RU2808831C1 - Новый вариант L-тирозин-экспортирующего белка и способ получения L-тирозина с его использованием - Google Patents
Новый вариант L-тирозин-экспортирующего белка и способ получения L-тирозина с его использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808831C1 RU2808831C1 RU2022131126A RU2022131126A RU2808831C1 RU 2808831 C1 RU2808831 C1 RU 2808831C1 RU 2022131126 A RU2022131126 A RU 2022131126A RU 2022131126 A RU2022131126 A RU 2022131126A RU 2808831 C1 RU2808831 C1 RU 2808831C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- leu
- ala
- gly
- val
- ser
- Prior art date
Links
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims abstract description 244
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 233
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 169
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 159
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 149
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims abstract description 129
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 100
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 86
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 69
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 69
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 49
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 80
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 46
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 25
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 25
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 24
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 24
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 24
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 24
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 18
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 16
- 101150083154 tyrA gene Proteins 0.000 description 16
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- HQPHMEPBNUHPKD-XIRDDKMYSA-N Leu-Cys-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N HQPHMEPBNUHPKD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N (2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 12
- KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N Ala-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N 0.000 description 12
- SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N Ala-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 12
- ZODMADSIQZZBSQ-FXQIFTODSA-N Ala-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZODMADSIQZZBSQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 12
- OMDNCNKNEGFOMM-BQBZGAKWSA-N Ala-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O OMDNCNKNEGFOMM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 12
- DRARURMRLANNLS-GUBZILKMSA-N Ala-Met-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DRARURMRLANNLS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 12
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 12
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 12
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 12
- FEZJJKXNPSEYEV-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FEZJJKXNPSEYEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- JPAWCMXVNZPJLO-IHRRRGAJSA-N Arg-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JPAWCMXVNZPJLO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N Asn-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 12
- LUJQEUOZJUWRRX-BPUTZDHNSA-N Asn-Trp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LUJQEUOZJUWRRX-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 12
- LTDGPJKGJDIBQD-LAEOZQHASA-N Asn-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LTDGPJKGJDIBQD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 12
- ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N Asn-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 12
- XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N Asn-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 12
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N Asp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 12
- FTNVLGCFIJEMQT-CIUDSAMLSA-N Asp-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N FTNVLGCFIJEMQT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- RGXXLQWXBFNXTG-CIUDSAMLSA-N Gln-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RGXXLQWXBFNXTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 12
- DVLZZEPUNFEUBW-AVGNSLFASA-N Glu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N DVLZZEPUNFEUBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 12
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 12
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 12
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 12
- IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N Gly-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N 0.000 description 12
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 12
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 12
- UIQGJYUEQDOODF-KWQFWETISA-N Gly-Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 UIQGJYUEQDOODF-KWQFWETISA-N 0.000 description 12
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 12
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 12
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PROLDOGUBQJNPG-RWMBFGLXSA-N His-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O PROLDOGUBQJNPG-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 12
- WUKLZPHVWAMZQV-UKJIMTQDSA-N Ile-Glu-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N WUKLZPHVWAMZQV-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 12
- DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N Ile-Leu-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N 0.000 description 12
- MLSUZXHSNRBDCI-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MLSUZXHSNRBDCI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 12
- KXUKTDGKLAOCQK-LSJOCFKGSA-N Ile-Val-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O KXUKTDGKLAOCQK-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 12
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 12
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N Leu-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 12
- AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 12
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N Leu-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 12
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 12
- MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 12
- FYPWFNKQVVEELI-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FYPWFNKQVVEELI-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 12
- MVHXGBZUJLWZOH-BJDJZHNGSA-N Leu-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MVHXGBZUJLWZOH-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 12
- SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 12
- HQBOMRTVKVKFMN-WDSOQIARSA-N Leu-Trp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HQBOMRTVKVKFMN-WDSOQIARSA-N 0.000 description 12
- XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- IPTUBUUIFRZMJK-ACRUOGEOSA-N Lys-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IPTUBUUIFRZMJK-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 12
- CAODKDAPYGUMLK-FXQIFTODSA-N Met-Asn-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CAODKDAPYGUMLK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N Met-Leu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- PNHRPOWKRRJATF-IHRRRGAJSA-N Met-Tyr-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PNHRPOWKRRJATF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 12
- HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N Phe-Asn-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 12
- WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 12
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 12
- RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N Ser-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 12
- QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N Ser-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 12
- ZVBCMFDJIMUELU-BZSNNMDCSA-N Ser-Tyr-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZVBCMFDJIMUELU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 12
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 description 12
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 12
- ARKBYVBCEOWRNR-UBHSHLNASA-N Trp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ARKBYVBCEOWRNR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 12
- XQMGDVVKFRLQKH-BBRMVZONSA-N Trp-Val-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 XQMGDVVKFRLQKH-BBRMVZONSA-N 0.000 description 12
- NMOIRIIIUVELLY-WDSOQIARSA-N Trp-Val-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C(C)C)=CNC2=C1 NMOIRIIIUVELLY-WDSOQIARSA-N 0.000 description 12
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- CWSIBTLMMQLPPZ-FXQIFTODSA-N Val-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)N CWSIBTLMMQLPPZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 12
- JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N Val-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N 0.000 description 12
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 12
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 12
- 101150076125 aroG gene Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 12
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 12
- 108010009932 leucyl-alanyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 12
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 12
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 12
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 12
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 12
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 12
- 108010065135 phenylalanyl-phenylalanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 12
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 12
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 12
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 12
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 12
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 12
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 10
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 10
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 9
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 101150023849 pheA gene Proteins 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- 101150010999 aroP gene Proteins 0.000 description 7
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 7
- 101150087955 glf gene Proteins 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 7
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 102220496976 Platelet-activating factor acetylhydrolase 2, cytoplasmic_L79A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 101100002724 Thermus thermophilus aroH gene Proteins 0.000 description 6
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 6
- 241000739044 Herbaspirillum rhizosphaerae Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 5
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220613752 Angiotensin-converting enzyme 2_L79T_mutation Human genes 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 4
- 102220500581 Fermitin family homolog 1_L79I_mutation Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220547630 Protocadherin-10_L79S_mutation Human genes 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 4
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 102220355157 c.235C>A Human genes 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 4
- 102200145357 rs1555341957 Human genes 0.000 description 4
- 102200118210 rs34870172 Human genes 0.000 description 4
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 101150109655 ptsG gene Proteins 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 7-phospho-2-dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC(=O)C(O)=O PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FPWMCUPFBRFMLH-UHFFFAOYSA-N prephenic acid Chemical compound OC1C=CC(CC(=O)C(O)=O)(C(O)=O)C=C1 FPWMCUPFBRFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100159893 Aeromonas salmonicida yggA gene Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100533902 Arabidopsis thaliana SPL13A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100533904 Arabidopsis thaliana SPL13B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100320391 Bacillus subtilis (strain 168) yflK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 101100379641 Escherichia coli (strain K12) argO gene Proteins 0.000 description 1
- 101100454725 Escherichia coli (strain K12) leuE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100319877 Escherichia coli (strain K12) yahN gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000605016 Herbaspirillum Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N Leu-Cys-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DKEZVKFLETVJFY-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DKEZVKFLETVJFY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PPTAQBNUFKTJKA-BJDJZHNGSA-N Leu-Cys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PPTAQBNUFKTJKA-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VFQOCUQGMUXTJR-DCAQKATOSA-N Leu-Cys-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N VFQOCUQGMUXTJR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HUEBCHPSXSQUGN-GARJFASQSA-N Leu-Cys-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N HUEBCHPSXSQUGN-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- PNUCWVAGVNLUMW-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PNUCWVAGVNLUMW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N Leu-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PIHFVNPEAHFNLN-KKUMJFAQSA-N Leu-Cys-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N PIHFVNPEAHFNLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100070556 Oryza sativa subsp. japonica HSFA4D gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043227 Oryza sativa subsp. japonica SPL13 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150001834 PTS gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 101150099282 SPL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 101150094644 rhtC gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 101150051662 yddG gene Proteins 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность, в котором 79-ая аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на аланин или глицин. Также предложены полинуклеотид, кодирующий указанный белок, и микроорганизм для продуцирования L-тирозина, содержащий одно или более из (1)-(3): (1) указанный белок; (2) полинуклеотид, кодирующий его; и (3) вектор, содержащий данный полинуклеотид. Также предложен способ продуцирования L-тирозина с использованием указанного микроорганизма. Изобретение позволяет эффективно продуцировать L-тирозин. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 16 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Настоящая заявка относится к новому варианту белка, обладающему L-тирозин-экспортирующей активностью, к микроорганизму для получения L-тирозина, включающему этот вариант белка, и к способу получения L-тирозина с использованием этого микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
L-тирозин представляет собой аминокислоту и используется в качестве важного вещества для фармацевтического сырья, пищевых добавок, кормов для животных, биологически активных добавок и т.п. Для того, чтобы получить L-тирозин и другие полезные вещества, проводятся различные исследования для разработки микроорганизмов с высокоэффективным продуцированием и технологий для процессов ферментации.
