EA029209B1

EA029209B1 - Кластер генов биосинтеза гризелимицина и метилгризелимицина

Info

Publication number: EA029209B1
Application number: EA201490767A
Authority: EA
Inventors: Марк БРЕНСТРУП; Каудиа Кениг; Луиджи Тоти; Йоахим ВИНК; Вульф Лойшнер; Йоханн ГАССЕНХУБЕР; Рольф Мюллер; Зильке Венцель; Тина Бинц; Карстен Фольц
Original assignee: Санофи
Priority date: 2011-10-12
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2018-02-28
Also published as: JP6430250B2; EP2766389B1; CN104024272B; JP2014530609A; EA201490767A1; US20140295457A1; CN104024272A; WO2013053857A3; US9422566B2; EP2766389A2; IN2014CN03414A; WO2013053857A2

Abstract

Настоящее изобретение относится к кластеру генов и генам, входящим в состав кластера генов, которые вовлечены в биосинтез гризелимицина и метилгризелимицина, и к применению кластера генов, входящих в него генов, и белков, кодируемых ими, для получения агентов-антибиотиков.

Description

изобретение относится к кластеру генов и генам, входящим в состав кластера генов, которые вовлечены в биосинтез гризелимицина и метилгризелимицина, и к применению кластера генов, входящих в него генов, и белков, кодируемых ими, для получения агентов-антибиотиков.

029209 Β1

029209

Настоящее изобретение относится к области антибиотиков и более конкретно к генам и белкам, вовлеченным в биосинтез (метил)гризелимицина. В настоящем изобретении предлагаются рекомбинантные способы получения (метил)гризелимицина с помощью метода рекомбинантной ДНК.

Известный уровень техники

Гризелимицин представляет собой природный антибиотик, продуцируемый микроорганизмом вида 5>1гсрЮтуес5. который принадлежит к самому крупному роду Ас1йюЬас1спа. и к типичным представителям семейства 5>1гсрЮтусс1ассас. Стрептомицеты являются грамположительными и имеют геномы с высоким содержанием СС. Стрептомицеты характеризуются сложным вторичным метаболизмом. Они продуцируют более двух третей клинически пригодных антибиотиков природного происхождения. Гризелимицин представляет собой антибиотик, который был впервые описан Тебат апб ТЬотак, 1971. Он состоит из десяти аминокислот, расположенных в таком порядке Ь-Ы-метилвалин, который является Ыацетилированным, Ь-транс-4-метилпролин, Ь-Ы-метилтреонин, Ь-лейцин, Ь-транс-4-метилпролин, Ьлейцин, Ь-Ы-метилвалин, Ь-пролин, Ό-Ы-метиллейцин и глицин. Пептидная цепь замкнута в кольцо между глицином и Ь-Ы-метилтреонином через сложноэфирную связь, что приводит к наличию не входящего в цикл хвоста, состоящего из аминокислот Ь-Ы-метилвалина, который является Ν-ацетилированным, и Ь-транс-4-метилпролина.

Гризелимицин принадлежит к группе микробных пептидов, синтезируемых нерибосомально, эта группа пептидов имеет существенное структурное разнообразие и включает широко распространенный класс наиболее сильных антибиотиков и другие важные фармацевтические агенты. Несмотря на структурное разнообразие, микробные пептиды, синтезируемые нерибосомально, характеризуются общим путем синтеза, механизмом мультиферментной тиоматрицы. В результате чего образование пептидной связи осуществляется на больших мультиферментных комплексах, которые одновременно представляют собой и матрицу, и систему биосинтеза. Эти мультиферментные комплексы обозначаются как нерибосомальные синтетазы пептидов (ЫКР§). Секвенирование генов, кодирующих ЫВР§, выявило их модульную организацию. Модуль представляет собой сегмент полипептидной цепи ЫВР§, который отвечает за включение одного определенного мономера в растущую полипептидную цепь. Таким образом, ЫВР§ используются одновременно в качестве матрицы, так как аминокислота, предназначенная для включения, определяется модулем, и в качестве системы биосинтеза, так как именно модуль имеет все необходимые каталитические функции. Модули могут быть дополнительно разделены на каталитические домены. Эти домены катализируют, по меньшей мере, стадии активации субстрата, ковалентного связывания и образования пептидной связи. Домены с одинаковой функцией имеют ряд высококонсервативных мотивов последовательности. Они могут быть модифицированы для изменений активности в пределах пептидной цепи, что открывает возможности для манипулирования системой ЫКР§.

В пределах каждого модуля выбор специфического субстрата (аминокислоты) опосредуется доменом аденилирования (А-доменом). Этот А-домен отвечает за выбор аминокислот, которые входят в продукт, и таким образом он контролирует первичную последовательность. А-домены активируют амино-, а также некоторые карбоксисубстраты с образованием аминоациладенилата с затратой АТФ. Этот промежуточный продукт реакции затем переносится на концевую тиоловую часть цистеамина простетической группы Ррап, которая присоединена к пептидильному домену белка-носителя (РСР), который обозначается также как домен тиолирования (Т), локализованный ниже А-домена в том же модуле. Он представляет собой транспортную единицу, которая принимает активированную аминокислоту, которая ковалентно связана с его 4'РР кофакторным тиоэфиром. Этот кофактор действует как гибкое плечо, позволяя связанному аминоацильному и пептидильному субстрату перемещаться между различными каталитическими центрами. Сочетание А-домена и Т-домена определяется как модуль инициации, так как оба домена требуются для активации и ковалентного связывания первого строительного блока для последующего синтеза пептида. Модули инициации липопептидных путей содержат дополнительный Ы-концевой С-домен для конденсации ацильной боковой цепи с аминогруппой первой аминокислоты. Домен конденсации или С-домен является центральной частью нерибосомального синтеза пептидов потому, что он отвечает за образование пептидной связи между аминоацильными субстратами, связанными с Т-доменом соседних модулей. Фермент катализирует нуклеофильную атаку аминогруппы (или имино, гидроксильной) группы активированной аминокислоты, связанной с нижележащим (относительно С-домена) модулем на ацильной группе, или аминокислоты, связанной с вышележащим модулем. Полученный пептидильный промежуточный продукт затем переносится ниже линии сборки для последующей конденсации и дополнительных стадий модификации. В процессе синтеза растущая пептидная цепь передается от одного модуля к следующему модулю до тех пор, пока она не достигает конечного модульного Т-домена. Этот модуль содержит в большинстве случаев ТЕ (тиоэстеразный)-домен, который важен для высвобождения продукта. Высвобождение продукта достигается в результате двухстадийного процесса, который включает ацил-О-ТЕ-ферментный промежуточный продукт, на который затем воздействует либо внутренний нуклеофил пептида, либо вода, что приводит к макроциклическому продукту или линейному пептиду, соответственно.

Особенно интересной чертой нерибосомальных пептидов является присутствие Ό-аминокислот. Один путь включения Ό-аминокислот заключается в использовании селективного для Ό-аминокислот А- 1 029209

домена. Более общим путем является, однако, использование Е-доменов (эпимеризации), которые находятся на С-конце модулей, ответственных за включение Ό-аминокислот. Фермент катализирует эпимеризацию связанной с Т-доменом Ь-аминокислоты растущей пептидной цепи. Дискриминация связанной с Т-доменом Ь-аминокислоты путем энантиоселективности нижележащего донорского сайта домена конденсации ведет к чистому продукту с Ό-конфигурацией.

Ряд ΝΡΡδ содержит метилтрансферазы (МТ-домен), который отвечает за Ν- или С-метилирование аминокислотных остатков, делая, таким образом, пептид менее чувствительным к протеолитическому расщеплению. Оба типа метилтрансфераз (Ν- или С-метилтрансферазы или сокращенного Ν-МТ или СМТ) используют З-аденозилметионин в качестве донора метила. МТ-домены часто находятся в виде вставок в А-домены (ЕФкищ с1 МагаШе1, 2004; Мага1ис1. 2009). Еще более удивительным является включение неприродных аминокислот, таких как метилпролин, биосинтез которых обычно осуществляется перед их использованием в линии сборки. Альтернативно, включенные аминокислоты могут быть модифицированы ферментативно после сборки с помощью ΝΚΡδ.

Гризелимицин в природе продуцируется микроорганизмами рода З1гер1отусез. Однако, хотя продукция гризелимицина З1гер1отусез известна в данной области техники, генетический локус, ответственный за биосинтез гризелимицина, до сих пор не идентифицирован. Следовательно, направленное воздействие на биосинтез гризелимицина и его модификацию все еще ограничено. Соответственно, существует потребность в генетической информации, касающейся биосинтеза гризелимицина.

Краткое изложение сущности изобретения

Кроме гризелимицина ЗВерФтусез продуцируют также вариант гризелимицина, называемый метилгризелимицин. Метилгризелимицин содержит Ь-транс-4-метилпролин вместо Ь-пролина.

Метилгризелимицин обладает рядом преимуществ, таких как, например, отличная от гризелимицина антибактериальная специфичность при его использовании в качестве антибактериального агента, однако он продуцируется ЗВерФтусез только как побочный продукт. Соответственно, существует потребность в генетической информации относительно биосинтеза метилгризелимицина.

Продукция метилпролиновой части как составляющей метилгризелимицина по сравнению с гризелимицином совершенно неизвестна. Соответственно, существует потребность в генетической информации относительно биосинтеза Ь-транс-4-метилпролина.

В настоящее время идентифицирован генетический локус, кодирующий полипептиды, вовлеченные в путь биосинтеза (метил)гризелимицина. Изобретатели настоящего изобретения достигли успеха в выделении и клонировании полного кластера генов биосинтеза гризелимицина из геномной ДНК ЗВерФтусез Ό3Μ 26643. Изобретатели настоящего изобретения достигли также успеха в выявлении открытых рамок считывания (ΘΡΕ), которые кодируют полипептиды, вовлеченные в путь биосинтеза (метил)гризелимицина, включая отвечающие за образование Е-транс-4-метилпролина. Это позволяет идентифицировать на молекулярном уровне отдельные стадии биосинтеза и влиять на них.

Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, включающая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, выбранную из:

(a) нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из открытых рамок считывания (ОКЕ) с 1 по 26 как составляющих ЗЕО ГО ΝΟ: 1, кодирующей белки с ЗЕО ГО ΝΟ: 2-27 или их вариант или фрагмент, где вариант или фрагмент кодирует функционально активный вариант или фрагмент белка с ЗЕО ГО ΝΟ: 2-27,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из белков с ЗЕО ГО ΝΟ: 2-27 или его функционально активный вариант или фрагмент,

(c) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 97% идентичен аминокислотной последовательности белка или его фрагмента, кодируемого нуклеиновой кислотой по (а) или (Ь),

(б) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой (а)(с),

(е) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой (а)(б) и состоит из 10-50 нуклеотидов в длину, или

(ί) нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте (а)-(Г).

Подробное описание

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота как составляющая часть настоящего изобретения представляет собой нуклеиновую кислоту, включающую или состоящую из ЗЕО ГО ΝΟ: 1, являющуюся частью генома ЗВерФтусез ЭЗМ 26643, включающую кластер генов биосинтеза гризелимицина длиной 66868 нуклеотидов. Этот впервые открытый кластер генов содержит по меньшей мере 26 ΟΚΕ, обозначаемых как от ΟΚΕ 1 по ΟΚΕ 26 (ΟΚΕ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26) или обозначаемых по названиям генов огГ-1, огГ-2, огГ-3, огГ-4, огГ-5, огГ-6, огГ-7, пгрз-1, ίηΐ-1, Фр-1, ίηΐ-2, Фр-2, Фр-3, бпа, пгрз-2, пгрз-3, тЫН, трз-1, трз-2, трз-3, трз-4, огГ-8, огГ-9, огГ10, огГ-11, огГ-12, соответственно, из нуклеотидов от 837 до 66108 ЗЕО ΙΝ ΝΟ: 1 с длиной 65272 нуклеотида. Эти ΟΚΕ кодируют белки с ЗЕО ГО ΝΟ: 2-27 (ЗЕО ГО ΝΟ: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27), соответственно, вовлеченные в биосинтез (ме- 2 029209

тил)гризелимицина. Структурная и функциональная характеристика белков, кодируемых кластером генов биосинтеза гризелимицина, представлена ниже.

В контексте настоящего изобретения термин "(метил)гризелимицин" относится к гризелимицину, а также к метилгризелимицину. Гризелимицин представляет собой антибиотик, который состоит из десяти аминокислот, представляющих собой Ь-Ы-метилвалин, который является Ν-ацетилированным (1), Ьтранс-4-метилпролин (2), Ь-Ы-метилтреонин (3), Ь-лейцин (4), Ь-транс-4-метилпролин (5), Ь-лейцин (6), Ь-Ы-метилвалин (7), Ь-пролин (8), Ό-Ν-метил-Э-лейцин (9) и глицин (10). Структурная формула гризелимицина и метилгризелимицина дана на фиг. 1. Гризелимицин и его вариант метилгризелимицин продуцируются в разных количествах по одному и тому же пути биосинтеза с вовлечением одних и тех же генов кластера генов биосинтеза (метил)гризелимицина, как идентифицировано в настоящем изобретении. Метилгризелимицин отличается от гризелимицина присутствием Ь-транс-4-метилпролина вместо Ьпролина в положении 8. Мультидоменный фермент, ответственный за включение Ь-транс-4метилпролина в метилгризелимицин и Ь-пролина в гризелимицин, представляет собой один и тот же фермент, называемый ΝΚΡδ-2, и является белковым продуктом гена игр8-2, как идентифицировано в настоящем документе.

В контексте настоящего изобретения термин "кластер генов" относится к набору из нескольких генов, которые локализованы последовательно на отрезке генома и которые управляют синтезом (метил)гризелимицина. Некоторые из генов, принадлежащих к кластеру генов, представляют собой гены, которые относятся и сгруппированы в семейство генов. Они кодируют белки, которые являются сходными по структуре и функции. Оставшиеся гены не сходны по структуре и кодируют белки, которые имеют различную структуру и функцию. Кодируемые белки представляют собой ферменты, которые или катализируют реакции или вовлечены, среди прочего, в регуляцию или транспорт. Совместно гены как составляющие кластера генов кодируют белки, которые служат для биосинтеза (метил)гризелимицина.

Термин "нуклеиновая кислота" охватывает нуклеиновые кислоты, которые определены ОКР с 1 по 26, кодирующие белки с 8ЕС ГО N0: 2-27, соответственно, а также их природные и неприродные варианты или фрагменты (как определено в настоящем описании). Нуклеиновая кислота может представлять собой любую макромолекулу, состоящую из цепей мономерных нуклеотидов, несущих генетическую информацию или образующих структуры в клетках. Наиболее обычные (и, следовательно, предпочтительные) нуклеиновые кислоты представляют собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновая кислота может представлять собой молекулу ДНК, такую как молекула геномной ДНК, такая как 8ЕС ГО N0: 1, или молекулу кДНК, которая может быть одно- или двухцепочечной, такой как нуклеиновая кислота, представляющая ОКР и кодирующая белок, а также синтетическую ДНК, такую как синтезированный одноцепочечный полинуклеотид, такой как праймер или зонд. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может также представлять собой молекулу РНК. Предпочтительно термин также относится к некодирующим областям гена, когда эти участки имеют соответствующий размер для того, чтобы быть специфичными для гена. Примерами этих областей являются регуляторные элементы, такие как промотор. Наиболее предпочтительно термин "нуклеиновая кислота" относится к гену, ОКР, промотору, ДНК, кДНК или мРНК. Нуклеиновая кислота, кодирующая желаемую генетическую информацию, предпочтительно ДНК, может включать представляющий интерес ген, область промотора, кодон инициации транскрипции и стоп-кодон и возможно дополнительные области, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии гена. Регуляторные области могут быть гетерологичными по отношении к соответствующему гену или могут быть связаны с ним в природе. В клетке, в которую введена нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, генетическая информация может экспрессироваться перманентно или под контролем репрессорной и/или промоторной области. Полученные клетки могут использоваться либо прямо, либо использоваться для клеточных культур, или клетки можно собрать, и образцы, включающие соответствующий белок, получить путем разрушения клеток. Альтернативно, ДНК или РНК можно использовать либо в клетках, либо в бесклеточных экспрессионных системах, таких как, например, системы микроматриц, в которых ДНК или РНК иммобилизуют и вызывают их трансляцию и/или транскрипцию путем добавления функционального клеточного лизата, включающего факторы, требуемые для транскрипции и/или трансляции (ферменты, рибосомы, тРНК, аминокислоты, нуклеотиды, АТФ и т.д.). Включаются также искусственные нуклеиновые кислоты, которые включают пептидо-нуклеиновую кислоту (ΡΝΑ), морфолино- и закрытую нуклеиновую кислоту (ΕΝΑ), а также гликоль-нуклеиновую кислоту (ΟΝΑ) и треозо-нуклеиновую кислоту (ΤΝΑ). Каждая из них отличается от природной ДНК или РНК изменениями остова молекулы.

Термин "включающий" при применении в настоящем описании обозначает "содержащий или охватывающий" желаемый признак и дополнительные признаки, которые не должны специально оговариваться. Термин "включающий" также обозначает "состоящий из" желаемого признака и не включает дополнительные признаки, за исключением желаемого признака. Таким образом, нуклеиновая кислота или белок, на которые ссылаются в настоящем описании, могут быть определены с помощью дополнительных признаков вдобавок к указанному определению, например, в дополнение к определению с помощью ОКР или номера 8ЕС ГО, или могут состоять только из определения по такому указанному признаку.

Термин "гетерологичная", когда он относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, таким

- 3 029209

как кодирующие или контролирующие последовательности, обозначает последовательности, которые обычно не связаны с областью рекомбинантного конструкта и/или конкретной клеткой. "Гетерологичная" область представляет собой поддающийся идентификации сегмент нуклеиновой кислоты, находящийся в пределах другой нуклеиновой кислоты или присоединенный к ней, который не находится в связи с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область конструкта может представлять собой регуляторную область, не находящуюся в связи с геном при идентификации ее в природе. Сходно гетерологичная последовательность может представлять собой кодирующую последовательность, которая сама по себе не найдена в природе, так как она содержит, например, синтетические последовательности с кодонами, отличными от природного гена. Более того, клетка-хозяин, трансформированная конструктом, который обычно не присутствует в клетке-хозяине, должна рассматриваться как гетерологичная для целей настоящего изобретения. Гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой вариант последовательности, как определено в настоящем описании. Термин "гомологичная" может использоваться взаимозаменяемо с вариантом. Термин "гомологичная" может также относиться к идентичной последовательности.

В варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует по меньшей мере один конкретный белок, соответствующий 8БО ГО N0: 2-27. В конкретном варианте осуществления полная последовательность кластера генов (метил)гризелимицина, составляющая 8Б0 ГО N0: 1, включает нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления нуклеиновые кислоты представляют собой варианты или фрагменты 0КБ с 1 по 26, кодирующие функционально активные варианты или фрагменты, по меньшей мере, одного из белков с 8Б0 ГО N0: 2-27. Наиболее предпочтительная нуклеиновая кислота кодирует природный вариант белка с 0КБ с 1 по 26, как подробно описано ниже, более предпочтительно природный белок 81гср1отусс5. еще более предпочтительно белок с 8Б0 ГО N0: 2-27, который вовлечен в синтез (метил)гризелимицина.

Термин "нуклеиновая кислота" может включать полноразмерные 0КБ с 1 по 26, как описано в настоящем документе, или может включать фрагменты или частичные последовательности 0КБ с 1 по 26. Такие фрагменты или частичные последовательности 0КБ с 1 по 26 кодируют фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, представленными с 8Б0 ГО N0: 2-27 соответственно. Они могут включать фрагменты белков с короткими внутренними и/или С-концевыми и/или ^концевыми делециями, в результате чего активность полученных белков, как идентифицировано в настоящем описании, поддерживается до степени более 5%, более 10%, более 20%, более 30%, более 40%, более 50%, более 60%, более 70%, более 80%, более 90%, более 95%, более 97% или более 100%, например более 150%, 200%, 300%, 400% или 500% активности белков дикого типа, кодируемых 0КБ с 1 по 26. Следовательно, соответствующая нуклеиновая кислота, кодирующая такие фрагменты, содержит делеции внутри и/или на 5'- и/или З'-концах 0КБ с 1 по 26, например делеции самое большее 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5% или менее. В контексте настоящего изобретения последовательность фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей функционально активный фрагмент белка с 8Б0 ГО N0: 2-27, обозначает последовательность, кодирующую фрагмент, который управляет синтезом (метил)гризелимицина и/или который может быть замещен на соответствующую 0КБ, кодирующую белок с 8Б0 ГО N0: 2-27, для управления синтезом (метил)гризелимицина.

Термин "нуклеиновая кислота" может относиться к вариантам 0КБ с 1 по 26, как раскрыто в настоящем описании, кодирующим функционально активные варианты белков с 8Б0 ГО N0: 2-27, как определено в настоящем описании. Такие функционально активные варианты характеризуются идентичностью последовательностей с 8Б0 ГО N0: 2-27 более 50%, более 60%, предпочтительно более 70%, более предпочтительно более 80%, еще более предпочтительно более 85%, даже еще более предпочтительно более 90%, даже еще более предпочтительно более 95%, наиболее предпочтительно более 97%, и/или имеют активность более 5%, более 10%, более 20%, более 30%, более 40%, более 50%, более 60%, более 70%, более 80%, более 90%, более 95%, более 97% или более 100%, например, более 150%, 200%, 300%, 400% или 500% от активности белков с 8Б0 ГО N0: 2-27. Следовательно, нуклеиновая кислота, кодирующая такие варианты, содержит делеции, вставки, замены и/или добавления внутри и/или на 5'- и/или 3'-концах 0КБ с 1 по 26, и характеризуется идентичностью с последовательностями 0КБ с 1 по 26 более 50%, более 60%, более 70%, предпочтительно более 80%, более предпочтительно более 85%, еще более предпочтительно более 90%, даже более предпочтительно более 95%, наиболее предпочтительно более 97%. В контексте настоящего изобретения последовательность варианта нуклеиновой кислоты, кодирующая функционально активный вариант белка с 8Б0 ГО N0: 2-27, обозначает последовательность, кодирующую вариант, который управляет синтезом (метил)гризелимицина и/или который может быть замещен на соответствующую 0КБ, кодирующую белок с 8Б0 ГО N0: 2-27, для управления синтезом (метил)гризелимицина.

Отмечается, что указанные выше модификации могут сочетаться. Например, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент, включающий один или более вариантов 0КБ с 1 по 26. Следует отметить, что фрагменты или варианты включают фрагменты или варианты, как определено в настоящем описании, промотор или регуляторные последовательности, с которыми

- 4 029209

ОКР с 1 по 26 или их фрагменты или варианты связаны в природе. Эти варианты являются функционально активными в том смысле, что они регулируют транскрипцию или трансляцию связанных с ними генов.

ОКР представляет собой открытую рамку считывания, которая является последовательностью ДНК, которая потенциально может кодировать белок. В контексте настоящего изобретения термин "ОКР" обозначает открытую рамку считывания в кластере генов биосинтеза (метил)гризелимицина 81гер1отуеек Ό8Μ 22643 (ОКР с 1 по 26). Изобретатели настоящего изобретения достигли успеха в идентификации кластера генов биосинтеза гризелимицина 81гер1отуеек Ό8Μ 22643 и идентифицировали 26 ОКР вдоль участка из 65272 нуклеотидов. Эти ОКР обозначены как огР-1, огР-2, огР-3, огР-4, огР-5, огР-6, огР-7, игрк-1, ίηΐ-1, ΐηρ-1, ίηΐ-2, ίηρ-2, ΐηρ-3, йиа, игрк-2, игрк-3, тЫН, трк-1, трк-2, трк-3, трк-4, огР-8, огР-9, огР-10, огР11 или огР-12, соответственно. Полный кластер генов биосинтеза гризелимицина 81гер1отусек Ό8Μ 22643 составляет 668 68 нуклеотидов в длину, включая ОКР с 1 по 26 и дополнительные нуклеотиды, локализованные от 5'- до 3'-конца от ОКР1 до ОКР26 соответственно.

26 ОКР, включенных в 8ЕО ГО ИО: 1, расположены от нуклеотида 837 до нуклеотида 66108 8ЕО ГО ИО: 1 81гер!отусек Ό8Μ 26643. В табл. 1 представлен перечень конкретных предполагаемых ОКР, обозначение соответствующих генов, нуклеотиды инициации транскрипции и стоп-кодона в пределах 8ЕО ГО ИО: 1, длины генов в нуклеотидах (ηΐ), цепь, количество аминокислот (аа) в предполагаемых кодируемых ими белках, обозначения белков и номера 8ЕО ГО белков. В табл. 2 представлены белки, которые обозначены их номерами поступления в ΟеиΒаик, доступными из ИСВ1 (ИаЦот1 Сейте Рог В^оίЬесЬηо1оду IиРо^таί^оη; Иа1юга1 ЫЬгагу оР Μеά^с^ηе 38А, ВеШекйа. ΜΌ20894; И8А; №№№.ηсЬ^.и^Ь.доν). Эти белки идентифицированы на основе поисков гомологии, как проявляющие наибольшую идентичность/сходство с белками с 8ЕО ГО ИО: 2-27. Эти белки определяются по их функции, их номеру поступления и их происхождению. Более того, в табл. 2 представлена е-уа1ие и степень идентичности и сходства между белками с 8ЕО ГО ИО: 2-27 и белками, идентифицированными на основе поисков гомологии. Е-уа1ие относится к ожидаемому числу случаев выравнивания с подсчетом очков выравнивания, по меньшей мере, равным наблюдаемому числу очков при выравнивании. Е-уа1ие 0,00 указывает на полную гомологию. Еуа1ие рассчитывают, как описано у А115с1ш1 8.Р. еΐ а1., 1997. Е-уа1ие способствует определению того, имеют ли две последовательности достаточное сходство для подтверждения вывода о гомологии. Идентичность указывает на то, что идентичные аминокислоты присутствуют в сравниваемых белках в соответствующих сайтах, тогда как сходство указывает на то, что консервативные аминокислотные замены, как определяется в настоящем описании ниже, присутствуют в соответствующих сайтах. Более того, указывается предполагаемая функция белков, кодируемых ОКР с 1 по 26.

