CN117417955A - 一种产赖氨酸的重组微生物及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种产赖氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。本发明提供的重组微生物的构建方法，通过代谢工程手段，对与赖氨酸合成相关的特定基因的表达进行了优化，包括使出发菌株强化表达基因lysC、asd、dapA、dapB和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapD的步骤。进一步包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd、pyc、aspA、aceA、aceB、lysG和lysE，以及失活或弱化表达基因hom、ldhA和gntR，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。最终获得的基因工程菌株可用于赖氨酸的高效发酵生产。

Description

一种产赖氨酸的重组微生物及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种产赖氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
谷氨酸棒杆菌用于生产氨基酸的历史可追溯到20世纪60年代，谷氨酸棒杆菌可以在自然环境下生产谷氨酸，诱变的谷氨酸棒杆菌还可以生产赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸。随着代谢工程技术和基因组测序技术的快速发展，对谷氨酸棒杆菌的代谢路径研究越来越清晰，研究者们陆续鉴定到很多遗传学上的高产机理，并实现了多种代谢产物的高效生产。
L-赖氨酸是碱性必需氨基酸，分子式为C6H14N2O2，外观为白色或近乎于白色结晶粉末。L-赖氨酸在210℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。L-赖氨酸广泛应用于动物饲料、医药和食品工业，其中L-赖氨酸约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料的质量和利用效价。随着发展，人们对肉类食物的需求日益增加。作为主要的饲料添加剂，L-赖氨酸的需求量呈上升趋势增长。
目前，L-赖氨酸的主流生产方法为微生物发酵法，微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。赖氨酸工业生产菌株包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，谷棒菌株由于其生物安全性，制备低含量饲料产品时无需考虑内毒素残留问题，比大肠杆菌更具有市场竞争优势。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性细菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
天然的谷氨酸棒杆菌即可用于生产氨基酸，比如谷氨酸和赖氨酸，进一步通过诱变或基因工程改造后，菌种的生产性能可大大提高。对于高性能的生产菌种，其后期提升的空间极小，且容易发生代谢不稳定的现象，给工业生产带来波动和影响生产成本。
因此，有必要对谷氨酸棒杆菌发酵生产氨基酸进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种可高效、稳定生产赖氨酸的重组微生物。
本发明的技术方案如下：
一种重组微生物的构建方法，其包括使出发菌株强化表达基因lysC、asd、dapA、dapB和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapD的步骤。
本发明的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd的步骤。
本发明的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因pyc、aspA、aceA和aceB，并失活或弱化表达基因hom和ldhA，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。
本发明的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因lysG和lysE，并失活或弱化表达基因gntR的步骤。
本发明经过多年的菌种研发和生产分析，通过代谢工程手段，对出发菌株中，赖氨酸合成相关的基因进行表达优化。优选经过十步遗传操作，实现对赖氨酸合成相关的二十个关键基因的表达/识别性能的特定优化，从而获得赖氨酸生产性能提升的发酵菌。
本发明首先，优先强化末端合成途径，包括对以下基因lysC、asd、dapA、dapB、ddh进行表达强化，和对dapD基因进行失活改造。
其次，强化还原力辅因子的供应，包括对以下基因tkt、gnd进行强化表达。
再次，对中央代谢进行优化，目的是将代谢流平衡的牵引到天冬氨酸节点，进而强化赖氨酸的合成供应。涉及到的基因包括糖酵解、柠檬酸循环和乙醛酸循环，优选对以下基因pyc、aspA、aceA、aceB进行强化，对以下基因ldhA进行弱化或失活改造，并弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性。
最后，强化赖氨酸外排蛋白的表达，强化的方式可为增加基因的拷贝数，同时增加外排蛋白的编码基因和其感应蛋白的编码基因的拷贝数。拷贝数的增加可以是原位串联，也可以是异位插入，或者同时对其他目标缺失基因进行失活插入改造。
本发明优选同时失活转录调控因子gntR。对于特定转录调控因子进行干扰，可以影响菌株的全局调控，进而影响菌株性能。
本发明的构建方法中，强化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更强的启动子；
(2)增加基因的拷贝数；
(3)对基因的编码区进行突变(使其在氨基酸水平发生变化)；
和/或，失活或弱化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更弱的启动子；
(2)减少基因的拷贝数；
(3)对基因的编码区进行突变(使其在氨基酸水平发生变化)。
基因的弱化或失活改造优选对基因的编码区进行缺失突变，或同时进行其他基因的插入改造，一步实现目标缺失基因的失活改造和目标过表达基因的异位插入改造。
优选，本发明的构建方法中，通过突变lysC基因的启动子，并改变lysC基因的起始密码子来强化lysC基因的表达；和/或，
