CN101087881A - 新型的l－赖氨酸－诱导型启动子 - Google Patents
新型的l－赖氨酸－诱导型启动子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101087881A CN101087881A CNA2005800449170A CN200580044917A CN101087881A CN 101087881 A CN101087881 A CN 101087881A CN A2005800449170 A CNA2005800449170 A CN A2005800449170A CN 200580044917 A CN200580044917 A CN 200580044917A CN 101087881 A CN101087881 A CN 101087881A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methionin
- nucleic acid
- gene
- acid molecule
- inducible promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 22
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 14
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 13
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101100315045 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) trpE gene Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 2
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 229940049547 paraxin Drugs 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000802734 Homo sapiens eIF5-mimic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100276922 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dapF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101100116197 Streptomyces lavendulae dcsC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150050866 argD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009649 dapC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062988 dapF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 102100035859 eIF5-mimic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
公开的是新型的L－赖氨酸－诱导型启动子核酸分子。也公开的是包含该核酸分子的载体、用该载体转化的宿主细胞以及使用该L－赖氨酸－诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
Description
技术领域
[01]本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子、包含该核酸分子的载体、用该载体转化的宿主细胞和使用L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
背景技术
[02]棒状细菌(Coryneform bacteria)是生产在动物饲料工业、药品工业、食物工业和类似工业中具有多种应用的化学物质的工业微生物，所述化学物质包含L-赖氨酸、L-苏氨酸和多种核酸。为了通过基因工程或代谢工程从这些棒状细菌中开发高效价菌株，在棒状细菌中涉及几个代谢途径的基因表达应该被有选择地调节。因此，需要对该基因调节有用的启动子序列。
[03]在棒状细菌上一旦发生基因表达，基因通常从它们自己的启动子表达(Vasicova，P.，等，J.Bacteriol.181，6188-6191，(1999)，等等)。然而，不像其它的工业微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，没有关于在棒状细菌中负责基因表达的启动子序列的基本结构的信息。因为这个原因，通过以下步骤开发出启动子：从与抗生素抗性相关的基因中除去启动子区，抗生素例如氯霉素；引导从棒状细菌分离的并使用适当的限制性内切酶消化的染色体DNA进入启动子位点；使用所形成的DNA分子转化棒状细菌；评估所获得的菌株的抗生素抗性(Eikmanns，B.J.等，Gene，102，93-98(1991)；Patek，M.等，Microbiology，142，1297-1309(1996))。然而，考虑到目标基因的选择性表达和表达效率，先前开发的启动子序列仍然需要进一步改进。
[04]涉及启动子分离的传统方法包括：(1)启动子探针载体系统在报道基因上游的基因组DNA片段的随机克隆中的使用，该报道基因仅当克隆的片段中包含启动子活性时才进行表达；(2)基于基因特异性探针的杂交，通过该杂交，基因和它的启动子从基因组文库分离出来；以及(3)诱导性的cDNA探针和非诱导性cDNA探针与基因文库的差示杂交。
[05]近来发展的使用2维(2-D)凝胶电泳的比较蛋白质组分析是鉴别在不同的生理状态下差异表达的蛋白质的技术。基于差异表达的蛋白质，许多研究已被施行以便鉴定能增加蛋白质表达的调节基因。
[06]基于这个背景，本发明人对存在赖氨酸时表达被诱导的蛋白质进行了2-D凝胶电泳，以及通过比较蛋白质组分析检测和鉴别了显示差异表达图式(pattern)的蛋白质。当与鉴定的蛋白质的推定的启动子区相对应的多核苷酸通过PCR扩增并被引入缺少启动子的lacZ基因的上游时，观察到在存在赖氨酸时β-半乳糖苷酶的活性显著增加，从而导致了本发明，其提供能在赖氨酸存在时诱导基因表达的新型启动子核酸分子。
发明内容
[07]因此，本发明的一个目标是提供新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
[08]本发明的另一个目标是提供包含该新型的启动子核酸分子的载体。
[09]本发明的进一步的目标是提供用该载体转化的宿主细胞。
