CN114058560B - 甘氨酸的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘氨酸的生产方法。本发明提供了一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，包括如下步骤：使受体菌表达来源于耻垢分枝杆菌、少盐芽孢杆菌、结核分支杆菌、海水芽孢杆菌、玻利维亚盐单胞菌、维氏气单胞菌或团聚拉布伦茨氏菌的乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产甘氨酸的工程菌株。本发明开辟了利用生物法合成甘氨酸的先河。

Description

甘氨酸的生产方法

技术领域

本发明涉及本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甘氨酸的生产方法。

背景技术

甘氨酸(glycine)是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必须氨基酸。作为一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品和饲料添加剂领域。在食品中添加甘氨酸可以用作食品的防腐剂，延长其保质期；在含酒精饮料和动植物食品的加工中，则作为调味剂，增香剂。在医药方面，甘氨酸可以合成多种药物，如治疗高血压药物盐酸地拉普利、抑制胃溃疡用碳酸钙制剂、扑热息痛甘氨酸盐、单甘氨酸乙酰水杨酸钙、利血胺注射液、抗帕金森氏药物L-多巴、甲砜霉素等。工业级甘氨酸则主要用于大规模生产除草活性最强的除草剂草甘膦。

我国甘氨酸的产能约55万吨，主要通过有机合成法生产。主要包括氯乙酸氨水解法、施特雷克法(Strecker)和海因法(Hydantion)等(徐泽辉，刁春霞，黄亚茹，常慧。甘氨酸的生产现状及发展趋势。2004，石油化工技术经济。20(5):41-45.)。这些方法的原料或制备中间体对环境污染严重，不符合现代社会对工业生产的环保要求。

利用微生物酶体外催化氨基乙氰酸溶液水解生产甘氨酸，是生物法制备甘氨酸方法之一。20世纪90年代，日本发表了以氨基氰酸为底物，利用微生物酶催化的专利(US5238827)，虽然在30h甘氨酸产量能达到148g/L，但底物氨基乙氰酸毒性大，微生物酶容易受有机物的影响失活。

尽管利用体外酶催化法能够实现甘氨酸的合成，其仍具有生产局限性。在细胞体内从头法合成甘氨酸能解决这一问题，但是合成途径中参与催化乙醛酸到甘氨酸反应的酶尚无，有待挖掘，也是实现这一技术的关键点。

综上，目前利用生物法从头合成甘氨酸还处于空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘氨酸的生产方法。

第一方面，本发明要求保护一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法。

本发明所提供的构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，可包括如下步骤(A1)：

(A1)使受体菌表达乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产甘氨酸的工程菌株。

进一步地，所述乙醛酸氨化酶可为如下a1)-a7)所示7种来源中任一种：

a1)来源于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的乙醛酸氨化酶；

a2)来源于少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus globuius)的乙醛酸氨化酶；

a3)来源于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的乙醛酸氨化酶；

a4)来源于海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)的乙醛酸氨化酶；

a5)来源于玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)的乙醛酸氨化酶；

a6)来源于维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的乙醛酸氨化酶；

a7)来源于团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)的乙醛酸氨化酶。

进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A2)：

(A2)以所述工程菌1为出发菌株，对其内源的甘氨酸脱羧酶(Glycinedecarboxylase)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够生产甘氨酸的工程菌株。

进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A3)：

(A3)以所述工程菌2为出发菌株，对其内源的苹果酸合成酶(malate synthase)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够生产甘氨酸的工程菌株。

进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A4)：

(A4)以所述工程菌3为出发菌株，对其内源的转录抑制蛋白(transcriptionalrepressor)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够生产甘氨酸的工程菌株。

更进一步地，所述步骤(A1)可为：向所述受体菌中导入所述乙醛酸氨化酶的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1。所述步骤(A2)可为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的甘氨酸脱羧酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌2。所述步骤(A3)可为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中苹果酸合成酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌3。所述步骤(A4)可为：以所述工程菌3为出发菌株，敲除基因组中转录抑制蛋白编码基因，所得菌株即为所述工程菌4。

进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A5)：

(A5)以所述工程菌4为出发菌株，提高内源异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase)的活性和/或表达量，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5也为能够生产甘氨酸的工程菌株。

在本发明的具体实施方式中，具体是通过将M1-93启动子整合于基因组中异柠檬酸裂解酶编码基因起始密码子前来提高内源异柠檬酸裂解酶的表达量的。

在步骤(A1)中，所述受体菌可隶属埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌等；也可隶属棒杆菌属(Corynebacterium)，如谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum等；还可隶属单胞菌属(Pseudoalteromonas)，如维氏气单胞菌Aeromonas veronii，或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa等；亦可隶属芽孢杆菌属(Bacillus)，如海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris，或蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，或弯曲芽孢杆菌Bacillusflexus，或地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，或贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，或枯草芽孢杆菌Bacillus substilis，或嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus，或赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，或少盐芽孢杆菌Paucisalibacillus globuius，或巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium等；还可隶属克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis，或结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis；还可隶属酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，或解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica，或东方伊萨酵母菌Issatchenkia orientalis等。

在本发明的具体实施方式中，所述受体菌具体为大肠杆菌ATCC 8739。

在本发明中，所述来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示的蛋白质，或为SEQ ID No.6经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.6具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于少盐芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示的蛋白质，或为SEQ ID No.5经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.5所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于结核分支杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示的蛋白质，或为SEQ ID No.7经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.7具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.7所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于海水芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的蛋白质，或为SEQ ID No.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于玻利维亚盐单胞菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQID No.3所示的蛋白质，或为SEQ ID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于维氏气单胞菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的蛋白质，或为SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，所述来源于团聚拉布伦茨氏菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQID No.4所示的蛋白质，或为SEQ ID No.4经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

其中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

步骤(A2)中，所述甘氨酸脱羧酶为GcvP蛋白；所述GcvP蛋白的氨基酸序列为Protein_ID:WP_000195064.1。步骤(A3)中，所述苹果酸合成酶为AceB蛋白；所述AceB蛋白的氨基酸序列为Protein_ID:WP_000138905.1。步骤(A4)中，所述转录抑制蛋白为IclR蛋白；所述IclR蛋白的氨基酸序列为Protein_ID:WP_000226403.1。步骤(A5)中，所述异柠檬酸裂解酶编码基因为aceA基因；所述aceA基因编码的蛋白质(即AceA蛋白)的氨基酸序列为Protein_ID:WP_000857856.1。

在本发明中，来源于所述耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.13所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.6所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.13所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.6所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述少盐芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.12所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.5所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.12所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.5所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述结核分支杆菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.14所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.7所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.14所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.7所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述海水芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.9所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.9所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述玻利维亚盐单胞菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.10所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.10所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述维氏气单胞菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.8所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.8所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子。

在本发明中，来源于所述团聚拉布伦茨氏菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.11所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.4所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.11所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.4所示的蛋白质的DNA分子。

上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述编码基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

步骤(A2)中，所述甘氨酸脱羧酶编码基因为gcvP基因；所述gcvP基因的核苷酸序列为Gene ID:6064873。步骤(A3)中，所述苹果酸合成酶编码基因为aceB基因；所述aceB基因的核苷酸序列为Gene ID:6064573。步骤(A4)中，所述转录抑制蛋白编码基因为iclR基因；所述iclR基因的核苷酸序列为Gene ID:6064567。步骤(A5)中，所述异柠檬酸裂解酶编码基因为aceA基因；所述aceA基因的核苷酸序列为Gene ID:6064570。步骤(A5)中，所述M1-93启动子是按照包括如下步骤的方法制备得到的：以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物aceA-P-up/aceA-RBS-down(表2)扩增，得到含有所述M1-93启动子的DNA片段。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A1)中，所述a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体大肠杆菌中的；所述重组载体具体为将所述a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶的编码基因克隆到pTrc99A-M质粒的KpnI和SalI位置后得到的重组质粒。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A2)中，所述“以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的甘氨酸脱羧酶编码基因(gcvP基因)”是通过包括如下步骤的方法实现的：(a1)在供体质粒placZ的基础上添加了半乳糖转录抑制蛋白编码基因(lacI基因)和针对自身质粒氯霉素cat基因的N20-gRNA序列，得到供体质粒pV4；(a2)在所述供体质粒pV4的基础上构建用于敲除gcvP基因的pV4-del-gcvP质粒，该质粒含有针对甘氨酸脱羧酶编码基因(gcvP基因)的gcvP-N20-gRNA序列和敲除甘氨酸脱羧编码基因(gcvP基因)的上下游同源臂序列；(a3)将所述pV4-del-gcvP质粒和pRedCas9质粒共同转化所述工程菌1，从而实现敲除所述工程菌1基因组中的编码基因(gcvP基因)。

更加具体的，步骤(a1)中，以placZ质粒为模板，使用引物Bone-F(见表2)和引物Bone-R(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段I(6.6kb左右的PCR产物)；以pACYC184-M质粒为模板，使用引物lacI-Ptrc-up(见表2)和引物lacI-Ptrc-down(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段II(1.5kb左右的PCR产物)；以placZ质粒为模板，用引物cat-N20-up(见表2)和引物cat-N20-down(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段III(400bp左右的PCR产物)；将所述DNA片段I、所述DNA片段II和所述DNA片段III用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述供体质粒pV4。

