CN115678863A - 琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用 - Google Patents

琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN115678863A CN202110858651.4A CN202110858651A CN115678863A CN 115678863 A CN115678863 A CN 115678863A CN 202110858651 A CN202110858651 A CN 202110858651A CN 115678863 A CN115678863 A CN 115678863A
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王亚迪
胡丹
李�柱
李岩
郑克义
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用。本发明发现通过降低琥珀酸脱氢酶的表达、酶活性能够显著提高赖氨酸等以天冬氨酸为合成前体的产物的产量和转化率。本发明提供的琥珀酸脱氢酶突变体能够弱化琥珀酸脱氢酶，促进赖氨酸等以天冬氨酸为合成前体的产物的积累，表达该突变体的重组微生物的赖氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，该突变体和重组微生物为天冬氨酸、其衍生物、天冬氨酸族氨基酸的生产菌株的选育提供了有利的改造靶点、突变体和菌种资源。

Description

琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用。
背景技术
天冬氨酸和天冬氨酸族氨基酸在饲料、食品、医药和化工等领域具有广泛的应用。其中，L-赖氨酸是一种碱性必需氨基酸，分子式为C6H14N2O2，外观为白色或近乎于白色结晶粉末。在210℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。L-赖氨酸广泛应用于动物饲料、医药和食品工业，其中约90％的L-赖氨酸用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可促进动物机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。因此，提高L-赖氨酸的生产效率具有重要的意义。
目前，L-赖氨酸最常用的生产方法为微生物发酵法，微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。大肠杆菌(Escherichia coli)由于其生长速度快，遗传背景清晰，培养条件简单，代谢工程手段成熟等优点，广泛应用于工业发酵领域，可用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸等。
琥珀酸脱氢酶(SDH)是三羧酸循环中的一个酶，该酶可逆地催化琥珀酸和延胡索酸的相互转化。根据微生物物种的不同，琥珀酸脱氢酶由3或4个亚基所构成，这其中如果有1种亚基经过修饰，则可导致琥珀酸脱氢酶的功能发生改变。其中，sdhA编码黄素蛋白亚基，后者参与了从琥珀酸合成延胡索酸的反应。中国专利CN101563453B公开了通过弱化sdhA基因，达到弱化琥珀酸脱氢酶的目的，可使得菠萝泛菌高产谷氨酸及其谷氨酸家族氨基酸。中国专利CN106191155B公开了通过弱化sdhA基因的表达，显著提高大肠杆菌合成聚酮类化合物的产量。
目前，关于黄素蛋白亚基编码基因sdhA的弱化对L-赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的积累是否有影响未见报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供琥珀酸脱氢酶在提高天冬氨酸或天冬氨酸族氨基酸的产量、转化率中应用。
本发明的第二目的在于提供琥珀酸脱氢酶突变体及其应用。
本发明的第三目的在于提供一种重组微生物。
本发明的第四目的在于提供一种生产天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供琥珀酸脱氢酶或其抑制因子、琥珀酸脱氢酶编码基因或其抑制因子、含有琥珀酸脱氢酶编码基因或所述抑制因子的生物材料的如下任一种应用：
(1)在提高微生物的天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的产量和/或转化率中的应用；
(2)在构建用于天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸生产的微生物中的应用；
(3)在天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的发酵生产中的应用。
本发明发现，在微生物中降低琥珀酸脱氢酶的表达、酶活性能够显著提高天冬氨酸、其衍生物和天冬氨酸族氨基酸的产量和转化率。
本发明中，所述天冬氨酸的衍生物为天冬氨酸经修饰或以天冬氨酸为前体合成的物质。所述天冬氨酸族氨基酸包括赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、高丝氨酸、异亮氨酸。
本发明所述的琥珀酸脱氢酶可为琥珀酸脱氢酶的各亚基中的一个或多个。
具体地，琥珀酸脱氢酶的亚基包括SdhA、SdhB、SdhC、SdhD。
优选地，所述琥珀酸脱氢酶为琥珀酸脱氢酶的黄素蛋白亚基(SdhA)，其编码基因为sdhA。
本发明中，所述微生物优选为肠杆菌科细菌，更优选为埃希氏菌属细菌，最优选为大肠杆菌。
对于大肠杆菌野生型而言，其黄素蛋白亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明中，所述抑制因子为能够抑制琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性的蛋白质、DNA、RNA、化合物或组合物。
本发明中，所述生物材料包括但不限于重组DNA、载体、宿主细胞(包括微生物细胞)。
具体地，以上所述的应用为通过降低所述琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性实现。
第二方面，本发明提供一种琥珀酸脱氢酶突变体，以大肠杆菌野生型琥珀酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述琥珀酸脱氢酶突变体含有第530位丙氨酸被除丙氨酸以外的氨基酸取代的突变。
发明人经多年的研究发现，对琥珀酸脱氢酶的黄素蛋白亚基的特定位置的氨基酸进行突变可以达到弱化琥珀酸脱氢酶的效果，进而提高赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的产量。
优先地，以大肠杆菌野生型琥珀酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述琥珀酸脱氢酶突变体含有第530位丙氨酸被甘氨酸、异亮氨酸、组氨酸、谷氨酸或苏氨酸取代的突变。
作为本发明的优选方案，本发明提供琥珀酸脱氢酶突变体，其具有如SEQ IDNO.1-5任一所示的氨基酸序列。
