CN116286807A - 突变的dapA启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及突变的dapA启动子及其应用。本发明提供的突变的dapA启动子相比于野生型dapA启动子具有明显更高的启动转录的活性，能够驱动目的基因在微生物中高效表达。利用该启动子替换dapA基因的天然启动子，可使得dapA基因的表达明显增强，由此构建得到的重组菌的赖氨酸产量和转化率显著提高。该启动子可用于调控dapA基因等氨基酸合成相关基因的表达，为基因表达调控提供了新的分子工具和方法。

Description

突变的dapA启动子及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种突变的dapA启动子、含有该启动子的重组微生物及其应用。
背景技术
L-赖氨酸是一种碱性必需氨基酸，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。L-赖氨酸可促进动物机体对其他氨基酸的吸收利用，从而提高饲料质量。目前，微生物发酵法是L-赖氨酸最常用的生产方法，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是L-赖氨酸发酵生产的重要菌种。
谷氨酸棒杆菌的赖氨酸合成路径较大肠杆菌具有明显优势，其合成赖氨酸的前体二氨基庚二酸仅需要1步酶催化反应，由二氨基庚二酸脱氢酶催化完成，而大肠杆菌则需4步酶催化。二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)是谷氨酸棒杆菌生物合成二氨基庚二酸过程中的关键酶，催化天冬氨酸-β-半醛脱氢酶生成四氢吡啶二羧酸，四氢吡啶二羧酸进一步在二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)和二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)催化下合成赖氨酸的前体二氨基庚二酸。因此，提高二氢吡啶二羧酸合成酶的表达和酶活性可增加赖氨酸的前体二氨基庚二酸，进而提高赖氨酸的产量。
目前，增强谷氨酸棒杆菌中dapA基因表达的方法主要为增加该基因的拷贝数，而通过dapA基因自身启动子的改造增强其表达方面的研究仍然较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变的dapA启动子，该启动子的转录活性较野生型dapA启动子(序列如SEQ ID NO.2所示)的活性显著增强。本发明还提供了含有该启动子的重组微生物以及利用该重组微生物生产赖氨酸的方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种启动子，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的启动子是指位于基因编码区上游的非翻译核酸序列，该序列至少包含RNA聚合酶结合位点，并且具有启动下游基因转录成mRNA的活性。启动子序列中还可包括5’非翻译区，该区域是某些转录因子或调控因子的结合区域。
上述提供的启动子为突变的dapA启动子，该启动子相比于野生型dapA启动子(SEQID NO.2)的转录活性显著提高，可用于驱动dapA等基因的表达，提高其表达量。
优选地，上述突变的dapA启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
基于上述启动子，本发明提供含有所述突变的dapA启动子的表达盒。
以上所述的表达盒可为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因得到的重组DNA，或者为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因、上游或下游可操作性地连接其他转录调控元件、翻译调控元件得到的重组DNA。
对于目的基因，本发明没有特殊限制，本发明提供的启动子可驱动任意基因在谷氨酸棒杆菌中进行转录，当某一基因有与所述启动子匹配的表达强度需求时，即可使用该启动子，因此，目的基因可以为dapA基因或者除dapA基因以外的其他基因。
作为本发明的优选方案，使用所述启动子驱动dapA基因的表达，以提高谷氨酸棒杆菌dapA基因的表达量。
本发明还提供含有所述突变的dapA启动子或所述表达盒的载体。
以上所述的载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
作为本发明的优选方案，本发明提供含有所述启动子以及用于将原始dapA启动子替换为所述突变的dapA启动子的同源臂片段的同源重组载体。该同源重组载体为在pK18mobsacB载体的基础上构建得到。
本发明还提供含有所述突变的dapA启动子、所述表达盒或所述载体的宿主细胞。
以上所述的宿主细胞优选为微生物细胞。
所述微生物细胞优选为埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属细菌。其中，埃希氏菌属细菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；棒杆菌属细菌优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)或产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)；短杆菌属细菌优选为黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)或乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。
基于本发明提供的突变的dapA启动子的功能，本发明进一步提供所述突变的dapA启动子、所述表达盒、所述载体或所述宿主细胞的如下任一种应用：
