KR20010112931A - α-Ｌ-아스파틸-Ｌ-페닐알라닌의 미생물학적 제조방법 - Google Patents

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홀란드 스위트너 캄파니 브이. 오. 에프.
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Abstract

본 발명은 유효량의 아데노신-트리포스페이트(ATP)의 존재하에서, 기질이 하나의 축합 도메인에 의해 연결되는 2개의 최소모듈을 포함하는 리보솜외 디펩티드 합성효소와 접촉하며, 상기 모듈의 N-말단 모듈은 L-Asp를 인식하고, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-Phe를 인식하고 그의 N-말단부에서 축합도메인과 공유결합하며, 상기 최소모듈 각각은 티올화 도메인을 함유하는 4'-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성되며, 형성된 Asp-Phe가 회수되는 것을 특징으로 하는, 기질 L-아스파르트산(L-Asp) 및 L-페닐알라닌(L-Phe)으로부터 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌(Asp-Phe)을 미생물학적으로 제조하는 방법 및, Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합, 상기 DNA 단편을 함유하는 미생물 뿐만 아니라 Asp-Phe 디펩티드 합성효소에 관한 것이다.

Description

α-Ｌ-아스파틸-Ｌ-페닐알라닌의 미생물학적 제조방법{MICROBIOLOGICAL PRODUCTION METHOD FOR α-Ｌ-ASPARTYL-Ｌ-PHENYLALANINE}
α-L-아스파틸-L-페닐알라닌(이하에, Asp-Phe라고 함)은 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(이하에 APM이라고 함)를 제조하기 위해 사용되는 중요한 디펩티드이다. APM은 수크로스의 단맛보다 약 200배의 단맛을 갖는 고강도 인공감미료인 것으로 알려져 있다. APM의 β-형태 뿐만 아니라, 아미노산중 하나 또는 둘 모두 D-배위로 있는 APM의 입체이성질체는 감미특성을 가지지 않는다. APM은 여러 식용물질의 감미료로 사용된다.
APM을 제조하는 여러 방법들이 존재하는데; 현 경로는 화학적 및 생화학적/미생물학적(특히, 효소적) 경로로 나누어질 수 있다. 공지된 펩티드합성방법을 사용하여 APM을 제조하는 방법에서, 선택적인 α-L,L-결합을 이루기 위해 α-아미노, 카르복실 및 측사슬기를 강하게 보호하고, 탈보호하는 것을 포함하는 장황하고, 비싼 방법이 수행되었다. 한편, 발효경로는 보통 저렴하며, 본질적으로 거울상이성질선택성 및 위치선택성을 나타낸다. 그러므로, 발효경로는 상기 화학적 및 생화학적 경로에 대한 대안으로서 생각되었다. EP-A-0036258에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기는 미생물의 단백질제조과정의 일부로서 미생물내에서 디펩티드 Asp-Phe를 제조하기에 부적합한 것으로 여겨졌으며; 이론적으로는, 상기 제조방법은 뉴클레오티드 염기서열 GAC 또는 GAT(L-Asp에 대한 코돈으로 알려짐) 및 TTT 또는 TTC(L-Phe에 대한 코돈으로 알려짐)를 미생물의 DNA에 삽입함으로써 수행되고, 처리되며, 그후에 적당히 처리하거나, 또는 정확한 조절하에서 정확한 리딩프레임내 코돈을 종결시킨다. 그러므로, EP-A-0036258에서는 일반식 (Asp-Phe)n(여기에서, n은 대수임)의 단백질 세그먼트를 제조하기 전에 Asp-Phe를 간접 합성하였으며; 이는 상기 폴리(Asp-Phe)를 코딩하는 합성된 DNA-단편을 클로닝 부형제에 삽입함으로써 실시되었다. 그러나, 상기 리보솜 발효경로는 여전히 길며, 경제적으로 매력적이지 않다. 주요 단점은 폴리펩티드로부터 Asp-Phe 디펩티드를 회수하는데 있다. 유사한 단점은 트리펩티드 서열 Asp-Phe-Lys의 세그먼트를 포함하는 폴리펩티드가 합성되는 Choi, S.-Y 외 다수의 J. Microbiol. Biotechnol., 2, 1992, p.1-6에 기술된 방법에 공헌될 수 있다.
그러므로, Asp-Phe로의 직접적인 발효경로를 발견할 필요가 있다. Asp-Phe의 직접 발효는 아직까지 알려져 있지 않다.
본 발명은 기질 L-아스파르트산(L-Asp) 및 L-페닐알라닌(L-Phe)으로부터 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌(Asp-Phe)을 제조하기 위한 미생물학적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, Asp-Phe 디펩티드 합성효소 자체 뿐만 아니라 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합, 상기 DNA 단편을 함유하는 미생물에 관한 것이다.
ASP-PHE의 제조방법:
본 발명자들은 기질 L-아스파르트산(L-Asp) 및 L-페닐알라닌(L-Phe)으로부터 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌(Asp-Phe)을 제조하기 위한 선택적인 미생물학적 방법을 발견하였는데, 여기에서 기질은 유효량의 아데노신-트리포스페이트(ATP)의 존재하에서 한개의 축합 도메인에 의해 연결된 두개의 최소 모듈(minimal module)을 포함하는 리보솜외(non-ribosomal) 디펩티드 합성효소와 접촉하며, 상기 모듈의 N-말단 모듈은 L-아스파르트산을 인식하며, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-페닐알라닌을 인식하고, 그의 N-말단에서 축합도메인에 공유결합되고, 상기 최소 모듈 각각은 티올화 도메인을 함유하는 4'-포스포판테테이닐(4'-phosphopantetheinyl) 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성되어 있으며, 형성된 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌 (Asp-Phe)을 회수한다.
상기 방법은 이후의 메틸화 단계에서 강한 감미료 아스파탐으로 전환되는 Asp-Phe를 직접 발효하기 위한 미생물학적 방법을 제공한다. 직접 발효에 의한 Asp-Phe의 제조예는 상기 디펩티드의 리보솜외 합성이기 때문에 지금까지 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 특정 보호단계 및 탈보호단계의 필요없이 디펩티드 Asp-Phe를 직접 제조하는 미생물학적 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 Asp-Phe를 제조하기 위해 사용될 수 있는 리보솜외의 디펩티드 합성효소는 또한 이후에 Asp-Phe 디펩티드 합성효소 또는 Asp-Phe 합성효소라고한다. (예를 들어, P. Zuber 외 다수의 "Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria", Sonenshein 외 다수의 (Eds.), Am Soc. Microbiol., Washington, DC, 1993, p.897-916)에는 미생물이 리보솜 및 리보솜외 기작을 통해 생물활성 펩티드를 제조할 수 있다고 공지되어 있다. 리보솜외에서 합성되는 것으로 지금까지 알려진 생물활성 펩티드는 여러 개의 토양균 및 균류에 의해 제조된다. 상기 생물활성 펩티드는 2 내지 48개의 잔기가 배열될 수 있으며, 구조적으로 다양하다. 이들은 항생, 항균 또는 항암 활성, 또는 면역억제 또는 효소-억제 활성을 포함하는 광범위한 생물학적 특성을 나타낸다. 상기에서와 같이, 상기 리보솜외에서 합성된 생물활성 펩티드는 의학, 농업학 및 생물학 연구에서 널리 사용되는 펩티드 이차 대사물질류를 형성한다. 이미 300개 이상의 다른 잔기들이 상기 펩티드 이차 대사물질에 첨가되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 지금까지 (그의 펩티드 서열의 일부로서) 디펩티드 Asp-Phe를 갖는 단일 리보솜외에 형성된 펩티드는 확인되지 않았으며, 디펩티드 Asp-Phe 자체도 리보솜외에서 합성된 생성물로서 확인되지 않았다.
본 발명에 따라, Asp-Phe는 리보솜외에서 생성될 수 있으며, 리보솜외 Asp-Phe 합성효소가 Asp-Phe를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 이후에는, Asp-Phe 합성효소를 코딩하는 DNA-단편을 다루는 명세서의 일부에서, 상기 Asp-Phe 합성효소가 제조될 수 있는 방법 및 본 발명의 명세서에서 유용하게 제조되는 방법을 보다 상세히 설명할 것이다. 그러나, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 우선 리보솜외 펩티드 합성을 위한 일반적인 배경이 개시된다.
공지된 펩티드의 리보솜외 합성에는 다중 운반체 티오템주형(thiotemplate) 기작이 포함된다(T. Stein 외 다수, J. Biol. Chem. 271, 1996, p.15428-15435). 상기 모델에 따라, 펩티드 결합 형성은 펩티드 합성효소라고 하며, 아미노산 인식모듈의 서열을 포함하는 다중-효소 복합물상에서 일어난다. 펩티드 합성효소상에서, 동종 아미노산을 인식하는 모듈의 순서에 의해 예정된 순서로 아미노산을 펩티드로 순차적으로 형성시킴으로써 펩티드를 형성시키는 일련의 효소반응이 일어난다. 상기 일련의 효소반응은:
1. 아미노산 기질을 인식하는 반응;
2. Mg2+-ATP 소모시에 상기 인식된 아미노산 기질을 그의 아미노아실-아데닐레이트(즉, 아미노아실 아데노신-모노포스페이트; aa-AMP)로 활성화하는 반응(아데닐화);
3. 보다 안정한 티오에스테르 형태의 아미노아실-아데닐레이트를 효소-결합된 4'-포스포판테테이닐(4'-PP) 보조인자의 시스테아민기에 결합시키는 반응(티올화), 상기 아데닐화 반응에서 소모된 ATP는 모노포스페이트 형태(AMP)로 방출됨;
4. 리보솜외에서 합성되는 펩티드에 따라, 티올-활성화 기질은 (에피머화 또는 N-메틸화에 의해) 변형되는 반응;
5. (경우에 따라, 변형된) 티오에스테르화 기질 아미노산을 성장 펩티드로 N 대 C 단계별 삽입에 의해 펩티드 생성물을 형성하는 반응;
6. 주형으로부터 리보솜외 형성된 펩티드를 방출하는 반응을 포함한다.
