PT98273A - Processo para a preparacao de mutantes resistentes a elfamicina - Google Patents

Description

vengZo de GISÍ-BROOAPBS N.V., holandesa» industrial e comercial, com sede em tfatering-seweg 1, P.O» 3ox 1» 2600 MA Belft, Países Baixos, (inventores! Rudolf Gijsbertus Hárie Luiten, Biohard KerKman, Leendert Bosch, EriK Vijgen-boom e Pieter Vilhelmus Henri-Kus Heinstra, residentes nos Países Baixos), para; uPE0j .SSO ΡΑ:ιΑ A PREPAHA^AO DE imkxm R';sis!n>.ms λ blpa- ΙΙΙΟΪγΙΑ”

DesorioSo A presente invenção refere-se a acti-nomieetaa que produzem elfamicina. a uma proteína i»P-Pu (Pastor de Alongamento Pa) de um actinomiceta produtor de el·* famicina, à sequência de AM tuf que codifica esta proteína, a vectores replicáveis contendo esta sequência de AM e a actinomicetas transformados com estes vectores.

As eifamicin~*s são um grupo de antibióticos, a que pertencem a Hocimicina (sambéa conhecida como ^uirromicina), Dihidromociciicina» J-i-ietilmociaicina (também conhecida como Aurodoxi), ^uirrotricina, Azditaicina, - 1 -

Bfrotomicina, e Fulvomicina. Eles são produzidos por bactérias que pertencem à ordem dos Actinomicetales. Sm particular, o antibiótico de tipo elfamicina mocimicina, que constitui o assunto de Patente ^ritônica 1325200, é produzido por bactérias que pertencem ao género dos Estroptomices, tais como Streptoavoes coiiinus. Streptomyoeg diaetatocb.ro-mogenes. Streptogivces fradiae e especialmente Streptomyces ramoclssimas,

Ma pr-ítiea, o nível da produção de elfamioinaa, em particular da mocimicina, pelas bactérias acima referidas ê demusiadamente baixo, tornando-se a sua exploração comercial não atraotiva. Λ aoção antibiótica das elfamicinas, incluindo a mocimicina, ê d-vido à sua inibição de if-lu (F. dolf et ool., Proc. ííatl. Acad. Sei. USA. 25. (1973) 53?4-5326).

Os Faetoree de Alongamento de Cadeia ce Polipéptido (FF) são essenciais para a sintese das proteí nas celulares. 0 tipo designado por K5-„u ocorre em todas as células procarióticas, incluindo bactérias gram-negati-vas tais como Lscheriehia coli e bactérias gram-positivas cotno as que pertencem à ordem dus Actinomicetales. Organismos diferentes tem df-.,.u semelhantes mas não idênticos. .a cequVcia de ΛΓ1Τ que codifica a .:F-2u foi designada como gene· tuf.

Foi ainda verificado por C. Glockner ô lí. Wolf (FSdIS Microbiology letters 2£ (1984( 121-1H), que o FF-Tu isolado de todas as estirpes que produzem mo-cimloina do género Zstreptomices ora sensível a concentra-ç8es relativamente pequenas de elfamicina num sistema de síntese de proteínas isentas de células, ior outro lado, entes autores verificaram que o IF-du isolado de Strepto tnvees oinnamomeue produtoras de quirrotrieina e de Strep- - 2 -

tomyces laotomdurana Íreeeatemente designados por Nocardia lactaciduras) , produtoras de efrotomicina eram relativa mente resistentes não apenas ao antibiótico endógeno mas também à mocimiciaa, Bates autores sugeriram que a sensibilidade do EF-Eu das estirpes produtoras de elfamicina à sua própris elfamicina é o factor que limita a sua' capacidade de produção. Eles pensaram que as estirpes tais como Streptomvces cinnamomeus e Streptomvces laotamdurans podem ser fontes adequadas de .autantes com maior produtividade dado que eles toleram altos niveis de antibióticos nas células. loi descrita a mutagénese, por compostos químicos mutagenicos, de EP-Eu originalmentè sensível à elfamicina em EF-2u que apresenta, uma maior resistência à elfamicina, por B. Fischer e col. (Proo. lati. Ácade.

Sei. USA, 74 (1977) 4341-4345) numa estirpe de laboratório de B. coli possuindo permeabilidade de membrana alterada, e também por J.A.M* vau de IClundert e col. (PEBS Betters 81 (1977) 303-307)· Os autores mencionados em primeiro lugar referem que a mutante E. coli era deficiente na capacidade de crescimento (na ausência de elfamicina), quando comparada com a Ξ, coli mãe. A mutação que conduz a uma resistência aumentada h elfamicina de B. coli SF--íDu verificou-se ser uma alteração de um resíduo de alanina na posição 375 de valina ou treonina (F. J* Buisterwinkel e col, BMBO J, 3, (1984) 113—120), 13o foram referidas outras proteínas EP-2u resistentes a elfamicina a partir de outras bactérias gram-negativasj foi identificada um BF-Eu resistente a elfamicina da bactéria gram-positiva Baoillus subtllis. mas não foi caraeterizado ao nível molecular (Σ, Smith e P. Paress, J. Bacteriol, 135 (1978) 1107-1117). Ião foram descritas essas mutaçSes em nenhum aetinomieeta, especialmente em estraptomicetas, em particular estrepto-micetas produtoras de moeiaieina, mais em particular em Streotomyces ramocissímus. - 3 -

Hás duas publicaçdes acima mencionadas àcerca da mutagénese química de estirpes de E, coli que conduzem a uma maior resistência à elfamicina, ê referido que a E, coli tem duas proteínas muito parecidas mas diferentes de EF-Eu, originárias de dois genes de tuf diferentes, Dado que a elfamicina inibe a actividade de !F-Eu sensível por ligação sua irrversivelmente dos ribossomas» a teoria sugere que uma mutante resistente à elfamicina de E» coli tem que ter ou as duas proteínas EP-Eu ambas com mutação e activas, ou apenas uma delas com mutação e aetiva, não sendo a outra aetiva, Isto foi confirmado por experiência in vitro.

Uoe estreptomieetas, em particular em Streetomyees ramocissimus os presentes inventores identificaram três genes de tuf muito parecidos» Houtra investigação foi descoberto que um deles era principalmente expresso no aicélio vegetativo exireptomiceta. Os produtos de proteína de ambos os outros genes constituem aproximadaaente 5 por cento da quantidade de espécies principais de EF-Eu» Isto foi especifiearaenie observado em Streptomyces ramoeiasimus»

Foi verificado um padrão semelhante em StreptomyQes oolllnus e Streptomycee goldiniensis.

Ao contrário da Escherichia coli, os estreptomieetas tem a capacidade de sofrer uma diferença morfológica e bioquímica complexa para a formação de esporos, Pode-se assim pensar que durante a esporulação e processo de germinação posterior (um deles) as espécies de EF-Eu vegetativas menores se tornam o principal EF-Eu activo, Esta expressão diferencial deve ser então análoga à, por exemplo, expressão de fsetores de sigma diferentes, observados em B, subtilis (E» Losick e ool», Ann» Hev, Oénetics 20 (1966) 625-669 e 6» ooelloolor A3 (2) (iu. Buttner, Molecular Microbiol, £ (1989) 1653-1659) dirigido a transcrição de conjuntos regulados em desenvolvimento de genes, A expressão diferencial de genes que codificam o EP-Eu i:ode - 4 - ίτ

ser necessária para adaptar um mecanismo de translacçSo, às necessidades específicas da fase de desenvolvimento.

Mesmo se © nível de expressão das duas espécies menores de EJMJu no mieélio vegetativo for baixo, é ainda possível que., em analogia com situação que se passa em Escherichia eoli» eles conduzam a dominância da sensibilidade à elfamieina mesmo se a proteína mais importante de Ef-fu for tornada resistente à elfamieina; o teor relativo de EP-íEu sensível à elfamieina em relação à EF-ftt resistente à elfamieina para a qual se torna aparente o fenotipo resistente à elfamieina, é desconhecido. Para os objeetivos da presente invenção contudo, os es-treptomieetas. em particular Streptomyçes ramoeissimus são considerados como tendo um Ef-lu importante.

Poi agora verificado ser possível modificar a proteína de E3f-2u sensível à elfamieina de um actinomiceta produtor de elfamieina, em particular um estreptomiceta produtor áe mocimioina, mais em particular um que pertence à espécie Strentomvees ramoeissimus. conferindo assim a esta proteína uma maior resistência h elfamieina produzida por esta bactéria* Verificou-se ser possível conseguir isto por mutagênese* Em particular os presentes inventores conseguiram a mutagênese utilizando técnicas de mutagênese dirigida a locais para modificar o gene tuf original, codificando o Sf-iu original para um gene tufR novo, codificado uma nova proteína EF-fuli possuindo uma maior resistinoia à elfamieina. A presente invenção proporciona assim proteínas EF-$uR, caracterizadas por serem derivadas de um actinomiceta produtor de elfamieina e tornadas resistentes à elfamieina por mutagênese, em particular uma mutagênese dirigida a pontos*

•mm JjjJ

 Invenção proporciona ainda várias sequências de AM tufR, que Codificam as referidas protei-nas E3M)uR. A invenção proporciona ainda vectores, contendo as referidas sequências de ABH. Esses vectores são replicáveis e/ou susceptíveis de se integrar na sequência de ADN cromossdmica de um actinomiceta produtor de elfamicina. A invenção proporciona ainda um actinomiceta produtor de elfamicina, compreendendo uma sequência de ADN tufR em vez da sequência de ABI tuf* Verificou--se que esses aetinomicetas possuiam uma resistência bastante aumentada à elfamicina, A maior resistência da proteína EB-$u á elfamicina elimina um factor limitativo na produção da elfamicina. Á expressão dos genes tuf resistentes à elfamicina revelou ter influencia no crescimento das estirpes transformadas. A invenção proporciona ainda processos para a preparação das referidas sequências de ADR, vectores e aetinomicetas.

Descrição dos desenhos

Nos desenhos são utilizadas as seguintes abreviaturas e símbolos; bla bla* cat >« tsr : gene resistente à ampioilina (bla~se inaetivo)* í posição do códão de paragem de translacção em bla»; : gene de resistência ao cloranfenieol (cat-vse inaetivo) | í posição do cáâão de paragem de translacção em cat» $ : gene de resistência à tiostreptonaj — 6 — £ ori322 orifl rep660

Srtuf

Plac

íorigem de replicação derivada do plasmidio pBB322j í origem de replicação derivada io fago fl? í região de origem de replicação derivada do plasmidio ρΜϊ660; i gene S.ramooieaimus tuf1 Srtuf 3' se apenas a região de codificação 3' do gene está presente? t promotor do operão E. ooli lac A sequência de ABI do gene S. ramocissi-mus tuf 1 e a sé quê nc ia, de aminõáeidos da proteína S. ramo-cissimus EF~2ul derivado dele (também representado oomo SEG. IB. 12 sl). A EF~2uR ê caraeterizada aqui pela substituição do aminoácido alanina na posição 3 78 por vali1 na ou treonina respectivamente1 0 gene tufE é aaracterizado aqui por o cédão que codifica a alanina na posição 378 (800) ser alterado para eédSes que codificam a valina, treonina1 prolina, ou fenilalanina.

Figura 2 a. Mapa do plasmidio pTJSrTl. b· Mapa do plasmídeo de expressão pUSrfl.. los xfLasmí- dios pUSr$iv-l, pUSrflí-l, pUSr$lp1l, e pUSrSIF-l, Ala378 é substituído por valina1 treonina, prolina, ou fenilalanina, respetivamente. 1 tm ..|Τ11ΜΠΙ

Haura 5 a. Mapa do plasmídeo plaSrll* Mos plasmídeos PMaSrliY, pMaSrElT, pMaSrTlp, e ptlaSrSlF, Ala378 ê substituído por valina* treonina, proiina, ou fenilalanina, respectivamente. b, Mapa do plasmídeo pMeSrSl.