本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的N端或C端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。
第三方面，本发明提供编码所述琥珀酸脱氢酶突变体的核酸分子。
根据上述提供的蛋白突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。
作为本发明的一种实施方式，编码所述琥珀酸脱氢酶突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO.8-12任一所示的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、载体或宿主细胞。
其中，所述重组DNA包括但不限于表达盒。所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组核酸分子。
所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
第五方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物其与出发菌株相比，琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低。
优先地，所述表达和/或酶活性降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：
(1)对所述琥珀酸脱氢酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低；
(2)将所述琥珀酸脱氢酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得琥珀酸脱氢酶的表达和/或活性降低。
以上(2)中所述的转录调控元件包括启动子、增强子、5’-UTR、终止子等。翻译调控元件包括核糖体结合位点等。
优选地，所述重组微生物表达所述的琥珀酸脱氢酶突变体，且不表达其出发菌株所具有的琥珀酸脱氢酶；或者，所述重组微生物的琥珀酸脱氢酶的编码基因的起始密码子替换为具有更弱活性的起始密码子。
作为本发明的一种实施方式，将所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶编码基因突变为所述琥珀酸脱氢酶突变体的编码基因。
作为本发明的另一种实施方式，将所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶编码基因的起始密码子由ATG替换为GTG。
本发明所述的重组微生物优选为肠杆菌科细菌，更优选为埃希氏菌属细菌，最优选为大肠杆菌。
本发明中，所述出发菌株为能够积累天冬氨酸、其衍生物或者天冬氨酸族氨基酸的菌株。
优选地，所述出发菌株为能够积累赖氨酸的大肠杆菌。
作为本发明的一种实施方式，所述出发菌株一株诱变获得的产赖氨酸的大肠杆菌MHZ-0914，该菌株已经于2021年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.22648，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
第六方面，本发明提供所述琥珀酸脱氢酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在提高微生物的天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的产量和/或转化率中的应用；
(2)在构建用于天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸生产的微生物中的应用；
(3)在天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的发酵生产中的应用。
第七方面，本发明还提供以上所述的重组微生物的构建方法，其包括：对所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低；
或者，将所述琥珀酸脱氢酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得其表达和/或酶活性降低。
优选地，所述制备方法包括：将所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶的编码基因突变为以上所述的琥珀酸脱氢酶突变体的基因，或者，包括：将所述重组微生物的琥珀酸脱氢酶的编码基因的起始密码子替换为具有更弱活性的起始密码子。
第八方面，本发明提供一种生产天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的方法，其包括：培养以上所述的重组微生物。
具体地，所述生产天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的方法包括：将所述重组微生物接种至活化培养基进行培养，挑取活化的菌种接种至种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基进行发酵。
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖55-65g/L，糖蜜5-15g/L，硫酸铵35-45g/L，玉米浆8-12g/L，磷酸二氢钾1.5-2g/L，七水硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铁0.01-0.05g/L，硫酸锰0.02-0.05g/L，碳酸钙10-30g/L，pH 6.8-7.2。
优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖15-25g/L，硫酸铵3-5g/L，玉米浆1-3g/L，磷酸二氢钾2-4g/L，七水硫酸镁0.2-0.6g/L，硫酸铁0.005-0.02g/L，硫酸锰0.005-0.02g/L，pH 6.8-7.2。
本发明所述的天冬氨酸族氨基酸优选为赖氨酸。
本发明的有益效果在于：本发明发现，通过降低琥珀酸脱氢酶的表达、酶活性能够显著提高赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的产量和转化率。本发明提供的琥珀酸脱氢酶突变体能够弱化琥珀酸脱氢酶，促进天冬氨酸的合成，进而促进赖氨酸等天冬氨酸族氨基酸的积累，表达该突变体的重组微生物的赖氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，该突变体和重组微生物为天冬氨酸、其衍生物、天冬氨酸族氨基酸的生产菌株的选育提供了有利的改造靶点以及突变体和菌株资源。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0003185039220000031
以下实施例中使用的出发菌株一株诱变获得的产赖氨酸的大肠杆菌MHZ-0914，该菌株已经于2021年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.22648，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1突变基因sdhAA530G的重组菌株构建