상기 일반적인 순서가 본 발명에 따른 Asp-Phe의 리보솜외 합성에 대해서도 정확하다고 가정하면, 이는 상기 합성단계가 (ⅰ)L-Asp 및 L-Phe를 인식하는 단계, (ⅱ)L-Asp-아실아데닐레이트 및 L-Phe-아실아데닐레이트의 형성단계, (ⅲ)각각의 티올화 도메인내 4'-PP 보조인자의 시스테아민기로의 결합단계, (ⅳ)축합생성물이 Phe-인식 모듈의 티올화 도메인내 4'-PP 보조인자를 통해 다중-효소 복합물에 공유결합되면서, L-Asp의 티오에스테르-활성화 카르복실기를 L-Phe의 아미노기로 전이시킴으로써 Asp-Phe 디펩티드를 형성하는 단계 및 (ⅴ)형성된 Asp-Phe의 방출단계를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명에 따라, 기질 L-Asp 및 L-Phe는 유효량의 ATP의 존재하에서 리보솜외 Asp-Phe 디펩티드 합성효소와 접촉한다. 여기에서 유효량의 ATP는 적당한 속도로 디펩티드 형성반응이 일어나도록 하는 ATP의 양을 의미한다. 보통, 상기 속도는 분당 적어도 하나의 대사회전수(turn-over number), 즉 분당 1의 대사회전수(kcat); 바람직하게는 kcat는 분당 적어도 10일 것이다. 경제적으로 매력적인 방법이 되도록 펩티드 합성반응에 의해 소모된 ATP는 재생되는 것이 바람직하다.
기질 L-Asp 및 L-Phe와 리보솜외 Asp-Phe 디펩티드 합성효소와의 반응은 적당한 방법으로 실시될 수 있는데; 예를 들어 Asp-Phe 디펩티드 합성효소가 미생물내에 존재한다면, L-Asp와 L-Phe는 상기 미생물을 함유하는 배양배지로 주입될 수 있다. 선택적으로는 미생물에 의해 생성되지 않는 아미노산(L-Asp 또는 L-Phe)을미생물에 각각 공급하면서 (예를 들어, 글루코스로부터) L-Asp 및/또는 L-Phe를 과잉생성할 수 있는 미생물을 사용한다. 상기 모든 방법은 생체내 방법으로 불리운다. ATP는 Asp-Phe 생성 미생물내에서 생체내 재생된다.
기질 L-Asp 및 L-Phe와 리보솜외 Asp-Phe 디펩티드 합성효소와의 반응은 분리형태의 합성효소를 사용함으로써, 즉 시험관내 방법에 의해 실시될 수도 있다. 상기 시험관내 방법에서, ATP-재생은 개별적으로 일어난다. 이는 ATP-재생 시스템을 적용함으로써 실시된다. ATP-재생 시스템은 당업자가 쉽게 사용할 수 있다.
세균 및 균류 기원의 펩티드 합성효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하고 시퀀싱하는데 있어서 단백질 화학 연구 및 최근의 진행상황은 공지된 펩티드 합성효소가 고도로 보존되고, 소위 모듈로 조성된 서열화 구조를 가진다는 것을 명확히 해준다. 상기 모듈은 기질의 인식, 활성화 및 변형에 필요한 모든 정보를 운반하는 펩티드 합성효소내 반-자율 단위로서 정의된다. 상기 모듈은 본래 독립적으로 작용할 수 있지만, 보통 펩티드를 연장시키기 위한 주형-기초된 방법에서 작업해야하는 것으로 가정된다.
보통, 각 모듈이 약 1000-1400개의 아미노산(즉, 모듈은 120-160 kDa 범위의 분자량을 가짐)의 길이를 갖는 펩티드 합성효소의 모듈은 기질 인식, 활성화, (및, 선택적으로는 변형) 및 축합화(즉, 펩티드 결합형성)에 포함되는 효소활성을 특이적으로 나타내는 보존 도메인의 선형 배열로서 자체 조성되어 있다. 상기 각 도메인 중 둘, 아데닐화 및 티올화 도메인(A-도메인 및 T-도메인)은 함께 아미노산 기질의 특이적 활성화 및 공유결합을 위한 모든 촉매활성을 보유하는 모듈의 최소일부를 형성한다. Stachelhaus 외 다수는 "최소 모듈"로서 상기 모듈의 코어 단편을 제조하였다(T. Stachelhaus 외 다수, J. Biol. Chem. 270, 1995, p.6163-6169).
따라서, 이하에서 "최소 모듈"이란 용어는 상기 정의에 따라 아데닐화 도메인 및 티올화 도메인으로 구성된 모듈의 상기 조합된 코어 단편을 의미한다.
펩티드 합성효소내에 존재하는 것으로 알려진 아데닐화 및 티올화 도메인의 고도로 보존된 코어 모티프(core motif)는 (본 명세서의 후반부에서 보다 상세히 설명될) 축합 및 티오에스테라제 도메인의 고도로 보존된 코어 모티프와 함께 표 1에 개시된다.
"아데닐화 도메인"(A-도메인, 약 550개의 아미노산)은 각 모듈의 필수 영역이다. A 도메인은 기질-인식 및 ATP-결합자리를 함유하는 것으로 나타났으며, ATP 가수분해를 통해 그의 아실 아데닐레이트로서 인식된 아미노산을 활성화시키기 위해 단독으로 반응할 수 있다(T. Stachelhaus 외 다수, J. Biol. Chem. 270, 1995, p.6163-6169).
공지된 펩티드 합성효소의 촉매 도메인의 고도로 보존된 코어 모티프(소스: M. Marahiel 외 다수, Chem. Rev. 97, 1997, p.2651-2673)
도메인 코어주:괄호안에 종래의 명명이 제공됨 콘센서스 서열
아데닐화 A1A2(코어 1)A3(코어 2)A4A5A6(코어 3)A7(코어 4)A8(코어 5)A9A10 L(TS)YxELLKAGxAYL(VL)P(LI)DLAYxxYTSG(ST)TGxPKGFDxSNxYGPTEGELxIxGxG(VL)ARGYLY(RK)TGDLGRxDxQVKIRGxRIELGEIELpxYM(IV)PNGK(VL)DR
티올화 T(코어 6) DxFFxxLGG(HD)S(LI)
축합 C1C2C3C4C5C6C7 SxAQxR(LM)(WY)xLRHExLRTxFMHHxISDG(WV)SYxD(FY)AVW(IV)GxFVNT(QL)(CA)xR(HN)QD(YV)PFERDxSRNPL
티오에스테라제 TE G(HY)SxG
펩티드 합성효소의 아데닐화 도메인의 첫번째 3D 구조(PheA 내지 GrsA)는 보고되어 있다(E. Conti 외 다수, EMBO J. 16, 1997, p.4174-4183). 상기 구조는 모든 고도로 보존된 코어모티프가 기질이 결합된 활성자리 주위에 위치되어 있다는 것을 보여준다. 기질-결합 포켓을 생성하는데 포함되는 주 잔기들은 모두 부여되었으며; 이들은 코어 모티프 A3과 A6사이에 위치되어 있는 것으로 발견되었으며, 고도로 보존되어 있지 않았다.
모듈의 A-도메인은 모듈의 특이성을 결정하는데 매우 중요하다. 모듈의 "특이성"이라는 용어는 모듈이 다른 아미노산위의 한 아미노산 또는 상기 다른 아미노산을 인식하는데 있어서 우선함을 가진다는 것을 의미한다. 물론, 모듈 주위에 존재하는 각 아미노산의 농도는 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 특정 아미노산의 농도가 (대부분의) 기타 아미노산의 농도보다 매우 높으면, 특이성을 위한 요건은 다소 덜 엄격하다.
소위 "티올화 도메인"(T-도메인, 약 100개의 아미노산; 또한, 펩티딜 운반 단백질(PCP)이라고도 함)은 아데닐화 도메인의 직접적인 하류에 위치되어 있는 도메인이다. 이는 펩티드 합성효소의 필수부분을 형성하며, 4'-PP 보조인자 결합 및 기질 아실화의 자리이다. T-도메인내에서, 4'-PP는 고도로 보존된 티올화 코어 모티프내에 위치된 비변형 세린잔기의 측사슬에 공유결합된다(표 1 참조). 펩티드 합성효소의 모듈내에서 T-도메인이 그의 4'-PP 보조인자를 운반하지 않는 경우에는, 아미노아실 기질의 공유결합은 일어나지 않으며, 사슬연장은 불가능할 것이다.
지금까지 공지된 펩티드 합성효소에서, 모든 T-도메인은 조효소 A(CoA)로부터 상기 세린잔기의 측사슬로 4'-PP 성분을 이동시킴으로써 비활성 아포(apo) 형태로부터 활성 홀로(holo) 형태로 전환된다. 각 T-도메인의 상기 후-해독 프라이밍은 최근에 발견된 효소 상과의 펩티드 합성효소 특이 요소인 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제에 의해 매개된다. 이들은 통상적인 기질로서 CoA를 사용하며, 단백질/단백질 상호반응을 통해 특이성을 얻는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법에 사용되는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소는 L-Asp를 인식하는 그의 N-말단부에서 하나의 최소 모듈 및 L-Phe를 인식하는 그의 C-말단부에서 다른 최소 모듈, 즉 2개의 최소 모듈을 포함한다. "최소 모듈"이라는 용어는Stachelhaus 외 다수의 J. Biol. Chem. 270, 1995, p.6163-6169에 개시된 의미와 같은 의미로 사용된다.
상기 최소 모듈 각각은 아데닐화 도메인(A-도메인) 및 티올화 도메인(T-도메인)으로 조성된다.
그리고, 본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 2개의 최소모듈은 Phe-모듈의 폴리펩티드 사슬, 즉 그의 N-말단부에 공유결합될 필요가 있는 소위 축합 도메인에 의해 연결된다. 그러나, 상기 2개의 최소 모듈이 단일 폴리펩티드 사슬상에 위치될 필요가 없기 때문에, 축합 도메인은 두개의 최소 모듈(즉, L-Asp 및 L-Phe 각각을 인식하는 모듈)에 공유결합될 필요가 없다. "연결된"이라는 용어는 축합 도메인이 두 최소 모듈을 협력하여 동작할 수 있도록 한다는 것을 의미한다.
