CN109929888B - 改进的l-赖氨酸的发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造棒杆菌属细菌染色体上编码DNA甲基化酶的基因，使DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低；和，用改造而得到的细菌发酵生产l‑赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的细菌等。

Description

改进的L-赖氨酸的发酵生产方法

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。

背景技术

通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。

产L-赖氨酸的细菌包括棒杆菌属的细菌。例如，中国专利CN1017906B公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含合成二氢二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶的重组DNA的棒状杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1187539A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码天冬氨酸激酶和编码二氨基庚二酸脱羧酶的重组DNA的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1310234A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脱氢酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN1890372A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN101065484A公开了具有产生Ｌ－氨基酸的能力的棒菌属细菌，其被修饰使得乙酰辅酶Ａ水解酶活性减少。

中国专利申请CN101855357A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用在编码果糖-PTS酶的ptsF基因上具有突变的谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。

中国专利申请CN104245921A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。

上述生产L-赖氨酸的文献都没有启示改造DNA甲基化酶（尤其是腺嘌呤特异性DNA甲基化酶）或其基因能提高生产L-赖氨酸的效率。

本发明人经过长期研究和实践，经历了众多的失败，凭借了一些运气，偶然发现在棒杆菌的染色体中对一个编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量。该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于多种细菌发酵生产L-赖氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：

（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因使得该基因的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，例如可以在该基因中插入无义密码子，也可以敲除该基因。也可以通过改造该基因的调控序列来间接改造该基因，从而使其编码的蛋白质的活性和/或表达量降低。

这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造。因此，在本文中，改造优选是通过同源重组进行的改造，更优选是通过同源重组进行的敲除。

在本文中，腺嘌呤特异性DNA甲基化酶优选是NCBI参考序列NP_600130.1（简称为NP_600130.1），其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NCgl0866）。编码NP_600130.1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。在本发明的具体实施方式中，NCgl0866基因被敲除后（即，它的活性和/或表达量消失），赖氨酸的产量提高了。因此，在本文中，腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量优选消失。

相应地，本发明还提供了其他的应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：

（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低，优选消失；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。

又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造棒杆菌属细菌染色体上编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低，优选消失。

还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造棒杆菌属细菌染色体上编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低，优选消失。

在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“细菌”或“棒杆菌属细菌”是未改造或改造前的细菌或棒杆菌属细菌，其染色体具有野生型的编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因。

L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数棒杆菌属细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸。现有技术没有在赖氨酸生产/发酵中关注过编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因，因此现有技术中的产L-赖氨酸的棒杆菌属细菌通常都带有野生型的编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因基本上都可以采用本发明的方法进行改造，提高L-赖氨酸的发酵量。在本文中，棒杆菌属细菌包括谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌，优选是谷氨酸棒杆菌。

更本质地，在第五方面，本发明提供了改造细菌的方法，其包括改造棒杆菌属细菌的方法，其包括改造棒杆菌属细菌染色体上编码腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低，优选消失。

本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生l-赖氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。本发明第六方面的细菌是棒杆菌属细菌，其染色体上编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因座位的核苷酸序列不同于编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因的核苷酸序列，优选其染色体上编码NCBI参考序列NP_600130.1的基因被敲除。

在第七方面，本发明提供了腺嘌呤特异性DNA甲基化酶（优选是NCBI参考序列NP_600130.1）和/或其编码基因在棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸中的应用。尽管可能增加NCBI参考序列NP_600130.1的活性和/或表达量能够用于降低棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸的产量，但是优选所述应用为NCBI参考序列NP_600130.1的活性和/或表达量降低（优选消失，如将其编码基因敲除）的应用，用于提高棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸的产量。其中，NCBI参考序列NP_600130.1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在第八方面，本发明提供了筛选对棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸有影响的基因的方法，其包括：

（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码DNA甲基化酶的基因，使DNA甲基化酶的活性和/或表达量上升或降低；

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸；和，

（3）将步骤（2）得到的L-赖氨酸产量同未改造的棒杆菌属细菌的L-赖氨酸产量进行比较。

优选在本发明第八方面的方法中，影响是增强，而且使DNA甲基化酶的活性和/或表达量降低，优选消失，如将编码DNA甲基化酶的基因敲除。

本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式，而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸的棒杆菌属细菌的染色体改造位点没有冲突，从而在实践上可用于进一步提高L-赖氨酸的产量。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1 NCgl0866基因表达下调实验

根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl0866基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下（上海英俊公司合成）：

P7: 5' CGGAATTCGATGCCTGC GGGATGACGA 3'（BamH1）

P8: 5'GATGACGAAG GAGCCCCTAT CCAGAGCCAC CAAACCTGGG ACG3'

P9: 5'CGTCCCAGGT TTGGTGGCTC TGGATAGGGG CTCCTTCGTC ATC3'

