KR20060079336A - 신규한 ｌ-라이신-유도성 프로모터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포 및 이러한 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 사용하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균, 2차원 전기영동법, L-라이신-유도성 프로모터
Description
도 1은 2차원 전기영동법에 의해 라이신 첨가에 따라 발현양이 변화되는 단백질들을 비교한 젤 사진이다. 변화된 단백질 점들은 화살표로 표시하였다.
도 2는 프로모터 탐색 벡터의 제작 방법을 나타낸 모식도이다. 프로모터의 활성도를 측정하기 위해서는 베타-갈락토시다제를 사용하였다.
본 발명은 신규한 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포 및 이러한 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 사용하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물 이다. 이러한 코리네형 세균을 유전공학적, 대사공학적 기술을 이용하여 고역가 균주로 개발하기 위해서는 코리네형 세균 내에서 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있어야 하는데, 이를 위해서 유용한 프로모터 서열이 필수적이라 할 수 있다.
코리네형 세균에서 유전자를 발현시키기 위해서는, 일반적으로 자체 유전자들이 원래 갖고 있던 프로모터를 사용하는 것이 일반적이었다 (Vasicova, P., et al., J. Bacteriol. 181, 6188-6191, (1999) 등). 한편, 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업용 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 그러므로 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자의 프로모터 부분을 제거하고, 여기에 코리네형 세균으로부터 분리한 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 절단하여 도입한 후, 이것으로 코리네형 세균을 형질 전환시켜 얻은 균주의 항생제 내성을 측정함으로써 프로모터를 개발해왔다 (Eikmanns, B.J., et al., Gene, 102, 93-98, (1991); Patek, M., et al., Microbiology, 142, 1297-1309, (1996)). 그러나, 기존에 개발된 프로모터 서열들은 유전자 발현의 선택성 및 발현효율 등의 측면에서 여전히 개선의 여지를 안고 있었다.
종래에 프로모터를 분리하기 위한 방법에는 (1) 게놈성 DNA 단편을 클로닝된 단편이 프로모터 활성을 포함하는 경우에만 발현되는 리포터 유전자의 전방에 무작위로 클로닝시키는 프로모터 프로브 벡터의 이용법, (2) 유전자 특이적 프로브에 기초한 하이브리드화를 이용하여 유전자 라이브러리로부터 유전자 및 이의 프로모 터의 분리법, (3) 유도성 cDNA 프로브 및 비유도성 cDNA 프로브를 사용한 유전자 뱅크의 차별 하이브리드화법 등이 있었다.
최근 들어, 2차원 전기영동을 이용한 프로테옴 비교분석법으로 상이한 조건 하에서 발현율이 상이한 단백질을 분석하는 방법이 개발되었으며, 발현에 차이를 보이는 단백질에 기초하여 이의 발현을 증대 시킬 수 있는 조절 유전자를 밝히고자 하는 연구가 진행되고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 라이신 첨가 조건에서 발현이 유도된 단백질을 2차원 전기영동법을 시행하고 발현량에 차이가 있는 단백질을 프로테옴(proteome) 비교분석법에 의해 확인 및 동정하여, 동정된 단백질의 예상 프로모터 부분의 폴리뉴클레오타이드를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하여 프로모터가 결핍된 lacZ 유전자의 앞부분에 도입한 후, 라이신 첨가에 따른 베타갈락토시다제 활성의 현격한 증가를 확인함으로써, 라이신에 의해 발현을 유도할 수 있는 신규 프로모터 핵산 분자를 제공할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다
본 발명의 목적은 신규한 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 신규 프로모터 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 신규 프로모터 핵산 분자를 사용하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 프로모터 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이 돌연변이 기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 염기서열로부터 유래된, 그와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상의 상동성(homology)을 가지고 프로모터로 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하다.
본 발명에서 사용된 용어 "상동성"은 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터의 핵산 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
또한, 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인(complementary) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택된 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어, "상보적인"은 뉴클레오타이드 또는 핵산, 예를 들어 이중가닥 DNA 분자의 2개의 스트랜드간 또는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머와 서열 분석되거나 증폭될 단일 스트랜드 핵산상의 프라이머 결합 부위간의 하이브리드화 또는 염기 짝지음을 의미한다.