更加具体的，步骤(a2)中，以所述供体质粒pV4为模板，用引物N20-B-F1(见表2)和引物N20-B-R1(见表2)反向PCR扩增，得到DNA片段I’(4.1kb左右的PCR产物)；以所述供体质粒pV4为模板，用引物gcvP-N20-B-F2(见表2)和引物N20-B-R2(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段II’(400bp左右的PCR产物)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物gcvP-F1(见表2)和引物gcvP-R1(见表2)进行PCR扩增，获得DNA片段III’(上游同源臂片段)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物gcvP-F2(见表2)和引物gcvP-R2(见表2)获得DNA片段IV’(下游同源臂片段)；将所述DNA片段I’、所述DNA片段II’、所述DNA片段III’和所述DNA片段IV’用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述pV4-del-gcvP质粒。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A3)中，所述“以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中苹果酸合成酶编码基因(aceB基因)”是通过包括如下步骤的方法实现的：(b1)同上述步骤(a1)，得到所述供体质粒pV4；(b2)在所述供体质粒pV4的基础上构建用于敲除aceB基因的pV4-del-aceB质粒，该质粒含有针对苹果酶合成酶编码基因(aceB基因)的aceB-N20-gRNA序列和敲除苹果酸合成酶编码基因(aceB基因)的上下游同源臂序列；(b3)将所述pV4-del-aceB质粒和pRedCas9质粒共同转化所述出发菌株(所述工程菌2)，从而实现敲除所述工程菌2基因组中的苹果酸合成酶编码基因(aceB基因)。

更加具体的，步骤(b2)中，以所述供体质粒pV4为模板，用引物N20-B-F1(见表2)和引物N20-B-R1(见表2)反向PCR扩增，得到DNA片段I’(4.1kb左右的PCR产物)；以所述供体质粒pV4为模板，用引物aceB-N20-B-F2(见表2)和引物N20-B-R2(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段II’(400bp左右的PCR产物)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物aceB-F1(见表2)和引物aceB-R1(见表2)进行PCR扩增，获得DNA片段III’(上游同源臂片段)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物aceB-F2(见表2)和引物aceB-R2(见表2)获得DNA片段IV’(下游同源臂片段)；将所述DNA片段I’、所述DNA片段II’、所述DNA片段III’和所述DNA片段IV’用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述pV4-del-aceB质粒。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A4)中，所述“以所述工程菌3为出发菌株，敲除基因组中iclR基因”是通过包括如下步骤的方法实现的：(c1)同上述步骤(a1)，得到所述供体质粒pV4；(c2)在所述供体质粒pV4的基础上构建用于敲除转录抑制蛋白编码基因(iclR基因)的pV4-del-iclR质粒，该质粒含有针对转录抑制蛋白编码基因(iclR基因)的iclR-N20-gRNA序列和敲除转录抑制蛋白编码基因(iclR基因)的上下游同源臂序列；(c3)将所述pV4-del-iclR质粒和pRedCas9质粒共同转化所述出发菌株(所述工程菌3)，从而实现敲除所述工程菌3基因组中的iclR基因。

更加具体的，步骤(c2)中，以所述供体质粒pV4为模板，用引物N20-B-F1(见表2)和引物N20-B-R1(见表2)反向PCR扩增，得到DNA片段I’(4.1kb左右的PCR产物)；以所述供体质粒pV4为模板，用引物iclR-N20-B-F2(见表2)和引物N20-B-R2(见表2)进行PCR扩增，得到DNA片段II’(400bp左右的PCR产物)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物iclR-F1(见表2)和引物iclR-R1(见表2)进行PCR扩增，获得DNA片段III’(上游同源臂片段)；以所述受体大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物iclR-F2(见表2)和引物iclR-R2(见表2)获得DNA片段IV’(下游同源臂片段)；将所述DNA片段I’、所述DNA片段II’、所述DNA片段III’和所述DNA片段IV’用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述pV4-del-iclR质粒。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A5)中，所述“以所述工程菌4为出发菌株，将M1-93启动子整合于基因组中异柠檬酸裂解酶编码基因(aceA基因)起始密码子前”是通过包括如下步骤的方法实现的：(d1)以pXZ-CS质粒为模板，使用引物aceA-cat-up(见表2)和引物aceA-sacB-down(见表2)进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于所述工程菌3基因组中aceA基因的ATG前；(d2)以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物aceA-P-up(见表2)和引物laceA-RBS-down(见表2)进行PCR扩增，得到同源重组的DNA启动子片段II，进行第二次同源重组，替换异柠檬酸裂解酶编码基因(aceA基因)前的cat-sacB。

第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面所述方法构建得到的大肠杆菌工程菌株。

第三方面，本发明要求保护如下任一应用：

(B1)第二方面所述大肠杆菌工程菌株在生产甘氨酸中的应用。

(B2)前文所述的a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶或其相关生物材料在构建前文所述大肠杆菌工程菌株中的应用。

(B3)前文所述的a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶或其相关生物材料在生产甘氨酸中的应用。

其中，所述相关生物材料可为前文所述a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶的编码基因，或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述乙醛酸氨化酶的DNA，该DNA不但包括启动所述乙醛酸氨化酶的编码基因转录的启动子，还可包括终止转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。可用于本发明的增强子可包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等。翻译控制信号的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因细胞系或者重组菌进行鉴定及筛选，可对所用重组载体进行加工，如加入可在宿主细胞中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。

所述重组载体可为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒等。

所述重组菌可为原核细胞或低等真核细胞。

具体地，所述原核细胞可为细菌；所述低等真核细胞可为酵母细胞。

更加具体地，所述细菌可为大肠杆菌。

第四方面，本发明要求保护一种生产甘氨酸的方法。

本发明所要求保护的生产甘氨酸的方法，可为如下任一：

(C1)一种通过发酵生产甘氨酸的方法，可包括如下步骤：对前文第二方面所述的大肠杆菌工程菌株进行发酵培养，从发酵产物中获得甘氨酸。

进一步地，进行所述发酵培养时使用的发酵培养基为含5g/L葡萄糖和100mM(NH₄)₂SO₄的无机盐培养基NBS。

更进一步地，所述发酵培养基的配方如下：每1L中含有葡萄糖5g，(NH₄)₂SO₄13.2g、KH₂PO₄ 3.5g、K₂HPO₄ 6.55g、(NH₄)₂HPO₄ 3.5g、MgSO₄·7H₂O 0.12g、甜菜碱-KCl0.15g。FeCl₃·6H₂O 1.5μg、CoCl₂·6H₂O 0.1μg、CuCl₂·2H₂O 0.1μg、ZnCl₂ 0.1μg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg、MnCl₂·4H₂O 0.2μg、H₃BO₃ 0.05μg；余量为水。

进一步地，所述发酵培养的条件可为37℃、250r/min培养3天。

(C2)一种体外催化生产甘氨酸的方法，可包括如下步骤：以前文所述的a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶体外催化乙醛酸和铵根离子反应生成甘氨酸。

所述乙醛酸氨化酶可以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或细胞的形式发挥催化作用。

其中，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均可按照包括如下步骤的方法制备得到：培养能够表达所述乙醛酸氨化酶的重组工程菌或天然菌，经诱导表达后，裂解菌体获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。

在本发明中，所述重组工程菌为将含有所述乙醛酸氨化酶的编码基因的重组载体导入大肠杆菌后所得。其中，所述重组载体为将所述编码基因克隆到pET30a载体的多克隆位点处后得到的重组质粒。

在本发明中，所述诱导表达为终浓度为0.1mM的IPTG、37℃诱导表达。

在以上所述乙醛酸氨化酶体外催化乙醛酸和铵根离子反应生成甘氨酸的过程中，反应体系的pH为7.0；反应体系中还含有磷酸钾缓冲液、NADPH。

在本发明的具体实施方式中，所用的反应缓冲液组成具体如下：40mM磷酸钾缓冲液、400mM硫酸铵、0.2mM NADPH、50mM乙醛酸钠；pH7.0。

在本发明中，所述“乙醛酸氨化酶”是指催化乙醛酸和氨还原为甘氨酸反应的酶。

在本发明中，所述甘氨酸脱羧酶(Glycine decarboxylase)是指能催化甘氨酸使之脱羧降解为二氧化碳和氨的酶。

在本发明中，所述苹果酸合成酶(malate synthase)是指能催化乙醛酸和酰基辅酶A聚合生成苹果酸的酶。

在本发明中，所述转录抑制蛋白(transcriptional repressor)是指参与操纵子aceBAK(分别编码苹果酸酶，异柠檬酸裂解酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸/磷酸化酶)表达的转录调控蛋白IclR。

在本发明中，所述异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase)是指催化异柠檬酸裂解成乙醛酸和柠檬酸的酶。

实验证明，本发明利用大肠杆菌原核表达得到的多种来源的乙醛酸氨化酶不仅能够体外催化乙醛酸和铵根离子生成甘氨酸，且本发明构建的大肠杆菌基因工程菌NZ-GAN005在摇瓶发酵中甘氨酸产量最高可达210mg/L。本发明开辟了利用生物法合成甘氨酸的先河。

