CN116949108A - L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用 - Google Patents

L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及L‑谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用。本发明通过强化棒状杆菌属细菌中大肠杆菌来源的rarD基因的表达，使得棒状杆菌属细菌生产L‑谷氨酰胺的能力显著提升。本发明还提供一种RarD蛋白突变体，该突变体能够显著提高RarD蛋白外运L‑谷氨酰胺的活性，可用于提升谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物的L‑谷氨酰胺或以L‑谷氨酰胺为前体的衍生物的产量和转化率。

Description

L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用。
背景技术
L-谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，还可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中具有重要作用。
目前，L-谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。目前主要以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为生产菌发酵生产L-谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。但目前生产L-谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，L-谷氨酰胺的产量和转化率仍不理想，工业上对L-谷氨酰胺的需求量较高，现有的菌种无法满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的第一目的是提供大肠杆菌RarD蛋白的应用以及表达大肠杆菌RarD蛋白的棒状杆菌属微生物。
本发明的第二目的是提供一种RarD蛋白突变体及其应用。
本发明的第三目的是提供表达RarD蛋白突变体的重组微生物以及利用该微生物发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物的方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因在提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
RarD为大肠杆菌的假定转运蛋白，本发明发现，大肠杆菌RarD蛋白具有将微生物细胞内的L-谷氨酰胺向细胞外转运的活性，可用于提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力，进而提高L-谷氨酰胺的产量、转化率。
对于大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因的序列，本领域技术人员可通过公开的数据库等获得，例如：其中一种大肠杆菌RarD蛋白的基因编号为b3819，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
具体地，上述应用为通过增强RarD蛋白的活性和/或增强RarD蛋白的表达提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力或提高微生物的L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率。
以上所述的增强RarD蛋白的活性、增强RarD蛋白的表达可通过以下1)-6)任一方式或其任选的组合实现：
1)通过导入具有RarD蛋白编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上RarD蛋白编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上RarD蛋白编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与RarD蛋白编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对RarD蛋白的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对RarD蛋白编码基因的序列进行改变而增强。
以上所述的微生物优选为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
本发明中，所述L-谷氨酰胺的衍生物为以L-谷氨酰胺为前体进行生物合成的物质，包括但不限于核苷类物质、精氨酸等。
第二方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物表达大肠杆菌RarD蛋白。
以上所述的表达大肠杆菌RarD蛋白可通过以下1)-2)任一方式或其任选的组合实现：
1)导入具有RarD蛋白编码基因的质粒；
2)在染色体上插入RarD蛋白编码基因。
优选地，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
第三方面，本发明提供一种RarD蛋白突变体，以野生型大肠杆菌的RarD蛋白为参考序列，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为除脯氨酸和丝氨酸以外的其它氨基酸的突变。
优选地，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸的突变。
本发明发现，将RarD蛋白的第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸能够显著提高其L-谷氨酰胺转运活性，可用于提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力，进而提高L-谷氨酰胺的产量、转化率。
进一步优选地，所述RarD蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。
其中，SEQ ID NO.1所示的RarD蛋白突变体的第188位氨基酸突变为苏氨酸，SEQID NO.2所示的RarD蛋白突变体的第188位氨基酸突变为亮氨酸。
第四方面，本发明提供编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子。
根据上述RarD蛋白突变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够确定编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。
第五方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体。
所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞，优选为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
第六方面，本发明提供所述RarD蛋白突变体或所述核酸分子在提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
优选地，所述微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
第七方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物表达所述RarD蛋白突变体。
优选地，所述重组微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
以上所述的表达RarD蛋白突变体可通过以下1)-2)任一方式或其任选的组合实现：
1)导入具有RarD蛋白突变体编码基因的质粒；
