CN118126146A - 一种cey17_04555突变体及含有其的重组微生物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种CEY17_04555突变体及含有其的重组微生物和应用。本发明提供的CEY17_04555突变体，以野生型CEY17_04555的氨基酸序列为参考序列，含有第2916位精氨酸被其他氨基酸取代的突变。优选，其他氨基酸为半胱氨酸、组氨酸或丝氨酸。含有本发明突变体的重组微生物产L‑谷氨酰胺的能力更强，为发酵提升L‑谷氨酰胺及其衍生物提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种CEY17_04555突变体及含有其的重组微生物和应用。
背景技术
谷氨酰胺是一种非必需氨基酸。化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。
目前，谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前生产谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，谷氨酰胺转化率不理想，工业上对谷氨酰胺的需求量极高，现有的菌种根本无法满足大规模工业化生产的需求。
因此，有必要对发酵生产谷氨酰胺进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-谷氨酰胺生产能力的应用，具体提供一种CEY17_04555突变体及含有其的重组微生物和应用。
本发明的技术方案如下：
一种CEY17_04555突变体，其以野生型CEY17_04555的氨基酸序列为参考序列，含有第2916位精氨酸(R)被其他氨基酸取代的突变。
优选，所述其他氨基酸为半胱氨酸(C)、组氨酸(H)或丝氨酸(S)。
本发明通过对CEY17_04555基因进行修饰，发现其具有特定突变后，可使得含有其的菌株产生L-谷氨酰胺的能力与未修饰的菌株相比得到增强，提升了工业化生产谷氨酰胺的效率。
本发明中，优选所述CEY17_04555突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种DNA分子，其以SEQ ID NO.1为参考序列，所述DNA分子含有第8746-8748位碱基由CGC突变为TGC、CAC或AGC的突变。
本发明另提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述CEY17_04555突变体。
本发明的所述重组微生物的出发菌株为棒杆菌、肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
优选，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
本发明还提供上述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物中的应用；
(2)在用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物产量上的应用。
以及，一种L-谷氨酰胺或其衍生物的生产方法，其包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如上所述。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种CEY17_04555突变体，含有其的重组微生物在发酵生产谷氨酰胺时，具有更高的产量，可明显提升工业化生产谷氨酰胺的能力。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体地，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明中，MHZ-0513-3已在中国专利CN106701649A中公开，其分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13405。MHZ-0513-3-ino-1S84A已在中国专利CN202110502341.9中公开。谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为模式菌，中国专利CN200610089484.7报道引入点突变glnAY405F解除了腺苷酰化修饰，有利于谷氨酰胺的积累，因此构建了菌株ATCC 14067-glnAY405F。
本发明的实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物序列(SEQ ID No.3-20)
| 引物 | 序列(由上至下依次为) |
| UP1-F | ctagTCTAGATACTTGCTCGAGAACTGAACAA |
| UP1-R | CTTCTAGGCGGTTTGCACCGGTGCACAGGCGCTGGGTTGCGCGTG |
| DN1-F | TGCACCGGTGCAAACCGCCTAGAAG |
| DN1-R | cccAAGCTTGTGAGGTTCTGCGCAGTCGACG |
| ID1-F | TTCTCGCAGTTGTTGCACAC |
| ID1-R | GAAGCCTTCAAATGTTGGGA |
| 鉴定1-F | CACGCGCAACCCAGCGCCTAT |
| 鉴定3-F | CACGCGCAACCCAGCGCCTGTA |
| 鉴定4-F | CACGCGCAACCCAGCGCCTTA |
| UP2-F | ctagTCTAGATGCTCCACGCGGCAGATGATAT |
| UP2-R | TGCAGCTTCCTCTGGTGGCAGTTCGAAGAGGTCCTTGTCCACTGGAGCGT |
| DN2-F | TTCGAACTGCCACCAGAGGAAGCT |
| DN2-R | cccAAGCTTAAATGAAGGTCTGGGAGACA |
| ID2-F | AAACCGTTGACGTGCGCGAT |
| ID2-R | TGTAACGCAAGAAGCAAATA |
| 鉴定2-F | ACGCTCCAGTGGACAAGGACCTCGT |
| P82 | CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG |
| P85 | CGCCCTGAGTGCTTGCGGCA |
实施例1质粒pK18-CEY17_04555R2916C构建和重组菌株MHZ-0513-3-CEY17_04555R29116C构建
突变前CEY17_04555的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(序列1)，突变后CEY17_04555的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(序列2)。
菌株MHZ-0513-3-CEY17_04555R2916C具体构建过程如下：
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067的基因组为模板，以UP1-F/UP1-R为引物，制备重组片段UP1，以DN1-F/DN1-R为引物，制备重组片段DN1，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以UP1、DN1为模板，以UP1-F/DN1-R为引物制备重组片段，所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/HindIII进行消化，同时将pK18-mobsacB(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/HindIII进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/HindIII酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过用P82/P85引物测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-CEY17_04555R2916C。
将pK18-CEY17_04555R2916C转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为33℃，倒置培养。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定1-F/DN1-R验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用ID1-F/ID1-R扩增测序，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-CEY17_04555R2916C。