附图说明

图1为甘氨酸生物合成反应。

图2为不同来源的乙醛酸氨化酶发酵产甘氨酸分析。来源Av-ald：维氏气单胞菌Aeromonas veronii，Ba-ald：海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris，Bc-ald：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，Bf-ald：弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus，Bl-ald：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，Bv-ald：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，Bs-ald：枯草芽孢杆菌Bacillus substilis，Gs-ald：嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus，Hb-ald：玻利维亚盐单胞菌Halomonas boliviensis，La-ald：团聚拉布伦茨氏菌Labrenzia aggregata，Lf-ald：赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，Pa-ald：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，Pg-ald：少盐芽孢杆菌Paucisalibacillus globuius，Ms-ald：耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis，Mt-ald：结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis。大肠杆菌ATCC 8739为对照菌株。纵坐标表示每升发酵液中甘氨酸产量。

图3为重组大肠杆菌NZ-GAN001、NZ-GAN002、NZ-GAN003、NZ-GAN004、NZ-GAN005发酵结果。纵坐标表示每升发酵液中甘氨酸产量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中的甘氨酸生物合成反应如图1所示。本发明所用的菌株和质粒如表1所示，所用的引物如表2所示。

表1本发明中所用的菌株与质粒

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表2本发明所用的引物

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实施例1、乙醛酸氨化酶基因全基因合成于表达质粒上

将来源于维氏气单胞菌Aeromonas veronii，海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus，地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，枯草芽孢杆菌Bacillussubstilis，嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，玻利维亚盐单胞菌Halomonas boliviensis，团聚拉布伦茨氏菌Labrenzia aggregata，赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，少盐芽孢杆菌Paucisalibacillus globuius，耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis，结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis的乙醛酸氨化酶基因ald(去除终止密码子)分别合成于pET30a(+)(金斯瑞公司)的NdeI和XhoI之间上，经测序验证正确后依次得到相应的质粒pET30a-Av ald，pET30a-Ba ald，pET30a-Bc ald，pET30a-Bf ald，pET30a-Bl ald，pET30a-Bv ald，pET30a-Bs ald，pET30a-Gs ald，pET30a-Hb ald，pET30a-La ald，pET30a-Lf ald，pET30a-Pa ald，pET30a-Pg ald，pET30a-Ms ald和pET30a-Mt ald(表1)。将这些质粒分别转化至表达菌BL21中，得到相应的菌株Av，Ba，Bc，Bf，Bl，Bv，Bs，Gs，Hb，La，Lf，Pa，Pg，Ms和Mt。

其中，来源于维氏气单胞菌Aeromonas veronii的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.8所示；来源于海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.9所示；来源于蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号QCX92624.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP034551.1所示；来源于弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号QCS51333.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP040367.1所示；来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号WP_061578175.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP042252.1所示；来源于贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号QKX13377.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP055160.1所示；来源于枯草芽孢杆菌Bacillus substilis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号QJR47777.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP053102.1所示；来源于嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号ABM69270.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号EF154460所示；来源于玻利维亚盐单胞菌Halomonas boliviensis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.10所示；来源于团聚拉布伦茨氏菌Labrenzia aggregata的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.11所示；来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号AJK86806.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP010820.1所示；来源于铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如GenBank号QKS42302.1所示，对应的编码基因序列如GenBank号CP034908.2所示；来源于少盐芽孢杆菌Paucisalibacillus globuius的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQID No.5所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.12所示；来源于耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis的乙醛酸氨化酶的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.13所示；结核分支杆菌Mycobacteriumtuberculosis的乙醛酸氨化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，对应的编码基因序列如SEQ ID No.14所示。

实施例2、乙醛酸氨化酶酶活分析

对实施例1获得的不同来源的乙醛酸氨化酶表达菌株Av，Ba，Bc，Bf，Bv，Bl，Bs，Gs，Hb，La，Lf，Pa，Pg，Ms，Mt进行乙醛酸氨化酶(Ald)的酶活分析。

接种菌株的单克隆于LB液体培养基(卡那霉素终浓度为50mg/L)中，37℃，250rpm培养至OD550＝0.1，加入诱导剂IPTG，终浓度为0.1mM，继续培养至对数期。取30ml培养液于50ml离心管中，在4℃下10,000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体，用15ml 100mM Tris-HCl buffer洗涤2次后，将菌体悬浮3ml 100mM Tris-HCl，冰浴超声破碎(功率：25W；开：1s；关：3s)破碎3-5min至澄清，4℃下10,000rpm离心20min，收集上清。用镍柱(GE Healthcare公司，瑞典)进行乙醛酸氨化酶蛋白纯化(具体步骤按说明书进行)。用10K超滤管(Amicon公司，爱尔兰)进行乙醛酸氨化酶的浓缩和清洗。最后，用Bradford试剂(Bio-rad公司，美国)进行乙醛酸氨化酶纯酶定量。

乙醛酸氨化酶(EC:1.4.1.1)酶活(Usha,V.,Jayaraman,R.,Toro,J.C.,Hoffner,S.E.,Das,K.S.,2002.Glycine and alanine dehydrogenase activities are catalyzedby the same protein in Mycobacterium smegmatis:upregulation of bothactivities under microaerophilic adaptation.Can J Microbiol.48,7-13)检测反应体系为：反应缓冲液990μl(40mM磷酸钾缓冲液、400mM硫酸铵、0.2mM NADPH、50mM乙醛酸钠；pH7.0)，加入10μl乙醛酸氨化酶纯酶，混匀后置于比色皿中，记录A340的变化情况。空白对照为反应缓冲液加入10μl的ddH₂O。NADPH在340nm处的消光系数为6.22cm^–1mM^–1。酶活力单位(U)定义为：每分钟每mg蛋白消耗1μmol的NADPH所需酶量(室温，pH7.0)。

不同来源的乙醛酸氨化酶纯酶的酶活结果见表3。

表3乙醛酸氨化酶酶活分析及甘氨酸分析

注：体外催化一栏指的是每升反应体系中生成的甘氨酸的质量，发酵一栏指的是每升发酵液中含有的甘氨酸的质量。

实施例3、乙醛酸氨化酶(Ald)体外催化产甘氨酸

将实施例2获得的不同来源的乙醛酸氨化酶纯酶进行体外催化，测定甘氨酸合成产量。

乙醛酸氨化酶体外催化产甘氨酸反应体系为：1.5ml离心管，加入反应缓冲液990μl(40mM磷酸钾缓冲液、400mM硫酸铵、0.2mM NADPH、50mM乙醛酸钠；pH7.0)，加入10μl 3U乙醛酸氨化酶纯酶，反应10min，在氨基酸分析仪上(日立全自动氨基酸分析仪L-8900)进行氨基酸分析检测甘氨酸的产量。

将不同来源的乙醛酸氨化酶纯酶进行体外催化，均能实现体外产甘氨酸的能力。来源于维氏气单胞菌A.veronii，海水芽孢杆菌B.aquimaris，蜡样芽孢杆菌B.cereus，弯曲芽孢杆菌B.flexus，地衣芽孢杆菌B.licheniformis，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，枯草芽孢杆菌B.substilis，嗜热脂肪芽孢杆菌G.stearothermophilus，玻利维亚盐单胞菌H.boliviensis，团聚拉布伦茨氏菌L.aggregata，赖氨酸芽孢杆菌L.fusiformis，铜绿假单胞菌P.aeruginosa，少盐芽孢杆菌P.globuius，耻垢分枝杆菌M.smegmatis，结核分支杆菌M.tuberculosis的乙醛酸氨化酶体外催化产甘氨酸分别为：20，45，36，5，4，2，3，46，41，38，26，33，31，75和55mg/L(表3)。

实施例4、直接发酵法产甘氨酸

将来源于维氏气单胞菌A.veronii，海水芽孢杆菌B.aquimaris，蜡样芽孢杆菌B.cereus，弯曲芽孢杆菌B.flexus，地衣芽孢杆菌B.licheniformis，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，枯草芽孢杆菌B.substilis，嗜热脂肪芽孢杆菌G.stearothermophilus，玻利维亚盐单胞菌H.boliviensis，团聚拉布伦茨氏菌L.aggregata，赖氨酸芽孢杆菌L.fusiformis，铜绿假单胞菌P.aeruginosa，少盐芽孢杆菌P.globuius，耻垢分枝杆菌M.smegmatis，结核分支杆菌M.tuberculosis的乙醛酸氨化酶基因(ald)从相应的pET30a-ald上克隆至pTrc99A-M(参考文献：“Zhao J,Li Q,Sun T,Zhu X,Xu H,Tang J,Zhang X,MaY(2013).Engineering central metabolic modules of Escherichia coli forimprovingβ-carotene production.MetabEng 17:42-50”)的SalI和KpnI位点上，得到相应质粒pTrc99AM-Av ald，pTrc99AM-Ba ald，pTrc99AM-Bc ald，pTrc99AM-Bf ald，pTrc99AM-Bv ald，pTrc99AM-Bl ald，pTrc99AM-Bs ald，pTrc99AM-Gs-ald，pTrc99AM-Hb ald，pTrc99AM-La ald，pTrc99AM-Lf ald，pTrc99AM-Pa ald，pTrc99AM-Pg ald，pTrc99AM-Msald和pTrc99AM-Mt ald。