P10: 5' CGGGATCCCCTAAACCCTGTCTCAAATCAC 3'(EcoR1)

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P7/P8及P9/P10，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段680bp及下游同源臂片段800bp再用引物P7/P10进行OVER PCR得到整个同源臂片段1480bp，两端分别含有EcoR1和BamH1酶切位点。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1480bp的DNA片段，并通过酶切回收连接，与穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。

将敲除质粒电转化入赖氨酸生产专利菌株YP97136（其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl0866基因），对培养产生的单菌落分别通过如下引物（上海英俊公司合成）进行PCR鉴定：

P11:5' CGCTACGGCGTCCAAGGAGT 3'

P12: 5' GTGCCCTAAGGCTGAATAAC 3'

上述PCR扩增出大小1900bp及750bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1900bp条带的菌株为原菌。阳性菌株分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P11/P12引物进行PCR鉴定，扩增出大小为750bp条带的菌株为Ncgl0866基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-4-002。

实施例2赖氨酸发酵实验

将实施例1构建的菌株和原始菌株在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以表1所示的培养基和表2所示的过程进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。

表1 发酵培养基配方

表2 发酵过程

表3 赖氨酸发酵实验结果

结果如表3所示，在棒杆菌中对NCgl0866进行点突变，有助于L-赖氨酸产量的提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> 改进的L-赖氨酸的发酵生产方法

<130> CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 1

gtgtcgagac tgacggaact gctgcggcag gtgcgcaagg cggacgcgca acttggtact 60

gacctggaag ccgaggtcgc tgcgctgacc aagcgtcgcaccttcgggct cgtctttgag 120

cagcatcagc ctgaggctgt cgagctgccc ggcagggtcg tccgtcgcgg cgacaaggtg 180

cgggtgctgc ctccgcgagg ggggacaaag gcaggtgacc aacggctgtg gcggacaact 240

cggatcgagt gcgtcgacgg gcagcgtgtg gctcatctcg cggagctcga cgtcgaagaa 300

cccgagactc gggcagtgct tgccgacgac gtggtggtcg tcgcggagtt ccgggatcgc 360

atctaccccg gcctggtgga gacaggcagg gttgagcggg gcggcgacaa gccgttccac 420

acggtcgtca acgctgagaa ctaccacgcg ctggagatgc tgacctatac gcaccggcat 480

tccatcgacg ccatctacat cgacccgccg tacaacaccg gggcgaggga ctggaagtac 540

gacaacgatt acgtcgcgag tgatgacgac tatcgacact cgaaatggct ggcgttcatg 600

gagcgacggt tgaagatctg tcgggagctc atgcgtagcg atgctactct tgtggcaact 660

atcgatgagc atgaagtaaa ccgtttgggc gtgttgctag atcagctctt cccggaatct 720

acgcggcaac tcgtcacaat tgtcaacaac cctaaaggcg ttactcaggg atatctttcg 780

agggtcgaag agtatgcgtt ctttgtattt ggtcctgacg cgcgaatcgg ttcggtcgat 840

gacgaccttc tgacgcatcg agacatggcc gatgctgaag gggaactgca gaggcctcga 900

tggaaggggc tcttgcggtc gggcgacgac tcgcttcgag ctgaccgtaa agatatgttc 960

tatccggtgt ggttcgatga gtcgactggg cgactcagcc acgcgggcga agcattgcca 1020

cttgacgaaa ctcctgactt cagtccgcag gatggcctga cgccgatctg gcctattagg 1080

cgggacatga aggaggggcc tacccgggca gcgccacgcc gttcgatcct tgactacgcg 1140

ctacaccctc atctgtga 1158

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 2

Met Ser Arg Leu Thr Glu Leu Leu Arg Gln Val Arg Lys Ala Asp Ala

1 5 10 15

Gln Leu Gly Thr Asp Leu Glu Ala Glu Val Ala Ala Leu Thr Lys Arg

20 25 30

Arg Thr Phe Gly Leu Val Phe Glu Gln His Gln Pro Glu Ala Val Glu

35 40 45

Leu Pro Gly Arg Val Val Arg Arg Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Pro

50 55 60

Pro Arg Gly Gly Thr Lys Ala Gly Asp Gln Arg Leu Trp Arg Thr Thr

65 70 75 80

Arg Ile Glu Cys Val Asp Gly Gln Arg Val Ala His Leu Ala Glu Leu

85 90 95

Asp Val Glu Glu Pro Glu Thr Arg Ala Val Leu Ala Asp Asp Val Val

100 105 110

Val Val Ala Glu Phe Arg Asp Arg Ile Tyr Pro Gly Leu Val Glu Thr

115 120 125

Gly Arg Val Glu Arg Gly Gly Asp Lys Pro Phe His Thr Val Val Asn

130 135 140

Ala Glu Asn Tyr His Ala Leu Glu Met Leu Thr Tyr Thr His Arg His

145 150 155 160

Ser Ile Asp Ala Ile Tyr Ile Asp Pro Pro Tyr Asn Thr Gly Ala Arg

165 170 175

Asp Trp Lys Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Ala Ser Asp Asp Asp Tyr Arg