(1)在微生物中驱动基因表达；
(2)在微生物中增强基因表达；
(3)提高微生物代谢产物的产量和/或转化率；
(4)构建微生物代谢产物的生产菌株；
(5)发酵生产微生物代谢产物。
上述应用中，所述代谢产物可为微生物能够合成的任意代谢产物，包括但不限于氨基酸、有机酸、核苷等。
上述应用中，所述微生物优选为棒杆菌属细菌。更优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)或产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)。
本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的上游基因间区域含有所述突变的dapA启动子。
以上所述的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的上游基因间区域具体为微生物染色体上的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的起始密码子与其上游基因的编码区之间的核苷酸序列。
优选地，所述重组微生物为重组谷氨酸棒杆菌，其二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因由所述突变的dapA启动子驱动表达。
本发明提供一种重组谷氨酸棒杆菌，其中二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因由所述突变的dapA启动子驱动表达。
具体地，所述重组谷氨酸棒杆菌中，二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的天然启动子被所述突变的dapA启动子替换。
以上所述的重组微生物的二氢吡啶二羧酸合成酶表达量显著提高，其赖氨酸及其衍生物的合成能力明显增强，具有较出发菌株更高的赖氨酸产量和转化率。
上述重组微生物的出发菌株优选为能够积累赖氨酸或其衍生物的棒杆菌属细菌。优选为能够积累赖氨酸或其衍生物的谷氨酸棒杆菌。
本发明进一步发现，上述替换二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因启动子的改造与某些特定的代谢工程靶点改造配合作用，更有利于提高赖氨酸的产量和转化率，基于此，上述重组微生物的出发菌株优选在野生型谷氨酸棒杆菌的基础上进行如下(1)或(2)的改造：
(1)突变染色体上的lysC基因，使其编码lysCT311I突变体(第311位氨基酸突变由T突变为I)；突变染色体上的pyc基因，使其编码pycP458S突变体(第458位氨基酸突变由P突变为S)；增加lysE基因的拷贝数。
(2)在染色体上的lysC中引入点突变T311I，hom中引入点突变V59A，pyc中引入点突变P458S，gnd中引入点突变S361F；增加dapA、dapB、ddh的拷贝数；改变aceE的启动子序列以弱化丙酮酸脱氢酶的表达。
作为本发明的一种优选方案，所述重组微生物的出发菌株为保藏编号为CGMCCNo.13407的赖氨酸生产菌，该菌株已于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，该菌株已在专利CN106635944A中公开。对于该菌株，采用本发明提供的突变的dapA启动子驱动其二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的表达，改造后的菌株的赖氨酸产量和转化率显著提升，且菌株的生长性能也有所改善。
作为本发明的另一种优选方案，所述重组微生物的出发菌株为保藏编号为CGMCCNo.11942的赖氨酸生产菌，该菌株已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，该菌株已在专利CN105734004B中公开。对于该菌株，采用本发明提供的突变的dapA启动子驱动其二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的表达，改造后的菌株的赖氨酸产量和转化率显著提升，且菌株的生长性能也有所改善。
本发明提供所述重组微生物的构建方法，该方法包括将二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的天然启动子替换为所述突变的dapA启动子的步骤。
具体地，所述方法为：在出发菌株中，将二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的天然启动子替换为所述突变的dapA启动子。
上述替换启动子可采用本领域常规方法实现，例如：将被替换启动子上下游片段以及所述突变的dapA启动子连入同源重组载体后，导入出发菌株中，通过同源重组替换出发菌株中的dapA原始启动子。
本发明提供所述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产微生物代谢产物或其衍生物中的应用；
(2)在选育微生物代谢产物或其衍生物的生产菌株中的应用；
优选地，所述微生物代谢产物为赖氨酸。所述衍生物包括但不限于三氟乙酰赖氨酸等。
本发明提供一种发酵生产赖氨酸或其衍生物的方法，包括培养所述重组微生物，从培养物中分离得到赖氨酸或其衍生物。
具体地，上述方法包括：将所述重组微生物接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中培养，得到发酵液，将发酵液经分离提取得到赖氨酸或其衍生物。
优选地，所述发酵培养基包含如下组分：葡萄糖25～35g/L，硫酸铵5～15g/L，酵母粉1～3g/L，蛋白胨3～5g/L，KH2PO41～2g/L，MgSO4·7H2O 1～3g/L，FeSO4·7H2O 0.1～0.3g/L，MnSO4·H2O0.1～0.3g/L，烟酰胺0.03～0.07g/L，泛酸钙0.005～0.015g/L，生物素0.001～0.002g/L，硫胺素0.005～0.015g/L。