Процесс получения L-тирозина микроорганизмами начинается с 3-дезокси-D-аробино-гептулозонат-7-фосфата (DAHP), получаемого посредством реакции полимеризации фосфоенолпирувата (PEP), который является промежуточным продуктом гликолиза, с эритрозо-4-фосфатом (Е4Р), который является промежуточным продуктом пентозофосфатного пути. Затем DAHP биосинтезируется из хоризмата в префенат посредством обычного ароматического биосинтетического пути и, наконец, превращается в L-тирозин посредством L-тирозин-биосинтетического пути.
При этом экспрессия гена, способного экспортировать определенную аминокислоту, способствует увеличению продуктивности по соответствующей аминокислоте в микроорганизмах. Усиление L-лизин-экспортирующего гена (lysE) в микроорганизме рода Corynebacterium улучшает продуктивность по лизину (US 6858406 В1). Кроме того, усиление гена rhtC в Е. coli улучшает устойчивость к L-треонину и одновременно также улучшают продуктивность по L-гомосерину, L-треонину и L-лейцину (ЕР 1013765 А1). В ЕР 1016710 В1 описано улучшение продуктивности по L-глутаминовой кислоте, L-лизину, L-треонину, L-аланину, L-гистидину, L-пролину, L-аргинину, L-валину и L-изолейцину путем усиления генов yahN, yeaS, yflK и yggA, функции которых в Е. coli еще не идентифицированы.
Описание
Техническая задача
Однако, до сих пор не сообщалось об экспортирующем белке, демонстрирующем специфичность к L-тирозину. Хотя ген yddG Е. coli известен как белок, экспортирующий ароматические аминокислоты, он демонстрирует более высокую специфичность к L-фенилаланину, чем к L-тирозину или L-триптофану (FEME Microbiol Lett 275 (2007) 312-318). Кроме того, ничего не сообщалось о белке, который может экспортировать L-тирозин или ароматическую аминокислоту (J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May; 42(5):787-97) в микроорганизме рода Corynebacterium, который в основном используется в качестве штамма, производящего ферментацию L-аминокислоты.
Решение технической задачи
Одной из задач настоящего изобретения является предложение варианта белка, в котором 79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на аланин или глицин; полинуклеотида, кодирующего такую последовательность; и вектора, содержащего такой полинуклеотид.
Другой задачей настоящего изобретения является предложение микроорганизма для продуцирования L-тирозина, включающего один или более вариантов белка; полинуклеотида, кодирующего их; и вектора, содержащего такой полинуклеотид.
Еще одной задачей настоящего изобретения является предложением способа получения L-тирозина, включающего культивирование микроорганизма.
Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение композиции для получения L-тирозина, включающей один или более вариантов белка; полинуклеотида; вектора; и микроорганизма.
Положительные эффекты
Микроорганизм, экспрессирующий вариант белка по настоящему изобретению, может значительно улучшать продуцирование L-тирозина по сравнению с родительским штаммом, который не экспрессирует такой вариант белка, и, следовательно, может эффективно продуцировать L-тирозин, используя вариант белка.
Подробное описание предпочтительных воплощений
Ниже настоящее изобретение будет описано подробно. При этом каждое описание и раскрытое здесь воплощение могут быть применены к другим описаниям и воплощениям соответственно. То есть, все комбинации различных раскрытых здесь элементов попадают в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, представленным ниже.
Кроме того, специалисты обычной квалификации в данной области способны определить или подтвердить, используя только обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных аспектов описанного здесь изобретения. Кроме того, также предполагается, что эти эквиваленты включены в настоящее описание изобретения.
Кроме того, ряд документов и патентов были упомянуты и процитированы в настоящем описании изобретения. Содержание процитированных документов и патентов включено в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте, и уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения будут описаны более четко.
В одном аспекте настоящей заявки предложен вариант белка, обладающего L-тирозин-экспортирующей активностью, в котором одна или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменены другой аминокислотой.
Вариант белка может быть вариантом белка, обладающим L-тирозин-экспортирующей активностью, в котором 79-ая аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой.
При использовании здесь термин "L-тирозин" относится к одной из 20 α-аминокислот и классифицируется, как полярная аминокислота или ароматическая аминокислота. Тирозин является коммерчески важной аминокислотой, используемой в качестве предшественника фармацевтических средств, флавоноидов, алкалоидов и т.д.
В настоящем описании "белок, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность" может быть белком, обладающим активностью, способной специфически экспортировать L-тирозин из клетки.
Белок, имеющий L-тирозин-экспортирующей активностью, по настоящему изобретению может происходить из белка, обладающего L-тирозин-экспортирующей способностью, полученного из Herbaspirillum rhizosphaerae, но без ограничения им.
В частности, "Herbaspirillum rhizosphaerae" являются грамотрицательной бактерией рода Herbaspirillum. В Корее он может быть выделен из ризосферы в почве, как штамм, выделенный на острове Ульдунг, и т.д.
Хотя белок, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью, происходящий из Herbaspirillum rhizosphaerae, может быть, например, белком, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, очевидно, что любая последовательность, обладающая такой же активностью, что и аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 52, в которой последовательность, соответствующая положению 79 в SEQ ID NO: 52, заменена другой аминокислотой по настоящему изобретению, отличной от последовательности дикого типа, и посредством этого имеющая способность экспортировать L-тирозин, входит в объем настоящего изобретения без ограничения в отношении ее происхождения в качестве целевого белка, имеющего аминокислотную мутацию остатка, соответствующего положению 79. Белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, может быть использован взаимозаменяемо с белком, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, и белком, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52.
Более конкретно, белок, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью по настоящему изобретению может быть вариантом белка, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.
Белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, представляет собой белок, обладающий L-триптофан-экспортирующей активностью, и впервые в настоящем изобретении было установлено, что вариант, в котором аминокислота, соответствующая 79-ому положению, мутирована, обладает L-тирозин-экспортирующей активностью.
В настоящем изобретении белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, представляет собой типичный пример белков, в которые может быть введена мутация, и это не исключает добавление последовательности до или после аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, мутация, которая может произойти естественным образом, или его молчащая мутация, и когда белок обладает активностью, идентичной или соответствующей белку, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, этот белок принадлежит к белкам, в которые может быть введена мутация, по настоящему изобретению.
Например, белок, в который может быть введена мутация по настоящему изобретению, может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 или аминокислотной последовательности, имеющей гомологию с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52, составляющую 80%, 90%, 95%, 97% или более. Кроме того, очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или вставкой в часть последовательности, может также входить в объем белка, являющегося мишенью для мутации по настоящему изобретению при условии, что этот белок имеет аминокислотную последовательность с любой из вышеперечисленных гомологий и идентичностей и демонстрирует эффект, соответствующий вышеуказанному белку.
То есть, в настоящем изобретении, хотя он описан как "белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с конкретным SEQ ID NO" или "белок или полипептид, включающий аминокислотную последовательность с конкретным SEQ ID NO", очевидно, что любой белок, который имеет делецию, модификацию, замену или вставку в часть аминокислотной последовательности, также может быть использован в настоящем изобретении, при условии, что белок имеет такую же или соответствующую активность с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности с соответствующим SEQ ID NO. Например, очевидно, что "белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52" может входить в объем термина "белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52", при условии, что этот белок имеет такую же или соответствующую активность.
При использовании здесь термин "вариант" относится к белку, имеющему одну или более аминокислот, отличных от указанной последовательности консервативными заменами и/или модификациями, такими, что функции и свойства белка сохраняются. Варианты отличаются от указанных последовательностей заменой, делецией или вставкой нескольких аминокислот. Такие варианты, как правило, могут быть идентифицированы путем модификации одной или более приведенных выше аминокислотных последовательностей белка и оценки свойств модифицированного белка. То есть способность вариантов может быть усилена, не изменена или снижена по сравнению с нативным белком. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, у которых одна или более частей, например N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, удалены. Кроме того, некоторые варианты могут включать в себя те, у которых один или более участков удалены с N- и/или С-конца зрелого белка. Термин "вариант" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный белок, модифицированный полипептид, мутант, мутеин, дивергент, вариант и т.д., без ограничений, при условии, что эти термины используют для указания мутации. Для целей настоящей заявки вариант может быть таким, в котором активность белка увеличена по сравнению с нативным белком дикого типа или не модифицированным белком, но не ограничен ими.
При использовании здесь термин "консервативная замена" относится к замене аминокислоты другой аминокислотой, имеющей похожие структурные и/или химические свойства. Вариант может иметь, например, одну или более консервативных замен при сохранении одной или более биологических активностей. Такая аминокислотная замена может, как правило, происходить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка.
Например, среди аминокислот, имеющих электрически заряженную боковую цепь, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; и аминокислоты, имеющие незаряженную боковую цепь, включают глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин.