또한, 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 상기한 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함한다. 상기한 기능적 등가물에는 작용성 단편을 포함하여, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이 된 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 코리네형 세균(Coryneform bacterium) 유래의 프로모터로서, 바람직하게는 원핵세포, 특히 대장균 및 코리네 형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터로 유용하다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 유전자의 전사가 개시되기 위해 RNA 폴리머라제(RNA polymerase)가 결합하는 DNA 부위로서, mRNA 전사 개시 부위의 5' 측에 위치한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 프로모터는 외부 시그날인 L-라이신의 첨가에 의해 프로모터-의존적 유전자 발현을 가능하게 하는 L-라이신-유도성 프로모터를 말한다.
본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "코리네형 세균"은 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 포함하는 개념이다. 이러한 코리네형 세균은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 외에 다른 코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주로는 공지된 야생형균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001 등을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 신규 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질 전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능 할 수 있거나, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.
본 발명자는 2차원 전기영동 후 발현이 증가된 단백질을 프로테옴 비교분석법으로 밝힌 후 이러한 단백질로부터 프로모터 서열을 찾기 위해 리포터 유전자를 이용하였다. 리포터 유전자는 이의 발현을 통해 프로모터의 작동 여부를 확인할 수 있는 유전자로서, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시파제, 클로람페니콜 트란스아세틸라제,형광 단백질(예: 그린 형광 단백질, 레드 형광 단백질, 옐로우 형광 단백질, 블루 형광 단백질, 시안 형광 단백질 등) 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시에서는 본 발명의 신규 프로모터 핵산 분자의 L-라이 신-유도성을 LacZ 유전자의 발현에 의한 베타-갈락토시다제의 활성을 통해 확인하였으며, 이 과정에서 플라스미드 벡터 pLCP를 제작하였다. 본 발명의 구체적 실시에서 본 발명의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 포함하는 벡터 pLCP의 경우, 250 mM L-라이신 첨가에 의해 L-라이신을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 2배 이상의 높은 베타-갈락토시다제 활성을 나타내었다.
L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 벡터는 목적 유전자를 재조합적으로 생산하기 위해 다양한 단백질을 코딩하는 유전자와 작동적으로 연결된다. 본 발명의 벡터를 사용하여 발현시키기에 유리한 목적 유전자로는 asd, dapA, dapC, dapF, fbp, lysC, pyc 등이 있으며, 반드시 이들로 제한되지는 않는다. 상기 목적 유전자중 특히 asd, dapA, lysC, pyc 등이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 벡터로 형질 전환된 숙주세포에 관한 것이다.
상기한 바와 같은 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 포함하는 벡터는 목적 단백질의 발현을 유도하기 위해 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결되며, 이와 같이 제작된 벡터는 목적 단백질의 발현을 위해 숙주 세포, 예를 들어 원핵세포, 바람직하게는 대장균 및 코리네형 세균, 보다 바람직하게는 코리네형 세균에 형질전환 시킨다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)))에 기술되어 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 사용하여, 목적 유전자의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자는 발효 배지 중 L-라이신 첨가에 의해 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 고발현을 유도할 수 있어, 목적 단백질의 대량 생산에 유용하다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되어서는 안 된다.
실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-라이신에 의해 발현이 유도되는 단백질 탐색 및 동정
(1) L-라이신 첨가에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 균체 유래 단 백질의 조제
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 L-라이신이 각각 0, 250 mM, 500 mM이 포함된 조건에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 균체를 각각 회수하였다. 이들 균체를 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 3회 세정하여 세정 균체를 취득하였다.
