CN116536237B - 改造的大肠杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了改造的大肠杆菌及其在发酵生产L‑缬氨酸中的应用。在生产缬氨酸的大肠杆菌中通过“敲除pflB基因”、“敲除pflB基因和adhE基因”、“敲除pflB基因和adhE基因且敲除ilvE（E）基因同时插入来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”、“敲除pflB基因、adhE基因和thiE基因且敲除ilvE（E）基因同时插入来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”或“敲除pflB基因、adhE基因、thiE基因和mdh基因且敲除ilvE（E）基因同时插入来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”获得的工程菌均可以提高L‑缬氨酸的产量。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及改造的大肠杆菌及其在发酵生产L-缬氨酸中的应用。
背景技术
L-缬氨酸在食品、医药、保健品﹑饲料等领域均有着重要的应用。目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-缬氨酸的生产，很多实验室也在开展关于L-缬氨酸发酵工艺研究的课题。研究人员发现，胞内L-缬氨酸透过细胞膜分泌到胞外的过程需要特定转运蛋白的参与，但在该过程中，特定转运蛋白活性不能满足及时将胞内缬氨酸透过细胞膜分泌到胞外，导致胞内L-缬氨酸积累；同时，在菌体细胞内含有乙酰羟酸合酶，乙酰羟酸合酶对L-缬氨酸的生物合成有催化作用，可以促进产酸，但是当菌体细胞内合成的L-缬氨酸不能及时外排产生积累时，乙酰羟酸合酶受到L-缬氨酸的强烈抑制，其催化作用下降，不能进一步催化合成L-缬氨酸，L-缬氨酸的继续合成就受到限制，最终导致产量低。另外，研究发现大肠杆菌对L-缬氨酸非常敏感，当L-缬氨酸生产菌胞内的L-缬氨酸不能及时排出产生积累时，会严重抑制大肠杆菌的生长，进而导致菌胞内L-缬氨酸的合成受到抑制，导致产量低。
发明内容
本发明的主要目的为如何提高L-氨基酸的产量，本发明的目的不限于所描述的主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它目的。
本发明首先保护一种工程菌，可为体内抑制或下调丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性的微生物；
所述微生物可以生产缬氨酸。
所述丙酮酸甲酸裂解酶为A1）、A2）或A3）：
A1）氨基酸序列如SEQ ID No：13所示的蛋白质；
A2）将A1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述工程菌中，所述抑制或下调丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因（即pflB基因）来实现的。
所述抑制或下调丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-pflB sgRNA质粒和SEQ ID No：2所示的ΔpflB-Up-Down片段实现。
上述工程菌的体内还抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性。
所述乙醇脱氢酶为B1）、B2）或B3）：
B1）氨基酸序列如SEQ ID No：14所示的蛋白质；
B2）将B1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3）在B1）或B2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述工程菌中，所述抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中乙醇脱氢酶的编码基因（即adhE基因）来实现的。
所述抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-adhE sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的ΔadhE-Up-Down片段实现。
上述工程菌的体内还抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶。
所述微生物来源的分支链氨基酸转氨酶为C1）、C2）或C3）：
C1）氨基酸序列如SEQ ID No：15所示的蛋白质；
C2）将C1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3）在C1）或C2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶为D1）、D2）或D3）：
D1）氨基酸序列如SEQ ID No：16所示的蛋白质；
D2）将D1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
D3）在D1）或D2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述工程菌中，所述抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（E）基因）来实现的。
上述工程菌中，所述含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶是通过向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（B）基因）来实现的。
上述工程菌中，所述向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因是通过向微生物中导入表达盒来实现的；所述表达盒包括启动子和枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因。所述启动子可为诱导型启动子。所述诱导型启动子具体可为ptrc启动子。
所述抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性和含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-ilvE sgRNA质粒和SEQ ID No：8所示的ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段实现。
上述工程菌的体内还抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性。
所述硫胺磷酸合酶为E1）、E2）或E3）：
E1）氨基酸序列如SEQ ID No：17所示的蛋白质；
E2）将E1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
E3）在E1）或E2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述工程菌中，所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。
所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：10所示的ΔthiE-Up-Down片段实现。
上述工程菌的体内还抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。
所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：
F1）氨基酸序列如SEQ ID No：18所示的蛋白质；
F2）将F1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
