포들의 클론 집단을 생산하는 수혼화성 화합물이 연속적 선택 라운드에 걸쳐 강화되도록 상기 검출 및 선택 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 유전자 변형되지 않는 모 미생물 세포에 비하여 더 큰 수율 및/또는 증가된 영속석으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 미생물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 유전자 변형되지 않은 모 미생물 세포에 비하여 증가된 수혼화성 화합물 생산을 가지는 유전자 변형된 미생물 세포를 확인 및 선택하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 WIC 대 세포 바이오매스의 비로 표현되는 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들으리 클론 집단을 확인하기에 충분하다. 이러한 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 단계(b)에서 WIC: 세포 바이오매스 비를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 바이오매스는 WIC에 결합되는 형광 염료로부터의 형광이 검출되지 않는 스펙트럼 조건 하에 복수 세포들의 자가 형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정된다. WIC: 바이오매스 비는 본원에 기재되는 스펙트럼 조건의 선택을 이용하여, WIC 및 바이오매스 각각의 별도이나 특이적 측정의 상대 형광 단위 (RFU)에 근거하여 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 약 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 또는 1:100의 WIC: 바이오매스 비로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 100:1 보다 크거나 1:100 미만의 WIC:바이오매스 비로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 발효 배지 리터 당 약 10 g 보다 큰 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 세포 배양액 리터 당 약 10 내지 약 50 g, 약 15 g 이상, 약 20 g 이상, 약 25 g 이상, 또는 약 30 g 이상의 양으로 생산된다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 건조 세포 중량 g 당 약 50 밀리그램 보다 큰 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 건조 세포 중량 g 당 약 50 내지 약 1500 밀리그램, 약 100 밀리그램 이상, 약 150 밀리그램 이상, 약 200 밀리그램 이상, 약 250 밀리그램 이상, 약 500 밀리그램 이상, 약 750 밀리그램 이상, 또는 약 1000 밀리그램 이상의 양으로 생산된다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 세포 배양액 단위 부피 당 기준으로, 본원에 기재되는 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의하여 생산되는 수혼화성 화합물의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 적어도 약 1,000-배 또는 그 이상 높은 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 건소 세포 중량 단위 당 기준으로, 본원에 기재되는 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의하여 생산되는 수혼화성 화합물의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1,000-배 또는 그 이상 높은 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 단위 시간 당 세포 배양액 단위 부피당 기준으로, 본원에 기재되는 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의하여 생산되는 수혼화성 화합물의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1,000-배 또는 그 이상 높은 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 단위 시간 당 단위 건조 세포 중량 당 기준으로, 본원에 기재되는 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의하여 생산되는 수혼화성 화합물의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1,000-배 또는 그 이상 높은 양으로 하나 이상의 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산하는 세포 또는 세포들의 클론 집단을 확인하기에 충분하다.
6.4 WIC 를 생산하는 숙주 세포 및 재조합 세포
다른 측면에서, 하나 이상의 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물을 포함하는 세포 또는 클론 세포 집단이 제공된다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물에서 유용한 세포는 수혼화성 화합물, 예를 들어 이소프레노이드, 폴리케티드, 지방산 등을 자연적으로 또는 재조합적으로 생산할 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 대장균 (Escherichia coli) 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS-7 세포, 마우스 섬유아세포, 마우스 태생성 암종 세포, 또는 마우스 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 곤충 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 S2 세포, Schneider 세포, S12 세포, 5B1-4 세포, Tn5 세포, 또는 Sf9 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 단세포 진핵생물 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 균사체 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 균사체 박테리아 세포는 방선균 강이다. 특정 구현예에서, 상기 균사체 박테리아 세포는 스트렙토마이세스 속, 예를 들어, 스트렙토마이세스 암보파시엔스 (Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 아베미틸리스 (Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 아주레우스 (Streptomyces azureus), 스트렙토마이세스 신나모넨시스 (Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 쿠라코이 (Streptomyces curacoi), 스트렙토마이세스 에리스라에우스 (Streptomyces erythraeus), 스트렙토마이세스 프라디애 (Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 갈리라에우스 (Streptomyces galilaeus), 스트렙토마이세스 글라우세센스 (Streptomyces glaucescens), 스트렙토마이세스 하이그로코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 파불루스 (Streptomyces parvulus), 스트렙토마이세스 퓨세티우스 (Streptomyces peucetius), 스트렙토마이세스 리모수스 (Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 로제오풀부스 (Streptomyces roseofulvus), 스트렙토마이세스 서모토레란스 (Streptomyces thermotolerans), 스트렙토마이세스 비오라세오루베르 (Streptomyces violaceoruber)이다.
다른 구현예에서, 상기 세포는 균류 세포이다. 보다 특정 구현예에서, 상기 세포는 효모 세포이다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물에 유용한 효모는 미생물 보관소 (예를 들어, IFO, ATCC 등)에 기탁되고, 무엇보다 아시큘로코니듐(Aciculoconidium), 암브로시오자이마(Ambrosiozyma), 아스로아스쿠스(Arthroascus), 아르시오자이마(Arxiozyma), 아쉬비아(Ashbya), 밥제비아(Babjevia), 벤싱토니아(Bensingtonia), 보트리아스쿠스(Botryoascus), 보트리오자이마(Botryozyma), 브레타노마이세스(Brettanomyces), 불레라(Bullera), 불레로마이세스(Bulleromyces), 캔디다(Candida), 시테로마이세스(Citeromyces), 클라비스포라(Clavispora), 크립토코커스(Cryptococcus), 시스토필로바시듐(Cystofilobasidium), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 데카라(Dekkara), 디포다스코프시스(Dipodascopsis), 디포다스쿠스(Dipodascus), 에니엘라(Eeniella), 엔도마이코프셀라(Endomycopsella), 에레마스쿠스 (Eremascus), 에레모테시움 (Eremothecium), 에리쓰로바시디움 (Erythrobasidium), 펠로마이세스 (Fellomyces), 필로바시디움 (Filobasidium), 갈락토마이세스 (Galactomyces), 지오트리춤 (Geotrichum), 길리에르몬델라 (Guilliermondella), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 한세눌라 (Hansenula), 하세가와에 (Hasegawaea), 홀터만니아 (Holtermannia), 호르모아스쿠스 (Hormoascus), 하이포피치아 (Hyphopichia), 이사트첸키아 (Issatchenkia), 클로에케라 (Kloeckera), 클로에케라스포라 (Kloeckeraspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 콘도아 (Kondoa), 쿠라이시아 (Kuraishia), 쿠르츠마노마이세스 (Kurtzmanomyces), 류코스포리디움 (Leucosporidium), 리포마이세스 (Lipomyces), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 말라세지아 (Malassezia), 메츠치니코위아 (Metschnikowia), 므라키아 (Mrakia), 믹소자이마 (Myxozyma), 나드소니아 (Nadsonia), 나카자와에 (Nakazawaea), 네마토스포라 (Nematospora), 오가태에 (Ogataea), 우스포리디움 (Oosporidium), 파치솔렌 (Pachysolen), 파치티코스포라 (Phachytichospora), 파피아 (Phaffia), 피치아 (Pichia), 로도스포리디움 (Rhodosporidium), 로도토룰라 (Rhodotorula), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사카로마이코데스 (Saccharomycodes), 사카로마이코프시스 (Saccharomycopsis), 사이토엘라 (Saitoella), 사카구치아 (Sakaguchia), 사투르노스포라 (Saturnospora), 시조블라스토스포리온 (Schizoblastosporion), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces), 스포로파치머미아 (Sporopachydermia), 스테파노아스쿠스 (Stephanoascus), 스테리그마토마이세스 (Sterigmatomyces), 스테리그마토스포리디움 (Sterigmatosporidium), 심비오타프리나 (Symbiotaphrina), 심포디오마이세스 (Sympodiomyces), 심포디오마이코프시스 (Sympodiomycopsis), 토룰라스포라 (Torulaspora), 트리코스포리엘라 (Trichosporiella), 트리코스포론 (Trichosporon), 트리고노프시스 (Trigonopsis), 츄치애에 (Tsuchiyaea), 우데니오마이세스 (Udeniomyces), 왈토마이세스 (Waltomyces), 위커하미아 (Wickerhamia), 위커하미엘라 (Wickerhamiella), 윌리오프시스 (Williopsis), 야마다자이마 (Yamadazyma), 애로위아 (Yarrowia), 자이고아스쿠스 (Zygoascus), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 자이고윌리오프시스 (Zygowilliopsis) 및 Zygozyma (자이고자이마) 속들에 속하는 효모들을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 방법 및 조성물에 유용한 효모는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 데케라 브룩셀렌시스 (Dekkera bruxellensis), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) (이전에 사카로마이세스 락티스 (Saccharomyces lactis)로 불리움), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluveromyces marxianus), 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans), 또는 한세뉼라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) (이제 피치아 앙구스타 (Pichia angusta)로 알려짐)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 미생물은 캔디다 리포리티카 (Candida lipolytica ), 캔디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii ), 캔디다 크루세이 (Candida krusei ), 캔디다 슈도트로피칼리스 (Candida pseudotropicalis ), 또는 캔디다 유틸리스 (Candida utilis)와 같은 캔디다 속의 균주이다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 사카로마이세스 세레비시애 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 사카로마이세스 세레비시애 세포 균주는 Baker's 효모, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, 및 AL-1로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 사카로마이세스 세레키시애 균주는 PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1, 및 SA-1로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 특정 구현예에서, 상기 사카로마이세스 세레비시애 균주는 CAT-1이다. 다른 특정 구현예에서, 상기 사카로마이세스 세레비시애 균주는 BG-1이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 반수체 미생물 세포이다. 다른 구현예에서, T아기 세포는 이배체 미생물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 이형접합이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 그의 교배 유형 대립유전자 이외에 동형접합이다 (즉, 세포가 포자형성이라면, 결과적인 네 개의 반수체 미생물 세포들은 그들의 교배 유형 대립유전자를 제외하고 유전적으로 동일할 것이며, 이는 반수체 세포들 중 두 개에서 교배 유형일 것이며 다른 두 반수체 세포에서 교배 유형 알파일 것이다).
일부 구현예에서, 상기 세포는 산업적 발효, 예를 들어, 바이오에탄올 발효에 적합한 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 산업적 발효 환경의 인지된 스트레스 조건인 높은 용매 농도, 고온, 확장된 기질 이용, 영양분 제한, 삼투압 스트레스, 산성도, 설파이트 및 박테리아 오염, 또는 이의 조합 하에 존속되도록 조정된다.
예시적인 수혼화성 화합물 생산 세포, 예를 들어 이소프레노이드, 폴리케티드 및 지방산을 재조합적으로 생산하는 세포, 및 그러한 세포의 생산 방법이 이하 제공된다.
6.4.1 이소프레노이드를 생산하는 재조합 세포
일 측면에서, 예를 들어 하나 이상의 이소프레노이드 화합물을 재조합적으로 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포들의 클론 집단 내에서 이소프레노이드 생산을 검출하는 방법이 제공된다. 이소프레노이드는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)로부터 유도되며, 이는 메발로네이트-의존적 ("MEV") 경로 또는 1-디옥시-D-자일룰로오스 5-디포스페이트 ("DXP") 경로의 효소에 의하여 생합성될 수 있다. MEV 경로가 도 1A에 개략적으로 기재되며, DXP 경로가 도 1B에 개략적으로 기재된다.