Haura 4 a*

EepreseataçSo gráfica das aetividaèes residuais de SrEf-$u e SrEF-íu mutantes A378V e Á3781 num sistema de sintese in vitro da polifenilalanina, na presença de diferentes concentrações de mocimicá] na. b*· Eepresentação gráfica do tempo de curso da m- eorporaçio de ^H-fenilalanina num sistema de sintese in vltro da polifenilalanina por Sr333M?a e SrSF-Su mutantes Á378Y e A3782? na presença de 16 mg/i de mociaicina.

Hgura 5

a* Analise das proteínas mutantes SrEF-Sul A378T e Α378Ϊ1 no ensaio de ligação da elfamicina, linhas 1 e 2í SrEf-Su de ocorrência natural, linhas 3 e 4* SrEF-fu A378E, linhas 5 e 6i SrUF-lu A378Y.

Has linhas 2, 4 e 6 a proteína SrBl?-$u foi pré--incubada com aurodox a 25 jM~ b. Análise da mutante SrlF—Sul proteínas A37SP e A378F no ensaio de ligaçSo à elfamicina. Linhas U3t

wUd-type SrSF-Su, linhas 5 e 4í BrBF-fu A378F, linhas 5 e 6j SrEF~2u Á378P. lias linhas 2, 4 e 6 a proteína SrEF-Tu indicada foi préincubada com aurodox a 25 /iM.

Figura 6 a· Mapa do plasmídio pUtl8* h. Mapa do plasmídeo pStil-1. Hos plasmídeos pSt^lY-l, e ptStS12-l* Ala578 é substituído por valina e treonina, respectivamente·

Figura 7 a. Mapa do plasmídio pStSllS» Eos plasmídeoa pSt£IV&S, e ptStSriv/p, Ala378 é substituído por valina e treonina» respectivamente. o b. Mapa do plasmídio pMSíSEl^ S* Hos plasaídios pHSSSiy^S, e pMSSiíl^ S, Âla378 é substituído por valina e treonina, respectivamente.

Figura 8 a. Mapa do loeal tuf cromossáaido GBS 190.69 de S. ratnocisslmus. b. Mapa do local tuf de S. ramoelssimus em que o pias·» raídio pMSSTl?^ 3 é integrado via recotnbinação homo-lágaa* 0. Hapa do local tufH cromossámico El¥ de S.rataoois-simus. 9 -

Análise de SrIF-fu de S« ramooiasumus estirpe EXT em relação à ligação de elfamicina. Aa amostras foram carregadas ao gel nativo da forma seguinte? linhas 1 e 2? SrEF-Tu de ocorrência natural isolado de E, ooli JM101 £pXJSrfl-l^/, linhas J e 4» SrSF-2u isolado de S. ramocisaimus GBS 190.69· linhas 5 e 6: SrEP-fu isolado de S»·" ramocissimus estirpe Ε11Γ. Nas'linhas 1, 4 e 6, as proteínas SrEF-Tu indicadas foram pré-incuhadas com Aurodox A espécies produtorasde elfaoinina podem ser encontradas entre os Actinomicetaa, Utilizam--se de preferência os Estreptomic etas. Exemplos' deles são os estreptomicetas produtores de mocisicina Sreotomyess collinus. Streotosavoes, diastatocirgomogenes. Streptomvoes fradlae. e Strentoavoag ramocissimus. Utiliza-se mais de preferência o 8. rainocissimus. O factor de alongamento 'fu (IF-fu) pode ser isolado de várias formas. Por exemplo podem ser utilizados coeMnaçães diferentes de técnicas gerais de purificação de proteínas conhecidas* como por exemplo a precipitação gradual com sulfato de amásio»filtração era gel* e cromatografia de permuta idnica. A aplicação desta téenica para a purificação da proteína BF-fu foi descrita por D. liller e H. Vfe&sabaeh (Aroh. Biochem. Biophys. 141 (1970) 26-37), 3C.-I, Arai e col. (J. Biol. Ohera. 247 (1972) 7029-7037)» e E. Beherman e col. (Anal, Biochem. 104 (1980) 29-36). Um procedimento de isolamento preferido para 1F-Iu é o seguinte* Apás se efectuar a cultura de B. ramocissifflus o mieélio 4 reco3.Mdo por centrifugação, o micélio é ressuspenso e tratado oom saponifioação. Agás centrifugação diferencial para remover os rihossoaas. a proteína é ainda purificada por cromatografia de afinidade (€r* Jacohson e J. Eosenbusoh, FBBS lett* 7^ (1977) 8-10); 10 —

para este fita ê especialmente átil o GBP-AH-Sephrose.

Apés purificação a proteína ê ainda caracterizada pela análise de permuta GBP (E. Weissbach e col. Arch* Biochem. Biophya. 157 (1970) 262-269) e para determinar a sua ca* pacidade para promover a einteee de lE-2u dependente de péptidos num extracto isento de células» por exemplo» como descrito por 0* Slokner e H, Wolf (acima citados). A caracterização adicional pode ser efectuada por determinação da composição em aminoácidos e a sequência (parcial) de ami-noáeidos da proteína* A ausceptibilidade do EB-Iu isolado à elfamicina ê ensaiada nos estudos de ligação de elfamici-na (G. Gbinali e col., lur. 3. Bicobem. (1977) 55-65») e nos estudos da inibição de síntese de péptidos dependentes de BB-Xu (0. Glockner e H. Wolf, acima cidados). Boi desenvolvida ainda outro ensaio de ligação direota da elfa- U I| . micina no qual pode ser visualizada a capacidade da proteína ΒΒ-1'u para ligar elfamicinas por uma alteração na migração da proteína EB-Xu na presença da elfamicina por ensaio de 'BASE (electroforese em gel de poliacrilamida} não âesnaturante. Apés a ligação de elfamicina a SB-Su, GBP, ê formado um complexo ternário que é mais negativamente carregado do que o complexo binário EB-fu.&DP (B. Kraal e col. 1989. em 2be Guanine-Nucleotide Biading Proteins» pp 121--129, Plemim Press, Kova Iorque). Oonsequentemente a ligação de elfamiciàa, uuilizando por exemplo aurodox, a BB-Χα de origem natural de Bscberlcliia coli aumenta a distância de migração num gel de poliacrilamida não desna-turante. Ambos os processos de sintese da inibição de pép-tido e visualização da ligação de elfamicina são as técnicas preferidas para determinar o efeito da ligação da elfa-micina na função de BP-Su. Bates ensaios de susceptibilidado são importantes se se pretender estabelecer uma maior resistência à elfamicina de EE-Xu. São possíveis várias formas para obter mutantes de EP-Tu que apresentem uma maior resistência ã - 11 - s s

elfatnicina. Uma delas é a mutagénese do micro-organismo mãe. Isto pode ser efectuado por exemplo utilizando substancias químicas, tais como o sulfonato de etilmetano. e I-metil-I’-nitro-I-nitrosoguanidina, ou por irradiação com. raios UY (ultra-violeta). A selecção posterior para maior resistência à elfamicina pode dar origem a estirpes que contém IP-Iu com maior resistência à elfamieinai Isto pode ser ensaiado isolando a proteína e efeetuando nela estudos de ligação de elfamicina, e por síntese de péptido dependendo de EF-Iu,’ da forma acima descrita. Outra forma de efectuar a mutagénese ê no gene clonado codificando para EF-2u; lesta técnica 4 possível efectuar a mutagénese aleatéria deste gene por meios químicos (R. Kyers e col';, Science 229 " (1985) 2’42~24?) oU meios enziaáticos (P. Dehtovaara e col., Protein Sngineering 2 (1988) 63-68), ou focar a mutagenesé em uma ou mais regides específicas de nueleésitos do gene (mutagénese dirigida a pontos). A mutagénese dirigida a pontos é a realização preferida da presente invenção*

Rara efectuar a clonação do gene que codifica a E3M?u, é isolado o ADI cromossémico da espécie promotora de elfamicina relevante e ‘.inserido nua vector adequado* Os vectores possíveis' são entre outros plasmídioa, fagos, s cosmídios* Se necessário, podem ser utilizados vectores de expressão. Os clones contendo o gene tuí podem ser escolhidos por hibridização com sondas sintéticas, que são sintetizadas de acordo com as sequências de proteína ou parcial de proteínas previamente determinadas. E também possível utilizar genes tuf isolados de outras espécies como sondas de hibridizaçãc?, desde que exista semelhança suficiente entre os dois genes. Pensa-se que quando existe 80$ de identidade ao nível de proteínas ocorre uma identidade suficiente no nível de ADI para de-tectárjos genes homólogos por hibrídizaçSo* Assim os genes de outras espécies que podem ser encontrados por hibri-dização e que codificam a proteina possuindo uma actividade - 12 - 3

do facior de «longa acato estio taatti» incluldoa αβ preeea-te 1५»9$ο* kpô& ®l08W9M& mm reator ie expresalo tem-—se também poeefvel úmmtim* « bifellctee» de AM ansía ©fctide «tUlMutâ» anticorpos eopeofflco» a BNe. Se pre«* f eririoia a AM orsaoasáaloc de n. raaõfclasligmt I isolado Cde fora» descrita per 1* Hopeood · eol» (1985) Ge&ctie fâneipalatlen ef Streptoeyees* á lefceratôry Manas1, John lenes Foundetltm, Moreieti) e oloaado itue plaimfaio tal cone plGS ou pueis» 1 a*l*oç«0 de ust gene tof i efecitmi* atilisand© © fcageent® Ipal/Isil ês gene ta* de B« oell ©os© sósia 4« M&rMtsaple (f. gofeete · ooi. Geae {1980} 21-51}. Sua* Mm» posterior íol «tiliead» ©os© «onda © peixeiro gene fuf i» 8*. rataoclaaaaas. Benta tonem fera» âeteeta&os tr*« gene» taf * olcaedc*, * «a «egniia aegaen-eitdes atlliMftâ* # «átode 4« iaager (te©* £fatl« Acad.

Sei. rn li CIOTI. 5465-540?). Stilixand© mm mmàmm ma-gecCficas denteadas destas tile setulfteia» mu* «xpsriln-cia ém xmlmtfto de Sortbsrs» MtA áetsctada s trsnserlpSo de mpmmm tm 4o» genes tof duraste o eresciaeoto rege**-tiv© 4« Beta funçlo principel m gmm taf 4# Il^.^ia44la§ljps {Srtofl} rerelos estsr looallaad© na» fmgaeato 4» restri^lo erôsoendeic© BgHI a» 2,8 fcfe* Àléa disso, utillsaado a»t£~oorfiG» específico», foi rerlfi-oado qu# proteica codificada pelo gene Srtofl mm aproxiaa&sseiit# 2© wmm mm1» «&H&da&t* %m mm proteína* oediflesds* pelo* cate» genes* Qe $Mmm gene», designado» por Srtefl * $rtn£3 £amm codificado» mt« fragasato de Baall de 5,0 Mb e ua fmgoent» fetl d# 4,2 kfe r*apectiY*~ •tate* tara rerifisar «· a reeletlaola à elfsaioi&a de srEMcl pedi» ser sel&órada, f»i aplicai» a «atagdneae dirigida m pontes no gene Srtaf* a partir de coapa*a$!e da» «egal&ol»» de Sf-fa mmmnÊm&m ea difenm-t«e «spdoie* i po»*£v»l faaer naa pr«vi«K» m» mlmé&lúm |t» «Io iapcrtaotea* ©atra» forme 4« eoiteegtilr teto pode» ser a aclliae d* mmtmtmm triiiataaioael da pretefoa, e»t«- — 15 —

dos iaíMdores m estado» de aeeanlftttos ensisáiioes. A partir âm icforssçSo aesi» obtida pode» mm propostas »u-t*p$e» espeeíitos.

