CN117720629A - 一种转录终止蛋白的突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录终止蛋白的突变体及其应用。所述突变体为将转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为其他氨基酸得到。本发明研究发现调控转录终止蛋白NusG的表达可以影响微生物合成赖氨酸的效率，将其第162位氨基酸由谷氨酸突变为其他氨基酸之后，可以有效提高微生物生产赖氨酸的能力，这在赖氨酸生产领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录终止蛋白的突变体及其应用。
背景技术
L-赖氨酸是碱性必需氨基酸，分子式为C6H14N2O2，外观为白色或近乎于白色结晶粉末。在162℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。L-赖氨酸广泛应用于动物饲料、医药和食品工业，当用于动物饲料添加剂时，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。因此，生产赖氨酸具有广阔的前景。
目前，L-赖氨酸最常用的生产方法为微生物发酵法。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种转录终止蛋白的突变体及其应用。
第一方面，本发明提供一种转录终止蛋白的突变体，所述突变体为将转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为其他氨基酸得到。
进一步地，所述转录终止蛋白NusG包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体为将转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸得到。
第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码所述的突变体。
第三方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中的转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。
进一步地，所述转录终止蛋白NusG包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
进一步地，所述转录终止蛋白NusG的编码基因包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述突变体可以为在SEQ ID NO.1的基础上发生例如E162H、E162K或E162R的突变，相应地，核苷酸序列的变化为在SEQ ID NO.3的基础上发生gag突变为cac、aag或cgt。
或者，所述突变体可以在SEQ ID NO.4的基础上发生例如E162H、E162K或E162R的突变，相应地，核苷酸序列的变化为在SEQ ID NO.4的基础上发生gag突变为cac、aag或cgt。
进一步地，所述重组微生物为棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
本发明进一步提供所述突变体，或所述核酸在提高微生物的生产赖氨酸或其衍生物的能力中的应用。
进一步地，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明针对将转录终止蛋白NusG研究发现，其第162位谷氨酸突变后对菌株生产赖氨酸的能力会显著上升，并且要优于现有技术中对于转录终止蛋白NusG改造后的效果。这在提升微生物生产赖氨酸的能力的领域，具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示：
表1引物序列
| 名称 | 序列5'→3' |
| NusG-1f | cgggatccatgagcgatgagaacattaa |
| NusG-1r | gataggaacaacaacctcaaa |
| NusGE162H-2f | tttgaggttgttgttcctatccaccaggtcactgagatccg |
| NusGE162K-2f | tttgaggttgttgttcctatcaagcaggtcactgagatccg |
| NusGE162R-2f | tttgaggttgttgttcctatccgtcaggtcactgagatccg |
| NusG-2r | cggctagcctagctaaccttctcaacct |
| NusGN210D-1f | cgggatccttcgatgcagaagcagacgta |
| NusGN210D-1r | acccacaaagctggtcac |
| NusGN210D-2f | ggtgtgaccagctttgtgggtgacgagggcaatgcaactc |
| NusGN210D-2r | cggctagccgtccggatgctcggtcccg |
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1在模式菌ATCC 13032中引入突变基因NusGE162H
本发明以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以NusG-1f/NusG-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段13032-NusG-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以NusGE162H-2f/NusG-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段13032-NusG-dn。以13032-NusG-up和13032-NusG-dn两片段混合物为模板，以NusG-1f/NusG-2r引物对进行PCR扩增，得到片段13032-up-dn，将13032-up-dn用BamHI、NheI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162H。
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC 13032的感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162H以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。
本发明通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得带有突变基因NusGE162H的菌株，并命名为13032-NusGE162H。
实施例2在模式菌ATCC 13032中引入突变基因NusGE162K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162K转入模式菌ATCC 13032中，获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为13032-NusGE162K。
实施例3在模式菌ATCC 13032中引入突变基因NusGE162R
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162R转入模式菌ATCC 13032中，获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为精氨酸的重组菌株，菌株命名为13032-NusGE162R。
实施例4在模式菌ATCC 14067中引入突变基因NusGE162H
本发明以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067基因组为模板，以NusG-1f/NusG-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段14067-NusG-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067基因组为模板，以NusGE162H-2f/NusG-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段14067-NusG-dn。以14067-NusG-up和14067-NusG-dn两片段混合物为模板，以NusG-1f/NusG-2r引物对进行PCR扩增，得到片段14067-up-dn，将14067-up-dn用BamHI、NheI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-14067-NusGE162H。
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC 14067的感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-14067-NusGE162H以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。
本发明通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得带有突变基因NusGE162H的菌株，并命名为14067-NusGE162H。
实施例5在模式菌ATCC14067中引入突变基因NusGE162K
参照实施例4的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-NusGE162K转入模式菌ATCC 14067中，获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-NusGE162K。
实施例6在模式菌ATCC 14067中引入突变基因NusGE162R
参照实施例4的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-NusGE162R转入模式菌ATCC 13032中，获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为精氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-NusGE162R。