상기 세정 균체를 파쇄 완충액(7 M 요소, 2 M 티오요소, 4% CHAPS (3-[(3-chloamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate), 0.4% 디티오트레이톨)에 현탁하여 초음파 파쇄 장치를 사용하여 냉각하면서 균체를 파쇄 한 후, 15분 동안 원심분리(12,000 x g, 4℃)하였다. 수득된 파쇄 액에 700 unit/㎖ 이 되도록 엔도뉴클레아제(sigma사 제품)를 첨가하고 또한, 1X 프로테아제 억제제 혼합물(Roche사 제품)을 첨가하였다. 상기 단백질 시료의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford)의 단백질 정량법에 의해 구하였다.
(2) 2차원 전기영동법에 의한 단백질의 분리
상기에서 얻어진 단백질 시료 500 ㎍을 최종부피가 500 ㎕가 되도록 용해촉진용액(7 M 요소, 2 M 티오요소, 4% CHAPS (3-[(3-chloamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate), 0.4% 디티오트레이톨, 1% 브로모페놀블루)을 가한 후, 15분 동안 원심분리(20,000 x g, 4℃)하였다. 상층액만을 취하여 0.5%가 되도록 IPG(immobiline pH gradient)완충용액 (pH 4.5-5.5 carrier ampolyte, Amersham Pharmacia Biotech사 제품)을 첨가한 후 IPG 건조 스트립(immobiline pH gradient dry strip) 재수화(rehydration) 트레이에 넣고, 18 cm pH 4.5-5.5의 선형 IPG 건조 스트립을 용액 위에 올려놓고 12시간동안 재수화시켰다.
재수화된 스트립을 멀티포어 II(Amersham Pharmacia Biotech사 제품) 전기영동 장치에서 90 KVhr의 전기를 걸어 등전점 전기영동을 수행하였다.
등전점 전기영동 후, IPG 스트립을 취득하고, 평형화 완충용액(0.2 mM 트리부틸포스파인, 6 M 요소, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20% 글리세롤 및 2.5% 아크릴아미드)에 넣어 15분 동안 교반하면서 평형화 하였다.
평형화 후, IPG 스트립은 1X SDS-PAGE 전개 완충액(192 mM 글리신, 0.1% SDS, 24.8 mM 트리즈마베이스)으로 가볍게 헹군 후 하기와 같이 2차원 전기영동을 실시하였다.
즉, 전기영동장치에 세팅한 8-16%의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 젤 상에 상기 IPG 스트립을 밀착한 후 젤 당 15 mA로 16시간 동안 전기영동하여 단백질을 분리하였다.
(3) 발현양이 증가된 단백질 점 검출
상기 단백질 분리가 이루어진 젤은 젤 당 250 ㎖의 3차 증류수로 세척한 후 고정용액(40% 메탄올, 5% 인산)에 1시간 동안 담았다가 Coomassie brilliant G-250(Sigma사 제품)으로 5시간 동안 염색하였다. 지나친 염색은 탈색용액(1% 초산)으로 12시간 동안 탈색하였다.
L-라이신이 각각 0, 250 mM, 500 mM 첨가된 조건으로부터 얻어진 2차원 젤을 PDQuest 프로그램(Bio-Rad사 제품)으로 비교분석 하여 발현이 증가된 5개의 단백질 점을 확인하였고 이 결과를 도1에 나타내었다.
실시예 2: L-라이신에 의해 발현이 유도되는 단백질 동정
(1) 단백질 점으로부터 펩타이드 분리
도 1에 나타낸 단백질 점들을 젤로부터 잘라내어 마이크로 튜브에 옮기고 120 ㎕의 탈 염색용액(25 mM 중탄산암모늄 pH 7.8, 50% 아세토니트릴)을 넣고 15분간 가볍게 교반한 후, 탈 염색용액을 제거하는 과정을 3회 반복하여 젤 조각의 염색을 제거하였다. 탈염 색을 마친 후, 젤 조각은 완전히 건조 시켰다. 건조된 젤 조각에 8 ㎕의 단백질소화용액(25 mM 중탄산암모늄 pH 7.8, 0.015 ㎍/㎕ 트립신)을 넣고 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 젤 내에 있는 단백질이 트립신으로 분해되도록 하였다. 반응을 마친 후, 이 시료에 8 ㎕의 펩타이드 추출용액 (50% 아세토니트릴과 0.5% 트리플루오로아세트산의 혼합액)을 첨가하여 10분간 초음파 처리하여 젤을 파쇄 하였다. 파쇄 시킨 후 원심분리하여 추출된 펩타이드들을 포함하는 상층액을 수득하여 동결건조기로 5 ㎕정도 되도록 농축시켰다.