本发明还提供一种表达目的基因的方法，该方法包括：将目的基因与所述突变的dapA启动子可操作性地连接，得到重组DNA，将所述重组DNA导入宿主细胞中，表达所述目的基因。
具体地，将所述目的基因可操作性地连接至所述突变的dapA启动子的下游；或者，将所述目的基因在染色体上的上下游DNA片段分别可操作性地连接至所述突变的dapA启动子的上游和下游。
以上所述的目的基因可为任意蛋白质的编码基因(例如：氨基酸合成相关基因等)或RNA分子(例如：干扰RNA分子、调控RNA分子、sgRNA等)的编码基因。
本发明的有益效果在于：本发明提供的突变的dapA启动子相比于野生型dapA启动子具有明显更高的启动转录的活性，能够驱动目的基因在微生物中高效表达。利用该启动子替换dapA基因的天然启动子，可使得dapA基因的表达明显增强，由此构建得到的重组菌的赖氨酸产量和转化率显著提高。本发明提供的突变的dapA启动子可用于调控dapA基因等氨基酸合成相关基因的表达，为基因表达调控提供了新的分子工具和方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1引物序列信息
引物名称 序列(5’-3’)
P-1f CGCGGATCCATGCCAATGCCACGATGTAT
P-1r TCGTGGGTGTGAGCTTTGCGTTAAAAGTCCATGACATACG
P-2f AGAAGGTAACCTTGAACTCTATGAGCACAGGTTTAACAGC
P-2r CCCAAGCTTCCCTTGGCGTCCTTGACCGC
RT-16S-f AATGGCGCATACAAAGAGAAGC
RT-16S-R GTTGCAGACTCCAATCCGGA
RT-dapA-f GAGACGCCTGAGTGAATTACCTACG
RT-dapA-r CGCCCAAAGCAAGCCAAACAAG
本发明提供的突变型启动子PdapA*(突变的dapA基因的启动子)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，专利申请CN111197021A中的突变型启动子PdapA**的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。委托金唯智生物科技有限公司(中国)合成突变型启动子PdapA*和CN111197021A中的突变启动子PdapA**，并将两个启动子分别用于赖氨酸合成途径的dapA基因的表达调控。
实施例1重组质粒的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以P-1f/P-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段P-up；以P-2f/P-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段P-dn。以P-up、P-dn和PdapA*三片段混合物为模板，以P-1f/P-2r引物对进行PCR扩增，得到片段up-PdapA*-dn，将up-PdapA*-dn用BamHI、HindIII进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从市售途径购买获得)用同样的酶双切。将上述两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PdapA*。
采用同样的方法构建重组质粒pK18mobsacB-PdapA**。
实施例2在出发菌株CGMCC No.13407中引入突变的dapA基因的启动子
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备CGMCCNo.13407的感受态细胞。将重组质粒pK18mobsacB-PdapA*以电穿孔方法转化至CGMCCNo.13407感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛选得到的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。固体培养基上生长的菌落在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的片段并进行核苷酸测序分析，获得在CGMCC No.13407的dapA基因前引入启动子PdapA*的重组菌株，即以PdapA*替换dapA基因的天然启动子的重组菌株，将该菌株命名为13407-PdapA*::PdapA-dapA。
采用同样的方法获得在CGMCC No.13407的dapA基因前引入启动子PdapA**的重组菌株，即以PdapA**替换dapA基因的天然启动子的重组菌株，将该菌株命名为13407-PdapA**::PdapA-dapA。
实施例3重组菌发酵生产L-赖氨酸的能力测试
对出发菌株CGMCC No.13407及实施例2获得的重组菌13407-PdapA*::PdapA-dapA和13407-PdapA**::PdapA-dapA进行发酵验证。使用Dasgip四联1L发酵罐，同期进行出发菌株及其改造后的重组菌的发酵验证。发酵培养基配方如表2所示，发酵控制工艺如表3所示。
表2发酵培养基配方
成分 浓度(g/L)
葡萄糖 30
硫酸铵 10
酵母粉 2
蛋白胨 4
KH2PO4 1.5
MgSO4·7H2O 2.0
FeSO4·7H2O 0.2
MnSO4·H2O 0.2
烟酰胺 0.05
泛酸钙 0.01
生物素 0.001
硫胺素 0.01
消泡剂 0.5
初始定容 400ml
表3发酵工艺控制参数
Figure BDA0003411180800000091
Figure BDA0003411180800000101