Iara «a estirpes &* B* ssii resistentes 4 elfaulein* «ela* «*!teio?i«aa eeriftottHie %m a eabe-titttl§de d® «alsedeid® alísias m pasi§t® 375 d* pro-teína i* Sf-S« d» E«...pg3^ por mUm m tmmim Muita auat múlêtml* d* SF ee* «ta* testo reelatineia i «Xfaaioina {!· £„&&»* Ssttae» Jg CW2J SHÍi f. fetetmfttftel * aol.« B9J& J. J íim) 1X3HU»}» f#â«s ser ntUimâae rdrius tdesioa* para inirodusir ®ttt«ç$ee neaatoatair »o 4DS m* mêtíím * protefa* W de S* μιη&*«1«ι· luaa realâsafSe preferida o mttev pm-e # ** ·**iaep** topedeíi»* m n*mlt fEd e liliwti aio as utilleed*· CE. St**·***» * eoi.

Swi* â®M* Se** |χ, C1.P3I 4441*4434), *a mm um att*agéfi«e*v asa letamlmi is daplex (¾. Kraser s eel. Saci. leid. Ha*· |g Clf84) 9441-1456). Fora» oooeeMis* atpeeif ieaaaat# sonda* is «ligonuolsMto aintétto» s iitílisada* par* «ftotaar * autagdaese da rnlrnmm m peai-çSo 376 t* SF d« $* raaog|galaua para mim* CA3707), ireoaía# {Λ3782}* preito £437§EÍ, ou íeailalanin» (43781). Oatraa possibilidades para a «uia^ao aio «ato* resíduo* d* «ainodeldes na* pesipSes 378, o» por mmplu «tttaçlo do doido glatlato na posição 360 par* fetiilãla-nina·

Sara ebier a proteína aodifloaâa o gene tpe eofrett * «mtaglo pode eer expresso *» t«*al%i»er hospedeiro *ά*ςβ*&β| *Io dados mm§%Q» is «*pr**s8e st» lft.„S.Q,ll * ** »*..... A eeijeibiHuôde d* m do «mtanl#* 43787 e 4378¾ i elfuaieíni foi rerifleada est estados ia yitro. $a«r os BE do «8* %u*v — 14 —

$ «ataste* *£><$» êm genes glosado»* r*isp«c~ *k*Mt ttíxmm mwm*«o» tuna estirpe ia S» oelA eoâifloado mi. EF-Φ* I rnltml&ím* Ga axtraetos isento» ie célula* deste» tmmi®mm%m fora» paste^iomente ensaiado* para ieierelsar a aessIMIMtie 1 alf&aiaina m diepoaiiive de traseiasçg», utilinando «e» rariaçl© do prooeiiaeato deseriio 99* 9* SAoe&ser # U* «láf {aeiaa oitadoa)* Terifloou-se $ue a SrBF-Ca ««tanta d# i&Wt · âllfif tiniam usa «etiriiate residual te gêf* para usa oon-oantrafl© de elfaaioin» te 16$ «g/1.. 4 StR$M&» mUm «tia» gla ta «ellrMsd* raaldnal Jl para a aasaant&aeKo te l#ã «*/A* lnSii mm wmmtwm SB«3i» resistente» fe eifaisioi-ta aio eosel^nSt» oos© proteína» oom ueu activi.aâe real-toai te 5ô£ pam nau oonoentraft© te elfanlelna te pelo •aso» 2 ag/*l# toando maniatas to ensaio aelna referido.

Soda» mm pmtmimm BF-2n mutmtmm foras ensaiadas através te mm ligaçSo direote TÍ8ualls*dos por usa «iteraplo na slgraçlo ea Fâ§S aio teasaiaraata apta HgapSe da mitmimim* data «uta&ttt SF {Α57«Τ, âltif* A3W * âHfSf) vmwm ser Aaaapa» te ligar a elfaaielaa nesta eaaaio. ©» ienes %m sofrera» a an&ae&a aio Istroáttaltoe no hospedeiro que pmãm m eociaioiim. ίϊ««» reallaapio preferida «ais hospedeiro i &» raaoclagiaas. ú gene %i*e eofreis a «aiapS© I te prefarisoia integrado m erososseaa* fara este fie pod# aos? wtiUeaio m veolor te isiegrafio# poaeninio mm kwmlm&m 00a o local do gene taf* A iniegrapio i te preferência efeotuaáa neste local* ea %iza o gene ale d «nhatltnito pelo gene <pe isofrau a auteçio. O gana %mm aofrea a auiaçio pote iamhén ser inserido no μνμμννημι aoutro» locais te esoolM, da pre-ferlnoia lotai» ·« que o nfaai ia empresas© ta proteína eo-tifioata d «lavado. tara na «li® nível d# «mpreanS© da proteína» a locallsafio do piaaafà&o é tasfela posefvel, « poda aer rantalosa* loa tola iltlaoa oaaoa Clnaerpio to tnfil 15 **»

noutro looal diferente 4o gene tuf « piaaaldio codificado tttfR) 4 eeaenoialaente que o gene ale »*$% deaactivaáo por eutaçlo, per exeaplo elininação do gene ooapleto ou, de una parto eua ou na» aoquSnolaa de regulação* A eetírpe do S. raaociaalaua «a que o gene Srtufl oroaoeadeioo foi eufcetituido por tufR revelou ttr o «ou nivel do roalatencla è elfaainin» aununtado «aio dc 5 veee» na faoo do crescimento vegetutlva d# aicálloe, A14« dloae a reelatlnoia aoe efeito» da» elfaaicina» exdgenaa aa especulação e gerainação do» eaporoa foi taatola igualaenta ausentada. u* eatreptoaicata reaiatente à olfaaioiaa 4 definido ooeo usa estirpe caraoteriauda por oe eeua aeporoe gérainarea e oreucere» nua aeio y: π con· tendo extraoto de fungo a 4 g/l, extraoto de aalte a ic g/1 e gilaoaa a 4 g/1, na presença de pelo nenos oe4 g de elfaaiolna/l de preferlnoia o*£ a 1,0 g de elfaaXcina/X.

Ao contrário da Eacherloliia ooll nflo foraa obaervadoa efeito» adverso» da autação de T-?~*u na velocidade de oreeoleento da Strentotaycea raaooialuuB fteelatente a eifaaielna.

Sal oooo deaonotrado aa proteína a EMbR denta invenção dlo «rlgas a eatirpe» que poenuea uaa ealor rseletlnola contra «Ifaalcinaa· A produySo de alfaaioiiia eerá auoentada ou pelo menos eerfio touauu» *e~ dldaa para ausentar « produção de eifaaioina da» estirpe» contendo aa protefna» aodifioadas qut aarão eueeeptíveie de ausentar a produção de eXfeeticlaa.

Oe aeguini** exeoplos servirão para ilustrar a invenção, eea de qualquer foraa licitare*·; o eeu Sct-ito· ão» exeaplo», a seno* que se indique o contrário, todoe oe prooediaentoa para preparar t aanipu- *· lõ ·*

lar o AJ5H reoombiaanta utiliaando E>rTOjtili ooao hoapudeiro foras efectuadoe por procedimento» convencionaie descri toe por t» Maaiatia e ool. U9d«t Hoiaoular Cloning: λ laboratory Kaaaal. Coid Spring Karbor jwboratory, Sold Spring Habor» $%ϊ·>*

Exemplo 1

IeoUetnto e gagjgltgiaaglg dOaotgj^^ *«.....3-, rMggiealfiug

Foi feita a cultura da raaooiaelao» CtíSl90,t>9 «a «aio S líquido (m* ukaaiehi a cci«, J« doo. tfiorobiol. M (1974) 309-4^') dura»ta 7* horae a 3Λ. foi recolhido o mioélio por oef.trifuga$8o e foi re-auupen-ao e* tamplo oonvenoional refrigerado oom golo (lo «·4 dt íría/HCl pH 7,af 60 «H d* ai^tíl, 10 d« acetato d* magndeio l *H M* 091$ da PfcSP). A suapena&o foi tratada coa eoeifioaçlo a 0°C oom lo puloaçdea de 45 aagundos ca» da uma, deixando u« intervalo de 15 aegundoa entre «loa para arrefecimento· A auapensSo tratada com eaponificaçlo foi oentrlfugad* a 30 000 g durante 15 minutos. os riboa» aoaaa alada presentes ao axtraoto ΰ 30 resultante foram agregados por eeutrifugaqto durante 3 hora o a ioo o,n g. 0 aobraoadaate âaata ôsntrifugsçSo foi considerada como a fracçto S-loú do mloAlio da õ· ra^ocisoimue. foi purificada a brKF-.u por oroaato-grafia de afinidade «a GDp-Ah Sepharose (α· dacobaon a d« Aosenbusch, aoiaa citados}· iate procedimento prociuaiu a prepampto 4« uma proteína de dnioo componente tal cota» determinado por SDWàGk, A proteína migrou com um peso molecular aparenta da 50 fcD# enquanto que a L'i ae r, .coli migra « 45 ltD. A protaíoa purifoaúa foi identificada como S* 8, ramociseimu* SF-Xu (SrBF-ru) por análise da proteína por ensaio* da permuta de O.V 0*. «eissbach a col,* acima citados) * pela aua capacidade pura promover a ein-taae dirigida a poli (U) dependente da >? da polifanilais* - 17 -

nina utiliiando riboatoaaa da B» ooli.

Aaboe 09 «atudoa 4« ligaçBo 4« «lfa- aloina (0. Chiaali e col. aolw oitaâoa) a a inibiçlo por «líialoina adicionada 4o aiataaa 4o poli (0) tranaiaoçio ia rltro dirigida por 3rBMu Indicara» 900 a Sr££1fit d atntfrtl à tlfaaiolna (ror fíxtaplo 5» · taabéa C. Glookatr « H. 1olf. ooiflo oliados)t A 81Κ?-Χι1 purificada foi utilieada paro orlar antloorpoo poliolonala oa ootlhoa 4« aoordo 00a ãienioaa ooortnolonaie.

Kxaaolo 2 M«ntiflc«cao. l»oU««nto » o»r«ot«gU«o»o do» «»«« tuf d». .....r»«oql»»Hn» 0 prooedintnio utiliaado para laolar o A3M eroaoaadaioo CBS X9Q.69 41 3. raaooiaaiaaa foi «aetnoialatoit o doacrlto por D. Koprood o ooX. (aolaa 0liados), io txptriinoiaa 4« rartlaçXo do Soalhara doai# A)ií. diga rido 00a oaaiaaa 4o raatrlylo, revelou qaa aaa «onda tuf A dt s» eoXl (fragatato (fragaanto Hpal/Srul» T. íokota · ooX,, aolaa oitadoa) hibridlsara fortoaoata 00a u1 fragaanto dt BglII 00a aproxiaadaaantt 310 kb o anata fortaaantt aaa aulto oapaolfioaaoato para ua fragatnto dt BaaHl dt 510 kb t ua fragaento dt PatX dt 412 kb.