(2) 질량분석법에 의한 단백질 동정
농축된 시료에서 1 ㎕을 취하여 1 ㎕의 매트릭스(matrix)용액 (10 mg/ml α- cyano-4-hydroxy cinnamic acid, 0.5% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴) 과 섞고 질량분광계의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 시간(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometer, MALDI-TOF MS)용 플레이트에 올려 놓은 뒤 건조 시켜 결정화하였다. 결정화된 펩타이드들의 질량은 MALDI-TOF MS로 측정하였고, 획득한 펩타이드 질량값은 MS-Fit(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm) 또는 ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound) 프로그램에 입력하여 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr.Z) 등의 단백질 데이터 베이스를 검색함으로써 단백질 점을 동정하였다. 이러한 방법으로 동정된 점 a는 Cgl1910, 점 b는 Cgl2134, 점 c는 Cgl2754, 점 d는 Cgl2818, 점 e는 Cgl3029이었다. 결과는 표 1에 나타내었다.
| Spot | Protein name | Cgl No. |
| a | Transcriptional regulator | 1910 |
| b | Dehydrogenases with different specificities | 2134 |
| c | NADPH-dependent glutamate synthase beta chain and related oxidoreductases | 2754 |
| d | NADPH-dependent glutamate synthase beta chain and related oxidoreductases | 2818 |
| e | Anthranilate synthase component I | 3029 |
실시예 3: 프로모터 서열을 함유하는 재조합 벡터의 제작
(1) 예상 프로모터 부위 DNA 단편 증폭
코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다. 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 표 1에 나타낸 단백질들의 유전자정보(Cgl1910, Cgl2134, Cgl2754, Cgl2818, 및 Cgl3029)를 확보하였다. 각 단백질 ORF의 앞부분에 위치한 예상 프로모터(서열번호 1: Cgl1910의 프로모터, 서열번호 2: Cgl2134, 서열번호 3: Cgl2754, 서열번호 4: Cgl2818, 서열번호 5: Cgl3029)를 증폭하기 위해 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 2에서 기재된 제한효소 BamHI 절단부위를 포함하는 프라이머를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=94℃, 1분/Annealing=58℃, 1분/Polymerization=68℃, 30초, 25회)에 의해 5종류의 유전자를 증폭하여 확보하였다.
| 프로모터 | 프라이머 서열 |
| Cgl1910 | 프라이머1(서열번호6) TTGGATCC AACCCCGTAGCAACCAGC 프라이머2(서열번호7 ) GAGGATCC GCGCCCAAGTGTACAAATT |
| Cgl2134 | 프라이머3(서열번호8) ATGGATCC TTGCCTCTAGTGGGACTG 프라이머4(서열번호9) TAGGATCC TGAAATCATGCCTTTCTCG |
| Cgl2754 | 프라이머5(서열번호10 ) TAGGATCC ATTTCAGCCTGAACCTTC 프라이머6(서열번호11) CAGGATCC ATAAAGTTCGATTCCTTAAA |
| Cgl2818 | 프라이머7(서열번호12) ACGGATCC TGCTTAATTTCCTCGGCA 프라이머8(서열번호13) ATGGATCC GTGTTTGAAGTTGCCTTT |
| Cgl3029 | 프라이머9(서열번호14) AAGGATCC ATGGCTGCGCATACTGTTG 프라이머10(서열번호15) ATGGATCC GGGGCACCTACCGAGGAA |
(2) 프로모터 활성 탐색 벡터의 제작
각 예상 프로모터의 활성을 탐색하기 위한 재조합벡터의 제작은 도2에 나타내었다.