通过突变lysC基因的启动子，来强化asd基因的表达(asd基因的表达受lysC基因的启动子调控，故通过突变lysC基因的启动子可同时实现lysC基因和asd基因的表达强化)；
和/或，通过缺失dapD基因，并在dapD基因缺失处增加一个ddh基因拷贝来同时失活dapD基因并强化ddh基因的表达；
和/或，通过缺失pck基因，并在pck基因缺失处增加一个dapB-dapA基因拷贝来同时失活pck基因并强化dapB-dapA基因的表达；
和/或，通过在gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子来强化gnd基因的表达；
和/或，通过突变tkt基因的启动子来强化tkt基因的表达；
和/或，通过缺失hom基因，并在hom基因缺失处增加一个突变的pyc基因拷贝来同时失活hom基因并强化pyc基因的表达；
和/或，通过缺失ldhA基因，并在ldhA基因缺失处增加一个aspA基因拷贝来同时失活ldhA基因并强化aspA基因的表达；
和/或，通过突变aceA、aceB基因的启动子，并更改ramB基因对aceA、aceB基因的识别序列来强化aceA和aceB基因的表达；
和/或，通过在icd基因的编码区引入突变来弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性；
和/或，通过缺失gntR基因，并在gntR基因缺失处增加一个lysG-lysE基因拷贝来同时失活gntR基因并强化lysG-lysE基因的表达。
本发明中，各野生型基因为本领域公知的基因，如野生型lysC基因的NCBI编号为NCgl0247、野生型dapD基因的NCBI编号为NCgl1061、野生型ddh基因的NCBI编号为NCgl2528、野生型pck基因的NCBI编号为NCgl2765、野生型dapB的NCBI编号为NCgl1898、野生型dapA基因的NCBI编号为NCgl1896、野生型gnd基因的NCBI编号为NCgl1396、野生型tkt基因的NCBI编号为NCgl1512、野生型hom基因的NCBI编号为NCgl1136、野生型pyc基因的NCBI编号为NCgl0659、野生型ldhA基因的NCBI编号为NCgl2810、野生型aspA基因的NCBI编号为NCgl1446、野生型aceA的NCBI编号为NCgl2248、野生型aceB基因的NCBI编号为NCgl2247、野生型icd基因的NCBI编号为NCgl0634、野生型icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的NCBI编号为NCgl0634、野生型gntR基因的NCBI编号为NCgl2440、野生型lysG的NCBI编号为NCgl1215、野生型lysE基因的NCBI编号为NCgl1214。
为达到快速构建的效果，本发明对关键靶点进行了组合优化，单次改造可同时实现调控2个基因的表达。最终，通过10轮遗传操作，实现对多个基因的组合优化，最终获得的基因工程菌经过5L罐测试，具有高产赖氨酸的效果。
更优选，本发明的构建方法中，强化lysC基因的表达时，以野生型lysC基因的启动子为参考序列，将第331至336位核苷酸突变为TATAAT，且将lysC基因的起始密码子由GTG替换为ATG；所述野生型lysC基因的启动子的序列如SEQ ID No.60所示；
强化gnd基因的表达时，在gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子，所述人工强启动子的序列如SEQ ID No.2所示；
强化tkt基因的表达时，以野生型tkt基因的启动子为参考序列，将第209-219位核苷酸突变为TGTGGTATCAT(SEQ ID No.65)，所述野生型tkt基因的启动子的序列如SEQ IDNo.61所示；
强化pyc基因的表达时，在pyc基因的起始密码子前引入人工强启动子，所述人工强启动子的序列如SEQ ID No.2所示；
强化aceA和aceB基因的表达时，以相邻的野生型aceA和aceB基因的中间间隔序列为参考序列，分别将第117-127位突变为CCATTATACCA(SEQ ID No.63)，将第205-207位突变为CTC，以及将第400-411位突变为GTGGTATAATGG(SEQ ID No.64)；所述中间间隔序列如SEQID No.62所示；
弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性时，以野生型icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶为参考序列，将第407位的氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸；
和/或，所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌(如，谷氨酸棒杆菌模式株ATCC 13032)。
本发明还提供一种重组微生物，其由上述构建方法构建得到。
本发明还提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产赖氨酸中的应用；
(2)在用于生产赖氨酸的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高生物法合成赖氨酸的性能中的应用。
本发明还提供一种发酵生产赖氨酸的方法，其包括培养上述重组微生物的步骤。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种高性能赖氨酸生产菌种的构建方法，该方法具有可重复性，构建步骤少，周期短的特点，并且获得的基因工程菌种性能优良稳定，可容易进行工业放大。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体地，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明的实施例所使用的引物序列信息如表1所示。本发明实施例所涉及的遗传改造基因靶点如表2所示。
表1引物序列信息(SEQ ID No.6-59)
表2实施例与遗传改造基因靶点信息
实施例1突变lysC基因的启动子，并将lysC基因的起始密码子由GTG替换为ATG1.1构建工程质粒pK18-PlysC*-A1G
含有突变的lysC基因的启动子的序列如序列SEQ ID No.1所示，该序列同时包含部分编码区，编码区的起始密码子为ATG。序列SEQ ID No.1的第1位至第300位核苷酸为启动子区，第301位至第350位为部分编码区。序列SEQ ID No.1可通过第三方基因合成公司进行全序列合成，也可通过特定引物PCR扩增及多轮片段融合方式引入目的突变。本实施例通过第三方基因合成公司进行全序列合成。