2)在染色体上插入RarD蛋白突变体编码基因。
进一步优选地，所述重组微生物为在染色体上插入编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子的谷氨酸棒状杆菌。
作为本发明的优选方案，所述编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子上游还连接有Psod启动子。
可选的染色体插入位置为CEY17_12610处。
所述重组微生物通过在出发菌株的染色体上插入编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子得到。
以上所述的重组微生物的出发菌株优选为能够合成并积累L-谷氨酰胺的微生物。
能够合成并积累L-谷氨酰胺的微生物可通过基因工程改造或诱变等方式获得。
优选地，所述出发菌株中以下(1)-(3)中任意一种或多种酶的活性降低或失活：
(1)腺苷酰基转移酶；
(2)L-谷氨酰胺酶；
(3)α-酮戊二酸脱氢酶；
优选地，所述α-酮戊二酸脱氢酶为α-酮戊二酸脱氢酶E1。
和/或，所述出发菌株中丙酮酸羧化酶的活性增强。
上述活性降低或失活可通过降低编码所述酶的基因的表达或敲除内源的编码所述酶的基因实现。
上述活性增强可通过以下1)～6)中的任一种或其任选的组合实现：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。
优选地，所述出发菌株为在谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067的基础上经上述改造得到。
作为本发明的优选方案，所述出发菌株为保藏编号为CGMCC No.13405的谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3。谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3已在专利申请CN106701649A中公开，其分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13405。
第八方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或所述重组微生物在生产L-谷氨酰胺或其衍生物或提高L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率中的应用。
第九方面，本发明提供一种发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物的方法，所述方法包括：培养所述修饰的棒状杆菌属微生物或所述重组微生物，获得培养物；从所述培养物中收集L-谷氨酰胺或其衍生物。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过强化棒状杆菌属细菌中大肠杆菌来源的rarD基因的表达，使得棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酰胺的能力显著提升。经验证，在染色体上插入大肠杆菌来源的rarD基因的谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酰胺的产量显著提高。
2、本发明提供的RarD蛋白突变体能够显著提高RarD蛋白外运L-谷氨酰胺的活性，可用于提升谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物的L-谷氨酰胺产量和转化率，经验证，在染色体上插入RarD蛋白突变体编码基因的谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酰胺产量得到进一步提升，该突变体可应用于L-谷氨酰胺或以L-谷氨酰胺为前体的衍生物(精氨酸和核苷类产品等)的发酵生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物序列
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1质粒pK18-Psod-rarD的构建和重组菌株MHZ-0513-3-Psod-rarD的构建
在谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3的基因组CEY17_12610处插入大肠杆菌来源的rarD基因，具体构建过程如下：
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ01-UP-F/PQ02-UP-R为引物，扩增重组片段UP，以PQ07-DN-F/PQ08-DN-R为引物，扩增重组片段DN，以PQ03-Psod-F/PQ04-Psod-R为引物，扩增启动子片段Psod；以大肠杆菌K-12MG1655为模板，以PQ05-rarD-F/PQ06-rarD-R为引物，扩增基因片段rarD，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以UP、Psod为模板，以PQ01-UP-F/PQ04-Psod-R为引物扩增overlap片段，所得overlap片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化。同时将pK18-mobsacB(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/SalI进行消化，将overlap、rarD、DN三个片段和pK18-mobsacB载体用无缝克隆试剂盒(诺唯赞)进行组装，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/SalI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过用P82/P85引物测序(金唯智公司)鉴定插入的片段正确(测序结果如SEQ ID NO.3所示)。将所得到的质粒命名为pK18-Psod-rarD。
将pK18-Psod-rarD转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为33℃，倒置培养。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用PQ09-ID-F/PQ10-ID-R验证重组子，将得到的阳性重组子用PQ09-ID-F/PQ10-ID-R扩增测序，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-Psod-rarD，该菌株在MHZ-0513-3的基因组CEY17_12610处插入顺次连接的Psod启动子和大肠杆菌来源的rarD基因，其中，rarD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例2 L-谷氨酰胺外运蛋白基因rarD点突变质粒构建及基因组改造
1、质粒pK18-rarDP188T和重组菌株MHZ-0513-3-rarDP188T的构建具体构建过程如下：