180 185 190

His Ser Lys Trp Leu Ala Phe Met Glu Arg Arg Leu Lys Ile Cys Arg

195 200 205

Glu Leu Met Arg Ser Asp Ala Thr Leu Val Ala Thr Ile Asp Glu His

210 215 220

Glu Val Asn Arg Leu Gly Val Leu Leu Asp Gln Leu Phe Pro Glu Ser

225 230 235 240

Thr Arg Gln Leu Val Thr Ile Val Asn Asn Pro Lys Gly Val Thr Gln

245 250 255

Gly Tyr Leu Ser Arg Val Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Val Phe Gly Pro

260 265 270

Asp Ala Arg Ile Gly Ser Val Asp Asp Asp Leu Leu Thr His Arg Asp

275 280 285

Met Ala Asp Ala Glu Gly Glu Leu Gln Arg Pro Arg Trp Lys Gly Leu

290 295 300

Leu Arg Ser Gly Asp Asp Ser Leu Arg Ala Asp Arg Lys Asp Met Phe

305 310 315 320

Tyr Pro Val Trp Phe Asp Glu Ser Thr Gly Arg Leu Ser His Ala Gly

325 330 335

Glu Ala Leu Pro Leu Asp Glu Thr Pro Asp Phe Ser Pro Gln Asp Gly

340 345 350

Leu Thr Pro Ile Trp Pro Ile Arg Arg Asp Met Lys Glu Gly Pro Thr

355 360 365

Arg Ala Ala Pro Arg Arg Ser Ile Leu Asp Tyr Ala Leu His Pro His

370 375 380

Leu

385

<210> 3

<211> 2700

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 3

ggcccgtgtt cgatgcctgc gggatgacga tgaggttgtt gtcgacggat acctgcagcg 60

cccgccacat ctcgaccagc gtgccggggc gcaccacggc gaagactggt cctccgccga 120

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ccagggggac gacgtctgcg accgtctgcc cggaagctcg ctacggcgtc caaggagtgt 420

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ttcggaccgc ggtactttcg gactccggta ggttcggacc gcggtacttt cggactccgg 540

taggttcgga ccgcggtact ttcggactcc ggtaggttcg gaccgcgata gttcggaccg 600

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cccgcgtggc tgagtcgccc agtcgactca tcgaaccaca ccggatagaa catatcttta 900

cggtcagctc gaagcgagtc gtcgcccgac cgcaagagcc ccttccatcg aggcctctgc 960

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tgagtaacgc ctttagggtt gttgacaatt gtgacgagtt gccgcgtaga ttccgggaag 1140

agctgatcta gcaacacgcc caaacggttt acttcatgct catcgatagt tgccacaaga 1200

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gaactccacc acgtgatcct tcaacctgta tgcaactaat ctagccagtt taggactaac 1980

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gcactcgtta aggtatctga ctactgattg ctctacgatt tctttcatcg tgcgatgttc 2100

tttaaatgcc tgtagtttca accgtctatg cacactggtg gtcatgcgga cattgaacat 2160

agtgctttcc tcagtcttgg aggcggaatt ggtatcgaca aacgcttcaa caatggagcg 2220

gcgctggtgg ggtttccccg gcccaagact caactttgca acagcacctt attaagtgcc 2280

ctagagttat tcagccttag ggcaccgctc tatttcttac ggcatttccc acttttctca 2340

atggcttaaa gagcatgaaa ccgcaggaaa ccgttgtatt tctgacgtgc gaccacatta 2400

tgtaaaagac tcacctgtca gggatctatc tccttgtaga ggaactattc cagtcttctt 2460

taaaaacact tatgatcgct gtgatcaggt aatttaatga aaaaacttat agcgttaaaa 2520

cgtgatgatt ttttgacgtc aaaaagtttt agcactataa cgttatgacg ttttagtgct 2580

aaagtgtggc ttgtcagatt cgtgttggtc gtgcgcccgt atggtgattt gagacagggt 2640

ttaggagaat tagttccatg tcgaatcgca cgtcatcttc accgaagaat tcaaagcagg 2700

Claims (2)

1.发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：

（1）敲除谷氨酸棒杆菌染色体上编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因，使腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的活性和/或表达量消失；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。

2.改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是敲除谷氨酸棒杆菌染色体上编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的腺嘌呤特异性DNA甲基化酶的基因。