F3）在F1）或F2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述工程菌中，所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：12所示的Δmdh-Up-Down片段实现。
本发明还保护一种制备生产缬氨酸的工程菌的方法，可包括步骤（a1）：降低微生物中上述任一所述丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性；
所述微生物可以生产缬氨酸。
所述制备方法中，所述降低微生物中丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因（即pflB基因）来实现的。
所述降低微生物中丙酮酸甲酸裂解酶的表达量和/或活性通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-pflB sgRNA质粒和SEQ ID No：2所示的ΔpflB-Up-Down片段实现。
所述制备方法还包括步骤（a2）：完成步骤（a1）后，降低微生物中上述任一所述乙醇脱氢酶的表达量和/或活性。
所述制备方法中，所述降低微生物中乙醇脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中乙醇脱氢酶的编码基因（即adhE基因）来实现的。
所述降低微生物中乙醇脱氢酶的表达量和/或活性通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-adhE sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的ΔadhE-Up-Down片段实现。
所述制备方法还包括步骤（a3）：完成步骤（a2）后，降低所述微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且在所述微生物中表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶。
所述微生物来源的分支链氨基酸转氨酶为C1）、C2）或C3）：
C1）氨基酸序列如SEQ ID No：15所示的蛋白质；
C2）将C1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3）在C1）或C2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶为D1）、D2）或D3）：
D1）氨基酸序列如SEQ ID No：16所示的蛋白质；
D2）将D1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
D3）在D1）或D2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述制备方法中，所述降低微生物中分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（E）基因）来实现的。所述在所述微生物中表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶是通过向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（B）基因）来实现的。所述向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因是通过向微生物中导入表达盒来实现的；所述表达盒包括启动子和枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因。所述启动子可为诱导型启动子。所述诱导型启动子具体可为ptrc启动子。
所述降低所述微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且在所述微生物中表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-ilvE sgRNA质粒和SEQ ID No：8所示的ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段实现。
所述制备方法还包括步骤（a4）：完成步骤（a3）后，降低所述微生物中上述任一所述硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性。
所述制备方法中，所述降低所述微生物中硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。
所述降低所述微生物中硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：10所示的ΔthiE-Up-Down片段实现。
所述制备方法还包括步骤（a5）：完成步骤（a4）后，降低所述微生物中上述任一所述苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。
所述制备方法中，所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：12所示的Δmdh-Up-Down片段实现。
本发明还保护上述任一所述的工程菌或上述任一所述的方法制备的工程菌的应用，可为K1）、K2）或K3）：
K1）生产L-氨基酸；
K2）制备用于生产L-氨基酸的产品；
K3）制备含有L-氨基酸的食品、饲料或药品。
本发明还保护一种生产或制备L-氨基酸的方法，包括如下步骤：发酵培养上述任一所述的工程菌或上述任一所述的方法制备的工程菌，收集发酵产物，从中获得L-氨基酸。
所述培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
本文中，所述L-氨基酸可包括L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸和/或L-组氨酸。
上述任一所述L-氨基酸具体可为L-缬氨酸。
本文中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、产碱菌属（Alcaligenes sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽胞杆菌属（Bacillus sp.）、短杆菌属（Brevibacterium sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）、气杆菌属（Aerobacter sp.）、肠杆菌属（Enterobacteria sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、普罗维登斯菌属（Providencia sp.）等但不限于此。
进一步地，所述细菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes，产氨短杆菌）、钝齿棒状杆菌（Corynebacterium crenatum）或泛菌（Pantoea）但不限于此。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌（Escherichia coli）。具体的，所述大肠杆菌可为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045 CGMCCNo.22721或大肠杆菌W3110。
本申请的发明人通过大量实验发现，在可以生产缬氨酸的大肠杆菌（如大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045 CGMCC No.22721或大肠杆菌W3110）中通过“敲除pflB基因”、“敲除pflB基因和adhE基因”、“敲除pflB基因和adhE基因且敲除ilvE（E）基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”、“敲除pflB基因、adhE基因和thiE基因且敲除ilvE（E）基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”或“敲除pflB基因、adhE基因、thiE基因和mdh基因且敲除ilvE（E）基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE（B）基因”获得的工程菌均可以显著提高L-氨基酸（如L-缬氨酸）的产量。本发明具有重要的应用价值。