6.4.1.1 MEV 경로
본원에 제공되는 이소프레노이드 생산 세포의 검출 방법의 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 유전자 비변형된 모 세포에 비하여 하나 이상의 이소프레노이드 화합물의 증가된 생산을 초래하는, MEV 경로의 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 두 개의 분자의 아세틸-보조효소 A를 아세토아세틸-CoA로 축합시킬 수 있는 효소, 예를 들어 아세틸-CoA 티올라아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나: (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans)), and (L20428; 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 아세토아세틸-Coa를 다른 아세틸-CoA 분자와 축합시켜 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 형성할 수 있는 효소, 예를 들어 HMG-CoA 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (NC_001145. complement 19061.20536; 사카로마이세스 세레비시애), (X96617; 사카로마이세스 세레비시애), (X83882; 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라 (Kitasatospora griseola)), (BT007302; 호모사피엔스 (Homo sapiens)), 및 (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (NM_206548; 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster)), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; 스태필로코커스 아우레우스), (NM_204485; 갈루스 갈루스 (Gallus gallus)), (AB015627; 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp . KO 3988), (AF542543; 니코티아나 아테뉴아타 (Nicotiana attenuata)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라 (Kitasatospora griseola)), (AX128213, 절단된 HMGR을 암호화하는 서열을 제공; 사카로마이세스 세레비시애), 및 (NC_001145: 상보적 (115734.118898; 사카로마이세스 세레비시애)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 메발로네이트 키나아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (L77688; 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), 및 (X55875; 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 포스포메발로네이크 키나아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF429385; 헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis)), (NM_006556; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), 및 (NC_001145. 상보적 712315.713670; 사카로마이세스 세레비시애)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트 5-피로포스페이트를 IPP로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 메발로네이트 피로포스페이트 디카르복실라아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (X97557; 사카로마이세스 세레비시애), (AF290095; 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium)), 및 (U49260; 호모 사피엔스 (Homo sapiens))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 하나 이상의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 두 개의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 효소 및 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 하나 잇아의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 세 개의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 네 개의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 다섯 개의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 여섯 개의 MEV 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로를 통하여 생산된 IPP를 그의 이성질체, 디메틸알릴 피로포스페이트 ("DMAPP")로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. DMAPP는 다양한 부가적 효소의 작용을 통하여 축합 및 변형되어 단순하고 보다 복잡한 이소프레노이드를 형성할 수 있다 (도 2).
6.4.1.2 DXP 경로
본원에 제공되는 이소프레노이드 생산 세포의 검출 방법의 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 유전자 비조작된 모 세포에 비하여 하나 이상의 이소프레노이드 화합물의 증가된 생산을 초래하는, DXP 경로의 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 두 개의 분자의 아세틸-코엔자임 A를 아세토아세틸-CoA로 축합시킬 수 있는 효소, 예를 들어 아세틸-CoA 티올라아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나: (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans)), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 피루베이트를 D-글리세르알데히드 3-포스페이트와 축합하여 1-디옥시-D-자일룰로오스-5-포스페이트를 형성할 수 있는 효소, 예를 들어 1-디옥시-3-자일룰로오스-5-포스페이트 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF035440; 에스케리치아 콜라이), (NC_002947, locus tag PP0527; 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; 살모넬라 엔테리카 파라티피 (Salmonella enterica Paratyphi), ATCC 9150 참조), (NC_007493, locus tag RSP_0254; 로도박터 스패로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) CGA009), (NC_004556, locus tag PD1293; 자일렐라 파스티디오사 테메쿨랄 (Xylella fastidiosa Temecula1)), 및 (NC_003076, locus tag AT5G11380; 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 1-디옥시-D-자일룰로오스-5-포스페이트를 2C-메틸-D-에리스리톨-4-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 1-디옥시-D-자일룰로오스-5-포스페이트 리덕토이소머라아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AB013300; 에스케리키라 콜라이), (AF148852; 아라비돕시스 탈리아나), (NC_002947, locus tag PP1597; 슈도모나스 푸티다 KT2440), (AL939124, locus tag SCO5694; 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor) A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP_2709; 로도박터 ㅅ스패로이데스 (Rodobacter sphaeroides) 2.4.1), 및 (NC_007492, locus tag Pfl_1107; 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) PfO-1)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 2C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트를 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF230736; 에스케리키라 콜라이), (NC_007493, locus tag RSP_2835; 로도박터 스패로이데스 2.4.1), (NC_003071, locus tag AT2G02500; 아라비돕시스 탈리아나), 및 (NC_002947, locus tag PP1614; 슈도모나스 푸티다 KT2440)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨을 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨-2-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 4-디포스포시티딜--2C-메틸-D-에리쓰리톨 키나아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF216300; 에스케리키라 콜라이) 및 (NC_007493, locus tag RSP_1779; 로도박터 스패로이데스 2.4.1)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨 2-포스페이트를 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF230738; 에스케리치아 콜라이), (NC_007493, locus tag RSP_6071; 로도박터 스패로이데스 2.4.1), 및 (NC_002947, locus tag PP1618; 슈도모나스 ㅍ푸티다 KT2440)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트를 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AY033515; 에스케리치아 콜라이), (NC_002947, locus tag PP0853; 슈도모나스 푸티다 KT2440), 및 (NC_007493, locus tag RSP_2982; 로도박터 스패로이데스 2.4.1)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트를 IPP 또는 그의 이성질체 DMAPP로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어, 이소펜틸/디메틸알릴 디포스페이트 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AY062212; 에스케리치아 콜라이) 및 (NC_002947, locus tag PP0606; 슈도모나스 푸티다 KT2440)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 하나 이상의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 두 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 세 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 네 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 다섯 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 여섯 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 일곱 개의 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포 자신의 대사 과정과 IPP 생산에 수반되는 과정들 간의 "크로스토크" (또는 간섭)가 최소화 또는 전적으로 제거된다. 예를 들어, 숙주 미생물이 IPP 합성을 위하여 DXP 경로에만 의존하고 MEV 경로가 도입되어 부가적 IPP를 제공할 때, 크로스토크가 최소화되거나 전적으로 제거된다. 이러한 숙주 미생물은 MEV 경로 효소의 발현을 변경시키거나 또는 MEV 경로와 관련되는 중간체를 가공하도록 구비되지 않을 것이다. DXP 경로에만 의존하거나 이에 주로 의존하는 미생물은 예를 들어 에스케리치아 콜라이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 DXP 경로와 조합되거나 또는 독점적으로 MEV 경로를 통하여 IPP를 생산한다. 다른 구현예에서, 숙주 세포가 이종 도입된 MEV 경로를 통해서만 IPP를 생산하도록 숙주의 DXP 경로가 기능적으로 상실된다. 상기 DXP 경로는 유전자 발현을 상실시키거나 또는 DXP 경로 효소 중 하나 이상의 기능을 불활성화함으로써 기능적으로 상실될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포에 의하여 생산되는 이소프레노이드는 C5 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 하나의 이소프렌 단위로부터 유도되고 헤미테르펜으로도 불리운다. 헤미테르펜의 예시적 예는 이소프렌이다. 다른 구현예에서, 상기 이소프레노이드는 C10 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 두 개의 이소프렌 단위로부터 유도되고, 모노테르펜으로도 불리운다. 모노테르펜의 예시적 예는 리모넨, 시트라넬롤, 게라니올, 멘톨, 페릴릴 알콜, 리날룰, 튜존, 및 미르센이다. 다른 구현예에서, 상기 이소프레노이드는 C15 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 세 개의 이소프렌 단위로부터 유도되고 세스퀴테르펜으로도 불리운다. 세스퀴테르펜의 예시적 예는 페리플란온 B (periplanone B), 깅콜라이드 B (gingkolide B), 아모르파디엔 (amorphadiene), 아르테미시닌 (artemisinin), 아르테미시닉산 (artemisinic acid), 발렌센 (valencene), 누트카톤 (nootkatone), 에피-세드롤 (epi-cedrol), 에피-아리스톨로센 (epi-aristolochene), 파르네솔 (farnesol), 고시폴 (gossypol), 사노닌 (sanonin), 페리플라논 (periplanone), 포르스콜린 (forskolin), 및 패출롤 (patchoulol) (패출리 알콜로도 알려짐)이다. 다른 구현예에서, 상기 이소프레노이드는 C20 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 네 개의 이소프렌 단위로부터 유도되고, 디테르펜으로도 불리운다. 디테르펜의 예시적 예는 카스벤 (casbene), 엘루테로빈 (eleutherobin), 파클리탁셀 (paclitaxel), 프로스트라틴 (prostratin), 슈도프테로신 (pseudopterosin), 및 탁사디엔 (taxadiene)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 이소프레노이드는 C20 + 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 네 개를 초과하는 이소프렌 단위로부터 유도되고, 아르브루사이드E (arbrusideE), 브루세안틴 (bruceantin), 테스토스테론 (testosterone), 프로제스테론 (progesterone), 코르티손 (cortisone), 디지톡신 (digitoxin), 및 스쿠알렌 (squalene)과 같은 트리테르펜 (6 이소프렌 단위로부터 유도되는 C30 이소프레노이드 화합물); β-카로텐과 같은 테트라테르펜 (8 이소프레노이드로부터 유도되는 C40 이소프레노이드 화합물); 및 폴리이소프렌과 같은 폴리테르펜 (8을 초과하는 이소프렌 단위로부터 유도되는 C40 + 이소프레노이드 화합물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드는 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐세라니올, 이소프렌, 리날룰, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이소프레노이드 화합물은 또한 이에 제한되지 않으나, 카로티노이드 (리코펜, α- 및 β-크립토크산틴, 빅신, 제아크산틴, 아스타크산틴 및 루테인과 같은), 스테로이드 화합물, 및 혼합 테르펜-알칼로이드, 및 코엔자임 Q-10과 같은 기타 화학기에 의하여 개질된 이소프레노이드로 이루어지는 화합물을 포함한다.