Кроме того, вариант может также включать делецию или вставку аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце, участвующей в переносе белков котрансляционно или посттрансляционно. Кроме того, полипептид также может быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для идентификации, очистки или синтеза полипептида.
Вариант белка, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью, предложенный в настоящем изобретении, может относиться к варианту, в котором, среди вышеописанных белков, аминокислота в конкретном положении или соответствующим ему заменена другой аминокислотой, и полученная L-тирозин-экспортирующая способность белка превышает 100% по сравнению с такой способностью до мутации.
В настоящем изобретении "замена другой аминокислотой" не ограничена, при условии, что происходит заменена аминокислотой, отличной от аминокислоты до замены. То есть выражение, что лейцин, который является 79-ой аминокислотой от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, заменен "аминокислотой, отличной от лейцина" может быть сформулировано следующим образом "79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой". При этом в настоящем изобретении, когда указано, что "конкретная аминокислота была заменена", очевидно, что эта аминокислота заменена аминокислотой, отличной от аминокислоты до замены, даже если конкретно не указано, что аминокислота была заменена другой аминокислотой.
Вариант белка по настоящему изобретению может быть вариантом, в котором 79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой, без ограничения этим.
Конкретно, вариант белка по настоящему изобретению может быть вариантом, в котором 79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена аланином, глицином, изолейцином, метионином, серином, пролином, треонином, тирозином, аспарагином, аргинином или триптофаном, но без ограничения ими.
Конкретно, вариант белка по настоящему изобретению может быть вариантом, в котором 79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена аланином, глицином, изолейцином, метионином, треонином, тирозином, аспарагином, аргинином или триптофаном, но без ограничения этим. Конкретно, вариант белка по настоящему изобретению может быть вариантом, в котором 79-ая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена аланином, глицином, но без ограничения ими.
Такой вариант белка по настоящему изобретению обладает повышенной L-тирозин-экспортирующей способностью по сравнению с белком до мутации.
Очевидно, что вариант белка, в котором аминокислота в положении 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 по настоящему изобретению заменена другой аминокислотой, может включать варианты белка, в которых аминокислота, соответствующая положению 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой, хотя это положение описано как другое положение, отличное от положения 79, в результате удаления/добавления/вставки на N- или С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 или промежуточной аминокислоты, и т.д.
Кроме того, хотя в настоящей заявке вариант белка, в котором 79-ая аминокислота от N-конца SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой, был описан как белок, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью, вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность, по настоящему изобретению, не ограничен вариантом SEQ ID NO: 52, и очевидно, что варианты, имеющие L-тирозин-экспортирующую активность в результате замены "аминокислоты, соответствующей положению 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52" другой аминокислотой, в любой аминокислотной последовательности, имеющей такую же активность, что и аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 52, или L-тирозин-экспортирующую активность, также попадают в объем вариантов белка по настоящему изобретению.
"Аминокислота, соответствующая положению 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52" в любой аминокислотной последовательности может быть идентифицирована посредством различных способов выравнивания последовательностей, известных в данной области.
Вариант белка, в котором аминокислота в положении 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 по настоящему изобретению заменена другой аминокислотой, может быть белком, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность, составляющую 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более, и в котором аминокислота, соответствующая положению 79 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой.
Вариант белка по настоящему изобретению может включать любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NOS: 77-85. В частности, это может быть последовательность, по существу состоящая из любой аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NOS: 77-85, и более конкретно, она может состоять из любой из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NOS: 77-85. В одном воплощении вариант белка по настоящему изобретению может состоять из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NOS: 77-83, и в другом воплощении вариант белка по настоящему изобретению может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, но не ограничен ими.
Вариант белка по настоящему изобретению может включать любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 85. Вариант белка по настоящему изобретению может включать любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, 2 и SEQ ID NO: 77-83. Вариант белка по настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, но без ограничения ими.
При этом вариант белка по настоящему изобретению может по существу состоять из вышеупомянутой аминокислотной последовательности SEQ ID NO или может состоять из вышеупомянутой аминокислотной последовательности SEQ ID NO, но без ограничения ими.
Кроме того, вариант белка может включать любую аминокислотную последовательность, в которой 79-ая аминокислота в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NOS: 77-85 фиксирована и которая обладает гомологией или идентичностью, составляющей по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, но вариант белка не ограничен этим. Кроме того, очевидно, что любой белок, который имеет аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или вставкой в часть последовательности, отличной от аминокислоты в положениях 79, также может быть включен в объем настоящего изобретения, при условии, что аминокислотная последовательность обладает любой из вышеупомянутых гомологий или идентичностей и демонстрирует эффект, соответствующий указанному выше варианту белка.
При использовании здесь термин "гомология" или "идентичность" относится к степени соответствия между двумя приведенными аминокислотными и нуклеотидными последовательностями и может быть выражен в процентах.
Термины "гомология" и "идентичность" часто могут использоваться взаимозаменяемо друг с другом.
Гомология или идентичность последовательности консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена с помощью стандартных алгоритмов выравнивания и может быть использована со штрафом за пропуск в последовательности, установленным используемой программой. По сути, гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться в умеренных или очень жестких условиях так, что полная длина последовательности или по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% или более от полной длины могут гибридизоваться. Также рассматриваются полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизованных полинуклеотид ах.
Гомология или идентичность полипептидных или полинуклеотидных последовательностей может быть определена посредством, например, алгоритма BLAST согласно литературе (Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)), или FASTA согласно Pearson {Methods Enzymol, 183, 63, 1990). Ha основании алгоритма BLAST была разработана программа, называемая BLASTN или BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, имеют ли какие-либо аминокислотные или полинуклеотидные последовательности гомологию, сходство или идентичность друг с другом, можно идентифицировать путем сравнения последовательностей в эксперименте Саузерн-гибридизации в жестких условиях, как определено, и определение соответствующих условий гибридизации входит в компетенцию специалиста данной области, и они могут быть определены посредством метода, хорошо известного специалистам в данной области (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology).
В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант белка.
При использовании здесь "полинуклеотид", который представляет собой полимер из нуклеотидов, состоящий из нуклеотидных мономеров, соединенных в длинную цепь посредством ковалентной связи, представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую по меньшей мере определенную длину. Более конкретно, это может относиться к фрагменту полинуклеотида, кодирующему вариант белка.
Полинуклеотид, кодирующий вариант белка по настоящему изобретению, может быть включен без ограничения, при условии, что он представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую способность.
В настоящей заявке ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, являющуюся объектом для мутации, может представлять собой ген wex и может быть получен из Herbaspirillum rhizosphaerae, и, в частности, он может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, но не ограничен этим.
Кроме того, полинуклеотид, кодирующий вариант белка по настоящему изобретению, может претерпевать различные модификации в области кодирования в объеме, не меняющем аминокислотную последовательность полипептида, из-за вырожденности кодонов или при рассмотрении предпочтительных в организме кодонов, в которых вариант белка должен быть экспрессирован. В частности, любая полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант белка, в которой 79-ая аминокислота в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на другую аминокислоту, может быть включена без ограничений.
Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может быть вариантом белка по настоящему изобретению, в частности белком, включающим любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NOS: 77-85 или полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющую гомологию или идентичность с ними, но без ограничения этим. Гомология и идентичность являются такими, как описано выше.
Кроме того, полинуклеотид, кодирующий вариант белка, может включать зонд, который может быть получен из известной последовательности генов, например, любой последовательности, кодирующей вариант белка, в которой 79-ая аминокислота в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена другой аминокислотой, при гибридизации с последовательностью, комплементарной всей или части полинуклеотидной последовательности в жестких условиях без ограничения.
"Жесткие условия" относятся к условиям, в которых возможна специфическая гибридизация полинуклеотидов. Такие условия более конкретно описаны в литературе (J. Sambrook et al., выше). Например, жесткие условия могут включать условия, в которых гены, имеющие высокую гомологию или идентичность, составляющую 40% или более, в частности 90% или более, в частности 95% или более, еще более конкретно 97% или более, еще более конкретно 99% или более, гибридизируются друг с другом, и гены, имеющие гомологию или идентичность ниже, чем вышеприведенная гомология или идентичность, не гибридизируются друг с другом, или условиях промывки Саузерн-гибридизации, то есть, при однократной промывке, особенно, при двукратной или трехкратной промывке при концентрации соли и температуре, соответствующей 60°С, 1×SSC (цитрат и хлорид натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), особенно 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS. Однако условия не ограничены этими и могут быть соответствующим образом скорректированы специалистами в данной области в зависимости от цели.
Для гибридизации требуется, чтобы два полинуклеотида содержали комплементарные последовательности, хотя возможны несоответствия между основаниями в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимоотношения между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК, аденин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее изобретение может включать выделенные полинуклеотидные фрагменты, комплементарные всей последовательности, а также полинуклеотидные последовательности в значительной степени похожие на нее.
Как правило, полинуклеотиды, обладающие гомологией, могут быть обнаружены с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С в вышеуказанных условиях. Кроме того, значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничено ими, и может быть соответствующим образом скорректировано специалистами в данной области в зависимости от цели.