保藏说明：
菌种名称：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
菌株编号：YP045
分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年06月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22721
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045可用于生产缬氨酸，其已于2021年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.22721。大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045的全称为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045 CGMCC No.22721，以下简称为缬氨酸生产菌CGMCC 22721。
实施例1、以缬氨酸生产菌CGMCC 22721出发的工程菌的改造
本发明的发明人经过大量实验，以缬氨酸生产菌CGMCC 22721出发进行改造，获得工程菌YPVal-pflB01、YPVal-pflB02、YPVal-pflB03、YPVal-pflB04和YPVal-pflB05。工程菌YPVal-pflB01、YPVal-pflB02、YPVal-pflB03、YPVal-pflB04和YPVal-pflB05的基因型见表1。
一、工程菌YPVal-pflB01的获得
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除缬氨酸生产菌CGMCC 22721基因组的pflB基因，得到工程菌YPVal-pflB01。
pflB基因编码丙酮酸甲酸裂解酶，其Gene ID为945514，其氨基酸序列如SEQ IDNo：13所示。
具体步骤如下：
1、pGRB-pflB sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/设计敲除pflB基因的sgRNA靶序列（SEQ ID No：1所示），在靶序列的5’末端和3’末端添加线性化pGRB载体同源臂序列，用于构建sgRNA质粒。
（1）由invitrogen公司合成引物sgRNA-1F：
5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTgcgaatttcttgaagttcagcggGTTTTAGA GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）、引物sgRNA-1R：
5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACccgctgaacttcaagaaattcgcACTAGTAT TATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）、引物sgRNA-PF：
5’-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3’和引物sgRNA-PR：
5’-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3’。
（2）将引物sgRNA-1F和引物sgRNA-1R进行退火（反应程序为：95℃变性5min，50℃退火1min），之后采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL，获得退火产物。退火产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的sgRNA-1片段。
（3）用限制性内切酶SpeI（Takara公司的产品，产品目录号为1631）酶切pGRB载体（addgene公司的产品，产品目录号为71539），用DNA回收试剂盒（QIAGEN Gel ExtractionKit）回收约2700bp的DNA片段。
酶切体系为50μL，由5μL 10×Buffer（限制性内切酶SpeI自带）、2.5μL限制性内切酶SpeI、3000-5000ng pGRB载体和ddH2O组成。
酶切程序：37℃ 3h。
（4）将步骤（3）回收的DNA片段进行去磷酸化反应（目的为防止pGRB载体自连），用DNA回收试剂盒回收，得到线性化pGRB载体。
去磷酸化体系为50μL，由5μL 10×Buffer（CIAP自带）、1000-2000ng步骤（3）回收的DNA片段、2.5μL CIAP（Takara公司的产品，产品目录号为2250A）和ddH2O组成。
去磷酸化程序：37℃ 1h。
（5）利用Gibson Assembly试剂盒（New England公司）将步骤（4）得到线性化pGRB载体和步骤（2）获得的退火产物进行重组，之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（TAKARA），得到pGRB-pflB sgRNA质粒。
重组体系为5μL，由2μL 线性化pGRB载体、0.5μL退火产物和2.5μL组装酶（GibsonAssembly试剂盒自带）组成。
重组程序：50℃组装30min。
2、ΔpflB-Up-Down片段的获得
（1）依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增上游同源臂的引物对和用于扩增下游同源臂的引物对。
用于扩增上游同源臂的引物对由引物P1：5’-CGTTGGTGTCCAGACAGGTATG-3’和引物P2：5’-GACATCCTGCGTTGCCGTAAATGAACCGTGAAATGCTGCTCG-3’组成。
用于扩增下游同源臂的引物对由引物P3：5’-CGAGCAGCATTTCACGGTTCATTTACGGCAACGCAGGATGTC-3’和引物P4: 5’- TTTCTCACCTGACCGTGATG-3’组成。
（2）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P1和引物P2组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为686bp的上游同源臂。
（3）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P3和引物P4组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为695bp的下游同源臂。
（4）将步骤（2）回收的上游同源臂和步骤（3）回收的下游同源臂混合并作为模板，采用引物P1和引物P4组成的引物对进行overlap PCR，获得SEQ ID No：2所示的ΔpflB-Up-Down片段。
3、CGMCC 22721-Cas9菌株的获得
（1）将质粒pREDCas9（addgene公司的产品，产品目录号为71541；含有壮观霉素抗性基因）转化至缬氨酸生产菌CGMCC 22721感受态细胞，之后涂布于含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上，32℃培养，获得抗壮观霉素的单菌落。
2-YT琼脂平板的制备方法如下：将16g胰蛋白胨、10g酵母浸粉、5g氯化钠和16g琼脂粉溶于适量水中，再用水定容至1L，用氢氧化钠调节pH值至7.0，121℃灭菌20分钟。