일부 구현예에에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로를 통하여 생산되는 IPP를 DMAPP로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 IPP 이소머라아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (NC_000913, 3031087.3031635; 에스케리치아 콜라이), 및 (AF082326; 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP 및/또는 DMAPP 분자를 축합시켜 5 개 이상의 탄소를 함유하는 폴리프레닐 화합물을 형성할 수 있는 폴리프레닐 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP 하나의 분자를 DAMPP 하나의 분자와 축합시켜 게라닐 피로포스페이트 ("GPP") 하나의 분자를 형성할 수 있는 효소, 예를 들어 GPP 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF513111; 아비에스 그란디스(Abies grandis)), (AF513112; 아비에스 그란디스), (AF513113; 아비에스 그란디스), (AY534686; 안티리늄 마주스(Antirrhinum majus)), (AY534687; 안티리늄 마주스), (Y17376; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), (AE016877, Locus AP11092; 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ); ATCC 14579), (AJ243739; 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)), (AY534745; 클라키아 브루에리(Clarkia breweri)), (AY953508; 이프스 피니(Ips pini)), (DQ286930; 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)), (AF182828; 멘타 x 피페리타(Mentha x piperita)), (AF182827; 멘타 x 피페리타), (MPI249453; 멘타 x 피페리타), (PZE431697, Locus CAD24425; 파라코커스 제아크산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)), (AY866498; 피크로리자 쿠로아(Picrorhiza kurrooa)), (AY351862; 비티스 비니페라(Vitis vinifera)), 및 (AF203881, Locus AAF12843; 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 두 분자의 IPP를 한 분자의 DMAPP와 축합시키거나, IPP 분자를 GPP 분자에 첨가하여 파르세닐 피로포스페이트 ("FPP")를 형성할 수 있는 효소, 예를 들어 FPP 합성효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (ATU80605; 아라비돕시스 탈리아나), (ATHFPS2R; 아라비돕시스 탈리아나), (AAU36376; 아트페미시아 안누아(Artemisia annua)), (AF461050; 보스 타우루스(Bos taurus)), (D00694; 에스케리치아 콜라이 K-12), (AE009951, Locus AAL95523; 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum subsp . nucleatum ) ATCC 25586), (GFFPPSGEN; 기베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi)), (CP000009, Locus AAW60034; 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans ) 621H), (AF019892; 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), (HUMFAPS; 호모 사피엔스(Homo sapiens)), (KLPFPSQCR; 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)), (LAU15777; 루피누스 알부스(Lupinus albus)), (LAU20771; 루피누스 알부스), (AF309508; 무스 무스쿨러스(Mus musculus)), (NCFPPSGEN; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), (PAFPS1; 파르테늄 아르겐타툼(Parthenium argentatum)), (PAFPS2; 파르테늄 아르겐타튬), (RATFAPS; 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)), (YSCFPP; 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)), (D89104; 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), (CP000003, Locus AAT87386; 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes)), (CP000017, Locus AAZ51849; 스트렙토코커스 파이오게네스), (NC_008022, Locus YP_598856; 스트렙토코커스 파이오게네스 MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; 스트렙토코커스 파이오게네스 MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; 스트렙토코커스 파이오게네스 MGAS10750), (MZEFPS; 제아 마이스(Zea mays)), (AE000657, Locus AAC06913; 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus ) VF5), (NM_202836; 아라비돕시스 탈리아나), (D84432, Locus BAA12575; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), (U12678, Locus AAC28894; 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum ) USDA 110), (BACFDPS; 게오바실러스 스테아로터모필러스(Geobacillus stearothermophilus)), (NC_002940, Locus NP_873754; 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi ) 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd KW20), (J05262; 호모 사피엔스(Homo sapiens)), (YP_395294; 락토바실러스 사케이 아종 사케이(Lactobacillus sakei subsp . sakei ) 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; 렙토스피라 인터로간스 세로바르 코펜하게니 str. 피오크루즈(Leptospira interrogans serovar Copenhageni str . Fiocruz ) L1-130), (AB003187; 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)), (NC_002946, Locus YP_208768; 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae ) FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; 리조븀(Rhizobium ) sp. NGR234), (J05091; 사카로마이세스 세레비시애), (CP000031, Locus AAV93568; 실리시박터 포메로이(Silicibacter pomeroyi ) DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) R6), 및 (NC_004556, Locus NP 779706; 크실렐라 파스티디오사 테메쿨라1(Xylella fastidiosa Temecula1)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP 및 DMAPP 또는 IPP 및 FPP를 조합하여 게라닐게라닐 피로포스페이트 ("GGPP")를 형성할 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (ATHGERPYRS; 아라비돕시스 탈리아나), (BT005328; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_119845; 아라비돕시스 탈리아나), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; 바실러스 투링기엔시스 세로바 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis serovar israelensis , ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; 푸소박테리움 누클레아툼 아종 빈센티(Fusobacterium nucleatum subsp . vincentii ), ATCC 49256), (GFGGPPSGN; 기베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi)), (AY371321; 깅코 빌로바(Ginkgo biloba)), (AB055496; 헤베아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis)), (AB017971; 호모 사피엔스(Homo sapiens)), (MCI276129; 무코 시르시넬로이데스 f. 루시타니쿠스(Mucor circinelloides f. lusitanicus), (AB016044; 무스 무스쿨러스(Mus musculus)), (AABX01000298, Locus NCU01427; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), (NCU20940; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)), (AB016095; 시네코코커스 일론게이트(Synechococcus elongates), (SAGGPS; 시나피스 알바(Sinapis alba)), (SSOGDS; 술폴로버스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)), (NC_007759, Locus YP_461832; 신트로푸스 액시디트로피쿠스(Syntrophus aciditrophicus ) SB), (NC_006840, Locus YP_204095; 비브리오 피세리(Vibrio fischeri ) ES114), (NM_112315; 아라비돕시스 탈리아나), (ERWCRTE; 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans)), (D90087, Locus BAA14124; 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)), (X52291, Locus CAA36538; 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)), (AF195122, Locus AAF24294; 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)), 및 (NC_004350, Locus NP_721015; 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ) UA159)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 폴리프레닐을 개질하여 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 폴리테르펜, 스테로이드 화합물, 카로티노이드, 개질된 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 카렌 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AF461460, REGION 43.1926; 피세아 아비에스(Picea abies) 및 (AF527416, REGION: 78.1871; 살비아 스테노필라(Salvia stenophylla))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 게라니올 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AJ457070; 신나모뭄 테누이필룸(Cinnamomum tenuipilum)), (AY362553; 오시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum)), (DQ234300; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens ) 균주 1864), (DQ234299; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora) 균주 1861), (DQ234298; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora) 균주 4935), 및 (DQ088667; 페릴라 시트리오도라)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 리날룰 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예는 이에 제한되지 않으나, (AF497485; 아라비돕시스 탈리아나), (AC002294, Locus AAB71482; 아라비돕시스 탈리아나), (AY059757; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_104793; 아라비돕시스 탈리아나), (AF154124; 아르테미시아 아누아(Artemisia annua)), (AF067603; 클라키아 브루에리(Clarkia breweri)), (AF067602; 클라키아 콘키나(Clarkia concinna)), (AF067601; 클라키아 브루에리(Clarkia breweri)), (U58314; 클라키아 브루에리(Clarkia breweri)), (AY840091; 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)), (DQ263741; 라반듈라 앙구스티폴리아(Lavandula angustifolia)), (AY083653; 멘타 시트라테(Mentha citrate)), (AY693647; 오시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum)), (XM_463918; 오리자 사티바(Oryza sativa)), (AP004078, Locus BAD07605; 오리자 사티바), (XM_463918, Locus XP_463918; 오리자 사티바), (AY917193; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora)), (AF271259; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens)), (AY473623; 피세아 아비에스(Picea abies)), (DQ195274; 피세아 시트첸시스(Picea sitchensis)), 및 (AF444798; 페릴라 프루테센스 변종 크리스파 쿨티바(Perilla frutescens var. crispa cultivar) No. 79)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 리모넨 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (+)-리모넨 합성효소 (AF514287, REGION: 47.1867; 시트러스 리몬(Citrus limon)) 및 (AY055214, REGION: 48.1889; 아가스타체 루고사(Agastache rugosa)) 및 (-)-리모넨 합성효소 (DQ195275, REGION: 1.1905; 피세아 시트첸시스(Picea sitchensis)), (AF006193, REGION: 73.1986; 아비에스 그란디스(Abies grandis)), 및 (MHC4SLSP, REGION: 29.1828; 멘타 스피카타(Mentha spicata))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 미르센 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (U87908; 아비세으 그란디스(Abies grandis)), (AY195609; 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)), (AY195608; 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS10), (NM_113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (AF271259; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens)), (AY473626; 피세아 아비에스(Picea abies)), (AF369919; 피세아 아비에스), 및 (AJ304839; 쿠에르쿠스 일렉스(Quercus ilex))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 오시멘 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AY195607; 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)), (AY195609; 안티리눔 마주스), (AY195608; 안티리눔 마주스), (AK221024; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_117775; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_001036574; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS10), (AB110642; 시트러스 운시우(Citrus unshiu ) CitMTSL4), 및 (AY575970; 로투스 코르니쿨라투스 변종 자포니쿠스(Lotus corniculatus var . japonicus))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 α-피넨 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (+) α-피넨 합성효소 (AF543530, REGION: 1.1887; 피누스 타에다(Pinus taeda)), (-) α-피넨 합성효소 (AF543527, REGION: 32.1921; 피누스 타에다(Pinus taeda)), 및 (+)/(-) α-피넨 합성효소 (AGU87909, REGION: 6111892; 아비에스 그란디스(Abies grandis))를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 β-피넨 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (-) β-피넨 합성효소 (AF276072, REGION: 1.1749; 아르테미시아 아누아(Artemisia annua)) 및 (AF514288, REGION: 26.1834; 시트루스 리몬(Citrus limon))을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 사비넨 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 살비아 오피시날리스(Salvia officinalis)로부터 AF051901, REGION: 26.1798를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 γ-테르피넨 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 (시트러스 리몬(Citrus limon)으로부터 AF514286, REGION: 30.1832) 및 (시트러스 운시우(Citrus unshiu)로부터 AB110640, REGION 1.1803)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 테르피놀렌 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (AY693650 오시뭄 바실리쿰(Oscimum basilicum)으로부터) 및 (슈도추가 멘지에시(Pseudotsuga menziesii)로부터 AY906866, REGION: 10.1887)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 아모르파디엔 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 미국 특허 출원 제 2004/0005678 호의 SEQ ID NO. 37을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 α-파르네센 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 피루스 코뮤니스 쿨티바 단주(Pyrus communis cultivar d'Anjou)로부터 DQ309034 (pear; 유전자 명 AFS1) 및 말루스 도메스티카(Malus domestica)로부터 AY182241 (apple; 유전자 AFS1). Pechouus et al ., Planta 219(1):84-94 (2004)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 β-파르네센 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 멘타 x 피페리타(Mentha x piperita)로부터 GenBank 기탁 번호 AF024615 (페퍼민트; 유전자 Tspa11), 및 아르테미시아 아누아(Artemisia annua)로부터 AY835398. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 파르네솔 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 제아 마이스(Zea mays)로부터 GenBank 기탁 번호 AF529266 및 사카로마이세스 세레비시애로부터 YDR481C (유전자 Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 네롤리돌 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나 제아 마이스로부터 AF529266 (옥수수: 유전자 tps1)을 포함한다.
일부 구현에에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 패출리올 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 포고스테몬 카블린(Pogostemon cablin)으로부터 AY508730 REGION: 1.1659를 포함한다.
일부 구현에에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 누트카톤 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)로부터 AF441124 REGION: 1.1647 및 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens)로부터 AY917195 REGION: 1.1653를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종 뉴클레오티드는 아비에타디엔 합성효소를 암호화한다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (U50768; 아비에스 그란디스(Abies grandis)) 및 (AY473621; 피세아 아비에스(Picea abies))를 포함한다.
6.4.2 폴리케티드를 생산하는 재조합 세포
다른 측면에서, 예를 들어 하나 이상의 폴리케티드 화합물을 재조합적으로 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포들의 클론 집단 내에 폴리케티드 생산을 검출하는 방법이 제공된다. 폴리케티드 합성은 지방산 합성효소(FASs)와 관련되는 다기능 효소인 폴리케티드 합성효소(PKSs)에 의하여 중재된다. PKSs는 아실티오에스테르, 대개 아세틸, 프로피오닐, 말로닐 또는 메틸말로닐 간의 반복되는 (탈탄산) Claisen 축합을 통하여 폴리케티드의 생합성을 촉매화한다. 각각의 축합 후, PKSs는 성장하는 폴리케티드 사슬의 β-케토기 상에 케토환원, 탈수 및 에노일환원을 포함하는 환원 사이클 모두 또는 일부를 촉매화하거나 이들 중 어느 것도 촉매화하지 않음으로써 폴리케티드 생성물 내로 구조적 변화를 도입한다.
본원에 제공되는 폴리케티드 생산 세포의 검출 방법의 일부 구현예에서, 사익 폴리케티드 생산 세포는 PKS 시스템을 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리케티드의 합성을 촉매화하여 유전자 비조작된 모 세포에 비하여 하나 이상의 폴리케티드 화합물의 증가된 생산을 초래할 수 있는 하나 이상의 PKSs를 포함한다.