实施例2MHZ-0513-3-CEY17_04555R2916C突变菌株生产谷氨酰胺的性能
发酵验证谷氨酰胺产量的方法：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于下述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于下述种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml下述发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。结果如表2所示(OD562培养液在562nm的浊度并表示细胞量，Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的量)。
培养基配方如下：
斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃0.1MPa灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆30g/L，pH 7.0；
发酵培养基：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，pH 7.0。
表2突变菌株谷氨酰胺含量检测
如表2所示，在MHZ-0513-3中CEY17_04555R2916C第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)，即CGC突变为TGC后，获得菌株MHZ-0513-3-CEY17_04555R2916C，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从28.9g/L提高到33.7g/L，产酸提高16.6％，由此可见，CEY17_04555R2916C突变利于谷氨酰胺的积累。为确认该点突变在不同菌株中是否有效，本发明将其引入菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A和谷氨酸棒杆菌ATCC 14067-glnAY405F中。
实施例3CEY17_04555R2916C突变菌株构建
菌株MHZ-0513-3、MHZ-0513-3-ino-1S84A是在模式菌谷氨酸棒杆菌ATCC 14067改造后获得，基因CEY17_04555完全相同，将实施例1构建的质粒pK18-CEY17_04555R2916C电转到MHZ-0513-3-ino-1S84A和ATCC 14067-glnAY405F(菌株ATCC 14067-glnAY405F构建方法同上，所用引物为UP2-F、UP2-R、DN2-F、DN2-R、ID2-F、ID2-R、鉴定2-F、P82、P85)。获得改造菌株命名为MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916C、14067-glnAY405F-CEY17_04555R2916C。
实施例4CEY17_04555R2916C突变菌株生产谷氨酰胺的性能
按照实施例2中的方法对实施例3中构建的改造菌株的生产谷氨酰胺的性能进行测试，结果如表2所示，MHZ-0513-3-ino-1S84A中CEY17_04555R2916C第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)，即CGC突变为TGC后，获得菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916C，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从30.7g/L提高到35.6g/L，产酸提高16.0％，ATCC14067-glnAY405F中CEY17_04555R2916C第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)，获得菌株14067-glnAY405F-CEY17_04555R2916C，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从0.6g/L提高到0.75g/L，产酸提高25.0％，由此可见，CEY17_04555R2916C突变在不同的菌株中均利于谷氨酰胺的积累。同理，将该基因整合到其他可以合成谷氨酰胺的菌株，如肠杆菌、枯草芽孢杆菌、棒杆菌等，均有利于谷氨酰胺或其衍生物的积累。
实施例5CEY17_04555第2916位氨基酸突变成其他氨基酸生产谷氨酰胺的性能
鉴于CEY17_04555第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)后，谷氨酰胺产量有所提升，本发明接着研究了第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为组氨酸(H)、丝氨酸(S)，具体为CGC突变为CAC，AGC后的改造菌株生产谷氨酰胺的性能。改造菌株构建方法参考实施例1，出发菌株为MHZ-0513-3-ino-1S84A，其中摸索退火温度所用的鉴定引物分别为鉴定3-F/DN1-R、鉴定4-F/DN1-R，其他引物相同，突变菌株分别命名为MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916H、MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916S，按照实施例2中的方法进行发酵实验，结果如下表3：
表3突变菌株谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A | 43.5 | 30.7 | -- |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916H | 43.9 | 33.5 | 9.1 |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04555R2916S | 44.3 | 34.9 | 13.7 |
发酵结果表明，第2916位氨基酸由精氨酸(R)突变为组氨酸(H)、丝氨酸(S)后，突变株谷氨酰胺产量均有提升，且效果都优于对照菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A，其中突变为丝氨酸(S)后，谷氨酰胺产量提高到34.9g/L，产酸提高13.7％。显而易见，该位点突变成其他氨基酸也有利于谷氨酰胺及其衍生物的生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种CEY17_04555突变体，其特征在于，以野生型CEY17_04555的氨基酸序列为参考序列，含有第2916位精氨酸被其他氨基酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的CEY17_04555突变体，其特征在于，所述其他氨基酸为半胱氨酸、组氨酸或丝氨酸。
3.根据权利要求2所述的CEY17_04555突变体，其特征在于，所述CEY17_04555突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种DNA分子，其特征在于，以SEQ ID NO.1为参考序列，所述DNA分子含有第8746-8748位碱基由CGC突变为TGC、CAC或AGC的突变。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1-3任一项所述的CEY17_04555突变体。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为棒杆菌、肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
8.权利要求5-7任一项所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物中的应用；
(2)在用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物产量上的应用。
9.一种L-谷氨酰胺或其衍生物的生产方法，其特征在于，包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如权利要求5-7任一项所述。
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