1、pTargetF-N20(sdhAA530G)质粒及Donor DNA构建
步骤1：使用pTF-sdhA-sgRNA-F/pTF-sdhA-sgRNA-R为引物(表1)，以质粒pTargetF为模板(参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System，Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol，2015)，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒在37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得质粒pTargetF-N20(sdhAA530G)，PCR鉴定及测序验证；
步骤2：以MG1655基因组为模板，选用sdhAA530-UF/sdhAA530G-UR引物对，扩增出上游同源臂①，选用sdhAA530G-DF/sdhAA530-DR引物对，扩增出下游同源臂②，以①、②为模板，选用sdhAA530-UF/sdhAA530-DR引物对，扩增出Donor DNA。
2、感受态细胞制备及电转化
步骤1：将pCas质粒(参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenomevia the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol，2015)电转入CGMCC No.22648感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
步骤2：挑取单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB培养基中，30℃、200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)；
步骤3：将1中构建得到的pTargetF-N20(sdhAA530G)质粒和Donor DNA同时电转入带有pCas感受态细胞中(电转条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
3、重组菌株验证
步骤1：使用引物对sdhAA530G-F1/sdhAA530-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
步骤2：将PCR鉴定正确的菌株用引物对sdhAA530-F/sdhAA530-R扩增，扩增产物送测序。
4、构建相关质粒丢失
步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20质粒已丢失；
步骤3：挑取pTargetF-N20质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0914-1(sdhAA530G)菌株。
实施例2突变基因sdhAA530I的重组菌株构建
参照实施例1的方法，获得琥珀酸脱氢酶530位氨基酸突变为异亮氨酸的重组菌株，菌株命名为MHZ-0914-2。
实施例3突变基因sdhAA530H的重组菌株构建
参照实施例1的方法，获得琥珀酸脱氢酶530位氨基酸突变为组氨酸的重组菌株，菌株命名为MHZ-0914-3。
实施例4突变基因sdhAA530E的重组菌株构建
参照实施例1的方法，获得琥珀酸脱氢酶530位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为MHZ-0914-4。
实施例5突变基因sdhAA530T的重组菌株构建
参照实施例1的方法，获得琥珀酸脱氢酶530位氨基酸突变为苏氨酸的重组菌株，菌株命名为MHZ-0914-5。
实施例6赖氨酸发酵实验
赖氨酸发酵实验使用的培养基如下：
种子活化培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，18g/L琼脂粉，调节pH至7.0。
种子培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵4g/L，玉米浆2.0g/L，磷酸二氢钾3g/L，七水硫酸镁0.4g/L，硫酸铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，糖蜜10g/L，硫酸铵40g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，七水硫酸镁1.0g/L，硫酸铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，碳酸钙25g/L，调节pH至7.0。
赖氨酸发酵方法如下：
1、种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，37℃培养12h；
2、种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养7h；
3、发酵培养：将2mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃、220r/min振荡培养12h，每株菌做三个平行。
4、OD600测定：取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长600处检测OD，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的OD600如表2所示。
赖氨酸浓度测定：取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与对照菌发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表2所示。
酶活测定：琥珀酸脱氢酶活性的测定通过以2，6-二氯靛酚(2，6-dichloroindophenol)(DCIP)的还原为指标进行测定，具体方法参考文献Kurokawa T,Sakamoto J.Purification and characterization of succinate:menaquinoneoxidoreductase from Corynebacterium glutamicum[J].Archives of Microbiology,2005,183(5):317，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的琥珀酸脱氢酶酶活如表2所示。
表2重组菌株的赖氨酸产量、生长和酶活检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD<sub>600</sub> 酶活U/mg
CGMCC No.22648 18.8 28.2 15.2 1.36
MHZ-0914-1(sdhA<sup>A530G</sup>) 22.4 33.6 15.0 1.24
MHZ-0914-2(sdhA<sup>A530I</sup>) 22.0 33.1 14.9 1.21
MHZ-0914-3(sdhA<sup>A530H</sup>) 22.1 33.2 14.7 1.21
MHZ-0914-4(sdhA<sup>A530E</sup>) 23.3 33.9 14.5 1.19