[10]本发明的还有另外一个目标是提供使用新型的启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
附图简述
[11]结合附图，通过下面的详细描述，本发明的上述和其它的目标、特征和其它优点将被更清楚的理解，在附图中：
[12]图1表示存在和不存在赖氨酸情况下培养的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的全细胞裂解产物的2-D凝胶电泳的结果，其中差异表达的蛋白质用箭头表示；以及
[13]图2是构建用于监控启动子活性的载体的方法的图示，其中β-半乳糖苷酶被用于检测启动子活性。
实施本发明的最好的方式
[14]一方面，本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
[15]具体而言，本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子具有SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列。
[16]依照本发明的启动子核酸分子的核苷酸序列可使用几个近来发展的方法中的任意一个修饰到一定的程度，这些方法例如定向进化或定点诱变。本领域技术人员容易地认识到，经过这种人工修饰具有70％或更高同源性的核苷酸序列衍生自本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列，只要它保持了用于表达靶基因的启动子活性。
[17]因此，本发明的L-赖氨酸诱导型启动子核酸分子包括与上述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-赖氨酸-诱导型启动子的核苷酸序列。
[18]在这里使用的术语“同源性(homology)”意欲指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的核苷酸序列具有优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的DNA序列。同源性的评价可用肉眼或商业上可获得的软件进行。使用商业可获得的计算机程序，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，相邻序列之间的同源性(％)可被评价。
[19]另外，本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子包括选自与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
[20]在这里使用的术语“互补的(complementary)”涉及在核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，例如诸如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物和将被测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间。
[21]本发明的L-赖氨酸诱导型启动子核酸分子也包括行使与L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子相同活性的功能等价物。包括功能片段在内的功能等价物可包括这样的变体，在该变体上，一个或多个核苷酸碱基通过取代、缺失、插入或其组合进行改变。
[22]本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子源自棒状细菌，并且在原核细胞中，特别在大肠杆菌和棒状细菌中，作为用于基因表达的启动子是有效用的。
[23]在这里使用的术语“启动子(promoter)”涉及RNA聚合酶与之结合以启始基因转录的DNA区域，和在mRNA转录启始位点的5’方向的位置。依照本发明的目的，本发明的启动子指L-赖氨酸-诱导型启动子，在存在外部信号L-赖氨酸时，其足以去指导启动子依赖性的基因表达。
[24]本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子可使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，它可通过使用适当的引物序列的PCR来分离。它也可以通过使用自动DNA合成仪的标准合成技术来制备。
[25]在这里使用的术语“棒状细菌”包括属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。这些棒状细菌包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032；其它野生型菌株，已知作为棒状杆菌属、特别是种谷氨酸棒状杆菌的适当的菌株、热氨基棒状杆菌(CorynebacteriumThermoaminogene)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067以及乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)ATCC 13869；以及由此制备的产L-氨基酸的突变体或菌株，例如谷氨酸棒状杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001。
[26]另一方面，本发明涉及包含新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的载体。
[27]在这里使用的术语“载体”涉及包含可操作地连接到适合的控制序列的DNA序列的DNA构建物。这些控制序列可包括指引转录的启动子、控制该转录的某些操纵子序列、在mRNA上编码合适的核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入片段。一旦转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和行使功能，或者可以在一些情况下，自身整合入基因组。
[28]这里使用的术语“可操作地连接(operably linked)”指将准备表达的基因以某种方式连接到它的控制序列以被表达。
[29]在施行2-D凝胶电泳之后，本发明人通过比较蛋白质组分析鉴定显示出增加的表达的蛋白质，以及使用报道基因从此类蛋白质搜寻启动子序列。报道基因是通过其表达使得目标启动子的活性能够被很容易地检测的基因。可利用的报道基因包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶和荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白等等)。