Замена вариантом нуклеиновой кислоты ОКР с 1 по 26 для управления синтезом (метил)гризелимицина обозначает, что этот вариант нуклеиновой кислоты может быть вставлен в геном 81гер1отусе5 Ό8Μ 22643 вместо ОКР, вариантом которой он является, в результате чего экспрессируется вариант белка, который принимает на себя функцию соответствующего белка с 8ЕО ГО ИО: 2-27 и управляет, т.е. участвует в синтезе (метил)гризелимицина. Степень, до которой вариант принимает на себя функцию, составляет степень, определенную в настоящем описании.

В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует белок с 8ЕО ГО ИО: 2-27. Нуклеиновая кислота может включать последовательности ОКР с 1 по 26, как представлено в 8ЕО ГО ИО: 1, с нуклеотидами инициации и терминации транскрипции, как показано в табл. 1. Нуклеиновая кислота может также кодировать белок с теми же аминокислотами, что и белки с 8ЕО ГО ИО: 2-27, однако она отличается по своему нуклеотидному составу из-за вырожденности генетического кода.

В дополнительном варианте осуществления нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, в состав которой входит кластер генов биосинтеза (метил)гризелимицина, как показано в 8ЕО ГО ИО: 1, или в состав которой входят ОКР с 1 по 26, или которая кодирует белки с 8ЕО ГО ИО: 2-27 или их функционально активные варианты или фрагменты. В настоящем изобретении термин "гибридизуется(ются), гибридизация(ции) в жестких условиях" относится к образованию гибрида между двумя молекулами нуклеиновой кислоты в условиях, которые допускают образование так называемого специфического гибрида, тогда как неспецифический гибрид по существу не образуется. Примеры таких условий включают условия, при которых комплементарная цепь высоко идентичной нуклеиновой кислоты, а именно ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, идентичной нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО ИО: 1 на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 85% или более, еще более предпочтительно на 90% или более и даже еще более предпочтительно на 95% или более, или представленной ОКР с 1 по 26, гибридизуется, тогда как менее комплементарная цепь нуклеиновой кислоты с меньшей идентичностью, чем представленная выше, не гибридизуется. Более конкретно такие условия относятся к условиям, при которых концентрация натриевой соли составляет от 15 до 750 мМ, предпочтительно от 50 до 750 мМ и более предпочтительно от 300 до 750 мМ, температура составляет от 25 до 70°С, предпочтительно от 50 до 70°С и более предпочтительно от 55 до 65°С, и концентрация формамида составляет от 0 до 50%, предпочтительно от 20 до 50% и более предпочтительно от 35 до 45%. Более того, в жестких условиях условия промывки фильтра после гибридизации обычно включают следующее: концентрация натриевой соли составляет от 15 до 600 мМ,

- 5 029209

предпочтительно от 50 до 600 мМ и более предпочтительно от 300 до 600 мМ, и температура составляет от 50 до 70°С, предпочтительно от 55 до 70°С и более предпочтительно 60°С. Жесткость и, следовательно, специфичность может быть, например, увеличена путем повышения температуры реакции и/или снижения ионной силы реакционного буфера. Например, условия низкой жесткости включают гибридизацию в 3/88С при температуре от комнатной до 65°С, а условия высокой жесткости включают гибридизацию в 0,1/88С при 68°С. Иллюстративные условия средней жесткости (нуклеиновые кислоты гибридизуются в условиях средней жесткости, если они максимально вырождены в отношении состава их кодонов) включают 50% формамид, 5/88С и 1% 8Ό8 при 42°С и промывку в 1/88С при 45°С. Условия высокой жесткости включают инкубацию при 42°С, 50% формамид, 5/88С и 1% 8Ό8 (например, 50% формамида, 5/88С и 1% 8Ό8, 50 мМ фосфат натрия, 5/ раствора Денхардта, 10/ декстран-сульфата, 20 мг/мл ДНК спермы лосося) или 5/88С и 1% 8Ό8 при 65°С и промывка в 0,2/88С и 0,1% 8Ό8 при приблизительно 65°С (1/88С устанавливается для 0,15 М хлорида натрия и 0,015 М тринатрийцитратного буфера). В настоящем изобретении предпочтительными являются условия средней или высокой жесткости, наиболее предпочтительными являются условия высокой жесткости. В контексте настоящего изобретения "гибридизующаяся" последовательность обозначает последовательность, которая кодирует белок, который управляет синтезом (метил)гризелимицина, и/или которая может быть заменена на ОВР. с которой она специфически гибридизуется для управления синтезом (метил)гризелимицина.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, как идентифицировано выше, и состоит из 5-100 нуклеотидов в длину. Информация о последовательности, предлагаемая в настоящей заявке, позволяет создать специфические нуклеотидные зонды и праймеры, которые пригодны для идентификации и выделения микроорганизмов, продуцирующих (метил)гризелимицин и несущих любой из белков с 8ЕО ГО N0: 2-27 или их варианты. Таким образом, нуклеотидный зонд имеет последовательность, найденную в генетическом коде или происходящую в результате вырожденности генетического кода из последовательности в пределах кластера генов биосинтеза (метил) гризелимицина, как представлено в 8ЕО ГО N0: 1 или ее варианте или кодируется любой из 8ЕО ГО N0: 2-27 или их функциональными вариантами. Термин "зонд" относится к ДНК, предпочтительно одноцепочечной, или к молекулам РНК или их модификациям или сочетаниям, которые гибридизуются в жестких условиях, как определено выше, с молекулами нуклеиновой кислоты, включенными в кластер генов биосинтеза (метил)гризелимицина, идентифицируемого 8Е0 ГО N0: 1 или ее вариантами, или кодирующими любой из белков с 8Е0 ГО N0: 2-27 или их функционально активными вариантами, или их комплементарными или смысловыми последовательностями. В целом зонды существенно короче, чем полноразмерные последовательности. Они могут содержать от 5 до 100, предпочтительно от 10 до 80 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов и еще более предпочтительно от 15 до 25 нуклеотидов. В частности, такие зонды могут иметь последовательности, которые по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно на 100% гомологичны кодирующей (0РР с 1 по 26) или некодирующей последовательности, как представлено в 8Е0 ГО N0: 1, или они в более высокой степени комплементарны им. Они могут содержать модифицированные основания, такие как инозин, метил-5-дезоксицитидин, дезоксиуридин, диметиламино-5-дезоксиуридин или диамино-2,6-пурин. Остатки Сахаров или фосфата тоже могут быть модифицированы или заменены, как известно в данной области техники. Например, остаток дезоксирибозы может быть заменен полиамидом, а остаток фосфата может быть заменен группами сложных эфиров, такими как дифосфатные, алкиловые, арилфосфонатные или фосфоротиоатные сложные эфиры. Альтернативно или в дополнение 2'-гидроксильная группа рибонуклеотидов может быть модифицирована путем включения таких групп как алкильные, 0-алкильные или галогеновые группы. Зонды по изобретению используются с любым общепринятым методом гибридизации, таким как дот-блот, блотгибридизация по Саузерну, нозерн-блот-гибридизация или метод сэндвича, который представляет собой метод, использующий специфичные захватывающие и/или определяющие зонды с нуклеотидными последовательностями, которые, по меньшей мере, частично отличаются друг от друга (8атЬтоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: А 1аЬота1оту тапиа1. Со1б 8ртшд НагЬог, ХУ: СоМ 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Рте88, 2001). Праймер используется для инициации ферментативной полимеризации ДНК при амплификации (например, ПЦР), элонгации или в методе обратной транскрипции. Праймеры, используемые в методах диагностики, включая ПЦР, метят с помощью методов, известных в данной области техники. Они могут также использоваться в качестве зондов. В принципе праймеры могут иметь те же самые характеристики, что и зонды. Они могут содержать от 5 до 100, предпочтительно от 10 до 80 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов и еще более предпочтительно от 15 до 25 нуклеотидов. В контексте настоящего изобретения праймер или зонд может быть использован для определения, идентификации и/или выделения микроорганизма, который продуцирует (метил)гризелимицин, в частности, который включает любой из белков с 8Е0 ГО N0: 2-27 или их функционально активные варианты, для определения, идентификации и/или выделения ДНК или РНК,

- 6 029209

кодирующих белки с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или их функционально активные варианты, и/или для амплификации ДНК или РНК, кодирующих белки с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или их функционально активные варианты. Таким образом, в вариант осуществления настоящего изобретения включается реагент, включающий праймер или зонд, с целью определения, идентификации и/или очистки, как представлено выше.

Альтернативно, идентификация нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который обладает активностью в отношении пути биосинтеза (метил)гризелимицина, может быть достигнута путем скрининга реактивности или перекрестной реактивности антитела, выработанного против белка, обладающего аминокислотной последовательностью с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или его функционально активного варианта или фрагмента. Процедура заключается в следующем: вырабатывается антитело против белка с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или его функционально активного варианта или фрагмента, гибридного полипептида (например, продукта экспрессии МВР, С8Т или систем Ηίδ-метки) , или синтетического пептида, происходящего от белка с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или его известного варианта или фрагмента. Специфическая антигенность может быть определена в соответствии с рядом методов, включая иммуноблоттинг, дот-блот и ЕЫ§Л. После выработки специфического антитела это антитело может быть использовано для идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих белки, несущие иммуногенный пептид, против которого выработано антитело, в результате чего идентифицируются белки, которые представляют собой белки с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или его функционально активные фрагменты или варианты, как определено в настоящем описании. Специфическая антигенность или специфическое антитело при применении в настоящем описании обозначает, что антитело связывается только с иммуногенным пептидом, против которого выработано антитело.

В дополнительном варианте осуществления нуклеиновая кислота является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной §ЕЦ ГО N0: 1 или кодирующей белок с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 или его функционально активный фрагмент или вариант.

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота включает по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более 0КГ, выбранных из 0КР с 1 по 26, кодирующих полипептиды, представленные с 8ЕЦ ГО N0: 2-27, кластера генов биосинтеза гризелимицина или их функционально активные фрагменты или варианты. В предпочтигельном варианте осуществления нуклеиновая кислота включает специфичную 0КР или сочетание специфичных 0КГ, которая(ые) вовлечена(ны) в биосинтез и функционируют совместно на определенных стадиях в процессе биосинтеза (метил)гризелимицина. В более предпочтительном варианте осуществления предлагается сочетание 0КГ, выбранное из 0КГ с 1 по 27, которое кодирует полипептиды, которые управляют биосинтезом (метил)гризелимицина. В еще более предпочтительном варианте осуществления 0КГ представляет собой 0КГ 8, 15 или 16, или их сочетание включает по меньшей мере две из 0ΚΤ 8, 15 или 16, обозначаемые пгр8-1, игр8-2 и игр8-3 соответственно, кодирующие субъединицы нерибосомальной протеинсинтетазы (ЫКР§). В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота включает 0КГ 18, 19 или 21 или сочетание по меньшей мере двух 0КГ с 18 по 21, состоящих из генов, обозначаемых тр8-1, тр8-2, тр8-3 и тр8-4 соответственно, или, по меньшей мере две из 0КР 18, 19 и 21, состоящих из генов, обозначаемых тр8-1, тр8-2 и тр8-4 соответственно, которые необходимы для биосинтеза Ь-транс-4-метилпролина. В другом варианте осуществления 0КГ 8, 15 и/или 16 могут сочетаться с 0КГ 18, 19, 2 0 и/или 21 или с 0КГ 18, 19 и/или 21 для повышения продукции Ь-транс-4-метилпролина и (метил)гризелимицина, в частности метилгризелимицина. В результате чего любая из 0КГ с 1 по 26 может сочетаться с любым вариантом или фрагментом 0КР с 1 по 26 для управления синтезом (метил)гризелимицина. В другом варианте осуществления этого изобретения 0КГ могут быть неизмененными, но контролирующие элементы (например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы, энхансеры и т.д.) могут быть модифицированными.

В другом варианте осуществления предлагается нуклеиновая кислота, включающая или состоящая из кластера генов биосинтеза гризелимицина, имеющая последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 или имеющая вариант последовательности §ЕЦ ГО N0: 1, несущая вариант или фрагмент по меньшей мере одной из 0КГ с 1 по 26, в результате чего вариант или фрагмент кодирует функционально активный вариант или фрагмент белка с 8ЕЦ ГО N0: 2-27. Последовательности варианта или фрагмента любой из 0ΚΤ с 1 по 26 в пределах кластера генов биосинтеза (метил)гризелимицина 8ЕЦ ГО N0: 1 в отличие от немодифицированного состояния могут приводить к одному или более вариантам белков с 8ЕЦ ГО N0: 2-27, модифицируя конкретную стадию пути биосинтеза (метил)гризелимицина. Это может приводить к повышенной продукции (метил)гризелимицина или Ь-транс-4-метилпролина или к модифицированной структуре (метил)гризелимицина с повышенной активностью в качестве антибиотика. В качестве примера, любая из 0КГ 8, 15 и 16 и/или 18, 19, 20 и 21 может быть модифицирована в пределах кластера генов биосинтеза гризелимицина по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 1, как указывается выше, тогда как оставшиеся 0КР остаются немодифицированными. Альтернативно или дополнительно можно модифицировать контролирующие элементы, что приводит к модифицированной экспрессии, по меньшей мере, одной из 0КГ с 1 по 26.

Таким образом, в одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, включающая по меньшей мере одну 0КГ, вовлеченную в биосинтез (метил)гризелимицина, такую как 0ΚΤ 18, 19, 20 и 21 или обозначаемые по-другому 0ΚΤ с 18 по 21, или 0ΚΤ 18, 19 и/или 21,

- 7 029209

и/или ОКБ 8, 15 и/или 16, или функционально активные варианты или фрагменты этих ОКБ, как определено в настоящем описании. Одна ОКБ или сочетание ОКБ может быть экспрессировано или гиперэкспрессировано в гетерологичной клетке для того, чтобы обеспечить продукцию соответствующих белков, которые могут использоваться, например, в качестве ферментативной поддержки для увеличения продукции гризелимицина и особенно метилгризелимицина в организме, продуцируя гризелимицин и/или метилгризелимицин эндогенно или гетерологично. Альтернативно ОКБ или сочетание ОКБ как составляющие изобретения экспрессируются или гиперэкспрессируются в клетке или организме, продуцирующем (метил)гризелимицин, для увеличения продукции соответствующего(щих) белка(ков) для того, чтобы повысить продукцию (метил)гризелимицина и/или благоприятствовать продукции метилгризелимицина. Например, ОКБ с 18 по 21 или ОКБ 18, 19 и 21 могут экспрессироваться сопутствующим образом, создавая возможность синтеза Б-транс-4-метилпролина. Повышенная продукция Б-транс-4метилпролина может служить для повышения продукции метилгризелимицина по сравнению с продукцией гризелимицина, что может быть продемонстрировано путем предоставления 4-метилпролина, в результате чего получено в пять раз более высокие выходы метилгризелимицина. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выход метилгризелимицина у δΐτβρΐοтусек ΌδΜ 22643 или другого организма, продуцирующего (метил)гризелимицин, может быть повышен путем введения нуклеиновой кислоты, включающей гены, вовлеченные в биосинтез Б-транс-4метилпролина, в частности ОКБ с 18 по 21, более предпочтительно ОКБ 18, 19 и 21, в соответствии с методами, известными в данной области техники, или как описано в настоящем документе, и создания возможности экспрессии указанных генов и генов кластера генов биосинтеза гризелимицина. Альтернативно или дополнительно, по меньшей мере, одна нуклеиновая кислота пгрк (ОКБ 8, 15 и/или 16) может быть экспрессирована для синтеза (метил)гризелимицина в гетерологичном организме или в организме, эндогенно экспрессирующем (метил)гризелимицин, для повышения его экспрессии. Альтернативно или дополнительно могут быть экспрессированы варианты нуклеиновых кислот, которые модулируют синтез (метил)гризелимицина, для того, чтобы повысить синтез (метил)гризелимицина, благоприятствовать синтезу метилгризелимицина или создавать производные (метил)гризелимицина с составом аминокислот, отличающимся от состава (метил)гризелимицина, которые являются, например, более эффективными антибиотиками. Например, специфичность аминокислот А-доменов белков ИКР§ может быть изменена путем мутагенеза или путем обмена доменами между синтетазами пептидов, в результате чего осуществляется возможность отбора различных аминокислот и создание производных природного (метил)гризелимицина.

Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая А-домен модуля 8 ЫКР§2, может быть подвергнута мутации с получением варианта нуклеиновой кислоты, который приводит к усилению вставки Бтранс-4-метилпролина в возникающую полипептидную цепь, в результате чего таким образом повышается продукция метилгризелимицина по сравнению с диким типом. Альтернативно, полный модуль 8 может быть заменен или С-домен модуля 8 может быть заменен или мутирован для предпочтительной конденсации метилпролина.

Б-транс-4-метилпролин находится в гризелимицине в положениях 2 и 5, а в метилгризелимицине в положениях 2, 5 и 8. Б-транс-4-метилпролин может быть получен химически, однако химическая продукция является дорогостоящей и затратной по времени. Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, включающая гены, вовлеченные в биосинтез Б-транс-4метилпролина, в частности, ОКБ с 18 по 21, или ОКБ 18, 19 и 21, или функционально активные варианты или фрагменты этих ОКБ, как определено в настоящем описании. Сочетание этих ОКБ может экспрессироваться или гиперэкспрессироваться в гетерологичной клетке для того, чтобы обеспечить продукцию Бтранс-4-метилпролина для использования, например, в качестве ферментативной добавки для повышения продукции гризелимицина и особенно метилгризелимицина в организме, продуцирующем гризелимицин и/или метилгризелимицин эндогенно или гетерологично. Альтернативно, сочетание этих генов экспрессируется или гиперэкспрессируется в клетке или организме, продуцирующем (метил)гризелимицин в природе, для повышения продукции Б-транс-4-метилпролина для того, чтобы благоприятствовать продукции метилгризелимицина. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выход метилгризелимицина у ЭгерЮтусек ΌδΜ 22643 может быть повышен путем введения нуклеиновой кислоты, включающей гены, вовлеченные в биосинтез Б-транс-4метилпролина, в частности, ОКБ с 18 по 21, более предпочтительно ОКБ 18, 19 и 21, в организм, эндогенно или гетерологично продуцирующий гризелимицин и/или метилгризелимицин, например, 51гер1отусек ΌδΜ 22643, в соответствии с методами, известными в данной области техники или описанными в настоящем документе, и обеспечения экспрессии указанных генов и генов кластера генов биосинтеза гризелимицина.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена с помощью любых методов, известных в данной области техники. Используя информацию о последовательности, предлагаемую в настоящем описании, праймеры, подходящие для амплификации/выделения одной или более ОКБ, могут быть определены в соответствии со стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Праймеры, подходящие для амплификации/выделения одной или более ОКБ,

- 8 029209

как определено в настоящем описании, создаются в соответствии с информацией о нуклеотидной последовательности, представленной в перечне последовательностей. Процедура является следующей: выбирают праймер, который может состоять из 10-40, предпочтительно 15-25 нуклеотидов. Выгодно выбирать праймеры, содержащие нуклеотиды С и О в пропорции, достаточной для уверенности в эффективной гибридизации; т.е. нуклеотиды С и О в количестве по меньшей мере 40%, предпочтительно 50% от суммарного содержания нуклеотидов. Обычно такие амплификации должны использовать в качестве матрицы ДНК или РНК организма, содержащего необходимые гены (например, 8!гер!отусек, в частности §!гер!отусек ΌδΜ 22643). Должна выполняться стандартная реакция ПЦР, которая обычно содержит от 0,5 до 5 единиц Тад ДНК-полимеразы на 100 мкл, от 20 до 200 мкМ каждого дезоксинуклеотида, предпочтительно в эквивалентных концентрациях, от 0,5 до 2,5 мМ магния на суммарную концентрацию дезоксинуклеотидов, от 105 до 106 молекул-мишеней и приблизительно 20 пмоль каждого праймера. Выполняют приблизительно от 25 до 50 циклов ПЦР. Более жесткие условия температуры отжига улучшают дискриминацию праймеров с некорректным отжигом и снижают включение некорректных нуклеотидов на З'-конце праймеров. Температура денатурации от 95 до 97°С является типичной, хотя более высокие температуры могут подходить для денатурации О+С-обогащенных мишеней. Количество осуществляемых циклов зависит от исходной концентрации молекул-мишеней, хотя обычно не рекомендуется более 40 циклов, так как неспецифические фоновые продукты имеют тенденцию к аккумуляции. Альтернативный метод поиска полинуклеотидов, кодирующих варианты полипептидов, как определено в настоящем описании, представляет собой скрининг гибридизации библиотеки ДНК или РНК с использованием праймеров и зондов, как определено в настоящем описании. Методы гибридизации хорошо известны и описываются в данной области техники и в настоящем описании.

Альтернативно или дополнительно к представленному выше нуклеиновая кислота может предлагаться путем клонирования и тем самым ее введения и ее амплификации в клетке. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагаются вектор, включающий нуклеиновую кислоту, как определено в настоящем описании, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором. Метод введения гена в клетку-реципиент называется трансформацией. Гены могут быть введены в клетки с помощью различных способов, известных в данной области техники и адаптированных для каждого клеточного типа. Термин "клетка" или "клетка-хозяин" относится к клетке, в которой экспрессируется ген, независимо от того, является ли клетка прокариотной или эукариотной клеткой и от того, экспрессирует ли клетка соответствующие гены в природе или нет, в результате чего в предпочтительном варианте осуществления клетка может представлять собой клетку, которая в природных условиях несет ген, экспрессирующий белок, включенный в настоящее изобретение, например, 81гер!отусек ΌδΜ 22643. Для введения и экспрессии гена, который является либо эндогенным, если клетка несет соответствующий ген, либо гетерологичным, если ген не является эндогенным для клетки, могут быть использованы методы клонирования рекомбинантной ДНК для введения и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, хорошо известные в данной области техники. Клетки можно трансформировать с использованием любых подходящих методов, включая векторы на основе вирусов или бактериофагов, химические агенты, электропорацию, совместную преципитацию с фосфатом кальция или прямую диффузию ДНК. Векторы представляют собой агенты, которые переносят эндогенный или гетерологичный ген в клетку, и могут включать подходящие сигналы, контролирующие транскрипцию и трансляцию, такие как промотор. Векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине или могут быть включены в хромосомную ДНК. Термин "векторы" включает векторы, которые функционируют в первую очередь для включения нуклеиновой кислоты в клетку, векторы, которые функционируют в первую очередь для репликации нуклеиновой кислоты (репликационный вектор) в клетке, или векторы, которые функционируют в первую очередь для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК в клетке. Примеры векторов включают рВТгр2, рВТас1, рВТас2 (все они производства Воейппдег Маппйеип). рКК263-2 (производства Рйагтааа), рОЕХ (производства Рйагтааа), р8Е280 (производства 1пуНгодеп), рОЕ-МЕХ-1 (производства Рготеда), рЦЕ-8 (производства Ц1адепе), рЕТ-3 (производства Ыоуадеп), рВ1иексг1р! II 8К+ (производства 8!га!адепе), рВ1иексг1р! II 8К(-) (производства 8!га!адепе), рТг§30 [полученный из ЕксЬепсЫа сой 1М109/рТг§30 (РЕРМ ВР-5407)], рТг§32 [полученный из ЕксЬепсЫа сой 1М109/рТг§32 (РЕРМ ВР5408)], р§ТУ28 (производства Такага Вю Шс.), рИС118 (производства Такага Вю Шс.), рН\1520 (производства МоВГТес), р8ЕТ152, рО1436 и рО1446 (В1егтап М, е! а1., 1992), р8Н19 (НЕга1 8. е! а1., 2004), р1Л\Т199. р1Л\'1.218 и рк\\Т219 (\еПшсчеги.Р., 1995) и рН6021 (Такапо Е. е! а1., 1995).