상기 실시예 3-(1)에서 얻어진 DNA 단편들을 도2에서 보듯이 lacZ유전자를 포함한 pRS415(Simons, R.W., et al., Gene, 53, 85-96 (1987))의 제한효소 BamHI의 절단부위에 각각 클로닝하였다. 클로닝된 재조합 벡터로부터 제한효소 HindII와 XbaI을 사용하여 도입된 예상 프로모터의 앞부분과 lacZ유전자 부위의 뒷부분을 절단하여 전기영동한 후, 아가로스 젤을 절단하여 회수용 키트(Qiagen사 제품)로 회수하였다.
회수된 DNA단편들을 각각 pXMJ19 벡터(Jakoby, M.J., et al., Biotechniques, 13, 437-441 (1999))에 클로닝하여, 최종적으로 프로모터 활성탐색 벡터인 pLCP-1910, pLCP-2134, pLCP-2754, pLCP-2818, 및 pLCP-3029를 제작하였다. 이로써 lacZ 유전자의 활성을 측정함으로써 각각의 프로모터의 활성을 결정할 수 있는 프로모터 활성탐색 벡터의 제작이 완결되었다.
이렇게 얻어진 재조합 벡터들을 각각 van der Rest 등의 방법(Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 541-545, (1999))으로 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입시켰다. 형질전환된 균주를 클로람페니콜 17 ㎎/㎖가 포함된 LB 한천 배지(효모 추출물 0.5%, NaCl 1%, 트립톤 1%, 한천 1.5%)에 도말하여 30℃에서 배양하면서 성장하는 균주를 선별하였다.
실시예 4: 코리네박테리움에서 프로모터 서열의 활성 측정
(1) 250 mM 라이신 첨가 유무에 따른 프로모터 서열의 활성 측정
획득된 형질전환 균주들은 프로모터 서열의 활성측정을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
250 mM의 L-라이신을 각각 함유 또는 함유하지 않은 최소 배지[포도당 5 g, 황산암모늄 5 g, 요소 2 g, NaCl 0.5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7 H2
O 0.5 g, 바이오틴 200 ㎍, 티아민 염산염 100 ㎍, Trace element 1 ㎖ (공정수 1 리터 기준),pH 7.2] 25 ㎖이 포함된 250㎖ 코너-바플 플라스크에 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들을 20분의 1 비율로 각각 접종하고 30℃에서 배양 중기(흡광도=5)까지 진탕 배양 (200 rpm) 하였다. 배양 종료 후 원심분리에 의해 균체를 회수하여 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)에 현탁한 뒤 초음파파쇄법으로 세포를 파괴하고 다시 고속원심분리하여 상등액을 얻었다. 위 방법으로 얻어진 상등액에서 2 ㎕씩 취하여 Rosenthal 의 방법(Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152, 704-720 (1987))에 따라 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)의 활성을 측정하였다. 그 결과로 라이신이 첨가되지 않은 조건에서 배양한 경우 보다 라이신이 첨가된 조건에서 배양한 경우 베타-갈락토시다제의 활성이 Cgl1910의 경우 2.1배, Cgl2134의 경우 2.1배, Cgl2754의 경우 2.0배, Cgl2818의 경우 3.4배, Cgl3029의 경우 2.7배로 높은 것으 로 나타났다 (표 3). 이 결과로 각 프로모터는 라이신 첨가에 의해 베타-갈락토시다제의 발현을 유도하고 있음을 확인하였다.
| 프로모터 | 라이신(mM) | 베타-갈락토시다제 활성도 (mmol min-1 mg-1) |
| Cgl1910 | 0 | 0.28 |
| 250 | 0.58 | |
| Cgl2134 | 0 | 3.30 |
| 250 | 6.99 | |
| Cgl2754 | 0 | 3.09 |
| 250 | 6.09 | |
| Cgl2818 | 0 | 2.75 |
| 250 | 9.23 | |
| Cgl3029 | 0 | 0.50 |
| 250 | 1.43 |
(2) 250 mM NaCl 첨가 유무에 따른 프로모터 서열의 활성 측정
실시예 4-(1)에서 기술한 방법에서 라이신 대신 NaCl을 사용하는 방법으로 배양한 후 각 프로모터의 활성을 측정하였다. 표 4에 나타낸 대로 250 mM NaCl의 첨가 유무와는 무관하게 베타-갈락토시다제의 활성이 유사하게 나타났다. 이 결과는 라이신 이외의 인자에 의한 유도 발현 가능성을 배제함으로써 각 프로모터는 라이신에 특이적으로 반응하여 발현을 유도한다는 것을 입증한다.