MHZ-0914-5(sdhA<sup>A530T</sup>) 19.8 29.7 14.8 1.22
发酵结果表明，sdhA基因编码蛋白的第530位氨基酸由丙氨酸(A)分别突变为甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)后，突变菌株琥珀酸脱氢酶的活性均有一定程度的降低，最终OD与出发菌株相当，但是赖氨酸产量均有提升，且突变为谷氨酸(E)后效果更好，MHZ-0914-4(sdhAA530E)重组菌株L-赖氨酸产量较出发菌株提高4.5g/L，转化率较出发菌株提高5.7％。
实施例7起始密码子替换的重组菌株构建
基于上述突变体的酶活性检测结果，推测sdhA基因的其他弱化方式也可能具有提高赖氨酸产量和转化率的作用，因此进一步进行了sdhA基因的其他弱化改造方式。
参照实施例1的方法，将琥珀酸脱氢酶起始密码子由ATG突变为GTG，替换后的sdhA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，使用的引物如表1所示(sdhAA1G-UF、sdhAA1G-UR、sdhAA1G-DF、sdhAA1G-DR、sdhAA1G-R、sdhAA1G-F)，获得琥珀酸脱氢酶起始密码子由ATG突变为GTG的重组菌株MHZ-0914-6(sdhAA1G)，菌株命名为MHZ-0914-6。
实施例8赖氨酸发酵实验
参照实施例6的方法对实施例7构建的重组菌株的性能进行测试，检测得到的赖氨酸浓度和生长如表3所示。
表3重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 转化率％ OD<sub>600</sub>
CGMCC No.22648 18.8 28.2 15.2
MHZ-0914-6 24.1 34.9 13.4
经检测，获得的MHZ-0914-6菌株的琥珀酸脱氢酶表达量较出发菌株下降了约70-80％(在不同培养基中略有差异)，而赖氨酸的产量得到显著提升，重组菌株MHZ-0914-6的L-赖氨酸产量较出发菌株高5.3g/L，转化率提高6.7％。该实施例进一步说明通过弱化琥珀酸脱氢酶可以促进大肠杆菌生产赖氨酸。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 梅花（上海）生物科技有限公司
<120> 琥珀酸脱氢酶突变体、重组微生物及其制备方法和应用
<130> KHP211117881.0
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Leu Pro Val Arg Glu Phe Asp Ala Val Val Ile Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Met Arg Ala Ala Leu Gln Ile Ser Gln Ser Gly Gln Thr
20 25 30
Cys Ala Leu Leu Ser Lys Val Phe Pro Thr Arg Ser His Thr Val Ser
35 40 45
Ala Gln Gly Gly Ile Thr Val Ala Leu Gly Asn Thr His Glu Asp Asn
50 55 60
Trp Glu Trp His Met Tyr Asp Thr Val Lys Gly Ser Asp Tyr Ile Gly
65 70 75 80
Asp Gln Asp Ala Ile Glu Tyr Met Cys Lys Thr Gly Pro Glu Ala Ile
85 90 95
Leu Glu Leu Glu His Met Gly Leu Pro Phe Ser Arg Leu Asp Asp Gly
100 105 110
Arg Ile Tyr Gln Arg Pro Phe Gly Gly Gln Ser Lys Asn Phe Gly Gly
115 120 125
Glu Gln Ala Ala Arg Thr Ala Ala Ala Ala Asp Arg Thr Gly His Ala
130 135 140
Leu Leu His Thr Leu Tyr Gln Gln Asn Leu Lys Asn His Thr Thr Ile
145 150 155 160
Phe Ser Glu Trp Tyr Ala Leu Asp Leu Val Lys Asn Gln Asp Gly Ala
165 170 175
Val Val Gly Cys Thr Ala Leu Cys Ile Glu Thr Gly Glu Val Val Tyr
180 185 190
Phe Lys Ala Arg Ala Thr Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Gly Arg Ile
195 200 205
Tyr Gln Ser Thr Thr Asn Ala His Ile Asn Thr Gly Asp Gly Val Gly
210 215 220
Met Ala Ile Arg Ala Gly Val Pro Val Gln Asp Met Glu Met Trp Gln
225 230 235 240
Phe His Pro Thr Gly Ile Ala Gly Ala Gly Val Leu Val Thr Glu Gly
245 250 255
Cys Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Leu Leu Asn Lys His Gly Glu Arg Phe
260 265 270
Met Glu Arg Tyr Ala Pro Asn Ala Lys Asp Leu Ala Gly Arg Asp Val
275 280 285
Val Ala Arg Ser Ile Met Ile Glu Ile Arg Glu Gly Arg Gly Cys Asp
290 295 300
Gly Pro Trp Gly Pro His Ala Lys Leu Lys Leu Asp His Leu Gly Lys
305 310 315 320
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Ala Val Gly Glu Ile Ala Cys Val Ser Val His Gly Ala Asn Arg Leu
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Gly Gly Asn Ser Leu Leu Asp Leu Val Val Phe Gly Arg Ala Ala Gly
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ggtcagtcga aaaacttcgg cggcgagcag gcggcacgca ctgcggcagc agctgaccgt 420
accggtcacg cactgttgca cacgctttat cagcagaacc tgaaaaacca caccaccatt 480
ttctccgagt ggtatgcgct ggatctggtg aaaaaccagg atggcgcggt ggtgggttgt 540