将这些质粒转化至大肠杆菌ATCC 8739(Gunsalus IC,Hand DB(1941)The use ofbacteria in the chemical determination of total vitamin C.J BiolChem 141:853-858.)电转化感受态细胞中。涂布氨苄平板(终浓度50mg/L)。得到的单克隆进行发酵分析。发酵的培养基如下：

种子培养基为LB：每1L中含胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；余量为水。灭菌后加氨苄青霉素(终浓度为50mg/L)。

1L NBS发酵培养基：葡萄糖5g、(NH₄)₂SO₄ 13.2g、KH₂PO₄ 3.5g、K₂HPO₄ 6.55g、(NH₄)₂HPO₄ 3.5g、MgSO₄·7H₂O 0.12g、和甜菜碱-KCl 0.15g。FeCl₃·6H₂O 1.5μg、CoCl₂·6H₂O 0.1μg、CuCl₂·2H₂O 0.1μg、ZnCl₂ 0.1μg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg、MnCl₂·4H₂O 0.2μg,H₃BO₃ 0.05μg；余量为水。

将抗生素平板上的单克隆转接于20ml LB液体培养基中(终浓度50ml/L的氨苄抗生素)，37℃、250r/min培养10-12h，获得摇瓶发酵种子液。离心收集20OD的种子液，重悬于10ml NBS培养基中，37℃、250r/min培养3天。

取样离心，上清用氨基酸分析仪(日立全自动氨基酸分析仪L-8900)甘氨酸产量。发酵结果如图2所示，对照菌株大肠杆菌ATCC 8739的产量为0，含有维氏气单胞菌A.veronii，海水芽孢杆菌B.aquimaris，蜡样芽孢杆菌B.cereus，弯曲芽孢杆菌B.flexus，地衣芽孢杆菌B.licheniformis，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，枯草芽孢杆菌B.substilis，嗜热脂肪芽孢杆菌G.stearothermophilus，玻利维亚盐单胞菌H.boliviensis，团聚拉布伦茨氏菌L.aggregata，赖氨酸芽孢杆菌L.fusiformis，铜绿假单胞菌P.aeruginosa，少盐芽孢杆菌P.globuius，耻垢分枝杆菌M.smegmatis，结核分支杆菌M.tuberculosis乙醛酸氨化酶基因(ald)的工程菌株对应的甘氨酸产量分别为：4.8,5.7,4.3,1.7,0.8,1.5,1.4,2.5,5.6,4.8,1.8,3.2,6.8,9.4,6.8mg/L(表2，图2)。甘氨酸产量在4.8mg/L以上的有7组，对应的乙醛酸氨化酶分别是：来源于耻垢分枝杆菌的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.13)，来源于少盐芽孢杆菌的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.12)，来源于结核分支杆菌的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQID No.14)，来源于海水芽孢杆菌的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.9)，来源于玻利维亚盐单胞菌的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.10)，来源于维氏气单胞菌的氨基酸序列如SEQID No.1所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.8)，来源于团聚拉布伦茨氏菌的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的乙醛酸氨化酶(对应编码基因为SEQ ID No.11)。其中，来源于耻垢分枝杆菌M.smegmatis的Ald产量最高，为9.4mg/L，将此大肠杆菌工程菌株命名为NZ-GAN001。

实施例5、NZ-GAN002菌株的构建

从大肠杆菌NZ-GAN001出发，采用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除甘氨酸脱羧酶编码基因(gcvP基因，Gene ID:6064873)，获得重组大肠杆菌NZ-GAN002(表1)。

(1)供体质粒pV4的构建

供体质粒pV4在pRedCas9的作用下具有自剪切功能，是在供体质粒placZ(仇焕娜,赵东东,满淑丽,毕昌昊,朱欣娜,张学礼(2018)大肠杆菌染色体上严谨型启动子的构建.微生物学通报,45(8):1693-1704.)的基础上添加了lacI基因和针对自身质粒cat基因的N20-gRNA序列，具体构建过程如下：

第一步，获得骨架DNA片段I。以placZ质粒为模板，使用引物Bone-F和Bone-R(表2)进行PCR扩增，得到6.6kb左右的PCR产物，即为骨架DNA片段I，含有cat、P15A和lacZ基因。

扩增体系为：New England Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各2.5mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

第二步，获得lacI基因及Ptrc启动子片段II。以pACYC184-M质粒(Zhao J,Li Q,Sun T,Zhu X,Xu H,Tang J,Zhang X,Ma Y(2013).Engineering central metabolicmodules of Escherichia coli for improvingβ-carotene production.MetabEng 17:42-50.)为模板，使用引物lacI-Ptrc-up和lacI-Ptrc-down(表2)进行PCR扩增，得到1.5kb左右的PCR产物，即为DNA片段II。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。

第三步，获得cat-N20-gRNA片段III。以placZ质粒为模板，用引物cat-N20-up和cat-N20-down(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为DNA片段III。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。

第四步，将骨架DNA片段I、lacI和Ptrc启动子片段II和cat-N20-gRNA片段III用Golden Gate技术策略(Engler C,Kandzia R,Marillonnet S(2008)A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability.PLoS One 3,e3647.)进行组装，转化感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物V4-lacI-YZ-up和cat-YZ-down(表2)进行PCR验证，条带大小为1.7Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4质粒，该质粒添加了lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA元件，因此具有自剪切功能。

(2)甘氨酸脱羧酶编码基因(gcvP基因)敲除质粒pV4-del-gcvP的构建

在pV4质粒基础上构建gcvP基因敲除质粒pV4-del-gcvP，该质粒含有针对gcvP基因的gcvP-N20-gRNA序列和敲除gcvP基因的上下游同源臂序列。具体步骤如下：

第一步，获得pV4质粒骨架片段I。以pV4质粒为模板，用引物N20-B-F1和N20-B-R1(表2)反向PCR扩增，得到4.1kb左右的PCR产物，即为pV4质粒骨架片段I。该片段含有cat、P15A和自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。

第二步，获得gcvP-N20-gRNA序列片段II。以pV4质粒为模板，用引物gcvP-N20-B-F2和N20-B-R2(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为DNA片段II。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。

第三步，获得gcvP基因的上下游同源臂片段III和片段IV。以大肠杆菌ATCC 8739(Gunsalus IC,Hand DB(1941)The use of bacteria in the chemical determinationof total vitamin C.J BiolChem 141:853-858.)的基因组DNA为模板，用引物gcvP-F1和glyA-R1(表2)进行PCR扩增，获得上游同源臂片段III，约500bp。同理，用引物gcvP-F2和gcvP-R2(表2)获得下游同源臂片段IV，约500bp。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。

第四步，将pV4质粒骨架片段I、gcvP-N20-gRNA序列片段II和gcvP基因的上下游同源臂片段III和片段IV用Golden Gate技术策略进行组装，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-UP和gcvP-R2(表2)进行PCR验证，条带大小为1.3Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-gcvP质粒。

(3)敲除甘氨酸脱羧酶编码基因(gcvP基因)

从大肠杆菌NZ-GAN001出发，制备电转化感受态细胞，将质粒pRedCas9(Zhu,X.,Zhao,D.,Qiu,H.,Fan,F.,Man,S.,Bi,C.,Zhang,X.,2017.The CRISPR/Cas9-facilitatedmultiplex pathway optimization(CFPO)technique and its application to improvethe Escherichia coli xylose utilization pathway.Metab.Eng.43,37-45)和pV4-del-gcvP同时转化到NZ-GAN001电转化感受态细胞，涂卡纳霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡纳霉素和氯霉素；2.5％L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡纳霉素和氯霉素，2.5％L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取10个单克隆进行菌落PCR验证，引物为gcvP-del-YZ-up和gcvP-del-YZ-down(表2)，大小约1Kb。阳性克隆经最终测序验证正确后命名为NZ-GAN002。

实施例6、重组大肠杆菌NZ-GAN003的构建

从重组大肠杆菌NZ-GAN002出发，采用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除苹果酸合成酶编码基因(aceB基因，Gene ID:6064573)，获得重组大肠杆菌NZ-GAN003(表1)。具体构建过程如下：

(1)苹果酸合成酶编码基因(aceB基因)敲除质粒pV4-del-aceB的构建

按照实施例2(2)中构建pV4-del-gcvP的策略，构建pV4-del-aceB质粒。使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除gcvP基因过程中所使用的引物的名称，仅将gcvP替换为aceB。

其中，获得的aceB-N20-gRNA序列片段II大小约为400bp，获得aceB基因的上游同源臂片段III大小约为400bp，aceB基因的下游同源臂片段IV大小约为500bp，将四个片段组装后用引物P15A-UP和aceB-R2(表2)进行PCR验证，条带大小为1.3Kb。

(2)敲除苹果酸合成酶编码基因(aceB基因)

从重组大肠杆菌NZ-GAN001出发，按照实施例2(3)中敲除gcvP的策略，敲除aceB基因。使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除aceB基因过程中所使用的引物的名称，仅将gcvP替换为aceB。最后菌落PCR验证aceB基因敲除正确的克隆命名为NZ-GAN003。

其中，用引物aceB-del-YZ-down和aceB-del-YZ-up进行菌落PCR验证，所得产物大小约为1.6Kb。

实施例7、重组大肠杆菌NZ-GAN004的构建

从大肠杆菌NZ-GAN003出发，双质粒基因编辑系统敲除转录抑制蛋白编码基因(iclR基因，Gene ID:6064567)，获得重组大肠杆菌NZ-GAN004(表1)。