| 프로모터 | NaCl (mM) | 베타-갈락토시다제 활성도 (mmol min-1 mg-1) |
| Cgl1910 | 0 | 0.30 |
| 250 | 0.31 | |
| Cgl2134 | 0 | 2.59 |
| 250 | 2.77 | |
| Cgl2754 | 0 | 2.49 |
| 250 | 2.05 | |
| Cgl2818 | 0 | 1.69 |
| 250 | 2.30 | |
| Cgl3029 | 0 | 0.87 |
| 250 | 0.99 |
본 발명에 따라 L-라이신에 특이적으로 반응하여 발현을 유도하는 프로모터 핵산 서열을 제공함으로써, 목적 단백질의 유전자를 고발현시키는 고역가 균주의 개발에 이용할 수 있다.
<110> CJ corporation
<120> Novel L-lysine-inducible promoter
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 578
<212> DNA
<213> C.glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(578)
<223> Promoter of cgl1910
<400> 1
aaccccgtag caaccagcga ctcactgacc acggtggctg ctgaggcctt gagcggcacg 60
atttcatcgc gctcgggcag atatttggtg gcaccttcgt ggcgcgcggc ggtgtacagc 120
accccggtga ccacattgat cacagcacct gccacgacct cgccgtcgat cgccgcagcg 180
atcgagacgg cgtattgggg caggtcataa aggaagttga cggtgccgtc aatggggtcg 240
acgatccagg taactccgct tatcgacgcc gtccccgtcc cttcctcgcc tatcagcccg 300
tctttaggcc gaagttcctg caacctattg gcgataaaat cttcagccaa agtatctact 360
atcgtcaccg gatcgactgt cgaacttttg gtgttggtgt agtcccacaa attggtgagt 420
tcagcacgct tatccctgat acgtacagcg gtaagcgtgg cagtttccgc ggcgatggca 480
cgcaactcat taaacgattg ttgttccata agaccatcat cgttgttttt ttagaaaatt 540
gcctgccaaa agccgaagta atttgtacac ttgggcgc 578
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> C.glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(500)
<223> Promoter of Cgl2134
<400> 2
ttgcctctag tgggactggc tatgaaccga acgcagtgcc ggactacatc cgatgatttt 60
ctcattgatc ccctgcatat cactgacggt gatgtaggcg aggaaatcga agcatatcta 120
gtgggtgcct actgcatcga agatgagctg attttacgcc ggcgaatccg cttcccgaga 180
ggagtcaaac caggagatat catcggaatt cctaacaccg caggatactt catgcatatc 240
ttggaaagtg catcgcacca aatcccgttg gcgaaaaatg tagtgtggcc ggaggggcag 300
ttagacgata tcgatgcgga ttaagacata accattcgct aatctttcga cgccccttct 360
gaggtgggga tttcttttca tcccctttaa ttattttcgg aaatttatac agcaatcctc 420
gaaatcctaa taaagatccc ttatcgtggg agaggtacgg tagttcgttc gaggacaacg 480
tcgagaaagg catgatttca 500
<210> 3
<211> 498
<212> DNA
<213> C.glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(498)
<223> Promoter of Cgl2754
<400> 3
atttcagcct gaaccttctc attgatgaca cttcaggctt gtgcctcctg gcactaatga 60
ggggaggttg tgatttctta catagtttag cgttcgtccg ccttgcgtac agcccggttt 120
gcaaagtttt attttgtaat tttcaaaccg atctcaattc cacgctttga gcagcacaaa 180
tgcttattgc cgtagaaaac aatacggagc ggttacaagt tgcgaagcac cctttgcaaa 240
gtttttagcg gtactttaca gctcttcacc ccccattaat ggggtctatg aaagcgcgca 300
gcgtgacaaa tctgacccca gcaaagcccc caatactccc cgactggcct ttattagtct 360
gcacttacca cgtatcatgg agggttgata gcagggcacc attagcagtc gcaccccgat 420
aggagtcgaa tctacaagtg gaacccccgc tcacatactc cacatttttt agaacccctt 480
taaggaatcg aactttat 498
<210> 4
<211> 498
<212> DNA
<213> C.glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(498)
<223> Promoter of Cgl2818
<400> 4