공지된 펩티드 합성효소에서, 축합 도메인은 중간에 보존된 영역으로서 발생한다. 축합 도메인(보존 영역)은 약 400개의 아미노산 잔기로 구성되며, 리보솜외 펩티드 형성을 촉매하는데 포함되는 것으로 알려져 있다. 보존된 코어 모티프 중 하나는 촉매적으로 활성인 히스티딘 잔기를 함유한다. Stachelhaus 외 다수의 J. Biol. Chem. 273, 1998, p.22773-22781을 참조한다.
형성된 Asp-Phe는 당업자가 사용가능한 방법에 의해 반응매질로부터 회수될 수 있다.
디펩티드 합성효소내 축합 도메인은 L-Asp를 인식하는 모듈에 공유결합되는 방법으로 두 최소 모듈에 연결되는 것이 바람직하다. 상기 경우에, 축합 도메인은 L-Phe 인식 모듈의 N-말단부에 공유결합될 뿐만 아니라, L-Asp 인식 모듈의 C-말단부에 결합되며, L-Asp 및 L-Phe 인식 모듈을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬의 일부를 형성한다.
리보솜외 펩티드 합성의 특징은 주형위에서 형성된 펩티드가 펩티딜-(4'-PP)-T-도메인 중간물질로서 C-말단 모듈의 T-도메인에 공유결합된다는 사실이다. 상기 중간물질로부터 펩티드의 방출은 순 가수분해를 일으키는, 물에 의한 분자간 공격에 의해, 또는 고리형 펩티드 생성물을 생성하는 펩티드 사슬 자체 및 홀로 형태의 펩티드 합성효소의 히드록실기 또는 아미노기에 의한 분자간 포획에 의해 일어나는 것으로 가정된다. 첫번째 종결경로는 (본 발명에 따른 Asp-Phe 합성의 경우에)자유 C-말단 카르복실기를 갖는 선형 펩티드를 수득한다.
Asp-Phe는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 주형에 결합된 중간물질 형태로 존재하기 때문에, 상기 주형으로부터 Asp-Phe의 방출을 증가시키기 위해 추가로 측정하는 것이 유리하다.
그러므로, 방출인자는 펩티드 합성효소상에서 형성된 Asp-Phe를 위해 존재하는 것이 특히 바람직하다. "방출인자"라는 용어는 합성효소위에서 형성된 Asp-Phe의 합성효소로부터의 방출을 증가시키는 합성효소의 일부 또는 그와 조합하여 존재하는 효소를 의미한다.
성장하는 펩티드 사슬로 최종 아미노산을 혼입시키는 모든 공지된 세균 및 일부 균류 펩티드 합성효소 모듈은 티오에스테라제-유사 기능을 갖는 영역을 나타낸다. 약 250개의 아미노산의 상기 영역은 아미노산 인식 모듈의 C-말단부에 위치되어 있다. 상기 티오에스테라제-유사 영역은 티오에스테라제-유사 단백질과 상동성을 나타내는 통합영역이며, 티오에스테라제 도메인((통합된) TE-도메인)으로도 언급된다. 상기 모든 통합된 TE-도메인은 코어 모티프 GxSxG의 일부인 활성 자리 세린 잔기를 함유한다(표 1 참조).
최근의 연구는 상기 통합된 TE-도메인이 사슬 연장 및 생성물 방출의 종결에 포함된다는 이론을 지지한다. 예를 들어, 서팩틴(surfactin) 합성효소로부터 완전한 TE-도메인의 결실은 생체내 서팩틴 생성을 97% 감소시킨다(Schneider A, 외 다수, Arch. Microbiol., 169, 1998, p.404-410). 그리고, 상기 통합된 TE-도메인을 서팩틴 합성효소의 모듈 7의 C-말단으로부터 모듈 4 및 5의 C-말단으로 대체시키면, 대응하는 리포테트라-펩티드 및 펩타펩티드가 형성된다는 것을 볼 수 있다. 또한, 상기 연구에서, 통합된 TE-도메인을 제거하면, 펩티드 합성을 거의 완전히 감소시켰다(Ferra F de, 외 다수, J. Biol. Chem. 272, 1997, p.25304-25309).
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 방출인자는 티오에스테라제-유사 기능을 나타내고, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합된 도메인을 형성하는 단백질이다.
그리고, Asp-Phe를 제조하기 전에 Asp-Phe 디펩티드 합성효소는 하나 이상의 후-해독 변형활성을 사용하여 그의 기능에 대해 최적화시키는 것이 바람직하다. 이는 Asp-Phe의 가장 유효한 리보솜외 합성을 이루는데 유용하다.
상기 사용된 Asp-Phe의 유효한 리보솜외 합성을 위한 "후-해독 변형활성"이라는 용어는 그의 Asp-Phe 합성기능을 포지티브하게 발휘함으로써 형성후 디펩티드 합성효소를 변형시키는 특정 활성을 포함하여 의미한다.
특히, 본 발명에 따른 Asp-Phe의 제조에 있어서, 사용된 후-해독 변형활성은 4'-포스포판테테이닐(4'-PP) 트랜스퍼라제이다. 4'-PP 트랜스퍼라제는 펩티드 합성효소의 아포-효소를 홀로-효소로 유효하게 전환시키기 위해 제공하며, T-도메인의 코어 모티프내 세린 측사슬에 4'-PP 보조인자를 부하함으로써 Asp-Phe의 제조시에 Asp-Phe의 수율을 높인다. Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 두 T-도메인에서 아포-효소의 적어도 10%가 홀로-형태로 전환되는 경우에, 아포-효소가 홀로-효소로 유효하게 전환된다.
본 발명에 따른 Asp-Phe의 제조예에 있어서, 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비-통합형 단백질이 디펩티드 합성효소와 함께 존재하는 것이 특히 바람직하다. 상기 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 단백질은 식물기원의 타입-Ⅱ 지방산 티오에스테라제와 강한 서열 상동성을 갖는 단백질이다. 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 상기 비-통합형 단백질은 통합형 티오에스테라제(TE-도메인)와 다르다. 최근의 논문(Schneider 외 다수, Arch. Microbiol. (1998), 169, 404-410)에는 서팩틴 합성효소 오페론으로부터 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 상기 비-통합형 단백질을 코딩하는 유전자를 결실시키면, 펩티드 제조가 84% 감소된다는 것이 나타나 있다. 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비-통합형 단백질은 4'-PP 보조인자에서 부정확한 아미노아실기 또는 바람직하지 않은 아실기에 의해 차단된 비-충진 모듈의 유리를 통한 재활성화에 의해 리보솜외 펩티드 제조를 향상시킨다는 것이 제시된다.
티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비-통합형 단백질을 코딩하는 유전자는 펩티드 합성효소 코딩 오페론의 5'- 또는 3'-말단에 위치될 수 있다. 상기 단백질은 25-29 kDa의 분자량을 가지며, 길이가 약 220-340개의 아미노산 잔기이며, 활성자리를 형성하는 것으로 추정되는 서열 GxSxG를 운반한다. 지금까지 알려진 거의 모든 원핵 펩티드 합성효소 코딩 오페론에서 상기 구별된 유전자가 발견되었다는 것에 주목한다.
본 발명에 따른 Asp-Phe의 제조예에서, Asp-Phe 디펩티드 합성효소는 미생물의 생세포-물질내에 존재하는 것이 바람직하며, 글루코스, L-Asp 및/또는 L-Phe는 상기 발효조에 공급되고, 형성된 Asp-Phe는 회수된다. 본 명세서에서 사용되는, "글루코스"라는 용어는 생세포물질내에서 ATP를 재생하고, 상기 생세포물질에 필요한 에너지를 유지하는데 필요한 글루코스 및 기타 에너지원을 포함하여 의미한다. 그리고, 글루코스(또는 기타 에너지원)는 본 발명의 방법에서 생세포내에서 생성되는 L-Asp 및/또는 L-Phe를 제조하기 위한 출발물질로서 사용된다.
당업자는 적당한 질소원, 염, 미량원소 및, 비타민 및 아미노산과 같은 기타 유기성장요소의 존재에 필요한 적당한 온도 및 pH 조건하에서 글루코스, L-Asp 및/또는 L-Phe를 Asp-Phe를 제조하는데 사용되는 발효조 또는 다른 종류의 (효소)반응기에 공급한다는 것을 알 것이다. 형성된 Asp-Phe는 회수된다. 상기 회수는 공정중에 또는 종반에 일어난다.
생세포물질은 당업자가 사용할 수 있는 적당한 형태로 존재한다. 예를 들어, 전체 세포들은 상기와 같이 또는 부동화 형태로 사용된다. 미생물은 본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소가 안정하게 발현될 수 있는 미생물 종류이면된다. 적당한 미생물은 예를 들어, (a)리보솜외 합성을 통해 펩티드를 제조하는 미생물, 가령 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species), 바실루스 종(Bacillus species), 악티노마이세스 종(Actinomyces species), 마이크로코커스 종(Micrococcus species), 노카르디아 종(Nocardia species)과 같은 세균류, 또는 톨리포클레디움 종(Tolypocladium species), 푸사리움 종(Fusarium species), 페니실륨 종(Penicillium species), 아스퍼길루스 종(Aspergillus species) 및 코클리오볼루스 종(Cochliobolus species)과 같은 균류; 또는 (b)아미노산, 특히 L-Asp 및/또는 L-Phe를 산업적인 규모로 제조할 수 있는 미생물, 가령 E.coli와 같은 에스케리키아 종(Escherichia species) 및 시.글루타미쿰(C.glutamicum)과 같은 코리네박테리움 종(Corynebacterium species)이다.
미생물은 당업자에 의해 쉽게 발견될 수 있는 조건하에 발효조내에서 배양되며, 그후 Asp-Phe의 제조는 같거나 또는 다른 발효조내에서 실시될 수 있다. 여기에서 발효조는 당업자에게 공지된 발효조 또는 다른 종류의 (효소)반응기이다.
본 발명에 따른 Asp-Phe의 제조방법에서, 미생물은 먼저 발효조내에서 배양되어 Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 발현이 스위칭되고, Asp-Phe 디펩티드를 합성하기 위한 글루코스, L-Asp 및/또는 L-Phe의 공급이 시작되기 전에 예정된 세포밀도에 도달하는 것이 바람직하다.