Para olonar o íragaento dt AEH farta «atata hidrídisante1 foi digerido 0 ADI oroaoatdaioo d1 3. raaoolaalaat até final eoa BglXX « ligado 00a o plaa1 aldio pUoa digerido 00a BaaFX (J. Vieira t J. Haaaiag» Gane |i (19»2) 2591204) a pUoê (c. YanÍHoh~Parron t oool. Gana 21 (194$) 10311X9)» raaptotireaants1 0 hospedeiro para a iranaforaaçSo foi a t1 ooll estirpe dHXOl (J. Mtaaing. 1 lô -

Rtcoabiaant ADI Technical Bulletin g (1979) 43-48). foi aplicado ua procedimento de ealeo-99o de aib para aeorutinar conjunto» de transforeant*’» para deteraiaar a preeença d# ao^uinoia» tuf d· g« raaooloal-aua. Coa «ata prooediaanto a aelecçío inicial por hibrldl-aa^lo de destoara 4 aplicada a plassldioe isolados da ua ooniunto da tranaforaentae* t euoeisivamente raduaido ua ooadunte positivo da aa dlaendo « «a cada faae a popuiaçlo total de plaaaíâlo» do conjunto d aaorutlnada por bibridi-«áçSo da Soutbera· Finalaente os plaeaidiou iaoladoa da iraaaforsaatae siaplaa alo analisadoe. lo prooadiaanto da aalaeylo da alb para ieolar o gana tuf da s« raaoolsBlaua. foi iaoiado o 151 do plataidio da 11 oonjuntoe da §0 · 70 transforaa&tsa cada a foi eubaetido a eleetroforeae aa gáls da agaross. 1 hidridiaaçio de Southern deatae pr*para$8ee da ABI ooa tufA da 5. coli revelon ua conjunto positivo· A reduçio auoessiv* do tamanho do oonjunto resultou nus plaaaídio p·. 018 reooabinaate positivo oontando uaa lneerçlo da ; glXX da 2»8 10· Bata plaaaídio foi designado por pl>Srfl (Figura 2*) 0 fragmento ooaplato da 2,0 kb foi $«auenolado aa aabaa aa baniu» utillaendo o proctaao da terainaçlo da oadaia da Sanger a ool. (aoiaa oitados) a os fagoe "l'5»pi8 ou M13*pl9 (0. íeoieoh-Perron, aoiaa ei-tadoa ooso vector. A análise da ac^ulnoia revelou ua quadro de leitura abarto da 1191 kb, oodifioaado uaa proteína de 39? aainoáoidoa, incluindo a aationina H-teralnsl (Figura 1| di:w» XO* 1)· a «equloola da proteínas derivadas iaata quadro da leitura abarto revelou uaa hoaologia da 745· ooa 3?-ϊα da S, ooll. 0 gana clonado aa pusrll foi ooosiderado ooao aeode o fc?-2u de a. raaooiaaiaua oodifioado o gene rtufi. 19

tmmm eienadoa, a» forae aaaalbavt·» mtHzmaé® 0 geoe ®r$«fi mm mmêm de Mdraâsgio* e frag~ «ante á» BaaiX de ffQ k& coetaede © gene Mtmtt, # fragata-to ietf de 4#2 fcfe eenteado o gene &M8 * fmm deterei-«ad«s a* «eijuiaoiea de aucleótldos da# regide» d* eodifí-ea^Ie* Ae mqutmiik* de oadifioaçSo de Srfca&â * SfftotQ * ee &m%vkêmim derivada» de »ain0áei4o* doe produto# codificados Sr&f-lii e «Se aprewmtadae nono SB0# II?. a · SEfi. m. % reapeotivaeeote. 0 Ss&Mh# is* ?f3l * o S«EF-£«3 fi# do» mm» resíduos 4e «Minodoide» MeeM-eea a B. oelf ssMftu grassa.,?,

Emr««tfa hefti Xona do gana dt 3rtaft.«» s.aoli 8a*a ««& idefítifioaçSo m «araste-tiatflo independente d» proseis» W de 0« g«»ooi»gieu» foi «affflaaso o gene de S*toffi elenai# mm M*.. sofi ASftOI* A ex~ pvaaaie foi oMide ooiooaoâo o gene Srtaf & Jusante do proaotor las ináatfeel «os plssaíâio® plISIi de S.ooli da fsraa «egeiate*

Foi isolado # fragaroto HraX/AfceX de píJSrfl costeado o gese Srtof, foi ligado eoa pBS18 digerido oea Bml/tbmt e treanforeado aa dHJLOi prodeaiado o plasafdae ptJ8*£i«4. (Mgure 2b}* 0 eseaei&eiste de SLeeli dMXÔi teaaaf fanado soa e a indaflo do preastor Xae foi oojiaegttido por «altura do tnaafovaaBtas doreiri» M fcoree a 37% ea «elo M mplmmntsãm mm 10β jm/mk de aspiei-

Um * 8,5 aH d» ®ã. á proteína total desta» oiiiiias fei aaaiiaada atUlsaato m& MSB. Isto reveio» m pt&maçm êm mm sole mpfmI» de protele» «a 8»aali tranaforaede. • 20

Beta protafos oonttgvm em pmi£&màm* a reagi* íbrtaaaate mm m mtimxpm Er§F»*ftt {wm Breaplo 1} nas axptr&i&siaa 4» revtiaçio da Waafcera· lata axparidt&ia iâaatifiooa mmim e gana prestai# e* ptlSrfl»!* soa© o g«o* Srtafi codificado *aa proteíi» designais per gg^-tsil*

tara a piirlf ieaç5o 4« Sv$f~tnX tei pra~ parad* mm ffe*a$Sa $-10© 4# B,oeli iíMl©l/pt?grSi~i (Bxaapi© 1), estabilizada pala «di#I© 4· ffiBF a 25 ttâ a falta passas· através de ttos salsas d* GMVâí! Bapbroaíi* Hastaa coaâi$5*s a 4a l.coli 4 ligada λ eoluna, imçpactG %m m protela» de SrBF*f«i passar* atesada dela. © eluído estabilizado em €SF foi #· segwMa aplicado m mm ooluaa de %e«atri« 1BB-A (Aeicoa), Apta «liaiaaçg© 4* pretafa» me ligada, fel alai&a * ^s3Mêu1 » m&mieadaaant· ô,45 H da 1*01 aplicaste »a gradiente aailtso llaear da O * 1,$ S da laOi» lisas!* .Sarta^l ®bj» * «Ntaeteat dirigida a p&mm m gea* da Srtitfl fera» attUsa&M» sistaoaa da reeteraa »Ba*a a estirpe* tacpaâatak* i^cell ^16 a tfâdantS (F. St*a-«a*a» * ©»!** aciaa citado»} ea fecs^laiiçle mm e $mm~ dlaaata d# anftaginea· da duplex mm íMtmwrélm (hu Xzaaav e aol», aci«a altada*}* fel digerido pi'âHtl mm mm # siadin * o ffeagaaert* mmm$e « g*a« setotf fel ligada * Beofflt * pH«6 « ptted dirigida» mm Siailíl proáuairam e» plaaafdiea pHaMl « pieSril, saapaotlvaaatit* (figas* 3)* ®* p£a§ « pHe) sle érni*m.m daa plassfiica ptni-a * ^ p^*f~S Cp, Staaaaai^ # ooi*# »ci«« citado»), a* $u« falta - 21 -

ο ponto ΜΙ mm β agente âe /3~*δ0ί8ΙΜ118** # proesdissuto is estagiasse s selso- $δβ 4* «atentas feres efeetuaâoe «tilixesâ© m pleasfilos pMaSríl * pMoSrfl* aase£el*l«enta ia forna ieecrita P. Stansaoes « «ol* (*ol«* elte&o»)* SaanfldLúaMHit·* foi preparai® ABI áe fcaada tfetoa a partir âú piaeafâi® pKtól por infsofl© âi p!l§Sff 1 seaisaio eélalaa te l.aoli mm a faro HX3S07· tara a f«tMagftfe 4® iaplsm coa ia-tcrvalos* foi eoaMtaa£« pHoMA a# tanti* únMm mm # frag-senta «aior MlnX/XimX 4# pMeSrfl * cm o eitgoimeieíStM® «Xn» tétleo 1 {m%* ΪΒ. 4). ou o oligooooleitli® «IntAtio® S (22Q· IS* 5) para «festos* a «*teç5o ia poeiçlo 378 (aleci-oa) ia proteína SrBIMíai para rsiina · traoolaa* A» proteína» aatastee foras iealgcedae per 8rEM« A3787 # A37Sf, reapeetivaae&te* Apis a tne&tente ios interralos « liga-pies utiliaando a ABI poiiseraas I }fragat*ato aalor) e M*àW* as aaostma foras transforsala» «a B»ealf HSfiastS, eiagtMfrt* a# «eleeoieiNmi para a m&Mêmím i eapicilinsi, 3» seguida* foi isolai# o AM 4® plmmíâtQ m partir 4« traasfersaates oeaftl&aie* ie WMmM e tntroâaelâo· m £*aflU estirpe W4* ôs traasferaàfitea WS6 seetsteiitee A asspieilina iniiriiual foras posteriogwmte infeotaias oo* fíBiCBI ia fés»* aoi*« ieeorlt* 4# «oio a #Bter-ae ο ΑΧϋ 4« plaesíilo mm* fora» i« bania tfaâea» foi otiUsae* * «ai~-lise ia ae$a§m»ia á» aoolsitMós Crer Bxespie 2) para iimstifleer os doas» mutmêM a antapio fretetóiie* · para detersia&r se olo tinhas #íis intreâusMee *mm&ê*SA* émtm i® iatervtèo durante o prooeiieento 4# «tagêQeees* foras rsoixperaioa os plssaíilos eoa-traio as mtteplts respetivas p?*rteMiiae « iesiipsitatnte per ^'laSrflV # tffaãxHS? {figure 3). M tmmm mmihmtn* fores lotroltisl-ém m aoto$lÉS A378F {pvotftDaft) e A378F Cf eollelâslca) - sa -

•V

utilizanár? oe eiígotítieXediMo* «utegâftieoa $ (3S0» IS* 6) e 4 CSE^· IS* 71 * xm&peâtlvaaetifie* m plammfiio· obtido* §or esta aaeperiêfleia foram âôaigaaáõ» por pUaSrflf * pKaiSrfâf. mm, rn M2êÊ..Mm..mm%ít, m aíntegada géptiâao M %l$r*i6

Bata «a e%t*r m **ps*mV» 4o« geae* «utente* Srtaf* M Usado a mm&wr Ki«I/£fe*i 4* piSrSl-i cem a fragetato míi p*%M#*to 4· stltiXAtaft 4* piaSrfl? * gRaMIS* obtendo-e* es pluem-filos p&S*Si?-4. e pBS«S12-l# rooiaraUraaiw&tm £f igara 2)* 0 plsamMiofs pfSril-l* ρϋ8*£1\Γ-1 « 0mu~l tom* m E»eoii m&m CM£t MP* sue* Sggp* wtóSêi f *ai» ta? K*i4 U&·» *ur* Sieefcmm* 4|g (X985) 409-417)1 «eia estirpe tWfe mpmmm O* gene iisf aoiivo» tae osiifiem uaa Bf-su raei*te»io è alfaiai-olaa* Os traaafermantes fle S.»ooli J&&455 respeotiiros fora* mltimôm «Ia t&tm toaria «a Βχβαρίο 3** toi preparado um oxtraeto à% S-3© «sseacifilmeai* d* fatma tawett* no àx«mple 1. foi aplicado l mi 4o omtmoto mmm coluna dmlõ ai d© áapfcadax ô»f| ¢2 g 4« ãephadax â-25) à* XS-20' es de ooaprisento (pipeta 4o 10 al). A coluna foi uluíia cos as tamplo cou»e»tÍocsl C^esple 1} · foram reoolhl-ias m 5 gota» ($00-708 ^1). â* primeira* 4 frmcçBme qu* tia&am uma abeor-rSísoi* a 2Ê0 <uk foram coaMoa-ias* Bata fracçtto oe&Mnaâa bruta foi utiliaaia pum. premo-?er a afatoa* d* poli (1?) dirigida a poli (pbe) in g&fes> âa farsa seguinte* foi preparais uma mistura 4« ineuba-pSc a 0% cosatitui«4o em 40 m êa fria-aettaie pli ?,fi,