Промотор может быть индуцибельным или конститутивным, общим или специфичным для клетки, специфичным для ядер или цитоплазмы, гетерологичным или связанным с геном в природе. Может быть использован любой тип промотора до тех пор, пока он функционирует в клетках-хозяевах. Примеры промоторов включают промоторы, происходящие от ЕксЬепсШа сой или фага, такие как промотор 1гр (Р1гр), промотор 1ас (Р1ас), промотор РЬ, промотор РР или промотор Р8Е, промотор 8РО1, промотор 8РО2 и промотор репР. Кроме того, также могут быть использованы искусственно созданные или модифицированные промоторы, такие как промотор, образованный в результате размещения двух Р!гр в серии (Р1гр*2), промотор !ас, промотор 1асТ7 или промотор 1е! I. Более того, также может быть использован промотор ху1А для экспрессии в бактериях рода ВасШик или промотор Р54-6 для экспрессии в бактериях

- 9 029209

рода СотупеЬас!егшт. Дополнительные пригодные промоторы включают РегтЕ (В1ЬЬ е! а1., 1985, РегтЕ* (В1ЬЬ е! а1., 1994), РйрЛ (Мигакат1 е! а1., 1989), экспрессионную систему ΡηίΐΆ-ΝίίΚ (Нета1 е! а1., 2004) и активатор-промоторную систему асШ-ОКЕ4/Рас11 (Рета'пйе/-Могепо е! а1., 1991). Выбор промоторов, векторов и других элементов проводится общепринятым способом. Многие такие элементы описываются в литературе и доступны из коммерческих источников. В клетку может быть введен один ген. В клетку также можно ввести и экспрессировать в ней более одного гена. Когда подлежат экспрессии большие кластеры, предпочтительно, чтобы были использованы фагемиды, космиды, РУ УЛСУ ВЛСХ РАСУ НЛСк или сходные клонирующие векторы. Если в клетку вводится более одного гена, то гены могут находиться под регуляцией одного и того же промотора и/или регуляторных элементов. Альтернативно, гены могут находиться под регуляцией различных промоторов и/или регуляторных элементов. Обычно метод переноса включает перенос в клетки маркера селекции. В целом, клеточная линия трансформируется с помощью любого из способов, упомянутых выше, где трансген оперативно связан с маркером селекции. После трансформации клетки выращивают в течение подходящего периода времени. Трансформированные клетки проявляют устойчивость при селекции и способны расти, в то время как нетрансформированные клетки в целом гибнут. Примеры маркеров селекции, которые придают устойчивость к пуромицину, зеоцину, аминогликозиду 0-418 и гигромицину В, включают пуромицин, зеоцин, неомицин и гигромицин В соответственно.

Клетки-хозяева, которые подходят в контексте настоящего изобретения в качестве примеров, происходят от любого организма, обладающего способностью нести и экспрессировать кластер генов биосинтеза рекомбинантного гризелимицина или один или более генов кластера генов биосинтеза гризелимицина. Примеры включают бактерии, дрожжи, нитчатые грибы, клетки животных и клетки растений, такие как, без ограничения, клетки штаммов Е. сой, клетки отряда Лс!шотусе!а1е8, такие как виды 8!гер!отусе§, такие как 81тер!отусе8 Ό8Μ 22643 или 81тер!отусе8 соейсо1от, клетки штаммов дрожжей, такие как 8ассйатотусе8 сегеу181ае, линии клеток насекомых, такие как происходящие от 8ройор!ета Ггифрегйа, клетки растений или клетки млекопитающих, такие как клетки Ь6, адипоциты 3Т3, НЕК 293, 745-А, А431, миоциты предсердий, ВхРСЗ, С5^ Сасо-2, Сарап-1, СС531, СРРЛС, СНО, СНО К1, СО8-1, СО8-7, СУ-1, ЕАНУ, ЕЛНУ 926. В предпочтительных вариантах осуществления используются бактериальные клетки, такие как клетки Лс!тотусе1а1е8, такие как 8!тер!отусе8 Ό8Μ 22643 или 8!тер!отусе8 соейсо1от, или клетки штаммов Е. со11. В особенно предпочтительных вариантах осуществления используются бактериальные клетки, такие как клетки отряда Лс!тотусе!а1е8, в частности 8!тер!отусе8 Ό8Μ 22643.

Как указано выше, предпочтительные клетки-хозяева, несущие и экспрессирующие гены по настоящему изобретению, представляют собой бактериальные клетки. Другие клетки-хозяева, подходящие для включения и экспрессии генов по настоящему изобретению, представляют собой созданные или иммортализованные клеточные линии, которые приобрели способность к неограниченной пролиферации либо благодаря случайной мутации, либо преднамеренной модификации, такой как искусственная экспрессия гена теломеразы. Существуют многочисленные хорошо адаптированные клеточные линии, представляющие конкретные клеточные типы, и для выбора подходящей клеточной линии достаточно знаний специалиста в данной области техники.

Клеточная линия представляет собой популяцию клеток, размножающихся в культуре, из которой они произошли, и, следовательно, генетически идентичных единственной общей предковой клетке. Подходящие клеточные линии для целей настоящего изобретения представляют собой клетки НЕК 293 (первичной эмбриональной почки человека), клетки 3Т3 (эмбриональных фибробластов мыши), клетки СНО (яичника китайского хомячка), клетки СО8-7 (клеточной линии африканской зеленой мартышки), клетки НеЬа (эпителиоидной карциномы шейки матки человека), клетки ШРКЛТ (Т-клеточного лейкоза человека), клетки ВНК 21 (фибробласты нормальной почки хомячка) и клетки МСР-7 (рака молочной железы человека).

Альтернативно, нуклеиновые кислоты, как определено в настоящем описании, могут быть клонированы и экспрессированы в тканевой культуре. Термин "тканевая культура" относится к методу, в котором культивируется группа клеток, образующая трехмерную сеть. Ткань может быть образована в культуре самими клетками или может быть образована внеклеточным матриксом, продуцируемом клетками, культуру можно культивировать на природном или искусственном внеклеточном матриксе (например, на коллагене, эластине, полистироле, нейлоне, полилизине), или ткань может быть получена от животного, включая человека. Тканевую культуру можно культивировать в культуральной среде при подходящей температуре. Культуральная среда может содержать питательные вещества (сахара, соли, аминокислоты и липиды), буферную систему (часто включающую одно или более химических веществ для буфера, таких как фосфаты, гидрофосфаты и/или трис с низкой токсичностью или с ее отсутствием и/или углекислый газ (СО₂)) и/или необязательно один или более антибиотиков. Для того чтобы предоставить достаточные количества питательных веществ и/или удалить метаболиты, среда может по необходимости заменяться. Необязательно тканевая культура может перфузироваться средой. Перфузия может представлять собой перманентную или пульсовую перфузию.

С помощью конструирования в нуклеиновую кислоту могут быть введены изменения, например, путем модификации нуклеотида в нуклеиновой кислоте специфическим путем, например, путем замены

- 10 029209

одного заместителя другим, что в результате ведет к частично или полностью искусственному кластеру генов биосинтеза гризелимицина. В качестве дополнительного примера специалист в данной области техники знает термин "синтетическая биология", который касается дизайна и конструирования новых биологических функций и систем, не встречающихся в природе. Например, специалист в данной области техники способен сконструировать последовательность ДНК ίη δίΐίοο и синтезировать ее как не имеющую сходства с уровнем нуклеиновой кислоты с последовательностью дикого типа, однако кодирующую тот(те) же самый(мые) белок(ки), что и последовательность дикого типа. Альтернативно, вариации могут быть сделаны случайным образом, например, путем создания библиотеки молекулярных вариантов (метил)гризелимицина с помощью систематической или бессистемной замены одной или более ОКР в пути биосинтеза. Более того, пригодные варианты и фрагменты нуклеиновой кислоты, которые не существуют в природе, создаются с использованием известных методов. Такая вариация может представлять собой любую модификацию, как подчеркнуто выше, например, замену одного заместителя другим. Например, идентифицируются области полипептида, которые, вероятно, толерантны к изменениям и/или делециям аминокислотной последовательности. В качестве примера, сравниваются варианты полипептидов, вовлеченных в синтез (метил)гризелимицина у различных видов, продуцирующих (метил)гризелимицин; идентифицируются консервативные последовательности. Более отличающиеся последовательности наиболее вероятно толерантны к изменениям последовательности. Гомология последовательностей может быть проанализирована с использованием методов, известных в данной области техники. Методы введения мутаций в нуклеиновую кислоту включают ПЦР с внесением ошибки, сайт-направленный мутагенез, метод, использующий гидроксиламин, или метод, позволяющий агенту, вызывающему мутацию, такому как УФ, действовать на клетки, имеющие нуклеиновую кислоту, представляющую интерес. Когда используют ПЦР с внесением ошибки, например, в качестве матрицы используют плазмиду, в которую включена нуклеиновая кислота, представляющая интерес, реакцию ПЦР осуществляют в реакционном растворе, в котором концентрация соли марганца (Μη) выше, чем при обычной реакции ПЦР.

При использовании информации, предлагаемой в настоящем описании, другие подходы к клонированию желаемых последовательностей должны быть ясны специалистам в данной области техники, например, по меньшей мере, одна из ОКР с 1 по 26, включая полный кластер генов биосинтеза гризелимицина, включающий ОКР с 1 по 26, и/или необязательно нуклеиновые кислоты, кодирующие модули ΝΚΡδ или представляющие интерес ферментативные домены, могут быть получены из организма, который их экспрессирует, с использованием рекомбинантных методов, таких как скрининг кДНК или геномных библиотек, происходящих из клеток, экспрессирующих ген(ы), или получение гена(нов) из вектора, известного как включающий то же самое. Ген(ы) или кластер могут быть затем выделены и объединены с другими желаемыми биосинтетическими элементами с использованием стандартных методов. Если рассматриваемый ген(ы) или кластер уже присутствуют в подходящем экспрессионном векторе, то он(они) могут быть объединены ίη 5Йи. например, с другими доменами или субъединицами, как это желательно. Ген(ы), представляющий(ие) интерес, можно получить синтетически, а не клонированием. Нуклеотидная последовательность с подходящими кодонами может быть создана для конкретной желаемой последовательности аминокислот. В целом, должны выбираться предпочтительные кодоны для предназначенного хозяина, в котором будет экспрессироваться последовательность. Кроме того, отмечается, что коммерчески доступным является традиционный синтез генов.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на белок, включающий, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 2-27, или на его функционально активные фрагменты или варианты, или кодируемые нуклеиновой кислотой, как указано выше. Белок может представлять собой единственный белок или может быть смесью белков, или может представлять собой гибридный белок, состоящий по меньшей мере из двух белков с 8ЕЦ ГО N0: 2-27. Белок может быть выделен, что означает, что он является, по существу, чистым и не связан с компонентами, с которыми он связан в природе, или белок присутствует в лизате клетки, продуцирующей белок. Белки с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 кодируются предполагаемыми ОКР с 1 по 26 соответственно. Эти ОКР принадлежат к кластеру генов биосинтеза гризелимицина и составляют его. На основе анализа последовательностей и поисков гомологии авторы настоящего изобретения достигли успеха в идентификации кластера генов биосинтеза гризелимицина, в идентификации специфичных предполагаемых ОКР в пределах кластера генов и в присваивании идентифицированным ОКР или конкретной белковой функции и/или специфичной гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей известный или гипотетический белок.

Белки по настоящему изобретению охватывают белки с 8ЕЦ ГО N0: 2-27, кодируемые кластером генов биосинтеза гризелимицина 5>1гср1отусс5 ΌδΜ 26643 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, и охватывают белки в том виде, в котором они существуют в других видах и штаммах §1гер1отусе8 и видах, не относящихся к §1гер1отусе8, которые продуцируют (метил)гризелимицин, являющиеся ортологами или гомологами, в результате чего эти ортологи или гомологи имеют ту же самую функцию, что и белки с §ЕЦ ГО N0: 2-27 §1гер1отусе8 ΌδΜ 26643. Предпочтительно их ортологи или гомологи отличаются от последовательностей с 8ЕЦ ГО N0: 2-27, например, добавлением, делецией, заменой и/или вставкой аминокислот и имеют последовательность, идентичную с 8ЕЦ ГО N0: 2-27 более чем на 50%, более чем на 60%, более чем на 70%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 85%,

- 11 029209

еще более предпочтительно более чем на 90%, даже более предпочтительно более чем на 95%, наиболее предпочтительно более чем на 97%, и/или обладают ферментативной активностью более 5%, более 10%, более 20%, более 30%, более 40%, более 50%, более 60%, более 70%, более 80%, более 90%, более 95%, более 97% или более 100%, например, более 150, 200, 300, 400 или 500% от активности белков с ЗЕф ГО N0: 2-27.

В контексте настоящего изобретения существующий или не существующий в природе вариант белков с ЗЕф ГО N0: 2-27 по настоящему изобретению представляет собой функционально активный белок, в том смысле, что он поддерживает биологическую функцию референсного белка с ЗЕф ГО N0: 2-27, т.е. вовлечен в реакцию, в которую вовлечен референсный белок в природных условиях (в случае неприродного варианта в биологическую функцию референсного белка), как представлено в соответствующих главах, раскрывающих функцию белков с ЗЕф ГО N0: 2-27, и может заменять их, как определено в настоящем описании.

Варианты белков с ЗЕф ГО N0: 2-27, не существующие в природе, или их природные варианты могут быть получены путем ограниченного числа аминокислотных делеций, вставок и/или замен, особенно делеций, вставок и/или замен, например, самое большее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислот(ы), с получением в результате этого последовательности, идентичной соответствующим белкам дикого типа по структуре или активности, например, в отношении ЗЕф ГО N0: 2-27, как указано выше.

Вариант может представлять собой модифицированный белок или модифицированный вариант белка, который включает дополнительный компонент. Соответственно, вариант может представлять собой молекулу, имеющую домен, состоящий из природного белка с ЗЕф ГО N0: 2-27 или его варианта, как подробно описано в настоящем описании, и, по меньшей мере, одного дополнительного компонента. В одном предпочтительном варианте осуществления вариант может представлять собой гибридный белок, включающий (ί) белок с ЗЕф ГО N0: 2-27 или его функционально активный вариант и (ίί) дополнительный белковый или пептидный компонент. Например, белок может быть соединен с маркером, таким как метка, используемая в целях очистки (например, метка 6 Ηίδ (или НехаШк), метка %1ср. метка НА, метка с-тус или глутатион-8-трансферазная метка (ОЗТ)). Если, например, должен требоваться высокоочищенный белок с ЗЕф ГО N0: 2-27 или его вариант, могут быть использованы двойные или множественные маркеры (например, сочетания указанных выше маркеров или меток). В этом случае белки очищают в две или более стадий хроматографии, в каждом случае используя аффинность сначала первой, а потом второй метки. Примеры таких двойных или тандемных меток включают метку ОЗТ-Ηίδ (глутатион-8-трансферазу, соединенную с полигистидиновой меткой), 6хН18-метку-100-метку (6 гистидиновых остатков, соединенных с 12 аминокислотами белка МАР-киназы 2 млекопитающих), 8хН18-НА-метку (8 гистидиновых остатков, соединенных с меткой эпитопом гемагглютинина), Н18-МВР (метку Н18, соединенную со связывающим мальтозу белком, РЬАС-НА-метку (РЬАС-метку, соединенную с меткой эпитопом гемагглютинина) и РЬАО-З1гер-метку. Маркер может быть использован для того, чтобы определять белок с меткой, когда могут быть использованы специфические антитела. Подходящие антитела включают анти-НА (такие как 12СА5 или 3Р10), анти-6 Н18, анти-с-тус и анти-ОЗТ. Кроме того, белок может быть соединен с маркером другой категории, таким как флуоресцентный маркер, таким как зеленый флуоресцентный белок, со связывающим белком, таким как стрептавидин, с одним или более низкомолекулярными красителями, такими как краситель Су, или с радиоактивным маркером, который позволяет определять белок по настоящему изобретению. В дополнительном варианте осуществления белки с ЗЕф ГО N0: 2-27 могут представлять собой часть гибридного белка, где вторая часть, такая как белковый компонент, обладающий ферментативной активностью, может быть использована для определения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариант белка с ЗЕф ГО N0: 2-27 может представлять собой фрагмент, где фрагмент все еще является функционально активным. Фрагменты могут представлять собой белки с ЗЕф ГО N0: 2-27 или их варианты, как подробно описано выше, с короткими внутренними и/или С-концевыми, и/или ^концевыми делениями (например, делециями самое большее 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислот(ы) в пределах варианта и/или с С- и/или ^концевыми суммарными делециями 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70% аминокислот или любых величин между этими величинами). Кроме того, фрагмент может быть дополнительно модифицирован, как подробно описано выше для белков с ЗЕф ГО N0: 2-27.

Альтернативно или дополнительно белки с ЗЕф ГО N0: 2-27 или их варианты, как описано выше, могут включать одну или более аминокислотных замен. Однако предпочтительны полуконсервативные и особенно консервативные аминокислотные замены, когда аминокислоту заменяют на химически родственную аминокислоту. Типичные замены осуществляются среди алифатических аминокислот, среди аминокислот, имеющих алифатическую гидроксильную боковую цепь, среди аминокислот, имеющих кислотные остатки, среди амидных производных, среди аминокислот с остатками оснований или аминокислот, имеющих ароматические остатки. Типичные полуконсервативные и консервативные аминокислотные замены представляют собой:

- 12 029209

Аминокислота

А

С

ϋ

Е

Р

С

Н

I

к

р

м

N

Р

Ω

к

8

Т

V

ΑΥ

Υ

Консервативная замена

С; 8; Т А; У;Р Ε; Ν; φ О; Ω;Ν \Υ; Υ; Ъ; Μ; Η А

Υ; Ρ; К; К

V; Υ; Μ; Α Κ; Η

Μ; I; V; Α Ρ; I; V; Α Ω

V; I Ν

Κ; Η

А; Τ; Ο; Ν Α; 8; Ο; Ν; V Α; Ц I Ρ; Υ;Η Ρ; \Υ; Η

Полуконсервативная замена

Ν; V; С Μ; I; Ρ; Ο Α; 8; Τ; Κ; Κ; Η Α; 8; Τ; К; Κ; Η I; V; Α

8; Ν; Τ; ϋ; Ε; Ν; Ρ Ρ; Μ; Α

Ρ; Υ; \Υ; Ο

ϋ; Ε; Ν; <3; 8; Τ; Α

Ρ; Υ; \Υ; Η; С

Ρ; Υ; \Υ; С;

ϋ; Ε; 8; Τ; А; О; К; Κ

Ρ; Α; Μ; \Υ; Υ; 8; Τ; С; Ρ

ϋ; Ε; Α; 8; Τ; Ρ; Μ; К; Ρ

Ν; Ρ; 8; Τ; ϋ; Ε; Α

ϋ; Ε; К; Κ

ϋ; Ε; К; К; I

Μ; Τ; С; Ν

Ρ; Μ; I; V; С

Замена А, Ρ, Η, I, Ь, Μ, Ρ, V, или Υ на С является полуконсервативной, если новый цистеин остается в виде свободного тиола. Кроме того, специалист в данной области техники должен понимать, что глицины в стерически значимых положениях не должны заменяться, и что Ρ не должен вводиться в части белка, которые имеют альфа-спиральную или бета-спиральную структуру. Белки с δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27 или их фрагменты или варианты с заменой могут быть модифицированы, как подробно описано выше для белков с δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27 или их фрагментов или вариантов.

Следует отметить, что указанные выше модификации белков с δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27 могут сочетаться. Варианты по настоящему изобретению могут представлять собой, например, фрагмент белка С δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27, имеющий соединенный с ним маркер или включающий одну или более аминокислотных замен. Дополнительно следует отметить, что любой из белков с δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27 можно сочетать с любым вариантом или фрагментом белков С δΡΡ) ГО ΝΟ: 2-27.

Белки по настоящему изобретению могут быть предоставлены с помощью любых способов, например, путем получения белков из природного источника, с помощью биотехнологических методов, хорошо известных в данной области техники, и/или с помощью методов синтеза. В настоящем описании термин «предоставление» может пониматься в самом широком смысле и может включать, но может не ограниваться этим, любые биохимические или биотехнологические способы, известные в данной области техники, которые могут быть использованы для получения белка или другого продукта. Следовательно, белок может быть получен путем экстракции из природного источника, такого как микроорганизм, содержащий белки, такой как штаммы δί^еρίοтусеδ, в частности δί^еρίοтусеδ ΏδΜ 26643. Специалист в данной области техники должен знать методы выделения белка. Клетки, несущие белок в природе, что охватывается настоящим изобретением, могут быть разрушены с помощью любых методов, известных в данной области техники, но, не ограничиваясь разрушением с помощью ультразвука, гипотонического буфера, детергентов, ЦИгаТштах, френч-пресса, циклов замораживания-оттаивания, механической гомогенизации и затирки. Представляющий интерес белок можно затем выделить известными методами, например, методом экстракции растворителями, методом высаливания, методом преципитации растворителями, методом диализа, методом ультрацентрифугирования, методом гель-электрофореза, гельфильтрационной хроматографией, ионообменной хроматографией, хроматографией с обращенной фазой и аффинной хроматографией, поодиночке или в сочетании, как больше подходит.

Альтернативно белки по настоящему изобретению могут представлять собой белки, которые получают рекомбинантными методами, например, путем клонирования и экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент или вариант, и выделения белка. Методы клонирования нуклеиновых кислот и выделения экспрессируемых белков представляют собой раскрытые выше.

Белки могут быть экспрессированы с подходящими маркерами для облегчения выделения. Маркер (или тег, или метка) представляет собой любой вид вещества, которое способно указывать на присутст- 13 029209

вие другого вещества или комплекса веществ. Маркер может представлять собой вещество, которое присоединено или введено в вещество, подлежащее определению. Поддающиеся определению маркеры используются в молекулярной биологии и биотехнологии для определения, например, белка, продукта ферментативной реакции, вторичного мессенджера, ДНК, взаимодействий молекул и т.д. Примеры подходящего маркера или меток включают флуорофор, хромофор, радиоактивную метку, коллоидный металл, фермент или хемилюминесцентную или биолюминесцентную молекулу. Примеры флуорофоров включают флуоресцеин, родамин и сульфоиндоцианиновый краситель Су5. Примеры радиоактивных меток включают ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³³Р, ³⁵8, ^99тТс или ¹²⁵1. Примеры ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу и уреазу.

Белки по настоящему изобретению, включая их функционально активные варианты и фрагменты, могут экспрессироваться в клетке поодиночке или несколько белков, включая их функционально активные варианты и фрагменты по настоящему изобретению, например, по меньшей мере, два, три, четыре, пять или более белков, могут одновременно экспрессироваться в клетке. Также весь кластер генов биосинтеза гризелимицина может быть экспрессирован гетерологически. Таким образом, включается любое сочетание варианта белка и белка, не являющегося вариантом. В одном варианте осуществления несколько белков, которые вносят вклад в определенный аспект пути биосинтеза (метил)гризелимицина, таких как белки, принадлежащие к тому же самому семейству белков, такие как нерибосомальные протеинсинтетазы, кодируемые генами игр8-1, игр8-2 и/или игр8-3, или такие как белки, кодируемые генами синтеза метилпролина трз-1, трз-2. трз-3 и тр8-4 или трз-1, тр8-2 и трз-4. можно совместно экспрессировать в клетке. В результате чего специфичная стадия синтеза (метил)гризелимицина получает особые преимущества, так что продукция (метил)гризелимицина и в частности метилгризелимицина увеличивается. Альтернативно, могут быть получены варианты, которые влияют на конкретную сторону пути биосинтеза (метил)гризелимицина и в результате на синтез (метил)гризелимицина. Примерами являются варианты одного или более белков с 8ЕО ГО N0: 9, 16 и 17, в частности 8ЕЦ ГО N0: 16, более конкретно модуля 6 с 8Е0 ГО N0: 16, который стимулирует вставку Ь-транс-4-метилпролина в метилгризелимицин, и/или 8Е0 ГО N0: 19, 20 и 22 и возможно 8ЕЦ ГО N0: 21, которые увеличивают синтез Ь-транс-4метилпролина, так что метилгризелимицин продуцируется с более высоким выходом, чем при отсутствии использования таких вариантов. Один или более вариантов могут сочетаться с белками с 8Е0 ГО N0: 2-27, не являющимися вариантами.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается антитело, по меньшей мере, против одного из белков с 8Е0 ГО N0: 2-27 или его функционально активный фрагмент или вариант. В определение белка часто вовлечено использование специфических антител. Соответственно, определение, по меньшей мере, одного из белков с 8Е0 ГО N0: 2-27 или его функционально активного варианта или фрагмента может включать специфическое антитело. Антитела могут быть выработаны с использованием хорошо известных методов иммунизации животных полученными формами антигена. Разнообразные реагенты доступны для использования при получении и очистке антитела, и различные компании специализируются на услугах по продукции антител. В зависимости от планируемого применения требуются различные степени очистки и типы специфичности предоставляемого первого антитела. Отмечая всего несколько параметров, антитела могут быть моноклональными или поликлональными, предоставляемыми в виде антисыворотки или аффинно-очищенного раствора, и пригодными для определения нативного белка или денатурированного белка. Они могут быть гибридными, гуманизированными, мультифункциональными, бифункциональными или олигоспецифическими антителами. Антитела по настоящему изобретению могут включать целые антитела или фрагменты антител, такие как РаЬ, Р(аЬ)₂ или 8с (одноцепочечный) Ρν.