당업자는 광학밀도(O.D.)를 측정함으로써 미생물의 배양을 쉽게 측정하고, 적당한 수준의 세포밀도를 발견할 수 있다. 미생물 배양의 네가티브 효과를 방지하기위해, 배양단계 및 Asp-Phe 합성효소 제조단계는 결합되지 않는 것이 바람직하다. 유도가능하고 밀접하게 조절가능한 프로모터로부터 Asp-Phe 합성효소를 위한 유전자를 발현함으로써 상기 결합해제가 이루어질 수 있다. Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 발현은 예정된 수준의 세포밀도가 도달된 후에, 특정 화학성분(유도물질)을 첨가함으로써 또는 온도, pH 또는 용해된 산소압력과 같은 물리적 조건을 변경함으로써 스위칭되는 것이 바람직하다. 발현은 Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 발현수준이 10의 인자에 의해 적어도 높아지는 경우에는, 비-유도 상태에 비해 스위칭되는 것으로 추정된다.
그후, 필요한 양의 기질의 공급이 시작되고, Asp-Phe가 제조되기 시작한다.
가장 바람직하게는, 미생물은 L-페닐알라닌 생성 미생물이며, 요구량의 염 및 미량원소 등과 달리 글루코스와 L-Asp만 공급된다. L-Phe 생성 미생물은 잘 알려져 있다. 예를 들어, E. coli 및 코리네박테리움 종(Corynebacterium species)은 L-Phe를 제조하기 위해 사용된다. 상기 미생물내에서 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 발현함으로써, 미생물내 L-Phe의 유용성이 제공되며, L-Asp 뿐만 아니라 글루코스, 적당한 질소원, 유기성장요소, 염 및 미량원소 등이 필요에 따라 공급되어야 한다.
특히, 사용된 미생물은 에스케리키아 또는 바실루스 종이다.
사용된 미생물이 Asp-Phe에 대한 프로테아제 활성이 감소되고, Asp-Phe를 향한 활성이 없는 균주인 경우에 최상의 결과가 얻어진다. 상기 균주를 사용함으로써 형성된 Asp-Phe의 분해가 방해된다. 프로테아제 활성이 없는(자연적으로 없거나, 또는 프로테아제의 활성이 실질적으로 낮아지거나 또는 완전히 제거되기 때문에 없음) 적당한 균주가 사용될 수 있다.
그리고, Asp-Phe의 합성이 미생물내에서 일어난다면, 미생물 외부의 반응매질로 형성된 Asp-Phe가 투과하는 것을 향상시키고, 미생물을 반응매질로부터 분리시킨후에 그로부터 Asp-Phe를 회수하기 위한 추가의 조치가 취해질 수 있다. 유사하게는, 글루코스 및/또는 L-Asp 및/또는 L-Phe의 흡수를 향상시키기 위한 추가의 조치도 취해질 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 사용된 미생물은 형성된 Asp-Phe에 대해 적당한 방출시스템 및/또는, 글루코스 및/또는 L-Asp 및/또는 L-Phe를 위한 하나 이상의 적당한 흡수시스템을 함유한다. 적당한 방출시스템을 사용하면, 형성된 Asp-Phe의 보다 유효한 분비가 이루어질 수 있을 것이다. 여기에서 분비라는 용어는 미생물내에서 형성된 Asp-Phe가 세포외 환경으로 분비되는 것을 의미한다. Asp-Phe의 유효한 분비는 Asp-Phe의 회수율을 향상시키고, 적당한 수준에서 Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 활성을 유지할 뿐만 아니라 Asp-Phe의 세포내 분해를 막기 위해 중요하다. 그리고, 분비된 Asp-Phe의 하류 처리는 보다 용이하다.
유사하게는, 적당한 흡수 시스템의 존재는 Asp-Phe에 대한 결합효율성을 향상시킬 것이다.
상기에서, Asp-Phe의 생체내 리보솜외 합성방법이 기술되어 있다. 이들은 모두 생세포물질이 사용되고, ATP 재생이 상기 세포물질내에서 일어나는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, 시험관내에서도 실시될 수 있다. 여기에서, 시험관내 시스템은 Asp-Phe 디펩티드 합성효소가 생세포물질내에 존재하지 않고; 그러나,예를 들어 투과가능한 세포, 세포-유리 추출물 또는 분리된 디펩티드 합성효소와 같은 다른 환경내에 존재될 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 경우에, ATP의 재생은 Asp-Phe를 합성하는데 사용되는 생세포물질내에서 일어나지 않으며, 유효량으로 ATP를 공급하기 위한 특별한 방법이 취해진다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, Asp-Phe의 제조는 ATP가 공급되고, L-Asp 및/또는 L-Phe가 공급되고, 형성된 Asp-Phe가 회수되면서 효소반응기내 시험관내에서 실시된다.
공정의 경제적인 수행력을 향상시키기 위해, Asp-Phe를 합성하기 위해 공급되는 ATP의 몰당 Asp-Phe의 수율을 증가시키는 것이 특히 바람직하다. 이는 연속적인 아데닐화 및 티올화 반응에서 ATP로부터 형성된 AMP로부터 인 시츄(in situ) 방식의 ATP 재생에 의해 이루어질 수 있다.
그러므로, 본 발명의 바람직한 방법에서, ATP의 공급은 인 시츄 방식의 ATP-재생 시스템에 의해 일부 제공된다.
(문헌에서 ATP 재생시스템이라고 언급되는)다양한 ATP 재생 시스템은 당업자에게 공지되어 있다. ATP 재생 시스템으로서, 전체 세포시스템(가령, 효소 해당시스템) 또는 분리된 ATP 재생효소, 가령 아세테이트 키나아제와 조합된 아데닐레이트 키나아제가 사용될 수 있다. 매우 정밀한 ATP 재생시스템은 T. Fujio 외 다수의 (Biosci., Biotechnol., Biochem. 61, 1997, p.840-845)에 기술되어 있다. 여기에는 투과가능한 E. coli 세포내 ATP-요구반응과 결합된 대응 모노포스페이트(AMP)로부터 ATP를 재생하기 위해 투과가능 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 세포를 사용하는 것이 개시되어 있다. 상기 정밀한 방법에서 대부분의 ATP 대신에 에너지원으로서 (저렴한)글루코스가 공급될 수 있다.
그러므로, ATP-재생 시스템은 투과성 미생물내에 존재하는 것이 바람직하다. 사용된 (효소)반응기내에 존재하는 상기 투과성 미생물은 유효량의 아데노신-트리포스페이트(ATP)가 본 발명에 따른 Asp-Phe 제조중에 항상 존재하고 사용가능할 것을 보장한다.
Asp-Phe 디펩티드 합성효소 등을 코딩하는 DNA 단편
본 발명은 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편에 관한 것이다.
상기 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 리보솜외 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하며, 상기 합성효소는 하나의 축합 도메인에 의해 연결된 2개의 최소모듈을 포함하며, 상기 모듈의 N-말단 모듈은 L-아스파르트산을 인식하고, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-페닐알라닌을 인식하고, 그의 N-말단부에서 축합 도메인에 공유결합되며, 상기 최소 모듈 각각은 티올화 도메인을 함유하는 4'-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성된다.
"DNA-단편 또는 DNA-단편의 조합"이라는 용어는 가장 광범위한 가능한 의미로 이해된다. 무엇보다, 상기 용어는 올바른 순서로 Asp 및 Phe를 위한 최소 모듈 및 축합 도메인을 코딩하는 상기 언급된 (하나 이상의 DNA-단편상의) 복합 생물학적 물질을 의미하며, 각 코딩서열은 Asp-Phe 디펩티드 합성활성을 발현하기에 적당한 전사 및 해독조절서열(가령, 프로모터, 전사 종결제) 등에 의해 둘러싸여 있다.조절서열은 상동 또는 이종이며, DNA내에 존재하는 프로모터는 구성할 수 있거나 또는 유도할 수 있다.
본 명세서에서, "DNA-단편"이라는 용어는 Asp 및 Phe 최소 모듈 및 축합 도메인을 위한 코딩에 더해 TE-도메인과 같은 다른 도메인의 활성을 위해 코딩하는 것으로 이해된다. 그리고, 상기 단편들은 통합형 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 단백질과 같은 Asp-Phe 디펩티드 합성효소 폴리펩티드 자체위에 위치하지 않는 활성을 위해 코딩하며, 다른 활성들은 Asp 및 Phe 최소 모듈과 협력하여 동시-동작한다.
"DNA-단편"이라는 용어는 본 명세서의 DNA 단편을 포함하는 유전자 구조를 포함하여 이해된다. 보다 정확하게는, 유전자구조는 본 발명에 따른 DNA-단편을 운반하는 유전자 및 기타 다른 뉴클레오티드 서열로서 이해된다. 적당한 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 플라스미드, 벡터, 염색체, 또는 파지일 수 있다. 유전자 구조는 단일 또는 다중복제 상황에서 자가복제하거나, 또는 단일 또는 다중복제 상황에서 염색체로 통합되는 벡터(의 일부)로서 존재한다.
유전자구조는 또한, 본 발명에 따른 DNA-단편이 분포되어 있는 벡터, 염색체 및 파지와 같은 상기 유전자 운반체의 조합으로 이해된다. 예를 들어, Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편은 벡터상에서 세포로 도입될 수 있으며, 비통합형 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 단백질을 코딩하는 DNA 단편은 염색체로 삽입될 수 있다. 그리고, 추가의 DNA-단편은 파지를 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 상기 예들은 본 발명으로부터 DNA-단편 분포의 다른 조합을 배제하는 것으로 간주되지 않는다. 본 발명에 따른 DNA-단편은 예를 들어 50개 이하의 복제본과 같은 충분히 높은 복제수로 미생물에 도입될 수 있다.
Asp-Phe 디펩티드 합성효소 및 2개의 최소모듈에 대한 상세한 설명은 본원의 전반부에 제공된다.