以ATCC 13032基因组(谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)模式株ATCC13032可从公开渠道购买。其基因组序列已公开，可从NCBI网站进行查询)为模板，以lysC-1f/lysC-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段lysC-up。以ATCC 13032基因组为模板，以lysC-2f/lysC-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段lysC-dn。以序列SEQ ID No.1为模板，以lysC-f/lysC-r引物对进行PCR扩增，得到目标替换片段PlysC*-A1G。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4 DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-PlysC*-A1G。
1.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)中描述的方法制备谷棒模式菌ATCC13032的感受态细胞及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-PlysC*-A1G转化至ATCC13032感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对lysC-1f/lysC-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G，菌株命名为SCK001。
实施例2缺失dapD基因，并在dapD基因缺失处增加一个ddh拷贝
2.1构建工程质粒pK18-dapD::ddh
以ATCC 13032基因组为模板，以dapD-1f/dapD-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段dapD-up。以ATCC 13032基因组为模板，以dapD-2f/dapD-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段dapD-dn。以ATCC 13032基因组为模板，以ddh-f/ddh-r引物对进行PCR扩增，得到目标插入基因片段ddh。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4 DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-dapD::ddh。
2.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例1所获得的菌株SCK001的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-dapD::ddh转化至SCK001感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对dapD-1f/dapD-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh，菌株命名为SCK002。
实施例3缺失pck基因，并在pck基因缺失处增加一个dapB-dapA拷贝
3.1构建工程质粒pK18-pck::dapB-dapA
以ATCC 13032基因组为模板，以pck-1f/pck-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段pck-up。以ATCC 13032基因组为模板，以pck-2f/pck-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段pck-dn。以ATCC 13032基因组为模板，以dapB-f/dapA-r引物对进行PCR扩增，得到目标插入基因片段dapB-dapA。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4 DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-pck::dapB-dapA。
3.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例2所获得的菌株SCK002的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-pck::dapB-dapA转化至SCK002感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对pck-1f/pck-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA，菌株命名为SCK003。
实施例4gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子
4.1构建工程质粒pK18-gndPpyc*
人工强启动子的序列如SEQ ID No.2所示，该序列为含有点突变的pyc基因的启动子。本发明通过启动子活性测定，发现该突变的启动子比其他公知的强启动子具有更强的表达活性。序列SEQ ID No.2可通过第三方基因合成公司进行全序列合成，也可通过特定引物PCR扩增及片段融合方式引入目的突变。本实施例通过第三方基因合成公司进行全序列合成。
以ATCC 13032基因组为模板，以gnd-1f/gnd-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段gnd-up。以ATCC 13032基因组为模板，以gnd-2f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段gnd-dn。以序列SEQ ID No.2为模板，以Ppyc-f/Ppyc-r引物对进行PCR扩增，得到携带融合区域的目标人工启动子片段Ppyc*。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-gndPpyc*。