폴리케드 합성효소(PKSs)에는 두 가지 주요 부류가 있다: 촉매 부위가 사용되는 방식에 있어서 다른 방향족 PKS 및 모듈식 PKS. 방향족 PKS의 경우, 최소 시스템, 즉 폴리케티드 생산을 촉매화하는데 요구되는 최소 성분들은 케토신타아제/아실 트랜스퍼라아제 (KS/AT) 촉매 영역, 사슬 길이 인자 (CLF) 촉매 영역 및 아실 캐리어 단백질 (ACP) 활성을 포함한다. 모듈식 PKS 시스템의 경우, 최소 시스템은 합성의 중간체가 기질로서 제공된다면, KS 촉매 영역, AT 촉매 영역, 및 ACP 활성을 포함한다. 데노보(de novo) 폴리케티드 합성이 요구되는 경우, 최소 모듈식 PKS 시스템은 부가적인 로딩 아실 트란스퍼라아제를 추가로 포함하며, 이는 부가적 AT 및 ACP 영역들을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 KS 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 AT 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 AT 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나를 초과하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 CLF 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 ACP 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 ACP 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나를 초과하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 최소의 방향족 PKS 시스템, 에를 들어, KS 촉매 영역을 포함하는 효소, AT 촉매 영역을 포함하는 효소, CLF 촉매 영역을 포함하는 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 효소 각각을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 최소 모듈식 PKS 시스템, 예를 들어, KS 촉매 영역을 포함하는 효소, AT 촉매 영역을 포함하는 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 효소 각각을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 데노보 폴리케티드 합성을 위한 모듈식 방향족 PKS 시스템, 예를 들어, KS 촉매 영역을 포함하는 효소, AT 촉매 영역을 포함하는 하나 이상의 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 하나 이상의 효소 각각을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 최소 PKS 시스템, 예를 들어 최소 방향족 PSK 시스템 또는 최소 모듈식 PKS 시스템을 포함하는 폴리케티드 생산 세포는 최종 생성물 폴리케티드의 생산에 기여할 수 있는 부가적 촉매 활성을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 초기 폴리케티드 백본의 고리화를 촉진시키는 시클라아제 (CYC) 촉매 영역을 포함하는 효소를암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 케토리덕타아제 (KR) 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 아로마타아제 (ARO) 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 에노일리덕타아제(ER) 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 티오에스터라아제(TE) 촉매 영역을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 ACP의 판테테이닐화(pantetheinylation)를 실행하는 홀로(holo) ACP 신타아제 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 합성후 폴리케티드 변경 활성을 부여하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 예를 들어 항생제 활성을 가지는 폴리케티드가 요구되는 경우, 폴리케티드의 합성후 변경을 실행하는 글리코실라아제 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 히드록실라아제 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 에폭시다아제 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는 메틸라아제 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리케티드 생산 세포는, 이에 제한되지 않으나 다음 폴리케티드로부터 선택되는 폴리케티드를 생산할 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 PKS 효소 및 폴리케티드 변경 효소를 암호화하는 서열을 포함한다: 아버멕틱(Avermectin) (예를 들어, 미국 특허 제 5,252,474호; 미국 특허 제 4,703,009호; EP 공보 제 118,367호; MacNeil et al., 1993, "Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics"; Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, "A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin"; MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125; 및 Ikeda and Omura, 1997, Chem . Res. 97: 2599-2609 참조); 캔디사이딘(Candicidin) (FR008) (예를 들어, Hu et al., 1994, Mol . Microbiol. 14: 163-172 참조); 카보마이신(Carbomycin), 큐라마이신(Curamycin) (예를 들어, Bergh et al., Biotechnol Appl Biochem . 1992 Feb;15(1):80-9 참조); 다우노루비신(Daunorubicin) (예를 들어, J Bacteriol . 1994 Oct;176(20):6270-80 참조); 에포틸론(Epothilone) (예를 들어, PCT 공보 제 99/66028호; 및 PCT 공보 제 00/031247호 참조); 에리쓰로마이신(Erythromycin) (예를 들어, PCT 공보 제 93/13663호; 미국 특허 제 6,004,787호; 미국 특허 제 5,824,513호; Donadio et al., 1991, Science 252:675-9; 및 Cortes et al., Nov. 8, 1990, Nature 348:176-8 참조); FK-506 (예를 들어,, Motamedi et al., 1998; Eur . J Biochem. 256: 528-534; 및 Motamedi et al., 1997, Eur . J Biochem. 244: 74-80 참조); FK-520 (예를 들어, PCT 공보 제 00/020601호; 및 Nielsen et al., 1991, Biochem. 30:5789-96 참조); 그리세우신(Griseusin) (예를 들어, Yu et al ., J Bacteriol . 1994 May;176(9):2627-34 참조); 로바스타틴(Lovastatin) (예를 들어, 미국 특허 제 5,744,350호); 프레놀리신(Frenolycin) (예를 들어, Khosla et al ., Bacteriol. 1993 Apr;175(8):2197-204; 및 Bibb et al ., Gene 1994 May 3;142(1):31-9 참조); 그라나티신(Granaticin) (예를 들어, Sherman et al ., EMBO J. 1989 Sep;8(9):2717-25; 및 Bechtold et al., Mol Gen Genet . 1995 Sep 20;248(5):610-20 참조); 메데마이신(Medermycin) (예를 들어, Ichinose et al ., Microbiology 2003 Jul;149(Pt 7):1633-45 참조); 모넨신(Monensin) (예를 들어, Arrowsmith et al., Mol Gen Genet. 1992 Aug;234(2):254-64 참조); 노낙틴(Nonactin) (예를 들어, FEMS Microbiol Lett . 2000 Feb 1;183(1):171-5 참조); 나노마이신(Nanaomycin) (예를 들어, Kitao et al ., J Antibiot (Tokyo). 1980 Jul;33(7):711-6 참조); 네마덱틴(Nemadectin) (예를 들어, MacNeil et al., 1993, supra 참조); 니다마이신(Niddamycin) (예를 들어, PCT 공보 제 98/51695호; 및 Kakavas et al., 1997, J. Bacteriol . 179: 7515-7522 참조); 올레안도마이신(Oleandomycin) (예를 들어, Swan et al., 1994, Mol . Gen . Genet. 242: 358-362; PCT 공보 제 00/026349호; Olano et al., 1998, Mol . Gen . Genet. 259(3): 299-308; 및 PCT 특허 출원 공보 제 WO 99/05283호 참조); 옥시테트라시클린(Oxytetracycline) (예를 들어, Kim et al ., Gene . 1994 Apr 8;141(1):141-2 참조); 피크로마이신(Picromycin) (예를 들어, PCT 공보 제 99/61599호; PCT 공보 제 00/00620호; Xue et al., 1998, Chemistry & Biology 5(11): 661-667; Xue et al., October 1998, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 95: 12111 12116 참조); 플라테놀리드(Platenolide) (예를 들어, EP 공보 제 791,656호; 및 미국 특허 제 5,945,320호 참조); 라파마이신(Rapamycin) (예를 들어, Schwecke et al., August 1995, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 92:7839-7843; 및 Aparicio et al., 1996, Gene 169: 9-16 참조); 리파마이신(Rifamycin) (예를 들어, PCT 공보 제 WO 98/07868호; 및 August et al., Feb. 13, 1998, Chemistry & Biology, 5(2): 69-79 참조); 소란기움(Sorangium) (예를 들어, 미국 특허 제 6,090,601호 참조); 소라펜(Soraphen) (예를 들어, 미국 특허 제 5,716,849호; Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-3679 참조); 스피노신(Spinocyn) (예를 들어, PCT 공보 제 99/46387호); 스피라마이신(Spiramycin) (예를 들어, 미국 특허 제 5,098,837호 참조); 테트라세노마이신(Tetracenomycin) (예를 들어, Summers et al ., J Bacteriol . 1992 Mar;174(6):1810-20; 및 Shen et al ., J Bacteriol . 1992 Jun;174(11):3818-21 참조); 테트라시클린(Tetracycline) (예를 들어, J Am Chem Soc . 2009 Dec 9;131(48):17677-89 참조); 틸로신(Tylosin) (예를 들어, 미국 특허 제 5,876,991호; 미국 특허 제 5,672,497호; 미국 특허 제 5,149,638호; EP 공보 제 791,655호; EP 공보 제 238,323호; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-6; 및 Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol . Microbiol. 13: 349-355 참조); 및 6-메틸살리실산 (예를 들어, Richardson et al., Metab Eng. 1999 Apr;1(2):180-7; 및 Shao et al ., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 23;345(1):133-9 참조).
6.4.3 지방산을 생산하는 재조합 세포
다른 측면에서, 예를 들어 하나 이상의 지방산을 재조합적으로 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포들의 클론 집단 내에 지방산 생산을 검출하는 방법이 제공된다. 지방산 합성은 아실 사슬의 개시 및 연장을 촉매화하는 지방산 합성효소 (FAS)에 의하여 중재된다. 아실 캐리어 단백질(ACP)이 FAS 경로 내 효소와 함께 생산되는 지방산의 길이, 포화 정도, 및 분지를 조절한다. 지방산 생합성 경로는 전구체 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 수반한다. 이 경로에서 단계는 지방산 생합성 (fab) 및 아세틸-CoA 카복실라아제 (ace) 유전자의 효소에 의하여 촉매화된다.
본원에 제공되는 지방산 생산 세포의 검출 방법의 일부 구현예에서, 상기 지방산 생산 세포는 유전자 비조작된 모 세포에 비하여 하나 이상의 지방산의 증가된 생산을 실행하도록, 아세틸-CoA 합성효소 및/또는 말로닐-CoA 합성효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 아세틸-CoA 생산을 증가시키기 위하여, 다음 유전자 하나 이상이 세포 내에 발현될 수 있다: pdh, panK, aceEF (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 디하이드로게나아제 복합체의 EIp 디하이도르게나아제 성분 및 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라아제 성분을 암호화), fabH, fabD, fabG, acpP, 및 fabF. 그러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (coaA, AAC76952로도 알려짐), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179)를 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 분해에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자를 감쇠 또는 녹아웃시킴으로써 증가된 지방산 수준이 세포 내에 초래될 수 있다. 예를 들어, fadE, gpsA, idhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, 및/또는 ackB의 발현 수준이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 엔지니어링된 숙주 세포 내에서 감쇠 또는 녹아웃될 수 있다. 그러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356), 및 ackB (BAB81430)를 포함한다. 결과 생성되는 숙주 세포는 적절한 환경에서 성장될 때 증가된 아세틸-CoA 생산 수준을 가질 것이다.
일부 구현예에서, 상기 지방산 생산 세포는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 멀티서브유닛 AccABCD 단백질을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. AccABCD를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나 기탁 번호 AAC73296, EC 6.4.1.2를포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 생산 세포는 리파아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 리파아제를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나 기탁 번호 CAA89087 및 CAA98876를 포함한다..
일부 구현예에서, 지방산 생합성 경로의 초기 단계를 억제할 장사슬 아실-ACP 수준 증가를 초래할 수 있는 PlsB를 억제함으로써 세포 내에 증가된 지방산 수준이 초래될 수 있다 (예를 들어, accABCD, fabH, 및 fabl). PlsB의 발현 수준은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 엔지니어링된 숙주 세포 내에서 감쇠 또는 녹아웃될 수 있다. PlsB를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 기탁 번호 AAC77011를 포함한다. 특정 구현예에서, plsB D31 IE 돌연변이를 이용하여 세포 내 유용한 CoA 양을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, fabA의 억제를 초래할 sfa 유전자를 과발현시킴으로써 세포 내에 단일불포화 지방산의 증가된 생산을 초래할 수 있다. sfa를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나 기탁 번호 AAN79592를 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 기질의 사슬 길이를 조절하는 효소, 예를 들어 티오에스터라아제의 발현을 조절함으로써 세포 내에서 증가된 지방산 수준이 초래될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 지방산 생산 세포는 tes 또는 fat 유전자를 과발현하도록 변형된 것이다. 적합한 tes 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 기탁 번호 (tesA: C18 :1 지방산을 생산할 수 있는, E. Coli 로부터 AAC73596) 및 (tesB: E. Coli로부터 AAC73555)를 포함한다. 적합한 fat 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, (fatB: C12 :0 지방산을 생산할 수 있는, 움벨룰라리아 캘리포니아(Umbellularia california)로부터 Q41635 및 AAA34215), (fatB2: C8 :0-C10 :0 지방산을 생산할 수 있는, 쿠페아 후커리아나(Cuphea hookeriana)로부터 Q39513 및 AAC49269), (fatB3: C14 :0-C16 :0 지방산을 생산할 수 있는, 쿠페아 후커리아나(Cuphea hookeriana)로부터 AAC49269 및 AAC72881), (fatB: C14:0 지방산을 생산할 수 있는, 신나모눔 캄포룸(Cinnamonum camphorum)으로부터 Q39473 및 AAC49151), (fatB [ M141T ]: C16 :1 지방산을 생산할 수 있는, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 CAA85388), (fatA: C18 :1 지방산을 생산할 수 있는, 아라비돕시스 탈리아나로부터 NP 189147 및 NP 193041), (fatA : C18 :1 지방산을 우선적으로 생산할 수 있는 브라디르히조큠 자포니쿰 (Bradvrhiizobium japonicum)으로부터 CAC39106), (fatA: C18 :1 지방산을 생산할 수 있는, 쿠페아 후테리아나로부터 AAC72883), 및 (fatA1, 헬리안투스 아누스(Helianthus annus)로부터 AAL79361)를 포함한다.
일부 구현예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 티오에스터라아제 C18의 발현 또는 활성을 감쇠시킴으로써 세포 내 C10 지방산의 증가된 수준이 초래될 수 있다. 티오에스터라아제 C18을 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 기탁 번호 AAC73596 및 P0ADA1을 포함한다. 다른 구현예에서, 당업게에 공지된 기술을 이용하여 티오에스터라아제 C10의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 세포 내 증가된 C10 지방산 수준을 초래할 수 있다. 티오에스터라아제 C10을 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나 기탁번호 Q39513을 포함한다.
일부 구현예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 비-C14 지방산을 생산하는 내생 티오에스터라아제의 발현 또는 활성을 감쇠시킴으로써 세포 내 C14 지방산의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 다른 구현예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 기질 C14-ACP를 사용하는 티오에스터라아제의 발현 또는 활성을 감쇠시킴으로써 세포 내 C14 지방산의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 그러한 티오에스터라아제를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 기탁 번호 Q39473를 포함한다.
일부 구현예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 비-C12 지방산을 생산하는 내생 티오에스터라아제의 발현 또는 활성을 감쇠시킴으로써 세포 내 C12 지방산의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 다른 구현예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 기질 C12-ACP를 사용하는 티오에스터라아제의 발현 또는 활성을 감쇠시킴으로써 세포 내 C12 지방산의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 그러한 티오에스터라아제를 암호화하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, 기탁 번호 Q41635를 포함한다.