（2）分别以步骤（1）获得的单菌落为模板，采用引物pRedCas9-PF：5’-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3’和引物pRedCas9-PR：5’-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的DNA片段，则该菌落含有质粒pREDCas9。将该菌落的菌株命名为CGMCC22721-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB01的获得
（1）培养CGMCC 22721-Cas9菌株；当CGMCC 22721-Cas9菌株生长至OD600nm为0.1时加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为0.1mM，继续培养以诱导λ-Red介导的同源重组；当CGMCC 22721-Cas9菌株生长至OD600nm为0.6时，收集菌体并制备CGMCC 22721-Cas9感受态细胞。
（2）向CGMCC 22721-Cas9感受态细胞中转化步骤1获得的pGRB-pflB sgRNA质粒和步骤2获得的ΔpflB-Up-Down片段，涂布于含100mg/L壮观霉素和100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板，32℃培养，获得单菌落。
（3）分别以步骤（2）获得的单菌落为模板，采用引物P1和引物P4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1339bp的DNA片段，则该菌落初步鉴定为阳性转化子。
（4）将步骤（3）获得的阳性转化子接种于含100mg/L壮观霉素和0.2%（m/v）阿拉伯糖的2-YT琼脂平板，32℃培养（用于消除pGRB-pflB sgRNA质粒）；之后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上生长而在含100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板上不生长的菌落，再将这些菌落转接至2-YT琼脂平板，42℃培养（用于消除质粒pREDCas9）；最后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上不生长而在无抗的2-YT琼脂平板上生长的菌落。
（5）以步骤（4）获得的单菌落为模板，采用引物P1和引物P4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1339bp的DNA片段，则该菌落鉴定为阳性转化子。该阳性转化子即敲除缬氨酸生产菌CGMCC 22721基因组的pflB基因，将该阳性转化子命名为工程菌YPVal-pflB01。
二、工程菌YPVal-pflB02的获得
以步骤一获得的工程菌YPVal-pflB01为出发菌，依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除工程菌YPVal-pflB01基因组中的adhE基因。
adhE基因编码乙醇脱氢酶，其Gene ID为945837，氨基酸序列如SEQ ID No：14所示。
具体步骤如下：
1、pGRB-adhE sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/设计敲除adhE基因的sgRNA靶序列（SEQ ID No：4所示），在靶序列的5’末端和3’末端添加线性化pGRB载体同源臂序列，用于构建sgRNA质粒。
（1）由invitrogen公司合成引物sgRNA-2F：
5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTaagaaccacaacccagagtcaggGTTTTAGA GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）和引物sgRNA-2R：
5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcctgactctgggttgtggttcttACTAGTAT TATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）。
（2）将引物sgRNA-2F和引物sgRNA-2R进行退火（反应程序为：95℃变性5min，50℃退火1min），之后采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL，获得退火产物。退火产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的sgRNA-2片段。
（3）用限制性内切酶SpeI酶切pGRB载体，用DNA回收试剂盒（QIAGEN GelExtraction Kit）回收约2700bp的DNA片段。
酶切体系为50μL，由5μL 10×Buffer（限制性内切酶SpeI自带）、2.5μL限制性内切酶SpeI、3000-5000ng pGRB载体和ddH2O组成。
酶切程序：37℃ 3h。
（4）将步骤（3）回收的DNA片段进行去磷酸化反应（目的为防止pGRB载体自连），用DNA回收试剂盒回收，得到线性化pGRB载体。
去磷酸化体系为50μL，由5μL 10×Buffer（CIAP自带）、1000-2000ng步骤（3）回收的DNA片段、2.5μL CIAP和ddH2O组成。
去磷酸化程序：37℃ 1h。
（5）利用Gibson Assembly试剂盒将步骤（4）得到线性化pGRB载体和步骤（2）获得的退火产物进行重组，之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pGRB-adhE sgRNA质粒。
重组体系为5μL，由2μL 线性化pGRB载体、0.5μL退火产物和2.5μL组装酶（GibsonAssembly试剂盒自带）组成。
重组程序：50℃组装30min。
2、ΔadhE-Up-Down片段的获得
（1）依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增上游同源臂的引物对和用于扩增下游同源臂的引物对。
用于扩增上游同源臂的引物对由引物P5：5’-GTGCCAGTCATCCTTCAGGT-3’和引物P6：5’-CGTTCCGACCACTAACCCGACTTGGGTATTCCGAAATCTATCC-3’组成。
用于扩增下游同源臂的引物对由引物P7：5’-GGATAGATTTCGGAATACCCAAGTCGGGTTAGTGGTCGGAACG-3’和引物P8：5’-AAGCGATGCTGAAAGGTGTC-3’组成。
（2）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P5和引物P6组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为765bp的上游同源臂。
（3）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P7和引物P8组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为643bp的下游同源臂。
（4）将步骤（2）回收的上游同源臂和步骤（3）回收的下游同源臂混合并作为模板，采用引物P5和引物P8组成的引物对进行overlap PCR，获得SEQ ID No：5所示的ΔadhE-Up-Down片段。
3、YPVal-pflB01-Cas9菌株的获得
（1）将质粒pREDCas9转化至工程菌YPVal-pflB01感受态细胞，之后涂布于含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上，32℃培养，获得抗壮观霉素的单菌落。
（2）分别以步骤（1）获得的单菌落为模板，采用引物pRedCas9-PF和引物pRedCas9-PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的DNA片段，则该菌落含有质粒pREDCas9。将该菌落的菌株命名为YPVal-pflB01-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB02的获得
（1）培养YPVal-pflB01-Cas9菌株；当YPVal-pflB01-Cas9菌株生长至OD600nm为0.1时加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为0.1mM，继续培养以诱导λ-Red介导的同源重组；当YPVal-pflB01-Cas9菌株生长至OD600nm为0.6时，收集菌体并制备YPVal-pflB01-Cas9菌株感受态细胞。
（2）向YPVal-pflB01-Cas9菌株感受态细胞中转化步骤1获得的pGRB-adhE sgRNA质粒和步骤2获得的ΔadhE-Up-Down片段，涂布于含100mg/L壮观霉素和100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板，32℃培养，获得单菌落。
（3）分别以步骤（2）获得的单菌落为模板，采用引物P5和引物P8组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1365bp的DNA片段，则该菌落初步鉴定为阳性转化子。
（4）将步骤（3）获得的阳性转化子接种于含100mg/L壮观霉素和0.2%（m/v）阿拉伯糖的2-YT琼脂平板，32℃培养（用于消除pGRB-adhE sgRNA质粒）；之后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上生长而在含100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板上不生长的菌落，再将这些菌落转接至2-YT琼脂平板，42℃培养（用于消除质粒pREDCas9）；最后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上不生长而在无抗的2-YT琼脂平板上生长的菌落。
（5）以步骤（4）获得的单菌落为模板，采用引物P5和引物P8组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1365bp的DNA片段，则该菌落鉴定为工程菌YPVal-pflB01基因组上缺失adhE基因的阳性转化子。将该阳性转化子命名为工程菌YPVal-pflB02。
三、工程菌YPVal-pflB03的获得
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110的基因组序列和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除步骤二获得的工程菌YPVal-pflB02基因组的ilvE(E)基因同时敲入由ptrc启动子启动的枯草芽孢杆菌ilvE基因（即ptrc-ilvE(B)序列），得到工程菌YPVal-pflB03，以下简称YPVal-pflB03。ptrc-ilvE(B)序列的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示，SEQ ID No：6中，自5’末端起，第1096-1169位为ptrc启动子的核苷酸序列，第1-1095位为枯草芽孢杆菌ilvE(B)基因。
工程菌YPVal-pflB02的ilvE(E)基因编码分支链氨基酸转氨酶，其Gene ID为948278，氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。
枯草芽孢杆菌ilvE(B)基因编码分支链氨基酸转氨酶，其Gene ID为938420，氨基酸序列如SEQ ID No：16所示。
具体步骤如下：
1、pGRB-ilvE sgRNA质粒的构建
（1）由invitrogen公司合成引物sgRNA-3F：
5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTgaaagcagcgataatcacgtcggGTTTTAGA GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）和引物sgRNA-3R：
5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACccgacgtgattatcgctgctttcACTAGTAT TATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）。
（2）将引物sgRNA-3F和引物sgRNA-3R进行退火（反应程序为：95℃变性5min，50℃退火1min），之后采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL，获得退火产物。退火产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：7所示的sgRNA-3片段。
（3）用限制性内切酶SpeI（Takara公司的产品，产品目录号为1631）酶切pGRB载体（addgene公司的产品，产品目录号为71539），用DNA回收试剂盒（QIAGEN Gel ExtractionKit）回收约2700bp的DNA片段。
酶切体系为50μL，由5μL 10×Buffer（限制性内切酶SpeI自带）、2.5μL限制性内切酶SpeI、3000-5000ng pGRB载体和ddH2O组成。
酶切程序：37℃ 3h。
（4）将步骤（3）回收的DNA片段进行去磷酸化反应（目的为防止pGRB载体自连），用DNA回收试剂盒回收，得到线性化pGRB载体。
去磷酸化体系为50μL，由5μL 10×Buffer（CIAP自带）、1000-2000ng步骤（3）回收的DNA片段、2.5μL CIAP（Takara公司的产品，产品目录号为2250A）和ddH2O组成。
去磷酸化程序：37℃ 1h。
（5）利用Gibson Assembly试剂盒（New England公司）将步骤（4）得到线性化pGRB载体和步骤（2）获得的退火产物进行重组，之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（TAKARA），得到pGRB-ilvE sgRNA质粒。
重组体系为5μL，由2μL 线性化pGRB载体、0.5μL退火产物和2.5μL组装酶（GibsonAssembly试剂盒自带）组成。
重组程序：50℃组装30min。
2、ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段的获得
（1）依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增上游同源臂的引物对和用于扩增下游同源臂的引物对。依据NCBI公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增ptrc-ilvE(B)的引物对。
用于扩增上游同源臂的引物对由引物P9：5’-CAGGCAGTTCATTGAGTTAGCG -3’和引物P10：5’-CACAGTGTATTAAGCAGACGTTAAATACAAAAAATGGGACGGCAC-3’组成。
用于扩增下游同源臂的引物对由引物P13：
5’-GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTTTATATTCCTTTTGCGCTC-3’（下划线为ptrc启动子的部分序列）和引物P14：
5’-ACGGTTAGGGATGGTTCGAC-3’组成。
用于扩增ptrc-ilvE(B)的引物对由引物P11：
5’-GTGCCGTCCCATTTTTTGTATTTAACGTCTGCTTAATACACTGTG-3’和引物P12：
5’-GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAACTTTTTAAATATATGGAG-3’（下划线为ptrc启动子的部分序列）组成。
（2）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P9和引物P10组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为709bp的上游同源臂。
（3）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P13和引物P14组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为611bp的下游同源臂。
（4）以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因组DNA为模板，采用引物P11和引物P12组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为1168bp的ilvE(B)片段。
（5）将步骤（2）回收的上游同源臂、步骤（3）回收的下游同源臂和步骤（4）回收的ilvE(B)片段混合并作为模板，采用引物P9和引物P14组成的引物对进行overlap PCR，获得SEQ ID No：8所示的ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段。
3、YPVal-pflB02-Cas9菌株的获得
（1）将质粒pREDCas9转化至工程菌YPVal-pflB02感受态细胞，之后涂布于含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上，32℃培养，获得抗壮观霉素的单菌落。
（2）分别以步骤（1）获得的单菌落为模板，采用引物pRedCas9-PF和引物pRedCas9-PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的DNA片段，则该菌落含有质粒pREDCas9。将该菌落的菌株命名为YPVal-pflB02-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB03的获得
（1）培养YPVal-pflB02-Cas9菌株；当YPVal-pflB02-Cas9菌株生长至OD600nm为0.1时加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为0.1mM，继续培养以诱导λ-Red介导的同源重组；当YPVal-pflB02-Cas9菌株生长至OD600nm为0.6时，收集菌体并制备YPVal-pflB02-Cas9菌株感受态细胞。
（2）向YPVal-pflB02-Cas9菌株感受态细胞中转化步骤1获得的pGRB-ilvE sgRNA质粒和步骤2获得的ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段，涂布于含100mg/L壮观霉素和100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板，32℃培养，获得单菌落。
（3）分别以步骤（2）获得的单菌落为模板，采用引物P11和引物P12组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1168bp的DNA片段，则该菌落初步鉴定为阳性转化子。
（4）将步骤（3）获得的阳性转化子接种于含100mg/L壮观霉素和0.2%（m/v）阿拉伯糖的2-YT琼脂平板，32℃培养（用于消除pGRB-ilvE sgRNA质粒）；之后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上生长而在含100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板上不生长的菌落，再将这些菌落转接至2-YT琼脂平板，42℃培养（用于消除质粒pREDCas9）；最后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上不生长而在无抗的2-YT琼脂平板上生长的菌落。
（5）以步骤（4）获得的单菌落为模板，采用引物P11和引物P12组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1168bp的DNA片段，则该菌落鉴定为阳性转化子。该阳性转化子即敲除工程菌YPVal-pflB02基因组的ilvE(E)基因同时敲入由ptrc启动子启动的枯草芽孢杆菌ilvE(B)基因（即ptrc-ilvE(B)序列），将该阳性转化子命名为工程菌YPVal-pflB03。
四、工程菌YPVal-pflB04的获得
以工程菌YPVal-pflB03为出发菌，依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除工程菌YPVal-pflB03基因组中的thiE基因。
thiE基因编码硫胺磷酸合酶，其Gene ID为948491，氨基酸序列如SEQ ID No：17所示。
具体步骤如下：
1、pGRB-thiE sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/设计敲除thiE基因的sgRNA靶序列（SEQ ID No：9所示），在靶序列的5’末端和3’末端添加线性化pGRB载体同源臂序列，用于构建sgRNA质粒。
（1）由invitrogen公司合成引物sgRNA-4F：
5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTcgcccctcttatatcgcgctgggGTTTTAGA GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）和引物sgRNA-4R：
5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcccagcgcgatataagaggggcgACTAGTAT TATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）。
（2）将引物sgRNA-4F和引物sgRNA-4R进行退火（反应程序为：95℃变性5min，50℃退火1min），之后采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL，获得退火产物。退火产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：9所示的sgRNA-4片段。
（3）用限制性内切酶SpeI酶切pGRB载体，用DNA回收试剂盒（QIAGEN GelExtraction Kit）回收约2700bp的DNA片段。
酶切体系为50μL，由5μL 10×Buffer（限制性内切酶SpeI自带）、2.5μL限制性内切酶SpeI、3000-5000ng pGRB载体和ddH2O组成。
酶切程序：37℃ 3h。
（4）将步骤（3）回收的DNA片段进行去磷酸化反应（目的为防止pGRB载体自连），用DNA回收试剂盒回收，得到线性化pGRB载体。
去磷酸化体系为50μL，由5μL 10×Buffer（CIAP自带）、1000-2000ng步骤（3）回收的DNA片段、2.5μL CIAP和ddH2O组成。
去磷酸化程序：37℃ 1h。
（5）利用Gibson Assembly试剂盒将步骤（4）得到线性化pGRB载体和步骤（2）获得的退火产物进行重组，之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pGRB-thiE sgRNA质粒。
重组体系为5μL，由2μL 线性化pGRB载体、0.5μL退火产物和2.5μL组装酶（GibsonAssembly试剂盒自带）组成。
重组程序：50℃组装30min。
2、ΔthiE-Up-Down片段的获得
（1）依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增上游同源臂的引物对和用于扩增下游同源臂的引物对。
用于扩增上游同源臂的引物对由引物P15：5’-TTCTATTCAGGACGCCAACG-3’和引物P16：5’-GCTATAACGCATAAAGTCACGGCACGCTTCCTCCTTACGCAGG-3’组成。