[30]在本发明的详细实践中，为了通过测量从LacZ基因表达的β-半乳糖苷酶的活性来确定本发明的新型启动子核酸分子是否是L-赖氨酸诱导型的，构建重组载体，pLCP。在本发明的另外一个详细实践中，包含本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的pLCP载体在存在250mM L-赖氨酸时，其显示的β-半乳糖苷酶活性是不存在L-赖氨酸的情况下的β-半乳糖苷酶活性的2倍或更多倍。
[31]为了重组产生靶基因，包含L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的本发明载体可操作地连接到编码多种蛋白的任一基因上。使用本发明载体容易表达的靶基因包括但不限定于asd、daβA、dapC、dapF、fbp、lysC和pyc。在这些靶基因中，asd、dapA、lysC和pyc是特别优选地。
[32]在进一步的方面，本发明涉及用载体转化的宿主细胞。
[33]上述包含L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的载体可操作地连接到编码靶蛋白的基因上以诱导靶蛋白的表达。用这种方式构建的载体被转化进入宿主细胞，例如原核细胞，优选地为大肠杆菌和棒状细菌，更优选地为棒状细菌。
[34]在这里使用的术语“转化(transformation)”指引导DNA以这样的方式进入宿主，即它能作为染色体外的成分复制，或者通过染色体整合进行复制。
[35]如此转化的宿主细胞(转化体)的培养可以按照本领域的普通方法进行。已知的培养方法被Chmiel所描述(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrungin die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))；以及被Storhas所描述(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
[36]在还有另一方面，本发明涉及诱导靶基因表达的方法，其是以使用L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子为基础的。
[37]本发明的新型L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子能诱导可操作地被连结到其上的靶基因的高水平的表达，因此在靶蛋白的大量生产中是有效用的。
[38]对本发明的更好的理解可以通过下述实施例获得，这些实施例被提出以举例说明本发明，而不是解释为对本发明的限制。
实施例1：在谷氨酸棒状杆菌中其表达被L-赖氨酸诱导的蛋白质的筛选和鉴定。
(1)从培养在不同浓度L-赖氨酸中的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中制备蛋白质样品。
[39]谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032被培养在不存在和存在L-赖氨酸(0、250和500mM)的情况下，细胞通过离心获得。用10mM Tris-Hcl缓冲液(pH7.5)洗细胞三遍。
[40]洗过的细胞被重新悬浮在裂解缓冲液中(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基-铵]-1-丙磺酸盐)，0.4％二硫苏糖醇)，在冰上使用超声波仪经超声波处理而破裂，并在4℃下12,000×g离心15分钟。如此获得的细胞裂解产物与最终浓度为700单位/ml的核酸内切酶(Sigma)和1×蛋白酶抑制剂混合物(Roche)混合。蛋白质浓度使用布拉德福(Bradford)方法测定。
(2)通过2-D凝胶电泳的蛋白质分离。
[41]每一个得到的蛋白样品中的500μg与溶解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基-铵]-1-丙磺酸盐)，0.4％二硫苏糖醇，1％溴酚蓝)混合得到最终体积500μl，然后在4℃下20,000×g离心15分钟。上清液与0.5％固定化电介质(immobiline)pH梯度(IPG)缓冲液(pH4.5-5.5载体两性电解质，Amersham PharmaciaBiotech)混合。所形成的溶液被装载到IPG干条再水化盘(IPG dry striprehydration tray)上，含pH4.5-5.5线性梯度的18cm IPG干条在再水化盘上与蛋白质样品再水化12小时。
[42]再水化的条在Multiphor II电泳槽(Amersham PharmaciaBiotech)上进行等电聚焦，90kVh。
[43]在第一向等电聚焦完成后，聚焦的IPG条用平衡缓冲液(0.2mM三丁基膦、6M尿素、2％SDS、375mM Tris-HCL、pH8.8、20％甘油和2.5％丙烯酰胺)搅拌下平衡15分钟。
[44]平衡的IPG条用1×SDS-PAGE分离缓冲液(192mM甘氨酸、0.1％SDS、24.8mM Trisma Base)轻微润湿，然后如下进行第二向电泳。
[45]平衡的IPG条被置于8-16％的梯度聚丙烯酰胺凝胶的顶部，并在每凝胶15mA下跑胶16小时来分离蛋白质。
(3)显示增加的表达水平的蛋白质点的检测。
[46]双向凝胶用250ml三重蒸馏水(triple-distilled water)清洗，在固定溶液(40％甲醇、5％磷酸)中温育1小时。凝胶用考马斯亮(Coomassie brilliant)G-250(sigma)染色5个小时，然后在去染色溶液(1％醋酸)中去染色12小时以除去过多的染色。
[47]利用PDQuest软件(Bio-rad)，对用蛋白质样品制备的双向凝胶进行相互比较，所述蛋白质样品是从存在0、250和500mM的L-赖氨酸下培养的细胞中获得的。结果如图1所示。五个表示出增加的表达的蛋白质点被检测到。
实施例2：其表达被L-赖氨酸诱导的蛋白质的鉴定
(1)从蛋白质点的肽提取
[48]在图1中所示的目标蛋白质点从凝胶上切下来，转移到微量离心管。凝胶块三次用120μl在25mM碳酸氢铵(pH7.8)中的50％乙腈去染色15分钟，伴随温和的搅动，并被完全干燥。干燥的凝胶块在37℃下在胰蛋白酶消化液(25mM碳酸氢铵，pH7.8，0.015μg/μl胰蛋白酶)中温育16个小时，以消化凝胶中的蛋白质。在凝胶内胰蛋白酶消化完成以后，消化的凝胶块用8μl肽提取液(50％乙腈和0.5％三氟乙酸的混合物)覆盖，并且被超声处理10分钟以从凝胶中提取肽。然后，凝胶块被离心，回收包含从凝胶中释放的肽的上清液并使用冷冻干燥器浓缩到大约5μl的体积。
(2)通过质谱法的蛋白质鉴定
[49]1μl的每个浓缩样品与1μl的基质溶液(10mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸、0.5％三氟乙酸和50％乙腈)混合，然后被装载到用于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱的采样板上，并被干燥以结晶。结晶肽的质量用MALDI-TOF质谱分析。为了蛋白质的鉴定，测量的肽质量被用于搜寻美国国家生物技术信息中心(NCBI)(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr.Z)的蛋白质数据库和其它来源，这使用MS-Fit软件(