6.4.4 부가적 유전자 변형
본원에 제공되는 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 하나 이상의 수혼화성 화합물을 생산하도록 엔지니어링된 유전자 변형된 세포는 산업적 발효에 있어서 유용한 특성을 세포에 부여하는 하나 이상의 유전자 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 응집(flocculation)을 증가시키는 하나 이상의 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 응집은 액체 성장 기질의 바닥으로 신속히 침강하는 다수의 세포를 함유하는 플로크를 형성하는, 미생물 세포의 무성, 가역적 및 칼슘-의존적 응집이다. 응집은 현탁된 효모 세포를 산업적 발효에서 이로부터 생산되는 발효 생성물로부터 분리하기 위한 과정을 크게 단순화시키므로, 예를 들어 바이오에탄올, 와인, 맥주 및 기타 생산물의 생산을 위하여 효모의 산업적 발효에 있어서 중요하다. 상기 분리는 원심분리 또는 여과에 의하여 달성될 수 있으나, 이러한 방법에 의한 분리는 시간 고모적이고 비용이 든다. 대안적으로 미생물 세포의 자연적 침강에 의하여 정화(clarification)가 달성될 수 있다. 단일 미생물 세포는 시간 경과에 따라 침강하는 경향이 있으나, 자연적 침강은 세포가 응집할 때에만 산업적 과정에서 실행가능한 옵션이 된다. 최근의 연구는 효모 세포의 응집 습성을 타이트하게 조절하고 미세 조정하여 특정 산업 요구조건을 충족시킬 수 있음을 입증한다 (예를 들어, Governder et al ., Appl Environ Microbiol. 74(19):6041-52 (2008) 참조, 상기 문헌들은 본원에 그 전체로서 참조로 포함됨). 효모 세포의 응집 습성은 이에 제한되지 않으나 FLO1, FLO5, FLO8 , FLO9 , FLO10 , 및 FLO11 유전자 생성물을 포함하는 특정 응집 단백질의 기능에 의존적이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 하나 이상의 수혼화성 화합물을 생산하도록 엔지니어링된 유전자 변형된 세포는 Flo1p, Flo5p, Flo8p, Flo9p, Flo10p, 및 Flo11p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응집 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 포자형성 손상 및/또는 내생적 짝짓기 손상된다. 포자형성 및/또는 내생적 짝짓기 손상된 유전자 변형 미생물 세포는 (1) 자연 파종; 및 (2) 유전자 변형된 미생물 세포와 자연 파종 능력이 위협되지 않는 야생형 미생물 간의 유전자 물질 교환의 감소된 위험을 제기한다. 효모 내에서, 배수체 미생물 세포의 포자형성 능력, 및 반수체 미생물 세포의 짝짓기 능력은 특정 유전자 생성물의 기능에 의존한다. 이들 중, Ime1 , Ime2 , Ndt80 , Spo11 , Spo20 , Ama1 , Hop2 , 및 Spo21 유전자와 같은 포자형성 유전자 생성물 및 Ste5 , Ste4 , Ste18 , Ste12, Ste7 및 Ste11 유전자와 같은 페로몬 반응 유전자 생성물이 효모 내에 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 페로몬 반응 유전자 중 하나 이상이 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다: Ste5 , Ste4 , Ste18 , Ste12 , Ste7 , 및 Ste11. 일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 포자형성 유전자 중 하나 이상이 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다: Ime1 , Ime2 , Ndt80 , Spo11 , Spo20 , Ama1 , Hop2 , 및 Spo21 . 일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 페로몬 반응 유전자 중 하나 이상: Ste5 , Ste4 , Ste18 , Ste12, Ste7 , 및 Ste11, 및 다음 포자형성 유전자 중 하나 이상: Ime1 , Ime2 , Ndt80 , Spo11 , Spo20, Ama1 , Hop2 , 및 Spo21이 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자 및 STE5 유전자가 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자 및 STE5 유전자가 기능적으로 파괴되고, HMG-CoA을 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자 및 STE5 유전자가 기능적으로 파괴되고, 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반수체 효모 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 페로몬 반응 유전자 중 하나 이상의 두 복사본이 기능적으로 파괴된 배수체 효모 세포이다: Ste5 , Ste4 , Ste18 , Ste12 , Ste7 , 및 Ste11. 일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 포자형성 유전자 중 하나 이상의 두 복사본이 기능적으로 파괴된 배수체 효모 세포이다: Ime1 , Ime2 , Ndt80 , Spo11 , Spo20 , Ama1 , Hop2, 및 Spo21 . 일부 구현예에서, 상기 세포는 다음 페로몬 반응 유전자 중 하나 이상의 두 복사본: Ste5 , Ste4 , Ste18 , Ste12 , Ste7 , 및 Ste11, 및 다음 포자형성 유전자 중 하나 이상의 두 복사본: Ime1 , Ime2 , Ndt80 , Spo11 , Spo20 , Ama1 , Hop2 , 및 Spo21이 기능적으로 파괴된 배수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 두 복사본 및 STE5 유전자의 두 복사본이 기능적으로 파괴된 배수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 두 복사본 및 STE5 유전자의 두 복사본이 기능적으로 파괴되고, HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 배수체 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 두 복사본 및 STE5 유전자의 두 복사본이 기능적으로 파괴되고, 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 배수체 효모 세포이다.
응집 단백질을 암호화하는 이종 서열의 도입, 및 하나 이상의 포자형성 유전자 및/또는 페로몬 반응 유전자의 기능적 파괴에 유용한 방법 및 조성물이 미국 특허 출원 공보 제 2010/0304490호 및 미국 특허 출원 공보 제 2010/0311065호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 전체로서 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 생합성 유전자 내 기능적 파괴를 포함하며, 상기 세포는 상기 파괴의 결과 영양요구성이다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 항생제 화합물에 내성을 부여하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 선택 표지 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 표지는 항생제 내성 표지이다. 항생제 내성 표지의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, BLA , NAT1 , PAT , AUR1 -C, PDR4 , SMR1 , CAT, 마우스 dhfr, HPH , DSDA , KAN R , 및 SH BLE 유전자 생성물을 포함한다. E. coli 로부터 BLA 유전자는 베타-락탐 항생제 (예를 들어, 좁은-스펙트럼 세팔로스포린, 세파마이신 및 카바페넴(에르타페넴), 세파만돌, 및 세포페라존) 및 테모실린을 제외한 모든 항-그램-음성-박테리움 페니실린에 대한 내성을 부여하고; S. 누르세이( noursei)로부터 NAT1 유전자는 누르세오트리신(nourseothricin)에 대한 내성을 부여하고; S. 비리도크로모게네스 ( viridochromogenes ) Tu94 로부터의 PAT 유전자는 비알로포스(bialophos)에 대한 내성을 부여하고; 사카로마이세스 세레키시애로부터 AUR1 -C 유전자는 아우에로바시딘(Auerobasidin) A (AbA)에 대한 내성을 부여하고; PDR4 유전자 생성물은 세룰레닌(cerulenin)에 대한 내성을 부여하고; SMR1 유전자 생성물은 술포메투론 메틸에 대한 내성을 부여하고; Tn9 트랜스포손으로부터 CAT 유전자 생성물은 클로르암페니콜에 대한 내성을 부여하고; 마우스 dgfr 유전자 생성물은 메톡트렉세이트에 대한 내성을 부여하고; 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)의 HPH 유전자 생성물은 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하고; E. coli로부터 DSDA 유전자 생성물은 세포가 D-세린을 유일한 질소 공급원으로 하여 플레이트 상에 성장하는 것을 허용하고; Tn903 트랜스포손의 KAN R 유전자는 G418에 대한 내성을 부여하고; 스트렙토알로테이추스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus)로부터 SH BLE 유전자는 제오신 (블레오마이신)에 대한 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 상기 항생제 내성 표지는 세포가 증가된 수혼화성 화합물 생산을 초래하도록 유전자 변형된 후 예를 들어 숙주 세포 게놈으로부터 절제다. 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 유전자 변형된 숙주 세포 게놈으로부터 항생제 내성 표지를 암호화하는 서열의 정확한 절제에 유용한 방법 및 조성물은 2010.12.23자로 출원된 미국 특허 출원 제 12/978,061호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 전체로서 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 선택 표지는 유전자 변형된 미생물 세포 내에서 영양요구성을 구제한다. 그러한 구현예에서, 모 미생물 세포는 예를 들어, 모 미생물 세포를 하나 이상의 영양분으로 보충되지 않고 배지 내에서 성장불가능하게 하는 (영양요구성 표현형), 효모 내 HIS3 , LEU2 , LYS1 , LYS2 , MET15, TRP1 , ADE2 , 및 URA3 유전자 생성물과 같은 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로에서 작용하는 하나 이상의 유전자 생성물 내에 기능적 파괴를 포함한다. 상기 영양요구성 표현형은 모 미생물 세포를 파괴된 유전자 생성물의 기능적 복사본을 암호화하는 염색체 통합 또는 발현 벡터로 형질전환함으로써 구제될 수 있으며, 생성되는 유전자 변형된 미생물 세포는 모 미생물 세포의 영양 요구성 표현형의 손실에 근거하여 선택될 수 있다. 선택 표지로서 URA3 , TRP1, 및 LYS2 유전자의 이용은 양성 및 음성 선택 모두 가능하므로 현저한 이점을 가진다. 양성 선택은 URA3 , TRP1, 및 LYS2 돌연변이의 영양요구성 보완에 의하여 수행되는 반면, 음성 선택은 독립영양성 균주의 성장을 방지하나 URA3 , TRP1, 및 LYS2 돌연변이 각각의 성장을 허용하는 특이적 억제제, 즉, 5-플로오로-오로틱산 (FOA), 5-플루오로안트라닐산, 및 a-아미노아디프산(aAA) 각각에 근거한다.
다른 구현예에서, 상기 선택 표지는 공지의 선택 방법에 의하여 확인될 수 있는 비-치명적 결함 또는 표현형을 구제한다.
예를 들어, 숙주 세포 내 하나 이상의 수혼화성 화합물의 증가된 생산을 실행하기 위하여 또는 상기한 바와 같이 그렇나 세포에 유용한 특성을 부여하기 위하여, 발현 벡터 또는 염색체 통합 구조물을 이용하여 미생물을 유전자 변형시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sherman, F., et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1978); Guthrie, C., et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991); Sambrook et al ., 2001, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; and Ausubel et al ., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.를 참조하며, 상기 문헌들은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 예를 들어 세포 내 하나 이상의 수혼화성 화합물의 증가된 생산을 초래하는 유전자 발현 억제는 결실, 돌연변이 및/또는 유전자 재배열에 의하여 달성될 수 있다. 이는 또한 안티센스 RNA, siRNA, mRNA, 리보자임, 삼중 가닥 DNA, 및 전사 및/또는 번역 억제제를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 트랜스포손을 이용하여, 예를 들어 이를 프로모터와 코딩 영역 사이에 또는 두 개의 인접한 유전자 사이에 삽입하여 하나 또는 두 유전자 모두를 불활성화시킴으로써, 유전자 발현을 파괴할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 내 수혼화성 화합물의 증가된 생산은 특정 단백질, 예를 들어 상기한 생합성 경로에 수반되는 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터의 사용에 의하여 실행된다. 일반적으로 발현 벡터는 복제 신호 및 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 종결자를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자이다. 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 폴리펩티드 발현에 유용한 발현 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스), 플라스미드 벡터, 및 코스미드를 포함한다. 효모 세포 내 적합한 발현 벡터의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, CEN/ARS 및 2μ플라스미드를 포함한다. 효모 세포 내 사용하기에 적합한 프로모터의 예시적 예는 이에 제한되지 않으나, K. lactis의 TEF1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비시애의 PGK1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비시애의 TDH3 유전자의 프로모터, 억제성 프로모터, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애의 CTR3 유전자의 프로모터, 유도성 프로모터, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애의 갈락토오스 유도성 프로모터 (예를 들어, GAL1, GAL7 및 GAL10 유전자의 프로모터)를 포함한다.
발현 벡터 및 염색체 통합 구조물은 제한없이 당업계에 공지된 방법에 의하여 미생물 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, Hinnen et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al ., Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 (1985); U.S. Patent No. 5,272,065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY를 참조한다. 예시적 기술은 이에 제한되지 않으나, 스페로플라스팅, 전기천공법, PEG1000 중재 형질전환 및 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 중재 형질전환을 포함한다.