4.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例3所获得的菌株SCK003的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-gndPpyc*转化至SCK003感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对gnd-1f/gnd-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*，菌株命名为SCK004。
实施例5tkt基因的启动子-10区引入点突变
5.1构建工程质粒pK18-Ptkt*
对tkt基因的启动子进行突变改造，包含将其-10区由TAACCT突变为TATCAT的突变，突变后的序列如序列SEQ ID No.3所示。序列SEQ ID No.3包含部分编码区。序列SEQ IDNo.3的第1位至第300位核苷酸为突变后的启动子区，第301位至第500位为部分编码区。序列SEQ ID No.3可通过第三方基因合成公司进行全序列合成，也可通过特定引物PCR扩增及片段融合方式引入目的突变。本实施例通过第三方基因合成公司进行全序列合成。
以全基因合成的上述序列SEQ ID No.3为模板，以tkt-f/tkt-r引物对进行PCR扩增，得到含有目标点突变的基因重组的同源片段Ptkt*。该片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-Ptkt*。
5.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例4所获得的菌株SCK004的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-Ptkt*转化至SCK004感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对tkt-f/tkt-r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*，菌株命名为SCK005。
实施例6缺失hom基因，并在hom基因缺失处增加一个pyc拷贝
6.1构建工程质粒pK18-hom::pyc458
本实施例是在hom基因处插入pyc基因，且pyc基因的编码区携带点突变，导致其在氨基酸水平具有突变，其第458位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸。一步实现基因的插入及失活，方法同前述实施例2和实施例3。
首先进行质粒构建，以ATCC 13032基因组为模板，以hom-1f/hom-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段hom-up。以ATCC 13032基因组为模板，以hom-2f/hom-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段hom-dn。携带点突变的pyc的基因序列见序列SEQ ID No.4所示。序列SEQ ID No.4同时包含突变的pyc的启动子区域。序列SEQ ID No.4的第1位至第200位为突变的启动子区域(人工强启动子SEQ ID No.2)，序列SEQ ID No.4的第201位至第3623位为基因的编码区。以序列SEQ ID No.4为模板，以pyc458-f/pyc458-r引物对进行PCR扩增，得到目标插入基因片段pyc458。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4 DNALigase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-hom::pyc458。
6.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例5所获得的菌株SCK005的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-hom::pyc458转化至SCK005感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对hom-1f/hom-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458，菌株命名为SCK006。
实施例7缺失ldhA基因，并在ldhA基因缺失处增加一个aspA拷贝
7.1构建工程质粒pK18-ldhA::aspA
本实施例是在ldhA基因处插入aspA基因。一步实现基因的插入及失活，方法同前述实施例2和实施例3。
首先进行质粒构建，以ATCC 13032基因组为模板，以ldhA-1f/ldhA-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段ldhA-up。以ATCC 13032基因组为模板，以ldhA-2f/ldhA-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段ldhA-dn。以ATCC 13032基因组为模板，以aspA-f/aspA-r引物对进行PCR扩增，得到目标插入基因片段aspA，该片段包含aspA的编码区及其天然启动子区域。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段用XbaI、NheI进行双酶切，并用胶回收试剂盒进行产物回收。质粒载体为pK18mobsacB(GenBank:FJ1287239.1)，该载体用同样的限制性内切酶双酶切，并进行胶回收处理。酶切及胶回收后的片段和载体以T4 DNA Ligase进行连接，并转化至Trans1 T1感受态细胞，获得的转化子提取质粒进行测序确认，并命名为pK18-ldhA::aspA。
7.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例6所获得的菌株SCK006的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-ldhA::aspA转化至SCK006感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对ldhA-1f/ldhA-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA，菌株命名为SCK007。
实施例8突变aceA、aceB基因的启动子，并更改ramB基因对aceA、aceB基因的识别序列
8.1构建工程质粒pK18-aceAB-ramB