Ml aa 4« acetato o âe «agméaio* m m m ΙΚΙφΟΙ, 5 *®t ** —

-aercaptoetaBol* 1 αϊδ de AW$ O*025 wM to 8$f# 2*5 dK d· foefoeaolpirwato* 0*23 Og/nít i# piravsto <pen*st, 0*8 #g/»l 4# t&ES, 0.1 isM 4# poU(8)t m βϊ d# fesii-aianiMt e 3 uoi/ut 4# % tmim&nim {m m/smlh A 0»ô >ãl tosta csistura de inoufcaçSto feras aáiaioaíàdoa 0,12 nl de estreei» fefute* Posteifi^seate foras incutada» asostra» da *S6 jsl a 37*0* A» mlwtum* to Imitais»-fm* processada* to fensa eesidatei foras toieleaetoe 180 ^ de mm lm m t foi pse&mgKâs a âas»$»sie duraste $ sis-utea a 31*«* $» «eeuidn tewm mm ynl de toiâe trieloroaototoo {«23) m 90 « as attoetre» feias» «rasaen*· dae -a 6% durtote 3 sieutee· fui filtrada o pjeoâpiteto as filtra» GF0 {Shetoan}. Mmâm par tr§« nesee mm eo&ugXo * S®S de Aid e usa fe» os» etasel a 960* 8* aegtsi-to m filtre» fora» »aao» durante 30 «tantos « Ô0®«, forna aâloier*aio» 2 ml de time d# e£a$il&$$s de xileno α aaâa filtre* fsi asalieada a ioesrpsrasiíe de %·£»»!-lalaaias naa ooatstto? to ei&tttag&o X£pids* B® «speritoeia» diferente* fera» enfiadas da toma indleads m Hgum 4 aner «e £rao$3ea · sertoeatrst&eii to elfasietea %aer 0« teafoa de iBouím$&o* O resultado da prtneira esperieaola é apresentado m ffigurs 4a*· Qna&tldatos sreeeeates ãm aooiaiclaa fora* adiste-nadas to mletmm to ecs mpmíêmím d# efuteee paralela de poli t$m) utiliisaede & extraote S-30 aolm senstefiate, Oe teapos de reaeç&o fora» mutiâos soastes* te» a IO «inutos. Astoas a* SrBIMõi. «atente» á5M t Á37S2 r«veia*«* nas atoiritoto residual €# 5®í »* síattse de soll (pM) ia .nutro m paessostea to ISO Hg/Ι to aooieici-* naf etupaiito ípe fui $8 Observada mo aetiviâeto residual to W> par» a SrSf-fu ai· â« S* «mneineiatts 0B8 190-69 mm 1,6 «β/fsi to aoeiseei&n (Wígum 4«). B» aegsmda esiperidaõi» foi estudada * sfatese to poli Cpto) dmnte un perfode d» 40 mimtm fare use ooac«otr*§to de wmiaiei«i to Id «g/1. ferifi- - 2# -

jficQtt-** tu* **ia £&<mfea$lat m iaesrporagle ia 3B«^a££a&M*£aji dirigMa $9* 3S89 «BfoMlt·* â3?8? * *318$» «t áá 96« «11 #fl6if»©ia 4# 30$ gttttã* «0«lW»tâft 66« & ineubtçlo paralela at® «oclftieiaa· ftt «xparilaoi* M m&» %mlof m «rtraoto» S~3® αοηΐβ&δο m SsB£*ta «ia »a praatB-0« d« -16 ag/1 â* «aotaioiaft refilara* tl*á afioilaeia rnix&m 4# £0$ da raaaçt* Um á» «ociaioia* 4b}*

káMíMJ nmrnmm m M mm~m mm$m f«ra m iisaet* 4« capa- aiiai·· ém 4* «IfauieiBa, fora® «xpreasa» as pr©t#Í~ as ««tanta* «« t.o&Xt Ml®l aasaneiaise&ta 4« forna 4**» crita aa BxaapXo 3* fcsferioraimie, foi prapsraiii «** mwm~ tra 4« 3-30, s*£ODt m Btw· farifimia aataMXiimi» ao* GOP* a foi iasabaia ao* auroâGx %$ jm âmtmt* 1$ alastes a 31%· Betas ««ostra* * «a ««ostras 4« eofttrolo *** aurodox fora» «* ssgaiia suimtidae & giis ia iOfê i« poXlaeriXa«i4a alo aasaataraota m «abaetidos « aiaotrofosass. 4 iateofl© ia» «spici** '· BrSf-^ι* foi *fectuada pala tloniõ* ia ravaXaçVQ 4# Western atilisaaio sntieorpsa SrB?«*Sa (£x:«*-pio 1). B»bor« « Bf-fa 4« S,i«iBoei«iti»ui i« tipo Emittral • pareça ligar-ee λ alfawioiaa m for** iailoai» pela «igra-çlo ereseaata 4o ooaplexo ternário ao g«i (Bigur* 5), « «igraçl© 4e SrS? «atonta proteína» 4313?» A3?8f* A318B* * 4313? »Io foi afeoiaia fmim pré-iRoabaçlo oo* a *$&«geiMU Bata erperilaeia estabeleceu *««1* que a reatetSnoia à alf asinina 4 «aia prararalaaata a «feito 4« ii«a Hf «fio raiaslis âa elfaaieiaa la proteína* «utaata» 4· irlf^f«.

Emtòs.1

Coaa&raolo 4oa raptores 4» sibatitaiflo ia gana» s&ISfX^i 3 « pran^a a

Mm obter 00 pla*«ídlo* prcmi^ S t 3 sutotptlvei* d· «ubatitulr o gec* Srtuf cro*oe~ eáaioo »K* fora* preparada» vária» coneuruçSaa 4» inter**-diário*. pUtldi

Foi digerido o plsaaídio pIJ702 (!>. K.ats «coi.. J* G*b. HioroMol, 12£ <1985) <>703-2714) 00w Bell» · foi purifíoado o frageettio d» 1,05 kb contendo 0 gene d# realettncla de tioetreptona « foi poeterioraente libado a pOtlâ digerido coe BaaKX, A tr*nefor**<;fto d» Íigsll JK101 produeiu o pUeefdio pfltid pretendido (Flgur* 6a). ρ$«ιτμι 9 punz-it

Foi digerido pUtlS 00« Seal e :íodIXI « foi purificado o fragaento de lvi kb aontendo o gese de realetênela è trioateptona.

Fora* digerido* pt'3rfl?~i » ptJSrflt-l 00* hcoAl e ΜαΙΣΧ e foi purificado o f -ageento de 1,9 kb contendo o gene Srtaf que «ofreu «utaçBo.

Aabce oe fragmento* purificado* fora* eoabiaado* 00a pSF70 (frooega) digerido 00* PvuII e SooúX, Ugedo e tran*fareado e« L.ooll dhioi. Oe pieeeídloe contendo toa03 00 trS« ele* cios aaiaa citado* fora* identificados e designado* por pSt?l¥-l * pSiUT-l, reapeotir*-aecte (Figura 6b). pdtUV^ 3 · p$%nt£ 3i Λ regilo a jusante a a regiBo de eodificaçfto 5* do gane Srtuf «uiacte fora* ellttinadaa doa plaeefdio* pStXiV-l e pi»tU2-i por digestlo oo* ScoRI e 3**1, **guido por tratamento eoe ãM peliaeraee X (frageentc «» 2d<*

graodt) para coa/«rt»r a» tarainai» adarentea :coHI «a terminais ligada»* Xigaçio, trtnaforaaslo «a K.ooll JMIOI. Λ* conrttruçflee pretendld»· fora* obtida» a designada» por patíl?^ δ · p3ttlT/\ S (figura 7a). p^iir^a · pMíísnt^.a* 0» «aiora» frageentotí que raaultavam da digestão d* latl/paull d» pStXiV^ δ a prtéo0 (A. Birch t «í. dullua, J. Oae. Kicroblol» 131 (1985) 1299-1305), reapfctivaaeat·* fora* ligado» & tranafora&doe ·* K.ooii J lOi. Atai* foi obtido o plaaaidlo pHXSJlir^ 3. Dt for«« ô*»eihanta, partindo d* p3tfi^A 3» foi conetruldo o piaa-«idio pMS&tlfyJ.g (figura 7b).

Bubitituiolo do gana tufl da S,ra*ooÍa»l*tta >· oor ua gana cue sofreu autaolo codificando a*a arotaína Kf-Xu raalat»n~ ta h olfaaioiaa irara a «ubatitttlçXo do gana çua codifica ,F-fu da s.ra*ool»»iau» ala paio gana da varianta de ..r-Tu raalatanta λ alfaaioina autaota A37&Y a Α378Ϊ. forna preparado» a»poroa freaco» d* a.raaooiitUmt Qm 190-í-'> utUlsando ua «aio d* eoporulação no* * aagulnta coa-poeiçSot líalOj 0.3 g/1» Κ^ΒΡ04.3%0 0.2 g/1, HgS04.7l 20 0.* g/1, CaCl2.2H20 0.005 g/1. f»tíC»4.7H20 0,01 g/1, „tti04.T.;20 0.01 g/1, 0u304.3ÍI20 0.005 g/1* «nS04.4B20 0.04 g/1, i#»Matioaina 0.1 g/1. L-Lauoina 0*1 g/1, 1-Xiroaina 0.5 g/1, glucoea 10 g/1 a dgar 20 g/1. Partindo da uma cultura aa «Mio δ (Εχββρίο 1), fora* dtapar»o« 0,5 ti naa plaoaa da aaporulaq&o a incubou~aa a 30aC duranta 5 dU», 0» ««poro» fora* iaoladoa aaeancial-«enta da foraa daecrita por !>* Hopwood a ool. (aoiea ctta- — 27 — doai. # utilUado» pera inocular o neio (extraeto d* fup-go 4 g/i, txtraoto de eelte 10 g/1» giiooae 4 g/i) oon-tendo 0,5^ d* glieina. 0· protoplaetos forao obtido» por tritaaeato coe Uaoglaa deata cultura, tranaforando» d» forea deeorita por Kopaood · col. (acloa oitadoe) ooa o piaeeidlo pK:tSTiV^ S « 3. Poaterloraente o» protoplaitoe tranafornadoa fora* di«pereo& nu» «aio d» ret generaçlo, · inoubado* * >0°0. 0 eeio d» regeneração foi preparado eiaturande ett rolttoe» iguaia de sseio de eaporule çío e «elo d« eetabili«açio. 0 mio do etitabilleaçlo canalete »«t HaííQ^ 3 g/i, G.0S5 g/l, V°4 0*25 g/1, 0#0I g/1, eoittçlo de «Xeaento* traço 0*1 ai, fri* 1,03 g/X, MaCX 2,§3 g/1, aaoaroee 103 g/1, gluooee XO g/i, ^g012„6H20 5 g/1, CaCl2*2K20 1.5 g/1, « lg«r 20 g/X, «luetado «a pK 7,2 ooa 48 HC1* A aolo-çlo de elemento» traço tinha a seguinte ooepoeiçlo: F#( « 4)2d04.6X20 0.25 g/i» ieS04.7H20 0.05 g/l. MnCX^. 4 í20 0.04 g/X,í*CaS04,3H20 0,01b g/1, ΟοΟΙ^δΗ,,Ο 0.015 g/1» 3w05 0.005 g/1 »»Í'004.2H20 0.0055 g/1, Kl 0.01 g/1, ajuntado « p' 5fo οοα 48 KCX. Paseedee 24 borae ee placas de regeoeraçKo forae coberta» ooa 3 «1 de dgar amolo contendo 20 ug/al de tioatreptone (Vopwood e ool.t aoloa citada·; a incubou-s* a 30°C durante 5 dia». A» coldole» reeiateatee k tloatreptona forna riacedo» nua «eio d* esporuleçto contendo 2 ' ug/al ae tloatreptona, « forna cultivada» ooldniaa individual· a 30°d «a «elo XM oontendo 2 ' ug/al da tloatreptona. Poete-rioraente foi leoledo o ADK da pleeaídio de onde cultura # foi analleedo por amnuaeasanto de enaieai de reatrlçio para eoofireer a Identidade e integridade doa plaesídeoe traneforaado» p»3fSfl¥£ 3 e pWXírfX?^ 5.