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ11-UP-F/PQ12-UP-R为引物，制备重组片段UP，以PQ13-DN-F/PQ14-DN-R为引物，制备重组片段DN，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，同时将pK18-mobsacB(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/SalI进行消化，将UP、DN两个片段和pK18-mobsacB载体用无缝克隆试剂盒(诺唯赞)进行组装，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/SalI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过用P82/P85引物测序(金唯智公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-rarDP188T。将pK18-rarDP188T转入谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3-Psod-rarD中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为33℃，倒置培养。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用PQ15-F/PQ14-DN-R验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用PQ16-ID-F/PQ17-ID-R扩增测序，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-rarDP188T，该菌株在MHZ-0513-3-Psod-rarD的基础上，将其中的rarD基因突变使得其编码蛋白发生P188T突变(第188位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸)。
2、质粒pK18-rarDP188L和重组菌株MHZ-0513-3-rarDP188L的构建
质粒pK18-rarDP188L的构建方法参考上述1，所用引物为PQ11-UP-F、PQ14-DN-R、PQ16-ID-F、PQ17-ID-R、PQ18-UP-R、PQ19-DN-F、PQ20-F。将质粒pK18-rarDP188L转入谷氨酸棒状杆菌MHZ-0513-3-Psod-rarD中，按照上述1中的菌株构建方法得到MHZ-0513-3-rarDP188L，该菌株在MHZ-0513-3-Psod-rarD的基础上，将其中的rarD基因突变使得其编码蛋白发生P188L(第188位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸)突变。
实施例3 MHZ-0513-3-Psod-rarD菌株生产L-谷氨酰胺的性能
对实施例1中构建的MHZ-0513-3-Psod-rarD菌株进行发酵实验，发酵验证L-谷氨酰胺产量的方法如下：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。取培养液在562nm处测定浊度，并采用高效液相色谱(HPLC)法测定培养液中的L-谷氨酰胺含量，结果如表2所示(OD562表示培养液在562nm的浊度，以此表示细胞量；Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的量，Gln转化率(％)代表相对于葡萄糖的L-谷氨酰胺的转化率)。
以上涉及的培养基配方如下：
斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃0.1MPa灭菌20min；
种子培养基为：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆30g/L，pH 7.0；
发酵培养基为：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，pH 7.0。
表2重组菌株的L-谷氨酰胺产量检测
结果显示，在MHZ-0513-3中表达大肠杆菌来源的L-谷氨酰胺外运蛋白基因rarD后，L-谷氨酰胺的产量从28.5g/L提高到31.9g/L，产酸提高11.9％，由此可见，rarD强化有利于L-谷氨酰胺的积累。
实施例4 L-谷氨酰胺外运蛋白基因rarD点突变菌株生产L-谷氨酰胺的性能
对实施例2构建的两个突变菌株MHZ-0513-3-rarDP188T和MHZ-0513-3-rarDP188L进行发酵实验，发酵实验的方法同实施例3。发酵结果如表3所示。发酵结果表明，与出发菌株MHZ-0513-3相比，突变菌株的L-谷氨酰胺产量均有显著提升，其中，MHZ-0513-3-rarDP188T的L-谷氨酰胺产量提高到38.6g/L，产酸提高35.4％，转化率达到43.0％。由此可见，RarD突变体可用于其他谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等宿主菌中，应用于L-谷氨酰胺或以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的生产，例如核苷类产品和精氨酸等。
表3突变菌株的L-谷氨酰胺产量检测
菌株 OD562 Gln(g/L) 产酸提高率％ Gln转化率％
MHZ-0513-3 43.3 28.5 -- 31.7
MHZ-0513-3-Psod-rarD 43.5 31.9 11.9 35.5
MHZ-0513-3-Psod-rarDP188T 43.6 38.6 35.4 43.0
MHZ-0513-3-Psod-rarDP188L 43.1 37.1 30.2 41.3
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用
<130> KHP221110899.3
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Ala Lys Gln Thr Arg Gln Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Phe Ile Trp Gly Ile Ala Pro Ala Tyr Phe Lys Leu Ile Tyr Tyr
20 25 30
Val Pro Ala Asp Glu Ile Leu Thr His Arg Val Ile Trp Ser Phe Phe
35 40 45
Phe Met Val Val Leu Met Ser Ile Cys Arg Gln Trp Ser Tyr Leu Lys
50 55 60
Thr Leu Ile Gln Thr Pro Gln Lys Ile Phe Met Leu Ala Val Ser Ala
65 70 75 80
Val Leu Ile Gly Gly Asn Trp Leu Leu Phe Ile Trp Ala Val Asn Asn
85 90 95
His His Met Leu Glu Ala Ser Leu Gly Tyr Phe Ile Asn Pro Leu Val
100 105 110
Asn Ile Val Leu Gly Met Ile Phe Leu Gly Glu Arg Phe Arg Arg Met
115 120 125
Gln Trp Leu Ala Val Ile Leu Ala Ile Cys Gly Val Leu Val Gln Leu
130 135 140
Trp Thr Phe Gly Ser Leu Pro Ile Ile Ala Leu Gly Leu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Phe Ala Phe Tyr Gly Leu Val Arg Lys Lys Ile Ala Val Glu Ala Gln
165 170 175
Thr Gly Met Leu Ile Glu Thr Met Trp Leu Leu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Tyr Leu Phe Ala Ile Ala Asp Ser Ser Thr Ser His Met Gly Gln Asn
195 200 205
Pro Met Ser Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ala Ala Gly Ile Val Thr Thr
210 215 220
Val Pro Leu Leu Cys Phe Thr Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Leu Ser
225 230 235 240
Thr Leu Gly Phe Phe Gln Tyr Ile Gly Pro Thr Leu Met Phe Leu Leu
245 250 255