aceA和aceB两个基因在谷氨酸棒杆菌染色体上是相邻的，但其编码方向相反，因此，两个基因的启动子区域是紧邻的，并且两个启动子中间是转录调控因子ramB的识别位点。因此，本实施例通过突变2个基因的启动子区域和其ramB识别区域(aceA和aceB基因的中间间隔序列)，来达到强化基因表达的目的。突变后的中间间隔序列如序列SEQ ID No.5所示，该序列的第1位至第145位是aceA的启动子区域，第146位至第239位是ramB的识别区域，第240位至第598位是aceB的启动子区域。序列SEQ ID No.5可通过第三方基因合成公司进行全序列合成，也可通过特定引物PCR扩增及多轮片段融合方式引入目的突变。本实施例通过第三方基因合成公司进行全序列合成。
以ATCC 13032基因组为模板，以aceA-1f/aceA-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段aceA-up。以ATCC 13032基因组为模板，以aceB-2f/aceB-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段aceB-dn。以序列SEQ ID No.5为模板，以aceA-f/aceB-r引物对进行PCR扩增，得到目标替换启动子片段aceAB-ramB。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段与质粒载体的连接同前述实施例。对最终获得的质粒进行测序确认，并命名为pK18-aceAB-ramB。
8.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例7所获得的菌株SCK007的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-aceAB-ramB转化至SCK007感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去，并同时引入目的突变。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的转化子应携带目的突变，且不携带插入的载体序列。进一步通过PCR扩增(使用引物对aceA-1f/aceB-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB，菌株命名为SCK008。
实施例9异柠檬酸脱氢酶(icd)编码区引入突变，导致其407位甘氨酸变为丝氨酸
9.1构建工程质粒pK18-icdG407S
以ATCC 13032基因组为模板，以icd-1f/icd-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段icd407-up。以ATCC 13032基因组为模板，以icd-2f/icd-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段icd407-dn。将以上获得的二个片段进行融合PCR，获得两片段融合的全长片段。全长片段与质粒载体的连接同前述实施例。对最终获得的质粒进行测序确认，并命名为pK18-icdG407S。
9.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB,icdG407S
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例8所获得的菌株SCK008的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-icdG407S转化至SCK008感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。后续的筛选及鉴定同前述实施例。最后通过PCR扩增(使用引物对icd-1f/icd-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB,icdG407S，菌株命名为SCK009。
实施例10缺失gntR基因，并在gntR基因缺失处增加一个lysG-lysE拷贝
10.1构建工程质粒pK18-gntR::lysG-lysE
本实施例是在gntR基因处插入lysG-lysE基因。一步实现基因的插入及失活，方法同前述实施例2和实施例3。
首先进行质粒构建，以ATCC 13032基因组为模板，以gntR-1f/gntR-1r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的上游同源臂片段gntR-up。以ATCC 13032基因组为模板，以gntR-2f/gntR-2r引物对进行PCR扩增，得到基因重组的下游同源臂片段gntR-dn。以ATCC 13032基因组为模板，以lysG-f/lysE-r引物对进行PCR扩增，得到目标插入基因片段lysG-lysE，该片段包含lysG、lysE基因的编码区及其天然启动子区域。将以上获得的三个片段进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。全长片段与质粒载体的连接同前述实施例。对最终获得的质粒进行测序确认，并命名为pK18-gntR::lysG-lysE。
10.2构建工程菌株13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB,icdG407S,gntR::lysG-lysE
按照实施例1中描述的制备模式菌13032的感受态细胞的方法，制备实施例9所获得的菌株SCK009的感受态细胞，及进行电击转化和重组菌株的筛选。
以电击的方法将上述获得的重组质粒pK18-gntR::lysG-lysE转化至SCK009感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。后续的筛选及鉴定同前述实施例。最后通过PCR扩增(使用引物对gntR-1f/gntR-2r)及核苷酸测序分析确认重组成功。
最终获得的目的改造菌株的基因型为13032,PlysC*-A1G,dapD::ddh,pck::dapB-dapA,gndPpyc*,Ptkt*,hom::pyc458,ldhA::aspA,aceAB-ramB,icdG407S,gntR::lysG-lysE，菌株命名为SCK010。
实施例11 5L罐测试SCK010菌株的赖氨酸发酵能力
对获得的基因工程菌株SCK010进行发酵验证，同时以本研究室之前开发的赖氨酸高产菌CGMCC No.13407(参见中国专利CN106635944A中的MHZ-0913-3，其分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13407)进行对照实验。