본 발명에 따른 DNA 단편의 구조는 자명하진 않지만, "모듈", "도메인" 등이그의 기능적인 경계에 대해 많이 오인되고 있다. 그러나, (돌연변이, 비-자연적) 펩티드 합성효소의 합리적인 디자인을 가능하게 하는 상세한 정보는 아직 없다. 그럼에도 불구하고, 돌연변이 펩티드 합성효소를 제조하기 위한 다양한 방법들이 최근에 문헌에 개시되어 있다. 문헌에 기술되어 있는 돌연변이 펩티드 합성효소를 제조하는 방법은 하기와 같다:
De Ferra 외 다수의 (J. Biol. Chem., 272, 1997, p.25304-25309)에는 서팩틴 합성효소의 필수 TE-도메인을 C-말단 모듈로부터 다른 내부 모듈의 C-말단으로 치환함으로써 예정된 서열의 절단된 펩티드를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 그러나, 상기 방법은 2개의 연속적인 Asp 및 Phe 모듈의 자연적인 순서가 본래 존재하는 것으로 알려져 있지 않기 때문에(자연적인 합성효소의 N-말단 또는 C-말단, 또는 자연적으로 발생하는 합성효소의 내부 서열로서) Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 제조하기에 부적합하다.
펩티드 합성효소를 가공하기 위한 다른 생체내 방법은 펩티드 생성물의 일차구조내에서 변경 프로그램되어 있다. 상기 방법에 대한 기초는 유전적인 수준에서 한 모듈을 다른 모듈에 의해 대체하는 것이다. 상기 방법은 보통 A. Schneider 외다수의 Mol. Gen. Genet., 257, 1998, p.308-318에 기술되어 있다. 상기 방법에서, 아미노산-활성화 최소모듈은 이종원의 다중-모듈 펩티드 합성효소 사이에서 성공적으로 생체내 교환될 수 있으며, 상기 변경없이 생성되는 펩티드와 다른 일차 구조를 갖는 리보솜외 펩티드를 대신에 생성하는 미생물이 얻어질 수 있다.
상기 방법이 Asp-Phe 펩티드 합성효소를 제조하기 위해 적용된다면, 본래 두개의 옵션이 사용가능한데, 각각은 (ⅰ)Asp 및, Phe와 다른 아미노산을 나타내는 XXX, 또는 (ⅱ)Asp와 다른 아미노산을 나타내는 YYY 및, Phe를 포함하는 두개의 모듈의 서열을 갖는 디펩티드 합성효소로부터 출발한다. 상기 디펩티드 합성효소에서, XXX 모듈을 코딩하는 DNA는 Phe 모듈을 코딩하는 DNA에 의해 치환되거나, 또는 YYY 모듈을 코딩하는 DNA는 Asp 모듈을 코딩하는 DNA에 의해 치환되어야 한다.
펩티드 합성효소를 제조하기 위한 다른 방법은 EP-A-0637630에 기술되어 있다. 상기 특허공보에서, 모듈(의 일부)를 치환시킴으로써 기질 특이성을 변경시킨 다음에 모듈이 결실되거나, 또는 합성효소 사슬로 삽입될 수 있는 방법이 제시되어 있다. 모듈의 "특이성"이라는 용어는 모듈이 다른 아미노산위에서의 하나의 아미노산, 상기 다른 아미노산을 인식하는데 바람직하다는 것을 의미한다.
상동 재조합이 본래의 펩티드 생성 미생물내에서 게놈 DNA내 원하는 변화를 일으키기 위해 사용된다는 점이 상기 펩티다아제 제조방법의 구별되는 특징이다. 상동 재조합이 고유의 펩티드 생성 미생물내에서 일어나기 때문에, 상기 방법은 모든 고유의 숙주효소 및 관련 조절요소가 존재한다는 잇점을 가진다.
그러나, 고유의 리보솜외 펩티드 생성물질을 사용하는 것에 의한 상동 재조합은 여러가지 심각한 단점을 갖고 있다. 상기 단점중 대부분은 특히 발달되지 않은 형질전환 시스템을 가지거나 또는 다른 유전도구가 없는 느리게 성장하는 미생물에 가해질때, 길고 기술적으로 어렵다는 것이다. 다른 단점은 고유의 리보솜외 펩티드를 생성하는 미생물이 종종 산업적인 규모로 안전하게 사용하는 히스토리를 갖고 있지 않으며, L-Phe 및/또는 L-Asp에 대한 생성유기체가 없고, 알려지지 않은 발효 특성을 가진다는 점이다. 그리고, 상기 모든 방법들은 원하는 펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편의 단일 복제본만 갖는 세포를 형성시킨다. 그러므로, 상기 생체내 방법중 어느것도 본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 제조하기에 적당하고, Asp-Phe를 산업적으로 제조하기 위해 사용하기에 적당하지 않다.
본 발명자들은 Asp-Phe 디펩티드 합성효소가 시험관내 방법을 사용함으로써 쉽게 얻어질 수 있다는 것을 발견하였다. 지금까지 펩티드 합성효소를 제조하기 위한 시험관내 방법이 기술된 것은 없다. 본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 제조하기 위한 상세한 프로토콜은 본원의 실시예에서 찾아볼 수 있다.
Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편은 Asp-XXX 또는 YYY-Phe(XXX 및 YYY는 상기에서와 같은 의미를 가짐)로부터 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편(또는 자연적으로 존재하는 펩티드 합성효소내에서 발생하는 상기 합성효소를 코딩하는 단편을 위한 일부 서열)이 시험관내에서 제조될 수 있다. 이는 PCR 방법에 의해 바실루스 수브틸리스 ATCC 21332 서팩틴 합성효소 A 유전자(srfA-B)로부터 얻어지는 Asp-Leu(Leu=류신) 디모듈 펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편으로부터 출발하여 수행되었다. Leu 최소모듈을 코딩하는 DNA-단편을 Phe 최소모듈을 코딩하는 바실루스 브레비스 ATCC 8185 티로시딘 A 합성효소 유전자(tycA)로부터 (PCR 방법에 의해 얻은) DNA-단편에 의해 치환하였다. 그후, Phe 모듈의 티올화 도메인을 srfA-C 티올화 및 TE 도메인을 코딩하는 PCR-단편에 의해 치환시킴으로써 필수 TE-도메인은 Asp-Phe를 코딩하는 DNA-단편의 C-말단에 첨가되었다. 상기 제조는 추가의 TE 도메인을 코딩하는 DNA가 Asp-Phe 합성효소를 코딩하는 유전자와 프레임내(in-frame) 융합되는 방법으로 실시되었다. 결과적으로, TE-도메인은 생성된 Asp-Phe 합성효소의 통합부를 형성한다. 본원의 실시예에서, Asp-Phe 합성효소를 함유하는 상기 TE-도메인이 이하에서는 Asp-Phe-TE로 언급될 것이다.
제조후에, 인코딩 DNA-단편을 적당한 숙주 미생물에 도입하였다. 적당한 숙주 미생물은 예를 들어 E. coli 및 바실루스 종이다. 유도조건하에서 상기 미생물을 배양한후, 세포를 분해하고, 생성된 합성효소를 IMAC(고정화 금속 친화도 크로마토그래피; Immobilised Metal Affinity Chromatography)에 의해 정제하였다. 정제된 효소제조물을 Asp-Phe의 형성을 입증하는 다른 실험에 사용하였다.
바람직한 DNA 단편
본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편의 하기 바람직한 측면은 Asp-Phe를 제조하는 바람직한 방법에 관해 상기 명세서의 전반부에 논의되어 있다.
본 발명에 따른 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA-단편에 있어서, L-아스파르트산을 인식하는 모듈에 공유결합하는 방법으로, 코딩된 디펩티드 합성효소내 축합 도메인이 두 최소모듈과 연결되는 것이 특히 바람직하다.
특히, 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합이 또한 디펩티드 합성효소상에서 형성된 Asp-Phe를 위한 방출인자를 코딩하는 것이 바람직하다. "방출인자"라는 용어는 명세서의 전반부에서 사용된 바와 같은 의미로 사용된다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 티오에스테라제-유사 기능을 나타내고, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합형 도메인을 형성하는 단백질을 코딩한다. "통합형 도메인" 등의 용어설명은 본원의 전반부를 참고한다.
그리고, 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 합성효소상에서 Asp-Phe를 유효하게 리보솜외 합성하기 위해 하나 이상의 후-해독 변형활성을 발현하는 것이 바람직하다. "후-해독 변형 활성"이라는 용어는 명세서의 전반부에 사용된 의미와 같은 의미로 사용된다.
특히, DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합에 의해 발현된 후-해독 변형 활성은 4'-포스포판테테이닐(4'-PP) 트랜스퍼라제 활성이다. 상기 활성의 형성은 아포-효소를 홀로-효소로 효과적으로 전환시킨다. 아포-효소의 홀로-효소로의 효과적인 전환은 명세서의 전반부에서 이미 설명되어 있다.
DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비통합형 단백질을 코딩하는 것이 특히 바람직하다. "티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비통합형 단백질"이라는 용어는 명세서의 전반부에서 사용된 의미와 같은 의미로 사용된다.
미생물
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합을 함유하는 미생물, 및 L-Asp 및/또는 L-Phe를 제조할 수 있는 미생물에 관한 것이다. 특히 미생물은 에스케리키아 콜리 또는 바실루스 종이다.
Asp-Phe 디펩티드 합성효소
본 발명은 또한, Asp-Phe 디펩티드 합성효소에 관한 것이다. Asp-Phe 디펩티드 합성효소에 관해 사용된 모든 용어 및 표현들은 상기 설명된 바와 같은 의미를 가진다.
본 발명에 따른 리보솜외 Asp-Phe 디펩티드 합성효소는 하나의 축합 도메인에 연결된 두개의 최소모듈을 포함하고, 상기 모듈의 N-말단 모듈이 L-아스파르트산을 인식하며, 상기 모듈의 C-말단 모듈이 L-페닐알라닌을 인식하며, 축합 도메인에 그의 N-말단에서 공유결합되며, 상기 최소모듈 각각은 티올화 도메인을 함유하는 4'-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성된 것을 특징으로 한다.
특히, 디펩티드 합성효소내 축합 도메인은 L-아스파르트산을 인식하는 모듈과 공유결합하는 방법으로 두 최소 모듈에 연결된다.
바람직하게는, Asp-Phe 디펩티드 합성효소는 디펩티드 합성효소상에서 형성된 Asp-Phe에 대한 방출인자를 포함한다.
가장 바람직하게는, 방출인자는 티오에스테라제-유사 기능을 나타내고, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합형 도메인을 형성하는 단백질이다.
본 발명은 이하의 실시예에서 보다 명확해질 것이지만, 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 사용된 모든 아미노산은 거울상으로 순수한 L-아미노산이었다.