7. 실시예
7.1 실시예 1: 유전자 변형된 반수체 세포의 생산
이 실시예는 이소프레노이드를 생산하도록 엔지니어링되는 유전자 변형된 반수체 S. 세레비시애 세포의 생산을 기재한다.
상 I 통합 구조물은 S. 세레비시애 GAL80 위치의 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 상동 서열에 의하여 플랭킹되는, 통합 서열로서 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(하이그로마이신 B에 내성을 부여하는 hygA); 갈락토오스-유도성 프로모터 (S. 세레비시애 유전자 GAL1 및 GAL10의 프로모터)의 조절 하에 있는, S. 세레비시애 MEV 경로의 두 효소 (절단된 HMG-CoA 리덕타아제를 암호화하는 절단된 HMG1 코딩 서열, 및 HMG-CoA 신타아제를 암호화하는 ERG13 코딩 서열), 및 S.세레비시애의 다른 효소 (아세토아세틸-CoA 티올라아제를 암호화하는 ERG10 코딩 서열)를 포함한다. S.세레비시애 숙주 세포 내로 도입되면, 상 I 통합 구조물은 상동 재조합에 의하여 S. 세레비시애 숙주 세포 게놈의 GAL80 위치 내로 통합될 수 있고, GAL80 코딩 서열을 그 통합 서열로 교체함으로써 GAL80 위치를 기능적으로 파괴할 수 있다. 상 I 통합 구조물을 TOPO Zero Blung II 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-상 I 통합 구조물을 얻었다. 상기 구조물을 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에 성장한 TOP10 세포 내에서 번식시켰다.
상 II 통합 구조물은 S. 세레비시애 LEU2 위치의 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 상동 서열에 의하여 플랭킹되는, 통합 서열로서 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(누르세오트리신(nourseothricin)에 내성을 부여하는 natA), 및 갈락토오스-유도성 프로모터 (S. 세레비시애 유전자 GAL1 및 GAL10의 프로모터)의 조절 하에 있는, S. 세레비시애 MEV 경로의 몇몇 효소 (메발로네이트 키나아제를 암호화하는 ERG12 코딩 서열, 및 포스포메발로네이트 키나아제를 암호화하는 ERG8 코딩 서열); 및 GAL4oc 프로모터 (MIG 결합 부위를 제거하여 프로모터가 글루코스에 의한 억제에 덜 민감하게 하는 돌연변이를 포함하는 GAL4 프로모터)의 조절 하에 있는 S.세레비시애 GAL4 유전자의 코딩 서열을 포함한다. S.세레비시애 숙주 세포 내로 도입되면, 상 II 통합 구조물은 상동 재조합에 의하여 S.세레비시애 숙주 세포 게놈의 LEU2 위치 내로 통합될 수 있고, LEU2 코딩 서열을 그 도입 서열로 교체함으로써 LEU2 위치를 기능적으로 파괴할 수 있다. 상 II 통합 구조물을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터 내로 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-상 II 통합 구조물을 얻었다. 상기 구조물을 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에 성장한 TOP10 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에서 번식시켰다.
상 III 통합 구조물은 S.세레비시애 ERG9 위치의 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오티드 서열에 의하여 플랭킹되는, 통합 서열로서 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (G418에 내성을 부여하는 kanA); 갈락토오스-유도성 프로모터 (S.세레비시애 유전자 GAL1, GAL10 및 GAL7의 프로모터)의 조절 하에 있는, MEV 경로의 생성물 IPP를 FPP로 전환시키는데 수반되는 S.세레비시애의 두 효소 (파르네실 피로포스페이트 합성효소를 암호화하는 ERG20 코딩 서열, 및 이소펜테닐 피로포스페이트 디카르복실라아제를 암호화하는 IDI1 코딩 서열); 및 S.세레비시애 CTR3 유전자의 프로모터를 포함한다. S.세레비시애 숙조 세포 내로 도입되면, 상 III 통합 구조물은 상동 재조합에 의하여 S.세레비시애 숙주 세놈의 ERG9 위치의 업스트림으로 통합되어, ERF9 (스쿠알렌 합성효소)의 발현이 구리에 의하여 조정될 수 있는 방식으로 천연 ERG9 프로모터를 CTR3 프로모터로 교체할 수 있다. 상 III 통합 구조물을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터 내로 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-상 III 통합 구조물을 얻었다. 상기 구조물을 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에 성장한 TOP10 세포 내에서 번식시켰다.
상 I 표지 재순환 구조물은 S.세레비시애 GAL80 위치의 업스트림 뉴클레오티드 서열 및 S.세레비시애 HMG1 유전자의 코딩 서열에 의하여 플랭킹되는, 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (우라실 결여 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하는 URA3); 및 S.세레비시애 GAL7 유전자의 프로모터의 조절 하에 있는, A.아누아의 효소 (파르네센 합성효소를 암호화하는 FS 코딩 서열)를 포함한다. S.세레비시애 숙주 세포 내로 도입되면, 상 I 표지 재순환 구조물은 선택 표지 hphA가 URA3으로 대체되도록, 상동 재조합에 의하여 이미 통합된 상 I 통합 서열 내로 통합될 수 있다.
상 II 표지 재순환 구조물은 S.세레비시애 LEU2 위치의 업스트림 뉴클레오티드 서열 및 S.세레비시애 ERG12 유전자의 코딩 서열에 의하여 플랭킹되는, 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (우라실 결여 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하는 URA3); 및 S.세레비시애 GAL7 유전자의 프로모터의 조절 하에 있는, A.아누아의 효소 (파르네센 합성효소를 암호화하는 FS 코딩 서열)를 포함한다. S.세레비시애 숙주 세포 내로 도입되면, 상 II 표지 재순환 구조물은 선택 표지 natA가 URA3으로 대체되도록, 상동 재조합에 의하여 이미 통합된 상 II 통합 서열 내로 통합될 수 있다.
상 III 표지 재순환 구조물은 S.세레비시애 ERG9 위치의 업스트림 뉴클레오티드 서열 및 S.세레비시애 ERG19 유전자의 코딩 서열에 의하여 플랭킹되는, 선택 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (우라실 결여 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하는 URA3); 및 S.세레비시애 GAL7 유전자의 프로모터의 조절 하에 있는, A.아누아의 효소 (파르네센 합성효소를 암호화하는 FS 코딩 서열)를 포함한다. S.세레비시애 숙주 세포 내로 도입되면, 상 III 표지 재순환 구조물은 선택 표지 kanA가 URA3으로 대체되도록, 상동 재조합에 의하여 이미 통합된 상 II 통합 서열 내로 통합될 수 있다.
발현 벡터 pAM404는 β-파르네센 합성효소를 암호화한다. 상기 뉴클레오티드 서열 삽입물을 주형으로서 사카로마이세스 세레비시애 내 발현이 코돈-최적화된 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua) (GenBank 기탁 번호 AY835398)의 β-파르네센 합성효소 유전자의 코딩 서열을 이용하여 합성적으로 생산하였다.
활성 건조 PE-2 효모(1994 분리됨; Santelisa Vale, Sertaozinho, Brazil로부터의 선물)를 100 ug/mL 카바미실린(carbamicillin) 및 50 ug/mL 카나마이신을 함유하는 YPD 배지 5 mL 내 재현탁시킴으로써, 스타터 숙주 균주 Y1198을 생산하였다. 상기 배양액을 200 rpm에서 회전 진탕기 상에서 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, 상기 배양액 분취액 10 uL를 YPD 플레이트 상에 플레이팅하고 건조되도록 하였다. 상기 세포를 단일 콜로니에 대하여 연속적으로 스트리킹하고, 30℃에서 2 일 동안 인큐베이션하였다. 12 단일 콜로니들을 고르고, 새로운 YPD 플레이트 상에 패치 아웃하고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 콜로니들의 균주 정체를 그들의 염색체 크기를 Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad, Hercules, CA)를 제조업자 지시에 따라 이용하여 Bio-Rad CHEF DR II 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 분석함으로써 확인하였다. 하나의 콜로니를 고르고 균주 Y1198로서 저장하였다.
균주 Y1661, Y1662, Y1663, 및 Y1664를 균주 Y1198로부터 상기 균주 반수체가 유전자 엔지니어링을 허용하도록 함으로써 생산하였다. 균주 Y1198을 롤러 드럼 내에 글래스 튜브 내에서 30℃에서 YPD 배지 5 mL 내에서 밤새 성장시켰다. OD600을 측정하고, 세포를 2% 포타슘 아세테이트를 함유하는 YP 배지 5 mL 내에서 0.2의 OD600으로 희석시켰다. 배양액을 롤러 드럼 내 글래스 튜브 내에서 30℃에서 밤새 성장시켰다. OD600을 다시 측정하고, 5,000 x g에서 2 분 동안 원심분리에 의하여 4 OD600*mL의 세포를 수집하였다. 세포 펠릿을 멸균수로 1회 세척한 다음, 0.02% 라피노스를 함유하는 2% 포타슘 아세테이트 3 mL 내에 재현탁시켰다. 세포를 롤러 드럼 내 글래스 튜브 내에서 30℃에서 3 일 동안 성장시켰다. 현미경에 의하여 포자형성을 확인하였다. 배양액 33 μL 분취액을 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브로 옮기고, 14,000rpm에서 2 분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 10 mg/mgL Zymolyase 100T (MP Biomedicals, Solon, OH) 2 μL를 함유하는 멸균수 50 μL 내에 재현탁시키고, 세포를 30℃ 수욕 내에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 튜브를 얼음으로 옮기고, 150μL의 아주 차가운 물을 첨가하였다. 이러한 혼합물의 10μL 분취액을 12 mL YPD 플레이트에 첨가하고, Singer MSM 300 해부 현미경 (Singer, Somerset, UK) 상에서 사분자(tetrad)를 해부하였다. 상기 YPD 플레이트를 30℃에서 3 일 동안 인큐베이션 한 후, 포자를 새로운 YPD 플레이트 상으로 패치 아웃하고 30℃에서 밤새 성장시켰다. 8개의 4-포자 사분자들로부터의 각각의 포자의 짝짓기 유형을 콜로니 PCR에 의하여 분석하였다. 2 MAT α 및 2 MAT α 포자를 가지는 단일 4 포자 사분자를 고르고, 균주 Y1661(MATα), Y1662 (MATα), Y1663 (MATα), 및 Y1664 (MATα)로서 저장하였다.
효모 세포 형질 전환을 위하여, 25 ml의 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스 (YPD) 배지를 출발 숙주 균주의 단일 콜로니로 접종하였다. 상기 배양액을 200rpm에서 회전 진탕기 상에서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 배양액의 OD600을 측정한 다음, 상기 배양액을 이용하여 YPD 배지 50 ml를 0.15의 OD600까지 접종하였다. 새롭게 접종된 배양액을 200 rpm에서 최전 진탕기 상에서 30℃에서 0.7 내지 0.9의 OD600으로 성장시키고, 이 지점에서 세포를 DNA 1 ㎍으로 형질전환시켰다. 세포를 4 시간 동안 YPD 배지 내에서 회수되도록 한 다음, 선택제를 함유하는 아가 상에 플레이팅하여 숙주 세포 형질전환체를 확인하였다.
균주 Y1664를 PmeI 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단된 플라스미드 TOPO-상 I 통합 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 Y1515를 생산하였다. 숙주 세포 형질전환체를 300 ug/mL 하이그로마이신 B를 함유하는 YPD 배지 상에서 선택하고, GAL80 위치에 통합된 상 I 통합 서열을 포함하는 양성 형질전환체를 PCR 증폭에 의하여 확인하였다.
균주 Y1515를 PmeI 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단된 플라스미드 TOPO-상 I 통합 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 Y1762를 생산하였다. 숙주 세포 형질전환체를 100 ug/mL 누르세오트리신(nourseothricin)을 함유하는 YPD 배지 상에서 선택하고, LEU2 위치에 통합된 상 II 통합 서열을 포함하는 양성 형질전환체를 PCR 증폭에 의하여 확인하였다.
균주 Y1762를 발현 플라스미드 pAM404 및 PmeI 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단된 플라스미드 TOPO-상 III 통합 구조물을 이용하여 2-단계로 형질전환시킴으로써 숙주 균주 Y1770을 생산하였다. pAM404를 가지는 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 류신을 결여한 완전 합성 배지 (CSM) 상에서 선택하였다. pAM404 및 상 III 통합 구조물을 가지는 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 류신을 결여하고 200 ug/mL G418 (Geneticin®)을 함유하는 CSM 상에서 선택하고, ERG9 위치에 통합된 상 III 통합 서열을 포함하는 형질전환체를 PCR 증폭에 의하여 확인하였다.