tgcttaattt cctcggcatg gttaagcggc tcggtgccgt cgattttcca ttggccttcg 60
ggcttaggct tcctggcggc acgtgctggc cgggcacttc cggtggttgt tgtcatgggg 120
agttaatcct taaagagcta gtgaagtaca tgtcactcgg tttgatctat ccgcaaactt 180
agacgtaccg ctctgtctag accaaccatt agattcatga gactgaaagc aatggagtca 240
cctaatgccc gtttaaatga attaacctgg ggatattagg ttaggttcac cgtgaatata 300
atagaccgat ctgtctagtt ttttcatgga gtttgaattt aattaagcaa aagtcttcgc 360
attgtcgcat ttcgctgcta cgtttacaga ccaagcggtc taggagtgtt aaacagcctg 420
gacttgaaac acctttaact acttgatttt cacacccttg tttccataaa agggctcacg 480
aaaggcaact tcaaacac 498
<210> 5
<211> 498
<212> DNA
<213> C.glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(498)
<223> Promoter of Cgl3029
<400> 5
atggctgcgc atactgttgc gatggttgac gcgaagcgca gtcgcgaaac cccgcaggcg 60
cctgtttccg ctgaaattga agaggccggt ggtgtgacta ttacctcgcc gattatcaac 120
aagactccgc tgaatgcccc caagattgac ttggatgcag tgcgtagagc tgcggaaact 180
acgcaagaac ccaaaaatga ttaataattg agacaagctt cccactatgt gataaagtcc 240
cattttgtga ataactcttg tctcagtcaa agcacccagt ggtggtggcg cgctaactaa 300
gcgagcctga cacctcaagt tgttttcact ttgatgaatt ttttaaggct cgtacttcgt 360
tcgacgaaga agcgggcctt ttgtggtttt tagcccacaa ccggcaagcc ctggatcgaa 420
tgaagctcgc agcgagtaat tatttgatgt ttcccagaaa ggcttcagcc ccacaatgat 480
ttcctcggta ggtgcccc 498
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl1910 gene
<400> 6
ttggatccaa ccccgtagca accagc 26
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl1910 gene
<400> 7
gaggatccgc gcccaagtgt acaaatt 27
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2134 gene
<400> 8
atggatcctt gcctctagtg ggactg 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2134 gene
<400> 9
taggatcctg aaatcatgcc tttctcg 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2754 gene
<400> 10
taggatccat ttcagcctga accttc 26
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2754 gene
<400> 11
caggatccat aaagttcgat tccttaaa 28
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2818 gene
<400> 12
acggatcctg cttaatttcc tcggca 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl2818 gene
<400> 13
atggatccgt gtttgaagtt gccttt 26
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl3029 gene
<400> 14
aaggatccat ggctgcgcat actgttg 27
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplifying the promoter of Cgl3029 gene
<400> 15
atggatccgg ggcacctacc gaggaa 26
Claims (5)
- (a) 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오타이드 서열:(b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상의 상동성을 가지고 프로모터로 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열; 및(c)상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택된 L-라이신-유도성(L-lysine-inducible) 프로모터 핵산 분자.
- 제1항의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제2항의 벡터로 형질전환된 원핵 숙주세포.
- 제3항에 있어서, 코리네형 세균인 숙주세포.
- 제1항의 L-라이신-유도성 프로모터 핵산 분자를 사용하여, 목적 유전자의 발현을 유도하는 방법.
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