Антитело, которое узнает антиген-мишень, здесь белки с 8Е0 ГО N0: 2-27 или их функционально активный вариант или фрагмент, называют "первым антителом". Если антитело помечено меткой, возможно прямое определение антигена. Обычно, однако, первое антитело не является меченым для прямого определения. Вместо этого на второй стадии для взаимодействия с первым антителом, которое связано с антигеном-мишенью, применяют "второе антитело", которое метят поддающейся определению меткой. Таким образом, антиген определяется непрямо. Другая форма непрямого определения включает использование первого или второго антитела, которое является меченным аффинной меткой, такой как биотин. Затем может быть использован второй (или третий) зонд, такой как стрептавидин, который метят поддающимся определению ферментом или флуорофором, для связывания с биотиновой меткой с получением поддающегося определению сигнала. Существует несколько вариантов стратегий осуществления этого взаимодействия и определения. Однако каждое зависит от специфического зонда (например, первого антитела), чье присутствие прямо или непрямо связано с каким-либо вариантом поддающейся измерению метки (например, с ферментом, активность которого может давать окрашенный продукт при реакции с его субстратом).

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается применение нуклеиновой кислоты или белка, как определено в настоящем описании, включая фрагменты и варианты, экспрессионного вектора, несущего нуклеиновую кислоту, или клетки-хозяина, несущей указанные экспрессионные векторы, для получения (метил)гризелимицина. В частности, предлагается применение по меньшей мере одной из

- 14 029209

нуклеиновых кислот, включающих 0КЕ 8, 15 и 16, или по меньшей мере одного из белков с 8ЕС ГО N0: 9, 16 и 17, включая их фрагменты и варианты, для получения (метил)гризелимицина. Предпочтительно предлагается сочетание нуклеиновых кислот, включающих ОКЕ 8, 15 и 16, или белков с 8ЕС ГО N0: 9, 16 и 17. В отношении терминов "нуклеиновая кислота", "белок", "ОКЕ 8, 15 и 16" и "белки "с 5>ЕС ГО N0: 9, 16 и 17", они относятся к определениям, предлагаемым в контексте нуклеиновых кислот и белков по изобретению.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается применение по меньшей мере одной из нуклеиновых кислот, включающих ОКЕ 18, 19 и 21, или по меньшей мере одного из белков с 8ЕС ГО N0: 19, 20 и 22, включая фрагменты и варианты, для получения Ь-транс-4-метилпролина. Предпочтительно предлагается сочетание нуклеиновых кислот, включающих 0КЕ 18, 19 и 21, или белков с 8ЕС ГО N0: 19, 20 и 22. В отношении 0КЕ 18, 19 и 21 и белков с 5>ЕС ГО N0: 19, 20 и 22 они относятся к определениям, предлагаемым в контексте нуклеиновых кислот и белков по изобретению. В отношении метода получения (метил)гризелимицина или Ь-транс-4-метилпролина делается ссылка на их описание в контексте определения вариантов 0КЕ с 1 по 26.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается метод получения, по меньшей мере, одного из белков или его функционально активного варианта или фрагмента, как определено в настоящем описании, включающий экспрессию нуклеиновой кислоты, включающей формы вариантов и фрагменты, как определено в настоящем описании, и необязательно выделение белка или его функционально активного варианта или фрагмента. Методы клонирования и экспрессии нуклеиновой кислоты и выделения белка известны в данной области техники и раскрыты в настоящем описании.

Настоящее изобретение в предпочтительном варианте осуществления относится к указанной выше нуклеиновой кислоте или к выделенному белку. Термин "выделенный" при применении в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК, относится к нуклеиновой кислоте, которая не связана со всем или частью полинуклеотида, в котором выделенная нуклеиновая кислота находится в природе. Термин "выделенный" при применении в настоящем описании в отношении белков относится к белку, который не связан со всеми или частью компонентов, с которыми выделенный белок находится в природе. Выделенная нуклеиновая кислота или выделенный белок отделены от других клеточных компонентов, которые сопутствуют природной последовательности или белку человека, например, от рибосом, полимераз, многих других геномных последовательностей и белков человека, а также клеточных компонентов любого другого типа. Термин охватывает последовательность нуклеиновой кислоты или белок, которые выделены из их природного окружения, и включает изоляты рекомбинантных или клонированных ДНК или белки, происходящие от них, или синтезированные химически аналоги, или аналоги, биологически синтезированные гетерологичными системами. "Выделенная нуклеиновая кислота" подразумевает включение фрагментов нуклеиновой кислоты, которые выделены из их природного окружения или которые не существуют в природе в виде фрагментов и не должны быть найдены в природе. Термин "выделенный" также относится к белкам, которые отделены от других клеточных белков, и он предназначен также для охвата рекомбинантных белков. Термин "выделенный" не означает "очищенный", который подразумевает, что нуклеиновую кислоту или полипептид, или белок очищают от их природного окружения только путем удаления загрязняющих агентов.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ определения варианта 0КЕ с 1 по 26 или белка с 8ЕС ГО N0: 2-27, который модулирует продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина. Способ включает получение варианта 0КЕ с 1 по 26, экспрессию варианта в белок, позволяющий продуцировать гризелимицин и/или метилгризелимицин или его производное с использованием указанного варианта белка, и определение количества гризелимицина и/или метилгризелимицина, где увеличение количества гризелимицина и/или метилгризелимицина по сравнению с количеством, продуцируемым, если вариант белка не присутствует, но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является показателем того, что вариант способен повышать продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина, или определение активности в качестве антибиотика производного гризелимицина и/или метилгризелимицина, где повышение активности в качестве антибиотика по сравнению с активностью в качестве антибиотика, если вариант белка не присутствует, но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является показателем того, что вариант способен продуцировать производное гризелимицина и/или метилгризелимицина с повышенной активностью в качестве антибиотика, и где производное отличается по аминокислотному составу от гризелимицина и/или метилгризелимицина и проявляет повышенную активность в качестве антибиотика по сравнению с гризелимицином и/или метилгризелимицином. В дополнительном аспекте изобретение охватывает способ определения варианта 0КЕ с 1 по 26 или белка с 8ЕС ГО N0: 2-27, который повышает продукцию Ь-транс-4-метилпролина, включающий получение варианта любой из 0КЕ с 1 по 26, экспрессию варианта в белок, что позволяет продуцировать Ь-транс-4-метилпролин с использованием указанного варианта белка, и определение количества Ь-транс-4-метилпролина, где увеличение количества Ь-транс-4-метилпролина по сравнению с количеством, если вариант белка не присутствует, но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является показателем того, что вариант способен повышать продукцию Ь-транс-4метилпролина.

- 15 029209

При применении в настоящем описании термин "метод" или "тест" может пониматься в самом широком смысле как экспериментальная активность или процедура. Должно быть понятно, что могут быть использованы все методы определения варианта ОКБ с 1 по 26 или белка с 8ЕО ГО N0: 2-27, который способен модулировать или повышать продукцию (метил)гризелимицина или Б-транс-4-метилпролина. Термин «вариант ОКБ с 1 по 26» может пониматься в смысле, определенном в настоящем документе, а именно в смысле вариантов ОКБ с 1 по 26 с заменами, добавками, вставками и/или делециями одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих варианты одного или более белков с 8Е0 ГО N0: 2-27, до тех пор, пока вариант кодирует белок, который способен повышать выход гризелимицина и/или метилгризелимицина, в особенности метилгризелимицина, или Б-транс-4-метилпролина, продуцируемых клеткой, несущей вариант, или изменять состав (метил)гризелимицина так, что (метил)гризелимицин с измененным составом проявляет повышенную активность в качестве антибиотика. Подходящие варианты представляют собой варианты, которые повышают выход гризелимицина и/или метилгризелимицина, в особенности метилгризелимицина, или Б-транс-4-метилпролина по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере, на 400% или, по меньшей мере, на 500%. Альтернативно, подходящие варианты представляют собой варианты, которые изменяют состав (метил)гризелимицина таким образом, что активность в качестве антибиотика повышается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 400% или по меньшей мере на 500%. Термин "модулирует продукцию гризелимицина и метилгризелимицина" обозначает повышение количества продуцируемого гризелимицина и/или метилгризелимицина или вариацию состава гризелимицина и/или метилгризелимицина. Таким образом, одна или две аминокислоты или даже больше аминокислот (например, три или четыре аминокислоты), или один или два или более доменов, или один, два или более модулей могут быть замещены отличными аминокислотами, или доменами, или модулями, соответственно, в результате чего полученные производные гризелимицина и/или метилгризелимицина проявляют повышенную активность в качестве антибиотиков. Например, варианты нуклеиновых кислот, кодирующие А-домен любого из модулей белков ΝΚΡ8, могут приводить к включению отличных аминокислот, что приводит к производному (метил)гризелимицина, которое может обладать повышенной активностью в качестве антибиотика. Термин "получение варианта" обозначает получение с помощью любого метода, известного в данной области техники или описанного в настоящем документе. Метод включает преднамеренно мутированные нуклеиновые кислоты в результате введения направленных мутаций или случайно мутированные нуклеиновые кислоты. После получения варианта нуклеиновой кислоты вариант нуклеиновой кислоты вводят в клетку. Альтернативно, вариант получают в клетке путем применения мутирующих воздействий на клетку. Клетка может природно нести гены продукции гризелимицина и/или метилгризелимицина или Б-транс-4-метилпролина, или клетка может включать гетерологичную систему продукции гризелимицина и/или метилгризелимицина или Б-транс-4-метилпролина. Ген, вариант которого предназначается для экспрессии в клетке, предпочтительно является неактивным в результате делеции или любого другого вида мутации или он включается в клетку в активном состоянии. Например, клетка может нести каждую из нуклеиновых кислот ОКБ с 1 по 26, включая один или более вариантов нуклеиновых кислот, подвергаемых тестированию, или набор нуклеиновых кислот вне ОКБ с 1 по 26, таких как гены пгрк. включая вариант гена пгрк или другой вариант гена, отличный от варианта гена итрк, или гены трк, включая вариант гена трк, или другой вариант гена, отличный от варианта гена трк. Клетку, несущую нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, участвующие в синтезе (метил)гризелимицина или Б-транс-4-метилпролина, и один или более вариантов нуклеиновых кислот, инкубируют в подходящих условиях для возможности осуществления синтеза (метил)гризелимицина или его производного, или Б-транс-4-метилпролина. Предпочтительно продукцию (метил)гризелимицина или Б-транс-4-метилпролина осуществляют в водном буфере при нейтральном рН, более предпочтительно в буфере с рН около рН 7, даже более предпочтительно в буфере с рН 7, включающем аминокислоты, такие как Ε-Ν-метилвалин, Б-лейцин, Ε-Ν-метилтреонин, Б-пролин, Ε-Ν-метиллейцин и глицин, предназначенные для включения в (метил)гризелимицин, или Б-лейцин для продукции Б-транс-4метилпролина. Предпочтительно белки с 8ЕО ГО NО: 2-27 и варианты белков поддерживают свою активность в используемом буфере, и предпочтительно избегается преципитация белка и субстрата. Необязательно образцы можно инкубировать при температуре, подходящей для активности белка, предпочтительно при температурах между 0 и 50°С, более предпочтительно при температурах между 10 и 40°С, даже более предпочтительно при температурах между 20 и 40°С, наиболее предпочтительно при 37°С. Альтернативно, вариант нуклеиновой кислоты экспрессируют, например, в бесклеточной экспрессионной системе и полученный белок затем добавляют к клетке, несущей белки для получения (метил)гризелимицина или Б-транс-4-метилпролина.

В другом варианте осуществления метод определения варианта любой из ОКЕ с 1 по 26, который повышает выход (метил)гризелимицина или Б-транс-4-метилпролина или изменяет состав (метил)гризелимицина, может быть осуществлен ίη νίΐτο. Метод, осуществляемый ίη νίΐτο (по латыни: в про- 16 029209

бирке), проводят не в живом организме, а в контролируемой среде, такой как пробирка для тестирования или чашка Петри. В методе ίη νίίτο компоненты, участвующие в реакции, объединяют в пробирке для тестирования, дают проходить реакции и определяют продукт. Для того чтобы это произошло, варианты нуклеиновых кислот, полученные как описано в настоящем документе, транскрибируют и транслируют в соответствующие варианты белков либо в клетке, либо с помощью метода трансляции в бесклеточной системе, белки очищают или используют клеточные лизаты (неочищенные, фракционированные или очищенные), и белки используют в методе совместно с белками, не являющимися вариантами, как представлено в δΕΟ ГО NО: 2-27. Метод ίη νίίτο пригоден, если варианты белков вовлечены в определенные стадии пути синтеза (метил)гризелимицина, так как, например, если вариант белка принадлежит к белкам, прямо осуществляющим синтез (метил)гризелимицина, таким как белки ΝΚΡδ, и только белки ΝΚΡδ, включая форму варианта, участвуют в синтезе (метил)гризелимицина или Ь-транс-4метилпролина, таким как белки, кодируемые генами тр5. и только эти белки, включая форму варианта, участвуют в синтезе Ь-транс-4-метилпролина. В методе ίη νίίτο компоненты, участвующие в реакции, такие как аминокислоты, такие как Ε-Ν-метилвалин, Ь-лейцин, Ε-Ν-метилтреонин, Ь-пролин, Ь-Νметиллейцин и глицин, и, по меньшей мере, один из белков с δΕΟ ГО NО: от 2 до 27, включая вариант, подлежащий тестированию, объединяют при заданных условиях времени, количества компонентов, составов реакционных буферов, температуры и т.д., давая осуществляться синтезу (метил)гризелимицина или его производного, или Ь-транс-4-метилпролина. Измерения могут осуществляться в молекулярном окружении, подходящем для активности участвующих белков. Подходящими условиями являются представленные выше.

Для синтеза Ь-транс-4-метилпролина ίη νίίτο выполняют три последовательных реакции с использованием Мр8-1, Мр§-2 и Мр5-3. В реакции с Мр8-1 Ь-лейцин превращают в 5-гидроксилейцин, в реакции с Мр§-2 5-гидроксилейцин превращают в γ-семиальдегид γ-метилглутаминовой кислоты и в реакции с Мр§-4 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновую кислоту превращают в 4-метилпролин. Предполагается, что циклизация γ-семиальдегида 111-метилглутаминовой кислоты до 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновой кислоты происходит спонтанно. Возможно, Мр5-3 участвует в этой реакции циклизации. Предпочтительно, чтобы для продукции 5-гидроксилейцина реакция с Мр8-1 выполнялась в водном буфере с нейтральным рН, более предпочтительно в буфере с рН около рН 7, даже более предпочтительно в буфере с рН 7, включающем субстрат, лейцин или родственные соединения и белок Мр§-1. Предпочтительно белок Мр8-1 поддерживает свою активность в используемом буфере и предпочтительно не допускается преципитация белка и субстрата. Необязательно образцы могут инкубироваться при температуре, подходящей для активности белка, предпочтительно при температурах между 0 и 50°С, более предпочтительно при температурах между 10 и 40°С, даже более предпочтительно при температурах между 20 и 40°С, наиболее предпочтительно при 37°С. Обычно продолжительность реакции составляет между несколькими минутами и несколькими часами, предпочтительно от 30 мин до 2 ч и более предпочтительно один час. Предпочтительно для продукции γ-семиальдегида γ-метилглутаминовой кислоты реакция с Мр§-2 выполняется в водном буфере с щелочным рН, более предпочтительно в буфере с рН около рН 10, даже более предпочтительно в буфере с рН 10, включающем субстрат, 5-гидроксилейцин и белок Мр§-2. Предпочтительно белок Мр§-2 поддерживает свою активность в используемом буфере и предпочтительно не допускается преципитация белка и субстрата. Необязательно образцы могут инкубироваться при температуре, подходящей для активности белка, предпочтительно при температурах между 0 и 50°С, более предпочтительно при температурах между 10 и 45°С, даже более предпочтительно при температурах между 30 и 42°С. Обычно продолжительность реакции составляет между несколькими минутами и несколькими часами, предпочтительно от 30 мин до 4 ч и более предпочтительно от о1 до 3 ч. Предпочтительно для продукции 4-метилпролина реакция с Мр§-4 выполняется в водном буфере с нейтральным рН, более предпочтительно в буфере с рН от 7 до 8, даже более предпочтительно в буфере с рН от 7,5 до 8, включающем субстрат, 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновую кислоту или родственные соединения и белок Мр§-4. Предпочтительно белок Мр§-4 поддерживает свою активность в используемом буфере и предпочтительно не допускается преципитация белка и субстрата. Необязательно образцы могут инкубироваться при температуре, подходящей для активности белка, предпочтительно при температурах между 0 и 50°С, более предпочтительно при температурах между 10 и 45°С, даже более предпочтительно при температурах между 30 и 42°С и еще более предпочтительно при 30°С. Обычно продолжительность реакции составляет между несколькими минутами и несколькими часами, предпочтительно от 30 мин до 4 ч и более предпочтительно от 1 до 3 ч.

Предпочтительно для продукции гризелимицина реакция выполняется в водном буфере с нейтральным рН, более предпочтительно в буфере с рН от 7 до 8, даже более предпочтительно в буфере с рН 8, включающем субстраты, ацетил-СοΑ, Ь-валин, (2§,4К)-4-метилпролин (или родственные соединения), Ьлейцин, Ь-пролин, Ь-треонин, Ь-глицин и белки ΝΚΡδ-1, ΝΚΡδ-2, ΝΚΡδ-3 (нерибосомальные синтетазы пептидов), и М(ЬН, и по необходимости δΑΙ^ и АТФ. Предпочтительно белки поддерживают свою активность в используемом буфере, и предпочтительно не допускается преципитация белков и субстратов. Необязательно образцы могут инкубироваться при температуре, подходящей для активности белка,

- 17 029209

предпочтительно при температурах между 0 и 50°С, более предпочтительно при температурах между 10 и 45°С, даже более предпочтительно при температурах между 20 и 40°С и еще более предпочтительно при 30°С. Обычно продолжительность реакции составляет между 1 и 100 ч, предпочтительно от 2 до 72 ч. Предпочтительно для продукции метилгризелимицина реакция выполняется также как реакция для гризелимицина. Однако Ь-пролин не является необходимым и, следовательно, не должен содержаться в реакционной смеси.

В данной области техники известны различные методы, с помощью которых специалист в данной области техники может определить концентрацию соединения и, таким образом, измерить, меняется ли концентрация соединения относительно контрольной реакции. Особо упоминаемыми являются радиометрические тесты, с помощью которых измеряют включение радиоактивности в вещества или ее высвобождение из веществ. Радиоактивные изотопы, наиболее часто используемые в этих методах, представ14 32 35 125

ляют собой С, Р, 8 и I. Концентрация может быть также определена с помощью иммуноблоттинга или метода ЕЬ18Л с использованием антитела или антисыворотки против тестируемого соединения. Хроматографический анализ использует измерение образования продукта путем разделения реакционной смеси на ее компоненты с помощью хроматографии. Это обычно осуществляется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но можно также использовать более простой метод тонкослойной хроматографии. Хотя этот подход может потребовать большое количество материала, его чувствительность может быть повышена путем промечивания субстратов/продуктов радиоактивной или флуоресцентной меткой. Предпочтительным методом является количественная оценка с помощью ВЭЖХ/МС. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС или альтернативно ВЭЖХ-МС) представляет собой метод аналитической химии, в котором сочетается способность жидкостной хроматографии (или ВЭЖХ) к физическому разделению со способностью масс-спектрометрии к анализу массы. ЖХ-МС представляет собой убедительный метод, используемый для многих целей, который имеет очень высокую чувствительность и специфичность. Термин "масс-спектрометрия" относится к использованию источника ионизации для создания из образца ионов газовой фазы на поверхности и определению ионов газовой фазы с помощью масс-спектрометра. Термин "масс-спектрометрия с лазерной десорбцией" относится к использованию лазера в качестве источника ионизации для создания из образца ионов газовой фазы на поверхности и определению ионов газовой фазы с помощью масс-спектрометра. Предпочтительным методом масс-спектрометрии биомолекул, таких как ацилированный акцептор ацилов, является масс-спектрометрия путем лазерной десорбции/ионизации с помощью матрицы или МАЬИТ Другой предпочтительный метод представляет собой масс-спектрометрию путем усиленной поверхностью лазерной десорбции/ионизации или 8ΕΕΌΙ. В масс-спектрометрии "кажущаяся молекулярная масса" относится к молекулярной массе (в Дальтонах)- к величине заряда, т/ζ, определяемых ионов. Совместно с ВЭЖХ анализируемое вещество ионизируется с помощью разнообразных методов ΑΡΙ, таких как Ε8Ι (ионизация электроспрея) или АРС1 (химическая ионизация при атмосферном давлении). В анализаторе ионы разделяются в соответствии с их отношением массы к заряду, т/ζ. Альтернативно количество (метил)гризелимицина может быть измерено с помощью определения его активности в качестве антибиотика с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. В другом варианте осуществления активность в качестве антибиотика производного (метил)гризелимицина может быть измерена с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Специалист в данной области техники, следовательно, должен знать, каким образом определить, обусловлена ли повышенная активность в качестве антибиотика повышенным количеством (метил)гризелимицина или продуцируется производное (метил)гризелимицина с повышенной активностью в качестве антибиотика, например, путем определения того, является ли генерируемый агент-антибиотик (метил)гризелимицином или нет. Такие методы перечислены выше.

Тестирование активности в качестве антибиотика может представлять собой, например, тестирование чувствительности к антибиотику по диффузии на пластине, которое представляет собой метод, при котором используются пропитанные антибиотиком подложки. Известное количество бактерий растет на пластинах агара в присутствии тонких подложек, содержащих антибиотик. Область просветления вокруг подложки, где бактерии не способны расти (называется зоной ингибирования). Это вместе со скоростью диффузии антибиотика используется для определения эффективности конкретного антибиотика. В целом более крупные зоны коррелируют с меньшей минимальной концентрацией ингибирования (М1С) антибиотика. Эта информация может быть использована для оценки эффективности производного (метил)гризелимицина относительно (метил)гризелимицина. М1С представляет собой самую низкую концентрацию антимикробного агента, которая будет ингибировать видимый рост микроорганизма после инкубации в течение ночи. Минимальные ингибиторные концентрации важны для диагностических лабораторий для подтверждения устойчивости микроорганизмов к антимикробным агентам, а также для мониторинга активности новых антимикробных агентов. М1С обычно рассматривается как самое основное лабораторное определение активности антимикробного агента против организма. М1С могут быть определены методами разведения в агаре или бульоне, обычно следуя инструкциям контролирующего органа, такого как институт клинических и лабораторных стандартов (СЬ81) или Британское общество антимикробной химиотерапии (В8АС). Доступно несколько коммерческих методов, включая общепри- 18 029209

знанные полоски Е1ек1. Система Е1ез1 включает предварительно определенный и непрерывный градиент концентрации различных антимикробных агентов, который при нанесении на инокулированные плашки агара и инкубации дает эллипсы микробного ингибирования. М1С определяют, когда эллипс ингибирования пересечет полоску, и это легко считывается по шкале считывания М1С на полоске.

Контроли являются частью методов тестирования, так как они могут устранить или свести к минимуму нежелательные влияния (такие как фоновые сигналы). Эксперименты с контролями используют для исследования эффекта переменной на конкретную систему. В эксперименте с контролями один набор образцов модифицируют (или считают модифицированным), а другой набор образцов, либо считают неизменным (отрицательный контроль), либо считают проявляющим определенное изменение (положительный контроль). Контроль может быть оценен в одновременном проведении анализа вместе с тестируемым веществом. Он может быть оценен перед или после определения эффекта тестируемого соединения, или он может представлять собой известную величину. Эксперимент с положительным контролем может представлять собой эксперимент, в котором те же самые условия используют для получения (метил)гризелимицина, его производного или Ь-транс-4-метилпролина что и в тестовом эксперименте, однако вариант нуклеиновой кислоты заменяют нуклеиновой кислотой, которая была исходной нуклеиновой кислотой для получения варианта, например, контрольная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту дикого типа. Примеры представляют собой ОКЕ с 1 по 26, находящиеся в немодифицированном состоянии в контрольном эксперименте, однако находящиеся в модифицированном состоянии в тестовом эксперименте.

Последовательность нуклеиновой кислоты варианта может быть определена с помощью методов секвенирования, как известно в данной области техники, в результате чего любая мутация в любой из ОКЕ с 1 по 26 может быть ответственной за модуляцию полученного белка, приводящую к повышенной продукции (метил)гризелимицина или Ь-транс-4-метилпролина, или к продукции производного (метил)гризелимицина.

В другом аспекте изобретения предлагается метод получения гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающий предоставление, по меньшей мере, одного белка или его функционально активного варианта или фрагмента, как определено в настоящем описании, или варианта белка, полученного с помощью метода идентификации вариантов, и инкубации по меньшей мере одного белка или его варианта или фрагмента с Ь-Ы-метилвалином, Ь-лейцином, Ь-Ы-метилтреонином, Ь-пролином, Ь-Ыметиллейцином, глицином и возможно Ь-метилпролином с получением гризелимицина и/или метилгризелимицина. Предпочтительно по меньшей мере один белок включает, по меньшей мере, ЫКР§-1, ЫКР§2 и ЫКР8-3. В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предлагается метод получения Ьтранс-4-метилпролина, включающий предоставление по меньшей мере одного белка или его функционально активного варианта или фрагмента, как определено в настоящем описании, или варианта белка, полученного с помощью метода идентификации вариантов, и инкубации по меньшей мере одного белка или его варианта или фрагмента с Ь-лейцином, 5-гидроксилейцином, γ-семиальдегидом γметилглутаминовой кислоты или 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновой кислотой, предпочтительно с Ьлейцином, с получением Ь-транс-4-метилпролина.