http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm)或者Profound软件(
http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)进行。结果被列在下面的表1里。如表1所示，五个蛋白质点被鉴定为：Cgl1910编码点a、Cgl2134编码点b、Cgl2754编码点c、Cgl2818编码点d以及Cgl3209编码点e。
表1
[50]存在赖氨酸情况下显示增加的表达水平的蛋白
| 点 | 蛋白名称 | Cgl编号 |
| a | 转录调节子 | 1910 |
| b | 具有不同特异性的脱氢酶 | 2134 |
| c | NADPH-依赖性的谷氨酸合成酶β链和相关的氧化还原酶 | 2754 |
| d | NADPH-依赖性的谷氨酸合成酶β链和相关的氧化还原酶 | 2818 |
| e | 邻氨基苯甲酸合成酶成分I | 3029 |
实施例3：包含启动子序列的重组载体的构建
(1) 对应于推定的启动子区的DNA片段的扩增
[51]谷氨酸棒状杆菌基因组基因的核苷酸序列已经完全被测定并广为人知了。列于表1中的蛋白质的遗传信息(Cgl1910、Cgl2134、Cgl2754、Cgl2818和Cgl3209)可从NIH GenBank数据库中得到。为了扩增位于每个蛋白质ORF上游的推定的启动子区(SEQ ID No.1：Cgl1910的启动子区；SEQ ID No.2：Cgl2134的启动子区；SEQ ID No.3：Cgl2754的启动子区；SEQ ID No.4：Cgl2818的启动子区；SEQ IDNo.5：Cgl3029的启动子区)，如下面表2所示，基于报道的核苷酸序列设计引物以包含BamHI位点，并将其合成。为了扩增五个启动子区，用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板与合成的引物一起进行PCR[Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories]。PCR的条件包括25个循环：在94℃下变性1分钟，在58℃下退火1分钟以及在68℃下聚合30秒。
表2
| 启动子 | 引物序列 |
| Cgl1910 | 引物1(SEQ ID No.6)：TT GGATCC AACCCCGTAGCAACCAGC引物2(SEQ ID No.7)：GA GGATCC GCGCCCAAGTGTACAAATT |
| Cgl2134 | 引物3(SEQ ID No.8)：AT GGATCC TTGCCTCTAGTGGGACTG引物4(SEQ ID No.9)：TA GGATCC TGAAATCATGCCTTTCTCG |
| Cgl2754 | 引物5(SEQ ID No.10)：TA GGATCC ATTTCAGCCTGAACCTTC引物6(SEQ ID No.11)：CA GGATCC ATAAAGTTCGATTCCTTAAA |
| Cgl2818 | 引物7(SEQ ID No.12)：AC GGATCC TGCTTAATTTCCTCGGCA引物8(SEQ ID No.13)：AT GGATCC GTGTTTGAAGTTGCCTTT |
| Cgl3029 | 引物9(SEQ ID No.14)：AA GGATCC ATGGCTGCGCATACTGTTG引物10(SEQ ID No.15)：AT GGATCC GGGGCACCTACCGAGGAA |
(2)用于检测启动子活性的载体的构建
[52]图2示意性的说明了构建检测每一个推定的启动子活性的重组载体的方法。
[53]在实施例3的(1)中扩增的DNA片段被分别地克隆到包含LacZ基因的pRS415的BamHI位点(Simons，R.W.等，Gene，53，85-96(1987))。每一个重组载体用HindIII和XbaI消化，以便在插入的推定启动子之前和LacZ基因的后面都进行切割，并在琼脂糖凝胶上电泳。每一个DNA片段被从凝胶上切除，并用凝胶提取试剂盒(Gel ExtractionKit(Qiagen))进行纯化。
[54]纯化的DNA片段被插入pXMJ19载体(Jakoby，M.J.，等，Biotechniques，13，437-441(1999))，因此产生了检测启动子活性的载体：pLCP-1910、pLCP-2134、pLCP-2754、pLCP-2818和pLCP-3029。通过LacZ基因产物β-半乳糖苷酶活性的测量，这些载体可进行推定的启动子活性的检测。
[55]如此获得的重组载体依照Van der Rest等(Appl.Microbiol.Biotechnol.52，541-545，(1999))描述的方法被引入到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的感受态细胞。转化的细胞被涂在补充以17mg/ml氯霉素的LB琼脂平板(0.5％酵母提取物、1％Nacl、1％胰化蛋白胨和1.5％琼脂)上，在30℃下培养以选择生长的菌落。
实施例4：谷氨酸棒状杆菌中启动子序列活性的测量
(1)在存在和不存在250mM赖氨酸的情况下，启动子序列活性的测量
[56]转化的菌落被培养以分析启动子序列的活性，如下。
[57]每一个转化的谷氨酸棒状杆菌的菌落在包含25ml基本培养基(5g葡萄糖、5g硫酸铵、2g尿素、0.5g NaCl、1g KH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、200μg生物素、100μg维生素B1和1ml微量元素溶液，于1升蒸馏水中，pH7.2)的250ml带挡板的瓶中以1∶20的比率接种，该基本培养基可补充或不补充250mM的L-赖氨酸，然后在30℃和200rpm持续摇动的情况下被培育。当培养物达到指数生长期的中期(mid-exponential growth phase)(吸光度为5)时，培养的细胞通过离心收集，悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，通过超声波处理裂解，然后高速离心。按照Rosenthal的方法(Rosenthal，N.，Methods Enzymol.152，704-720(1987))，使用2μl上清液测量β-半乳糖苷酶的活性。结果是，当赖氨酸存在下培养时，转化的细胞显示β-半乳糖苷酶的活性高于赖氨酸不存在的情况下培养的活性，具体来说：对Cgl1910，高2.1倍；对Cgl2134，高2.1倍；对Cgl2754，高2.0倍；对Cgl2818，高3.4倍以及对Cgl3029，高2.7倍(表3)。这些结果表明每一个启动子在存在赖氨酸的情况下诱导了β-半乳糖苷酶的表达。