Bera obter a Integração do plaaaídio p-íSXiV^ 3 no croaoeaoee de s.raaooleaistia CBS 190.69» de preferindo por reooablnaçlo bondloga do plaeafdlo looalisaf ao na» aeçitlnoi*· SrtafE outantee ooa o looal de srtufl - 23 -

«S* (Figura 8a), fe*-ee uao do repiieSo phlcuO sensível à te «per atura. Oa tranaformandea aeleccionados foraa feitos passar por ririas rasas (paio asnos 3) ciclos de cultura em meio líquido (YHG) a «sporulaçSo a 37°C na presença da 2 ^ug/al da tiostreptona, da aodo a remover o piasmídlo iirraaanta rapiioanta das células, aae para escolher a in-tegraçio oromosatímíca do piasmídio. Oa esporos obtidos por «ata prooadiaento foras diluídos» placados e incubados a 37°C| fora» raoolhidoa as colónias individuais, cultivadas a 37°C oua meio YMG coutando 2 ^ug/«1 de tiostreptona, e foi confirmada a aueinoia do ADN da piaa caídlo. £© seguida, foi isolado o ABK total das colónias isentas de plasaídio, digerido por Bgill e analisado pela tdonica de revelaçBo da Southera. A integraçSo foi observada por aeio do desaparecimento da baada da 2,8 kfe oroaoasóeica · aparecimento da uaa banda a 1,2 a a 9,2 kb (Figura Ob).

Aa estirpes que poaeuiam uma cópia do plasaídic integrada no local Srtufi crajoeaómico, xoraa cultivadas aa YKG saa ilostreptona e placadas num meio de esporulaçSo nSo eelectiiro. Os esporos foram Isolados, diluídos a placados num seio da esporulaçSo nSo selectlvo. A placagea da réplica posterior da coldniae simples para seios da aaporulaçSo contando 2 j&g/ml de tiostreptona identificaras estirpes sensíveis I tiostreptona que tinham perdido as sequências da nuoiedtidos por recombinaçSo in-tramolecular hosóloga do croaoasoaa (o processo inverso da integraçSo de plasoídio)· A selecçXo das estirpes sensíveis à tiostreptona para a resistência A eifamisina quer e« selo líquido IMG contendo 0,3 g/l de oocioicina e nus meio de esporulaçSo sólido contendo 0,1 g/l de mociml-clna produsiu a estirpe 3. ramooiaeiaus HIV possuindo ua local de Srtuf craossómioo restaurado que é idêntico à S.raaosaisalaua tafie CBS 190.79* coa a exoepção da mutaçlo À378Y (Figura 8c). - 29 3 J5» £or®a etaelbaata, poóe ser uiiiieedo o piaeaídío ptit$ÍTlf£ V para m ufet«r- a.raaool·-elaua estirpe Il'i possuindo o locai Srtuf «ia* oo* a ·*β·ρ~ çSo ia autante A3?8r. sm«b1o a

Propriedade» d» rcalaitncla k elfaaioia· de S.raaoci«alana tatírm KIT

Fora· exaaittados esporo», «icélio, · protoplasto» da estirpe b.rattociaalaua RiV m releçfto A coneentraçl© inibidora <*ini»a de eocieicina nas auae propriedades 4« creaoieeoto.

Oa eeporo· da eetirpe S.raeooieel···

Hl¥ * o controlo S*raftool»»Í«ue CâS 190«69 foraa Inoculado· a 5.10^ #»poroe/»i «a íreeeo» 4« sgitepte paralelo» «on-tecdo /5 ai d* cie ia xí;c t «oolaicin· · oonceistrayBee 9®· vavXm de 0 i l g/l. A lncubaçlo foi «f«otuada duranto 5 41a» a 50°ϋ« A fab*l« 1 ilustra oa resultado· obtido· n«sta experiência. rara a eatlrpe de controlo 9,15 &/1 d· eocialci·· ru inibia· a ^arnlnaçSo (e/ou o ar«©ci«ento) dos esporo·»

»· : anto que os ••poros de b.raaocUelaua estirpe Rl¥ ainda ;«i· insTa» · crescia· para concentraçd·· ·· aocleicina até í *75 g/U foro ofeblios rsaultados tteoeU.aat·· t® mio s&Lido 07r~ígar, Dlfco) contendo 0 a 1 gfl de ao-oinioinai oe esporos de s^muociBglauy HiV · S.raaogiasliiu· CdG 190*t>9 fora· diluído» de foraa a que fora· aplicado· aproAlaadaaeQtt iQQ unidades foradora» d· 00Ideia» a cada placa de lg«r. A incubaçlo da· placa· foi efectuada a 30°C durante 5 dias. ?ara a e stirpe d· controlo S.raaocleaieu· :Λ. 3 190.69 aio aparecia· coldnl*· aoim de 0,1 $/\ d« • fflocieicina; pelo contrArio, os esporo» de S.raaoolaalaue »<· tirpe H1Y era· quantitatlraeente aueeeptÍTel· de gemina? e foraar coldnlae pelo «aso· &%4 0,75 g/l* «to -

Foras obtido» resultado# e*ecuci«laec~ t* iguala quando par* cada um ias estlrpea o» eaporos fo~ r«a «ubesituido* por ai c tf lio» prtfcultirado es aeio ΪΗ0 b#« «ociaioina. A plaoages de 1 »1 de um cultura d» 16 hora» revelou que a estirpe d.rarflocieaieue K17 e o controlo S.raaooiseisus 03s 19^*69 tinha* conoentraçC·· initidora» aínisaa de 0,75 » 0-15 g/1. reapeetiirsttent*.

Foi efeotuado outro enaalo utllitando protoplsstos da# estirpe» o*r»<soci»blaus 0i*8 190.69 e £*, raaoolaalasa iilV, preparada da forca descrita no hxeaplo 7. Dado que soe protoplaatoe falta a parede oelular, que foros usa barreira proteotors entre o caspartisento intra-celular e o «elo externo, eles apresentas um eenelbllldads conaideravelaente superior e« reieylo à elfaaicina do que oa esporo» e os siotflioe. Ael», o» protoplaeto» foras pi*· oados e« »eio de regeneraçSo (Exeaplo 7} contendo o a 0,1 g/1 de «ooislelna. nesta# oondiçBea oe protoplaetoe de s.raaoclaalsu* CBS 190.69 eras auaoeptíveia de ee regenerar apenae para ôoooentragde» de «oeisioina Inferiores s 0,02 g/l{ s regeneraçSo de protoplaetoe de S.rasoolsalswe Ãlf na presença de attf 0.1 g/1 de soolaloins ocorria coe a seesa eflollnols es relação & que nlo poeeula sooisloina (tabela 2). gabela 1

Cersinaçlo e oresolsento de eeporos de S.rasoolseisue es igar Hl contendo várias quantidades de sooisloina. 31

JbXkt mVAV i\j

AitlXlao do ftP-luK iodado do ji.ragtoeiaalaua e^tirp· Hl?

Fara estafcolecer que u S.raaoclaalaua t i.tifpe Ri? expreeeiva ofootivaaeutt o gene drtufl quo nofreu autaçSo coao «aplai* d· KF«*u principal. foi propa-» r*ào u« «xtraoto de 3»loo a partir de usa cultura do g.ra-gioclasiauo estirpe Hlt easeeelaleuata da foraa dt-ocrita ro -x«»plo 1. Poatorloraonto e»t« exiracto foi eudôtido i un toeaio do iiga$5o drecta de olfaoiciBa o o ao Uaaorlto ro Kxeaplo 6. Da reâuXtadoa deata exparifocia, que ao apreóantaa na Fiáuru 9* prova· que au «aplcioa prinolpai» de -'-Ju do ^«.Maoglaelmia estirpe Hl? ao contrário da e a- tirpe GáS 190.69 a«o capa*** na* condiçBIe utiliaadaa. da ligara· à eifaatoina aurodox m w m i i fXSO BB mmMOtà * «m psoteíM «om*i»aâett*· soiiptiese sb w^iiiâ * nm para» 4* %«*# I* BE SASMS s dupla feftitãi wmimií i Msear fIBO $£ miâÚUM. t àM Qmúmíma FOIfB OBiexifô í gfegfHPtowro«i raaoeinaiaug mnm& * m 190.69 OABáGSBBXSSICAS iâii* 1191 ρ»ϊ tf*£ttftaela 4« eodifiemçlo 4· 1 · 596 *a s protaloa Sal 4a faato» 4# aleagaeeeto per traíialasçSss :8B0ÍRX&BA&£ t $êm EtaeptQaycea «MK»eal»8ÍfMX8 tafl mãi£&~ mn$& # Saeta» âe aidfsgamato por truRalaoçio GTG GCG AAG GCG AAG TTC GAG CGG ACT AAG CCG CAC GTC AAC ATC GGC 48 Ala Lys Ala Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Vai Asn Ile Gly 1 5 10 15 ACC ATC GGT CAC ATC GAC CAC GGT AAG ACG ACC CTC ACG GCC GCC ATT 96 .Thr Ile Gly His Ile Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile · 20 25 30 ACC AAG GTG CTG CAC GAC GCG TAC CCG GAC CTG AAC GAG GCC ACC CCG 144 Thr Lys Vai Leu His Asp Ala Tyr Pro Asp Leu Asn Glu Ala Thr Pro 35 40 45 TTC GAC AAC ATC GAC AAG GCT ÇCT GAG GAG CGT CAG CGC GGT ATC ACC 192 Phe Asp Asn Ile Asp Lys Ala Pro Glu Glu Arg Gin Arg Gly Ile Thr 50 55 60 ATC TCC ATC GCG CAC GTC GAG TAC CAG ACC GAG GCG CGT CAC TAC GCC 24 o Ile Ser Ile Ala His Vai Glu Tyr Gin Thr Glu Ala Arg His Tyr Ala 65 70 75 CAC GTC GAC TGC CCG GGT CAC GCG GAC TAC ATC AAG AAC ATG ATC ACG 288 His Vai Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Met Ile Thr 80 85 90 95 GGT GCG GCG CAG ATG GAC GGC GCC ATC CTC GTG GTC GCC GCC ACC GAC 336 Gly Ala' Ala Gin Met Asp Gly Ala Ile Leu Vai Vai Ala Ala Thr Asp 100 105 110 GGC CCG ATG CCG CAG ACC AAG GAG CAC GTG CTC CTG GCC CGC CAG GTC 384 Gly Pro Met Pro Gin Thr Lys Glu His Vai Leu Leu Ala Arg Gin Vai 115 120 125 » 54 *.

