CN118126145A - 提高谷氨酰胺发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高谷氨酰胺发酵产量的方法，通过将谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_10535基因编码的蛋白第64位缬氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，第158位精氨酸突变为丝氨酸，获得特定突变体，显著提高了谷氨酰胺生产菌株中谷氨酰胺以及以谷氨酰胺为前体的衍生物的产量及转化率。本发明为谷氨酰胺发酵生产提供有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地说，涉及一种提高谷氨酰胺发酵产量的方法。
背景技术
L-谷氨酰胺是一种非必需氨基酸。化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。
目前，L-谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产L-谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前生产L-谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，L-谷氨酰胺转化率不理想，工业上对L-谷氨酰胺的需求量极高，现有的菌种无法满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高谷氨酰胺发酵产量的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种蛋白突变体，其为CEY17_10535基因编码的蛋白突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_10535基因编码的氨基酸序列为参考序列，所述CEY17_10535基因编码的蛋白突变体含有如下①和/或②突变：
①第64位由V到A或G的突变；
②第158位由R到S的突变。
优选地，所述CEY17_10535基因编码的蛋白突变体含有V64G和R158S突变。
第二方面，本发明提供编码所述蛋白突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。
所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第三方面，本发明提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
(1)用于L-谷氨酰胺以及以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产；
(2)用于构建产L-谷氨酰胺的工程菌。
本发明中，所述以L-谷氨酰胺为前体的衍生物包括但不限于精氨酸和核苷。
第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述微生物表达所述的蛋白突变体。
进一步地，出发菌为棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)或芽孢杆菌属(Bacillus)菌种，如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
优选地，出发菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3，保藏编号为CGMCC No.13405。谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3可参见CN106701649A。
第五方面，本发明提供所述重组微生物的构建方法，将编码所述蛋白突变体的基因通过质粒导入出发菌中或通过基因工程手段整合到出发菌的染色体上，或者，将谷氨酸棒杆菌中的CEY17_10535基因突变为编码所述蛋白突变体的基因。
第六方面，本发明提供所述重组微生物在L-谷氨酰胺以及以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产中的应用。
第七方面，本发明提供一种提高谷氨酰胺发酵产量的方法，包括对所述重组微生物进行发酵培养的步骤。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
当CEY17_10535基因的64位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)，158位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)后，与出发菌株MHZ-0513-3相比，L-谷氨酰胺产量均有提高。其中单点突变V64A和V64G菌株的L-谷氨酰胺产量由28.5g/L分别提高到30.2g/L和31.4g/L，产酸提高6.0％和10.2％；而第158位氨基酸突变为丝氨酸时，L-谷氨酰胺产量达31.6g/L，产酸提高10.9％。叠加以上两个不同位点的突变后发现，L-谷氨酰胺产量增加有累加效果。其中V64G-R158S双突变的L-谷氨酰胺达到32.9g/L，产酸提高15.4％，转化率最高达到36.6％。此外通过构建删除200bp失活CEY17_10535基因的菌株，L-谷氨酰胺产量仅为29g/L。由此可见，CEY17_10535位点的第64和158位点突变均优于删除失活。以上突变可用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等宿主菌中，应用于以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的生产，例如精氨酸和核苷类产品等。
具体实施方式
本发明提供一种谷氨酸棒杆菌，对细胞内CEY17_10535(NCBI的序列编号)位点进行修饰，具体修饰手段为第64位氨基酸突变(V64A、V64G)和第158位氨基酸突变(R158S)。其中CEY17_10535基因编码一个未知功能的假定蛋白。本发明同时实施了CEY17_10535位点删除200bp以失活该基因，以及检测其产L-谷氨酰胺的能力。
谷氨酸棒杆菌以保藏编号为CGMCC No.13405的谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3为出发菌株构建得到。其中，谷氨酸棒杆MHZ-0513-3已在CN106701649A中公开，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13405。
以下实施例中涉及的引物名称及序列信息如表1所示。
表1引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