表3
在存在和不存在赖氨酸情况下启动子活性的比较
| 启动子 | 赖氨酸(mM) | β-半乳糖苷酶活性(mmol/min/mg) |
| Cgl1910 | 0 | 0.28 |
| 250 | 0.58 | |
| Cgl2134 | 0 | 3.30 |
| 250 | 6.99 | |
| Cgl2754 | 0 | 3.09 |
| 250 | 6.09 | |
| Cgl2818 | 0 | 2.75 |
| 250 | 9.23 | |
| Cgl3029 | 0 | 0.50 |
| 250 | 1.43 |
(2)存在或不存在250mM NaCl时启动子序列活性的测量
[58]每一个启动子的活性依照与实施例4的(1)中相同的方法进行测量，除了细胞被培养在存在或不存在NaCl而不是赖氨酸的情况下。结果被列在下面的表4里。如表4所示，在两种培养条件下观察到相似的β-半乳糖苷酶活性，也就是存在和不存在NaCl的条件下。这些结果排除了LacZ基因表达被赖氨酸以外的因素诱导的可能性，因此证明了，每一个启动子以对赖氨酸的特异性反应而诱导基因表达。
表4
在存在和不存在NaCl情况下启动子活性的比较
| 启动子 | NaCl(mM) | β-半乳糖苷酶活性(mmol/min/mg) |
| Cgl1910 | 0 | 0.30 |
| 250 | 0.3 1 | |
| Cgl2134 | 0 | 2.59 |
| 250 | 2.77 | |
| Cgl2754 | 0 | 2.49 |
| 250 | 2.05 | |
| Cgl2818 | 0 | 1.69 |
| 250 | 2.30 | |
| Cgl3029 | 0 | 0.87 |
| 250 | 0.99 |
工业适用性
[59]像在上文中描述的，本发明提供了对赖氨酸特异性反应的、诱导基因表达的启动子核酸分子，因此本发明对开发高效价细菌菌株十分有用，该菌株能高水平的表达编码目标蛋白的基因。
<110>希杰公司
<120>新型的L-赖氨酸-诱导型启动子
<160>15
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>578
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(578)
<223>cgl1910的启动子
<400>1
aaccccgtag caaccagcga ctcactgacc acggtggctg ctgaggcctt gagcggcacg 60
atttcatcgc gctcgggcag atatttggtg gcaccttcgt ggcgcgcggc ggtgtacagc 120
accccggtga ccacattgat cacagcacct gccacgacct cgccgtcgat cgccgcagcg 180
atcgagacgg cgtattgggg caggtcataa aggaagttga cggtgccgtc aatggggtcg 240
acgatccagg taactccgct tatcgacgcc gtccccgtcc cttcctcgcc tatcagcccg 300
tctttaggcc gaagttcctg caacctattg gcgataaaat cttcagccaa agtatctact 360
atcgtcaccg gatcgactgt cgaacttttg gtgttggtgt agtcccacaa attggtgagt 420
tcagcacgct tatccctgat acgtacagcg gtaagcgtgg cagtttccgc ggcgatggca 480
cgcaactcat taaacgattg ttgttccata agaccatcat cgttgttttt ttagaaaatt 540
gcctgccaaa agccgaagta atttgtacac ttgggcgc 578
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(500)
<223>Cgl2134的启动子
<400>2
ttgcctctag tgggactggc tatgaaccga acgcagtgcc ggactaeatc cgatgatttt 60
ctcattgatc ccctgcatat cactgacggt gatgtaggcg aggaaatcga agcatatcta 120
gtgggtgcct actgcatcga agatgagctg attttacgcc ggcgaatccg cttcccgaga 180
ggagtcaaac caggagatat catcggaatt cctaacaccg caggatactt catgcatatc 240
ttggaaagtg catcgcacca aatcccgttg gcgaaaaatg tagtgtggcc ggaggggcag 300
ttagacgata tcgatgcgga ttaagacata accattcgct aatctttcga cgccccttct 360
gaggtgggga tttcttttca tcccctttaa ttattttcgg aaatttatac agcaatcctc 420
gaaatcctaa taaagatccc ttatcgtggg agaggtacgg tagttcgttc gaggacaacg 480
tcgagaaagg catgatttca 500
<210>3
<211>498
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(498)
<223>Cgl2754的启动子
<400>3
atttcagcct gaaccttctc attgatgaca cttcaggctt gtgcctcctg gcactaatga 60
ggggaggttg tgatttctta catagtttag cgttcgtccg ccttgcgtac agcccggttt 120
gcaaagtttt attttgtaat tttcaaaccg atctcaattc cacgctttga gcagcacaaa 180
tgcttattgc cgtagaaaac aatacggagc ggttacaagt tgcgaagcac cctttgcaaa 240
gtttttagcg gtactttaca gctcttcacc ccccattaat ggggtctatg aaagcgcgca 300
gcgtgacaaa tctgacccca gcaaagcccc caatactccc cgactggcct ttattagtct 360
gcacttacca cgtatcatgg agggttgata gcagggcacc attagcagtc gcaccccgat 420
aggagtcgaa tctacaagtg gaacccccgc tcacatactc cacatttttt agaacccctt 480