accgcactgt gcatcgaaac cggtgaagtg gtttatttca aagcccgcgc taccgtgctg 600
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gatccggtga aagagccgat tccggttatc ccaacctgtc actacatgat gggcggtatt 1080
ccgaccaaag ttaccggtca ggcactgact gtgaatgaga aaggcgaaga tgtggttgtt 1140
ccgggactgt ttgccgttgg tgaaatcgct tgtgtatcgg tacacggcgc taaccgtctg 1200
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gagtctatcg ccgagcaggg cgcactgcgc gatgccagcg agtctgatgt tgaagcgtct 1320
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aaagcgctgc aagaatgtat gcagcataac ttctcggtct tccgtgaagg tgatgcgatg 1440
gcgaaagggc ttgagcagtt gaaagtgatc cgcgagcgtc tgaaaaatgc ccgtctggat 1500
gacacttcca gcgagttcaa cacccagcgc gttgagtgcc tggaactgga taacctgatg 1560
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agccgcttcg acttcccgga tcgtgatgat gaaaactggc tgtgccactc cctgtatctg 1680
ccagagtcgg aatccatgac gcgccgaagc gtcaacatgg aaccgaaact gcgcccggca 1740
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<210> 8
<211> 1767
<212> DNA
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<400> 8
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ccgacccgtt cccataccgt ttctgcgcaa ggcggcatta ccgttgcgct gggtaatacc 180
catgaagata actgggaatg gcatatgtac gacaccgtga aagggtcgga ctatatcggt 240
gaccaggacg cgattgaata tatgtgtaaa accgggccgg aagcgattct ggaactcgaa 300
cacatgggcc tgccgttctc gcgtctcgat gatggtcgta tctatcaacg tccgtttggc 360
ggtcagtcga aaaacttcgg cggcgagcag gcggcacgca ctgcggcagc agctgaccgt 420
accggtcacg cactgttgca cacgctttat cagcagaacc tgaaaaacca caccaccatt 480
ttctccgagt ggtatgcgct ggatctggtg aaaaaccagg atggcgcggt ggtgggttgt 540
accgcactgt gcatcgaaac cggtgaagtg gtttatttca aagcccgcgc taccgtgctg 600
gcgactggcg gagcagggcg tatttatcag tccaccacca acgcccacat taacaccggc 660
gacggtgtcg gcatggctat ccgtgccggc gtaccggtgc aggatatgga aatgtggcag 720
ttccacccga ccggcattgc cggtgcgggc gtactggtca ccgaaggttg ccgtggtgaa 780
ggcggttatc tgctgaacaa acatggcgaa cgttttatgg agcgttatgc gccgaacgcc 840
aaagacctgg cgggccgtga cgtggttgcg cgttccatca tgatcgaaat ccgtgaaggt 900
cgcggctgtg atggtccgtg ggggccacac gcgaaactga aactcgatca cctgggtaaa 960
gaagttctcg aatcccgtct gccgggtatc ctggagcttt cccgtacctt cgctcacgtc 1020
gatccggtga aagagccgat tccggttatc ccaacctgtc actacatgat gggcggtatt 1080
ccgaccaaag ttaccggtca ggcactgact gtgaatgaga aaggcgaaga tgtggttgtt 1140
ccgggactgt ttgccgttgg tgaaatcgct tgtgtatcgg tacacggcgc taaccgtctg 1200
ggcggcaact cgctgctgga cctggtggtc tttggtcgcg cggcaggtct gcatctgcaa 1260
gagtctatcg ccgagcaggg cgcactgcgc gatgccagcg agtctgatgt tgaagcgtct 1320
ctggatcgcc tgaaccgctg gaacaataat cgtaacggtg aagatccggt ggcgatccgt 1380
aaagcgctgc aagaatgtat gcagcataac ttctcggtct tccgtgaagg tgatgcgatg 1440
gcgaaagggc ttgagcagtt gaaagtgatc cgcgagcgtc tgaaaaatgc ccgtctggat 1500
gacacttcca gcgagttcaa cacccagcgc gttgagtgcc tggaactgga taacctgatg 1560
gaaacggcgt atgcaacggc tgtttctggc aacttccgta ccgaaagccg tggcgcgcat 1620
agccgcttcg acttcccgga tcgtgatgat gaaaactggc tgtgccactc cctgtatctg 1680
ccagagtcgg aatccatgac gcgccgaagc gtcaacatgg aaccgaaact gcgcccggca 1740
ttcccgccga agattcgtac ttactaa 1767
<210> 9
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaaattgc cagtcagaga atttgatgca gttgtgattg gtgccggtgg cgcaggtatg 60