일반적인 과정
DNA 분리, 겔 전기영동, 핵산의 효소제한변형법, E.coli 형질전환 등과 같은 표준 분자 클로닝방법은 Sambrook 외 다수의 1989, "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York and Innis 외 다수의 1990, "PCR protocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego에 기술된 바와 같이 수행하였다. 합성 올리고 데옥시뉴클레오티드는 MWG-Biotech AG, D-Ebersberg로부터 얻었다. DNA 서열분석은 제조사의 지시에 따라 Applied Biosystems ABI 310 유전분석기상에서 수행하였다. 시퀀싱 반응은 AmpliTaq FS 중합효소(Applied Biosystems)를 구비한 프리즘 준비 반응 다이데옥시 종결자 사이클 시퀀싱 킷(PRISM ready Reaction DyeDeoxy Terminator cycle sequencing kit)으로부터 염료-표시된 디데옥시 종결자에 의한 사슬종결화 방법에 의해 실시하였다.
플라스미드 pasp-leu-His 6 의 제조예
하기의 프라이머를 사용하여 염색체 바실루스 수브틸리스 ATCC 21332 DNA로부터 srfB 유전자좌로부터의 영역을 포함하는 4934bp 단편을 증폭(PCR)하였다:
5' TAA GCA TGC TGC TTT CAT CTG CAG AAA C(5' asp-leu-sphI-srfB2), 및
3' AAT GGA TCC TTC GGC ACG CTC TAC(3' asp-leu-BamHI-srfB3).
증폭된 단편의 정확한 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
단편(20㎍)을 효소 BamHI/SphI의 1단위(37℃, 16h)에 의해 소화시켜 종결 제한위치를 생성하였다.
플라스미드 pQE70(Qiagen제, D-Hilden)(10㎍)을 같은 효소에 의해 소화시키고, 1단위 알칼리성 포스파타제와 함께 1시간동안 배양하였다(37℃). 완전한 소화는 선형화 플라스미드 DNA 1㎕를 E.coli XL1 블루의 반응성 세포로 형질전환시킴으로써 확인하였다. 두개의 단편을 T4-DNA-연결효소 1단위와 1:3의 벡터/삽입물 비율로 계속해서 결찰반응(10㎕)에서 결찰시켰다(16℃, 16h).
전기영동에 의해 E.coli XL 블루(Stratagene, D-Heidelberg)의 40㎕ 반응성 세포를 형질전환시키기 위해 결찰 혼합물 1㎕를 사용하였다. 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 2x YT 아가 플레이트상에서 형질전환체를 선별하였다. 암피실린에 대한 48개의 형질전환체의 내성분석으로 인해 상기중 4개가 ca. 5000bp 단편이 삽입되었음을 알았다. 정확한 삽입은 삽입물의 제한효소 소화분석 및 종결시퀀싱을 사용하여 확인하였다. 정확한 클론 pasp-leu-His6은 추가의 연구를 위해 사용하였다.
플라스미드 pasp-phe-His 6 의 제조예
플라스미드 pasp-phe-His6은 하기와 같이 플라스미드 pasp-leu-His6로부터 제조하였다.
하기의 프라이머를 사용하여 바실루스 브레비스 ATCC 8185 DNA로부터 1894bp 염색체 DNA-단편을 증폭(PCR)하였다:
5' ATT TGG TCA CCA ATC TCA TCG ACA A (5' BstEII-TycA-NLID), 및
5' ATA GGA TCC TGT ATT CGT AAA GTT TTT C (3'-PheAT-BamHI).
단편의 정확한 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
단편을 효소 BamHI 1단위에 의해 소화시키고, 30℃에서 4시간동안 배양하였다. 이후에, 효소 BstEII 1단위를 첨가하고, 60℃에서 4시간 더 배양하였다.
플라스미드 pasp-leu-His6을 같은 방법으로 소화시키고, 이후에 알칼리성 포스파타제 1단위와 함께 1시간동안 배양하였다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 다른 DNA 단편으로부터 벡터부(ca. 6.5kb)를 분리하고, 재정제하였다. 완전한 소화는 선형화 pasp-leu-His6에 의해 위에서와 같이 확인하였다. T4-연결효소 1단위를 사용하여 16℃에서 5시간동안 동등몰량으로 두개의 단편을 결찰시켰다. E.coli XL1 블루 반응성 세포를 전기영동하기 위해 결찰 혼합물 1㎕를 사용하였다. 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 2x YT 아가상에서 형질전환체를 선별하였다. 형질전환체의 분석으로 인해 90개의 클론중 1개에 ca. 2000bp의 단편이 삽입되었음을 알았다. 정확한 삽입은 삽입물의 제한효소 소화분석 및 종결시퀀싱을 사용하여 확인하였다. 정확한 클론은 제조된 pasp-phe-His6이다. 플라스미드 pasp-leu-His6상의 펩티드 합성효소를 코딩하는 유전자에 비해, 플라스미드 pasp-phe-His6상의 펩티드 합성효소를 코딩하는 유전자는 제2 (Leu) 최소모듈(A-도메인 및 T-도메인)을 코딩하는 DNA-단편, Phe 최소모듈을 코딩하는 DNA-단편을 교환함으로써 얻은 잡종 유전자이다.
플라스미드 pasp-phe-TE-His 6 의 제조
플라스미드 pasp-phe-TE-His6은 플라스미드 pasp-phe-His6로부터 제조하였다.
하기의 프라이머를 사용하여 바실루스 수브틸리스 ATCC 21332 DNA로부터 910bp 염색체 DNA-단편을 증폭(PCR)하였다:
5' ATA ATC GAT AAT CGC ACA AAT ATG GTC (5' TE-srfCl-ClaI), 및
3' ATA AGA TCT AAC AAC CGT TAC GGT TTG TGT (3' int TE-srfCl-BglII).
단편의 정확한 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
완충조건을 조정하고, 효소 BglII 1단위에 의해 소화시키기 전에 단편을 효소 ClaI 1단위에 의해 37℃에서 4시간동안 소화시켰다(4시간, 37℃).
알칼리성 포스파타제 1단위와 함께 1시간동안 선형화 플라스미드를 배양하기 전에, 플라스미드 pasp-phe-His6을 효소 ClaI에 의해 소화하고(4h, 37℃), BamHI에 의해 소화하였다(4h, 37℃). 아가로스 겔 전기영동에 의해 다른 DNA-단편으로부터 벡터부(ca. 8kb)를 분리하고, 재정제하였다.
완전한 소화, 결찰, 전기영동 및 형질전환체 선별의 조절은 상기 기술된 바대로 실시하였다.
분석한 형질전환체중 둘은 원하는 DNA-단편을 함유하는 것으로 나타났다.900bp 단편의 정확한 삽입은 삽입물의 제한효소분석 및 종결시퀀싱에 의해 확인하였다.
정확한 클론은 제조된 pasp-phe-TE-His6이었다. 플라스미드 pasp-phe-His6상에서 펩티드 합성효소를 코딩하는 유전자에 비해, 플라스미드 pasp-phe-TE-His6상에서 펩티드 합성효소를 코딩하는 유전자는 제2 (Phe) 최소모듈의 티올화 도메인과 아데닐화 도메인을 코딩하는 DNA 사이에 위치하는 제2 융합위치를 함유한다. C-말단 T-TE 도메인은 서팩틴 합성효소 srfC의 고유 C-말단과 유사하다.
펩티드 합성효소 asp-leu-His 6 , asp-phe-His 6 및 asp-phe-TE-His 6 의 발현
E.coli BL21/pgsp 반응성 성분세포내에서 각 제조된 플라스미드 1㎕를 형질전환하였다. 균주 BL21 1DE3은 Stratagene, D-Heidelberg에서 얻었다. (Qiagen에서 얻은, D-Hilden)플라스미드 pREP4에 기초하는 플라스미드 pgsp는 T7 프로모터의 조절하에 gsp 유전자(바실루스 브레비스 ATCC 9999로부터 그라미시딘(Gramicidin) S-생합성 오페론으로부터의 4'-PP 트랜스퍼라제) 유전자를 함유한다.
암피실린(110㎍/㎖) 및 카나마이신(25㎍/㎖)을 함유하는 2x YT 아가 플레이트상에서 형질전환체를 선별하였다. (10mM MgCl2를 추가로 함유하는) 2x YT 액체배지를 4㎖ 접종하기 위해 여러 클로니를 사용하고, 37℃에서 16시간동안 배양하였다. 같은 배지 400㎖를 접종하기 위해 상기 4㎖ 배양액을 계속해서 사용하였다. 수조 쉐이커내에서 30℃에서 세포를 배양하였다(250rpm). 3-4시간후에, 세포는0.7(OD600㎚)의 광학밀도에 도달했으며, 200㎛ IPTG를 첨가함으로써 유도하였다. 세포를 수확하기 전에 1.5시간동안 더 배양하였다.
유도시에, 그리고 1.5시간후에 채취한 단백질 샘플을 SDS-PAGE 비교함으로써 재조합 단백질의 발현을 확인하였다.
BL21/pgsp/pasp-leu-His6및 BL21/pgsp/pasp-phe-His6발현으로부터의 조세포 추출물에서, ca.180 kDa의 유도성 단백질의 발현을 확인하였다. BL21/pgsp/pasp-phe-TE-His6의 조세포 추출물로부터, ca.200 kDa의 유도성 단백질의 발현을 볼 수 있었다.
정확한 재조합 단백질 글리세롤을 발현하는 배양액으로부터 스톡을 제조하고, -80℃에서 저장하였다.
재조합 단백질 Asp-Leu-His 6 , Asp-Phe-His 6 및 Asp-Phe-TE-His 6 의 정제
"Expression of the peptide systhetases..."에 기술된 바와 같이 처리된 BL21/pgsp/pasp-leu-His6, BL21/pgsp/pasp-phe-His6및 BL21/pgsp/pasp-phe-TE-His6의 배양액 800㎖를 5000rpm으로 5분간 원심분리하고, 완충액 A(50mM HEPES, 300mM NaCl, pH 8.0)의 30㎖/ℓ 배양액내에서 재현탁하였다. 세포현탁액을 직접 사용하거나 또는, 사용하기 전까지 -20℃에서 저장하였다. 세포분해는 12000psi의 동작압력에서 2개의 프랑스제 프레스 패시지(French press passage)를 사용하여 실시하였다.