实施例7摇瓶测试2株模式菌引入NusG突变体后的发酵性能
本发明进一步摇瓶培养两株模式菌ATCC 13032以及ATCC 14067的各突变体以验证其发酵能力，具体如下：
赖氨酸发酵实验使用的培养基如下：
种子活化培养基：BHI 37g/L，18g/L琼脂粉。
种子培养基：蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，尿素5g/L，七水硫酸镁0.4g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵25g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，豆粕水解液10g/L，碳酸钙30g/L，调节pH至7.0。
赖氨酸发酵方法如下：
1、种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，33℃培养24h；
2、种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养6h；
3、发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养14-15h，每株菌做三个平行。
4、OD562测定：取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562处检测OD，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的OD562如表2所示。
5、赖氨酸浓度测定：取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与对照菌发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表2所示。
表2重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
检测发酵液中的赖氨酸含量，发现携带有转录终止/抗终止蛋白突变体的谷氨酸棒杆菌的培养液中的赖氨酸浓度更高。
前述实施例证明突变的转录终止/抗终止蛋白对模式菌株的赖氨酸合成具有促进作用，本发明进一步在赖氨酸生产菌上进行突变效果的验证。使用2株实验室保藏的赖氨酸生产菌CGMCC No.13407(公开于中国专利CN106635944A)和CGMCC No.11942(公开于CN105734004B)进行验证。CGMCC No.13407和CGMCC No.11942由模式菌ATCC13032经过基因改造获得，其赖氨酸合成相关基因得到了强化改造。
实施例8在CGMCC No.13407中引入突变基因NusGE162H
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162H转入CGMCCNo.13407中，获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为组氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-NusGE162H。
实施例9在CGMCC No.13407中引入突变基因NusGE162K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162K转入CGMCCNo.13407中获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-NusGE162K。
实施例10在CGMCC No.13407中引入突变基因NusGE162R
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162R转入CGMCCNo.13407中获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为丝氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-NusGE162R。
实施例11在CGMCC No.11942中引入突变基因NusGE162H
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162H转入CGMCCNo.13407中获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为组氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-NusGE162H。
实施例12在CGMCC No.11942中引入突变基因NusGE162K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162K转入CGMCCNo.13407中获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-NusGE162K。
实施例13在CGMCC No.11942中引入突变基因NusGE162R
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGE162R转入CGMCCNo.13407中获得转录终止/抗终止蛋白162位氨基酸突变为精氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-NusGE162R。
实施例14赖氨酸发酵实验
本发明进一步参照实施例7的方法对CGMCC No.13407、CGMCC No.11942及其改造后的重组菌13407-NusGE162H、13407-NusGE162K、13407-NusGE162R、11942-NusGE162H、11942-NusGE162K、11942-NusGE162R进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表3所述。
表3重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
发酵结果表明，同批次测试2种赖氨酸生产菌及携带有转录终止/抗终止蛋白突变体的改造菌，携带有转录终止/抗终止蛋白突变体的改造菌，其赖氨酸产量和糖酸转化率均有显著提高，且NusG第162位氨基酸由谷氨酸(E)突变为精氨酸(R)后效果更好。
以上结果表明，本发明所提供的转录终止/抗终止蛋白突变体对棒杆菌的赖氨酸产量和糖酸转化率均有促进作用。
试验例1
为了验证本发明提供的突变体对于赖氨酸生产的优势，本发明进一步对比NusG第210位氨基酸突变为其他氨基酸的效果，具体流程如下：
1、参照实施例1的方法，构建重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGN210D，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-NusGN210D分别转入赖氨酸生产菌CGMCC No.13407和CGMCCNo.11942中，获得NusG第210位天冬酰胺突变为天冬氨酸的重组菌株，菌株分别命名为13407-NusGN210D和11942-NusGN210D。
2、参照实施例7的方法，对CGMCC No.13407、CGMCC No.11942及其改造后的重组菌13407-NusGN210D、11942-NusGN210D以及本发明提供的13407-NusGE162H、13407-NusGE162K、13407-NusGE162R、11942-NusGE162H、11942-NusGE162K、11942-NusGE162R进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如下表所示：
表4重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
该实验结果显示，同批次测试2种赖氨酸生产菌及携带有NusG突变体的改造菌，与出发菌株CGMCC No.13407和CGMCC No.11942相比，13407-NusGN210D和11942-NusGN210D的赖氨酸产量和转化率均有提升，但是提升效果显著弱于本发明提供的改造菌。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种转录终止蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体为将转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为其他氨基酸得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述转录终止蛋白NusG包括如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为将转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸得到。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1-3任一项所述的突变体。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的转录终止蛋白NusG的第162位谷氨酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述转录终止蛋白NusG包括如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述转录终止蛋白NusG的编码基因包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求5-7任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
9.权利要求1-3任一项所述的突变体或权利要求4所述的核酸在提高微生物的生产赖氨酸或其衍生物的能力中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种。
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