cgcgcggcgc tgcaaatttc ccagagcggc cagacctgtg cgctgctctc taaagtcttc 120
ccgacccgtt cccataccgt ttctgcgcaa ggcggcatta ccgttgcgct gggtaatacc 180
catgaagata actgggaatg gcatatgtac gacaccgtga aagggtcgga ctatatcggt 240
gaccaggacg cgattgaata tatgtgtaaa accgggccgg aagcgattct ggaactcgaa 300
cacatgggcc tgccgttctc gcgtctcgat gatggtcgta tctatcaacg tccgtttggc 360
ggtcagtcga aaaacttcgg cggcgagcag gcggcacgca ctgcggcagc agctgaccgt 420
accggtcacg cactgttgca cacgctttat cagcagaacc tgaaaaacca caccaccatt 480
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ggcggttatc tgctgaacaa acatggcgaa cgttttatgg agcgttatgc gccgaacgcc 840
aaagacctgg cgggccgtga cgtggttgcg cgttccatca tgatcgaaat ccgtgaaggt 900
cgcggctgtg atggtccgtg ggggccacac gcgaaactga aactcgatca cctgggtaaa 960
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gatccggtga aagagccgat tccggttatc ccaacctgtc actacatgat gggcggtatt 1080
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ccgggactgt ttgccgttgg tgaaatcgct tgtgtatcgg tacacggcgc taaccgtctg 1200
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gagtctatcg ccgagcaggg cgcactgcgc gatgccagcg agtctgatgt tgaagcgtct 1320
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agccgcttcg acttcccgga tcgtgatgat gaaaactggc tgtgccactc cctgtatctg 1680
ccagagtcgg aatccatgac gcgccgaagc gtcaacatgg aaccgaaact gcgcccggca 1740
ttcccgccga agattcgtac ttactaa 1767
<210> 10
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaattgc cagtcagaga atttgatgca gttgtgattg gtgccggtgg cgcaggtatg 60
cgcgcggcgc tgcaaatttc ccagagcggc cagacctgtg cgctgctctc taaagtcttc 120
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catgaagata actgggaatg gcatatgtac gacaccgtga aagggtcgga ctatatcggt 240
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ccagagtcgg aatccatgac gcgccgaagc gtcaacatgg aaccgaaact gcgcccggca 1740
ttcccgccga agattcgtac ttactaa 1767
<210> 11
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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gaaacggcgt atgcaacggc tgtttctacc aacttccgta ccgaaagccg tggcgcgcat 1620
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<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcctaggtat aatactagtc gtatctatca acgtccgttg ttttagagct agaaatagc 59
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
actagtatta tacctaggac tgagctagct gtcaag 36
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcactgcgc gatgccagcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccagaaaca gccgttgcat 20
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatgcaacgg ctgtttctgg caacttccgt accgaaagcc 40
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatagaaaca gccgttgcat 20
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tatgcaacgg ctgtttctat caacttccgt accgaaagcc 40
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgagaaaca gccgttgcat 20
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tatgcaacgg ctgtttctca caacttccgt accgaaagcc 40
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttcagaaaca gccgttgcat 20
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatgcaacgg ctgtttctga aaacttccgt accgaaagcc 40
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccaagaaaca gccgttgcat 20
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tatgcaacgg ctgtttctac caacttccgt accgaaagcc 40