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| PQ592-ID-R | GTTTCTAGCGCAACTGCTTC |
| PQ82 | CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG |
| PQ85 | CGCCCTGAGTGCTTGCGGCA |
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过正规渠道商购获得。
本发明提供的CEY17_10535基因编码的含有V64A、V64G、R158S蛋白突变体的氨基酸序列，分别如SEQ ID NO:2、4、6所示，其编码核酸序列分别如SEQ ID NO:1、3、5所示。CEY17_10535基因ORF删除200bp后碱基序列如SEQ ID NO:7所示。
实施例1CEY17_10535基因氨基酸点突变质粒构建及基因组改造
具体构建步骤如下：
1、质粒pK18-V64A和重组菌株MHZ-0513-3-V64A的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ570-UP-1F/PQ571-UP-1R为引物，制备重组片段UP，以PQ572-DN-2F/PQ573-DN-2R为引物，制备重组片段DN，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)纯化。同时将pK18-mobsacB质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/HindIII进行消化，将UP、DN片段和pK18-mobsacB载体用无缝克隆试剂盒(诺唯赞)进行组装，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆用PQ82/PQ85引物进行PCR鉴定，正确的提取质粒后进行XbaI/HindIII酶切鉴定，进一步通过用PQ82/PQ85引物测序(金唯智公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-V64A。将pK18-V64A转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为33℃，倒置培养。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用PQ574-id-F/PQ576-ID-R验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用PQ575-ID-F/PQ576-ID-R扩增片段测序，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-V64A。
2、质粒pK18-V64G和重组菌株MHZ-0513-3-V64G的构建
质粒和重组菌种构建方法参考上述1，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ570-UP-1F/PQ577-UP-1R为引物，制备重组片段UP，以PQ578-DN-2F/PQ573-DN-2R为引物，制备重组片段DN。将UP、DN片段和经过XbaI/HindIII消化的pK18-mobsacB载体进行组装，转化Trans1T1感受态细胞，挑取卡那抗性克隆用PQ82/PQ85引物进行PCR鉴定，正确的提取质粒后进行XbaI/HindIII酶切鉴定，进一步通过用PQ82/PQ85引物测序鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-V64G。将pK18-V64G转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中。使用引物PQ579-id-F/PQ576-ID-R摸索退火温度，鉴定正确的二次重组子用PQ575-ID-F/PQ576-ID-R扩增片段测序，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-V64G。
3、质粒pK18-R158S和重组菌株MHZ-0513-3-R158S的构建
质粒和重组菌种构建方法参见步骤1，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ580-UP-1F/PQ581-UP-1R为引物，制备重组片段UP，以PQ582-DN-2F/PQ583-DN-2R为引物，制备重组片段DN。将UP、DN片段和经过XbaI/HindIII消化的pK18-mobsacB载体进行组装，转化Trans1T1感受态细胞，挑取卡那抗性克隆用PQ82/PQ85引物进行PCR鉴定，正确的提取质粒后进行XbaI/HindIII酶切鉴定，进一步通过用PQ82/PQ85引物测序鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-R158S。将pK18-R158S转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中。使用引物PQ584-id-F/PQ586-ID-R摸索退火温度，鉴定正确的二次重组子用PQ585-ID-F/PQ586-ID-R扩增片段测序，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-R158S。
4、MHZ-0513-3-V64A-R158S和MHZ-0513-3-V64G-R158S的构建
构建方法参考步骤3，分别以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3-V64A和MHZ-0513-3-V64G为出发菌，电转质粒pK18-R158S。使用引物PQ584-id-F/PQ586-ID-R摸索退火温度，鉴定正确的二次重组子用PQ585-ID-F/PQ586-ID-R扩增片段测序，获得目的突变菌株，并分别命名为MHZ-0513-3-V64A-R158S和MHZ-0513-3-V64G-R158S。
5、质粒pK18-ΔCEY17_10535和重组菌株MHZ-0513-3-ΔCEY17_10535的构建