균주 Y1770을 URA3 녹아웃 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 Y1793을 생산하였다. 상기 URA3 녹아웃 구조물은 URA3 위치의 업스트림 및 다운스트림 서열들을 포함한다 (사카로마이세스 세레비시애 균주 CEN.PK2 게놈 DNA로부터 생산됨). 숙주 세포 형질전환체를 5-FOA를 함유하는 YPD 배지 상에서 선택하였다.
균주 Y1793을 상 I 표지 재순환 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 YAAA를 생산하였다. 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 우라실 결여 CSM 상에서 선택하였다. 상기 세포를 200rpm에서 회전 진탕기 상에서 30℃에서 YPD 배지 내에 밤새 성장시킨 다음, 상기 세포들을 5-FOA를 함유하는 아가 상으로 플레이팅함으로써 상기 URA3 표지를 절제하였다. 표지 절제를 콜로니 PCR에 의하여 확인하였다.
균주 YAAA를 상 II 표지 재순환 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 YBBB를 생산하였다. 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 우라실 결여 CSM 상에서 선택하였다. 상기 세포를 200rpm에서 회전 진탕기 상에서 30℃에서 YPD 배지 내에 밤새 성장시킨 다음, 상기 세포들을 5-FOA를 함유하는 아가 상으로 플레이팅함으로써 상기 URA3 표지를 절제하였다. 표지 절제를 콜로니 PCR에 의하여 확인하였다.
균주 YBBB를 상 III 표지 재순환 구조물을 이용하여 형질전환시킴으로써 숙주 균주 Y1912를 생산하였다. 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 우라실 결여 CSM 상에서 선택하였다. 상기 세포를 200rpm에서 회전 진탕기 상에서 30℃에서 YPD 배지 내에 밤새 성장시킨 다음, 상기 세포들을 5-FOA를 함유하는 아가 상으로 플레이팅함으로써 상기 URA3 표지를 절제하였다. 표지 절제를 콜로니 PCR에 의하여 확인하였다.
7.2 실시예 2: 재조합적으로 생산된 수혼화성 화합물( WIC )을 특이적으로 검출하기 위한 스펙트럼 조건의 결정
이 실시예는 친지성 염료 나일레드를 이용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되는, 재조합 효모 세포 집단에 의하여 생산되는 파르네센의 특이적 검출에 유용한 스펙트럼 조건을 결정하는 예시적 방법을 제공한다. 이하 입증되는 바와 같이, 이러한 스펙트럼 조건들은 세포막-특이적 (즉, 바이오매스-특이적) 형광의 스필오버가 거의 없거나 없이, 나일 레드에 의하여 방출되는 파르네센-특이적 형광의 검출을 가능케 함으로써, 바이오매스에 의하여 영향받지 않는 파르네센 생산의 평가를 허용한다. 재조합 화합물 생산의 바이오매스-무관 평가는 세포 생존률 및 바이오매스가 재조합 생산물의 생산에 의하여 부정적으로 영향을 받을 수 있을 경우, 복수 세포 집단들을 비교할 때, 예를 들어 재조합 생산자들의 라이브러리를 스크리닝할 때 결정적이다.
나일 레드는 포유동물 세포, 박테리아, 효모 및 미세조류를 포함하는 동물 세포 및 미생물의 지질 함량을 평가하는데 종종 사용되는 지용성 형광 염료이다. 이러한 연구들은 주로 공지의 비극성 용매 또는 중성 지질의 여기 및 방출 최대값에 대체로 근거하는 스펙트럼 조건 하에 천연적으로 생산되는 세포내 지질의 검출에 집중하여 왔다. Greenspan et al . (J. Cell Biology 100:965-973 (1985))은 세포를 황-금 형광에 대하여, 즉 450-500 nm의 여기 파장 및 >528 nm의 방출 파장에 대하여 보았을 때 세포질 지질 액적에 대한 선택도가 얻어졌음을 보고하였다. 이들 스펙트럼 조건은 광학 현미경 또는 유세포 분석기에 의하여 평가되는 단일 세포 내 세포막으로부터 중성 지질 액적을 구별하기에 충분한 것으로 알려졌으나, 특히 분광분석에 의한 변화하는 광학 밀도 (ODs)의 세포 집단 내 세포막이 기여하는 황-금 형광의 양에 대한 어떠한 평가도 이루어지지 않았다. 또한, 나일 레드가 지질 또는 세포외 용액 내로 분비 또는 확산된 기타 중성 화합물을 검출할 수 있는 능력에 대한 어떠한 평가도 이루어지지 않았다.
변화하는 ODs의 세포 집단의 존재 하에 파르네센의 황-금 형광에 대한 바이오매스-특이적 기여를 결정하기 위하여, 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제조하고 나일 레드로 스테이닝하고, 황-금 스펙트럼 내 형광을 검출하였다. 도 1에 도시되는 바와 같이, OD 5, 10, 15, 20 및 25의 천연 효모 세포 집단들, 및 비-세포 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 x-축을 따라 성장 배지 내에 플레이팅하고, 증가하는 농도의 정제된 파르네센 (0,2,4,6,8 및 10 g/L)을 y-축을 따라 웰에 첨가하였다. DMSO 내 나일 레드 100 ㎍/ml 용액 2 ㎕를 세포 및/또는 파르네센을 포함하는 용액 98㎕에 첨가하였다. 상기 매트릭스를 황-금 스펙트럼 내 두 개의 다른 스펙트럼 조건 하에 보았다: (1) 488 nm의 여기 파장 및 515 nm의 방출 파장 (도 1); 및 (2) 500 nm의 여기 파장 및 550 nm의 방출 파장 (도 2).
도 1에 도시되는 바와 같이, 488ex/515em에서 볼 때, 형광은 증가하는 세포 밀도 및 증가하는 파르네센 모두에 의하여 매우 영향을 받는다. 형광이 y-축을 따라 증가하는 파르네센 농도와 함께 증가하는 반면, 형광은 또한 증가하는 세포 밀도와 함께 x-축을 따라 증가한다. 특히, 파르네센 부재시 OD5 내지 OD25 사이의 형광 차이는 3배 더 컸다. 유사한 결과가 500ex/550em에서 관찰되었으며 (도 2a), 여기서 파르네센 부재시 OD5 내지 OD25 사이의 형광 차이는 5배에 가까웠다. 증가하는 세포 밀도를 통한 파르네센 농도 대 형광 단위의 곡선은 R2=0.650 (500ex/550em; 도 2b)의 비교적 저조한 상관관계 계수를 보인다. 따라서, 황-금 스펙트럼 내 스펙트럼 조건 하에, 형광은 파르네센 및 바이오매스 모두에 기인할 수 있다. 이러한 데이터는 황-금 스펙트럼 (450-500 nm의 여기 파장 및 518-550 nm의 방출 파장) 내에서 작동하는 나일 레드 검출 계획이 변화하는 세포 수를 가지는 세포 집단의 조사를 요하는 적용, 예를 들어, WIC-생산 세포의 라이브러리의 고-처리률 스크리닝과 상용가능하지 않을 것임을 나타낸다. 이러한 세팅에서, 높은 바이오매스를 가지나 낮은 WIC 생산을 가지는 표본은 낮은 바이오매스를 가지나 높은 WIC 생산을 가지는 표본과 쉽게 구별되지 않을 것이다.
다음, 형광이 세포에 의한 기여가 거의 없이 또는 없이 대체로 또는 유일하게 파르네센에 기인하는 경우, 여기/방출 파장 쌍이 확인될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 하나의 세팅에서, 방출 파장은 550 nm로 일정하게 고정하고, 여기 스펙트럼을 250 내지 520 nm로 생성하였다 (도 3a). 두번째 세팅에서, 여기 파장을 290 nm로 일정하게 고정하고, 방출 스펙트럼을 330 내지 710 nm로 생성하였다 (도 3b). 세 개의 표본들을 이들 스펙트럼 조건 하에 시험하였다: (1) 세포 없이, 10 g/L 파르네센; (2) 파르네센 없이, OD25의 천연 효모 세포; 및 (3) 10 g/L 파르네센 플러스 OD25의 천연 효모 세포.
도 3a는 550 nm의 방출 파장에서 여기 스펙트럼을 도시한다. 이전의 결과와 일관되게, 500ex/550em에서의 검출은 세포 단독에 대하여 ~2000 상대 형광 단위 (RFU), 파르네센 단독에 대하여 ~5000 RFU, 및 세포 플러스 파르네센에 대하여 ~14000 RFU를 초래한다. 따라서, 세포가 파르네센과 조합될 때 500ex/550em에서 아티팩트가 상승하는 것으로 보이며, 여기서 상기 조합으로부터의 형광은 세포 및 파르네센 각각으로부터의 형광 합을 훨씬 초과한다. 이와 대조적으로, 260 내지 290 nm의 여기 범위 및 550 nm에서 방출에서, 파르네센 단독으로부터의 형광은 파르네센 플러스 세포보다 크지 않으며, 세포 단독으로부터의 형광은 거의 백그라운드 수준이다. 290/550의 여기/방출 파장 쌍 또한 도 3b에 도시되는 바와 같이 290 nm의 여기 파장에서 방출 스펙트럼의 측면에서 유리한 것으로 관찰되었다. 530 내지 570 nm의 방출 파장 범위에서, 세포 단독으로부터의 형광 기여는 거의 백그라운드 수준이며 파르네센 단독 신호는 거의 그의 방출 피크이다.
290ex/550em에서 파르네센에 결합되는 나일 레드의 검출이 증가하는 세포 밀도에 의하여 영향을 받지 않음을 확인하기 위하여, 상기한 바와 같이 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제조하고 나일 레드로 스테이닝하였다. 도 4a에 도시되는 바와 같이, 형광은 y-축을 따라 증가하는 파르네센 농도와 함께 증가하나, 형광은 x-축을 따라 증가하는 세포 밀도와 함께 거의 변화하지 않는다. 나아가, 증가하는 세포 밀도를 통한 파르네센 농도 대 형광 단위의 곡선은 R2=0.918의 매우 향상된 상관 계수를 보인다 (도 4b).
이러한 결과는 선택된 스펙트럼 조건, 예를 들어 260 내지 290 nm의 여기 파장 및 530 내지 570 nm의 방출 파장 하에, 나일 레드가 파르네센, 예를 들어 효모 세포 집단에 의하여 재조합적으로 생산되고 분비되는 파르네센의 선택적 검출에 이용될 수 있으며, 여기서 바이오매스로부터의 형광은 대체로 제거됨을 입증한다. 나아가, 이러한 결과는 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물에 결합되는 염료를 검출하는데 선택적인 형광 염료에 대한 스펙트럼 조건을 결정하기 위하여 본원에 제공되는 일반적 방법의 검증을 제공한다.
7.3 실시예 3: 바이오매스를 특이적으로 검출하기 위한 스펙트럼 조건의 결정
실시예 2의 연구는 파르네센에 결합되는 나일 레드로부터의 형광 검출이 바이오매스로부터의 형광에 의하여 영향을 받지 않는 스펙트럼 조건을 확인하고자 하였다. 자가형광을 통한 바이오매스의 검출이 파르네센에 결합되는 나일 레드로부터의 형광에 의하여 영향을 받지 않는 스펙트럼 조건을 확인하기 위하여 부가적인 연구를 수행하였다. 파르네센 및 바이오매스의 별도의 그러나 특이적 측정으로, 파르네센:바이오매스의 정확한 비를 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 예를 들어 고-처리량 나일 레드 스크리닝 동안 세포 집단을 계층화하고 등급을 매길 수 있다.
형광이 파르네센에 결합된 나일 레드에 의한 기여가 거의 없거나 없이 세포 자가 형광에 거의 또는 유일하게 기인하는 여기/방출 파장 쌍을 확인할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 여기 파장을 350 nm로 일정하게 고정하고, 430 내지 750 nm에서 방출 스펙트럼을 생성하였다. 세 가지 표본을 이들 스펙트럼 조건 하에 시험하였다: (1) 세포 없이, 10 g/L 파르네센; (2) 파르네센 없이, OD25의 천연 효모 세포; 및 (3) 10 g/L 파르네센 플러스 OD25의 천연 효모 세포.