(1)转录抑制蛋白编码基因(iclR基因)敲除质粒pV4-del-iclR的构建

按照实施例2(2)中构建pV4-del-gcvP的策略，构建pV4-del-iclR质粒。使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除gcvP基因过程中所使用的引物的名称，仅将gcvP替换为iclR。

其中，获得的iclR-N20-gRNA序列片段II大小约为400bp，获得iclR基因的上游同源臂片段III大小约为500bp，iclR基因的下游同源臂片段IV大小约为400bp，将四个片段组装后用引物P15A-UP和iclR-R2(表2)进行PCR验证，条带大小为1.3Kb。

(2)敲除转录抑制蛋白编码基因(iclR基因)

从大肠杆菌NZ-GAN003出发，按照实施例2(3)中敲除gcvP的策略，敲除iclR基因。使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除iclR基因过程中所使用的引物的名称，仅将gcvP替换为iclR。最后菌落PCR验证iclR基因敲除正确的克隆命名为NZ-GAN004。

其中，用引物iclR-del-YZ-down和iclR-del-YZ-up进行菌落PCR验证，所得产物大小约为1.3Kb。

实施例8、重组大肠杆菌NZ-GAN005的构建

从NZ-GAN004出发，用启动子M1-93调控异柠檬酸裂解酶编码基因(aceA基因，GeneID:6064570)的表达，得到重组大肠杆菌NZ-GAN005。

根据两步法同源重组，具体方法见文献(Tan,Z,Chen J,Zhang X.(2016).Systematic engineering of pentose phosphate pathway improves Escherichiacoli succinate production.Biotechnology for Biofuels,9.；Chen J,Zhu X,Tan Z,XuH,Tang J,Xiao D,Zhang X(2014).Activating C4-dicarboxylate transporters DcuBand DcuC for improving succinateproduction.ApplMicrobiolBiotechnol,98(5),2197-2205.)。以pXZ-CS质粒(Tan,Z.,Zhu,X.,Chen,J.,Li,Q.,Zhang,X.,2013.Activatingphosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase incombination for improvement of succinate production.Appl.Environ.Microbiol.79,4838-4844.)为模板，使用引物aceA-cat-up/aceA-sacB-down(表2)进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于aceA基因的ATG前。以重组大肠杆菌M1-93(Lu J,Tang J,Liu Y,Zhu X,Zhang T,Zhang X(2012)Combinatorial modulation of galP andglk gene expression for improved alternative glucose utilization.ApplMicrobiol Biotechnol 93:2455-2426.)的基因组DNA为模板，用引物aceA-P-up/aceA-RBS-down(表2)扩增，得到同源重组的DNA启动子片段II，进行第二次同源重组，替换异柠檬酸裂解酶编码基因(aceA基因)前的cat-sacB，从而实现M1-93调控aceA的表达。用引物AP1-up/aceA-YZ-down200(表2)进行PCR验证。验证正确的重组菌株经最终测序验证正确(将M1-93启动子插入到了大肠杆菌基因组中aceA基因ATG前)后命名为NZ-GAN005(表1)。

实施例9、重组大肠杆菌NZ-GAN001、NZ-GAN002、NZ-GAN003、NZ-GAN004、NZ-GAN005发酵

使用实施例3的方法对重组大肠杆菌NZ-GAN001、NZ-GAN002、NZ-GAN003、NZ-GAN004、NZ-GAN005进行产甘氨酸分析评价。

结果分析(见图3)：随着菌株的改造，敲除乙醛酸的旁支代谢途径aceB、iclR和强启动子M1-93替换增加aceA的表达，大肠杆菌重组菌株的甘氨酸产量逐渐增加，相对于NZ-GAN001的产量为9.4mg/L，NZ-GAN002、NZ-GAN003、NZ-GAN004和NZ-GAN005的产量分别为10，58，122和210mg/L。其中，重组大肠杆菌NZ-GAN005的产量是出发菌株的22倍。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 甘氨酸的生产方法

<130> GNCLN200507

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> Aeromonas veronii

<400> 1

Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn His Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Gly Met Val Pro Ala Ser Val Arg Glu Leu Thr Ala Arg Asn His Thr

20 25 30

Val Phe Val Gln Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ile Gly Phe Ser Asp Ala

35 40 45

Asp Tyr Ile Ala Val Gly Ala Glu Ile Leu Ala Ser Ala Ala Glu Val

50 55 60

Phe Ala Lys Ala Glu Met Ile Val Lys Val Lys Glu Pro Gln Pro Val

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Glu Cys Ala Met Leu Arg Pro Gly Gln Thr Leu Phe Thr Tyr Leu His

85 90 95

Leu Ala Pro Asp Leu Pro Gln Thr Glu Ala Leu Leu Lys Ser Gly Ala

100 105 110

Ile Cys Ile Ala Tyr Glu Thr Val Thr Asp Gly Arg Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Ala Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Ile Gln Ala

130 135 140

Gly Ala Gln Ala Leu Glu Lys Ser Arg Gly Gly Ser Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Val Pro Gly Val Glu Pro Ala Lys Val Val Ile Ile Gly Gly

165 170 175

Gly Val Val Gly Ser Asn Ala Ala Arg Met Ala Ile Gly Leu Arg Ala

180 185 190

Asp Val Thr Ile Leu Asp Asn Asn Val Asp Thr Leu Arg Arg Leu Asp

195 200 205

Asn Glu Phe Gln Gly Ala Ala Lys Val Val Tyr Ser Asn Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Glu Arg His Leu Leu Ala Ala Asp Leu Val Ile Gly Gly Val Leu

225 230 235 240

Val Pro Gly Ala Thr Ala Pro Lys Leu Val Arg Arg Asp His Ile Ala

245 250 255

Arg Met Lys Pro Gly Ser Ala Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

Gly Cys Val Glu Thr Ser His Ala Thr Thr His Gln Asp Pro Thr Tyr

275 280 285

Ile Val Asp Glu Val Val His Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Ala Arg Thr Ser Thr Val Ala Leu Asn Asn Ala Thr Leu Pro Phe

305 310 315 320

Ile Ile Lys Leu Ala Gln Gln Gly Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Asn Asp

325 330 335

Pro Asn Leu Leu His Gly Leu Asn Val Met Glu Gly Lys Leu Thr Cys

340 345 350

Lys Glu Val Ala Val Ala His Gly Leu Ala Tyr Thr Asp Pro Leu Thr

355 360 365

Leu Leu Asn

370

<210> 2

<211> 372

<212> PRT

<213> Bacillus aquimaris

<400> 2

Met Arg Ile Gly Val Pro Met Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Met Thr Pro Ala Gly Val Val Asn Leu Val Gln Phe Gly His Glu

20 25 30

Val Phe Ile Glu Ser Gly Ala Gly Met Gly Ser Gly Phe Thr Asp Glu

35 40 45

Asp Tyr Thr Ala Ala Gly Gly Gln Ile Val Ser Thr Ala Ser Glu Ala

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Trp Ser Met Asp Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Ser Glu

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Tyr Ser Tyr Phe Arg Glu Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

85 90 95

Ala Pro Glu Pro Glu Leu Thr Lys Ala Leu Ile Asp Asn Lys Val Val

100 105 110

Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Glu Val Asn Arg Ser Leu Pro Leu Leu

115 120 125

Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Thr Gln Ile Gly Ala

130 135 140

Gln Phe Leu Glu Lys Ile His Gly Gly Lys Gly Val Leu Leu Ser Gly

145 150 155 160

Val Pro Gly Val Arg Arg Ser Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val

165 170 175

Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asn Val

180 185 190

Thr Ile Leu Asp Leu Asn Pro Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile

195 200 205

Phe Gly Ser Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Pro Leu Asn Ile Glu

210 215 220

Gln Ala Val Lys Glu Ala Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu Ile Pro

225 230 235 240

Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Asp Met Ile Lys Ser Met

245 250 255

Thr Pro Gly Ser Val Val Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile

260 265 270

Phe Glu Thr Thr Asp Arg Ile Thr Thr His Asp Asp Pro Thr Tyr Glu

275 280 285

Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val

290 295 300

Pro Arg Thr Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala

305 310 315 320

Ile Gln Ile Ala Ser Lys Gly Tyr Lys Gln Ala Cys Leu Asp Asn Glu

325 330 335

Ala Leu Leu Lys Gly Val Asn Thr Leu Asn Gly Tyr Val Thr Tyr Gln

340 345 350

Ala Val Ala Glu Ala His Gly Leu Asp Tyr Ser Asn Thr Arg Thr Gln

355 360 365

Leu Glu Gln Leu

370

<210> 3

<211> 372

<212> PRT

<213> Halomonas boliviensis

<400> 3

Met Lys Ile Ala Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn His Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Ala Leu Thr Pro Thr Gly Ala Arg Glu Leu Thr Gly Arg Gly His Gln

20 25 30

Val Ser Val Gln Ala Gly Ala Gly Glu Gly Ala Gly Phe Ala Asp Ala

35 40 45

Asp Phe Gln Ala Ala Gly Ala Gln Ile Glu Ala Asp Val Asp Ala Leu

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Trp Arg Asn Ala Glu Leu Ile Leu Lys Val Lys Glu Pro Gln Pro Asp