Предпочтительно по меньшей мере один белок включает, по меньшей мере, Мр8-1, Мр§-2 и Мр§-4. В отношении терминов "предоставление" и "белок или его функционально активный вариант или фрагмент", они относятся к определениям, предлагаемым в контексте нуклеиновых кислот и белков по изобретению. В отношении термина "получаемый методом" он относится к определениям, предлагаемым в контексте определения варианта с 8Еф ГО ЫО: 2-27. Термин "инкубация" обозначает поддержание белка и других компонентов в конкретных условиях для осуществления продукции гризелимицина и/или метилгризелимицина, или Ь-транс-4-метилпролина. В отношении конкретных условий делается ссылка на определения в контексте определения варианта с 8Еф ГО ЫО: 2-27.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту из группы, состоящей из:

(a) нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из открытых рамок считывания (ОКЕ) с 1 по 26 §Е0 ГО ЫО: 1, которая кодирует белки с 8Еф ГО ЫО: 2-27 соответственно, или ее варианта или фрагмента, где вариант или фрагмент кодирует функционально активный вариант или фрагмент белка с 8Е0 ГО ЫО: 2-27;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из белков с 8Еф ГО ЫО: 2-27, или его функционально активный вариант или фрагмент;

(c) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 97% белку или его фрагменту, кодируемому нуклеиновой кислотой стадий (а) или (Ь);

(б) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой любой из стадий (а)-(с);

(е) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой лю- 19 029209

бой из стадий (а)-(б) и состоит из 10-50 нуклеотидов в длину; и

(ί) нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте любой из стадий (а)-(Г).

В дополнительном варианте осуществления представленная выше нуклеиновая кислота включает по меньшей мере две 0КР, кодирующие любой из белков с 8ЕО ГО N0: 2-27, или их функционально активный вариант или фрагмент, как представлено в любой из стадий (а)-(б).

В еще одном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота включает по меньшей мере одну из 0КР 18, 19, 20 и 21, которые кодируют белки с 8Е0 ГО N0: 19, 20, 21 и 22 соответственно, или их функционально активный вариант или фрагмент в любой из стадий (а)-(б).

В еще одном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота включает по меньшей мере одну из 0КР 8, 15 и 16, которые кодируют белки 8Е0 ГО N0: 9, 16 и 17 соответственно, или их функционально активный вариант или фрагмент в любой из стадий с (а) по (б).

В еще одном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота включает кластер генов биосинтеза гризелимицина, обладающий последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0: 1, или обладающий последовательностью варианта 8Е0 ГО N0: 1, несущей вариант или фрагмент по меньшей мере одной из 0КБ с 1 по 26, в результате чего вариант или фрагмент кодирует функционально активный вариант или фрагмент белка с 8Е0 ГО N0: 2-27.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает экспрессионный вектор, включающий любую из указанных выше нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает клетку-хозяина, трансформированную указанным выше экспрессионным вектором.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает белок, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 2-27 или ее функционально активный вариант или фрагмент.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает антитело, специфически направленное по меньшей мере против одного из указанных выше белков или его функционально активного варианта или фрагмента.

Эта заявка охватывает также результаты изобретения относительно способа получения гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающего получение по меньшей мере одного из белков с 8Е0 ГО N0: 9, 16 и 17.

В одном варианте осуществления изобретение охватывает способ получения Ь-транс-4метилпролина, включающий получение по меньшей мере одного из белков с 8Е0 ГО N0: 19, 20, 21 и 22. В другом варианте осуществления изобретение охватывает способ получения по меньшей мере одного из указанных выше белков или его функционально активного варианта или фрагмента, включающий:

a) экспрессию любой из указанных выше нуклеиновых кислот, и

b) необязательно выделение указанного выше белка или его функционально активного варианта или фрагмента.

В еще одном варианте осуществления изобретение охватывает способ определения варианта одной или более 0КБ с 1 по 26 8Б0 ГО N0: 1, которая кодирует белки с 8Б0 ГО N0: 2-27, соответственно, которые модулируют продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающий стадии:

a) получения варианта любой одной или более 0КБ с 1 по 26,

b) экспрессии варианта в белок,

c) получения гризелимицина и/или метилгризелимицина или их производного с использованием белка со стадии Ь) и

61) определения полученного количества гризелимицина и/или метилгризелимицина,

где повышение количества полученного гризелимицина и/или метилгризелимицина по сравнению с количеством, полученным, если не присутствует белок стадии Ь), но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что вариант способен повышать продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина, или

62) определения активности производного гризелимицина и/или метилгризелимицина в качестве антибиотика,

где повышение активности в качестве антибиотика на стадии б2) по сравнению с активностью в качестве антибиотика, если не присутствует белок стадии Ь), но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что вариант способен продуцировать производное гризелимицина и/или метилгризелимицина с повышенной активностью в качестве антибиотика;

и где указанное производное отличается аминокисмлотным составом от гризелимицина и/или метилгризелимицина и проявляет повышенную антибиотическую активность по сравнению с гризелимицином и/или метилгризелимицином.

В другом варианте осуществления изобретение охватывает способ определения варианта одной или более 0КБ с 1 по 26 8Б0 ГО N0: 1, которая кодирует белки с 8Б0 ГО N0: 2-27, соответственно, которые повышают продукцию Ь-транс-4-метилпролина, включающий стадии:

b) экспрессии варианта в белок,

- 20 029209

с) получения Ь-транс-4-метилпролина с использованием белка со стадии Ь) и б) определения полученного количества Ь-транс-4-метилпролина,

где повышение количества Ь-транс-4-метилпролина, полученного на стадии с) по сравнению с количеством, полученным, если не присутствует белок стадии Ь), но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что вариант способен повышать продукцию Ь-транс-4метилпролина.

В другом варианте осуществления изобретение охватывает способ получения гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающий стадии:

a) предоставления по меньшей мере одного белка по п.8 или его функционально активного варианта или фрагмента и

b) инкубации по меньшей мере одного белка стадии а) с Ь-Ы-метилвалином, Ь-лейцином, Ь-Νметилтреонином, Ь-пролином, Ь-Ы-метиллейцином и глицином с получением гризелимицина и/или метилгризелимицина.

В другом варианте осуществления изобретение охватывает способ получения Ь-транс-4метилпролина, включающий стадии:

b) инкубации по меньшей мере одного белка стадии а) с Ь-лейцином, 5-гидроксилейцином, γсемиальдегидом γ-метилглутаминовой кислоты и/или 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновой кислотой, с получением Ь-транс-4-метилпролина.

В еще одном варианте осуществления изобретение охватывает штамм 5>1гср1отусс5. положенный на хранение в ОенЬсНе 8атт1ип§ νοη МПаоогдапЬтеп ипб 2с11ки11игсп СтЬй (ΌδΜΖ) под номером поступления ΌδΜ 22643.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 продемонстрирована структура гризелимицина (А) и метилгризелимицина (В).

На фиг. 2 представлена карта организации генов кластера генов биосинтеза гризелимицина 5>1гер1отусе5 ΌδΜ 22643, представленного δΕΟ ГО N0: 1. Предполагаемые 0КР указаны черными блоками стрелок с обозначением соответствующих названий генов. Указаны направления транскрипции и относительные размеры.

На фиг. 3 представлена модель биосинтеза гризелимицина. Предполагаемые белки ΝΚΡδ-1, ΝΚΡδ2, ΝΚΡδ-3 указаны белыми блоками. Модули, обозначенные с М1 до М10, указаны ниже каждого блока. Каждый модуль разделен на домены, обозначенные С для домена конденсации, А для домена аденилирования, МТ для домена метилтрансферазы, Т для домена тиолирования, Е для домена эпимеризации и ТЕ для домена тиоэстеразы, номер после обозначения каждого домена указывает на номер модуля, к которому приписан домен. Организация А'-МТ-А" указывает на то, что домены МТ интегрированы в домены А. Ниже обозначения каждого модуля представлена аминокислота, которая вводится соответствующим модулем в гризелимицин. Nте-Vа1 обозначает Ε-Ν-метилвалин, Ме-Рго обозначает Ь-транс-4метилпролин, №пе-ТНг обозначает Ε-Ν-метилтреонин, Ьеи обозначает Ь-лейцин, Рго обозначает Ьпролин, №пеГО-Ьеи обозначает Ό-Ν-метиллейцин и О1у обозначает глицин. Ниже модулей представлена биосинтетическая роль каждого модуля в виде предоставления структуры соответствующих аминокислот и их включения в гризелимицин. С помощью каждого модуля одна аминокислота конденсируется с предшествующей аминокислотой, приводя к элонгации растущей пептидной цепи. В высвобождение продукта вовлечен домен ТЕ10 с последующей циклизацией пептида с получением макроциклического продукта. Ν-концевой домен С модуля 1, как предполагается, катализирует ацетилирование валина.

На фиг. 4 представлен синтез 4-метилпролина в пределах кластера генов биосинтеза ностопептолида (Нойтапп е1 а1., 2003; верхний путь) и кластера генов биосинтеза гризелимицина (нижний путь). В обоих путях биосинтеза Ь-лейцин превращается с помощью ферментов 0й1 (ностопептолид) или Мр8-1 (метил)гризелимицин) в 5-гидроксилейцин, который превращается с помощью №§Е (ностопептолид) или Мр§-2 ((метил)гризелимицин) в γ-семиальдегид γ-метилглутаминовой кислоты, который спонтанно образует 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновую кислоту. Она превращается в 4-метилпролин под действием №§Р (ностопептолид) или Мр§-4 ((метил)гризелимицин). Продукты каждой стадии синтеза 4метилпролина путей (ностопептолида) или ((метил)гризелимицина) отличаются по их конфигурации в отношении метильной группы в 4 положении 5-гидроксилейцина, γ-семиальдегида γ-метилглутаминовой кислоты и 4-метилпролина и в 5 положении 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновой кислоты, в том, что при биосинтезе ностопептолида метильная группа находится в δ-конфигурации, тогда как при биосинтезе ((метил)гризелимицина) метильная группа находится в К-конфигурации. Возможно, Мр8-3 играет роль в превращении γ-семиальдегида γ-метилглутаминовой кислоты в 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновую кислоту.

На фиг. 5 представлены результаты анализа ВЭЖХ-МС Мр§-1 или определения лейцингидроксилазы. Диаграмма показывает, что при определении фермента, осуществляемом с инактивированным Мр8-1 (хроматограммы А) и В)), гидроксилейцин не продуцируется, тогда как при определении,

- 21 029209

осуществляемом с активным Мрз-1 (хроматограммы С) и Ό)), гидроксилейцин продуцируется. А) и С): хроматограммы экстрагированных ионов для т//=273,1 (|Μ+Ν;·ι|' РТС-лейцина). В) и Ό): хроматограммы экстрагированных ионов для т//=289,1 (|Μ+Ν;·ι|' РТС-гидроксилейцина).

На фиг. 6 представлены результаты, полученные с мутантными генами пгрз-1 и пгрз-3 и с мутантным опероном трз. Гены пгрз и трз указаны блоками стрелок. Примерная локализация вставочных мутаций указана символом кружка с перекрестом. Ниже представленных генов пгрз и трз даны соответствующие хроматограммы иНРЬС (УФ 210 нм) супернатанта культур дикого типа, мутанта пгрз-1, мутанта пгрз-3 и мутанта трз. У дикого типа пик при 5,29 мин указывает на присутствие гризелимицина. Напротив, гризелимицин не может быть выявлен в супернатантах культур трех мутантов.

На фиг. 7 показана комплементация мутанта трз, полученного в примере 5.

A) Комплементация мутанта трз путем подпитки среды продукции 20 мкг/мл (2З,4К)-4метилпролином один раз на день 0. С 1 по 4 день анализировали продукцию (метил)гризелимицина (серый столбик: продукция гризелимицина, черный столбик: продукция метилгризелимицина). Мутант трз способен продуцировать (метил)гризелимицин только в среде с комплементацией. Эксперимент, в котором представлено повышение продукции метилгризелимицина относительно гризелимицина при подпитке метилпролином, представлен в примере 9 и на странице 15.

B) Схематическое изображение относящихся к этому аспектов генетической комплементации мутанта трз: оперон трз (гены трз-1, трз-2, трз-3 и трз-4) находится под экспрессионным контролем вставленного на 5'-конце конститутивного промотора егтЕ.

C) Генетическая комплементация мутанта трз. После интеграции оперона Р(егтЕ)-трз в сайт абВ мутанта трз способность к продукции гризелимицина восстанавливается (серый столбик: продукция гризелимицина, черный столбик: продукция метилгризелимицина).

На фиг. 8 представлен анализ ВЭЖХ-МС дериватизированных экстрактов из культуры, экспрессирующей трз (ЗВерФтусез соебсо1ог/риШЬ2 01-трз; фиг. 8А), и отрицательного контроля (ЗВерФтусез соебсо1ог ШТ; фиг. 8В). ФИТЦ-производные ожидаемого продукта (2З,4К)-4-метилпролина (4-ая хроматограмма на фиг. 8А и В), а также производные двух промежуточных продуктов биосинтеза 5гидроксилейцина (2-ая хроматограмма на фиг. 8А и В) и γ-семиальдегид γ-метилглутаминовой кислоты (3-я хроматограмма на фиг. 8А и В) могут быть определены в экстракте культуры, экспрессирующей трз, но не у ЗВерФтусез соебсоФг ШТ. 1-ая хроматограмма на фиг. 8А и В соответствует лейцину.

На фиг. 9 представлено филогенетическое древо, иллюстрирующее взаимоотношения между №зАА(тРго), НерВ-А(тРго) и №зО-А(рго) и МКРЗ-1-А2, МКРЗ-1-А5 и МКРЗ-2-А8. Отрезок шкалы масштаба соответствует 0,09 замен на сайт аминокислоты.

На фиг. 10 представлен анализ субстратной специфичности доменов А модуля 2 (А2; верхняя панель), модуля 5 (А5; средняя панель) и модуля 8 (А8; нижняя панель) с помощью экспериментов обмена АТР-Рр1 ίη \бго. Для А5 и А8 эксперименты проводили в трех параллельных экспериментах, для А2 - в двух параллельных экспериментах. Наиболее высокие активности принимались за 100%. Тестировали следующие субстраты: (2З,4К)-4-фторпролин (2З,4К Ерго), (2З,4З)-4-метилпролин (2З,4З МеРго), (2З,4К)-4-метилпролин (2З,4К МеРго), Ь-пролин (Ь-Рго), Ь-пипеколиновую кислоту (Ь-Р1р), Ь-глицин (ЬО1у), 4-метиленпролин (МеШу1еп Рго), 4,4-диметилпролин (Όί Ме Рго) и 4,4-дифторпролин (Όί Е Рго). Относительные активности указаны на оси Υ. Ниже каждого субстрата указана его активность в процентах от самой высокой активности, принятой за 100%. В контрольном эксперименте аминокислота не присутствовала.

Фиг. 11: Связывание полноразмерных регуляторов ΟγΠ и ΟγΓ12 с фрагментами ДНК Рпгрз1, Рпгрз2 и Ртхап_сВ1. Представлены сканированные изображения результатов метода ЕМЗА. Рпгрз1 и Рпгрз2: метод ЕМЗА с использованием фрагментов ДНК, включающих области промоторов генов пгрз1 или пгрз2. Ртхап с1г1: метод ЕМЗА с использованием меченного Нех фрагмента ДНК, включающего двойную промоторную систему в межгенной области Мухососсиз хапбшз ΌΚ1622, с примыкающими тхап_3950 и тхап_3951. ΟγΓ-1-Шз и ΟγΓ-12-Шз: ΟγΓ-1 и ΟγΓ-12 с С-концевыми метками 6х№з. +: с регулятором. -: без регулятора.

На фиг. 12 представлена предсказанная организация доменов регуляторов ΟγΓ-1 и ΟγΓ-12. Представлены домены, предсказанные средствами ЗМАКТ Ьбр://зтагбетЬ1-бе1бе1Ьег§.бе/. НТН: мотив спиральповорот-спираль, аа: аминокислоты.

На фиг. 13 представлено связывание укороченных вариантов регуляторов ΟγΓ1 и ΟγΓ12 с фрагментами ДНК Рпгрз1, Рпгрз2 и Ртхап с1г1. Представлены сканированные изображения результатов метода ЕМЗА. В тестах использовали только производные ΟγΓ-1 и ΟγΓ-12, включающие предсказанные домены НТН. Рпгрз1 и Рпгрз2: метод ЕМЗА с использованием фрагментов ДНК, включающих области промоторов генов пгрз1 или пгрз2. Ртхап с1г1: метод ЕМЗА с использованием меченного Нех фрагмента ДНК, включающего двойную промоторную систему в межгенной области Мухососсиз хапбшз ΌΚ1622 с примыкающими тхап_3950 и тхап_3951. ΟγΓ-1-НТШ, ΟγΓ-1-НТЮ, Ο^Г-1-НТН12 и ΟγΓ-12-НТН: ΟγΓ-1 и ΟγΓ12, включающие только домены НТН, с С-концевыми метками 6хН1з. -: без регулятора. Цифры показывают молярный избыток регуляторного белка по сравнению с количеством фрагмента ДНК.

- 22 029209

Описание примеров

Пример 1. Идентификация локуса биосинтеза гризелимицина у 81гер1отусек Ώ8Μ 22643. 81гер1отусек Ώ8Μ 22643 продуцирует антибиотики гризелимицин и метилгризелимицин в природных условиях. Однако генетический локус, вовлеченный в биосинтез этих веществ-антибиотиков, ранее не был идентифицирован. Для идентификации локуса биосинтеза гризелимицина 81гер1отусек Ώ8Μ 22643 культивировали в соответствии со стандартными микробиологическими методами. ДНК экстрагировали в соответствии со стандартными методами и полную последовательность определяли в соответствии со стандартными методами. Анализ генов, включенных в ДНК 81гер1отусек Ώ8Μ 22643, и белков, кодируемых генами, осуществляли т кШсо. В табл. 1 перечислены гены, идентифицированные по номерам ОКБ, которые были определены с помощью поисков гомологии. Конкретные обозначения генов приписаны к номерам ОКБ. Положение генов и их организация в пределах кластера генов биосинтеза гризелимицина схематически указаны на фиг. 2.

Таблица 1

О о ТО 2 -η Я> Ό	Обозначение гена	Старт πί	Стоп п!	Длина гена (πί)	Спиральность	Длина белка (аа)	Обозначение белка	ЗЕО ГО ΝΟ: белка
1	огГ-1	837	2075	1269	положительная	412	Ог£-1	2
2	огГ-2	2185	2625	441	положительная	146	Ог£-2	3
3	ог£-3	2625	2819	195	положительная	64	Ог£-3	4
4	ог£-4	3033	4037	1005	положительная	334	Ог£-4	5
5	ог£-5	4110	5630	1521	положительная	506	Ог£-5	6
6	ог£-6	5627	7066	1440	положительная	479	Ог£-6	7
7	ог£-7	7240	8133	894	положительная	297	Ог£-7	8
8	пгрк-1	31885	8501	26385	отрицательная	7794	ΝΚΡ8-1	9
9	ΐηί-1	33102	32770	333	отрицательная	по	Ιηί-1	10
10	ίηρ-1	33187	33726	540	положительная	179	Тпр-1	11
11	ΐπί-2	34127	33567	561	отрицательная	186	Ιηί-2	12
12	1пр-2	36300	34648	1653	отрицательная	550	Тпр-2	13
13	ίηρ-3	36172	37314	1143	положительная	380	Тпр-3	14
14	Дпа	39032	37746	1287	отрицательная	428	Опа	15
15	пгр§-2	39643	52149	12507	положительная	4168	ΝΚΡ8-2	16
16	пгрк-З	52146	56120	3975	положительная	1324	ΝΚΡ8-3	17
17	тЫН	56117	56335	219	положительная	72	мын	18
18	тр8-1	56434	57246	813	положительная	270	Мр§-1	19
19	тр8-2	57243	58418	1176	положительная	391	Мрз-2	20
20	тр8-3	58445	59245	801	положительная	266	М_Р8-3	21
21	тр8-4	59242	60141	900	положительная	299	Мрз-4	26
26	ог£-8	61680	61144	537	отрицательная	178	Ог£-8	26
26	ог£-9	62170	62820	651	положительная	216	Ог£-9	24
24	ог£-10	62824	63939	1116	положительная	371	Ог£-Ю	25
25	огГ-11	63969	65165	1197	положительная	398	Ог£-11	26
26	ог£-12	66108	65206	903	отрицательная	300	Ог£-12	27

Пример 2. Гены и белки, вовлеченные в биосинтез гризелимицина и метилгризелимицина.

С помощью анализа т кШсо было обнаружено, что кластер генов биосинтеза гризелимицина включает 26 генов, кодирующих 26 белков. Биологическая функция 26 белков биосинтеза (метил)гризелимицина была оценена с помощью компьютерного сравнения каждого идентифицированного белка с белками, найденными в NСΒI. В табл. 2 показаны белки, включенные в кластер генов биосинтеза гризелимицина, и соответствующие белки ОепВапк, найденные с помощью поисков гомологии.

- 23 029209

Таблица 2

Номер ОНГ	Лучший результат поиска ВЬАЗТ	Предполагаемая функция
Лучший результат поиска ВЬАЗТ	Номер поступления в бепВапк	Ближайший гомолог у	е-Уа1ие	Идентичность/ сходство (%)
						Регулятор
	Т1шН2		ЗЁгерЁо-
1	АВБ74963.1	а11сРе1скиз	2Е-55	35/53	транскрипции
			ЫпсЗизЁапиз			семейства Хге
	Гипотетический		ЗЁгерЁотусез			Гипотетический
2	белок 5506 02153	ΖΡ_07294072	кудгозсорасиз	5Е-11	41/47	белок
			АТСС 53653
	Консервативный					Консервативный
	гипотетический		ЗЁгерЁотусез			гипотетический
3	ΖΡ 06583961	гозеозрогиз ДЕНЬ	ЗЕ-15	61/86
	белок		15998			белок
	Консервативный					Консервативный
4	гипотетический	СВ669271.1	ЗЁгерЁотусез	1,00Е-	81/87	гипотетический
	белок Предполагаемый	зсаЫеи 87.26 ЗЁгерЁотусез	140	белок

5	СВ669272.1	0.0	91/94	Транспортер
транспортер Предполагаемая	зсаЫе! 87.26 ЗЁгерЁотусез

б	СВ669273.1	0.0	81/87	Глутаминсинтетаза
	глутаминсинтетаза	зсаЫе! 87.26
Гипотетический		ЗЁгерЁотусез			Гипотетический
7	белок	СВС69274.1	8Е-120	73/81	белок
зсаЬе! 87.26
	Белок, содержащий
	домен		5аИп1зрога			ΝΕΡ5
8		ΥΡ 001539321.1	агеп!со1а ΟΝ5-	0.0	51/63
	аденилирования		205
	аминокислот
	Каталитическая		РзеисЗопосагсИа			Каталитическая
9	область интегразы	ΥΡ 004330163	άίохалиуогапз	1Е-43	75/92	область интегразы
		СВ1190
	Предполагаемая					Транспозаза для
	транспозаза для		Ргапкиа			вставки элемента
10	вставки элемента	ΥΡ 001509642	ЗЕ-15	76/78
		—	зр. ЕАШрес		последовательност
	последователь-					и
	ности
11	Каталитическая		РзеисЗопосагсИа			Каталитическая
область интегразы	ΥΡ 004330974	άίохалиуогалз	4Е-33	67/81	область интегразы
		СВ1190
12	Белок семейства		ЗЁгерЁотусез
транспозазы	ΖΡ_07610914	^ио1асеизлидег	0.0	74/80	Транспозаза
	НПобор1ге11и1а		Ти 4113
	Предполагаемая
13	транспозаза	ΖΡ 06418432.1	Ргалкиа зр.	9Е-60	43/55	Транспозаза
			Е1Ж1£	Е-бО
	семейства 154
	Бета-субъединица					Бета-субъединица
14	ДНК-полимеразы	ΖΡ 06824689	ЗЁгерЁотусез зр.	4Е-110	53/70	ДНК-полимеразы
			5РВ74
	III					III
	Предполагаемая
15	пептидсинтаза 3 и	СВН31051.1	ЗЁгерЁотусез ргиз^илаезригаИ	0.0	51/62	ΝΕΡ5
	4 пристинамицина I		3
16	Предполагаемая		ЗЁгерЁотусез			ΝΕΡ5
ΝΗΡ5	ΖΡ_04685020.1	дПапаепз1з АТСС	0.0	45/61
		14672
			Ггапкша зушЫопЬ
17	Домен белка МЬЬН	ΖΡ_06476953	о£ БаИзса	9Е-26	72/81	Домен белка МЪЬН
			д1отега£а
18	Фитаноил-СоА-	ΥΡ 001539320.1	ЗаИлизрога агепасоЗа ΟΝ5-	8Е-91	60/76	Гидроксилаза лейцина
	диоксигеназа		205
19	Алкоголь-	ΥΡ 707358.1	Ккос1ососсиз	6Е-102	51/67	Алкогольдегидроге
	дегидрогеназа		4θ3ίίί ННА1		наза
	Белок укладки		ЗЁгерЁотусез			Альфа/бета-
20	альфа/бета-	ΖΡ_04702845.1	ЗЕ-77	56/71
			а!Ьиз Л074		гидролаза
	гидролазы
21	ЬшЬУ	ΑΒΧ00626.1	ЗЁгерЁотусез 1илсо1лелзиз	5Е-131	76/88	Оксидоредуктаза

- 24 029209

26	Гипотетический белок Зс1аА2 13611	ΖΡ 08216838	ЗЁгерЁотусез с1ауиИдегиз АТСС 27064	1Е-42	65/78	Белок надсемейства белков, подобных ΡΝΡΟχ
26	Гипотетический белок ЗАСТЕОНАГТ 3210	ΖΡ_06272665.1	ЗЁгерЁотусез зр. АСТЕ	3Ε-38	64/74	Гипотетический белок
24	Гипотетический белок ЗАСТЕОНАГТ 3209	ΖΡ 06272664.1	ЗЁгер^отусез зр. АСТЕ	2Е-112	67/78	Гипотетический белок
25	Амидогидролаза	ΖΡ_06272663.1	ЗЁгерЁотусез зр. АСТЕ	1Е-148	70/80	Амидогидролаза
26	Гипотетический белок ЗАСТЕОНАГТ 3207	ΖΡ_06272662.1	5(гер(отусез зр. АСТЕ	2Е-64	52/69	Регулятор транскрипции семейства Хге

Между индивидуальными модулями и доменами существуют линкерные области, называемые межмодульным линкером и междоменным линкером. На Оконце и С-конце белков существуют домены С0М или домены докинга, которые необходимы для взаимодействия индивидуальных белков МВР8. Опосредующие коммуникацию (С0М) домены облегчают селективное взаимодействие между нерибосомальными пептидсинтетазами с помощью коротких опосредующих коммуникацию доменов (Найп М. апб 81асйе1йаиз Т; 2004).