Ala Val Thr Phe Tyr Gly Glu Lys Pro Gly Ala Asp Lys Met Val Thr
260 265 270
Phe Ala Phe Ile Trp Val Ala Leu Ala Ile Phe Val Met Asp Ala Ile
275 280 285
Tyr Thr Gln Arg Arg Thr Ser Lys
290 295
<210> 2
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ala Lys Gln Thr Arg Gln Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Phe Ile Trp Gly Ile Ala Pro Ala Tyr Phe Lys Leu Ile Tyr Tyr
20 25 30
Val Pro Ala Asp Glu Ile Leu Thr His Arg Val Ile Trp Ser Phe Phe
35 40 45
Phe Met Val Val Leu Met Ser Ile Cys Arg Gln Trp Ser Tyr Leu Lys
50 55 60
Thr Leu Ile Gln Thr Pro Gln Lys Ile Phe Met Leu Ala Val Ser Ala
65 70 75 80
Val Leu Ile Gly Gly Asn Trp Leu Leu Phe Ile Trp Ala Val Asn Asn
85 90 95
His His Met Leu Glu Ala Ser Leu Gly Tyr Phe Ile Asn Pro Leu Val
100 105 110
Asn Ile Val Leu Gly Met Ile Phe Leu Gly Glu Arg Phe Arg Arg Met
115 120 125
Gln Trp Leu Ala Val Ile Leu Ala Ile Cys Gly Val Leu Val Gln Leu
130 135 140
Trp Thr Phe Gly Ser Leu Pro Ile Ile Ala Leu Gly Leu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Phe Ala Phe Tyr Gly Leu Val Arg Lys Lys Ile Ala Val Glu Ala Gln
165 170 175
Thr Gly Met Leu Ile Glu Thr Met Trp Leu Leu Leu Val Ala Ala Ile
180 185 190
Tyr Leu Phe Ala Ile Ala Asp Ser Ser Thr Ser His Met Gly Gln Asn
195 200 205
Pro Met Ser Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ala Ala Gly Ile Val Thr Thr
210 215 220
Val Pro Leu Leu Cys Phe Thr Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Leu Ser
225 230 235 240
Thr Leu Gly Phe Phe Gln Tyr Ile Gly Pro Thr Leu Met Phe Leu Leu
245 250 255
Ala Val Thr Phe Tyr Gly Glu Lys Pro Gly Ala Asp Lys Met Val Thr
260 265 270
Phe Ala Phe Ile Trp Val Ala Leu Ala Ile Phe Val Met Asp Ala Ile
275 280 285
Tyr Thr Gln Arg Arg Thr Ser Lys
290 295
<210> 3
<211> 2429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgaca 60
tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga agctgcaaca atcaaaggca 120
acataagctt ctttttcacc gattaatctc cttcgaattg ttcagaccat aaagctaccg 180
gtcacactcg ttctttgcag atggtgccgt cggaaaacat gaaatcgggc agtacgtcat 240
ctgggtcgag gatgaacacc tcaaagcctg cgtcgcggat gcgtttgagg ccttctttga 300
tcatgcggat ggctacgggg tggaagctaa gtactcgggt gagatcaaga acaacttcgg 360
tgccttcaaa gttgtgttcc acgatggcgt ggaggaagct ttcgctggct gagaagttca 420
tggcgccctg catttggatg aaggtggtgt cgccgtcccg cgtaatggat cgtactgcgt 480
ggccggatac ctgctcggtg gacataaggt ggaggcccat gtcgtcggaa agctgtttga 540
atatttttac gccgcgcacg ctgttgcctt tggggttcag gcgtggggaa aatgtggcga 600
tgcccagctg atagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccga taaataggtc 660
ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggagg tgtcgcacca 720
agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa 780
acctacgaaa ggatttttta cccatggatg caaaacaaac gcggcagggc gtattactcg 840
ctcttgccgc ttattttatt tggggtatag cgccagcgta cttcaagttg atttactacg 900
tgcccgccga tgaaatcctg acgcatcgcg tgatctggtc gtttttcttt atggtggtgc 960
tgatgagcat ttgccgccag tggtcctatt taaaaacgct gattcagacg ccacagaaaa 1020
tttttatgct ggcagtctct gccgtgctga ttggtggcaa ctggctactg tttatctggg 1080
cggtgaacaa tcaccatatg ctggaagcga gccttggtta ctttattaac ccgctggtga 1140
acattgtgct ggggatgatt ttcctcggcg agcgattccg ccggatgcaa tggctggcgg 1200
tgattctggc gatatgtggc gtgttagtcc agctgtggac ttttggttcg ctacctatta 1260
tcgcgctggg actggcattt agttttgcct tctacggtct ggtacgcaag aagattgccg 1320
ttgaagcgca aaccggcatg ttaatcgaaa ccatgtggct gctgcccgtg gcggcaattt 1380
acctgtttgc tattgccgac agctcaacca gccatatggg gcaaaacccg atgtcgctga 1440
atttactgct gatcgccgcc ggtattgtca ctaccgtacc gctgttgtgt tttaccgccg 1500
ctgccacgcg cttgcgtctc tcaacgttag gctttttcca gtacattggc ccgacgctga 1560