Соответствующая жесткость гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и эти переменные хорошо известны в данной области (например, Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариант белка.
При использовании здесь термин "вектор" относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, функционально связанной с подходящей последовательностью регуляции экспрессии так, чтобы обеспечить возможность экспрессии целевого белка в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность экспрессии может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания с рибосомой на мРНК, и последовательность для регулирования прекращения транскрипции и трансляции. При трансформации в подходящую клетку-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может интегрировать в его геном.
Вектор, используемый в настоящей заявке, конкретно не ограничен, и может быть использован любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемого вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХП, ASHII, АРП, t10, t11, Charon4A и Charon21A, и т.д.; а в качестве плазмидного вектора могут использоваться векторы, основанные на pBR, pUC, pBluescriptll, pGEM, pTZ, pCL и pET, и т.д. В частности, может быть использован вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 или pCClBAC.
В одном примере полинуклеотид, кодирующий целевой белок в хромосоме, может быть заменен модифицированным полинуклеотидом при помощи вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена любым методом, известным в данной области, например посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения ей. Вектор может дополнительно включать маркер селекции для подтверждения вставки в хромосому. Маркер селекции предназначен для селекции клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения того, что молекула целевой нуклеиновой кислоты была введена, и для этого могут быть использованы маркеры, которые обеспечивают селектируемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофия, устойчивость к клеточным токсическим агентам или экспрессия поверхностных белков. Только клетки, экспрессирующие маркер селекции, способны выживать или демонстрировать разные фенотипы в окружающей среде, обработанной селективным агентом, и, таким образом, трансформированные клетки могут быть отобраны.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм для продуцирования L-тирозина, включающий один или более вариантов белка; полинуклеотид, кодирующий их; вектор, содержащий полинуклеотид.
Микроорганизм для продуцирования L-тирозина может быть микроорганизмом, имеющим повышенную L-тирозин-продуцирующую способность, включающим один или более вариантов белка; полинуклеотид, кодирующий их; и вектор, содержащий полинуклеотид, по сравнению с микроорганизмом, включающим SEQ ID NO: 52 дикого типа.
Микроорганизм, включающий один или более вариантов белка; полинуклеотид, кодирующий их; и вектор, содержащий полинуклеотид, может быть микроорганизмом, которому придана L-тирозин-продуцирующая способность, но не ограничен им.
При использовании здесь термин "микроорганизм для продуцирования L-тирозина" или "микроорганизм, имеющий L-тирозин-продуцирующую способность" может быть микроорганизмом, имеющим природную способность производить тирозин, или микроорганизмом, в котором тирозин-продуцирующая способность придана родительскому штамму, который не способен продуцировать тирозин.
Микроорганизм может быть микроорганизмом, который может производить L-тирозин из источников углерода в среде в избыточном количестве по сравнению с микроорганизмом дикого типа или не модифицированным микроорганизмом. Кроме того, микроорганизм для продуцирования L-тирозина может быть рекомбинантным микроорганизмом. В частности, микроорганизм может быть микроорганизмом рода Enterobacter, микроорганизмом рода Escherichia, микроорганизмом рода Erwinia, микроорганизмом рода Serratia, микроорганизмом рода Providencia, микроорганизмом рода Corynebacterium или микроорганизмом рода Brevibacterium, но тип микроорганизма конкретно не ограничен при условии, что микроорганизм продуцирует L-тирозин. Более конкретно, микроорганизм может быть микроорганизмом рода С oryneb acterium или микроорганизмом рода Escherichia. Более конкретно, микроорганизм может быть микроорганизмом рода Corynebacterium, например Corynebacterium glutamicum, но не ограничен ими.
Еще более конкретно, микроорганизм рода Escherichia может быть микроорганизмом Escherichia coli, а микроорганизм рода Corynebacterium может быть микроорганизмом Corynebacterium glutamicum, но любой микроорганизм рода Escherichia или рода Corynebacterium, в который белок введен, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью, или активность которого повышена и, таким образом, количество полученного L-тирозина может быть увеличено, может быть включен без ограничения.
Микроорганизм, который может продуцировать L-тирозин путем включения варианта белка по настоящему изобретению; полинуклеотид, кодирующий его; вектор, содержащий такой полинуклеотид, может быть микроорганизмом, экспрессирующим вариант белка по настоящему изобретению.
При использовании здесь термин "экспрессированный/экспрессируемый" белок относится к состоянию, в котором целевой белок введен в микроорганизм или целевой белок модифицирован для экспрессии в микроорганизме. Когда целевой белок представляет собой белок, присутствующий в микроорганизме, этот термин относится к состоянию, в котором активность белка увеличена по сравнению с активностью его эндогенного белка или активностью до его модификации.
Микроорганизм, экспрессирующий вариант белка по настоящему изобретению, может быть микроорганизмом, который был модифицирован для экспрессии варианта белка, и соответственно, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения микроорганизма, экспрессирующего вариант белка по настоящему изобретению.
Для целей настоящего изобретения, "целевой белок" может быть вариантом белка, имеющим L-тирозин-экспортирующую активность, описанную выше.
В частности, термин "введение белка" означает, что микроорганизм демонстрирует активность конкретного белка, которым этот микроорганизм изначально не обладал, или микроорганизм демонстрирует повышенную активность по сравнению с его эндогенной активностью или активностью белка до модификации. Например, это может означать, что полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, введен в хромосому микроорганизма; или вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, введен в микроорганизм, и это позволяет проявлять активность конкретного белка. Кроме того, термин "повышение активности" означает, что активность конкретного белка, которым обладает микроорганизм, повышена по сравнению с его эндогенной активностью или активностью до модификации. Термин "эндогенная активность" относится к активности конкретного белка, которым исходно обладал родительский штамм до модификации, в случае, когда характеристика микроорганизма изменена в результате генетической мутации, вызванный природным или искусственным фактором.
В частности, повышение активности по настоящему изобретению может быть достигнуто одним или более методами, выбранными из группы, состоящей из: метода увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего вариант белка; метода введения мутации в последовательность, контролирующую экспрессию гена, кодирующего вариант белка; метода замены последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего вариант белка, имеющего L-тирозин-экспортирующую активность, последовательностью, имеющей сильную активность; метода замены гена, кодирующего нативный белок, обладающий L-тирозин-экспортирующей активностью, в хромосоме геном, кодирующим вариант белка; метода дополнительного введения мутации в ген, кодирующий белок так, чтобы активность варианта белка повышалась; и метода введения варианта белка в микроорганизм, но метод увеличения активности не ограничен этим.
В вышеуказанном методе увеличение числа копий гена может быть выполнено в форме, когда ген функционально связан с вектором, или посредством вставки гена в хромосому клетки-хозяина, но метод конкретно не ограничен этим. В частности, число копий гена может быть увеличено посредством введения вектора в клетку-хозяина, где вектор, с которым полинуклеотид, кодирующий белок по настоящему изобретению, функционально связан и который может реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина, введен в клетку-хозяина. Альтернативно, число копий гена может быть увеличено путем введения в хромосому клетки-хозяина вектора, с которым функционально связан полинуклеотид и который может ввести полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина. Введение полинуклеотида в хромосому может быть способом, известным в данной области, например посредством гомологичной рекомбинации.
Затем модификацию последовательности контролирования экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида можно осуществить путем индукции мутации в последовательности нуклеиновой кислоты посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации так, чтобы еще больше усилить активность последовательности контролирования экспрессии; или посредством замены последовательности контролирования экспрессии последовательностью нуклеиновой кислоты с более сильной активностью, но способ модификации последовательности контролирования экспрессии конкретно не ограничен этим. Последовательность контролирования экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательности, контролирующие окончание транскрипции и трансляции, и т.д., но последовательность контролирования экспрессии конкретно не ограничена этим.
Сильный промотор может быть связан с расположенной выше единицей экспрессии полинуклеотида вместо исходного промотора, но без ограничения этим. Примеры сильного промотора, известного в данной области, могут включать промоторы cj1 - cj7 (патент KR 10-0620092), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор фага лямбда PR, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (патент KR 10-1783170), промотор O2 (патент KR 10-1632642), промотор tkt, промотор усс А, и т.д., но сильный промотор не ограничен этим.
Кроме того, модификация последовательности полинуклеотида в хромосоме может быть выполнена путем индукции мутации в последовательности контролирования экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, чтобы еще больше повысить активность полинуклеотидной последовательности; или посредством замены полинуклеотидной последовательности последовательностью полинуклеотида, улучшенной так, чтобы иметь более сильную активность, но способ модификации полинуклеотидной последовательности конкретно не ограничен этим.
Введение и усиление активности белка, как описано выше, может, в общем случае, увеличить активность или концентрацию соответствующего белка по меньшей мере на 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500%, и в лучшем случае на 1000% или 2000%, на основе активности или концентрации белка в штамме микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма, но диапазон увеличения не ограничен этим.
При использовании здесь термин "немодифицированный штамм" не исключает штамм, содержащий мутацию, которая может произойти естественным образом в микроорганизме, и может относиться к самому штамму природного типа или к штамму до изменения его характеристики в результате генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами. "Немодифицированный штамм" может использоваться взаимозаменяемо с терминами "немутантный штамм", "штамм до модификации", "микроорганизм до модификации", "немутантный микроорганизм", "немодифицированный микроорганизм" или "микроорганизм для сравнения". В одном воплощении немодифицированный микроорганизм может быть штаммом, который не включает вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность по настоящему изобретению.
Микроорганизм по настоящему изобретению может быть природным микроорганизмом самим по себе, имеющим тирозин-продуцирующую способность, микроорганизмом, в котором активность гена, вовлеченного в механизм продуцирования тирозина, увеличена или инактивирована так, чтобы иметь улучшенную тирозин-продуцирующую способность, или микроорганизмом, в котором активность чужеродного гена внесена или повышена так, чтобы иметь улучшенную тирозин-продуцирующую способность.
Для того чтобы придать L-тирозин-продуцирующую способность микроорганизму по настоящему изобретению или увеличить продуцирующую способность, можно использовать модификацию для непрерывного снабжения предшественниками (например эритрозо-4-фосфатом; Е4Р) и эффективное использование энергии, метод увеличения биосинтеза L-тирозина посредством блокирования разветвленных путей в пути биосинтеза L-тирозина или модификацию использования меньшего количества АТФ и т.д.
В частности, в настоящем изобретении родительский штамм L-тирозин-продуцирующего микроорганизма, который модифицирован таким образом, что вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность, может быть экспрессирован, конкретно не ограничен, при условии, что он является L-тирозин-продуцирующим микроорганизмом. L-тирозин-продуцирующий микроорганизм может быть микроорганизмом, в котором активность гена конкурентного пути, регулятор направленного пути оперона L-тирозина, ген импорта L-тирозина или ген импорта и разложения L-тирозина ослаблен или инактивирован так, чтобы усилить путь биосинтеза L-тирозина; и/или может быть микроорганизмом, в котором регулируется активность оперона L-тирозина.
Например, для модификации микроорганизма активность белка, импортирующего ароматические аминокислоты, может быть ослаблена или удалена по сравнению с его эндогенной активностью (например ослабление/удаление активности aroP), и обратная связь может быть выключена в результате введения мутации в ген, кодирующий белок, вовлеченный в регуляцию обратной связи (например tyrA, aroG). Кроме того, экспрессия гена, кодирующего белок, вовлеченный в снабжение предшественниками (например гена tkt) может быть повышена. Кроме того, активность гена (например pheA) в конкурентном пути может быть ослаблена, ликвидирована или изменена (например изменение в зависимости от концентрации L-триптофана) по сравнению с эндогенной активностью, но без ограничения этим.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования L-тирозина, включающий: культивирование в среде микроорганизма, экспрессирующего вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность по настоящему изобретению.
Вариант белка, экспрессия белка и микроорганизм являются такими, как описано выше.
При использовании здесь термин "культивирование" означает, что микроорганизм выращивается при соответствующих контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть осуществлен в подходящей культуральной среде и в условиях культивирования, известных в данной области. Такой процесс культивирования может быть легко скорректирован для использования специалистами в данной области в соответствии с выбранным штаммом. В частности, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и культивирование с подпиткой, но не ограничено этим.
При использовании здесь термин "среда" относится к смеси веществ, содержащей питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма, в качестве основного ингредиента, и она поставляет питательные вещества и факторы роста, наряду с водой, которая необходима для выживания и роста. В частности, среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, может быть любой средой, используемой для обычного культивирования микроорганизмов без какого-либо конкретного ограничения. Однако микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в аэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамины, при регулировании температуры, рН и т.д.
В настоящей заявке источник углерода может включать углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и т.д.; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит и т.д.; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота, лимонная кислота и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, лизин и т.д. Кроме того, источник углерода может включать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, патока, сырая меласса, рисовые отруби, маниок, тростниково-сахарная меласса и кукурузный экстракт, и т.д. В частности, могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза и стерилизованная предварительно обработанная патока (то есть меласса, превращенная в восстанавливающий сахар) и, кроме того, различные другие источники углерода в соответствующем количестве могут использоваться без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации двух или более видов, но они не ограничены этим.
Источник азота может включать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и т.д.; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, экстракт солода, кукурузный экстракт, казеиновый гидролизат, рыба или продукт его разложения, обезжиренный соевый жмых или продукт его разложения, и т.д. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации двух или более видов, но они не ограничены этим.
Источник фосфора может включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие натрий-содержащие соли и т.д. Примеры неорганического соединения могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и т.д. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. Эти составляющие ингредиенты или предшественники могут быть добавлены в среду порционно или непрерывным способом, но источники фосфора не ограничены ими.
В настоящей заявке значение рН среды может быть скорректировано во время культивирования микроорганизма путем добавления к среде подходящим образом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота, и т.д. Кроме того, при культивировании можно добавить пеногаситель, такой как сложный полигликоле вый эфир жирных кислот, чтобы предупредить пенообразование. Кроме того, кислород или кислородсодержащий газ может быть введен в среду, чтобы поддерживать аэробное состояние среды; или газообразный азот, водород или диоксида углерода может быть введен или никакой газ может быть не введен для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния среды, но газ не ограничен вышеперечисленным.
Средняя температура может быть в диапазоне от 20°С до 50°С, и, в частности, от 30°С до 37°С, но не ограничена этим. Культивирование может быть продолжено до получения необходимого количества полезных веществ, и, в частности, период культивирования может составлять от 10 часов до 100 часов, но не ограничен этим.
Способ продуцирования, кроме того, может включать выделение L-тирозина из среды или микроорганизма в зависимости от культивирования.
При выделении L-тирозина, требуемый L-тирозин может быть собран с использованием способа культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например с использованием подходящего метода, известного в данной области, в соответствии с методом периодического культивирования, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, могут быть использованы такие методы как центрифугирование, фильтрация, обработка с помощью осадителя для кристаллизации белка (метод высаливания), экстракция, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрация, диализ, различные виды хроматографии, такие как ситовая хроматография (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.д., ВЭЖХ или их комбинация, но методы не ограничены этим.
Способ продуцирования может включать процесс дополнительной очистки, который может быть выполнен с использованием подходящего метода, известного в данной области, и выделенный L-тирозин может быть очищен.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для получения L-тирозина, включающий один или более вариантов белка; полинуклеотид, кодирующий их; вектор, содержащий полинуклеотид; и микроорганизм, экспрессирующий вариант белка.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение одного или более вариантов белка; полинуклеотида, кодирующего их; вектора, содержащего полинуклеотид; и микроорганизма, экспрессирующий вариант белка в продуцировании L-тирозина.
Вариант белка, кодирующий его полинуклеотид, содержащий его вектор и микроорганизм являются такими, как описано выше.
Композиция по настоящему изобретению может включать дополнительный компонент, который может продуцировать L-тирозин с использованием варианта белка, полинуклеотид, кодирующий его; вектор, содержащий полинуклеотид; и микроорганизм, экспрессирующий вариант белка, без ограничения. Например, она может дополнительно включать любые подходящие эксципиенты или компоненты среды, обычно используемые в композициях для микробной ферментации, но без ограничения этим.
В настоящем описании, если контекст не требует иного, выражения "включать", "включающий", "содержащий" и т.д. означает включение указанного целого числа или группы целых чисел, но следует понимать, что другие целые числа или совокупности целых чисел не исключены.
Способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение описано более подробно посредством Примеров и Экспериментальных примеров. Однако эти Примеры и Экспериментальные примеры представлены только для иллюстративных целей и не предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен этими Примерами и Экспериментальными примерами.
Сравнительный пример 1: Конструирование L-тирозин-продуцирующего штамма
Хотя Corynebacterium glutamicum дикого типа способен продуцировать L-тирозин, он не производит L-тирозин в избытке для выделения в культуральную среду. В соответствии с целью настоящего изобретения, чтобы идентифицировать генетическую характеристику, которая увеличивает L-тирозин-продуцирующую способность, использовали штамм с повышенной L-тирозин-продуцирующей способностью, а не штамм дикого типа. Следовательно, L-тирозин-продуцирующий штамм был сконструирован посредством усиления генов, необходимых для получения L-тирозина, на основе штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.
Во-первых, для усиления снабжения эритрозо-4-фосфатом (Е4Р) в качестве предшественника L-тирозина, гены tkt были сверхэкспрессированы. В то же время, был удален aroP, ген импортера ароматических аминокислот, который вводит L-тирозин в клетки.
Для генетической манипуляции сначала были получены области, расположенные ниже и выше гена aroP, в которые следовало вводить ген tkt посредством замены. В частности, фрагмент гена в нижерасположенной области гена агоР был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, a фрагмент гена в вышерасположенной области гена aroP был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 60°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Кроме того, для получения гена tkt, включающего промотор tkt, был получен фрагмент гена tkt, включающий промотор tkt, с использованием праймеров SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 60°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 150 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированные вышерасположенные и нижерасположенные области промотора aroP, фрагмент гена tkt, включающий промотор tkt и вектор pDZ (патент KR 10-0924065) для хромосомной трансформации, расщепленные рестриктазой Smal, клонировали с использованием метода сборки Гибсона (DG Gibson et al., NATURE METHODS, Vol.6 No. 5, May 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-AaroP::Pn-tkt. Клонирование проводили путем смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые для построения каждого из векторов, показаны в таблице 1 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔaroP::Pn-tkt трансформировали в штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 посредством электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в который введен ген tkt, включающий промотор tkt, при одновременной делеции гена aroP. Соответствующая генетическая манипуляция была подтверждена посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной и нижерасположенной области гомологичной рекомбинации, в которую был введен соответствующий ген, и полученный штамм был назван СМ06-0001.
Для того, чтобы усилить путь L-тирозина, ген tyrA, который получает регуляцию по типу обратной связи L-тирозином, имеющуюся у Corynebacterium glutamicum, был заменен вариантом tyrA, который не получает регуляцию по типу обратной связи, происходящим из Е. coli, включающим сильный промотор gapA. Известно, что в происходящем из Е. coli белке tyrA обратная связь выключена, когда метионин в положении 53 мутирован в изолейцин и аланин в положении 354 мутирован в валин, и использовали данную форму белка (SEQ ID NO: 11) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).
Для генетической манипуляции сначала были получены вышерасположенные и нижерасположенные области гена tyrA, в которые ген tyrA следовало вводить посредством замены. В частности, фрагмент гена в вышерасположенной области гена tyrA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, a фрагмент гена в нижерасположенной области гена tyrA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы и ПЦР осуществляли в условиях амплификации, включающих денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Кроме того, для получения происходящего из Е. coli варианта гена tyrA, включающего промотор gapA, был получен фрагмент промотора gapA с использованием праймеров SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР, а фрагмент варианта гена tyrA, происходящего из E.coli, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 на основе происходящей из E.coli синтетической ДНК варианта tyrA в качестве матрицы, посредством ПЦР.
Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали, как полимеразу, и ПЦР выполняли в условиях амплификации, включающих денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амлифицированные вышерасположенные и нижерасположенные области гена tyrA, происходящий из Е. coli фрагмент варианта гена tyrA, включающего промотор gapA, и вектор pDZ для хромосомной трансформации, расщепленные с использованием рестриктазы SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm. Клонирование выполняли путем смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые для конструирования каждого из векторов, показаны в Таблице 3 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm трансформировали в штамм СМ06-0001 посредством электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в который был введен происходящий из Е. coli вариант гена tyrA, включающий промотор gapA, при одновременном удалении гена tyrA. Соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной области и нижерасположенной области гомологичной рекомбинации, куда был введен соответствующий ген, и полученный штамм был назван СМ06-0002.
Для увеличения продуцирования L-тирозина, ген aroG, вовлеченный в первую стадию общего ароматического биосинтетического пути, был усилен посредством добавления сильного промотора к происходящему из Е. coli варианту aroG с выключенной регуляцией по типу обратной связи. Известно, что в происходящем из Е. coli белке aroG обратная связь выключена, когда пролин в положении 150 заменен на лейцин, и используют данную форму белка (SEQ ID NO: 68) (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)).
Для генетической манипуляции были получены нижерасположенные и вышерасположенные области, в которые следовало вводить ген aroG. В частности, фрагмент гена в вышерасположенной области гена BBD29_14470 был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, и фрагмент гена в нижерасположенной области гена BBD29_14470 был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали, как полимеразу и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, и с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированные вышерасположенные и нижерасположенные области, в которые следовало дополнительно вводить вариант aroG, и вектор pDZ для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазой Smal, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔBBD29_14470. Клонирование выполняли посредством смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Кроме того, для получения происходящего из Е. coli варианта гена aroG, включающего промотор gapA, фрагмент промотора gapA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР, а происходящий из Е. coli фрагмент варианта гена aroG был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 на основе происходящего из Е. coli синтетического варианта ДНК с выключенной регуляцией по типу обратной связи aroG, в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, и последующей полимеризации при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированный фрагмент варианта гена aroG, включающий промотор gap А, и вектор pDZ-ΔBBD29_14470 для хромосомной трансформации, расщепленные рестриктазой SeaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ABBD29_14470::PgapA-aroGm. Клонирование выполняли посредством смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые для конструирования каждого из векторов показаны в Таблице 5 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm трансформировали в штамм СМ06-0002 посредством электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в который был введен происходящий из Е. coli вариант гена aroG с выключенной регуляцией по типу обратной связи, включающий промотор gapA. Соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, которые могут соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенного района и нижерасположенного участка гомологичной рекомбинации, в которую вводили соответствующий ген, и полученный штамм был назван СМ06-0003.
Можно предвидеть, что при усилении общего пути ароматического продуцирования в большей степени увеличится продуцирование L-тирозина и L-триптофана, при этом продуцирование L-фенилаланина минимизируется в конкурентном пути в увеличенном хоризматном пуле. Однако, если делетировать ген pheA в конкурентном пути, продуцирование L-фенилаланина становится невозможным, и L-фенилаланин необходим, и, таким образом, использовали L-триптофановый механизм регулирования, чтобы не влиять на рост клеток при сохранении низкой концентрации.
Можно предвидеть, что концентрация L-триптофана строго регулируется таким образом, что она не препятствует росту клеток при условии, что L-триптофан имеет низкую концентрации во все время культивирования. Из литературы также известно, что продуцирование L-триптофана одновременно регулируется аттенюаторами и промоторами в соответствии с концентрацией L-триптофана (Appl. Environ Microbiol 59 791, 1993).
Таким образом, ген pheA, отвечающий за продуцирование L-фенилаланина, подвергался воздействию L-триптофанового регуляторного механизма, так что ген pheA мог регулироваться в соответствии с концентрацией L-триптофана.
Для того, чтобы позволить гену pheA регулироваться промотором гена trpE, были получены вышестоящая область, в которую ген следовало вводить, область промотора trpE, и нижестоящая область, в которую ген следовало вводить. В частности, фрагмент гена в вышерасположенной области, в которую следовало вводить ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34; фрагмент гена в области промотора trpE был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36; и фрагмент гена в нижерасположенной области, в которую следовало вводить ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированные вышестоящая и нижестоящая области, в которые следовало вводить ген, область промотора trpE и вектор pDZ для хромосомной трансформации, расщепленные рестриктазой Smal, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔPpheA::PtrpE. Клонирование выполняли путем смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Сконструированный вектор pDZ-ΔPpheA::PtrpE трансформировали в штамм СМ06-0003 посредством электропорации, затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в котором ген pheA мог регулироваться промотором trpE. Соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной и нижерасположенной областей гомологичной рекомбинации, куда введен соответствующий ген, и полученный штамм, в который был введен промотор trpE выше pheA, был назван СМ06-0005.
Последовательности праймеров, используемых для конструирования каждого из векторов, показаны в Таблице 7 ниже.
Поскольку производство L-тирозина начинается с PEP и Е4Р в качестве предшественников, использование нефосфотрансферазной системы (PTS) может увеличить поставку PEP, и, таким образом, можно ожидать повышенного продуцирования L-тирозина (Nature biotechnol 14 620, 1996). Таким образом, ptsG, PTS ген штамма, был удален, и был введен происходящий из Zymomonas mobilis АТСС 10988 ген glf, He-PTS ген.
Для того, чтобы удалить ptsG и ввести glf, были получены вышестоящие и нижестоящие области, в которые следовало вводить происходящий из Zymomonas mobilis ген glf. В частности, фрагмент гена в вышерасположенной области гена ptsG был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42, а фрагмент гена в нижерасположенной области гена ptsG был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Кроме того, для получения гена glf включающего хорошо известный промотор cj7 (SEQ ID NO: 45, корейский патент №10-0620092), был получен фрагмент промотора cj7 с использованием праймеров SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47 на основе синтетической ДНК промотора cj7 в качестве матрицы, посредством ПЦР, и был получен фрагмент гена glf с использованием праймеров SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 на основе хромосомной ДНК Zymomonas mobilis АТСС10988 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли в условиях ПЦР-амплификации, представляющих собой денатурацию при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированные вышерасположенные и нижерасположенные области гена ptsG, фрагмент гена glf, включающий промотор cj7, и вектор pDZ для хромосомной трансформации, расщепленные рестриктазой Seal, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔptsG::pcj7-glf. Клонирование выполняли посредством смешивания реагента сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в расчетном количестве молей с последующим инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые в сравнительном примере, показаны в Таблице 8 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔptsG::pcj7-glf трансформировали в штамм СМ06-0005 посредством электропорации, затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в который был введен происходящий из Zymomonas mobilis ген glf, включающий промотор cj7. Соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной и нижерасположенной областей района гомологичной рекомбинации, куда введен соответствующий ген, и полученный штамм был назван СМ06-0010.
Сравнительный пример 2: Оценка продуцирующей способности L-тирозин-продуцирующих штаммов
Для подтверждения L-тирозин-продуцирующей способности штаммов, сконструированных в Примере 1, штаммы культивировали и оценивали следующим образом. Каждый из штаммов инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл соответствующей посевной среды, и культивировали с покачиванием при 200 об/мин. при 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора посевной среды инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл соответствующей среды для продуцирования и культивировали с покачиванием при 200 об/мин. при 30°С в течение 24 часов. После культивирования количество произведенного L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана измеряли с помощью ВЭЖХ.
Посевная среда (рН 7,0)
20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
30 г глюкозы, 15 г (NH4)2SO4, 1,2 г MgSO4⋅7H2O, 1 г KH2PO4, 5 г дрожжевого экстракта, 900 мкг биотина, 4,500 мкг тиамина HCl, 4,500 мкг пантотената кальция, и 30 г СаСО3 (на литр дистиллированной воды).
Результаты по производству L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС 13869, СМ06-0001, СМ06-0002, СМ06-0003, СМ06-0005 и СМ06-0010 показаны в Таблице 10.
L-тирозин не продуцировался в СМ06-0001, который представляет собой штамм, усиливающий подачу Е4Р, предшественника, полученный в результате удаления гена импорта ароматических аминокислот из штамма дикого типа, и L-тирозин также не был обнаружен в СМ06-0002, в котором ингибирование регуляции tyrA по типу обратной связи было также выключено у СМ06-0001.
Продуцирование L-тирозина и L-фенилаланина было подтверждено в штамме СМ06-0003, в котором был усилен путь производства обычных ароматических соединений посредством выключения ингибирования по типу обратной связью aroG в штамме СМ06-0002. Продуцирование L-тирозина и L-фенилаланина было значительно повышенным по сравнению с предыдущими штаммами, но продуцирование L-триптофана не показало существенного изменения. Кроме того, в случае штамма СМ06-0005, в котором L-фенилаланиновый путь регулировался концентрацией L-триптофана, L-тирозин продуцировался с выходом 5,37%. Продуцирование L-тирозина штаммом СМ06-0005 было улучшено на 283% по сравнению с родительским штаммом СМ06-0003. Из приведенных выше результатов можно сделать вывод, что, когда pheA регулировался концентрацией L-триптофана, продуцирование L-тирозина значительно возрастало.
Кроме того, как и ожидалось, было подтверждено, что продуцирование L-тирозина увеличивалось в СМ06-0010, не-PTS штамме, который может облегчить поставку PEP, по сравнению с СМ06-0005, PTS штаммом. Штамм СМ06-0010 продуцировал L-тирозин с улучшенным выходом 7,06%.
Пример 1: Конструирование штамма с L-триптофан-экспортирующим белком L-тирозин-продуцирующего штамма
Тирозин-экспортирующая способность была подтверждена путем введения нового L-триптофан-экспортирующего белка (WO 2019164348 А1) в L-тирозин-продуцирующий штамм СМ06-0010, полученный в сравнительном примере 1.
Новый L-триптофан-экспортирующий белок представляет собой мембранный белок, происходящий из Herbaspirillum rhizosphaerae и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 52. Вектором для трансформации, используемым в международном патентной публикации WO 2019164348 А1, был pDZTn-PgapA-Hrh и такой же вектор трансформировали в L-тирозин-продуцирующий штамм СМ06-0010 посредством электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545) и затем подвергали вторичному кроссинговеру с получением штамма, в котором одна копия PgapA-Hrh была введена между геном транспозона на хромосоме. Белок, экспрессирующий ген PgapA-Hrh, был назван Wex, и соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной и нижерасположенной области гомологичной рекомбинации, куда введен соответствующий ген.
Таким образом полученный штамм был назван Corynebacterium glutamicum СМ06-0111.
Пример 2: Оценка продуцирующей способности L-тирозин-продуцирующего штамма с введенным L-триптофан-экспортирующим белком Wex
Для подтверждения L-тирозин-продуцирующей способности штамма, полученного в Примере 1, штамм культивировали с использованием метода и состава среды, описанных в сравнительном примере 2.
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах L-тирозин-продуцирующих штаммов СМ06-0010 and СМ06-0111 представлены в вышеприведенной Таблице 12.
Штамм с введенным мембранным белком Wex, который представляет собой экспортер L-триптофана, не продемонстрировал L-тирозин-экспортирующей способности и было невозможно подтвердить, произошло ли увеличение из-за небольшого количества L-триптофана. Соответственно, была предпринята попытка придать субстратную специфичность в отношении L-тирозина посредством введения мутации в мембранный белок Wex.
Пример 3: Замена лейцина, 79-ой аминокислоты, другими аминокислотами в последовательности Wex L-тирозин-продуцирующего штамма
Чтобы обеспечить субстратную специфичность мембранного белка Wex в отношении L-тирозина, лейцин, который представляет собой 79-ую аминокислоту (ниже называемый 79-ый лейцин или 79-ый), был заменен другими аминокислотами, чтобы найти мутанты, которые экспортируют L-тирозин. Чтобы создать мутации аминокислот, отличных от лейцина, выполняли сайт-направленный мутагенез с использованием pDZTn-PgapA-Hrh, используемого в Примере 1 в качестве матрицы. Сайт-направленный мутагенез выполняли следующим образом.
Для того, чтобы заменить лейцин, 79-ую аминокислоту в аминокислотной последовательности Wex, другими аминокислотами, например аланином (A) (SEQ ID NO: 1), глицином (G) (SEQ ID NO: 2), изолейцином (I) (SEQ ID NO: 77), метионином (M) (SEQ ID NO: 78), треонином (T) (SEQ ID NO: 79)), тирозином (Y) (SEQ ID NO: 80), аспарагином (N) (SEQ ID NO: 81), аргинином (R) (SEQ ID NO: 82), триптофаном (W) (SEQ ID NO: 83), серином (S) (SEQ ID NO: 84)) и пролином (P) (SEQ ID NO: 85), готовили смесь для ПЦР, как показано в Таблице 14, с использованием каждой совокупности мутагенных праймеров, указанной в Таблице 15, и ПЦР выполняли с циклом, показанным в Таблице 15. После завершения ПЦР, добавляли 1 мкл рестриктазы DpnI и затем обрабатывали при 37°С в течение 1 часа. Затем 3 мкл ДНК, обработанной DpnI, трансформировали в компетентные клетки DH5a с получением мутантных плазмид pDZTn-PgapA-wex, и каждая мутация была подтверждена посредством секвенирования, как показано в Таблице 15.
Каждый из векторов pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79I, pDZTn-PgapA-wex L79G, pDZTn-PgapA-wex L79M, pDZTn-PgapA-wex L79S, pDZTn-PgapA-wex L79P, pDZTn-PgapA-wex L79T, pDZTn-PgapA-wex L79Y, pDZTn-PgapA-wex L79N, pDZTn-PgapA-wex L79W и pDZTn-PgapA-wex L79R, полученных, как показано в Таблице 15, трансформировали в штамм СМ06-0111, полученный в Примере 2, посредством электропорации, и затем выполняли вторичный кроссинговер с получением 19 штаммов, в которых мутантный ген wex gene был введен в хромосому. Соответствующую генетическую манипуляцию подтверждали посредством секвенирования генома и методом ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышерасположенной и нижерасположенной областей гомологичной рекомбинации, куда введен соответствующий ген.
Полученные таким образом штаммы были названы СМ06-0112 (wex L79A), СМ06-0114 (wex L79I), СМ06-0115 (wex L79G), СМ06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W) и CM06-0129 (wex L79R).
Для того, чтобы подтвердить количество произведенного тирозина в штаммах СМ06-0112 (wex L79A), СМ06-0114 (wex L79I), СМ06-0115 (wex L79G), СМ06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W) и CM06-0129 (wex L79R), штаммы культивировали таким же образом, как в Примере 2. После завершения культивирования количество произведенного L-тирозина измеряли посредством ВЭЖХ.
Штамм с введенным мембранным белком Wex дикого типа демонстрировал незначительные эффекты, в то время как штамм СМ06-0112 со введенной мутацией Wex L79A имел концентрацию L-тирозина, составляющую 2,92 г/л в культуре, выращиваемой в колбе, где выход был улучшен на примерно 2,5%р по сравнению с контролем СМ06-0111. Кроме того, было подтверждено, что выход для штамма СМ06-0115 с введенной мутацией Wex L79G также было улучшен на 2,4%р; это подтверждало, что мутант Wex L79A и мутант L79G специфически выделяют L-тирозин.
Штамм СМ06-0112 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), международном депозитарном органе, в рамках Будапештского договора, 27 апреля 2020 года, с номером доступа КССМ12708Р.