도 5는 350 nm의 여기 파장에서 방출 스펙트럼을 도시한다. 350ex/430em는 세포 단독에 대하여 ~1000 RFU의 신호, 및 파르네센 단독에 대하여 0 RFU에 가까운 신호를 초래한다. 그러나, 세포 플러스 파르네센의 조합은 세포 단독에 대하여 상당한 형광 증가를 가져왔다 (~1450 RFU). 이와 대조적으로, 350 nm에서 여기 및 470 내지 510 nm의 방출 범위에서, 세포 플러스 파르네센으로부터의 형광은 세포 단독보다 단지 약간 클 뿐이며, 파르네센 단독으로부터의 형광은 거의 백그라운드 수준이다.
350ex/490em에서 세포의 자가형광이 증가하는 파르네센에 의하여 영향받지 않음을 확인하기 위하여, 상기한 바와 같이 세포/파르네센 적정 매트릭스를 제조하고 나일 레드로 스테이닝하였다. 도 6에 도시되는 바와 같이, 형광은 x-축을 따라 증가하는 세포 밀도와 함께 증가하나, 형광은 y-축을 따라 증가하는 파르네센 농도와 함께 거의 불변이다. 더욱이, 증가하는 파르네센 농도를 통한 세포 밀도 대 형광 단위의 곡선은 R2=0.955의 상관 계수를 보인다 (도 6b). 이러한 결과는 선택된 스페트럼 조건, 예를 들어 약 350의 여기 파장 및 470 내지 510 nm의 방출 파장 하에, 나일 레드를 효모 세포 바이오매스의 선택적 검출에 이용할 수 있으며, 여기서 파르네센에 결합된 나일 레드로부터의 형광은 거의 제거됨을 입증한다. 이러한 불편(unbiased) 바이오매스 판독을 결정하는 방법은 WIC의 재조합 생산에 이용될 수 있는 임의의 세포 유형에 추론될 수 있다.
7.4 실시예 4: 고-처리량 스크리닝
이 실시예는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되는, 재조합 효모 세포 내 파르네센 생산에 대한 고-처리량 나일 레드 스크리닝의 예시적 방법을 제공한다.
재료:
Beckman Coulter NX
스태커 부착된 M5 분광광도계
블랙 폴리스티렌 편평 바닥 96-웰 분석 플레이트 (Costar 3916)
INFORS Multitron II 습윤 진탕기/인큐베이터
(33.5℃, 80% 습도, 1000RPM으로 셋팅됨)
Axygen 1.1ml 96 웰 배양판
Aeromark 통기성막
나일 레드 용액 (DMSO 내 100 mg/ml)
BSM 2% 수크로오스 0.25N+crb (카르베니실린)
BSM 4% 수크로오스
전- 배양판 제조
아가 플레이트로부터 360 ㎕의 BSM% 수크로오스 0.25N+ crb를 함유하는 1.1 ml 96 웰 플레이트 내로 단일 콜로니를 선택하였다 (전-배양 배지). 카르베니실린의 상기 배지에 첨가가 분석 성능에 영향을 미치지 않으면서 박테리아 오염을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 낮은 변동계수 (CVs)를 유지하기 위하여, 모든 콜로니들을 바람직하게 신선한 아가 플레이트로부터 선택하고, 모두 동일하게 처리하였다. 하나가 4℃에서 며칠 저장된 두 세트의 플레이트로부터의 콜로니의 이용은, 예상하는 것과 같이 성장하고 성능하지 못하는 웰의 수에 의하여 정량되는 바와 같이, 높은 CVs 및 불균일한 라이브러리 성능을 초래할 수 있다. 일단 신선한 콜로니로 접종되면, 전-배양판을 라이브러리 성능의 단지 약간의 감소로 2일까지 4℃에서 저장할 수 있다.
상기 전-배양판을 통기성 막으로 밀봉하고, 배양액을 1000 rpm에서 진탕하면서 33.5℃, 80% 습도에서 96 시간 동안 인큐베이션한다. 통기성 레이온 플레이트 밀봉은 증발로 인한 용적 손실을 최소화하고, 적절한 산소 전달을 허용하여 호기 배양을 유지한다. 복수 플레이트를 인큐베이션할 때, 스태킹된 플레이트를 분리하기 위한 1 cm 고무 가스켓을 사용함으로써 플레이트 위치 바이어스를 제거할 수 있다. 상부 플레이트를 사용하여 표본 플레이트의 상부를 덮는다.
전- 배양판의 생산 배지 내로의 희석
14.4㎕의 전-배양 배지를 1.1 ml 96 웰 생산 플레이트 내 함유되는 BSM 4% 수크로오스 (생산 배지) 360㎕ (1:25 희석) 내로 옮긴다. 전-배양 배지의 1:25의 생산 플레이트 내로의 희석이 분석 성능에 최적인 것으로 밝혀졌다. 더 낮거나 높은 희석은 분석 CVs를 증가시키거나 분석 시간을 48 내지 72 시간 또는 그 이상 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 1:25 희석에서, 웰의 대다수는 48 시간 후 탄소 고갈되고 CVs가 정상 수준으로 유지된다.
상기 생산 플레이트를 통기성 막으로 밀봉하고, 배양액을 1000 rpm에서 진탕하면서 33.5℃, 80% 습도에서 48 시간 동안 인큐베이션한다.
분석
인큐베이션 후, 98㎕의 생산 배양액을 96-웰 블랙 폴리스티렌 편평 바닥 분석 플레이트 내에서 2μL의 나일 레드 용액과 혼합한다 (최종 나일 레드 농도 2 ㎍/ml). 상기 플레이트를 분광광도계 상에 로딩하기 전에 30 초 동안 혼합한다. 파르네센 특이적 판독을 290 nm에서 여기 및 550 nm에서 방출로 얻은 후, 바이오매스 특이적 판독이 350 nm에서 여기 및 490nm에서 방출로 얻어지며, 파르네센 대 바이오매스 비를 얻는다.
본원 명세서에 인용되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원들은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 특별히 개별적으로 기재된 것과 같이 본원에 참조로 포함된다. 전술한 본 발명은 이해의 명확성의 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 상세히 기재되었으나, 본 발명의 교시의 견지에서 첨부되는 청구범위의 사상 또는 범위로부터 이탈됨이 없이 이에 대한 몇몇 변화 및 변경이 행하여질 수 있음이 당업자에게 분명할 것이다.

Claims (60)

  1. 용액 내에서, 복수의 세포로부터 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물 (WIC)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 WIC에 직접 결합하는 형광 염료를 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 복수의 세포를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 재조합적으로 생산되는 WIC에 결합되는 형광 염료의 선택적 검출에 적합한 스펙트럼 조건 하에 상기 형광 염료를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 WIC는 상기 WIC를 재조합적으로 생산하는 세포로부터 분비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 형광 염료는 나일 레드(Nile Red)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 형광 염료는 BODIPY 493/503 또는 BODIPY 505/515인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 세포를 포함하는 용액은 복수-웰 세포 배양판의 웰 내에 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 검출 전 적어도 12 시간의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    WIC:세포 바이오매스 비를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포 바이오매스는 상기 복수의 세포의 자가형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 복수의 세포의 자가형광을 검출하는 단계는 상기 WIC에 결합되는 형광 염료로부터 형광을 검출하지 않는 스펙트럼 조건 하에 자가 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 자가형광은 330 내지 350 nm의 여기 파장, 및 470 내지 510 nm의 방출 파장에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 형광 염료는 나일 레드이고, WIC:세포 바이오매스 비를 결정하는 단계는 녹색 대 적색 형광의 비를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스펙트럼 조건은
    (a) 상기 형광 염료를 제1 복수의 세포 집단 및 제2 복수의 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수의 세포들은 제1항의 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
    (b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 여기 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
    (c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
    (ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
    여기 파장을 선택하는 단계
    에 의하여 선택되는 여기 파장에서 상기 형광 염료를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 여기 스펙트럼에 대한 방출 파장은 550 nm로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스펙트럼 조건은
    (a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 제1항의 세포와 동일한 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
    (b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 방출 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
    (c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
    (ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
    방출 파장을 선택하는 단계
    에 의하여 선택되는 방출 파장에서 상기 형광 염료를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 방출 스펙트럼에 대한 여기 파장은 290 nm로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 복수 세포 집단은 적어도 2 g/L WIC를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 파르네센인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 하나 이상의 메발로네이트 (MEV) 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 파르네센 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 상기 메발로네이트 경로의 2 이상의 효소를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 세포는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 세포는 IPP 또는 폴리프레닐을 개질시켜 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 효소는 카렌 합성효소, 게라니올 합성효소, 리날룰 합성효소, 리모넨 합성효소, 미르센 합성효소, 오시멘 합성효소, α-피넨 합성효소, β-피넨 합성효소, γ-테르피넨 합성효소, 테르피놀렌 합성효소, 아모르파디엔 합성효소, α-파르네센 합성효소, β-파르네센 합성효소, 파르네솔 합성효소, 네롤리돌 합성효소, 패출리올 합성효소, 누트카톤 합성효소, 및 아비에타디엔 합성효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 이소프레노이드는 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 이소프레노이드는 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날룰, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌, 및 발렌센으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 용액 내에서, 세포로부터 생산 및 분비되는 파르네센을 검출하는 방법으로서,
    (a) 파르네센을 재조합적으로 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 용액을 나일 레드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 약 260 내지 290 nm의 여기 파장 및 약 530 내지 570 nm의 방출 파장에서 나일 레드를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 복수의 세포를 포함하는 용액이 복수-웰 세포 배양판의 웰 내에 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 복수-웰 세포 배양판은 테플론으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 검출 전에 적어도 12 시간의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 전에 상기 복수-웰 세포 배양판을 진탕시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비시애인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. (a) 수혼화성 화합물을 재조합적으로 생산 및 분비하는 세포;
    (b) 상기 세포로부터 분비되는 수혼화성 화합물;
    (c) 상기 분비되는 수혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료; 및
    (d) 세포 배양 배지
    를 포함하는 액체 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제39항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비시애인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광 염료는 나일 레드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광 염료는 BODIPY 493/503 또는 BODIPY 505/515인 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물은 파르네센인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 하나 이상의 메발로네이트 (MEV) 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 파르네센 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제47항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제47항에 있어서,
    상기 재조합 효모 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제47항에 있어서,
    상기 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 2 이상의 상기 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제47항에 있어서,
    상기 세포는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 세포는 IPP 또는 폴리프레닐을 개질시켜 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 효소는 카렌 합성효소, 게라니올 합성효소, 리날룰 합성효소, 리모넨 합성효소, 미르센 합성효소, 오시멘 합성효소, α-피넨 합성효소, β-피넨 합성효소, γ-테르피넨 합성효소, 테르피놀렌 합성효소, 아모르파디엔 합성효소, α-파르네센 합성효소, β-파르네센 합성효소, 파르네솔 합성효소, 네롤리돌 합성효소, 패출리올 합성효소, 누트카톤 합성효소, 및 아비에타디엔 합성효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제53항에 있어서,
    상기 이소프레노이드는 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 이소프레노이드는 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날룰, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌, 및 발렌센으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 세포로부터 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물 (WIC)에 직접 결합되는 형광 염료의 선택적 검출을 위한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 동일 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
    (b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 여기 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
    (c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
    (ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
    여기 파장을 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  58. 제56항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 여기 스펙트럼에 대한 방출 파장이 550 nm으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 세포로부터 재조합적으로 생산되는 수혼화성 화합물 (WIC)에 직접 결합되는 형광 염료의 선택적 검출을 위한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 형광 염료를 제1 복수 세포 집단 및 제2 복수 세포 집단과 접촉시키는 단계 - 상기 제1 및 제2 복수 세포들은 동일 세포 유형이고, 각각의 복수 세포 집단은 x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단 및 5x의 세포 밀도를 가지는 세포 집단을 포함하고, 상기 제1 복수 세포 집단은 WIC를 포함하고, 상기 제2 복수 세포 집단은 WIC를 포함하지 않음;
    (b) 상기 제1 복수 및 제2 복수 세포 집단에 대한 방출 스펙트럼을 각각 결정하는 단계; 및
    (c) (i) 상기 제1 복수 세포 집단 및 동일한 세포 밀도를 가지는 상기 제2 복수 세포 집단 간의 형광 차이가 적어도 80%이고;
    (ii) 상기 제2 복수 세포 집단으로부터 세포 밀도 x 및 세포 밀도 5x의 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인
    방출 파장을 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 방출 스펙트럼에 대한 여기 파장이 290 nm으로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
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