tgttcctgct ggctgtgacg ttttatggtg aaaaaccggg tgccgataag atggtgactt 1620
tcgcctttat ttgggtggcg ctggcaattt ttgtgatgga tgcgatttat acgcagcgta 1680
gaacgtccaa ataacctggc agaatgccga tgagtccgcc ggcgactcct gatttcgcgg 1740
ggatgcctac ggtggagagc cactgccctg cctcgtcgta catgcctgct gaagccatga 1800
cggagagggt gaggcggcag acgcgggcgt cgagaagctt cttgccggta attgggtgcg 1860
tgccgccggc ggcgagcgtg gcggtcatga ctgcgaggtc gcgcgtggtt actttgatgg 1920
cacattgcag cgtgtagctg aggacggcgt cgtgggcttc gtcttcgatg acgccatagt 1980
tgcgcagcat gtgggcgatg gagaggttgc ggtcggcgcc ggcgagttcg gattcaaagc 2040
cgcattcttg gagtgcgagt gcgtaggcaa agggcttgga aatactttgc atggtgaatt 2100
cgatgtcgtc atcgcctgcg ctgtagatgt gtccgttaac ggtgcacagg gctactgcca 2160
gcgggtttgg gtcggcagat tttagttccg ggatgtaatc ggccaagtcg acctgcaggc 2220
atgcaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 2280
cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 2340
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgataagcta 2400
gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcg 2429
<210> 4
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggatgcaa aacaaacgcg gcagggcgta ttactcgctc ttgccgctta ttttatttgg 60
ggtatagcgc cagcgtactt caagttgatt tactacgtgc ccgccgatga aatcctgacg 120
catcgcgtga tctggtcgtt tttctttatg gtggtgctga tgagcatttg ccgccagtgg 180
tcctatttaa aaacgctgat tcagacgcca cagaaaattt ttatgctggc agtctctgcc 240
gtgctgattg gtggcaactg gctactgttt atctgggcgg tgaacaatca ccatatgctg 300
gaagcgagcc ttggttactt tattaacccg ctggtgaaca ttgtgctggg gatgattttc 360
ctcggcgagc gattccgccg gatgcaatgg ctggcggtga ttctggcgat atgtggcgtg 420
ttagtccagc tgtggacttt tggttcgcta cctattatcg cgctgggact ggcatttagt 480
tttgccttct acggtctggt acgcaagaag attgccgttg aagcgcaaac cggcatgtta 540
atcgaaacca tgtggctgct gcccgtggcg gcaatttacc tgtttgctat tgccgacagc 600
tcaaccagcc atatggggca aaacccgatg tcgctgaatt tactgctgat cgccgccggt 660
attgtcacta ccgtaccgct gttgtgtttt accgccgctg ccacgcgctt gcgtctctca 720
acgttaggct ttttccagta cattggcccg acgctgatgt tcctgctggc tgtgacgttt 780
tatggtgaaa aaccgggtgc cgataagatg gtgactttcg cctttatttg ggtggcgctg 840
gcaatttttg tgatggatgc gatttatacg cagcgtagaa cgtccaaata a 891
<210> 5
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asp Ala Lys Gln Thr Arg Gln Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Phe Ile Trp Gly Ile Ala Pro Ala Tyr Phe Lys Leu Ile Tyr Tyr
20 25 30
Val Pro Ala Asp Glu Ile Leu Thr His Arg Val Ile Trp Ser Phe Phe
35 40 45
Phe Met Val Val Leu Met Ser Ile Cys Arg Gln Trp Ser Tyr Leu Lys
50 55 60
Thr Leu Ile Gln Thr Pro Gln Lys Ile Phe Met Leu Ala Val Ser Ala
65 70 75 80
Val Leu Ile Gly Gly Asn Trp Leu Leu Phe Ile Trp Ala Val Asn Asn
85 90 95
His His Met Leu Glu Ala Ser Leu Gly Tyr Phe Ile Asn Pro Leu Val
100 105 110
Asn Ile Val Leu Gly Met Ile Phe Leu Gly Glu Arg Phe Arg Arg Met
115 120 125
Gln Trp Leu Ala Val Ile Leu Ala Ile Cys Gly Val Leu Val Gln Leu
130 135 140
Trp Thr Phe Gly Ser Leu Pro Ile Ile Ala Leu Gly Leu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Phe Ala Phe Tyr Gly Leu Val Arg Lys Lys Ile Ala Val Glu Ala Gln
165 170 175
Thr Gly Met Leu Ile Glu Thr Met Trp Leu Leu Pro Val Ala Ala Ile
180 185 190
Tyr Leu Phe Ala Ile Ala Asp Ser Ser Thr Ser His Met Gly Gln Asn
195 200 205
Pro Met Ser Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ala Ala Gly Ile Val Thr Thr
210 215 220
Val Pro Leu Leu Cys Phe Thr Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Leu Ser
225 230 235 240
Thr Leu Gly Phe Phe Gln Tyr Ile Gly Pro Thr Leu Met Phe Leu Leu
245 250 255
Ala Val Thr Phe Tyr Gly Glu Lys Pro Gly Ala Asp Lys Met Val Thr
260 265 270
Phe Ala Phe Ile Trp Val Ala Leu Ala Ile Phe Val Met Asp Ala Ile
