CN117624316A - 一种cey17_05975蛋白的突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种CEY17_05975蛋白的突变体及其应用。本发明研究得到一种和微生物生产谷氨酰胺能力相关的蛋白，CEY17_05975蛋白。并且针对该蛋白研究得到了一个突变位点。本发明研究发现将微生物中CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为其他氨基酸可以提高该微生物生产谷氨酰胺的效率，这在提高菌株生产谷氨酰胺的效率的领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种CEY17_05975蛋白的突变体及其应用。
背景技术
谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。
目前，谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前生产谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，谷氨酰胺转化率不理想，工业上对谷氨酰胺的需求量极高，现有的菌种根本无法满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种CEY17_05975蛋白的突变体及其应用。
第一方面，本发明提供一种CEY17_05975蛋白的突变体，所述突变体为将CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为缬氨酸外其他氨基酸中的一种得到。
进一步地，所述CEY17_05975蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体为将CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为异亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的一种得到。
第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码所述突变体。
第三方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中的CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为异亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的一种。
进一步地，所述CEY17_05975蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述CEY17_05975蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸。
进一步地，所述重组微生物为棒杆菌、肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
本发明进一步提供所述突变体或所述核酸在提高微生物的生产谷氨酰胺或其衍生物的能力中的应用。
进一步地，所述微生物为棒杆菌、肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
第四方面，本发明提供一种CEY17_05975蛋白，所述CEY17_05975蛋白包括如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明具备如下有益效果：
本发明研究得到一种和微生物生产谷氨酰胺能力相关的蛋白，CEY17_05975蛋白，并且针对该蛋白研究得到一个和谷氨酰胺生产能力密切相关的突变位点。本发明研究发现将该突变位点的缬氨酸突变为其他氨基酸可以有效提高微生物的谷氨酰胺生产能力。本发明提供的突变体在谷氨酰胺或其衍生物的生产中具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示：
表1引物序列
| 引物 | 序列(由上至下依次为) |
| UP-F | ctagTCTAGAACTATTAGACGATGTCGCAG |
| UP-R | ACTACGCCGTACACGAGCGCGGTGATGCCGATGCCCACGACAAATA |
| DN-F | ATCACCGCGCTCGTGTACGGCGTAGT |
| DN-R | cccAAGCTTCTTTCCTTAAATTTCGTGCA |
| 鉴定-F | TGCTATTTGTCGTGGGCATCGGTA |
| 鉴定-1F | CTATTTGTCGTGGGCATCGGCTC |
| 鉴定-2F | TATTTGTCGTGGGCATCGGAC |
| ID-F | ACTGCACCAGCGCCAACGAT |
| ID-R | ATGTTGGGCAGTCTGTGCAGA |
| P82 | CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG |
| P85 | CGCCCTGAGTGCTTGCGGCA |
以下实施例中涉及的菌株，MHZ-0513-3在专利CN106701649A中公开，MHZ-0513-3-ino-1S84A已在专利CN202110502341.9中公开，谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为模式菌。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例提供重组菌株MHZ-0513-3-CEY17_05975V184I的构建方法，具体流程如下：
本发明利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组为模板，以UP-F/UP-R为引物，制备重组片段UP，以DN-F/DN-R为引物，制备重组片段DN，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以UP、DN为模板，以UP-F/DN-R为引物制备重组片段，所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/HindIII进行消化，同时将pK18-mobsacB(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/HindIII进行消化，并用T4DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/HindIII酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过用P82/P85引物测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-CEY17_05975V184I。
本发明进一步将pK18-CEY17_05975V184I转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为33℃，倒置培养。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。
本发明进一步将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定-F/DN-R验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用ID-F/ID-R扩增测序，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-CEY17_05975V184I。
实施例2
本发明验证MHZ-0513-3-CEY17_05975V184I突变菌株生产谷氨酰胺的性能，具体如下：
将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于下述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔。从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于下述种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液。以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。稳定重复发酵3批平均值如表2所示(OD562培养液在562nm的浊度并表示细胞量，Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的量)。
培养基配方如下：
斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃0.1MPa灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆30g/L，pH 7.0；
发酵培养基：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，pH 7.0。
表2突变菌株谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3 | 43.3±0.116 | 28.9±0.102 | -- |
| MHZ-0513-3-CEY17_05975V184I | 42.9±0.014 | 30.8+0.121 | 6.6 |
如表2所示，在MHZ-0513-3中CEY17_05975第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)，即GTC突变为ATC后，获得菌株MHZ-0513-3-CEY17_05975V184I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从28.9g/L提高到30.8g/L，产酸提高6.6％，由此可见，CEY17_05975V184I突变更利于谷氨酰胺的积累。为确认该点突变在不同菌株中是否有效，将其引入菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A和模式菌谷氨酸棒杆菌ATCC14067。
实施例3
本实施例进一步针对菌株MHZ-0513-3、MHZ-0513-3-ino-1S84A进行实施例1相同的方法进行重组菌株的构建，以实施例2相同方法进行生产谷氨酰胺效率的验证，具体流程如下：
1、CEY17_05975V184I突变菌株构建
菌株MHZ-0513-3、MHZ-0513-3-ino-1S84A是在模式菌谷氨酸棒杆菌ATCC 14067改造后获得，基因CEY17_05975完全相同，将质粒pK18-CEY17_05975V184I电转到MHZ-0513-3-ino-1S84A和ATCC 14067，获得改造菌株命名为MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_05975V184I、14067-CEY17_05975V184I。
2、CEY17_05975V184I突变菌株生产谷氨酰胺的性能
如表3所示，MHZ-0513-3-ino-1S84A中CEY17_05975第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)，即GTC突变为ATC后，获得菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_05975V184I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从30.7g/L提高到32.9g/L，产酸提高7.2％，模式菌ATCC 14067中CEY17_05975第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)，获得菌株14067-CEY17_05975V184I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从0.3g/L提高到0.33g/L，产酸提高10％，由此可见，CEY17_05975V184I突变在不同的菌株中均利于谷氨酰胺的积累。同理，将该基因整合到其他可以合成谷氨酰胺的菌株，如肠杆菌、枯草芽孢杆菌，棒杆菌等，均有利于谷氨酰胺的积累。
表3突变菌株谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A | 43.5±0.212 | 30.7±0.019 | -- |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_05975V184I | 43.7±0.019 | 32.9±0.105 | 7.2 |
| 14067 | 43.6±0.214 | 0.3±0.008 | -- |
| 14067-CEY17_05975V184I | 42.5±0.117 | 0.33±0.002 | 10.0 |
实施例4
本实施例进一步验证CEY17_05975第184位氨基酸突变成其他氨基酸生产谷氨酰胺的性能，具体流程如下：
鉴于CEY17_05975第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)后，谷氨酰胺产量有所提升，本发明进一步研究了第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)，具体为GTC突变为GCC，CTC，菌株构建方法参考实施例1，其中摸索退火温度所用的鉴定引物分别为鉴定-1F/DN-R、鉴定-2F/DN-R，其他引物相同，突变菌株发酵结果如下表4：
表4突变菌株谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A | 43.5±0.212 | 30.7±0.019 | -- |
| MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_05975V184A | 43.1±0.021 | 32.1±0.104 | 4.6 |
| MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_05975V184L | 42.5±0.014 | 31.6±0.121 | 2.9 |
发酵结果表明，第184位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)后，突变株谷氨酰胺产量均有提升，且效果都优于对照菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A，其中突变为丙氨酸(A)后，谷氨酰胺产量提高到32.1g/L，产酸提高4.6％。这一结果充分说明，该位点突变成其他氨基酸也有利于谷氨酰胺及其衍生物的生产。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种CEY17_05975蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体为将CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为缬氨酸外其他氨基酸中的一种得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述CEY17_05975蛋白包括如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为将CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为异亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的一种得到。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1-3任一项所述的突变体。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的CEY17_05975蛋白第184位氨基酸突变为异亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的一种。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述CEY17_05975蛋白包括如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述CEY17_05975蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸。
8.根据权利要求5-7任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为棒杆菌、肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
9.权利要求1-3任一项所述的突变体或权利要求4所述的核酸在提高微生物的生产谷氨酰胺或其衍生物的能力中的应用。
10.根据权利要求9中的应用，其特征在于，所述微生物为棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
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