taaggaatcg aactttat 498
<210>4
<211>498
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(498)
<223>Cgl2818的启动子
<400>4
tgcttaattt cctcggcatg gttaagcggc tcggtgccgt cgattttcca ttggccttcg 60
ggcttaggct tcctggcggc acgtgctggc cgggcacttc cggtggttgt tgtcatgggg 120
agttaatcct taaagagcta gtgaagtaca tgtcactcgg tttgatctat ccgcaaactt 180
agacgtaccg ctctgtctag accaaccatt agattcatga gactgaaagc aatggagtca 240
cctaatgccc gtttaaatga attaacctgg ggatattagg ttaggttcac cgtgaatata 300
atagaccgat ctgtctagtt ttttcatgga gtttgaattt aattaagcaa aagtcttcgc 360
attgtcgcat ttcgctgcta cgtttacaga ccaagcggtc taggagtgtt aaacagcctg 420
gacttgaaac acctttaact acttgatttt cacacccttg tttccataaa agggctcacg 480
aaaggcaact tcaaacac 498
<210>5
<211>498
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(498)
<223>Cgl3029的启动子
<400>5
atggctgcgc atactgttgc gatggttgac gcgaagcgca gtcgcgaaac cccgcaggcg 60
cctgtttccg ctgaaattga agaggccggt ggtgtgacta ttacctcgcc gattatcaac 120
aagactccgc tgaatgcccc caagattgac ttggatgcag tgcgtagagc tgcggaaact 180
acgcaagaac ccaaaaatga ttaataattg agacaagctt cccactatgt gataaagtcc 240
cattttgtga ataactcttg tctcagtcaa agcacccagt ggtggtggcg cgctaactaa 300
gcgagcctga cacctcaagt tgttttcact ttgatgaatt ttttaaggct cgtacttcgt 360
tcgacgaaga agcgggcctt ttgtggtttt tagcccacaa ccggcaagcc ctggatcgaa 420
tgaagctcgc agcgagtaat tatttgatgt ttcccagaaa ggcttcagcc ccacaatgat 480
ttcctcggta ggtgcccc 498
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl1910基因的启动子的引物
<400>6
ttggatccaa ccccgtagca accagc 26
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl1910基因的启动子的引物
<400>7
gaggatccgc gcccaagtgt acaaatt 27
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2134基因的启动子的引物
<400>8
atggatcctt gcctctagtg ggactg 26
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2134基因的启动子的引物
<400>9
taggatcctg aaatcatgcc tttctcg 27
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2754基因的启动子的引物
<400>10
taggatccat ttcagcctga accttc 26
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2754基因的启动子的引物
<400>11
caggatccat aaagttcgat tccttaaa 28
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2818基因的启动子的引物
<400>12
acggatcctg cttaatttcc tcggca 26
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl2818基因的启动子的引物
<400>13
atggatccgt gtttgaagtt gccttt 26
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl3029基因的启动子的引物
<400>14
aaggatccat ggctgcgcat actgttg 27
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Cgl3029基因的启动子的引物
<400>15
atggatccgg ggcacctacc gaggaa 26
Claims (5)
1.一种L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子，其选自：
(a)SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列；
(b)与(a)中所述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-赖氨酸-诱导型启动子的核苷酸序列；以及
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种载体，包含权利要求1所述的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
3.一种原核宿主细胞，其用权利要求2所述的载体转化。
4.如权利要求3中所述的原核宿主细胞，其是棒状细菌。
5.一种使用权利要求1所述的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2004-0117104 | 2004-12-30 | ||
| KR1020040117104 | 2004-12-30 | ||