275 280 285
Tyr Thr Gln Arg Arg Thr Ser Lys
290 295
<210> 6
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60
ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120
gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
gattttttac cc 192
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtacccggg gatcctctag aagctgcaac aatcaaaggc aac 43
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccggaata attggcagct atcagctggg catcgccaca t 41
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagctgccaa ttattccggg c 21
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtttgtttt gcatccatgg gtaaaaaatc ctttcgtag 39
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggatgcaa aacaaacg 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttatttggac gttctacgct g 21
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagcgtagaa cgtccaaata acctggcaga atgccgatga g 41
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactt ggccgattac atc 43
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgggttggc cacttaatga ggt 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgcggattt tctccgcagt 20
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtacccggg gatcctctag acaagttgat ttactacgtg c 41
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccacgagcag cagccacatg gtttcg 26
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggctgctgct cgtggcggca atttac 26
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgcatgcct gcaggtcgac cgccgccggc ggcacgcacc caat 44
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgaaaccatg tggctgctga t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaacgcggca gggcgtatta c 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgaccgcaac ctctccatcg 20
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccactggcag cagccacatg gtttcg 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggctgctgac cgtggcggca atttac 26
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atcgaaacca tgtggctgct ca 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctcgtatgtt gtgtggaatt gtg 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgccctgagt gcttgcggca 20

Claims (10)

1.大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因在提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过增强RarD蛋白的活性和/或增强RarD蛋白的表达提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力或提高L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率；
优选地，所述微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
3.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物表达大肠杆菌RarD蛋白。
4.RarD蛋白突变体，其特征在于，以野生型大肠杆菌的RarD蛋白为参考序列，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为除脯氨酸和丝氨酸以外的其它氨基酸的突变；
优选地，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸的突变；
更优选地，所述RarD蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。
5.编码权利要求4所述的RarD蛋白突变体的核酸分子。
6.含有权利要求5所述的核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
7.权利要求4所述的RarD蛋白突变体或权利要求5所述的核酸分子在提高微生物的L-谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L-谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用；
优选地，所述微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
8.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求4所述的RarD蛋白突变体；
优选地，所述重组微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物；
更优选地，所述重组微生物为在染色体上插入编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子的谷氨酸棒状杆菌。
9.权利要求3所述的修饰的棒状杆菌属微生物或权利要求8所述的重组微生物在生产L-谷氨酰胺或其衍生物或提高L-谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率中的应用。
10.一种发酵生产L-谷氨酰胺或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求3所述的修饰的棒状杆菌属微生物或权利要求8所述的重组微生物，获得培养物；从所述培养物中收集L-谷氨酰胺或其衍生物。
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