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctgggatct ttctctttta g 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgcaacggc tgtttctggc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgcaacggc tgtttctatc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgcaacggc tgtttctcac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgcaacggc tgtttctgaa 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgcaacggc tgtttcttac c 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cggcactcaa ccagccgggc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aatcgcttgt gtatcggtac 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acatgatttc atcctcgttc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cacacacccc acaccacaac 20
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtgaaattgc cagtcagaga atttgatgca gttgtgattg 40
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgtgttcgag ttccagaatc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgtgtgcaac agtgcgtgac 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tttcacttct cgcaggagtc 20

Claims (10)

1.琥珀酸脱氢酶或其抑制因子、琥珀酸脱氢酶编码基因或其抑制因子、含有琥珀酸脱氢酶编码基因或所述抑制因子的生物材料的如下任一种应用：
(1)在提高微生物的天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的产量和/或转化率中的应用；
(2)在构建用于天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸生产的微生物中的应用；
(3)在天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的发酵生产中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为通过降低所述琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性实现。
3.琥珀酸脱氢酶突变体，其特征在于，以大肠杆菌野生型琥珀酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述琥珀酸脱氢酶突变体含有第530位丙氨酸被除丙氨酸以外的氨基酸取代的突变；
优先地，以大肠杆菌野生型琥珀酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述琥珀酸脱氢酶突变体含有第530位丙氨酸被甘氨酸、异亮氨酸、组氨酸、谷氨酸或苏氨酸取代的突变；
更优选地，所述琥珀酸脱氢酶突变体具有如SEQ ID NO.1-5任一所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的琥珀酸脱氢酶突变体的核酸分子。
5.含有权利要求4所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、载体或宿主细胞。
6.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物其与出发菌株相比，琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低；
优先地，所述表达和/或酶活性降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：
(1)对所述琥珀酸脱氢酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低；
(2)将所述琥珀酸脱氢酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得琥珀酸脱氢酶的表达和/或酶活性降低。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求3所述的琥珀酸脱氢酶突变体，且不表达其出发菌株所具有的琥珀酸脱氢酶；
或者，所述重组微生物的琥珀酸脱氢酶的编码基因的起始密码子替换为具有更弱活性的起始密码子；
优选地，所述重组微生物为肠杆菌科细菌，更优选为埃希氏菌属细菌。
8.权利要求3所述的琥珀酸脱氢酶突变体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6或7所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在提高微生物的天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的产量和/或转化率中的应用；
(2)在构建用于天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸生产的微生物中的应用；
(3)在天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的发酵生产中的应用。
9.权利要求6或7所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，包括：对所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得琥珀酸脱氢酶的表达量降低和/或活性降低；
或者，将所述琥珀酸脱氢酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得其表达和/或酶活性降低；
优选地，所述制备方法包括：将所述出发菌株中的琥珀酸脱氢酶的编码基因突变为编码权利要求3所述的琥珀酸脱氢酶突变体的基因；
或者，将所述重组微生物的琥珀酸脱氢酶的编码基因的起始密码子替换为具有更弱活性的起始密码子。
10.一种生产天冬氨酸、其衍生物或天冬氨酸族氨基酸的方法，其特征在于，包括：培养权利要求6或7所述的重组微生物。
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