| KR1020040117104A KR100653742B1 (ko) | 2004-12-30 | 2004-12-30 | 신규한 ｌ-라이신-유도성 프로모터 |
| PCT/KR2005/004675 WO2006071099A1 (en) | 2004-12-30 | 2005-12-30 | Novel l-lysine-inducible promoter |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101087881A true CN101087881A (zh) | 2007-12-12 |
| CN101087881B CN101087881B (zh) | 2010-06-16 |
Family
ID=36615177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2005800449170A Active CN101087881B (zh) | 2004-12-30 | 2005-12-30 | 新型的l-赖氨酸-诱导型启动子 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7851198B2 (zh) |
| EP (1) | EP1841871B1 (zh) |
| JP (1) | JP4837676B2 (zh) |
| KR (1) | KR100653742B1 (zh) |
| CN (1) | CN101087881B (zh) |
| AT (1) | ATE488591T1 (zh) |
| BR (1) | BRPI0519344A2 (zh) |
| DE (1) | DE602005024868D1 (zh) |
| WO (1) | WO2006071099A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103298930B (zh) * | 2008-01-28 | 2015-01-14 | Cj第一制糖株式会社 | 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法 |
| CN114072492A (zh) * | 2019-06-17 | 2022-02-18 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0716980A2 (pt) * | 2006-09-15 | 2013-10-22 | Cj Cheiljedang Corp | Corynebacteria com produtividade de l-lisina aumentada e método de produção da l-lisina usando a mesma |
| KR100830826B1 (ko) | 2007-01-24 | 2008-05-19 | 씨제이제일제당 (주) | 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법 |
| KR100898246B1 (ko) | 2007-08-17 | 2009-05-18 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 |
| KR100987281B1 (ko) | 2008-01-31 | 2010-10-12 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
| KR101126041B1 (ko) | 2008-04-10 | 2012-03-19 | 씨제이제일제당 (주) | 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법 |
| KR101226384B1 (ko) | 2010-03-05 | 2013-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| EP2860256B1 (en) | 2013-10-11 | 2017-03-08 | CJ Cheiljedang Corporation | Method of producing l-amino acids |
| CN111088202B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-01-04 | 南京工业大学 | 一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1114167A1 (en) * | 1998-08-03 | 2001-07-11 | Syngenta Mogen B.V. | Salicylic acid inducible genes and promoters from tobacco |
| DE19931317A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| DE10021828A1 (de) * | 2000-05-04 | 2001-11-08 | Degussa | Neue für das cdsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| WO2002040679A2 (en) * | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Archer-Daniels-Midland Company | Corynebacterium glutamicum promoters |
| KR100420497B1 (ko) * | 2001-11-15 | 2004-03-02 | 씨제이 주식회사 | 프로모터로서 유용한 코리네형 세균 유래의폴리뉴클레오타이드 |
| KR20050056668A (ko) * | 2003-12-10 | 2005-06-16 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움의 신규 ｌ-스레오닌 유입유전자 및 상기유전자를 이용한 ｌ-스레오닌 생산균주 개발방법 |
| JP4712716B2 (ja) * | 2004-09-09 | 2011-06-29 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | プロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
-
2004
- 2004-12-30 KR KR1020040117104A patent/KR100653742B1/ko active IP Right Grant
-
2005