Из вышеизложенного специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, может понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без модификации технических принципов или существенных характеристик настоящего изобретения. В связи с этим, воплощения раскрыты здесь в примерах предназначены только для иллюстративных целей, и их не следует рассматривать как ограничивающиеся объем настоящего изобретения. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только приведенные в примерах воплощения, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощений, которые могут быть включены, в пределах объема и существа настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ L-ТИРОЗИН-ЭКСПОРТИРУЮЩЕГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
L-ТИРОЗИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
L-ТИРОЗИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
<130> OPA21208
<150> KR 10-2020-0063778
<151> 2020-05-27
<160> 85
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wex L79A
<400> 1
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ala Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wex L79G
<400> 2
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Gly Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 3
tcgagctcgg taccctggga acttgtcgac gctat 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 4
tgttcggcaa gcattgtggt gtgggcaatg atcac 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 5
attaacggtt aaagtactca ttgtgaggtg gcggg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 6
ctctagagga tccccggagc tgctgtccaa cgtgg 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 7
ccacaccaca atgcttgccg aacatttttc ttttc 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 8
cacaatgagt actttaaccg ttaatggagt ccttg 35
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 9
acgcgccaag tcggacg 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 10
cgcacgatgt ttacctgcg 19
<210> 11
<211> 1122
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli tyrA_M53I_A354V
<400> 11
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300
gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540
ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900
cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 12
ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 13
gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 14
tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 15
actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 16
gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 17
tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 18
ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 19
tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 20
gcccactagt cgaatccc 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 21
ctgtccgcaa cctgtgcg 18
<210> 22
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli aroG_P150L
<400> 22
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 23
tcgagctcgg taccccccgg cggtatcgag gtagt 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 24
gacaagttta gtactttaat cacccgcggg gaccc 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 25
ggtgattaaa gtactaaact tgtcccgagg gtgag 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 26
ctctagagga tcccctatca gtcacttccc tgaga 35
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 27
gcgggtgatt aaagtgaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 28
gttctgataa ttcatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 29
atgaattatc agaacgacga 20
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 30
cgggacaagt ttagtttacc cgcgacgcgc tttta 35
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 31
ttgatatgac cgcagcctga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 32
ctgcattctc atcgatcttg 20
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 33
ttcgagctcg gtacccggag gggtttccac ctcg 34
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 34
tgggaagctt gtctcaatta tgtctgttgc tcaattagcg 40
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 35
ctaattgagc aacagacata attgagacaa gcttccca 38
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 36
aattggtgcg tcgctcatgg ggcacctacc gaggaa 36
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 37
ttcctcggta ggtgccccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 38
cgactctaga ggatcccccc gaagagttcg gctgcg 36
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 39
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 40
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 41
ttcgagctcg gtacccgagg gctcactgac gttga 35
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 42
cgctgggatg tttctaccgg attcgattcc tcag 34
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 43
cgctcccaga agtaggctca aaccttgccc ataac 35
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 44
ctctagagga tccccctccc ccaaaccacg ctttt 35
<210> 45
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> промотор CJ7
<400> 45
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300
caacgaaagg aaacactc 318
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 46
ggaatcgaat ccggtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 47
tactttcaga actcatgagt gtttcctttc gttgg 35
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 48
acgaaaggaa acactcatga gttctgaaag tagtc 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 49
gggcaaggtt tgagcctact tctgggagcg ccaca 35
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 50
acattaagtg gtaggcgctg a 21
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 51
cataacaggg cagaacaaac 20
<210> 52
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex AA seq
<400> 52
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 53
cggattatgc caatgatgtg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 54
cacgatcacc aacattcagg 20
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 55
gtgtcctacg aactctgcgc atcgctctcc atcggttatg 40
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 56
cataaccgat ggagagcgat gcgcagagtt cgtaggacac 40
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 57
gtgtcctacg aactctgcat ctcgctctcc atcggttatg 40
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 58
cataaccgat ggagagcgag atgcagagtt cgtaggacac 40
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 59
gtgtcctacg aactctgcgg ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 60
cataaccgat ggagagcgag ccgcagagtt cgtagg 36
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 61
gtgtcctacg aactctgcat gtcgctctcc atcggtt 37
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 62
cataaccgat ggagagcgac atgcagagtt cgtagg 36
<210> 63
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 63
gtgtcctacg aactctgcac ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 64
cataaccgat ggagagcgag gtgcagagtt cgtagg 36
<210> 65
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 65
gtgtcctacg aactctgcta ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 66
cataaccgat ggagagcgag tagcagagtt cgtagg 36
<210> 67
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 67
gtgtcctacg aactctgcaa ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 68
cataaccgat ggagagcgag ttgcagagtt cgtagg 36
<210> 69
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 69
gtgtcctacg aactctgctg gtcgctctcc atcggtt 37
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 70
cataaccgat ggagagcgac cagcagagtt cgtagg 36
<210> 71
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 71
gtgtcctacg aactctgccg ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 72
cataaccgat ggagagcgag cggcagagtt cgtagg 36
<210> 73
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 73
gtgtcctacg aactctgctc ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 74
cataaccgat ggagagcgag gagcagagtt cgtagg 36
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 75
gtgtcctacg aactctgccc atcgctctcc atcggtt 37
<210> 76
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 76
cataaccgat ggagagcgat gggcagagtt cgtagg 36
<210> 77
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79I
<400> 77
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ile Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 78
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79M
<400> 78
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Met Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 79
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79T
<400> 79
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Thr Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 80
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79Y
<400> 80
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Tyr Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 81
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79N
<400> 81
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 82
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79R
<400> 82
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Arg Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 83
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79W
<400> 83
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Trp Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 84
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79S
<400> 84
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 85
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wex L79P
<400> 85
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Pro Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
Claims (14)
1. Микроорганизм для продуцирования L-тирозина, содержащий одно или более из (1)-(3):
(1) вариант белка, в котором 79-ая аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на аланин или глицин;
(2) полинуклеотид, кодирующий его; и
(3) вектор, содержащий данный полинуклеотид.
2. Микроорганизм по п. 1, который принадлежит к Corynebacterium sp.
3. Способ продуцирования L-тирозина, включающий: культивирование в среде микроорганизма для продуцирования L-тирозина, который содержит одно или более из
(1)-(3):
(1) вариант белка, у которого 79-ая аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на аланин или глицин;
(2) полинуклеотид, кодирующий его; и
(3) вектор, содержащий данный полинуклеотид.
4. Способ по п. 3, включающий выделение полученного тирозина.
5. Способ по п. 3, где микроорганизм принадлежит к Corynebacterium sp.
6. Вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность, в котором 79-ая аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 заменена на аланин или глицин.
7. Полинуклеотид, кодирующий вариант белка, имеющий L-тирозин-экспортирующую активность, по п. 6.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2020-0063778 | 2020-05-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2808831C1 true RU2808831C1 (ru) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003044192A1 (fr) * | 2001-11-23 | 2003-05-30 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de production de l-aminoacides a l'aide d'escherichia |
RU2530171C2 (ru) * | 2012-02-29 | 2014-10-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | МУТАНТНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ ГЕНОМ yddG, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia |
WO2019164348A1 (ko) * | 2018-02-23 | 2019-08-29 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법 |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003044192A1 (fr) * | 2001-11-23 | 2003-05-30 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de production de l-aminoacides a l'aide d'escherichia |
RU2530171C2 (ru) * | 2012-02-29 | 2014-10-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | МУТАНТНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ ГЕНОМ yddG, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia |
WO2019164348A1 (ko) * | 2018-02-23 | 2019-08-29 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NCBI Reference Sequence: WP_050478745.1, 06.04.2020. aromatic amino acid DMT transporter YddG [Herbaspirillum rhizosphaerae] Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_050478745.1?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=BD9MZPWP016 Дата обращения 19.07.2023. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2763603C1 (ru) | Новый вариант белка-экспортера l-триптофана и способ получения l-триптофана с его применением | |
RU2761871C1 (ru) | Новый экспортер L-триптофана и способ продуцирования L-триптофана с его использованием | |
CA3073177C (en) | A novel promoter and a method for producing l-amino acid using the same | |
KR102204917B1 (ko) | L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법 | |
AU2020268059B2 (en) | Microorganism Producing L-Amino Acid And Method Of Producing L-Amino Acid Using The Same | |
KR102647745B1 (ko) | 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법 | |
RU2808831C1 (ru) | Новый вариант L-тирозин-экспортирующего белка и способ получения L-тирозина с его использованием | |
CN114072492B (zh) | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 | |
RU2779461C1 (ru) | Микроорганизмы для получения l-тирозина и способ получения l-тирозина с их использованием | |
RU2795161C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты с его использованием | |
KR102147381B1 (ko) | 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물 | |
KR20230094761A (ko) | L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법 | |
CA3201761A1 (en) | Novel .gamma.-aminobutyrate permease variant and method for producing isoleucine by using same | |
CN115135761A (zh) | 新型互变异构酶ppta变体及使用其生产l-色氨酸的方法 |