65 70 75 80

Glu Val Ala Arg Leu Thr Pro Gln His Thr Leu Phe Thr Tyr Leu His

85 90 95

Leu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Thr Arg Gly Leu Met Glu Ser Gly Ala

100 105 110

Thr Cys Ile Ala Tyr Glu Thr Ile Thr Asp Ala Arg Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Ala Pro Met Ser Thr Val Ala Gly Arg Met Ala Val Gln Ala

130 135 140

Gly Ala His Ser Leu Glu Lys Ala Gln Gly Gly Ala Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Pro Gly Val Pro Gly Val Ala Pro Gly Lys Val Thr Val Ile Gly Gly

165 170 175

Gly Val Val Gly Glu Asn Ala Ala Arg Met Ala Leu Gly Leu Gly Ala

180 185 190

Glu Val Thr Ile Leu Asp Lys Ser Leu Ala Arg Leu Glu Val Leu Asp

195 200 205

Asp Arg Tyr Gln Gly Arg Ile Lys Thr Val Tyr Ser Thr Ala Asp Ala

210 215 220

Leu Glu Thr Ala Thr Arg Glu Ser Asp Met Ile Ile Gly Ala Val Leu

225 230 235 240

Val Pro Gly Ala Ala Ala Pro Lys Leu Ile Thr Arg Ser Met Leu Ala

245 250 255

Asp Met Lys Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

Gly Cys Phe Glu Thr Ser Lys Pro Thr Thr His Ala Glu Pro Thr Tyr

275 280 285

Ile Val Asp Gly Val Val His Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

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325 330 335

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Gln Ala Val Ala Asp Ala Phe Gly Leu Glu Ser Ser Asp Pro Gly Ser

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370

<210> 4

<211> 379

<212> PRT

<213> Labrenzia aggregata

<400> 4

Met Arg Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn His Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Gly Leu Thr Pro Asn Ser Val Leu Glu Met Val Ala His Gly His Glu

20 25 30

Val Val Val Glu Thr Asn Ala Gly Val Gly Ile Gly Ala Ser Asp Ala

35 40 45

Asp Tyr Glu Ala Ala Gly Ala Lys Ile Leu Ala Thr Ala Lys Glu Val

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Arg Ala Met Leu Arg Pro Asp His Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His

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100 105 110

Thr Cys Ile Ala Tyr Glu Thr Val Val Asp Ala Arg Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Val Pro Met Ser Gln Val Ala Gly Arg Leu Ser Val Ile Ala

130 135 140

Gly Ala Lys Ala Leu Glu Lys Ala Gln Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val

145 150 155 160

Gly Gly Val Pro Gly Val Glu Pro Ala Lys Val Val Val Ile Gly Gly

165 170 175

Gly Val Val Gly Ser His Ala Ile Thr Met Ala Leu Gly Leu Gly Ala

180 185 190

Asp Val Thr Val Leu Asp Arg Ser Thr Ala Val Leu Gly Asn Leu Ser

195 200 205

Gln Thr Phe Gly Pro Ala Leu Lys Thr Val Tyr Ser Thr Lys Ala Ala

210 215 220

Leu Glu Lys His Val Leu Glu Ala Asp Met Val Val Gly Ala Val Leu

225 230 235 240

Val Ala Gly Ala Ala Ala Pro Lys Leu Val Ser Arg Glu Leu Val Ser

245 250 255

Arg Met Lys Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Ala Leu Ala Leu Ala Asp Lys Gly Ala Lys Lys Ala Leu Leu Asp Asp

325 330 335

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Glu Ala Val Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Ala Tyr Val Asp Pro Lys Val

355 360 365

Ala Leu Glu Gln Ala Lys Glu Ser Ala Ala Ala

370 375

<210> 5

<211> 371

<212> PRT

<213> Paucisalibacillus globuius

<400> 5

Met Lys Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Leu Thr Leu Thr Ser Ala Gly His Glu

20 25 30

Val Tyr Val Glu Thr Asp Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Thr Asp Glu

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Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Glu Asn Arg Thr Leu Pro Leu

115 120 125

Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly

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145 150 155 160

Ala Ile Pro Gly Val Arg Arg Ala Asn Val Thr Val Ile Gly Gly Gly

165 170 175

Val Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asn

180 185 190

Val Thr Ile Leu Asp Leu Ser Pro Glu Arg Leu Arg Tyr Leu Asp Asp

195 200 205

Val Phe Gly Ser Lys Val Asn Thr Met Met Ser Asn Pro Met Asn Ile

210 215 220

Ala Glu Cys Val Ala Gln Ser Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu Ile

225 230 235 240

Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln

245 250 255

Met Ser Glu Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly

260 265 270

Ile Phe Glu Thr Ser Asp Arg Ile Thr Thr His Asp Asn Pro Thr Phe

275 280 285

Thr Lys His Gly Val Leu His Tyr Ser Val Ala Asn Met Pro Gly Gly

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ala Thr Ile Gly Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Gln Ile Ala Thr Lys Gly Tyr Ala Gln Ala Cys Leu Ser Asn

325 330 335

Pro Ala Leu Leu Lys Gly Leu Asn Thr Leu Asp Gly Tyr Val Thr Tyr

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Glu Ala Val Ala Leu Ser His Gly Leu Glu His Arg Lys Ser Glu Glu

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Leu Leu Gly

370

<210> 6

<211> 371

<212> PRT

<213> Mycobacterium smegmatis

<400> 6

Met Leu Val Gly Ile Pro Thr Glu Ile Lys Asn Asn Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Ala Glu Leu Thr Arg Arg Gly His Glu

20 25 30

Val Ile Ile Gln Ala Gly Ala Gly Glu Gly Ser Ala Ile Ser Asp Arg

35 40 45

Asp Phe Lys Ala Ala Gly Ala Glu Ile Val Asn Thr Ala Asp Gln Val

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Trp Ser Glu Ala Glu Leu Leu Leu Lys Val Lys Glu Pro Ile Glu Pro

65 70 75 80

Glu Tyr Ser Arg Met Arg Lys Gly Gln Thr Leu Phe Thr Tyr Leu His

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Leu Ala Ala Ser Lys Pro Cys Thr Asp Ala Leu Leu Ala Ser Gly Thr

100 105 110

Thr Ser Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Ala Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Leu Ser Ala Gln Val

130 135 140

Gly Ala Tyr His Leu Met Arg Ser Tyr Gly Gly Arg Gly Val Leu Met

145 150 155 160

Gly Gly Val Pro Gly Val Ala Pro Ala Glu Val Val Val Ile Gly Ala

165 170 175

Gly Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Ala Arg Val Ala Ala Gly Met Gly Ala

180 185 190

His Val Thr Val Phe Asp Leu Asn Ile Asn Thr Leu Arg Arg Val Asp

195 200 205

Gly Glu Phe Gly Gly Arg Ile Glu Thr Arg Tyr Ser Ser Ser Leu Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ala Val Lys Lys Ala Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu

225 230 235 240

Val Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Asn Ser Thr Val Ala

245 250 255

His Met Lys Pro Gly Ala Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

Gly Cys Phe Glu Asp Ser Arg Pro Thr Thr His Asp Glu Pro Thr Phe

275 280 285

Lys Val His Asp Thr Ile Phe Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Ser Thr Met Pro Tyr

305 310 315 320

Val Leu Lys Leu Ala Asp Lys Gly Trp Gln Ala Ala Cys Ala Ser Asp

325 330 335

Ser Ala Leu Ala Lys Gly Leu Ser Thr His Asp Gly Lys Leu Leu Ser

340 345 350

Glu Ala Val Ala Lys Asp Leu Asp Leu Pro Phe Thr Asp Ala Ala Gln

355 360 365

Phe Leu Ala

370

<210> 7

<211> 371

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 7

Met Arg Val Gly Ile Pro Thr Glu Thr Lys Asn Asn Glu Phe Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Ala Glu Leu Thr Arg Arg Gly His Glu

20 25 30

Val Leu Ile Gln Ala Gly Ala Gly Glu Gly Ser Ala Ile Thr Asp Ala

35 40 45

Asp Phe Lys Ala Ala Gly Ala Gln Leu Val Gly Thr Ala Asp Gln Val

50 55 60

Trp Ala Asp Ala Asp Leu Leu Leu Lys Val Lys Glu Pro Ile Ala Ala

65 70 75 80

Glu Tyr Gly Arg Leu Arg His Gly Gln Ile Leu Phe Thr Phe Leu His

85 90 95

Leu Ala Ala Ser Arg Ala Cys Thr Asp Ala Leu Leu Asp Ser Gly Thr

100 105 110

Thr Ser Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Thr Ala Asp Gly Ala Leu Pro

115 120 125

Leu Leu Ala Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Leu Ala Ala Gln Val

130 135 140

Gly Ala Tyr His Leu Met Arg Thr Gln Gly Gly Arg Gly Val Leu Met

145 150 155 160

Gly Gly Val Pro Gly Val Glu Pro Ala Asp Val Val Val Ile Gly Ala

165 170 175

Gly Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Ala Arg Ile Ala Asn Gly Met Gly Ala