发酵测试结果如表4所示，出发菌株及其改造后的重组菌各平行发酵三个批次，取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测出发菌株及其改造后的重组菌的发酵液中的赖氨酸含量，以三个批次的平均值作为最终实验结果。取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562nm处检测OD，以三个批次的平均值作为最终实验结果。
表4 L-赖氨酸发酵实验结果
Figure BDA0003411180800000102
上述发酵实验结果显示，改造后的重组菌较出发菌株具有明显更高的赖氨酸产量和糖酸转化率，且具有显著性差异(P＜0.05)。出发菌株CGMCC No.13407的赖氨酸产量为74.8g/L，糖酸转化率为49.8％，采用突变的dapA基因启动子PdapA*替换dapA基因天然启动子的重组菌13407-PdapA*::PdapA-dapA的赖氨酸产量为77.8g/L，糖酸转化率为51.8％，其中，糖酸转化率较出发菌株提高了2.0个百分点，且重组菌的生长也有所改善。突变的dapA**基因启动子PdapA**替换dapA基因天然启动子的重组菌13407-PdapA**::PdapA-dapA的赖氨酸产量为76.7g/L，糖酸转化率为51.1％，两个重组菌相比于出发菌株CGMCC No.13407的赖氨酸产量和转化率均有提升，且具有显著性差异(P＜0.05)，但是重组菌13407-PdapA**::PdapA-dapA的赖氨酸产量和转化率明显低于(P＜0.05)重组菌13407-PdapA*::PdapA-dapA。由此可见，启动子PdapA*较PdapA**具有更强的启动活性。
实施例4在出发菌株CGMCC No.11942中引入突变的dapA基因的启动子
为进一步验证突变的dapA基因的启动子对赖氨酸产量的提升效果，进一步将两个突变的dapA基因的启动子(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7)分别引入另一株赖氨酸生产菌CGMCC No.11942中。
参照实施例2的方法将重组质粒pK18mobsacB-PdapA*转入CGMCC No.11942的感受态细胞。通过PCR扩增目的片段并进行核苷酸测序分析，获得在CGMCC No.11942的dapA基因前引入启动子PdapA*的重组菌，即以PdapA*替换dapA基因的天然启动子的重组菌，将其命名为11942-PdapA*::PdapA-dapA。
采用同样的方法获得在CGMCC No.11942的dapA基因前引入启动子PdapA**的重组菌株，即以PdapA**替换dapA基因的天然启动子的重组菌株，将该菌株命名为11942-PdapA**::PdapA-dapA。
实施例5重组菌发酵生产L-赖氨酸的能力测试
参照实施例3的方法对CGMCC No.11942及其改造后的重组菌11942-PdapA*::PdapA-dapA和11942-PdapA**::PdapA-dapA进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表5所述。
表5L-赖氨酸发酵实验结果
Figure BDA0003411180800000121
上述发酵实验结果显示，改造后的两个重组菌较出发菌株具有明显更高的赖氨酸产量和糖酸转化率，且具有显著性差异(P＜0.05)。出发菌株CGMCC No.11942的赖氨酸产量为89.5g/L，糖酸转化率为59.4％，采用突变的dapA基因启动子PdapA*替换dapA基因天然启动子的重组菌11942-PdapA*::PdapA-dapA的赖氨酸产量为92.5g/L，糖酸转化率为61.7％，其中，糖酸转化率较出发菌株提高了2.3个百分点，且重组菌的生长也有所改善。突变的dapA**基因启动子PdapA**替换dapA基因天然启动子的重组菌13407-PdapA**::PdapA-dapA的赖氨酸产量为91.4g/L，糖酸转化率为60.9％，其赖氨酸产量和转化率明显低于(P＜0.05)重组菌13407-PdapA*::PdapA-dapA。由此可见，启动子PdapA*较PdapA**具有更强的启动活性。
以上采用PdapA*替换dapA基因的天然启动子获得的重组菌的赖氨酸产量和转化率的提升对于转化率水平已经比较高的赖氨酸生产菌而言，是比较可观的生产性能改良效果。证明在谷氨酸棒杆菌中采用突变的dapA基因启动子PdapA*调控dapA基因的表达，有助于L-赖氨酸产量和转化率的提高。
实施例6突变型启动子的转录活性检测
为了进一步验证本发明提供的突变型启动子PdapA*和专利申请CN111197021A中的突变型启动子PdapA**的启动转录的活性，利用实时荧光定量PCR检测突变型启动子在出发菌CGMCC No.11942中转录活性，使用的引物见表1。
实时荧光定量PCR方法：收集对数生长期的菌体，按照CW BIO UIltrapure RNAKit试剂盒操作说明提取谷氨酸棒杆菌总RNA。琼脂糖凝胶电泳验证抽提的RNA是否符合实验要求、同时用酶标仪定量RNA浓度。按照苏州宇恒生物公司的US EVERBRIGHT反转录试剂盒操作说明将mRNA经两步反应反转录生成cDNA。使用2×Super EvaGreen Master Mix(USEVERBRIGHT)和CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行实时荧光定量PCR。每次反应都设阴性对照和标准品校正，并设置3个生物学重复和3个技术重复，以保证实验数据的有效性。反应完毕后根据熔解曲线分析PCR产物的特异性。以16S rDNA作为内参基因，将不同菌株所得的CT值差异记做△Ct值，将报告基因的二氢吡啶二羧酸合成酶转录水平标准化为16S rRNA基因的转录水平，后者用作内源性对照。采用Livak等的2-△△Ct方法处理数据(Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T))[J].Methods,2001.25(4):402-408.)，最终得到两种重组菌中二氢吡啶二羧酸合成酶基因的转录水平，结果如表6所示。
表6启动子的相对转录水平
Figure BDA0003411180800000131
Figure BDA0003411180800000141
通过荧光定量PCR试验来直接比较重组菌11942-PdapA*::PdapA-dapA和11942-PdapA**::PdapA-dapA中二氢吡啶二羧酸合成酶基因dapA的转录水平，结果表明，dapA基因在启动子PdapA*的控制下，其转录水平是在PdapA**控制下转录水平的1.6倍，且具有显著性差异(P＜0.05)，表明PdapA*启动子具有优异的启动转录的活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 突变的dapA启动子及其应用
<130> KHP211123993.1
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta 60
aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg 120
cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180
atgtggtatc attgaactct 200
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta 60
aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg 120
cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180
agaaggtaac cttgaactct 200
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcca tgccaatgcc acgatgtat 29
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtgggtgt gagctttgcg ttaaaagtcc atgacatacg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc 40
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccaagcttc ccttggcgtc cttgaccgc 29
<210> 7
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta 60
gaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg 120
cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180
atgtggtatc attgaactct 200
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatggcgcat acaaagagaa gc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttgcagact ccaatccgga 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagacgcctg agtgaattac ctacg 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcccaaagc aagccaaaca ag 22

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，其含有权利要求1所述的启动子。
3.一种载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达盒。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞的如下任一种应用：
(1)在微生物中驱动基因表达；
(2)在微生物中增强基因表达；
(3)提高微生物代谢产物的产量和/或转化率；
(4)构建微生物代谢产物的生产菌株；
(5)发酵生产微生物代谢产物。
6.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的上游基因间区域含有权利要求1所述的启动子；
优选地，所述重组微生物为重组谷氨酸棒杆菌，其二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因由权利要求1所述的启动子驱动表达。
7.权利要求6所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，将二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因的天然启动子替换为权利要求1所述的启动子。
8.权利要求6所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产微生物代谢产物或其衍生物中的应用；
(2)在选育微生物代谢产物或其衍生物的生产菌株中的应用；
优选地，所述微生物代谢产物为赖氨酸。
9.一种发酵生产赖氨酸或其衍生物的方法，其特征在于，培养权利要求6所述的重组微生物，从培养物中分离得到赖氨酸或其衍生物。
10.一种表达目的基因的方法，其特征在于，包括：将目的基因与权利要求1所述的启动子可操作性地连接，得到重组DNA，将所述重组DNA导入宿主细胞中，表达所述目的基因。
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