GGC GTT CCG TAC ATC GTG GTC GCC CTG AAC AAG GCC GAC ATG GTG GAC 432

Gly Vai Pro Tyr Ile Vai Vai Ala Leu Asn Lys Ala Asp Met Vai Asp 130 135 140 GAC GAG GAG ATC ATG GAG CTC GTT GAG CTC GAG GTC CGT GAG CTC CTC 480

Asp Glu Glu lie Met Glu Leu Vai Glu Leu Glu Vai Arg Glu Leu Leu 145 I5O 155 TCC GAG TAC GAG TTC CCG GGC GAC GAC CTG CCG GTC GTC CGC GTC TCC 528

Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Gly Asp Asp Leu Pro Vai Vai Arg Vai Ser 160 165 I70 175 GCG CTG AAG GCG CTG GAG GGC GAC GCT CAG TGG ACG CAG TCC GTC CTC 576

Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Gin Trp Thr Gin Ser Vai Leu Í80 ' 185 ·. Ι90 QAC CTG ATG AAG GCC GTC GAC GAG TCC ATC CCG GAG CCG 'GAG CGC GAC 624

Asp Leu Met Lys Ala Vai Asp Glu Ser Ile Pro Glu Pro Glu Arg Asp 195 200 · 205 GTC GAC AAG CCG TTC CTC ATG CCG ATC GAG GAC GTC TTC ACG ATC ACC 672

Vai Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Ile Glu Asp Vai Phe Thr Ile Thr 210 215 220 GGT CGC GGC ACG GTC GTC ACC GGC CGT ATC GAG CGT GGT GTC CTG AAG 720

Gly Arg Gly Thr Vai Vai Thr Gly Arg Ile Glu Arg Gly Vai Leu Lys 225 230 235 GTC AAC GAG ACC GTC GAC ATC ATC GGC ATC AAG ACC GAG AAG ACC ACC 768

Vai Asn Glu Thr Vai Asp Ile Ile Gly Ile Lys Thr Glu Lys Thr Thr 240 245 250 255 ACC ACG GTC ACC GGC ATC GAG ATG TTC CGC AAG CTG CTC GAC GAG GGC 8l6

Thr Thr Vai Thr Gly Ile Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Glu Gly

260 265 27O CAG GCC GGT GAG AAC GTC GGT CTG CTG CTC CGC GGC ATC AAG CGC GAG 864

Gin Ala Gly Glu Asn Vai Gly Leu Leu Leu Arg Gly Ile Lys Arg Glu 275 280 285 GAC GTC GAG CGC GGC CAG GTC ATC ATC AAG CCG GGC TCG GTC ACC CCG 912

Asp Vai Glu Arg Gly Gin Vai Ile Ile ‘Lys Pro Gly Ser Vai Thr Pro 290 295 , 300 C3

CAC ACC GAG TTC GAG GCG CAG GCC TAC ATC CTC TCC AAG GAC.GAG GGT 96O

His Thr Glu Phe Glu Ala Gin Ala Tyr Ile Leu Ser Lys Asp Glu Gly 305 310 315 1008

GGC CGC CAC ACG CCG TTC TTC AAC AAC TAC CGC CCG CAG TTC TAC TTC

Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Asn Asn Tyr Arg Pro Gin Phe Tyr Phe 320 325 330 335

CGT ACC ACG GAC GTG ACC GGC GTT GTG CAC CTC CCC GAG GGC ACC GAG

Arg Thr Thr Asp Vai Thr Gly Vai Vai His 'Leu Pro Glu Gly Thr Glu 3^0 345 350 - 35 1056

V

1104 1152 CTG ATC CAG Leu Ile Gin 365 GAG GGT GGC Glu Gly Gly

ATG GTC ATG CCG GGC GAC AAC ACC GAG ATG CGC GTC GAG

Met Vai Met Pro Gly Asp Asn Thr Glu Met Arg Vai Glu 355 360 CCC GTC GCC ATG GAG GAG GGC CTG AAG TTC GCC ATC CGT Pro Vai Ala Met Glu Glu Gly Leu Lys Phe Ala Ile Arg 370 375 380 CGG ACC GTC GGC GCC GGC CAG GTC ACC AAG ATC GTC AAG TAA 1194

Arg Thr Vai Gly Ala Gly Gin Vai Thr Lys Ile Vai Lys 385 390 395 - 36

SEQ ID NO : 2 TIPO DE SEQUENCIA : Nucleótido oom proteína correspondente COMPRIMENTO DE SEQUENCIA : 1194 pares de base NS de BANDAS : dupla banda TOPOLOGIA : Linear TIPO DE MOLÉCULA : ADN Genómicos PONTE ORIGINAL : Streptomyces ramocissimus ESTIRPE : CBS 190.69 CARACTERISTICAS : de 1 a 1191 PR : sequência de codificação de 1 a 396 aa : proteína Tul do factor de alongamento por translacção PROPRIEDADE : gene Streptomyces ramocissimus tufl codificando o factor de alongamento por translacção. GTG GCG AAG GCG AAG TTC CAG CGG ACC ΛΛΛ CCG CAC GTC AAC ATC GGC '· 18 Ala Lys Ala Lys Phe Gin Arg Thr Lys Pro His Vai Asn Ile Gly 1 5 10 15 Λ C C ATC GCl CAC ATC CAC CAC GGC AAG ACC ACA CTC ACC CCG CCG ATC 96 Thr Ile Gi y 1 lis Ile Asp His Gly L.ys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile 20 25 30 ACG AAG GTG CTC CAC GAC CGG TTC CCC GAC CTC AAC CCG TTC ACC CCG Thi- l.ys Vai Leu Mis Asp Arg Phe Pro Asp Leu Asn Pro Phe Thr Pro * 35 '10 *15 TTC GAC CAG ATC GAC AAG GCG CCC GAG GAA CCG CAG CGC CJGC ATC ACC 192 Phe As p Gin Ile Asp Lys Ala Pro Glu Glu Arg Glu Arg Gly Ile Th ι- 50 55 60 ATC TCG ATC ccc CAC GTC GAG TAC CAG ACC GAG GCG CGG CAC TAC σσο 2*10 Ile Ser lie Ala His Vai Glu Tyr Gin Thr Glu Ala Arg His Tyr Ala 65 70 75 CAC GTC GAC TGC CCC GGA CAC GCC GAC TAC ATC AAG AAC ATG ATC ACC 280 !lis Va.l Asp Cys Pro Gly H i s Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Met Ile Thr SO 85 90 95 CGC GCG GCC CAC ATG GAC GGC CCG ATC CTG CTC GTC GCG GCC ACG GAC 336 Gly Alá ' Ala Gin Met Asp Gly Ala Ile Leu Vnl Vai Ala Ala Thr Asp 100 105 110 GGG CCG ATG CCC CAG ACC AAG GAA CAT GTG CTG CTG GCA CGG CAG GTG 38*1 Gly Pro Met Pro Gin Thr Lys Glu llis Vai Leu Leu Ala Arg Gin Vai 1.15 120 125 - 37 -

V

GGC GTG CCC TAC ATC GTC GTC GCG CTG AAC AAG ACC GAC ATG GTC GAC 432 Gly Vai Pro Tyr Ile Vai Vai Ala Leu Asn Lys Thr Asp Met Vai Asp 130 135 1*40 GAC GAG GAG ATC CTC GAA CTC GTG GAG TTG GAG GTG CGC GAG CTG CTC *180 Asp Glu Glu Ile Leu Glu Leu Vai Glu Leu Glu Vai Arg Glu Leu Leu 1*15 150 155 ACC GAG TAC GAG TTC CCC GGC GAC GAC GTC CCG GTC GTC AAG GTG TCG 528 Thr Glu Tyr Glu Phe Pro Gly Asp Asp Vai Pro Vai Vai Lys Vai Ser l60 165 170 175 GCG CTC AGG GCC CTG GAG GGC GAC CCC CGG TGG ACC CGG TCG GTA CTC 576 Ala Leu Arg Ala Leu Glu Gly Asp Pro Arg Trp Thr Arg Ser Vai Leu 180 185 190 GAA CTC CTC GAC GCC GTC GAC GAG TTC GTG CCC GAG CCG GTG CGG GAC 62*1 Glu Leu Leu Asp Ala Vai Asp Glu Phe Vai Pro Glu Pro Vai Arg Asp 195 200 205 GTC GAC CGG CCG TTC CTG ATG CCG ATC GAG GAC GTC TTC ACC ATC ACC 672 Vai Asp Arg Pro Phe Leu Met Pro Ile Glu Asp Vai Phe Thr Ile Thr 210 215 220 GGA CGC GGC ACG GTC GTC ACC GGC CGG ATA GAG CGC GGC ACG CTG AAC 720 Gly Arg Gly Thr Vai Vai Thr Gly Arg Ile Glu Arg Gly Thr Leu Asn 225 23O 235 GTG AAC ACC GAG GTG GAG ATC ATC GGC ATC CAC GAA CAG AGG ACC CGG 768 Vai Asn Thr Glu Vai Glu Ile Ile Gly Ile His Glu Gin Arg Thr Arg 2*10 2*45 25O 255 ACC ACG GTC ACC GGC ATC GAG ATG TTC CGC AAG CTC CTC GAC GAG GGC 816 Thr Thr Vai Thr Gly Ile Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Glu Gly 260 265 270 CGG GCC GGC GAG AAC GTC GGA CTG CTG CTG CGC GGA GTG AAG CGG GAG 86*1 Arg Ala Gly Glu Asn Vai Gly Leu Leu Leu Arg Gly Vai Lys Arg Glu 275 280 285 CAG GTC GAG CGC GGT CAG GTC GTC ATC AGG CCC GGA TCG GTC ACC CCG 912 Gin Vai Glu Arg Gly Gin Vai Vai Ile Arg Pro Gly Ser Vai Thr Pro 290 295 i 300 CAC ACG CAG TTC GAG GCG CAG GCG TAC ATC CTG TCC AAG GAC GAG GGC 96o His Thr'Gin Phe Glu Ala Gin Ala Tyr Ile Leu Ser Lys Asp Glu Gly 305 310 315 GGC CGG CAC ACG CCG TTC TTC GAG AAC TAC CGT CCG CAG TTC TAC TTC 1008 Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Glu Asn Tyr Arg Pro Gin Phe Tyr Phe 320 325 330 335 CGC ACC ACC GAC GTC ACG GGC GTG GTG ACG CTG CCG AAG GGC ACC GAG 1056 Arg Thr Thr Asp Vai Thr Gly Vai Vai Thr Leu Pro Lys Gly Thr Glu 3;40 3^5 350 38 1104

V

ATG GTG ATG CCG GGC GAC AAC ACC GCC ATG CAC GTC CAG CTG ATC CAG Met Vai Met Pro Gly Asp Asn Thr Ala Met His Vai Gin Leu Ile Gin 355 360 365 CCG ATC GCC ATG GAG GAG GGG CTG AAG TTC GCC ATC CGC GAG GGC GGC 1152

Pro Ile Ala Met Glu Glu Gly Leu Lys Phe Ala Ile Arg Glu Gly Gly 370 375 380 CGC ACG GTC GGC GCC GGC CAG GTC ACG CGG ATC GTG AAG TAG H9^

Arg Thr Vai Gly Ala Gly Gin Vai Thr Arg Ile Vai Lys 385 390 395 39

SBQ ID 10 : 3 ΪΓΡΟ DE SEQDBICIA s Nucledtido eom proteína correspondente ΟΟΜΡϋΙΜΕΜίΟ DE 'SEQDBICIA : 1194 pares d e nase E2 DE BjUTOAS í dupla banda lOPOiOGU : Linear ΪΙΡΟ DE MOLSOUIiA : ADI Gendtaicos ΕΟΙΪΕ ORIGIIAL : Streptomycea ramocissiams ESTIRPE ; DBS 190.69 .GARAGTERISTIOAS : de 1 a 1191 ps; sequência de codificação de 1 a 396 aa; proteína Tul do factor de alongamento por translacção PE0P1IEDADE : gene Streptomyces ramocissimus tufl codificando o factor de alongamento por translacçSo ATG TCC AAG ACG GCA TAC GTG CGC ACC ΑΑΛ CCG CAT CTG AAC ATC GGC *18 Ser Lys Thr Ala Tyr Vai Arg. Thr Lys Pro His Leu Asn Ile Gly 1 5 10 15 ACG ATG GGT CAT GTC GAC CAC GGC AAG ACC ACG TTG ACC GCC GCC ATC 96 Thr Mo t G,1y Il.i s Vai Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile 20 25 30 ACC AAG GTC CTC GCC GAG CGT GGC TCC GGG ACG TTC GTC CCG 1TC GAC 1*1*{ Thr Lys Vai Leu Ala Glu Arg Gly Ser Gly Thr Phe Vai Pro Phe Asp 35 *10 *15 CGC ATC GAC CGC GCC CCG GAG GAG GCC GCG CGC GGC ATC ACC ATC AAC 192 Arg Ile Asp Arg Ala Pro Glu Glu Ala Ala Arg Gly Ile Thr Ile Asn 50 55 60 ATC GCG CAC GTC GAG TAC GAG ACC GAC ACC CGG CAC TAC GCG CAC GTC 2*10 Ile Ala His Vai Glu Tyr Glu Thr Asp Thr Arg His Tyr Ala His Vai 65 70 75 GAC ATG CCG GGC CAC GCC GAC TAC GTC AAG AAC ATG GTC ACC GGC GCC 288 Asp Met Pro Gly His Ala Asp Tyr Vai Lys Asn Met Vai Thr Gly Ala 80 85 90 95 GCG CAG CTC GAC GGG GCG ATC CTC GTC GTC TCC GCG CTC GAC GGG ATC 336 Ala Gin Léu Asp Gly Ala Ile Leu Vai Vai Ser Ala Leu Asp Gly Ile 100 105 110 ATG GCG CAG ACC GCC GAA CAC GTC CTG CTC GCC CGG CAG GTG GGC GTC 384 Met Pro Gin Thr Ala Glu His Vai Leu Leu Ala Arg Gin Vai Gly Vai 115 120 125 - 40 -