세포분해후에, PMSF를 1mM의 최종농도로 직접 첨가하였다. 세포 분해물을 10000rpm에서 30분간 원심분리한후, 상층액을 1%(v/v) 완충액 B(50mM HEPES, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)와 조합하였다. 1% (v/v) 완충액 B에 의해 미리 평형화하기 전에, 단백질 용액을 Ni2+-NTA-아가로스 컬럼(Qiagen, D-Hilden)상에 가했다. 유속은 0.75㎖/분이었다. non-His6-표적 단백질을 컬럼을 통해 통과시킨후에, 선형 구배가 가해지기 전에 1% 완충액 B에 의해 추가 10분간 세척하였다(30% B에 대해 30분, 100% B에 대해 추가 10분). 세 개의 단백질 모두 약 5% 완충액 B(15mM 이미다졸)의 농도에서 용출시키고, 2㎖ 프랙션으로서 수집하였다.
브래드포드(Bradford) 제제를 사용하여 재조합 단백질함유 프랙션을 595㎚의 흡광도에 의해 검출하였다. 상기 프랙션을 풀(pool)하고, 50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM MgCl2및 5mM DTE를 함유하는 완충액에 대해 16시간동안 투석하였다. 투석한후에 단백질 농도를 다시 측정하였다.
글리세롤을 10%(v/v)까지 첨가한후에 추가사용까지 단백질을 -20℃에서 저장하였다.
1L 배양액으로부터 각 순 재조합 단백질 약 5㎎을 얻을 수 있었다. 정제 등급은 SDS-PAGE에 의해 95%로 평가되었다.
효소활성의 분석
ATP-PPi-교환 반응:
아미노산 활성화의 특이성은 역반응동안 표시된32PPi를 ATP로 혼입함으로써 간접측정하였다(Lee, S.G. & Lipmann, F.; Tyrocidine synthetase system; Methods Enzymol. 43, 1975, p.585-602). 상기 목적을 위해, 각 효소 20pmol을 1mM 아미노산, 1mM ATP, 0.1mM PPi, 50mM HEPES, 100mM NaCl 및 10mM MgCl2및 2mCi32PPi와 함께 100㎕의 전체부피로 37℃에서 배양하였다. 100mM NaPPi, 560mM 과염소산 및 1.2%(w/v) 활성 목탄을 함유하는 용액 500㎕를 첨가함으로써 10분후에 반응을 퀸칭하였다. 13000rpm에서 1분간 상기 혼합물을 원심분리하였다. 펠릿을 1mL H2O에 의해 2회 세척 및 재현탁하였다.
(목탄에 흡수된)표시된 ATP의 혼입은 침전물의 방사능을 측정함으로써 검출하였다.
Asp-Leu-His6은 Asp 및 Leu를 배타적으로 활성화시키는 것으로 나타났다. Asp 및 ATP에 대한 KM값은 각각 3.5mM 및 0.9mM로 측정되었다. Leu 및 ATP에 대한 KM값은 각각 0.3mM 및 0.6mM으로 측정되었다.
Asp-Phe-His6및 Asp-Phe-TE-His6은 Phe 및 Asp를 모두 활성화시키는 것으로 나타났다. Phe에 대한 KM값은 약 50μM으로 측정되었다.
Asp-Phe-His6및 Asp-Phe-TE-His6의 아미노산 활성화 패턴은 동일한 것으로밝혀졌다.
Asp-Phe 디펩티드 합성효소에 대한 아미노산의 공유결합:
홀로-효소 형성의 정량은 정제된 단백질 Asp-Leu-His6, Asp-Phe-His6및 Asp-Phe-TE-His6의 1당량과 공유결합하는, 표시된 Asp, Leu 및 Phe의 양을 측정함으로써 측정하였다. (Lee, S.G.; 상기 참조)
각 효소 50pmol을 2mM ATP, 50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM MgCl2및 100pmol14C 표시된 아미노산(각각 Asp 및 Leu 또는 Asp 및 Phe)과 함께 37℃에서 배양하였다. 30분후, 10% TCA 1㎖ 및 5㎎/㎖ BSA를 첨가함으로써 반응을 퀸칭하고, 0℃에서 30분더 저장하였다. 단백질 침전물을 원심분리(13000rpm에서 30분)에 의해 수집하고, 10% TCA에 의해 2회 세척하였다. 세척한 침전물을 50% 과포름산에 용해하고, 표시된 아미노산의 혼입을 측정하기 위해 사용하였다.
Asp-Leu-His6을 약 20-25%의 정도로 Asp 및 Leu로 표시하였다. Asp-Phe-His6및 Asp-Phe-TE-His6은 10-15%의 정도로만 Asp에 의해 표시하였다. Phe의 혼입은 약 50%의 수준에 이르렀다.
디펩티드 Asp-Leu 및 Asp-Phe 형성의 간접적인 증명:
디펩티드 합성효소에 대한 구성 아미노산의 공유결합은 방사능 표시된 Asp를 사용한 동적 실험에 의해 보여졌다. 첫 번째 시험에서, 37℃에서 완충액(50mM HEPES, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, pH 8.0)내에서 0.85㎛ Asp-Leu-His6을 2mM ATP,2.8㎛ Asp(14C, 56nCi)와 함께 배양하였다. 규칙적인 시간간격으로 샘플을 취하고, 상기 내용에서와 같이 처리하고; (효소와 공유결합한 Asp의) 방사능을 각 샘플에서 측정하였다. 4분후에, 두 번째 아미노산을 첨가하지 않으면, 혼입된 표시 Asp의 양은 몇분후에 최대로 도달하기 위해 탈평준화되기 시작했다. 그러나, 1.5μM Leu가 4분후에 첨가된다면, 보다 강하지만 일시적인 방사능 증가가 관찰되었으며, 약 5분후에 제2 아미노산이 첨가되지 않을 경우 관찰되는 최대 이하의 수준으로 갑자기 감소하였다.
다른 실시예에서, 0.5μM Asp-Phe-His6을 이전의 Asp-Leu-His6과 같은 방법으로 배양하였다. 상기 경우, 약 5분후 0.1mM Phe를 첨가함으로써 상기에서와 같이 공유결합된 방사성 Asp를 유사하게 일시적으로 증가시켰다. 그러나, Phe 대신에 Leu를 첨가하면 상기 일시적인 증가을 일으키지 않았다.
이는 펩티드 결합형성이 상기 펩티드 합성효소 각각위에서 일어난다는 것을 명확하게 보여준다. 그러므로, 결과는 펩티드 합성효소상에서 형성된 펩티드가 그로부터 방출된다는 것을 보여준다.
디펩티드 Asp-Phe 형성의 직접적인 증명:
디펩티드 Asp-Phe의 형성은 다른 분석방법, 즉 방사능 검출에 의한 박층 크로마토그래피(TLC), 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용한 일련의 실험에 의해 입증되었다.
제1 셋트의 실험예(디펩티드 합성효소로부터 방출된 Asp-Phe를 측정하는 방법)에서, Asp-Phe-His6100pmol을 1mM ATP, 1mM Phe 및 1.25μM14C-표시된 Asp의 전체부피로 완충액(50mM HEPES, 20mM MgCl2, pH 8)에서 37℃에서 6시간동안 배양하였다. ATP, Phe 또는 효소중 하나를 생략하여 대조군 실험을 실시하였다.
추가의 유사한 실험예에서, 같은 양의 상기 효소를 (Phe 및14C-표시된 Asp 대신에) 1mM Asp 및 1.25μM14C-표시된 Phe와 함께 동일한 조건하에서 배양하였다. 또한 적당한 블랭크도 실시하였다.
반응을 완료시키기 위해, 이후에 제거되는 효소를 침전시키기 위해 n-부탄올 100㎕를 첨가했다. 남은 맑은 용액을 물내에서 10부피% 메탄올에 의해 20㎕의 부피로 증발 및 보충하였다. 적당한 부피의 상기 각 샘플을 실리카 TLC 플레이트에 가하고, 용출액으로서 부탄올/아세트산/에틸 아세테이트/물 1:1:1:1(v/v/v/v)의 용액을 사용하여 발달시켰다. 용출후, 상기 플레이트를 건조시키고, 2일 내지 5일 노출하는 동안 X-선 필름을 그위에 놓았다. 마지막으로 방사능표시된 화합물의 점을 나타내기 위해 막을 처리하였다.
Asp, Phe, ATP 및 효소가 반응혼합물내에 존재하는 경우에만, Asp-Phe와 같은 보유인자(Rf)를 갖는 점을 발견할 수 있었다.
제2 셋트의 실험예(Asp-Phe에 결합된 디펩티드 합성효소를 측정하는 방법)에서, 1nmol의 Asp-Phe-His6을 37℃에서 완충액(50mM HEPES, 20mM MgCl2, pH 8)내에서1mM ATP, 1mM Asp 및 1μM14C-표시된 Phe와 함께 600㎕의 전체 부피로 배양하였다.
20(중량)% 수성 트리클로로아세트산(TCA) 300㎕를 첨가함으로써 10분, 20분 및 30분후에 반응을 각각 정지시키고, 혼합물을 4℃로 냉각하였다. 모든 추가의 단계들은 4℃에서 실시하였다.
침전된 단백질을 원심분리에 의해 수집하고, 10% 수성 TCA 500㎕에 의해 1회 세척한후, 디에틸 에테르와 에탄올의 3:1(v/v) 혼합물 1㎖에 의해 세척하고, 마지막으로 디에틸 에테르 1㎖에 의해 세척하였다. 다음으로, 격렬하게 쉐이킹하면서 100mM 수산화칼륨 수용액 200㎖내에 재현탁하기 전에 펠릿을 37℃에서 15분간 건조시켰다. 그후 혼합물을 70℃에서 0.5시간동안 처리하여 효소로부터 티오에스테르 결합된 디펩티드를 방출하였다. 단백질로부터 방출된 디펩티드를 분리하기 위해, 용액을 메탄올로 1㎖까지 보충하였다. 상기 용액을 4℃에서 30분간 원심분리하고, 상층액을 실온에서 3시간동안 진공증발시켰다. 얻은 펠릿을 10% 수성 메탄올 25㎕내에 마지막으로 재현탁하였다.