180 185 190

Thr Val Thr Val Leu Asp Ile Asn Ile Asp Lys Leu Arg Gln Leu Asp

195 200 205

Ala Glu Phe Cys Gly Arg Ile His Thr Arg Tyr Ser Ser Ala Tyr Glu

210 215 220

Leu Glu Gly Ala Val Lys Arg Ala Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu

225 230 235 240

Val Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Ser Asn Ser Leu Val Ala

245 250 255

His Met Lys Pro Gly Ala Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly

260 265 270

Gly Cys Phe Glu Gly Ser Arg Pro Thr Thr Tyr Asp His Pro Thr Phe

275 280 285

Ala Val His Asp Thr Leu Phe Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Ala Ser

290 295 300

Val Pro Lys Thr Ser Thr Tyr Ala Leu Thr Asn Ala Thr Met Pro Tyr

305 310 315 320

Val Leu Glu Leu Ala Asp His Gly Trp Arg Ala Ala Cys Arg Ser Asn

325 330 335

Pro Ala Leu Ala Lys Gly Leu Ser Thr His Glu Gly Ala Leu Leu Ser

340 345 350

Glu Arg Val Ala Thr Asp Leu Gly Val Pro Phe Thr Glu Pro Ala Ser

355 360 365

Val Leu Ala

370

<210> 8

<211> 1116

<212> DNA

<213> Aeromonas veronii

<400> 8

atgattatcg gtgtacctaa agagataaaa aaccatgaat accgcgtagg catggttccg 60

gccagtgtac gtgaactgac agcacgaaac catactgttt tcgtccaaag cggtgccgga 120

aacggcattg gcttcagcga tgcagattat atcgctgttg gagccgaaat tttggcctct 180

gctgcagagg ttttcgccaa agccgagatg atcgtcaagg tcaaggaacc tcagcctgtc 240

gaatgtgcca tgctgcgtcc gggtcagacc ctgttcacct atctgcatct ggcgccagac 300

ttgccccaga ccgaagccct gctgaaaagc ggcgccatct gtatcgccta tgaaaccgtc 360

accgacggcc gtggcggcct gcccctgctg gcccccatgt cggaagtggc cggacgcatg 420

tctattcagg cgggtgccca ggcgctggaa aaatcgcgcg gtggtagcgg agtgctgctc 480

ggcggcgtac ccggtgtcga accagccaag gtggtgatca tcggtggcgg cgtggtcggc 540

tccaatgcag cccgcatggc cattggcctg cgcgcggatg tgaccatcct cgacaacaac 600

gtcgataccc tgcgtcgtct cgataacgag ttccagggag cggccaaagt ggtctactcc 660

aacagcgaga cgctggagcg ccatctgctg gcggccgatc tggtcatcgg cggcgtgctg 720

gtaccggggg ccactgcgcc aaaacttgtc cgccgtgacc acattgcgcg catgaagccg 780

ggttctgcta tcgtcgatgt ggccatcgat cagggcggct gtgtggaaac ctcccacgcc 840

accacccacc aggatccgac ctatattgtc gatgaggtgg tgcactactg tgtcgccaac 900

atgccggggg cggtagcccg cacctcgacc gtggcgctca acaatgccac tctccccttt 960

atcatcaagc tggcccagca agggtatcgt caggcactgc tgaacgatcc caacctgctg 1020

cacgggctca acgtgatgga gggcaaactc acctgcaagg aagtggccgt ggcacatggc 1080

cttgcctaca cggatcccct gaccctgctg aattga 1116

<210> 9

<211> 1119

<212> DNA

<213> Bacillus aquimaris

<400> 9

atgcgtattg gtgtgccaat ggaaatcaag aataatgaaa accgtgtagc gatgactcct 60

gccggtgttg tgaaccttgt tcaattcgga catgaggtgt ttatcgaatc cggagcaggg 120

atgggttcag gctttacaga tgaagattac actgctgcag gcggacaaat cgtaagcact 180

gcatcggaag catggtcgat ggatatggtc atgaaggtaa aggagccgct tccaagcgaa 240

tattcttatt tccgtgaagg gctgatttta tttacatatt tacatcttgc accggaacct 300

gaacttacaa aggcactaat cgacaataaa gtcgtagcga ttgcttacga aacagtcgaa 360

gtgaaccgct cgcttccgct tctgactcct atgagtgaag tggctggacg catggcgact 420

cagatcggtg cccagttcct tgagaagatc catggcggaa aaggggttct tctatctgga 480

gtgccgggtg tgcgccgcag taaggtaacg atcatcggcg gaggggttgc cggaacgaat 540

gctgctaaaa tggctgtcgg acttggagct aacgtcacca tccttgattt gaatcccgac 600

cgtctgcgcc agctcgatga tatcttcgga agcgatgtta ctacgctgat gtccaaccca 660

ttaaatatcg aacaagctgt aaaagaagca gatcttgtta tcggtgccgt cctgatcccg 720

ggagcgaaag cacctaaact ggtaacagaa gacatgatca agtcaatgac tcctggatca 780

gtcgtggtcg atatcgcaat cgatcaaggc ggtatctttg aaacgacaga caggatcacg 840

actcatgatg atcctactta cgaaaaacat ggtgtagtcc actatgccgt tgcaaatatg 900

ccaggagctg taccgcgtac atccacgatt gcattgacaa acgtgacggt tccttatgcg 960

atccaaatcg catcaaaagg ttacaagcaa gcatgcctgg acaatgaagc cctgcttaaa 1020

ggggtcaaca cactgaatgg ttatgtaacc tatcaagccg ttgctgaagc acacggactt 1080

gactactcaa acacaagaac acaacttgaa caactctaa 1119

<210> 10

<211> 1119

<212> DNA

<213> Halomonas boliviensis

<400> 10

atgaaaatcg ccgtccccaa agagattaaa aatcacgaat atcgcgtggc cttaacgcct 60

accggcgcac gagaattaac cgggcgcggt catcaggtga gcgtccaagc cggtgctggc 120

gaaggcgcag gctttgccga tgctgatttc caagccgccg gtgcccagat agaggcggat 180

gtggacgctt tgtggcgcaa cgccgagctg atcctcaagg tgaaagagcc gcagccggac 240

gaagtggcgc gacttacccc gcagcatacg ctgttcacct atctgcacct cgctgctgaa 300

gagccgctta cccgcgggct aatggaaagc ggtgccacct gtatcgccta tgaaacgatt 360

accgacgccc gcggaggctt gccgctactt gcgccgatga gcaccgtagc ggggcggatg 420

gcggtgcaag cgggtgctca tagcctggag aaggcccagg gcggtgcggg cgtgctgctg 480

cccggcgtgc ccggtgtggc gccgggcaag gtaaccgtga ttgggggtgg cgtggtgggc 540

gaaaacgctg cgcgcatggc gctggggctg ggtgctgagg tcaccattct ggataagtcg 600

ttagcgcggc tggaagtgct ggacgaccgc tatcagggcc gcataaagac ggtgtattcc 660

accgccgacg cgctggaaac ggccacgcgt gagtcggata tgattattgg cgcggtgctg 720

gtgcccggtg ccgctgcgcc aaaattgatc actcgcagca tgctggccga tatgaagccc 780

ggcagtgtac tggtggatgt ggcgatcgat cagggtggct gctttgaaac cagtaagccc 840

accacccatg ccgagccgac ctatatagtc gatggagtgg tgcactactg cgtggctaat 900

atgcccggcg cggtagcgcg cacgtctacc caggggctga ccaatgccac cttgcccttt 960

gtgctcgccc tggcggataa aggctggcag caggcgctac gcgacgaccc gcacttcctg 1020

ccgggcctta acgtgtatgc gggtcaagtc acctaccaag cagtagcgga tgcctttggg 1080

ctggaaagta gtgatcctgg gagcgttgtt ggaagctaa 1119

<210> 11

<211> 1140

<212> DNA

<213> Labrenzia aggregata

<400> 11

atgcgcattg gtgtgccgaa agaaatcaaa aaccacgagt accgggttgg tctgaccccg 60

aacagtgttc ttgaaatggt ggctcatggc cacgaagttg tcgttgaaac caatgccggt 120

gtcggcatcg gcgccagcga tgccgactac gaagcagcag gcgcgaagat cctggcaaca 180

gccaaggaag tcttcgatgc cgcgaacatg atcgtgaagg tcaaggaacc gcaggccgtc 240

gaacgcgcca tgctgcgccc cgaccacatt ctcttcacct atctgcacct ggcgccagac 300

gcggagcaga ccgcggacct ggtaaagtcc ggtgcgacct gcattgccta tgaaaccgtt 360

gtcgatgctc gcggcggtct gccgcttctg gtgccgatgt cccaggttgc cggccgcctg 420

tcggtgattg ccggcgccaa ggcgctggaa aaggcccagg gtggctccgg tacgctcgtg 480

ggcggtgttc ccggcgtcga accggccaag gtcgttgtca tcggtggcgg tgtggtcggc 540

tcgcatgcca ttaccatggc gcttggcctc ggagccgatg tcaccgttct cgatcggtct 600

accgccgttc tgggcaatct ctcacagacg ttcggtccgg cactgaaaac cgtctattcg 660

accaaggctg ccctggagaa gcatgtgctg gaagccgaca tggtcgtcgg tgcggtgctg 720

gttgccggtg cggcggcacc aaagctggtt tcgcgcgagc tggtcagccg catgaagccg 780

ggatcggttc tcgttgatgt cgccatcgac cagggcggct gcttcgaaac ctccaaggca 840