GAC CAC ATC GTC GTC GCC CTC AAC AAG GCC GAC GCG GGC GAC GAG GAG 432 Asp His Ile 130 Vai Vai Ala Leu Asn 135 Lys Ala Asp Ala Gly Asp 14 0 Glu Glu CTC ACC. GAC CTC GTC GAG CTG GAG GTC CGC GAT CTG CTC TCC GAG CAC 480 Leu Thr 145 Asp Leu Vai Glu Leu 150 Glu Vai Arg Asp Leu 155 Leu Ser Glu His GO.C TAC GGC GGC GAC GGT GCC CCC GTC GTA CGG GTC TCG GGG CTG AAG 528 Gly 160 Tyr Gly Gly Asp Gly 165 Ala Pro Vai Vai Arg Vai I70 Ser Gly Leu Lys 175 GCG CTG GAG GGC GAC CCC AAG TGG ACG GCG TCC ATC GAG GCG CTG CTC 576 Ala Leu Glu Gly Asp 180 Pro Lys Trp Thr Ala 185 Ser Ile Glu Ala Leu Leu I90 GAC GCG GTG GAC ACC TAC GTG CCG ATG CCG GAG CGG TAT GTG GAC GCG 624 Asp Ala Vai Asp 195 Thr Tyr Vai Pro Met P-ro 200. Glu Arg Tyr Vai 205 Asp Ala CCG TTC CTG CTG CCC GTG GAG AAC GTG CTC ACC ATC ACC GGT CGG GGG 672 Pro Phe Leu 210 Leu Pro Vai Glu Asn 215 Vai Leu Thr Ile Thr Gly Arg Gly 220 ACC GTG GTC ACC GGA GCC GTC GAG CGG GGC ACC GTG CGC GTG GGC AAC 720 Thr Vai 225 Vai Thr Gly Ala Vai 230 Glu Arg Gly Thr Vai 235 Arg Vai Gly Asn CGG GTC GAA GTG CTC GGC GCC GGG CTG GAG ACC GTG GTC ACC GGC CTG 768 Arg 240 Vai Glu Vai Leu Gly 24 5 Ala Gly Leu Glu Thr Vai 250 Vai Thr Gly Leu 255 GAG ACG TTC GGC AAG CCC ATG GAC GAG GCG CAG GCC GGG GAC AAC GTG 816 Glu Thr Phe Gly Lys 260 Pro Met Asp Glu Ala 265 Gin Ala Gly Asp Asn Vai 270 - GCG CTG TTG CTG CGT GGG GTT CCG CGG GAC GCC GTA CGG CGT GGG CAT 864 Ala Leu Leu Leu 275 Arg Gly Vai Pro Arg Asp 280 Ala Vai Arg Arg 285 Gly His GTG GTC GCG GCG CCG GGG AGC GTG GTG CCC CGG AGT CGA TTC TCC GCG 912 Vai Vai Ala 290 Ala Pro Gly Ser Vai 295 Vai .Pro t Arg Ser Arg Phe 300 Ser Ala CAG GTG TAT GTG CTC TCG GCC CGC GAG GGC GGT CGT ACG ACT CCT GTC 960 Gin Vai Tyr 305 Vai Leu Ser Ala 310 Arg Glu Gly Gly Arg 315 Thr Thr Pro Vai ACC AGC GGG TAT CGG CCG CAG TTC TAC ATC CGT ACG GCG GAT GTG GTG 1008 Thr 320 Ser Gly Tyr Arg Pro 325 Gin Phe Tyr Ile Arg Thr 330 Ala Asp Vai Vai 335 GGG GAC"GTC GAC CTG GGG GAG GTG GGG GTC GCT CGG CCT GGG GAG ACG 1056 Gly Asp Vai Asp Leu 340 Gly Glu Vai Gly Vai 345 Ala Arg Pro Gly Glu Thr 350 41

GTT TCG ATG ATC GTC GAG TTG GGC CGG GAG GTT CCG CTG GAG CCC GGG Vai Ser Met Ile Vai Glu Leu Gly Arg Glu Vai Pro Leu Glu Pro Gly 355 360 365 1104

TTG GGG TTC GCC ATT CGT GAG GGC GGC AGG ACC GTG GGG GCG GGG ACC Leu Gly Phe Ala Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Vai Gly Ala Gly Thr 370 375 38O 1152 GTT ACG GCC CTT GTG TGA Vai Thr Ala Leu Vai385 1170 - 42 -

SBQ ID 10 í 4 PIPO BB SBQUSNCIA : Nuoleétido OOmiMBM-O BB SEQUÊNCIA t 35 nucleétidos Nâ de bandas í banda dniea PGPOLOGIA : Linear PIPO Bl MOLÉCULA s ABI sintético PEOPIillBABE : Gligomioledtido alterando o eodão para ala-nina 37S do gene S.raaoelgsimtus Srtufl para valina* GCGACC02CA GG3APGAGGA ACPIOAGGGC CPC 33 - 43 -

SEQ IB m Í 5 ΪΙΡΟ BE SEQUÊNCIA í Nucleétido OOMHIMEffiEO BE SEQUSNOIA ; 33 micledtiáos NS BE BANDAS : banda dniea lOPOBOGIA ϊ linear ΪΙΡΟ DE MOLÉCULA : ADS sintético PROPRIEDADE 5 Oligonncleátido alterando o codâo para alanina 378 do gene Saratnocissimue Srtufl para treonine. GCCACCCICA OSOAIOSISA ACSÍEOAGGCC CIO 33 - 44

SBQ IB HO t 6 ΪΙΡΟ BE SEQUENCIA í lucledtldo COMPRIMENTO ΊΜ SEQUMCIA s 33 naoledtidos HS BE BAMBAS s banda única TOPOLOGIA i Linear TIPO BE MOLÉCULA t ABI sintético PROPRIEBABE ; Oligonueledtido alterando o codão para ala-nina 378 âo gene e>ratnociasinms Srtufl para proiina GCCACCCICA CGGATCGGGA AGTTGAGGGC GTC 33 - 45 -

SEQ IBKO i 7 ΪΪΡΟ BE SEQUBHCIA í Hueleétido G0I5PEIMM20 BB SBQBBIQIA í 33 nucleéiiâos

Jf* de BAIMS j Banda ánica Ϊ0Ρ0Β0&ΙΑ i Mnear ΪΙΡΟ BE I-lOIiECUM ϊ ABI sintético PROPRIEDADE i Oligonueleátido alterando o codão pai® ala-iiina 378 do gene S.ramooisaiíaus Srtufl para fenilalanina;

GrOCACCGIGA CGC-AIGAÃGAA GEiDCAGGGC GSC 33 - 46 -

Claims (2)

1. HEIVnroiOAQÕES - 16 - Processo para a preparação d© um aotinomioeta produtor de elfamioina que expressa um PA-ÍPuR (Pactor de Alongamento lu) resistente à elfamioina oarac-terizado por compreender as seguintes fases: 1. olonar-se o gene tuf de um aotino-mioeta produtor de elfamioina, 20 aplicar-se a mutagénese dirigida a locais no referido gene tuf, alterando assim o gene tuf que codifica um PA-Tu sensível à elfamioina no gene tufR que codifica uma PA-TuR resistente à elfamioina. 3. construir-se um vector contendo o gene tufR ou uma parte dele, 4. transformar-se um aotinomioeta produtor de elfamioina por introdução nele do referido vector, 5. esoolh.er-se o referido transfor-mante para integração do referido vector no local de tuf, oromossdnioo, pelo seu fenotipo resistente à elfamioina.
2. - 2& - Processo de aoordo com a reivindicação 1 caraoterizado por se obter uma proteína PA-TuR em que a elfamioina é a mocimicina (oirromicina). - 47 -

   « %à * iírocess© á© acordo oo« a» reivindi* oapB»* l m 2 «aroaterisodo por m obtor vm protoífl* Μ·*ϊιίΗ $&*» quando ensaiada iiua eiatoo» ΐβοοΐο d* ©éiula* gaua a alai»»*!, dst polif«ii£l$loti£8ft dirigida * p©XI(U}, tm a»» «etiridad# tsuMaaÚL $B §®μ mm hoío ®o»t«iíâe peio *t-«o* * *S pwf litro 4« tteeieieine* de proftoei&eia pelo *»»&» 160 «g por litro de «TOMAIS*· «·* 4« ·* Praeeseo ã» aoord© eo» <pal$uer d«* mlviRãim^nm H3 eoreotosisado por #« ebtor «too protelo* m %w o mtÊmmlmtm é na *atropto*iioetftf âe profostnolft «*i* prof*ri**l~ «»*· 1^1¾¾^ ®* w.«&. m §® -** $rooeero de eioorâo eoa qualquer doo r«lvisâi©aç5t» X a 4 oaraoterizsdo por e* obter tt«* protei-fía ?â«$aa $o« oo&olst# mm m%mêmíM de aeinoíoidoe oorroí poaâente mm poio mm» 89$ à roprooootoda no Figura i doe doeoohoo osoxos* «* «* Proeeeso i» aaexáo oo« » roivisdicoql© 5 cor«ot«risa&& por ee obter mm protele* fâ-fol mm %m m mlmnlm oi poe£§Io 3 fâ o» na peaigSe eosreepo&deate **«« *mma proteína boedloga, d oubotitui#* por ▼*!£&«* tveoalne* proliot ou foft-llaleoSit** m • 1* * Imsmm para t pmpamçUo de uee elf&taiolaa eavsstsrlesft* por * ferweniagl© de m ecti&offileets euacegtiirel de pre&tsi? m» elfasieina * m$& mtlnomlmt* â 2*eaiet««ie a assa «©«ΜΐΏΝφΧ» de alfa· sjioiRa de peie aeoos %Z gA# de preferfoela ô»2 a 3t*0 g/3U » si «. Prece»»© de acordo cos m reiYiaditm-çlo 7 oeraotarisedo por eo oOter uee «Ifeeicin» %ue é a aoeiaiolofi* m 9» *» Proceeeo de acordo coe «e reivicdlo*-$8es 7 ou 8 earaeterisadc por o aotiísoaieet* ser u« «etrep-toaic«t«, 4« ps»f*rtnoia Stg8Bt3wo»».CTao»l«al»g». â ref&areate reiirisiioa a prioridade d© pedido de p&teste Europeia apreeestsdo *« 10 de daiho de 1990« eob o li 9© 2&2â$i.4. MeOoa. 10 de «ful&e de 1991 Q AGBHXE onCUL ©A FK©?SE:>A»E ΕΦΓδΤΒΙΑΙ.

   - 49