- 2005-12-30 BR BRPI0519344-3A patent/BRPI0519344A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-12-30 AT AT05823655T patent/ATE488591T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-12-30 EP EP05823655A patent/EP1841871B1/en active Active
- 2005-12-30 JP JP2007549271A patent/JP4837676B2/ja active Active
- 2005-12-30 WO PCT/KR2005/004675 patent/WO2006071099A1/en active Application Filing
- 2005-12-30 CN CN2005800449170A patent/CN101087881B/zh active Active
- 2005-12-30 DE DE602005024868T patent/DE602005024868D1/de active Active
- 2005-12-30 US US11/794,688 patent/US7851198B2/en active Active
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103298930B (zh) * | 2008-01-28 | 2015-01-14 | Cj第一制糖株式会社 | 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法 |
| CN114072492A (zh) * | 2019-06-17 | 2022-02-18 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
| CN114072492B (zh) * | 2019-06-17 | 2024-04-30 | Cj第一制糖株式会社 | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7851198B2 (en) | 2010-12-14 |
| CN101087881B (zh) | 2010-06-16 |
| KR20060079336A (ko) | 2006-07-06 |
| EP1841871A4 (en) | 2008-07-30 |
| EP1841871B1 (en) | 2010-11-17 |
| ATE488591T1 (de) | 2010-12-15 |
| WO2006071099A1 (en) | 2006-07-06 |
| JP4837676B2 (ja) | 2011-12-14 |
| US20100047900A1 (en) | 2010-02-25 |
| BRPI0519344A2 (pt) | 2009-01-20 |
| KR100653742B1 (ko) | 2006-12-05 |
| JP2008526197A (ja) | 2008-07-24 |
| DE602005024868D1 (de) | 2010-12-30 |
| EP1841871A1 (en) | 2007-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101087881B (zh) | 新型的l-赖氨酸-诱导型启动子 | |
| CN101605890B (zh) | 源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子、包括所述启动子的重组载体、包括所述重组载体的宿主细胞和利用所述宿主细胞表达基因的方法 | |
| KR100760222B1 (ko) | 유전자 증폭에 의해 증가된 리신 생산 | |
| ES2380000T3 (es) | Promotores múltiples y su uso para la expresión de genes | |
| RU2262532C2 (ru) | Полинуклеотид, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу, и зонд, предназначенный для его получения | |
| US20230279366A1 (en) | Mutant of Glutamate Dehydrogenase Gene Promoter and Application Thereof | |
| CA2548349A1 (en) | P ef-tu expression units | |
| SK12052001A3 (sk) | Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus | |
| US20020086371A1 (en) | L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine | |
| TW200602489A (en) | PSOD expression units | |
| HUE030771T2 (en) | A method of producing an improved promoter and an improved promoter using L-lysine | |
| KR100898246B1 (ko) | 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 | |
| US20230272366A1 (en) | Mutant of Pyruvate Carboxylase Gene Promoter and Use Thereof | |
| CA2548306A1 (en) | Pgro expression units | |
| KR100860932B1 (ko) | 신규한 프로모터 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CJ CHEIL JEDANG CORP. Free format text: FORMER OWNER: CJ CORP. Effective date: 20080418 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20080418 Address after: Seoul, South Kerean Applicant after: CJ Corp. Address before: Seoul, South Kerean Applicant before: CJ Corp. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |