CN116286809A - 一种突变的gluB启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种突变的gluB启动子及其应用。本发明发现强化gluB基因的表达能够显著提高菌株生产赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的能力。本发明提供的突变的gluB启动子相比于野生型gluB启动子具有明显更高的启动转录的活性，利用该启动子替换gluB基因的天然启动子，可使得gluB基因的表达明显增强，构建得到的重组微生物的赖氨酸产量和转化率显著提高。本发明提供的突变的gluB启动子可用于调控gluB基因等氨基酸合成相关基因的表达，为基因表达调控提供了新的分子工具和方法。

Description

一种突变的gluB启动子及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种突变的gluB启动子及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及有机酸。
谷氨酸棒杆菌用于生产氨基酸的历史可追溯到20世纪60年代，最早由日本协和公司发现，该菌可在自然环境下生产谷氨酸，诱变的谷氨酸棒杆菌还可生产赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸。随着代谢工程技术和基因组测序技术的快速发展，对谷氨酸棒杆菌的代谢路径研究越来越清晰，研究人员陆续鉴定得到多种代谢产物在遗传学上的高产机理，并实现了多种代谢产物的高效生产。
谷氨酸棒杆菌中谷氨酸的摄取系统包含核苷酸结合蛋白基因(gluA)、周质结合蛋白基因(gluB)和两个跨膜蛋白基因(gluC和gluD)，其中周质结合蛋白基因(gluB)对谷氨酸的摄取至关重要。gluB存在一个信号序列和信号肽酶的靶点短序列，在一系列反应中导致N端半胱氨酸的脂质修饰，负责将结合蛋白锚定在膜上。目前，关于gluB对L-赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的积累是否有影响未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供gluB基因在赖氨酸发酵生产中的应用以及一种突变的gluB启动子及其应用。
本发明发现，gluB基因的强化表达有利于提升菌株生产赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的能力。通过对gluB基因的启动子区域进行点突变，获得了突变的gluB启动子，该突变的启动子与gluB的天然启动子相比，具有更高的启动转录的活性。该启动子可应用于调控氨基酸的代谢路径，对于氨基酸的生产具有明显的改善效果。
具体地，本发明提供以下技术方案：
首先，本发明提供周质结合蛋白基因gluB的强化表达或周质结合蛋白GluB的活性增强在提高微生物的天冬氨酸族氨基酸的产量或构建生产天冬氨酸族氨基酸的微生物中的应用。
以上所述的强化表达可通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式实现：
(1)采用具有更高转录或翻译启动活性的元件启动周质结合蛋白基因gluB的转录或翻译；
(2)增加周质结合蛋白基因gluB的拷贝数；
(3)对周质结合蛋白基因gluB进行突变以使得其表达量提高。
上述(1)中，具有更高活性是指与周质结合蛋白基因gluB的天然转录或翻译元件相比。
其中，转录元件包括启动子、增强子等；翻译元件包括核糖体结合位点、5’-UTR等。
上述(2)中，增加基因的拷贝数可通过导入携带基因的表达质粒，或者，在染色体上增加基因的拷贝数。
以上所述的周质结合蛋白GluB的活性增强可通过对周质结合蛋白基因gluB进行突变，以使得其编码蛋白的活性增强。
本发明所述的周质结合蛋白基因gluB的Genbank编号为NCgl1876。
以上所述的应用中，所述微生物为棒杆菌属细菌，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
以上所述的应用中，所述天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；优选为赖氨酸。
另一方面，本发明提供一种启动子，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的启动子是指位于基因编码区上游的非翻译核酸序列，该序列至少包含RNA聚合酶结合位点，并且具有启动下游基因转录成mRNA的活性。启动子序列中还可包括5’非翻译区，该区域是某些转录因子或调控因子的结合区域。
上述提供的启动子为突变的gluB启动子，该启动子相比于野生型gluB启动子(SEQID NO.2)的转录活性显著提高，可用于驱动gluB等基因的表达，提高其表达量。
优选地，上述突变的gluB启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
基于上述启动子，本发明提供含有所述突变的gluB启动子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，表达盒可为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因得到的重组DNA，或者为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因、上游或下游可操作性地连接其他转录调控元件、翻译调控元件得到的重组DNA。
对于目的基因，本发明没有特殊限制，本发明提供的启动子可驱动任意基因在谷氨酸棒杆菌中进行转录，当某一基因有与所述启动子匹配的表达强度需求时，即可使用该启动子，因此，目的基因可以为gluB基因或者除gluB基因以外的其他基因。
上述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
作为本发明的优选方案，本发明提供含有突变的gluB启动子以及用于将天然gluB启动子替换为突变的gluB启动子的同源臂片段的同源重组载体。该同源重组载体为在pK18mobsacB载体的基础上构建得到。
上述宿主细胞优选为微生物细胞。微生物细胞优选为埃希氏菌属或棒杆菌属细菌。其中，埃希氏菌属细菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；棒杆菌属细菌优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)或产氨棒杆菌(Corynebacteriumaminogenes)。
基于本发明提供的突变的gluB启动子的功能，本发明进一步提供所述突变的gluB启动子或所述生物材料如下任一种应用：
(1)在微生物中驱动基因表达；
(2)在微生物中增强基因表达；
(3)提高微生物代谢产物的产量和/或转化率；
(4)构建微生物代谢产物的生产菌株；
(5)发酵生产微生物代谢产物。
优选地，上述应用中，所述微生物为棒杆菌属细菌，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
所述代谢产物可为微生物能够合成的任意代谢产物，包括但不限于氨基酸、有机酸、核苷等。
本发明进一步提供一种重组微生物，所述重组微生物的周质结合蛋白基因gluB被强化表达或周质结合蛋白GluB的活性被增强。
以上所述的强化表达可通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式实现：
(1)采用具有更高转录或翻译启动活性的元件启动周质结合蛋白基因gluB的转录或翻译；
(2)增加周质结合蛋白基因gluB的拷贝数；
(3)对周质结合蛋白基因gluB进行突变以使得其表达量提高。
上述(1)中，具有更高活性是指与周质结合蛋白基因gluB的天然转录或翻译元件相比。
其中，转录元件包括启动子、增强子等；翻译元件包括核糖体结合位点、5’-UTR等。
上述(2)中，增加基因的拷贝数可通过导入携带基因的表达质粒，或者，在染色体上增加基因的拷贝数。
以上所述的周质结合蛋白GluB的活性增强可通过对周质结合蛋白基因gluB进行突变，以使得其编码蛋白的活性增强。
优选地，所述重组微生物的周质结合蛋白基因gluB的上游基因间区域含有所述突变的gluB启动子。
其中，上游基因间区域具体为微生物染色体上的周质结合蛋白基因gluB的起始密码子与其上游基因的编码区之间的核苷酸序列。
优选地，所述重组微生物为重组谷氨酸棒杆菌，其周质结合蛋白基因gluB由所述突变的gluB启动子驱动表达。
以上所述的重组微生物的周质结合蛋白GluB的表达量显著提高，其赖氨酸的合成能力明显增强，具有较出发菌显著更高的赖氨酸产量和转化率。
上述重组微生物的出发菌优选为能够积累赖氨酸或其衍生物的棒杆菌属细菌。优选为能够积累赖氨酸或其衍生物的谷氨酸棒杆菌。
本发明进一步发现，上述替换周质结合蛋白基因gluB启动子的改造与某些特定的代谢工程靶点改造配合作用，更有利于提高赖氨酸的产量和转化率，基于此，上述重组微生物的出发菌株优选在野生型谷氨酸棒杆菌的基础上进行如下(1)或(2)的改造：
(1)突变染色体上的lysC基因，使其编码lysCT311I突变体(第311位氨基酸突变由T突变为I)；突变染色体上的pyc基因，使其编码pycP458S突变体(第458位氨基酸突变由P突变为S)；增加lysE基因的拷贝数。
(2)在染色体上的lysC中引入点突变T311I，hom中引入点突变V59A，pyc中引入点突变P458S，gnd中引入点突变S361F；增加dapA、dapB、ddh的拷贝数；改变aceE的启动子序列以弱化丙酮酸脱氢酶的表达。
作为本发明的一种优选方案，所述重组微生物的出发菌株为保藏编号为CGMCCNo.13407的赖氨酸生产菌，该菌株已于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，该菌株已在专利CN106635944A中公开。对于该菌株，采用本发明提供的突变的gluB启动子驱动其周质结合蛋白基因gluB的表达，改造后的菌株的赖氨酸产量和转化率显著提升，且菌株的生长性能也有所改善。
作为本发明的另一种优选方案，所述重组微生物的出发菌株为保藏编号为CGMCCNo.11942的赖氨酸生产菌，该菌株已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，该菌株已在专利CN105734004B中公开。对于该菌株，采用本发明提供的突变的gluB启动子驱动其周质结合蛋白基因gluB的表达，改造后的菌株的赖氨酸产量和转化率显著提升，且菌株的生长性能也有所改善。
本发明提供所述重组微生物的构建方法，该方法包括将周质结合蛋白基因gluB的天然启动子替换为所述突变的gluB启动子的步骤。
具体地，所述方法为：在出发菌中，将周质结合蛋白基因gluB的天然启动子替换为所述突变的gluB启动子。
以上所述的天然启动子优选为野生型gluB启动子。
上述替换启动子可采用本领域常规方法实现，例如：将被替换启动子上下游片段以及所述突变的gluB启动子连入同源重组载体后，导入出发菌中，通过同源重组替换出发菌中的gluB天然启动子。
本发明提供所述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产天冬氨酸族氨基酸或其衍生物中的应用；
(2)在作为出发菌选育天冬氨酸族氨基酸或其衍生物的生产菌株中的应用。
优选地，所述天冬氨酸族氨基酸为赖氨酸。所述衍生物包括但不限于三氟乙酰赖氨酸等。
本发明提供一种发酵生产赖氨酸或其衍生物的方法，包括培养所述重组微生物，从培养物中分离得到赖氨酸或其衍生物。
具体地，上述方法包括：将所述重组微生物接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中培养，得到发酵液，将发酵液经分离提取得到赖氨酸或其衍生物。
优选地，所述发酵培养基包含如下组分：葡萄糖55-65g/L，硫酸铵20-30g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，七水硫酸镁0.8-1.2g/L，豆粕水解液8-12g/L，碳酸钙25-35g/L，调节pH至7.0-7.2。
本发明还提供一种表达目的基因的方法，该方法包括：将目的基因与所述突变的gluB启动子可操作性地连接，得到重组DNA，将所述重组DNA导入宿主细胞中，表达所述目的基因。
具体地，将所述目的基因可操作性地连接至所述突变的gluB启动子的下游；或者，将所述目的基因在染色体上的上下游DNA片段分别可操作性地连接至所述突变的gluB启动子的上游和下游。
以上所述的目的基因可为任意蛋白质的编码基因(例如：氨基酸合成相关基因等)或RNA分子(例如：干扰RNA分子、调控RNA分子、sgRNA等)的编码基因。
本发明的有益效果在于：本发明发现强化gluB基因的表达能够显著提高菌株生产赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的能力。本发明提供的突变的gluB启动子相比于野生型gluB启动子具有明显更高的启动转录的活性，能够驱动目的基因在微生物中高效表达。利用该启动子替换gluB基因的天然启动子，可使得gluB基因的表达明显增强，构建得到的重组微生物的赖氨酸产量和转化率显著提高。本发明提供的突变的gluB启动子可用于调控gluB基因等氨基酸合成相关基因的表达，为基因表达调控提供了新的分子工具和方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：
表1引物序列信息
引物名称 序列(5’-3’)
P-1f CGGGATCCCTTTGCCGCACGATCAACCG
P-1r GGAATCTGGTTCCGTATCTTCCACAATGAGCCCATCCGCC
P-2f TAGATATATAAGGAGACAACATGTCTGCAAAGCGTACTTT
P-2r GCGTCGACTCCTTGACCTTCTGAGCTGG
RT-16S-f AATGGCGCATACAAAGAGAAGC
RT-16S-R GTTGCAGACTCCAATCCGGA
RT-gluB-f GGAAGGCACCGACGCTATCAAC
RT-gluB-R TCTTCAACAACCACGGAGTCTTCAC
实施例1重组质粒pK18mobsacB-PgluB*的构建
突变的gluB启动子PgluB*的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由金唯智生物科技有限公司(中国)合成。以P-1f/P-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段P-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以P-2f/P-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段P-dn。以P-up、P-dn和PgluB*三片段混合物为模板，以P-1f/P-2r引物对进行PCR扩增，得到片段up-PgluB*-dn，将up-PgluB*-dn用BamHI、SalI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从市售途径购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PgluB*。
实施例2在出发菌CGMCC No.13407中引入突变的gluB启动子
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备CGMCCNo.13407的感受态细胞。将重组质粒pK18mobsacB-PgluB*以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌落的基因组中不携带插入的载体序列。使用PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，通过PCR扩增目的片段并进行核苷酸测序分析，获得在gluB基因前引入启动子PgluB*的重组菌(以PgluB*替换gluB基因的天然启动子)，并命名为13407-PgluB*::PgluB-gluB。
实施例3摇瓶发酵测试重组菌的赖氨酸发酵能力
对实施例2构建的重组菌13407-PgluB*::PgluB-gluB进行摇瓶发酵实验，摇瓶发酵使用的培养基如下：
种子活化培养基：BHI 37g/L，18g/L琼脂粉。
种子培养基：蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，尿素5g/L，七水硫酸镁0.4g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵25g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，豆粕水解液10g/L，碳酸钙30g/L，调节pH至7.0。
赖氨酸发酵方法如下：
1、种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，33℃培养24h；
2、种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养6h，得到种子液；
3、发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养14-15h，每株菌做三个平行，得到发酵液。
4、OD562测定：取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562nm处检测OD，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的OD562如表2所示。
5、赖氨酸浓度测定：取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与出发菌的发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表2所示。
表2重组菌的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
CGMCC No.13407 15.1 25.2 47.7
13407-PgluB*::PgluB-gluB 18.2 30.3 48.8
结果表明，重组菌13407-PgluB*::PgluB-gluB相比出发菌CGMCC No.13407的赖氨酸产量和转化率大幅度提高，且具有显著性差异(P＜0.05)，其中，L-赖氨酸产量提高了3.1g/L，转化率提高了5.1％，重组菌的最终OD与出发菌相当。
实施例4在出发菌CGMCC No.11942中引入突变的gluB启动子
为进一步验证突变的gluB启动子对赖氨酸产量的提升效果，进一步将突变的gluB启动子引入另一株赖氨酸生产菌CGMCC No.11942中。
参照实施例2的方法将重组质粒pK18mobsacB-PgluB*转入CGMCC No.11942的感受态细胞。通过PCR扩增目的片段并进行核苷酸测序分析，获得在CGMCC No.11942的gluB基因前引入启动子PgluB*的重组菌(以PgluB*替换gluB基因的天然启动子)，并命名为11942-PgluB*::PgluB-gluB。
实施例5摇瓶发酵测试重组菌的赖氨酸发酵能力
参照实施例3的方法对CGMCC No.11942及其改造后的重组菌11942-PgluB*::PgluB-gluB进行摇瓶发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表3所述。
表3重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
CGMCC No.11942 18.5 30.1 38.7
11942-PgluB*::PgluB-gluB 21.4 35.7 37.5
结果表明，重组菌11942-PgluB*::PgluB-gluB相比出发菌CGMCC No.11942的赖氨酸产量大幅度提高，且具有显著性差异(P＜0.05)，其中，L-赖氨酸产量提高了2.9g/L，转化率提高了5.6％，重组菌的最终OD与对出发菌相当。
实施例6突变的gluB启动子的转录活性检测
为了进一步验证突变的gluB启动子PgluB*(SEQ ID NO.1)相比于gluB的天然启动子(野生型gluB启动子，SEQ ID NO.2)具有更高的转录活性，利用实时荧光定量PCR检测由PgluB*启动子启动的gluB基因的转录水平，所使用的引物见表1。
实时荧光定量PCR方法：收集对数生长期的菌体，按照CW BIO UIltrapure RNAKit试剂盒操作说明提取谷氨酸棒杆菌总RNA。琼脂糖凝胶电泳验证抽提的RNA是否符合实验要求、同时用酶标仪定量RNA浓度。按照苏州宇恒生物公司的US EVERBRIGHT反转录试剂盒操作说明将mRNA经两步反应反转录生成cDNA。使用2×Super EvaGreen Master Mix(USEVERBRIGHT)和CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行实时荧光定量PCR。每次反应都设阴性对照和标准品校正，同时设置基于3个生物学重复和3个技术重复，以保证实验数据的有效性。反应完毕后根据熔解曲线分析PCR产物的特异性。以16S rDNA作为内参基因，将不同菌株所得的CT值差异记做△Ct值，将报告基因周质结合蛋白基因gluB的转录水平标准化为16S rRNA基因的转录水平，后者用作内源性对照。采用Livak等的2-△△Ct方法处理数据(Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T))[J].Methods,2001.25(4):402-408.)，最终得到重组菌周质结合蛋白基因gluB的转录水平，结果如表4所示。
表4启动子的相对转录水平
Figure BDA0003422112170000121
通过荧光定量PCR试验检测重组菌中周质结合蛋白基因的转录水平，结果表明，gluB基因在启动子PgluB*的控制下的转录水平是在gluB天然启动子控制下的3.6倍，且具有显著性差异(P＜0.05)，表明突变的gluB启动子PgluB*较天然启动子PgluB具有更高的启动转录的活性，结合实施例3和5的发酵实验结果可知，增强gluB基因的表达有利于赖氨酸的生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种突变的gluB启动子及其应用