用于扩增下游同源臂的引物对由引物P17：5’-CCTGCGTAAGGAGGAAGCGTGCCGTGACTTTATGCGTTATAGC-3’和引物P18：5’-GCCTGCAAAGTGCCCATAACCC-3’组成。
（2）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P15和引物P16组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为721bp的上游同源臂。
（3）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P17和引物P18组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为618bp的下游同源臂。
（4）将步骤（2）回收的上游同源臂和步骤（3）回收的下游同源臂混合并作为模板，采用引物P15和引物P18组成的引物对进行overlap PCR，获得SEQ ID No：10所示的ΔthiE-Up-Down片段。
3、YPVal-pflB03-Cas9菌株的获得
（1）将质粒pREDCas9转化至工程菌YPVal-pflB03感受态细胞，之后涂布于含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上，32℃培养，获得抗壮观霉素的单菌落。
（2）分别以步骤（1）获得的单菌落为模板，采用引物pRedCas9-PF和引物pRedCas9-PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的DNA片段，则该菌落含有质粒pREDCas9。将该菌落的菌株命名为YPVal-pflB03-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB04的获得
（1）培养YPVal-pflB03-Cas9菌株；当YPVal-pflB03-Cas9菌株生长至OD600nm为0.1时加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为0.1mM，继续培养以诱导λ-Red介导的同源重组；当YPVal-pflB03-Cas9菌株生长至OD600nm为0.6时，收集菌体并制备YPVal-pflB03-Cas9菌株感受态细胞。
（2）向YPVal-pflB03-Cas9菌株感受态细胞中转化步骤1获得的pGRB-thiE sgRNA质粒和步骤2获得的ΔthiE-Up-Down片段，涂布于含100mg/L壮观霉素和100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板，32℃培养，获得单菌落。
（3）分别以步骤（2）获得的单菌落为模板，采用引物P15和引物P18组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1296bp的DNA片段，则该菌落初步鉴定为阳性转化子。
（4）将步骤（3）获得的阳性转化子接种于含100mg/L壮观霉素和0.2%（m/v）阿拉伯糖的2-YT琼脂平板，32℃培养（用于消除pGRB-thiE sgRNA质粒）；之后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上生长而在含100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板上不生长的菌落，再将这些菌落转接至2-YT琼脂平板，42℃培养（用于消除质粒pREDCas9）；最后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上不生长而在无抗的2-YT琼脂平板上生长的菌落。
（5）以步骤（4）获得的单菌落为模板，采用引物P15和引物P18组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1296bp的DNA片段，则该菌落鉴定为工程菌YPVal-pflB03基因组上缺失thiE基因的阳性转化子。将该阳性转化子命名为工程菌YPVal-pflB04。
五、工程菌YPVal-pflB05的获得
以工程菌YPVal-pflB04为出发菌，依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除工程菌YPVal-pflB04基因组中的mdh基因。
mdh基因编码苹果酸脱氢酶，其Gene ID为947854，氨基酸序列如SEQ ID No：18所示。
具体步骤如下：
1、pGRB-mdh sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/设计敲除mdh基因的sgRNA靶序列（SEQ ID No：11所示），在靶序列的5’末端和3’末端添加线性化pGRB载体同源臂序列，用于构建sgRNA质粒。
（1）由invitrogen公司合成引物sgRNA-5F：
5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTgcctttcagttccgcaacaaaggGTTTTAGA GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）和引物sgRNA-5R：
5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcctttgttgcggaactgaaaggcACTAGTAT TATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’（下划线为pGRB载体同源臂序列）。
（2）将引物sgRNA-5F和引物sgRNA-5R进行退火（反应程序为：95℃变性5min，50℃退火1min），之后采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL，获得退火产物。退火产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：11所示的sgRNA-5片段。
（3）用限制性内切酶SpeI酶切pGRB载体，用DNA回收试剂盒（QIAGEN GelExtraction Kit）回收约2700bp的DNA片段。
酶切体系为50μL，由5μL 10×Buffer（限制性内切酶SpeI自带）、2.5μL限制性内切酶SpeI、3000-5000ng pGRB载体和ddH2O组成。
酶切程序：37℃ 3h。
（4）将步骤（3）回收的DNA片段进行去磷酸化反应（目的为防止pGRB载体自连），用DNA回收试剂盒回收，得到线性化pGRB载体。
去磷酸化体系为50μL，由5μL 10×Buffer（CIAP自带）、1000-2000ng步骤（3）回收的DNA片段、2.5μL CIAP和ddH2O组成。
去磷酸化程序：37℃ 1h。
（5）利用Gibson Assembly试剂盒将步骤（4）得到线性化pGRB载体和步骤（2）获得的退火产物进行重组，之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pGRB-mdh sgRNA质粒。
重组体系为5μL，由2μL 线性化pGRB载体、0.5μL退火产物和2.5μL组装酶（GibsonAssembly试剂盒自带）组成。
重组程序：50℃组装30min。
2、Δmdh-Up-Down片段的获得
（1）依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并由invitrogen公司合成用于扩增上游同源臂的引物对和用于扩增下游同源臂的引物对。
用于扩增上游同源臂的引物对由引物P19：5’-AACTTCCTCCAAACCGATGC-3’和引物P20：5’-CAATATAATAAGGAGTTTAGGTTGATTAGCGGATAATAAAAAACC-3’组成。
用于扩增下游同源臂的引物对由引物P21：5’-GGTTTTTTATTATCCGCTAATCAACCTAAACTCCTTATTATATTG-3’和引物P22：5’-TCTTCAATGGACTGGAGGTG-3’组成。