Основываясь на поисках гомологии, гены, обозначенные как пгрз-1, пгрз-2 и пгрз-3, кодируют субъединицы нерибосомальной протеинсинтетазы (N^8), участвующей в синтезе гризелимицина и метилгризелимицина (см. фиг. 3). Ген пгрз-1 имеет длину приблизительно 26,4 т.п.о. и кодирует 6 модулей, которые необходимы для включения (1) Г-М-метилвалина (М1), (2) Г-транс-4-метилпролина (М2), (3) ЬN-метилтреонина (М3), (4) Ь-лейцина (М4), (5) Г-транс-4-метилпролина (М5) и (6) Ь-лейцина (М6) соответственно в (метил)гризелимицин. Модуль 1 или М1 и модуль 3 или М3, каждый, кодирует С-домен, Адомен, который прерывается МТ-доменом, и Т-домен, тогда как модуль 2 или М2, модуль 4 или М4, модуль 5 или М5 и модуль 6 или М6, каждый кодирует С-домен, А-домен и Т-домен. Более того он содержит домен конденсации модуля 7 или М7. Домен конденсации М1, С1, отвечает за ^ацетилирование. Ген пгрз-2 имеет длину приблизительно 12,5 т.п.о. и кодирует часть модуля 7 и модули 8 и 9, которые необходимы для включения (7) ^-N-метилвалина (М7), (8) Ь-пролина (гризелимицин) или Ь-транс-4метилпролина (метилгризелимицин) (М8) и (9) ^-N-метиллейцина (М9). Часть модуля 7 включает Адомен, который прерывается МТ-доменом, и Т-домен, модуль 8 или М8 включает С-домен, А-домен и Тдомен, и модуль 9 или М9 включает С-домен, А-домен, который прерывается МТ-доменом, Т-домен и Едомен. Присутствие Ό-аминокислоты в положении 9 (метил)гризелимицина совпадает с присутствием Едомена в модуле 9, который катализирует вставку ^-N-метиллейцина. Ген пгрз-3 имеет длину приблизительно 4 т.п.о. и кодирует модуль 10, который включает в молекулу глицин и управляет циклизацией линейной пептидной цепи между глицином и ^-N-метилтреонином через сложноэфирную связь. Модуль 10 включает С-домен, А-домен, Т-домен и ТЕ-домен.

Поиски гомологии позволили определить роль в биосинтезе белков ЖВР8 повторяющихся единиц, модулей. На фиг. 3 представлено отнесение модулей с 1 по 10 к белкам МВР8, разделение на домены и активность в отношении биосинтеза путем указания аминокислот и их включения в растущую цепь гризелимицина. Модуль 10 вызывает высвобождение цепи от белка МВР8-3 с последующей циклизацией цепи. В табл. 3 указаны приблизительные границы модулей и доменов на уровне белка и ДНК относительно их локализации у индивидуальных белков ЖВР8. Таким образом, С представляет собой домен конденсации, А представляет собой домен аденилирования, МТ представляет собой домен метилтрансферазы и Т представляет собой домен тиолирования. Домены МТ интегрированы в домены А. Это указывается в виде расположения "А'-МТ-А''".

- 25 029209

Таблица 3

Белок	Модули/ домены	Локализация в последовательности белка (аа)	Локализация в последовательности кластера генов
(ЗЕф Ю ΝΦ: (пб)	1)
ΝΗΡ5-1 (ЗЕф
	модуль 1	9-1493 аа	31861-27407	пб
Ю N0: 9)
	С1	9-336 аа	31861-30878	пб
	А1'	481-939 аа	30445-29069	пб
	МТ	940-1365 аа	29068-27791	пб
	А1' '	1366-1406 аа	27790-27668	пб
	Т1	1429-1493 аа	27601-27407	пб
	модуль 2	1517-2569 аа	27337-24179	пб
	С2	1517-1858 аа	27337-26312	пб
	А2	2003-2482 аа	25879-24440	пб
	Т2	2505-2569 аа	24373-24179	пб
	модуль 3	2591-4102 аа	24115-19580	пб
	СЗ	2591-2932 аа	24115-26090	пб
	АЗ'	3077-3536 аа	26657-21278	пб
	МТЗ	3537-3974 аа	21277-19964	пб
	АЗ' '	3975-4015 аа	19963-19841	пб
	ТЗ	4038-4102 аа	19774-19580	пб
	модуль 4	4124-5170 аа	19516-16376	пб
	С4	4124-4465 аа	19516-18491	пб
	А4	4612-5083 аа	18052-16637	пб
	Т4	5106-5170 аа	16570-16376	пб
	модуль 5	5193-6245 аа	16309-13151	пб
	С5	5193-5534 аа	16309-15284	пб
	А5	5679-6158 аа	14851-13412	пб
	Т5	6181-6245 аа	13345-13151	пб
	модуль 6	6268-7312 аа	13084-9950	пб
	С6	6268-6609 аа	13084-12059	пб
	А6	6754-7265 аа	11626-10211	пб
	Тб	7248-7312 аа	10144-9950	пб
	модуль 7'	7336-7677 аа	9880-8855 пб
	С7	7336-7677 аа	9880-8855 пб
ΝΗΡ5-2 (ЗЕф	модуль
		42-1066 аа	39766-42840	пб
Ю ΝΦ: 16)	7' ’
	А7'	42-500 аа	39766-41142	пб
	МТ7	501-938 аа	41143-42456	пб
	А7' ’	939-979 аа	42457-42579	пб
	Т7	1002-1066 аа	42646-42840	пб
	модуль 8	1088-2148 аа	42904-46086	пб
	С8	1088-1430 аа	42904-43932	пб
	А8	1575-2061 аа	44365-45825	пб
	Т8	2084-2148 аа	45892-46086	пб
	модуль 9	2172-4160 аа	46156-52126	пб
	С9	2172-2513 аа	46156-47181	пб
	А9'	2658-3098 аа	47614-48936	пб
	МТ 9	3099-3536 аа	48937-50250	пб
	А9' '	3537-3577 аа	50251-50373	пб

- 26 029209

	Т9	3600-3663 аа	50440-50631 пЕ
	Е9	3679-4160 аа	50677-52126 пЕ
ΝΗΡ3-3 (5Εζ) Ю ΝΟ: 17)	модуль 10	13-1312 аа	52182-56081 пЕ
	СЮ	13-343 аа	52182-53174 пЕ
	А10	484-951 аа	53595-54998 пЕ
	Т10	974-1038 аа	55065-55259 пЕ
	ТЕЮ	1060-1312 аа	55326-56081 пЕ

η! - нуклеотид; аа - аминокислота

На основании поисков гомологии и биохимического анализа выявлено, что гены, обозначенные как тр§-1, тр§-2 и тр§-4 кодируют белки, необходимые для биосинтеза Ь-транс-4-метилпролина. Ь-транс-4метилпролин содержится в положениях 2 и 5 гризелимицина и в положениях 2, 5 и 8 метилгризелимицина. Ген тр§-1 кодирует белок с самой высокой гомологией с 4-пролингидроксилазами (41% идентичности/57% сходства) и фитаноил-СоЛ-диоксигеназой, но с помощью биохимического анализа может быть продемонстрировано, что ген тр§-1 кодирует лейцингидроксилазу, которая гидроксилирует Ь-лейцин до (28,4К)-5-гидроксилейцина. Ген тр§-2 кодирует алкогольдегидрогеназу, которая обладает 34% идентичностью/55% сходства с геном по§Е кластера генов ностопептолида, который вовлечен в синтез Ь-цис-4метилпролина (ЬиезсН е! а1., 2003). Мр§-2 катализирует дегидрирование (28,4К)-5-гидроксилейцина до γсемиальдегида (28,4К)^-метилглутаминовой кислоты. После спонтанного образования кольца белок, кодируемый тр§-4, очевидно, катализирует восстановление (38,5К)-3-метил-Л¹-пирролин-5-карбоновой кислоты до (28,4К)-4-метилпролина. Ген тр§-4 проявляет самую высокую гомологию с 8Л (55% идентичности/70% сходства) и ЬтЬУ, они оба кодируют зависимые от флавина монооксигеназы и катализируют сходную реакцию (Ъ1 е! а1., 2009; РезсЬке е! а1., 1995). Ген тр§-3 проявляет самую высокую гомологию с α,β-гидролазой с самой высокой гомологией с продуктом гена НрЕ (50% идентичности/68% сходства) в кластере генов биосинтеза фриулимицина (Ми11ег е! а1., 2007). Кодируемый белок должен действовать как тиоэстераза типа II с функцией регенерации ΝΚΡ8 при биосинтезе с неправильной затравкой. Возможно, продукт гена тр§-3 вовлечен в циклизацию пирролинового производного в пути биосинтеза 4-метилпролина. Основываясь на этих результатах, авторы настоящего изобретения достигли успеха в выяснении пути биосинтеза Ь-транс-4-метилпролина при биосинтезе гризелимицина или метилгризелимицина. На фиг. 4 представлено сравнение путей биосинтеза 4-метилпролина, включая вовлеченные в них белки, с путем биосинтеза ностопептолида цианобактерии ШМос §р. О8У264 (НоГГтапп е! а1., 2003) и с путем биосинтеза (метил)гризелимицина, идентифицированным с помощью настоящего изобретения. Основываясь на анализе последовательностей, гены, обозначенные как тр§-1 - тр§-4, вероятно, транскрибируются как оперон.

Более того, основываясь на поисках гомологии, были идентифицированы следующие гены. В кластере генов существует два гена огГ-1 и огГ-12 с гомологией с белками семейства Хге регуляторов транскрипции. Кодируемые белки играют роль в регуляции биосинтеза (метил)гризелимицина. Может быть показано, что инактивация обоих генов приводит к существенной потере продукции (метил)гризелимицина, что доказывает их функцию в качестве прямых или непрямых регуляторов. ОгГ-5 кодирует белок с гомологией предполагаемой транспортной молекуле и может быть вовлечен в экспорт (метил)гризелимицина. ОгГ-6 кодирует белок с предполагаемой функцией глутаминсинтетазы. 1п!-1 и ΐη!2 кодируют белки с гомологией каталитическим областям интегразы, так что предполагается, что эти белки обладают активностью интегразы. Тпр-1, !пр-2 и !пр-3 между генами пгр§-1 и пгр§-3 кодируют белки с гомологией предполагаемым белкам транспозазам и, как предполагается, обладают активностью транспозазы. Дополнительная открытая рамка считывания обладает предполагаемой функцией в качестве субъединицы β ДНК-полимеразы III. Эта огГ обозначена как бпа. Небольшая ОКБ из 219 п.о. непосредственно ниже пгр§-3 кодирует МЬ!Н-подобный белок и, следовательно, обозначается как МЬ!Н. Белок МЬ!Н необходим для правильного функционирования ΝΚΙ’8 (Ваггу & СНаШз, 2009). ОгГ-8 обладает гомологией с гипотетическим белком 8с1а 13611 и, как предполагается, принадлежит к РЭ’О\подобному надсемейству. ОгГ-11 кодирует предполагаемый белок надсемейства амидогидролазы. Предполагаемые гены огГ-2, огГ-3, огГ-4, огГ-7, огГ-9 и огГ-10 все кодируют различные консервативные гипотетические белки.

Пример 3. Синтез Б-транс-4-метилпролина т уИго.

Синтез Б-транс-4-метилпролина т уИго может быть осуществлен путем сочетания трех последовательных тестирований, называемых тестирование Мр§-1, тестирование Мр§-2 и тестирование Мр§-3. Циклизация γ-семиальдегида γ-метилглутаминовой кислоты до 3-метил-Л²-пирролин-5-карбоновой кислоты происходит спонтанно или в нее может быть вовлечен Мр§-3. На фиг. 4 представлено превращение Б-лейцина в (28,4К)-4-метилпролин с использованием Мр§-1, Мр§-2, вероятно, Мр§-3 и Мр§-4.

- 27 029209

(a) Тестирование лейцингидролазы

На основании анализа ΐη зШсо, было обнаружено, что ген трз-1 кодирует лейцингидролазу. Для подтверждения того, что белок Μρδ-1 кодирует лейцингидролазу, осуществляли следующую экспериментальную процедуру.

Ген трз-1, кодирующий предполагаемую лейцингидролазу, амплифицировали с использованием праймеров

6г13_£ог (5'ССССССАТАТСАТССАССТСАССССССАТ-3¹) (5Е<2 Ю N0: 28) и 0Γί3_Γθν

(5'-ССТСАССАТССТСАТСССАСССТССАТТС-3') (5Е<2 Ю N0: 29)

Из геномной ДНК 81гер1отусез Ό8Μ 26643 с полимеразой РЬизюи и клонировали в вектор рТЕТ 2.1 (ТеппепШ) лигированием тупых концов. После подтверждения последовательности фрагмент ДНК субклонировали в рЕТ28Ь(+) через введенные сайты рестрикции Ибе1/ВатН1. Полученный конструкт рОпз3 трансформировали в Е. сой КозеИа ВЬ21 (ΌΕ3) рЬу88/КАКЕ для экспрессии белка. Свежеприготовленные трансформанты, несущие конструкты, выращивали в среде ЬВ (11 периодических культур, начатых с 0,1% инокуляций из 10-мл культуры, растущей в течение 5 ч при 37°С), дополненной канамицином (50 мкг/мл) и хлорамфениколом (34 мкг/мл). Все клетки росли при 37°С до ОП 600 приблизительно 0,8. Затем клетки стимулировали 1 М изопропил-Ь-О-тиогалактопиранозидом (1РТО) до конечной концентрации 0,2 мМ и затем выращивали при 16°С в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин, 4°С) и ресуспендировали в буфере А (20 мМ трис-НС1, рН 7,8, 200 мМ ИаС1 и 10% [об./об.] глицерина). Клетки затем лизировали (2 пассажа при 700 фунт/кв. дюйм, РТепсИ ргезз, 8ΓΜ АтГ со), и разрушенные клетки удаляли центрифугированием (21000 об/мин, 10 мин, 4°С). Использовали предварительно забитые ШзТгар™ НР колонки для препаративной очистки меченных гистидином рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IΜАС) в системе Ак1а рпте™ р1из (Ое НеаЙЬсаге). 15 мл лизатов белков фильтровали через стерильный фильтр и наносили на 1 мл колонку ШзТгар. Очистку осуществляли, как рекомендовано в руководстве ОЕ НеаЙЬсаге (Н1зТгар НР, инструкции 71-5027-68 АР). Желаемый белок элюировали с колонки ступенчатым градиентом имидазола с буфером В (20 мМ трис-НС1, рН 7,8, 200 мМ ИаС1 и 10% [об./об.] глицерина и 60, 100, 200 300 и 500 мМ имидазола, 10 мл фракции). Фракции, содержащие очищенный целевой белок при определении электрофорезом на 8Б8-полиакриламидном геле (РАОЕ), объединяли и концентрировали до приблизительно 200 мкл с использованием фильтров для ультрацентрифугирования АтГ сои ЦИга РЬ-10. Затем к сконцентрированному белку добавляли 800 мкл буфера для хранения (50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ ИаС1 и 10% [об./об.] глицерин) перед быстрым замораживанием в жидком азоте и хранением при -80°С. Концентрации белка определяли с использованием метода Бредфорда (Вю-Каб, Негси1ез, СА, И8А). Получали 1-3 мг/мл очищенного белка на литр культуры.

Тесты с лейцином в качестве субстрата проводили в ΜΘΡ8 (50 мМ), рН 7,0, и включенными субстратом (1 мМ), α-кетоглутаратом (1 мМ), Ре8О₄ (25 мкМ), БТТ (0,5 мМ), аскорбатом (0,1 мМ) и Μρδ1 (1 мкМ) в суммарной объеме 200 мкл. Реакции инициировали добавлением Μρδ1, и проводили инкубацию при 30°С в течение 1 ч. Белок осаждали холодным этанолом, и супернатант декантировали и использовали для дериватизации. Раствор сушили в роторном испарителе и ресуспендировали в 200 мкл буфера для присоединения (ацетонитрил:пиридин:триэтиламин:Н₂О 10:5:2:3). К этому раствору добавляли 50 мкл раствора ФИТЦ и после 5-минутной реакции при комнатной температуре добавляли 50 мкл Н₂О для остановки реакции. Раствор упаривали досуха с помощью скоростного вакуумного испарителя. Полученные ФИТЦ-аминокислоты растворяли в 1 мл смеси вода:ацетонитрил (7:2), центрифугировали и супернатант опять высушивали с помощью скоростного вакуумного испарителя. Аминокислоты затем растворяли в 100 мкл воды/ацетонитрила и использовали для анализа ВЭЖХ/МС. ФИТЦ-лейцин и ФИТЦгидроксилейцин определяли методом положительной ионизации (лейцин: [М+Н]+=272,9 и гидроксилейцин: [М+Н]+=288,9). Показано, что Μρδ-1 катализирует реакцию превращения лейцина в 5гидроксилейцин (фиг. 5).

(b) Тестирование Μρδ-2

Превращение 5-гидроксилейцина в γ-семиальдегид γ-метилглутаминовой кислоты может быть осуществлено с помощью реакции с Μρδ-2 или алкогольдегидрогеназой по Ьеизсй е! а1., 2003, которые провели реакцию с функционально сходным белком ИозЕ. Обычно реакционные смеси с 5гидроксилейцином или родственными соединениями в качестве субстрата могут содержать 100 мМ глицина (рН 10), 2 мМ β-НАД, субстрат (0,1-10 мМ), 1 мМ 2и8О₄ и приблизительно 3 мкг Μρδ-2. Типичные реакционные объемы могут составлять 500 мкл, реакции могут быть инициированы добавлением Μρδ-2, и реакционные смеси могут инкубироваться при 30-42°С в течение 1-3 ч.

(c) Тестирование Μρδ-4

Превращение 3-метил-А¹-пирролин-5-карбоновой кислоты в 4-метилпролин может быть осуществлено с помощью реакции с Μρδ-4 по Ьеизсй е! а1., 2003, которые провели реакцию с функционально сходным белком ИозР. Обычно реакционные смеси могут содержать 200 мМ трис (рН 8), субстрат, 0,2 мМ β-НАДН или β-НАДФН и приблизительно 5 мкг Μρδ-4. Реакционные объемы обычно составляют 1

- 28 029209

мл, реакции могут быть инициированы добавлением Мр8-4 и инкубацией при 30-42°С в течение 1-3 ч. Альтернативно, тестирование Мр8-4 по Вескег е! а1., 1997 включает 3-метил-Л¹-пирролин-5-карбоновую кислоту или родственные соединения в качестве субстрата, и оно может быть проведено в 50 мМ трис/НС1, рН 7,5, и включает субстрат (0,1-10 мМ), 0,2 мМ ФАД, 0,5 мМ НАДН и подходящее разведение Мр8-4 (например, конечную концентрацию 1 мкг в суммарном объеме 100-500 мкл). Реакции могут быть инициированы добавлением Мр8-4, и реакционные смеси могут инкубироваться при 30°С в течение 1-3 ч.

Пример 4. Синтез гризелимицина и метилгризелимицина ΐη νΐΐΓΟ.

Синтез гризелимицина и метилгризелимицина ΐη νΐΐΓΟ может быть осуществлен в соответствии с условиями реакции, как раскрыто у ОаНа1718 е! а1., 2001. При инкубации 1 мл каждая реакционная смесь может содержать 25 мМ трис НС1 (рН 8,0), 50 мМ №С1, 1 мМ ацетил-СоА (или 1 мМ ацетнл-8NАС), 2 мМ Ь-валина, от 2 до 3 мМ (28,4К)-4-метилпролина (или родственных соединений), 3 мМ Ь-лейцина, 1 мМ Ь-пролина (или без Ь-пролина для синтеза метилгризелимицина), 1 мМ Ь-треонина, 4 мМ 8аденозил-Ь-метионина, 1 мМ глицина, 10 мМ АТФ, 0,5-5 мМ N^8-1, N^8-2, N^8-3 и М!ЬН. Реакционные смеси могут инкубироваться при 30°С после начала реакции с АТФ в течение 2-72 ч.

Пример 5. Инактивация генов пгр8-1 и пгр8-3 и оперона тр8.

В соответствии со стандартными процедурами создавали мутантов 81гер1отусе8 И8М 22643 со вставками. Фрагменты приблизительно 3000 п.о. в длину, которые гомологичны частям оперона тр8, гены пгр8-1 и пгр8-3, соответственно, амплифицировали с хромосомной ДНК И8М 26643 с помощью ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в табл. 4. Эти фрагменты клонировали в клонирующий вектор рВ1ие8СГ1р! 8К+ Е. сой, дающий плазмиды рМР8, рNКР8-1, рNКР8-3. Затем кассету АргКογϊΤ, созданную как описано у Ои81 е! а1., 2003, амплифицировали с помощью праймеров, представленных в таблице 5, и интегрировали в плазмиды рМР8, рNКР8-1 и рNКР8-3 с помощью метода КебЕТ (ОепеЬг1бде8) с получением конъюгационных плазмид. Созданные плазмиды затем переносили в О8М 22643, и конъюгаты анализировали на корректную интеграцию генов в оперон тр8, ген пгр8-1 и пгр8-3, соответственно, перед тестированием на продукцию (метил)гризелимицина.

Таблица 4. Праймер для амплификации гомологичных фрагментов ДНК

Мутант	Праймер	Последовательность	ЗЕО ΙΌ ΝΟ
Игрз-1	Цгрз-1 £ог	С С Т С Т АСАС Т САТ С САСАТ СААС ТСС	30
	Ыгрз-1 τβν	ССТСТАСАТССТСАСССАССТСТС	31
Цгрз-З	Цгрз-З £ог	ССТСТАСААТССАССССАТСССААТ	32
	Цгрз-З гел	ССТСТАСААССТСТТСССССАССАТ	33
трз	Мрз £ог1	СССССТАСССАТСТССТСССТАССАТ	34
	Мрз Γβνΐ	ТССССТССТТТАССТСА	35
	Мрз £ог2	СССТТСАССССАССТСА	36
	Мрз гел2	ССТСТАСАТССТСААСТСТСССАТА	37

Подчеркнуты последовательности сайтов рестрикции

Таблица 5. Праймер для вставки кассеты АргК-οτΐΤ

Мутант	Праймер	Последовательность	ЗЕО Ιϋ ΝΟ
Игрз-1	Игрз-	ТСАССТСТСТССТСССТСТСТТСССССССС	38
	1_£ог2	САСТССССТАТТССССССАТСССТССАСС
		ТСАСАССТССТССССТССАСССТССТСТСС	39
	Игрз-	СТСССССССТСТАСССТССАССТССТТС
	1 гел2
Игрз-3	Игрз-	ТССССАТСССАССССАСТССТСТТТСАСА	40
	3 £ог2	САССАСССТАТТССССССАТСССТССАСС
		АССАТСАССТССААССАТТСТСТССССТС	41
	Игрз-	ТССАТСТСТТСТАСССТССАССТССТТС
	3_гел2
трз	Мрз £огЗ	АТСАСССТАССТСТСССТСТСТССТААСС	42
		ССТССТСТСАТТССССССАТСССТССАСС
	Мрз гелЗ	ТСАССТАТСАСССТСССААССТССССССТ	43
		ТТССАСТАСТСТАСССТССАССТССТТС

Подчеркнуты последовательности, гомологичные кассете АргК-οτΐΤ.

Для подтверждения продукции гризелимицина у дикого типа и для тестирования мутантов со встав- 29 029209

кой на способность к синтезу гризелимицина различные штаммы культивировали в среде N£5645 ((состав в процентах): лактоза 2,0, соевый шрот 2,5, №С1 0,5, СаС0₃ 0,1 и дрожжевой экстракт 0,5, рН 6,8) в перемешиваемых сосудах. Культуральный супернатант собирали через различные интервалы времени, фильтровали и смешивали 1:1 с этанолом.

После осаждения и отделения нерастворившихся веществ супернатант анализировали с помощью ИНРЬС (ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии) на продукцию (метил)гризелимицина.