<130> KHP211123995.3
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagatacgga accagattcc ttcttcacca accctaagtc tgatcgtgca aaagacttcc 60
tcggcaagat ccttgcccac tagtttttgg ctgcgcctct atcttcagag tcacttcttt 120
cagtgtcatt tttctcggcc ctaatccccc gctggagttc aatcagcgat tgcaaccttt 180
tagatatata atgagacaac 200
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagatacgga accagattcc ttcttcacca accctaagtc tgatcgtgca aaagacttcc 60
tcggcaagat ccttgcccac tagttttcgg ctgcgcctct atcttcagag tcacttcttt 120
cagtgtcatt tttctcggcc ctaatccccc gctggagttc aatcagcgat tgcaaccttt 180
tagatatata aggagacaac 200
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccct ttgccgcacg atcaaccg 28
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaatctggt tccgtatctt ccacaatgag cccatccgcc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagatatata aggagacaac atgtctgcaa agcgtacttt 40
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgtcgactc cttgaccttc tgagctgg 28
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatggcgcat acaaagagaa gc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttgcagact ccaatccgga 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaaggcacc gacgctatca ac 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcttcaacaa ccacggagtc ttcac 25

Claims (10)

1.周质结合蛋白基因gluB的强化表达或周质结合蛋白GluB的活性增强在提高微生物的天冬氨酸族氨基酸的产量或构建生产天冬氨酸族氨基酸的微生物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为棒杆菌属细菌，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，
和/或，所述天冬氨酸族氨基酸为赖氨酸。
3.一种启动子，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种生物材料，其特征在于，其含有权利要求3所述的启动子；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.权利要求3所述的启动子或权利要求4所述的生物材料的如下任一种应用：
(1)在微生物中驱动基因表达；
(2)在微生物中增强基因表达；
(3)提高微生物代谢产物的产量和/或转化率；
(4)构建微生物代谢产物的生产菌株；
(5)发酵生产微生物代谢产物；
优选地，所述微生物为棒杆菌属细菌，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
6.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的周质结合蛋白基因gluB被强化表达或周质结合蛋白GluB的活性被增强。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的周质结合蛋白基因gluB的上游基因间区域含有权利要求3所述的启动子；
优选地，所述重组微生物为重组谷氨酸棒杆菌，其周质结合蛋白基因gluB由权利要求3所述的启动子驱动表达。
8.权利要求6或7所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，将周质结合蛋白基因gluB的天然启动子替换为权利要求3所述的启动子。
9.权利要求6或7所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产天冬氨酸族氨基酸或其衍生物中的应用；
(2)在作为出发菌选育天冬氨酸族氨基酸或其衍生物的生产菌株中的应用。
10.一种发酵生产赖氨酸或其衍生物的方法，其特征在于，培养权利要求6或7所述的重组微生物，从培养物中分离得到赖氨酸或其衍生物。
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