acgacgcatt ccgagccgac ctacatcatc gatgaagtcg ttcactactg cgtcgccaac 900

atgccgggcg ccgtgccgaa gacgtccacc tacgcgctga acaacgccac cctgccgttt 960

gctctcgcac tggcagacaa gggtgccaag aaggcgctgc tcgatgatcc gcacttcctg 1020

ccgggcctta acgtgatcgg cggtcaggtg acctgtgagg cggtcgcaac cgctctcggc 1080

tatgcctacg tcgatccgaa ggttgctctt gagcaggcca aggaaagcgc tgctgcctga 1140

<210> 12

<211> 1116

<212> DNA

<213> Paucisalibacillus globuius

<400> 12

atgaaaatag gggttccaaa agagataaag aataatgaaa atagggtagc aatcacacca 60

gctggagtac taactttaac aagcgcaggg catgaggttt atgtagaaac agatgctggt 120

cttggatcag gttttactga tgagcaatac actcaaactg gtgcagtaat tgttaattct 180

gcaaaagaag catgggaaca agaaatggtg atgaaggtta aggagccgct accagaggaa 240

tatgattatt tctatgaggg gcaaatatta tttacatact tacacttagc tgcagaacca 300

gaattaacgc gtgtgctact agagaaaaaa gtagttggta tagcttacga aactgttcag 360

ttggaaaatc gaactcttcc attacttaca ccaatgagtg aagttgctgg tcgaatggcc 420

gcacaaattg gtgcgcaatt ccttgagaaa tctaagggcg gaaaagggat attgctcgcg 480

gcaattcctg gtgttagacg tgcaaatgta accgttattg ggggaggagt agttggtact 540

aatgcagcaa aaatagctgt tggtttagga gcaaatgtaa ctatattaga tttaagtcca 600

gaaagacttc gttatttaga tgatgtcttt ggatctaagg ttaatacgat gatgtcgaat 660

ccaatgaata ttgcagaatg tgttgcacaa tctgatttag ttattggtgc cgttttaatt 720

ccaggggcta aagcaccaaa acttgtaacc gaggaaatgg ttaaacagat gtctgagggt 780

tctgttattg tggacgttgc gattgaccaa ggtggtattt ttgaaacaag tgatcgtatc 840

acaacacatg ataatccaac ttttacaaag catggtgtgc ttcactattc tgttgccaat 900

atgcctggtg gggtaccacg taccgcaaca attggcttaa cgaatgtaac cgtaccgtat 960

gcacttcaaa ttgctactaa aggatatgca caagcgtgtt tgagtaatcc tgcattatta 1020

aagggactta atacattgga tgggtatgta acttatgaag ccgttgcatt atcacatgga 1080

ttagaacata gaaagtcaga agaattatta ggctaa 1116

<210> 13

<211> 1116

<212> DNA

<213> Mycobacterium smegmatis

<400> 13

atgctggttg gtatcccgac cgagatcaag aacaacgagt accgtgttgc catcaccccg 60

gctggtgtgg cagagctgac ccgtcgtggt cacgaagtga tcatccaggc cggtgccggt 120

gagggttctg ccatctctga ccgcgacttc aaggcggcgg gtgccgaaat cgttaacacc 180

gccgaccagg tctggtctga agcagaactg ctgctgaagg ttaaagaacc gatcgagccg 240

gaatactctc gtatgcgcaa aggccagacc ctgttcacct acctgcacct ggcggcgtcc 300

aagccgtgca ccgacgcgct gctggcgtcc ggcaccacgt ctatcgccta cgagacagtt 360

cagaccgccg aaggtgcgct gccgctgctg gcgccgatga gcgaggttgc cggccgtctg 420

tctgcccagg tcggtgccta ccacctgatg cgtagctacg gtggccgtgg cgtcctgatg 480

ggcggcgtcc cgggtgtcgc gcctgccgag gtcgtcgtga tcggcgcagg caccgccggc 540

tacaacgccg cgcgtgttgc tgcgggtatg ggcgctcacg tgaccgtgtt cgacctgaac 600

atcaacaccc tgcgtcgtgt cgacggcgag ttcggtggtc gtatcgaaac ccgttactct 660

tcttctctgg aactggaaga agcggttaag aaagccgacc tggtgatcgg cgcagttctg 720

gtgccgggtg ccaaagcgcc gaaactggtt accaattcta ccgtcgcgca catgaaaccg 780

ggtgcggttc tggtcgacat cgcgatcgac cagggtggct gcttcgagga ctctcgtccg 840

accacgcacg acgaaccgac cttcaaggtt cacgacacga tcttctactg cgtggccaac 900

atgccgggtg cggtgccgcg tacgtctacg ttcgcgctga ccaactctac catgccgtac 960

gtgctgaagc tggctgacaa aggttggcag gccgcgtgtg cgtctgattc cgcactggcc 1020

aagggtctgt ctacccacga cggtaaactg ctgtccgaag ccgtcgccaa ggacctggac 1080

ctgccgttca ccgacgcggc acagttcctg gcgtaa 1116

<210> 14

<211> 1116

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 14

atgcgcgtcg gtattccgac cgaaaccaaa aacaacgaat tccgggtggc catcaccccg 60

gccggcgtcg cggaactaac ccgtcgtggc catgaggtgc tcatccaggc aggtgccgga 120

gagggctcgg ctatcaccga cgcggatttc aaggcggcag gcgcgcaact ggtcggcacc 180

gccgaccagg tgtgggccga cgctgattta ttgctcaagg tcaaagaacc gatagcggcg 240

gaatacggcc gcctgcgaca cgggcagatc ttgttcacgt tcttgcattt ggccgcgtca 300

cgtgcttgca ccgatgcgtt gttggattcc ggcaccacgt caattgccta cgagacggtc 360

cagaccgccg acggcgcact acccctgctt gccccgatga gcgaagtcgc cggtcgactc 420

gccgcccagg ttggcgctta ccacctgatg cgaacccaag ggggccgcgg tgtgctgatg 480

ggcggggtgc ccggcgtcga accggccgac gtcgtggtga tcggcgccgg caccgccggc 540

tacaacgcag cccgcatcgc caacggcatg ggcgcgaccg ttacggttct agacatcaac 600

atcgacaaac ttcggcaact cgacgccgag ttctgcggcc ggatccacac tcgctactca 660

tcggcctacg agctggaggg tgccgtcaaa cgtgccgacc tggtgattgg ggccgtcctg 720

gtgccaggcg ccaaggcacc caaattagtc tcgaattcac ttgtcgcgca catgaaacca 780

ggtgcggtac tggtggatat agccatcgac cagggcggct gtttcgaagg ctcacgaccg 840

accacctacg accacccgac gttcgccgtg cacgacacgc tgttttactg cgtggcgaac 900

atgcccgcct cggtgccgaa gacgtcgacc tacgcgctga ccaacgcgac gatgccgtat 960

gtgcttgagc ttgccgacca tggctggcgg gcggcgtgcc ggtcgaatcc ggcactagcc 1020

aaaggtcttt cgacgcacga aggggcgtta ctgtccgaac gggtggccac cgacctgggg 1080

gtgccgttca ccgagcccgc cagcgtgctg gcctaa 1116

Claims (11)

1.一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，包括如下步骤：

（A1）使受体菌表达乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；

所述乙醛酸氨化酶为来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶；

（A2）以所述工程菌1为出发菌株，对其内源的甘氨酸脱羧酶进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌2；

（A3）以所述工程菌2为出发菌株，对其内源的苹果酸合成酶进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌3；

（A4）以所述工程菌3为出发菌株，对其内源的转录抑制蛋白进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌4；

（A5）以所述工程菌4为出发菌株，提高内源异柠檬酸裂解酶的表达量，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5为能够生产甘氨酸的工程菌株；

所述受体菌为大肠杆菌；

所述来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质或为在SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（A1）为：向所述受体菌中导入所述乙醛酸氨化酶的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（A2）中对其内源的甘氨酸脱羧酶进行抑制表达的方法为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的甘氨酸脱羧酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（A3）中对其内源的苹果酸合成酶进行抑制表达的方法为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中苹果酸合成酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（A4）中对其内源的转录抑制蛋白进行抑制表达的方法为：以所述工程菌3为出发菌株，敲除基因组中转录抑制蛋白编码基因，所得菌株即为所述工程菌4。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌ATCC 8739。

7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：来源于所述耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的DNA分子。

8.利用权利要求1-7中任一所述方法构建得到的工程菌株。

9.权利要求8所述工程菌株在生产甘氨酸中的应用。

10.一种通过发酵生产甘氨酸的方法，包括如下步骤：对权利要求8所述的工程菌株进行发酵培养，从发酵产物中获得甘氨酸。

11.一种体外催化生产甘氨酸的方法，包括如下步骤：以来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶体外催化乙醛酸和铵根离子反应生成甘氨酸；

在所述乙醛酸氨化酶体外催化乙醛酸和铵根离子反应生成甘氨酸的过程中，反应体系的pH为7.0；反应体系中还含有磷酸钾缓冲液和NADPH；

所述来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质或为在SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。