Как можно видеть из фиг. 6, штамм Ό8Μ 22643 дикого типа продуцирует гризелимицин (см. пик, отмеченный как "гризелимицин", на 5,29 мин в хроматограмме ИНРЬС (УФ 210 нм)), тогда как мутанты Ό8Μ 22643 по игр8-1, игр8-3 и тр8 не продуцируют гризелимицин (отсутствие пика на 5,29 мин). Этот эксперимент подтверждает важность белков ИКР8 и белков Мр8 для синтеза гризелимицина и метилгризелимицина.

Пример 6. Комплементация мутантов тр8.

Для демонстрации того, что гены оперона тр8 имеют отношение к синтезу (28,4Р)-4-метилпролина проводили комплементацию мутанта тр8 (1) путем подпитки (28,4Р)-4-метилпролином и (2) путем генетической комплементации, обусловленной хромосомной интеграцией экспрессионного конструкта, в котором оперон тр8 экспрессируется с конститутивного промотора егтЕ.

В эксперименте с подпиткой 20 мкг/мл (28,4Р)-4-метилпролина добавляли к культурам мутанта тр8 и в супернатанте культур анализировали продукцию (метил)гризелимицина, как описано в примере 5. В то время как в нормальной культуральной среде без подпитки (28,4Р)-4-метилпролином мутант тр8 не продуцирует сколько-нибудь (метил)гризелимицина, подпитка в 20 мкг приводит к продукции (метил)гризелимицина (фиг. 7А, а также пример 9).

Для генетической комплементации мутанта тр8 создавали конструкт Р(егтЕ)-тр8, включающий оперон тр8 с генами тр8-1, тр8-2, тр8-3 и тр8-4 под контролем конститутивного промотора егтЕ в конъюгационном векторе с сайтом присоединения айР для интегразы, опосредующим интеграцию в хромосомный сайт аЙВ (см. фиг. 7В относительно последовательности промотора егтЕ). После интеграции этого конструкта Р(егтЕ)-тр8 в мутант тр8, созданный в примере 5, мутант тр8 с комплементацией тестировали на продукцию гризелимицина. Как показано на фиг. 7С, у мутанта тр8 с комплементацией продукция гризелимицина может быть восстановлена.

Оба эксперимента четко указывают на то, что оперон тр8 необходим для синтеза (28,4Р)-4метилпролина, который затем используется для синтеза метилгризелимицина.

Пример 7. Гетерологичная продукция метилпролина с помощью экспрессии набора генов тр8 1-4 у Е8сйет1сЫа сой и 8йерЮтусе8 соейсо1от.

Для подтверждения того, что набор генов тр8 1-4 кодирует элементы ферментативного механизма биосинтеза 4-метилпролина, создавали конструкты для экспрессии в Е. сой (рЕТ28-тр8) и 8. соейсо1от

(рЕ\\'Е201-тр8).

(a) Создание ри^Ъ201-тр8 и гетерологичная экспрессия в 8йерЮтусе8 соейсо1ог

Фрагмент ~5,8 т.п.о. ЕсоР1 из космиды В:Ь23, несущей 3'-конец кластера генов биосинтеза гризелимицина (54283-60163 нуклеотида из 8ЕЦ ГО N0: 1) субклонировали в репликационный челночный вектор рЕАЕ201 Е. соН/8йерЮтусе8 под контролем конститутивного промотора РегтЕ*. Полученный экспрессионный конструкт ри^Ь201-тр8 затем трансформировали в штамм хозяина 8йер1отусе8 соейсо1ог А3(2) с использованием метода протопластов (Кте8ет е1 а1., 2000). Трансформанты (8. соейсо1от/ри^Ь201-тр8) культивировали параллельно со штаммом дикого типа в 50 мл среды Т8В в течение 4 дней при 30°С в перемешиваемых сосудах с перегородками (мутантные культуры дополняли тиострептоном в конечной концентрации 20 мкг/мл). Клетки собирали центрифугированием и экстрагировали 50 мл метанола (15 мин обработка ультразвуком и 30 мин перемешивание). После фильтрации экстракт упаривали досуха и дериватизировали как описано ниже.

(b) Создание рЕТ28-тр8 и гетерологичная экспрессия у Е8сйепсЙ1а сой.

Фрагмент ~ 3,7 т.п.о. ХЬа1/ЕсоР1 из космиды В:Ь23-СтР субклонировали в экспрессионный вектор рЕТ28Ь (Nоνадеη), линеаризованный ШеЕЕсоРЛ под контролем индуцибельного промотора Т7. Клонированный фрагмент 3,7 т.п.о. ДНК несет гены тр8 1-4 (56434-60163 нуклеотида из 8ЕЦ ГО N0: 1 с расширением СТАОА на 5'-конце). Полученный экспрессионный конструкт рЕТ28-тр8, а также пустой экспрессионный вектор рЕТ28Ь затем трансформировали в штамм хозяина Е8сйепсЫа сой ВЬ21 (ИЕ3)/Сойоир1и8/рЕ18Е2 с помощью электропорации. Трансформанты (Е. сой ВЬ21 (ИЕ3)/Сойоир1и8/рЕ18Е2/рЕ128-тр8 или рЕТ28Ь) культивировали в 50 мл среды ЬВ, содержащей 0,2% глюкозы, дополненной канамицином (в конечной концентрации 50 мкг/мл), ампициллином (в конечной концентрации 50 мкг/мл) и хлорамфениколом (в конечной концентрации 25 мкг/мл) при 30°С. Культуры росли до ОП₆₀₀=0,6, экспрессию индуцировали 1РТО (в конечной концентрации 0,3 мМ), и инкубацию продолжали дополнительные 4 ч при 30°С. Клетки собирали центрифугированием и экстрагировали 50 мл метанола (15 мин обработка ультразвуком и 20 мин перемешивание). После фильтрации экстракт упаривали досуха и дериватизировали как описано ниже.

- 30 029209

(с) Дериватизация экстрактов и анализ ВЭЖХ-МС

Сухие клеточные экстракты, а также (28,4Р)-метилпролин (как референсный стандарт для времени удерживания и спектров фрагментации) ресуспендировали в 200 мкл буфера для присоединения (ацетонитрил:пиридин:триэтиламин:Н₂О). Добавляли 50 мкл раствора ФИТЦ (фенилизотиоцианата) и после 5минутной реакции при комнатной температуре добавляли 50 мкл Н₂О для прекращения реакции. Раствор упаривали досуха с помощью скоростного вакуумного испарителя. Полученные ФИТЦ-аминокислоты растворяли в 1 мл смеси вода:ацетонитрил (7:2), центрифугировали, и супернатант сушили с помощью скоростного вакуумного испарителя. Дериватизированные экстракты и дериватизированный референсный (28,4Р)-метилпролин затем растворяли в 100 мкл воды/ацетонитрила для анализа ВЭЖХ/МС.

Все измерения проводили в системе Эюпе.х ИШта!е 3000 Р8ЬС с использованием \а!егк ВЕН С18, 50x2,1 мм, 1,7 мкм бр колонки. Вводили два мкл образца, если не указано иначе. Разделение достигалось с помощью линейного градиента с (А) Н₂О + 0,1% РА до (В) АСЫ + 0,1% РА при скорости тока 600 мкл/мин при 45°С. Градиент инициировали 0,33 мин изократической стадией при 5% В с последующим увеличением до 95% В с 9 мин до конца с 1,6 мин флэш-стадией при 95% В перед повторным уравновешиванием в исходных условиях. УФ и МС определение осуществляли одновременно. Объединение ВЭЖХ и МС поддерживалось системой Абуюп Тпуегка Ыапота!е папо-Е8Е присоединенной к Тйегто Р1кйег ОгЬйгар. Масс-спектры получали в центроидной форме из 100-500 т/ζ при разрешении Р=30000. Мониторинг одной реакции с использованием индуцируемой столкновением диссоциации осуществляли при 247,11, 249,12, 265,12 и 267,12 т/ζ. Все родительские ионы выделяли в пределах окна 2 т/ζ и фрагментировали при 35% энергии СГО.

Ожидаемое производное 4-метилпролина может быть определено в дериватизированных экстрактах культур, несущих экспрессионные конструкты трк (ри\Ъ201-тр5 и рЕТ28-трк), но не в дериватизированных конструктах отрицательных контролей, как показано на фиг. 8 при иллюстрации гетерологичной экспрессии в 8. соеПсо1ог (8. соейсо1ог/ри\Ь201-тр5 по сравнению с 8. соейсо1ог \Т). При сравнении с референсным веществом дериватизированным ФИТЦ-(28,4Р)-4-метилпролином по времени удерживания и данным масс-спектрометрии высокого разрешения (включая данные фрагментации) это соединение может быть четко идентифицировано в экстрактах культур, экспрессирующих трк.

Эти недвусмысленно доказывает, что набор генов трк 1-4 кодирует всю необходимую ферментативную активность, требуемую для биосинтеза предшественника гризелимицина 4-метилпролина. Кроме того, могут быть определены производные двух предполагаемых промежуточных соединений пути (5гидроксилейцина и γ-семиальдегида γ-метилглутаминовой кислоты, см. фиг. 8), что служит дополнительным доказательством постулируемой ферментативной активности. Функция предполагаемой лейцингидроксилазы может быть дополнительно подтверждена исследованиями ш убго с использованием очищенного фермента (как описано выше в примере 5). Производное третьего постулируемого промежуточного продукта 3-метил-Д¹-пирролин-5-карбоновой кислоты не может быть определено, так как это соединение не может быть дериватизировано используемым методом.

Успешная гетерологичная экспрессия генов трк в двух различных хозяйских штаммах (Е. сой и 8. соейсо1ог) также показывает, что эта стратегия может быть применена к продукции 4-метилпролина, например, в подходах к органическому синтезу гризелимицина или для подпитки предшественником культур, продуцирующих гризелимицин/метилгризелимицин для повышения выхода метилгризелимицина.

Пример 8. Анализ специфичности домена А ш кШсо.

Анализ аминокислотной специфичности доменов А белков ЫРР8 ш кШсо осуществляли в соответствии с СйаШк е! а1., 2000. Вкратце, последовательности доменов А выравнивали с последовательностью активирующего фенилаланин домена А (РйеА) грамицидин-8-синтетазы ОгкА. На основе этого выравнивания идентифицировано восемь аминокислот, образующих связывающий карман, и проведено сравнение с придающими специфичность аминокислотами доменов А с известной субстратной специфичностью. В последующей табл. 6 представлена специфичность доменов А ЫРР8-1, ЫРР8-2 и ЫРР8-3 для субстратов, предсказанная ш кШсо. Для сравнения перечислены действительные субстраты в их активированном виде для введения в (метил)гризелимицин.

"Положение остатка" относится к восьми аминокислотам индивидуальных доменов А, которые, как считается, важны для узнавания субстрата ("аминокислоты, придающие специфичность" или "код, придающий специфичность"). Эти остатки сравнивали с "кодами, придающими специфичность", доменов А с известной субстратной специфичностью (ййр://пгр5лд5.итагу1апб.еби/пгр5/Ь1а5!.й!т1).

- 31 029209

Таблица 6

^б В соответствии со сравнением с кодом, придающим специфичность, других доменов А (Ипр ://пгр5. ΐ§5. ишагу1апб.еби/пгр 5/Ыа5!.к!ш1)

^с Остатки соответствуют нумерации грамицидин-3-синтетазы РНеА (СНаШз е! а1., 2000) ^а Номер поступления: АЕ204805_1 (Ио££шапп е! а1., 2003) ^е Номер поступления: ААО26334 (ЬиезсН е! а1., 2003)

^£ Номер поступления: ААЕ17281 (Ио££шапп е! а1., 2003)

Результаты для домена А3, домена А10 и частично домена А8 согласуются с аминокислотами, которые действительно включены в (метил)гризелимицин. Оставшиеся результаты не выглядят выровненными с действительно включенными аминокислотами, что может быть обусловлено применяемым методом. На основе восьми аминокислотных остатков синтетаз, которые, как считается, являются существенными для специфичности аминокислоты-субстрата, подлежащей включению в гризелимицин, невозможно провести различие между специфичными для пролина и метилпролина доменами А.

Пример 9. Филогенетический анализ доменов, специфичных для метилпролина и пролина.

Как представлено на фиг. 9, филогенетический анализ доменов А, которые специфичны для метилпролина и пролина, показывает, что домены А из модулей \КР8. включающих метилпролин АКР8-1-Л2 и ККРЗ-1-А5, и №рВ8(шРго), и ША-А(шРго)), более тесно связаны друг с другом, чем с доменами А доменов, включающих пролин АРР8-2-А8 и \о5О(тРго)). Это предполагает, что специфичность определяется не только восемью аминокислотными остатками, как представлено в табл. 6.

Анализ осуществляли с использованием функции Оепешоз Тгее ВшШег компьютерной программы Оепеюиз Рго 5.4.3 (опции выравнивания древа: матрица стоимости (В1озиш 62), штраф за открытие пробела (12), штраф за удлинение пробелов (3) и тип выравнивания (глобальное выравнивание); опции построения древа: модель генетической дистанции (Шке5-Сап!ог), метод построения древа ^е^кбог1отт§), корневой вид (некорневой вид)). Отрезок шкалы масштаба соответствует 0,09 замен на сайт аминокислоты.

Пример 10. Специфичность доменов А модулей 2, 5 и 8.

Для того чтобы узнать подробности специфичности доменов А модулей 2, 5 и 8, домены получали рекомбинантно, и их специфичность анализировали путем анализа обмена АТР/РР1 ш убго. Результаты представлены на фиг. 10. Как и ожидалось, специфичность доменов А2 и А5 является наивысшей для (28,4К)-4-метилпролина. Интересно, что то же самое наблюдается в случае домена А8, хотя в процессе биосинтеза гризелимицина модулем 8 предпочтительно включается Ь-пролин. Показано, что существует также высокая специфичность для Ь-пролина. Предполагается, что домен С модуля 8 предпочтительно конденсирует пролин и вводит его в растущую пептидную цепь. Доступность метилпролина в процессе биосинтеза (метил)гризелимицина, очевидно, также играет роль, как это может быть продемонстрировано в экспериментах с подпиткой. Подпитка 4-метилпролином в концентрациях от 0,025 до 1,0 г/л приводит к повышению метилгризелимицина до 5-кратного по сравнению с контролем. Эксперименты показывают, что скорость включения не является линейной, но достигает насыщения при приблизительно 0,5 г/л. Подпитка транс-гидроксипролином и транс-фторпролином также ведет к существенному включению.

(а) Получение рекомбинантных доменов А2, А5 и А8

Для того чтобы прямо изучать субстратную специфичность домена А, авторы изобретения задались

- 32 029209

целью экспрессировать А домены А2, А5 и А8 пути биосинтеза гризелимицина в виде белков с Νконцевыми метками Ηΐδ₆ из рЕТ28Ь(+). Фрагменты ДНК, кодирующие домены аденилирования А2, А5 и А8, амплифицировали из геномной ДНК δΐΐΌρΙοιηννο ΌδΜ 22643 с использованием олигонуклеотидов

А2_£ог 5’-СССАССАТАТССАТССССАТСТСАСССТССС-3'

(5Е<2 Ю N0: 44) и А2 Γθν 5'-АСССССААТТСССССАССССССССАСССССА-3'

(ЗЕО Ю N0: 45)

(из-за высокой гомологии все три домена А могут быть амплифицированы с использованием одной и той же пары праймеров) и клонировали в вектор р1ЕТ2.1 лигированием тупых концов.

Секвенирование выявило, что все домены А были корректными. В соответствии с молекулярной структурой гризелимицина и анализа доменов А ΐη δΐΐΐοο, предполагалось, что А2 и А5 служат для включения 2δ,4Κ-метилпролина. Домен А8, как ожидалось, проявляет более широкую субстратную специфичность и служит для включения либо Ь-пролина, либо 2δ,4Κ-метилпролина. Для определения этого ΐη νΐίτο заявители экспрессировали домены А в Е. соН Козейа рЬуз (КАКЕ) при 16°С в течение ночи. Все три домена А могли быть получены в виде растворимых фракций.

Белки затем очищали №+-аффинной хроматографией с использованием ступенчатого градиента имидазола. Чистый белок может быть получен во фракции 8 для всех доменов А. Хотя количество белка было очень низким (0,2 мг/мл), он мог быть использован для метода обмена ΑΤΡ-ΡΡΐ для определения субстратной специфичности.

Субстратную специфичность 3 очищенных доменов аденилирования оценивали с использованием метода обмена ΑΤΡ-ΡΡΐ (ΜοοΙζ апд МагаЫе1, 1997, ТЬошаз е1 а1., 2002). Вкратце, каждый белок инкубировали с панелью различных аминокислот, включая ожидаемый субстрат каждого домена. В качестве контроля каждый белок инкубировали в отсутствие добавленной аминокислоты для определения радиоактивности в фоновой реакции. Тестировали девять различных субстратов (см. фиг. 10).

(Ь) Определение субстратной специфичности с помощью метода обмена ΧΤΡ-Ι'^ΡΙΡΡ,

Для определения субстратной специфичности реакционные смеси ΧΤΡ-Ι'^ΡΙΡΡ, (100 мкл), содержащие трис-НС1 (рН 7,5, 75 мМ), Μμ('Ί₂ (10 мМ) , άΑΤΡ (5 мМ), аминокислоту (5 мМ) и белок (2 мкг), готовили при 30°С. Пирофосфат ³²Р-тетразолия получали от Ρе^к^η Е1тег (ΝΕΝ #\ЕХ019). Реакции инициировали добавлением [³²Ρ]ΡΡ; (конечное количество 0,1 мкКи) в течение до 30 мин перед гашением суспензиями активированного угля (500 мкл, 1,6% [мас./об.] активированного угля, 0,1 М \;·ι₄Ρ₂Ο- и 0,35 М хлорной кислоты в Η₂Ο) . Активированный уголь осаждали центрифугированием перед двукратным промыванием раствором для промывания 0,1 М \;·ι₄Ρ₂Ο- и 0,35 М хлорной кислоты в Η₂Ο), ресуспендировали в Н₂О (50 0 мкл) и подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике (Весктап Εδ6500).

Пример 11. Регуляторы транскрипции типа Хге, кодируемые ογ£-1 и ογ£-12 кластера генов биосинтеза гризелимицина.

Для выяснения вовлечения двух предполагаемых регуляторов транскрипции, кодируемых ογ£-1 и οιΤ-12. в продукцию гризелимицина создавали мутантов с инактивацией соответствующих ΟΚΡ. Затем определяли влияние на продукцию гризелимицина с помощью анализа ВЭЖХ/МС экстрактов штамма дикого типа δΤ105671 и мутантных штаммов δΤ105671-οΓί-1 и δΤ105671-οΓί-26, соответственно. Для того чтобы определить, обусловлено ли влияние на продукцию, наблюдаемое у мутантов с инактивацией, прямой регуляцией регуляторами транскрипции, кодируемыми ογ£-1 и ογ£-12, осуществляли гетерологичную экспрессию и очистку регуляторов. Очищенные белки использовали в методах сдвига электрофоретической подвижности (ΕΜδΑ) для проверки прямого взаимодействия с предполагаемыми промоторными областями кластера генов биосинтеза гризелимицина.

(а) Инактивация ογ£-1 и ογ£-12

Гены ογ£-1 и ογ£-12 разрушали с использованием производных плазмиды рКС1132 с интеграцией в ογ£-1 и ογ£-12 путем гомологичной рекомбинации. Конструировали две производных рКС1132 (рКС1132ογ£-1 и рКС1132-ο^£-26, соответственно), несущих центральную часть кодирующей области либо ογ£-1, либо ογ£-12. Затем фрагмент 623 п.о. ДНК ογ£-1 и фрагмент 1139 п.о. ДНК ογ£-12 амплифицировали с помощью реакций ПЦР с использованием сочетаний праймеров Рхгешзе ΙοιΗχίΌμπδν' гет и дхтеПдпзе Юг/дхгеПдпзе гех. соответственно (последовательности праймеров см. в табл. 8). Затем к обоим концам фрагментов с помощью используемых праймеров присоединяли сайты рестрикции ЕгоКЕ Фрагменты ДНК и плазмиду рКС1132 гидролизовали с использованием ΡχοΚΙ и затем подвергали лигированию. Продукты лигирования, содержащие желаемые плазмиды рКС1132-ο^ί-1 и рКС1132-ο^£-26, соответственно, трансформировали в электрокомпетентные клетки ΌΗ10Β Е. сο1^. Селекцию трансформантов проводили на чашках агара, содержащих 60 мкг/мл апрамицина. Единичные колонии выращивали в жидкой среде РВ в присутствии 60 мкг/мл апрамицина, и получали плазмиды. Плазмиды, несущие корректные вставки (рКС1132-ο^ί-1 и рКС1132-ο^ί-26), идентифицировали с помощью аналитического гидролиза с использованием Е^КЕ Клетки ЕТ12567 Е. сο1^, несущие непермиссивную плазмиду рИ28002, затем трансформировали с использованием корректных плазмид рКС1132-ο^£-1 и рКС1132-ο^ί-26. Селекцию трансформантов проводили на чашках агара, содержащих 60 мкг/мл апрамицина с получением штаммов Е. сο1^ ЕΤ12567рυΖ8002рКС-ο^£-1 и Е. сο1^ ЕΤ12567рυΖ8002рКС-ο^£-26. Эти штаммы использовали для

- 33 029209

доставки производных плазмиды рКС1132 в штамм ЗТ105671 путем конъюгации. Метод осуществляли следующим образом. 2 мл 2-дневных жидких культур штамма ЗФгерФотусез ЗТ105671 выращивали в среде 5288 для продукции гризелимицина и в среде ТЗВ при 30°С, и 2 мл соответствующих штаммов Е. сой, несущих плазмиды рКС1132-огГ-1 или рКС1132-огГ-26 (выращенных в среде ЬВ, содержащей 25 мкг/мл канамицина, 25 мкг/мл хлорамфеникола и 60 мкг/мл апрамицина), осаждали, каждый штамм промывали стерильной водой и ресуспендировали в 500 мкл ТЗВ. 250 мкл штамма ЗТ105671 ЗФгерФотусез и соответствующий штамм Е. сой смешивали и инкубировали в течение ночи при 30°С с аэрацией. Добавляли 1 мл ТЗВ, содержащего 60 мкг/мл апрамицина и 25 мкг/мл налидиксовой кислоты, и дополнительно инкубировали в течение ночи при 30°С с аэрацией. После инкубации клетки осаждали, промывали один раз ТЗВ и высаживали на МЗ-агар, содержащий 60 мкг/мл апрамицина и 25 мкг/мл налидиксовой кислоты, с последующей дополнительной инкубацией при 30°С до тех пор, пока конъюгаты не станут видимыми. Корректную интеграцию плазмид рКС1132-огГ-1 или рКС1132-огГ-26 в кодирующие области огГ-1 или огГ-12, соответственно, подтверждали путем выполнения ПЦР с использованием геномной ДНК конъюгатов и сочетаний праймеров 1ас21, 1ас22 и §пхге1 §1, §г1хге1_§2 в случае разрушения огГ-1 или §г1хге11_§1, дпхгеП §2 в случае разрушения огГ-12, соответственно. Инактивирующие мутанты ЗТ105671огГ-1 и ЗТ105671-огГ-26, созданные с помощью этого метода, использовали для определения влияний на продукцию гризелимицина по сравнению с предшественником ЗТ105671.

(Ь)Анализ ВЭЖХ/МС экстрактов ЗТ105671-огГ-1 и ЗТ105671-огГ-26

Жидкие культуры четырех независимых инактивированных мутантов огГ-1 и двух независимых инактивированных мутантов огГ-12 выращивали в течение двух дней в жидкой среде ТЗВ, содержащей 60 мкг/мл апрамицина. Эти используемые культуры инокулировали 1:50 в двух параллельных каждую в 100 мл свежей среды ТЗВ без антибиотика, и выращивали в течение 3 дней. Клетки ЗТ105671 дикого типа обрабатывали таким же образом без использования апрамицина в предварительной культуре. Клетки осаждали центрифугированием, и супернатант использовали для экстракции этилацетатом. Для прослеживания эффектов на продукцию гризелимицина экстракты затем анализировали с помощью анализа ВЭЖХ/МС. Определяли количества гризелимицина от каждого мутанта и штамма дикого типа ЗТ105671 относительно количества суммарного белка каждой культуры. Поэтому области соответствующих пиков объединяли и подсчеты проводили относительно количества суммарного белка осажденных клеток. Рассчитывали средние величины и стандартные отклонения. Инактивация огГ-1 приводила более чем к 200кратному снижению продукции гризелимицина. Гризелимицин не мог быть определен у инактивированного мутанта огГ-12 (см. табл. 7). Наблюдения показывают вовлечение транскрипционных регуляторов типа Хге, кодируемых огГ-1 и огГ-12, в регуляцию продукции гризелимицина. Являются ли эти эффекты результатом прямой регуляции промоторов в пределах кластера генов биосинтеза гризелимицина путем связывания транскрипционных регуляторов типа Хге или отражают непрямой эффект, должно быть выяснено с помощью выполнения исследований по ДНК-белковому взаимодействию (методами сдвига электрофоретической подвижности, ЕМЗА).

Таблица 7. Влияние на продукцию гризелимицина у мутантов ЗТ105671-огГ-1 и ЗТ105671-огГ-26.