그후, 이전의 실험예에서 기술된 방사능 검출에 의한 TLC에 의해 분석을 실시하였다. 디펩티드 Asp-Phe의 맑은 점을 세 개의 샘플 각각내에서 관찰하였다. 상기 점의 강도는 10분, 20분 및 30분 각각에 채취한 샘플에 대해 상당히 증가하였다. 이는 디펩티드 Asp-Phe의 형성이 디펩티드 합성효소상에서 실제로 일어난다는 것을 보여준다.
최종 실험예에서, Asp-Phe의 형성은 형성된 디펩티드의 HPLC 보유시간 및 질량-스펙트럼을 비교함으로써 확인하였다. 200㎕의 전체부피에서, Asp-Phe-TE-His650pmol을 1mM ATP, 1mM Asp 및 0.5mM Phe와 함께 37℃에서 6시간동안 완충액(50mM HEPES, 20mM MgCl2, pH 8)내에서 배양하였다. 반응을 종결시키기 위해, 이후에 제거되는 효소를 침전시키기 위해 n-부탄올 100㎕를 첨가하였다. 남은 맑은 용액을 진공하에 3시간동안 증발시키고, 물내 메탄올 10부피%에 의해 20㎕의 부피로 보충하였다.
추가의 분석을 위해, (물내 10부피% 메탄올에 의해 다시)상기 부피를 10배 희석하고, 그의 일부를 HPLC에 가한후에 광도측정 검출(하기 개시됨)하고, 전기분무 이온화 LC-MS 분석(Electrospray Ionisation LC-MS analysis)하였다. 화학합성된 Asp-Phe의 참고샘플을 비교를 위해 사용하였다.
광도측정 검출에 의한 HPLC를 위해, 10배 희석된 샘플의 50㎕ 부를 Chromsep Inertsil 5 ODS-3 컬럼(250×3㎜; 입자크기 5μ)상에서 주입하였다. 용출액 A(0.05M aq. H3BO3완충액 pH=3.0) 및 B(아세토니트릴; Merck, HPLC-급)을 구배(t=0분: 98% A, 2% B; t=35분: 10% A, 90% B) 및 1.2㎖/분의 유속으로 40℃에서 사용하였다.
검측은 (210㎚ 및 257㎚에서, 210㎚에서 정량화에 의한)광도측정법으로 실시하였다.
실험 샘플에 대한 결과 HPLC 크로마토그램에서, Asp-Phe 참고 화합물에 대한 보유시간과 정확히 같은 6.59분에서 피크를 발견하였다. 그리고, 샘플로부터 Asp-Phe 피크에 대해 기록된 UV-스펙트럼은 (200 내지 380㎚ 영역의 흡광 대 파장에 대해) Asp-Phe 참고화합물에 대해 기록된 UV-스펙트럼과 동일한 것으로 나타났다. 샘플내 Asp-Phe의 양은 16.1㎎/ℓ로 계산되었다.
전기분무 이온화 LC-MS 분석을 위해, 10배 희석된 실험샘플의 4㎕ 부(상기 참조)를 컬럼위에 주입하였다. 컬럼으로서 Nucleosil 120-3 C18 역상(Macherey & Nagel, 250×4㎜)을 사용하였다. 용출액은 용출액 A(포름산을 0.05% 함유하는 반-수(demi-water)) 및 용출액 B(포름산을 0.05% 함유하는 HPLC-급 메탄올)였다.
구배로서 하기와 같이 용출액 A 및 B를 사용하였다: 주위온도에서 0.4㎖/분의 유속에서 t=0: 10%B; t=25분: 60%B; t=30분: 100%B; t=34분: 100% B. 검측은 이온화 방법으로서 양이온 방법에서 전기분무 이온화를 사용한 전체 이온흐름(TIC)에 의해 실시하였다. 스캔 범위는 1msec의 머무름시간에 의해 120-300amu였다. Asp-Phe에 대한 보유시간은 (샘플 및 참고화합물에 모두에 대해)23.7분이었다. 질량 분석법은 샘플 및 참고화합물로부터의 Asp-Phe 모두에 대한 같은 분자량(280g/mol)을 확인하였으며, 동일한 단편화 패턴을 관찰하였다. 상기 방법에 따라, 샘플내 Asp-Phe의 양은 약 20㎎/ℓ으로 계산되었다.

Claims (30)

  1. 기질 L-아스파르트산(L-Asp) 및 L-페닐알라닌(L-Phe)으로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌(Asp-Phe)을 미생물학적으로 제조하는 방법에 있어서,
    유효량의 아데노신-트리포스페이트(ATP)의 존재하에서, 기질은 하나의 축합 도메인에 의해 연결되는 2개의 최소모듈을 포함하는 리보솜외 디펩티드 합성효소와 접촉하며, 상기 모듈의 N-말단 모듈은 L-아스파르트산을 인식하고, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-페닐알라닌을 인식하며 그의 N-말단부에서 축합도메인과 공유결합하며, 상기 최소모듈 각각은 티올화 도메인을 함유하는 4'-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성되며, 형성된 α-L-아스파틸-L-페닐알라닌(Asp-Phe)이 회수되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소내 축합 도메인은 L-아스파르트산을 인식하는 모듈과 공유결합하는 방법으로 두 최소모듈에 연결되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소상에 형성된 Asp-Phe에 대한 방출인자가 존재하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방출인자는 티오에스테라제-유사 기능을 나타내고, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합형 도메인을 형성하는 단백질인 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Asp-Phe를 제조하기 전에, 디펩티드 합성효소는 하나 이상의 후-해독 변형활성을 사용하여 그의 기능이 최적화되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    후-해독 변형활성으로서, 4'-포스포판테테이닐(4'-PP) 트랜스퍼라제가 사용되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소와 함께 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비통합형 단백질이 존재하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소는 미생물의 생세포물질내에 존재하며, 글루코스, L-Asp및/또는 L-Phe는 발효조로 공급되며, 형성된 Asp-Phe는 회수되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    Asp-Phe 디펩티드 합성효소의 발현이 스위칭되고, Asp-Phe 디펩티드를 합성하기 위한 글루코스, L-Asp 및/또는 L-Phe의 공급이 시작되기 전에 예정된 세포밀도에 도달하기까지 발효조내에서 미생물이 먼저 배양되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    미생물은 L-페닐알라닌 생성 미생물이며, 글루코스와 L-Asp만이 공급되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    미생물은 에스케리키아 또는 바실루스 종인 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용된 미생물은 Asp-Phe에 대한 프로테아제 활성이 감소되거나 또는 Asp-Phe로의 프로테아제 활성이 없는 균주인 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용된 미생물은 형성된 Asp-Phe를 위한 적당한 방출시스템 및/또는 글루코스 및/또는 L-Asp 및/또는 L-Phe를 위한 하나 이상의 적당한 흡수시스템을 함유하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Asp-Phe의 제조는 효소반응기내에서 시험관내 방식으로 실시되며, ATP가 공급되며, L-Asp 및/또는 L-Phe가 공급되고, 형성된 Asp-Phe가 회수되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    ATP의 공급은 인 시츄(in situ) 방식으로 ATP-재생 시스템에 의해 일부 제공되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    ATP-재생 시스템은 투과가능한 미생물내에 존재하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe의 제조방법.
  17. 하나의 축합 도메인에 의해 연결된 2개의 최소모듈을 포함하는 리보솜외Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하며, 상기 모듈의 N-말단모듈은 L-아스파르트산을 인식하며, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-페닐알라닌을 인식하고, 축합 도메인과 그의 N-말단부에서 공유결합하며, 상기 각 최소모듈은 티올화 도메인을 함유하는 4-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성되는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  18. 제 17 항에 있어서,
    코딩된 디펩티드 합성효소내 축합 도메인은 L-아스파르트산을 인식하는 모듈과 공유결합하는 방법으로 두 최소모듈과 연결되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 형성된 Asp-Phe를 위한 방출인자를 디펩티드 합성효소 상에서 코딩하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소를 코딩하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 단편 및 DNA 단편의 조합은 티오에스테라제-유사 기능을 나타내며, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합형 도메인을 형성하는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 합성효소상에서 Asp-Phe를 유효하게 리보솜외 합성하기 위해 후-해독 변형활성을 발현하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  22. 제 21 항에 있어서,
    발현된 후-해독 변형활성은 4'-포스포판테테이닐 (4'-PP) 트랜스퍼라제 활성인 것을 특징으로 하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합은 티오에스테라제 타입-Ⅱ-유사 활성을 갖는 비통합형 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합.
  24. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 단편 또는 DNA 단편의 조합을 함유하는 미생물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    미생물은 L-Asp 및/또는 L-Phe를 제조할 수 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    미생물은 에스케리키아 콜리 또는 바실루스 종인 것을 특징으로 하는 미생물.
  27. 하나의 축합 도메인에 의해 연결된 2개의 최소모듈을 포함하며, 상기 모듈의 N-말단 모듈은 L-아스파르트산을 인식하며, 상기 모듈의 C-말단 모듈은 L-페닐알라닌을 인식하고, 축합 도메인과 그의 N-말단부에서 공유결합하며, 상기 각 최소모듈은 티올화 도메인을 함유하는 4-포스포판테테이닐 보조인자 및 아데닐화 도메인으로 조성되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소.
  28. 제 27 항에 있어서,
    디펩티드 합성효소내 축합 도메인은 L-아스파르트산을 인식하는 모듈과 공유결합하는 방법으로 두 최소모듈에 연결되는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    상기 디펩티드 합성효소는 디펩티드 합성효소상에서 형성된 Asp-Phe를 위한 방출인자도 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 방출인자는 티오에스테라제-유사 기능을 나타내고, 그의 C-말단에서 디펩티드 합성효소의 통합형 도메인을 형성하는 단백질인 것을 특징으로 하는 Asp-Phe 디펩티드 합성효소.
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JP2005040037A (ja) * 2003-07-25 2005-02-17 Ajinomoto Co Inc ジペプチドの製造方法、それに用いるペプチド生成酵素、およびペプチド生成酵素の製造方法
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US20080213827A1 (en) * 2004-06-25 2008-09-04 Hashimoto Shin-Ichi Process For Producing Dipeptides or Dipeptide Derivatives
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