质粒和重组菌种构建方法参考上述1，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3的基因组为模板，以PQ587-UP-1F/PQ588-UP-1R为引物，制备重组片段UP，以PQ589-DN-2F/PQ590-DN-2R为引物，制备重组片段DN。将UP、DN片段和经过XbaI/HindIII消化的pK18-mobsacB载体进行组装，转化Trans1T1感受态细胞，挑取卡那抗性克隆用PQ82/PQ85引物进行PCR鉴定，正确的提取质粒后进行XbaI/HindIII酶切鉴定，进一步通过用PQ82/PQ85引物测序鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-ΔCEY17_10535。将pK18-ΔCEY17_10535转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中。使用引物PQ591-ID-F/PQ592-ID-R鉴定正确的二次重组子并测序，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-ΔCEY17_10535。
实施例2重组菌株生产L-谷氨酰胺的性能
发酵验证L-谷氨酰胺产量的方法：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。结果如表2所示(OD562培养液在562nm的浊度并表示细胞量，Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的量)。
培养基配方如下：
斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃0.1MPa灭菌20min；
种子培养基为：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆30g/L，pH 7.0。
发酵培养基为：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，pH 7.0。
表2重组菌株L-谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 转化率％ |
| MHZ-0513-3 | 43.9 | 28.5 | 31.7 |
| MHZ-0513-3-ΔCEY17_10535 | 43.3 | 29.0 | 32.2 |
| MHZ-0513-3-V64A | 43.5 | 30.2 | 33.6 |
| MHZ-0513-3-V64G | 43.7 | 31.4 | 34.9 |
| MHZ-0513-3-R158S | 44.0 | 31.6 | 35.1 |
| MHZ-0513-3-V64A-R158S | 44.1 | 32.3 | 35.9 |
| MHZ-0513-3-V64G-R158S | 44.3 | 32.9 | 36.6 |
注：OD562表示培养液在562nm的浊度并表示细胞量，Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的量。
如表2所示，在MHZ-0513-3中失活CEY17_10535基因(删除ORF区200bp)后，L-谷氨酰胺产量仅有29.0g/L。而CEY17_10535基因的第64位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)，第158位精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)后，突变菌株L-谷氨酰胺产量均有提升，分别为30.2g/L、31.4g/L和31.6g/L；在叠加这两个位点氨基酸突变后，L-谷氨酰胺产量有了进一步提高，其中MHZ-0513-3-V64G-R158S达到32.9g/L，转化率为36.6％，转化率比出发菌MHZ-0513-3提高4.9％。进一步地，可将该突变用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等宿主菌中，应用于以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的生产，例如核苷类产品和精氨酸等。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.蛋白突变体，其特征在于，其为CEY17_10535基因编码的蛋白突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_10535基因编码的氨基酸序列为参考序列，所述CEY17_10535基因编码的蛋白突变体含有如下①和/或②突变：
①第64位由V到A或G的突变；
②第158位由R到S的突变。
2.编码权利要求1所述蛋白突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；
所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
3.权利要求2所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
(1)用于L-谷氨酰胺以及以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产；
(2)用于构建产L-谷氨酰胺的工程菌；
其中，所述以L-谷氨酰胺为前体的衍生物包括精氨酸和核苷。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物表达权利要求1所述的蛋白突变体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，出发菌为棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)或芽孢杆菌属(Bacillus)菌种。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，出发菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；
优选地，出发菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3，保藏编号为CGMCC No.13405。
7.权利要求4-6任一项所述重组微生物的构建方法，其特征在于，将编码权利要求1所述蛋白突变体的基因通过质粒导入出发菌中或通过基因工程手段整合到出发菌的染色体上，或者，将谷氨酸棒杆菌中的CEY17_10535基因突变为编码权利要求1所述蛋白突变体的基因；
所述出发菌同权利要求5或6中所述。
8.权利要求4-6任一项所述重组微生物在L-谷氨酰胺以及以L-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产中的应用；
其中，所述以L-谷氨酰胺为前体的衍生物包括精氨酸和核苷。
9.一种提高谷氨酰胺发酵产量的方法，其特征在于，包括对权利要求4-6任一项所述重组微生物进行发酵培养的步骤。
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