Штамм	№ повторов	Среднее (отн. интенсивность)	Станд. откл.
5Т105671	4	7,38*10⁹	4,59*10⁹
ЗТ105б71-ог£-1	8	3, 19*10⁷	1,41*10⁷
5Т105671-ог£-2 б	8	-	-

Представлены количества гризелимицина от каждого мутанта и штамма дикого типа ЗТ105671 в виде средних величин количеств в полученных экстрактах относительно суммарного содержания белка культур, независимо выращенных в повторах.

(с) Проверка специфического связывания транскрипционных регуляторов ОгГ-1 и ОгГ-12 с промоторными областями итр§1 и итр§2.

Для проверки прямой транскрипционной регуляции генов биосинтеза гризелимицина регуляторами ОгГ-1 и ОгГ-12 определяли возможное связывание с предполагаемыми промоторными областями выше генов итр§1 и пгр§2. Для этого кодирующие области огГ-1 и огГ-12 сначала амплифицировали в реакциях ПЦР с сочетаниями праймеров хгеЕМеЕГог/хгеЕНтйШ-геу и хгеЕ^еЕГог/хгеП-НтйШ-геу с использованием геномной ДНК штамма ЗТ105671 в качестве матрицы. Сайты рестрикции Нбе1 таким образом присоединяли к 5'-концам, и сайты рестрикции ΗΐπάΙΙΙ присоединяли к 3'-концам полученных фрагментов ДНК. Плазмиду рЕТ22Ь и амплифицированные фрагменты ДНК, несущие гены огГ-1 и огГ-12, гидролизовали ΝίΕΙ и ΗΐπάΙΙΙ. Затем гидролизованные ΝάβΙ/ΗΐηάΠΙ огГ-1 и огГ-12 лигировали с ΝάβΙ/ΗΐηάΠΙ гидролизованной рЕТ22Ь в двух отдельных пробах. Продукты лигирования трансформировали в Е. сой □1110В, и селекцию трансформантов проводили на чашках агара в ЕВ, содержащих 200 мкг/мл ампициллина. Получали плазмиды, и корректную интеграцию вставок (огГ-1 и огГ-12, соответственно) в плазмиды подтверждали гидролизом ΗΐηάΙΙΙ/ΝάβΙ. Плазмиды, несущие вставки, в конце подвергали секвенированию ДНК, для того, чтобы исключить мутации последовательности ДНК. Благодаря стратегии клониро- 34 029209

вания, полученные плазмиды рЕТ22Ь-огГ-1 и рЕТ22Ь-огГ-26 кодировали ОгГ-1 и ОгГ-12 с С-концевыми бтью Н18-метками (6/Н1к). Обе плазмиды трансформировали в Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3) с помощью электропорации и проводили селекцию трансформантов на чашках агара ЬВ, содержащих 200 мкг/мл ампициллина. Экспрессию гибридных белков с С-концевыми 6/Н1К метками ОгГ-1-Н1к и ОгГ-12-Н|к осуществляли в жидкой среде ЬВ, содержащей 200 мкг/мл ампициллина, в присутствии 0,1 мМ ΙΡΤΟ при 16°С в течение ночи.

Клетки лизировали обработкой ультразвуком и очистки ОгГ-1-Н1к (~33 кДа) и ОгГ-12-Нй (~47 кДа) добивались при использовании Νί²⁺ аффинных колонок.

Предполагаемую промоторную область генов пгрк1 (область 581 п.о. выше пгрк1) и пгрк2 (область 632 п.о. выше пгрк2) амплифицировали в реакциях ПЦР с использованием сочетаний праймеров ргот4Нех2_геу/ргот4Нех3_Гог и ргот5Ьех2 гсу/ргот5Нсх3 Гог, соответственно, для получения фрагментов ДНК, несущих 18 п.о. линкерные области на обоих концах. Во второй реакции ПЦР эти фрагменты ДНК метили флуорофором Нех на 5'-конце каждой цепи. После этого использовали праймеры (Нех2 и Нех3), несущие флуорофор Нех на 5'-конце и являющиеся обратно комплементарными 18 п.о. линкерным областям, присоединенным в первых реакциях ПЦР. В результате этого создавали фрагменты ДНК, меченные Нех, охватывающие указанные выше вышележащие области генов пгрк1 и пгрк2, и обозначали как Рпгрк1 и Рпгрк2. В параллельной пробе 696 п.о. межгенную область, примыкающую к генам тхап_3950 и тхап 3951 аннотированного генома Мухососсик хапбшк ΌΚ1622, включающую двойную промоторную систему, амплифицировали праймерами ЕН33951 геу/ЕН33950 гем с использованием геномной ДНК соответствующего штамма. Как и праймеры, несущие такие же 18 п.о. линкерные области, подобные указанным выше, фрагмент ДНК можно в последующем пометить флуорофором Нех на обоих 5'-концах, как описано выше. Так как специфическое связывание регуляторов ОгГ-1-Нтк и ОтГ-2-Н1к с этой промоторной областью вне генома Мухососсик хапГЪик ΌΚ1622 не может ожидаться, результирующий фрагмент ДНК, обозначаемый как Ртхап_с1г1, служил отрицательным контролем в методах ЕМ8А.

Эти фрагменты ДНК, а также оба очищенных регулятора (ОгГ-1-Шк и ОтГ-12-Н1к) затем использовали в методах ЕМ8А. Вкратце, методы выполняли следующим образом. 4% нативные РАА-гели получали в 1/ буфере НО (25 мМ НЕРЕ8, 192 мМ глицин, рН 7,3 с КОН). Карманы геля промывали, и электрофорез осуществляли в течение 30 мин при 120 В без образцов в 1/ буфере НО. Образцы (100 фмоль каждого фрагмента ДНК Рпгрк1, Рпгрк2 и Ртхап с1г1 без или с 500-кратным молярным избытком либо ОгГ-1Н1к, либо ОгГ-12-Нтк и 2,5 мкг ДНК спермы лосося высокой молекулярной массы в качестве конкурента ДНК) получали и инкубировали в течение 10 мин при 30°С. Образцы наносили на гель и электрофорез осуществляли в течение 2 ч при 120 В. Определение фрагментов ДНК выполняли с использованием визуализатора ТурЬооп 9410 (АтеткЬат) при соответствующей длине волны. В присутствии ОгГ-1-Шк при электрофорезе может наблюдаться задержка каждого фрагмента ДНК, меченного Нех, по сравнению с пробами без ОтГ-1-Н1к, указывая на неспецифическое связывание регулятора ОтГ-1-Н1к с ДНК, включающей промоторную область (фиг. 11). С другой стороны, ОгГ-12-Нтк не проявлял способности к взаимодействию с какими-либо фрагментами ДНК, демонстрируя отсутствие специфичности по отношению к ДНК, меченной Нех, используемой в методах. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что ни ОгГ1-Н1К, ни ОгГ-12-Нтк не являются прямыми транскрипционными регуляторами промоторов Рпгрк1 и Рпгрк2.

Регуляторы транскрипции типа Хге ОгГ-1 и ОгГ-12 демонстрируют существенные черты их предсказанной доменной организации, которая определена с использованием способа 8МАКТ по Ьйр://ктат1.етЬ1-Ье1бе1Ьегд.бе/ (фиг. 12). Как и ожидалось, оба регулятора обладают Ν-концевым мотивом типа Хге спираль-поворот-спираль (НТН), тогда как ОгГ-1 очевидно содержит второй домен этого типа (НТН2). В дополнение к этому оба регулятора характеризуются расширенным С-концом с неизвестной функцией.

Так как было вероятно, что эти экстраординарные черты являются частью регуляторных механизмов, которые влияют на аффинность и тем самым на специфичность в отношении индивидуальных последовательностей ДНК регуляторов ОгГ-1 и ОгГ-12, методы ЕМ8А повторяли с использованием укороченных с С-конца вариантов регуляторов. В случае ОгГ-1 эти варианты включали только НТН1, НТН2 или оба предсказанных НТН домена. Соответствующие белки названы ОКЕ1-НТН1 (~9,6 кДа), ОКЕ1НТН2 (~9,8 кДа) и ОКЕ1-НТН12 (16,4 кДа). В случае ОгГ-12 укороченный вариант содержал только Νконцевой домен НТН, названный ОКЕ26-НТН (~9,9 кДа). Регуляторные влияния (например, связывание неизвестных кофакторов или белок-белковые взаимодействия), приводящие к конформационным изменениям С-конца или всего белка и тем самым влияющие на связывающее сродство регуляторов к ДНК, должны быть исключены.

Укороченные варианты ОгГ-1 и ОгГ-2 получали клонированием соответствующих 5'-областей огГ-1 и огГ-2 в виде вставки фрагментов №е1/Ншб111 в ШеЕНшбШ гидролизованную рЕТ22Ь с получением кодируемых гибридных белков с С-концевой меткой 6/Нщ Клонирование осуществляли, как описано в случае полноразмерных ОгГ-1 и ОгГ-2. Пары праймеров, используемых для амплификации вставок, подвергаемых клонированию, представляли собой хге1-Ше1Тог/хге11цЫгеу (ОгГ-1-НТН1),

- 35 029209

хге1й1й2£ог/хгеШ1й12геу (Ог£-1-НТН2), хге1-Ыбе1-£ог/хгеШИ12геу (Ог£-1 -НТН12) и хге11-Ыбе1Юг/хгеПЫйгеу (Ог£-12-НТН). Гетерологичную экспрессию, очистку и последующую проверку связывания с указанными выше промоторными областями генов пгр§1 и пгр§2, проводили, как описано для полноразмерных белков. Методы ЕМ8А, осуществляемые с использованием этих укороченных вариантов регуляторов, выявили специфическое связывание ОКР1-НТН12 с промотором Рпгр§1 и Ог£12-НТН с обеими промоторными областями Рпгр§1 и Рпгр§2 (фиг. 13).

Только при совместной инкубации Ог£-1-НТН12 и Рпгр§1 может быть достигнута существенная задержка при электрофорезе ДНК. Эта задержка не может быть выявлена при использовании отрицательного контроля Ртхап_с1г1. Совместная инкубация с Рпгр§2 дала менее четкий результат, в связи с этим не может быть сделано четкого вывода о прямом связывании Ог£1-НТН12 с промоторной областью Рпгр§2. Совместная инкубация Ог£-12-НТН с Рпгр§1 или Рпгр§2 приводила к четким индивидуальным задержкам фрагментов ДНК, тогда как в случае отрицательного контроля Ртхап_с1г1 сдвиг полностью отсутствовал.

Основываясь на этих экспериментальных результатах, роль С-концов обоих регуляторов попрежнему требует выяснения, но, как предполагается, она связана с модификацией специфичности связывания Ог£-1 и Ог£-2 с ДНК. Тем не менее, основываясь на влияниях на продукцию гризелимицина, наблюдаемых после инактивации ог£-1 или ог£-2, прямом специфическом связывании Ог£-1-НТН12 с промотором Рпгр§1 и Ог£-12-НТН с промоторами Рпгр§1 и Рпгр§2, регуляторы транскрипции типа Хге, кодируемые ог£-1 и ог£-2, отчетливо функционально связаны с биосинтезом гризелимицина и могут рассматриваться как часть вторичного метаболического кластера.

Таблица 8. Перечень праймеров, используемых в экспериментах

Название праймеров	Последовательность 5' -^3'	ЗЕО Ю N0
Лхгедгтзе £ог	сдСААТТСТСАСААССТСССТССАС	46
Лхгедгтзе геу	сдСААТТССТСАТАСАССТСАССССС	47
Лхге11дг1зе £ог	сд6ААТТСС6ТА66АСАС66АААСТ6ТС	48
ЛхгеИдгФзе τεν	сдСААТТСССАТССАТССТСАССАС	49
ΕΗ33950_Γθν	ССААТССССССССТАСТССАСССТССТАТТТ СТСАСААТС	50
ЕН33951 Γθν	ССААТССССССССТАСТСАСАССАСССССТСТС	51
дг1хге1 д1	АТССССТТСССССАСАС	52
дг1хге1 д2	ССТСССССТАТСССАСТС	53
дг1хге11 д1	СААСССАСАССТССАССС	54
дг1хге11 д2	ССТСТССТССАСССАСАС	55
Ьех2	сстстссстссссттстс	56
ЬехЗ	ССААТССССССССТАСТС	57
1асг1	СТТССССТССАССТССАС	58
1асг2	СТСТССААТТСТСАСССС	59
ргот4Нех2 геу	ССТСТСССТССССТТСТСТТСАСТАТССССАТСТТСТ ттсс	60
ргот4НехЗ £ог	ССААТССССССССТАСТССТССТСАСТСААССАСАТ СТСАС	61
ргот5Нех2 геу	ССТСТСССТССССТТСТССАТССААСАССССТСАС СТС	62
ргот5ЬехЗ £ог	ССААТССССССССТАСТСССАССАСТТСАТССТССС	63
ΧΓθΙ-ΗίηάΙIIΓθν	сдЕААССТТСТССТТССССССССТТТС	64
хге1Н£Ы2гем	сдЕААССТТССССАТССАССССТСТТС	65
ΧΓθΙΗΕΗΐΓθν	сдЕААССТТАТСАСТСАСАТССССССС	66
хге1Н£Н2£ог	дЕааддСАТАТССАТСТСТТСССССССТСС	67
хге1Ι-ΗίηάΙIIΓθν	сдЕААССТТССТТСТССТААТСССССТСС	68
хгеПШгеу	сдЕААССТТСТССССТТСССССТСАС	69
хге11-Ы0е1-£ог	дЕааддСАТАТСАСТСААААССТСАСССТСССАС	70
хге1-Ыйе1-£ог	дЕааддСАТАТСТСТССТССТСАСТТССАССС	71

Название ДНК и последовательности показаны в расположении олигонуклеотидов от 5'- к З'-концу.

- 36 029209

Буквы с одинарным подчеркиванием: сайты рестрикции, присоединенные к праймерам. Буквы с двойным подчеркиванием: 5'-линкерные области, присоединенные к соответствующей последовательности. Строчные буквы: нуклеотиды, присоединенные для повышения эффективности рестрикции.

Пример 12. 81гер1отусез ΌδΜ 22643.

81гер1отусез ΌδΜ 22643 положен на хранение 6 апреля 2009 г. в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов в целях патентной процедуры с □енАсИе 8атт1ипд νοη Мхкгоогдашзтеп ипб 2е11ки11игеп ОтЬН (ΌδΜΖ)), 1пйоГГеп81гаЗе 7В, 38124 Вгаип8сЬ^е1д, Оегтапу, 4 июня 2009 г. от δаηοГ^-Ανеηί^δ ОеиГзсЫапб ОтЬН, 1пби81г1ерагк НосЬз!, 65926 БгапкГигСтМат, Оегтапу.

Ссылки

А1ЬзсЬи1 5.Г. еЬ а1. , Ыис1е1с АсНз Нез., 1997, 25, 33893402

Ваггу З.М. апЬ СЬаШз С.Ь., Сигг. Ορίη. СЬет. ΒίοΙ., 2009, 13, 205-215

Вескег ϋ. еЬ а1., Еиг. Л. В1осЬет. 1997, 249, 739-747 В1ЬЬ, М.Ь. еЬ а1., Сепе 1985, 38, 215-266

В1ЪЪ, М.СГ. еЬ а1., Мо1еси1аг М1сгоЫо1оду 1994, 14, 533545

В1егтап М. еЬ а1., Сепе 1992, 116, 43-49

СЬаШз С. Ъ. еЬ а1. , СЬет. ΒίοΙ. 2000, 7, 211-264

Ег1ко Т. ек а1., Сепе, 1995, 66, 133-137

Еегпа" пЬег-Могепо М.А. ек а1., Се11, 1991, 66, 769-780 Е1пк1пд К. апЬ МагаЫе1 М.А., Аппи. Ηθν. М1сгоЫо1., 2004;

58, 453-488

Са1ЬаЬг1з Ν. ек а1. , Ргос. ЫаЬ1. АсаЬ. 3οί. ЮЗА, 2001, 98, 11136-11141

СизЬ	В ек а1., Ргос. ЫаЬ1.	АсаЬ.	3οί .	ИЗА,	2003,	10 0.
1546 НаЬп	М. апЬ ЗЬасЬе1Ьаиз Т.;	Ргос.	ЫаЬ1.	АсаЬ.	3οί .	изА,
101, Нега!	15585-15590;. ЕриЬ 2004 3. ек а!., Ргос. ЫаЬ1	ОсЬ 21 . АсасЬ	. Зет.	. ИЗА	2004,	101,

14031-14035

НоЬЬтапп ϋ. ек а1., Сепе, 2003, 311, 171-180

Киезег ек а1., РгасНса1 ЗИерЁотусез бепеИсз, ТЬе ЬоЬп

1ппез ЕоипЬаЫоп, Ыогм1сЬ 2000

Ы И. ек а1. , Αρρί. Εηνίτοη. ΜίοΓοίίοί., 2009, 75, 28692878

ЬиезсЬ Н. ек а1., Ь. Огд. СЬет., 2003, 68, 83-91

МагаЫе1 М.А., Л. РерЬ. 3οί., 2009, 15, 799-807

Ме^уп Л. ек а1. , Мо1еси1аг М1сгоЫо1оду, 1994, 14(3),

533-545

МооЬг Η.ϋ. апЬ МагаЫе1 М. А., Л. ВасЬег1о1., 1997, 179,

6843-6850

- 37 029209

Ми11ег С. еЕ а1. , АпЕФтФсгоЬ. АдепЕз СЬетоЕЬег., 2007, 51,

1028-1037

Мигакат1, Т. еЕ а1., Ь. ВасЕег1о1., 1989, 171, 1459-1466 РезсЬке и. еЕ а1. , Мо1. М1сгоЫо1., 1995, 16, 1137-1156 ЗатЬгоок еЕ а1. , Мо1еси1аг с1оп1пд: А 1аЬогаЕогу тапиа1.

СоШ Зрг1пд НагЬог, ΝΥ: СоШ Зрг1пд НагЬог ЬаЬогаЕогу Ргезз,

2001

Такапо, Е. еЕ а1. , бепе, 1995, 166, 133-137

Тег1а1п В. апЦ ТЬотаз ОГ.-Р., Ви11еЕ1п Це 1а 3οοίέΕίέ СЬетадие Це Егапсе, 1971, 6, 2657-2662

ТЕютаз М. С. еЕ а1. , СЬет. ΒίοΙ. 2002, 9, 171-184.

ИеЬте1ег и. Е:, Сепе, 1995, 165, 149-150 Υίη X. еЕ а1., СЬет. ΒίοΙ. СЬет. 2004, 5, 1274

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Нуклеиновая кислота, включающая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, выбранную из:

(a) нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из открытых рамок считывания (ОКЕ) с 1 по 26 как составляющих ЗЕС) ГО N0: 1, кодирующей белки с ЗЕС) ГО N0: 2-27 или их фрагмент, где указанный фрагмент кодирует функционально активный фрагмент белка с ЗЕС) ГО N0: 2-27, где указанный функционально активный фрагмент направляет синтез (метил)гризелимицина,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из белков с ЗЕС) ГО N0: 2-27 или функционально активный фрагмент указанных по меньшей мере одного из белков с ЗЕС) ГО N0: 2-27, где указанный функционально активный фрагмент направляет синтез (метил)гризелимицина,

(c) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 97% идентичен по аминокислотной последовательности белку с ЗЕС) ГО N0: 2-27 и направляет синтез (метил)гризелимицина, или функционально активному фрагменту указанного белка, где указанный функционально активный фрагмент направляет синтез (метил)гризелимицина,

(ά) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой (а)(с),

(е) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой (а)(ά) и состоит из 10-50 нуклеотидов в длину, или

(ί) нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте (а)-(е).
2. Нуклеиновая кислота по п.1, где указанная нуклеиновая кислота включает по меньшей мере две 0КЕ, предпочтительно по меньшей мере три 0КЕ, кодирующие любой из белков с ЗЕС) ГО N0: 2-27 или их функционально активные фрагменты, как представлено в разделе (а) п. 1.
3. Нуклеиновая кислота по п.1 или 2, где указанная нуклеиновая кислота включает по меньшей мере одну из 0КЕ 18, 19, 20 и 21, кодирующую белки с ЗЕС) ГО N0: 19, 20, 21 и 22 соответственно, или их функционально активные фрагменты, как представлено в разделе (а) п.1.
4. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-3, где указанная нуклеиновая кислота включает по меньшей мере одну из 0КЕ 8, 15 и 16, кодирующую белки с ЗЕС) ГО N0: 9, 16 и 17 соответственно, или их функционально активные фрагменты, как представлено в разделе (а) п. 1.
5. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-4, включающая или состоящая из кластера генов биосинтеза гризелимицина, имеющая последовательность ЗЕС) ГО N0: 1 или имеющая вариант последовательности ЗЕС) ГО N0: 1, несущая фрагмент по меньшей мере одной из 0КЕ с 1 по 26, в результате чего указанный фрагмент кодирует функционально активный вариант или фрагмент белка с ЗЕС) ГО N0: 2-27, где указанный функционально активный фрагмент направляет синтез (метил)гризелимицина.
6. Экспрессионный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-5.
7. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором по п.6.
8. Белок, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕС) ГО N0: 2-27, или ее функционально активный фрагмент, где указанный функционально активный фрагмент направляет синтез (метил)гризелимицина, или кодируемый нуклеиновой кислотой из раздела (Ь) или (с) из п.1.
9. Антитело, специфически направленное против по меньшей мере одного из белков или его функционально активного фрагмента по п.8.
10. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, экспрессионного вектора по п.6, клетки-хозяина по п.7 или белка по п.8, в частности, по меньшей мере одного из белков с ЗЕС) ГО N0: 9, 16 и 17 для получения гризелимицина и/или метилгризелимицина.
11. Применение нуклеиновой кислоты по п.3, экспрессионного вектора по п.6, включающего нук- 38 029209

леиновую кислоту по п.3, клетки-хозяина по п.7, трансформированной указанным экспрессионным вектором, или по меньшей мере одного из белков с δΕΟ ΙΌ NО: 19, 20, 21 и 22, для получения Ь-транс-4метилпролина.
12. Способ получения по меньшей мере одного из белков или его функционально активного фрагмента по п.8, включающий:

a) экспрессию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, и

b) выделение белка или его функционально активного фрагмента.
13. Способ определения варианта ОКР с 1 по 26, как представлено в δΕΟ ΙΌ NО: 1, который кодирует белки с δΕΟ ΙΌ NО: 2-27, или белков с δΕΟ ΙΌ NО: 2-27, которые модулируют продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающий:

a) получение варианта любой из ОКР с 1 по 26,

b) экспрессию варианта в белок,

c) получение гризелимицина и/или метилгризелимицина или их производного с использованием белка по Ь) и

41) определение количества гризелимицина и/или метилгризелимицина,

где повышение количества полученного гризелимицина и/или метилгризелимицина по сравнению с количеством, полученным, если не присутствует белок по Ь), но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что указанный вариант способен повышать продукцию гризелимицина и/или метилгризелимицина, или

42) определение активности производного гризелимицина и/или метилгризелимицина в качестве антибиотика,

где повышение активности в качестве антибиотика по сравнению с активностью в качестве антибиотика, если не присутствует белок по Ь), но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что указанный вариант способен продуцировать производное гризелимицина и/или метилгризелимицина с повышенной активностью в качестве антибиотика,

и где указанное производное отличается по аминокислотному составу от гризелимицина и/или метилгризелимицина и проявляет повышенную активность в качестве антибиотика по сравнению с гризелимицином и/или метилгризелимицином.
14. Способ определения варианта с ОКР 1 по 26, как представлено в δΕΟ ΙΌ NО: 1, который кодирует белки с δΕΟ ΙΌ NО: 2-27, или белков с δΕΟ ΙΌ NО: 2-27, которые повышают продукцию Ь-транс-4метилпролина, включающий:

a) получение варианта любой из ОКР с 1 по 26,

b) экспрессию варианта в белок,

c) получение Ь-транс-4-метилпролина с использованием белка по Ь) и

4) определение количества Ь-транс-4-метилпролина,

где повышение количества Ь-транс-4-метилпролина по сравнению с количеством, полученным, если белок из Ь) не присутствует, но присутствует соответствующая инвариантная форма белка, является указанием на то, что указанный вариант способен повышать продукцию Ь-транс-4-метилпролина.
15. Способ получения гризелимицина и/или метилгризелимицина, включающий:

a) предоставление по меньшей мере одного белка по п.8 или его функционально активного фрагмента или предоставление варианта белка, полученного способом по п.13 или 14, и

b) инкубацию по меньшей мере одного белка из а) с Ό-Ν-метилвалином, Ь-лейцином, Ь-Νметилтреонином, Ь-пролином, Ό-Ν-метиллейцином и глицином с получением гризелимицина и/или метилгризелимицина.
16. Способ получения Ь-транс-4-метилпролина, включающий:

a) предоставление по меньшей мере одного белка по п.8 или его функционально активного фрагмента или предоставление варианта белка, полученного способом по п.14, и

b) инкубацию по меньшей мере одного белка из а) с Ь-лейцином, 5-гидроксилейцином, γсемиальдегидом γ-метилглутаминовой кислоты и/или 3-метил-Д^!-пирролин-5-карбоновой кислотой с получением Ь-транс-4-метилпролина.
17. δίτерΐοтусе8 ΌδΙΟ 22643, содержащий ОКР с 1 по 26 как составляющие δΕΟ ΙΌ NО: 1.

- 39 029209