使用百伦四联5L发酵罐，同期进行改造菌和对照菌的验证。发酵培养基配方如表3所示，控制工艺如表4所示。
表3发酵培养基配方
表4工艺控制参数
发酵测试结果如表5所示。对照菌和改造菌各平行发酵三个批次，取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与对照菌发酵液中的赖氨酸含量，以三个批次的平均值作为最终实验结果。取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562nm处检测OD，以三个批次的平均值作为最终实验结果。
表5 L-赖氨酸发酵实验结果
上述发酵实验结果显示，利用本发明所提供的构建方法，可以获得高性能赖氨酸生产菌种，相比之前本实验室开发的赖氨酸生产菌种具有更高的糖酸转化率，具有显著的性能指标优势。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种重组微生物的构建方法，其特征在于，包括使出发菌株强化表达基因lysC、asd、dapA、dapB和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapD的步骤。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd的步骤。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因pyc、aspA、aceA和aceB，并失活或弱化表达基因hom和ldhA，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因lysG和lysE，并失活或弱化表达基因gntR的步骤。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，强化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更强的启动子；
(2)增加基因的拷贝数；
(3)对基因的编码区进行突变；
和/或，失活或弱化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更弱的启动子；
(2)减少基因的拷贝数；
(3)对基因的编码区进行突变。
6.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，通过突变lysC基因的启动子，并改变lysC基因的起始密码子来强化lysC基因的表达；和/或，
通过突变lysC基因的启动子，来强化asd基因的表达；
和/或，通过缺失dapD基因，并在dapD基因缺失处增加一个ddh基因拷贝来同时失活dapD基因并强化ddh基因的表达；
和/或，通过缺失pck基因，并在pck基因缺失处增加一个dapB-dapA基因拷贝来同时失活pck基因并强化dapB-dapA基因的表达；
和/或，通过在gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子来强化gnd基因的表达；
和/或，通过突变tkt基因的启动子来强化tkt基因的表达；
和/或，通过缺失hom基因，并在hom基因缺失处增加一个突变的pyc基因拷贝来同时失活hom基因并强化pyc基因的表达；
和/或，通过缺失ldhA基因，并在ldhA基因缺失处增加一个aspA基因拷贝来同时失活ldhA基因并强化aspA基因的表达；
和/或，通过突变aceA、aceB基因的启动子，并更改ramB基因对aceA、aceB基因的识别序列来强化aceA和aceB基因的表达；
和/或，通过在icd基因的编码区引入突变来弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性；
和/或，通过缺失gntR基因，并在gntR基因缺失处增加一个lysG-lysE基因拷贝来同时失活gntR基因并强化lysG-lysE基因的表达。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
强化lysC基因的表达时，以野生型lysC基因的启动子为参考序列，将第331至336位核苷酸突变为TATAAT，且将lysC基因的起始密码子由GTG替换为ATG；所述野生型lysC基因的启动子的序列如SEQ ID No.60所示；
强化gnd基因的表达时，在gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子，所述人工强启动子的序列如SEQ ID No.2所示；
强化tkt基因的表达时，以野生型tkt基因的启动子为参考序列，将第209-219位核苷酸突变为TGTGGTATCAT，所述野生型tkt基因的启动子的序列如SEQ ID No.61所示；
强化pyc基因的表达时，在pyc基因的起始密码子前引入人工强启动子，所述人工强启动子的序列如SEQ ID No.2所示；
强化aceA和aceB基因的表达时，以相邻的野生型aceA和aceB基因的中间间隔序列为参考序列，分别将第117-127位突变为CCATTATACCA，将第205-207位突变为CTC，以及将第400-411位突变为GTGGTATAATGG；所述中间间隔序列如SEQ ID No.62所示；
弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性时，以野生型icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶为参考序列，将第407位的氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸；
和/或，所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
8.一种重组微生物，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到。
9.权利要求8所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产赖氨酸中的应用；
(2)在用于生产赖氨酸的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高生物法合成赖氨酸的性能中的应用。
10.一种发酵生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括培养权利要求8所述的重组微生物的步骤。
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