（2）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P19和引物P20组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为590bp的上游同源臂。
（3）以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物P21和引物P22组成的引物对用高保真扩增酶KAPA HiFi HotStart 进行PCR扩增，采用DNA回收试剂盒回收大小为708bp的下游同源臂。
（4）将步骤（2）回收的上游同源臂和步骤（3）回收的下游同源臂混合并作为模板，采用引物P19和引物P22组成的引物对进行overlap PCR，获得SEQ ID No：12所示的Δmdh-Up-Down片段。
3、YPVal-pflB04-Cas9菌株的获得
（1）将质粒pREDCas9转化至工程菌YPVal-pflB04感受态细胞，之后涂布于含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上，32℃培养，获得抗壮观霉素的单菌落。
（2）分别以步骤（1）获得的单菌落为模板，采用引物pRedCas9-PF和引物pRedCas9-PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的DNA片段，则该菌落含有质粒pREDCas9。将该菌落的菌株命名为YPVal-pflB04-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB05的获得
（1）培养YPVal-pflB04-Cas9菌株；当YPVal-pflB04-Cas9菌株生长至OD600nm为0.1时加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为0.1mM，继续培养以诱导λ-Red介导的同源重组；当YPVal-pflB04-Cas9菌株生长至OD600nm为0.6时，收集菌体并制备YPVal-pflB04-Cas9菌株感受态细胞。
（2）向YPVal-pflB04-Cas9菌株感受态细胞中转化步骤1获得的pGRB-mdh sgRNA质粒和步骤2获得的Δmdh-Up-Down片段，涂布于含100mg/L壮观霉素和100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板，32℃培养，获得单菌落。
（3）分别以步骤（2）获得的单菌落为模板，采用引物P19和引物P22组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1253bp的DNA片段，则该菌落初步鉴定为阳性转化子。
（4）将步骤（3）获得的阳性转化子接种于含100mg/L壮观霉素和0.2%（m/v）阿拉伯糖的2-YT琼脂平板，32℃培养（用于消除pGRB-thiE sgRNA质粒）；之后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上生长而在含100mg/L氨苄霉素的2-YT琼脂平板上不生长的菌落，再将这些菌落转接至2-YT琼脂平板，42℃培养（用于消除质粒pREDCas9）；最后挑选在含100mg/L壮观霉素的2-YT琼脂平板上不生长而在无抗的2-YT琼脂平板上生长的菌落。
（5）以步骤（4）获得的单菌落为模板，采用引物P19和引物P22组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某单菌落得到的PCR扩增产物中含有大小为1253bp的DNA片段，则该菌落鉴定为工程菌YPVal-pflB04基因组上缺失mdh基因的阳性转化子。将该阳性转化子命名为工程菌YPVal-pflB05。
实施例2、以大肠杆菌W3110出发的工程菌的改造
本发明的发明人经过大量实验，以大肠杆菌W3110出发进行改造，获得工程菌YPVal-pflB06、YPVal-pflB07、YPVal-pflB08、YPVal-pflB09和YPVal-pflB10。工程菌YPVal-pflB06、YPVal-pflB07、YPVal-pflB08、YPVal-pflB09和YPVal-pflB10的基因型见表2。
一、工程菌YPVal-pflB06的获得
1、pGRB-pflB sgRNA质粒的构建
同实施例1步骤一中1。
2、ΔpflB-Up-Down片段的获得
同实施例1步骤一中2。
3、W3110-Cas9菌株的获得
按照实施例1步骤一中3的步骤，将缬氨酸生产菌CGMCC 22721感受态细胞替换为大肠杆菌W3110感受态细胞，其他步骤均不变，得到W3110-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB06的获得
按照实施例1步骤一中4的步骤，将CGMCC 22721-Cas9菌株替换为W3110-Cas9菌株，其他步骤均不变，得到工程菌YPVal-pflB06。
二、工程菌YPVal-pflB07的获得
1、pGRB-adhE sgRNA质粒的构建
同实施例1步骤二中1。
2、ΔadhE-Up-Down片段的获得
同实施例1步骤二中2。
3、YPVal-pflB06-Cas9菌株的获得
按照实施例1步骤二中3的步骤，将工程菌YPVal-pflB01感受态细胞替换为工程菌YPVal-pflB06感受态细胞，其他步骤均不变，得到YPVal-pflB06-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB07的获得
按照实施例1步骤二中4的步骤，将YPVal-pflB01-Cas9菌株替换为YPVal-pflB06-Cas9菌株，其他步骤均不变，得到工程菌YPVal-pflB07。
三、工程菌YPVal-pflB08的获得
1、pGRB-ilvE sgRNA质粒的构建
同实施例1步骤三中1。
2、ptrc-ilvE(B)-Up-Down片段的获得
同实施例1步骤三中2。
3、YPVal-pflB07-Cas9菌株的获得
按照实施例1步骤三中3的步骤，将工程菌YPVal-pflB02感受态细胞替换为工程菌YPVal-pflB07感受态细胞，其他步骤均不变，得到YPVal-pflB07-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB08的获得
按照实施例1步骤三中4的步骤，将YPVal-pflB02-Cas9菌株替换为YPVal-pflB07-Cas9菌株，其他步骤均不变，得到工程菌YPVal-pflB08。
四、工程菌YPVal-pflB09的获得
1、pGRB-thiE sgRNA质粒的构建
同实施例1步骤四中1。
2、ΔthiE-Up-Down片段的获得
同实施例1步骤四中2。
3、YPVal-pflB08-Cas9菌株的获得
按照实施例1步骤四中3的步骤，将工程菌YPVal-pflB03感受态细胞替换为工程菌YPVal-pflB08感受态细胞，其他步骤均不变，得到YPVal-pflB08-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB09的获得
按照实施例1步骤四中4的步骤，将YPVal-pflB03-Cas9菌株替换为YPVal-pflB08-Cas9菌株，其他步骤均不变，得到工程菌YPVal-pflB09。
五、工程菌YPVal-pflB10的获得
1、pGRB-mdh sgRNA质粒的构建
同实施例1步骤五中1。
2、Δmdh-Up-Down片段的获得
同实施例1步骤五中2。
3、YPVal-pflB09-Cas9菌株的获得
按照实施例1步骤五中3的步骤，将工程菌YPVal-pflB04感受态细胞替换为工程菌YPVal-pflB09感受态细胞，其他步骤均不变，得到YPVal-pflB09-Cas9菌株。
4、工程菌YPVal-pflB10的获得
按照实施例1步骤五中4的步骤，将YPVal-pflB04-Cas9菌株替换为YPVal-pflB09-Cas9菌株，其他步骤均不变，得到工程菌YPVal-pflB10。
实施例3、采用实施例1和实施例2改造获得的工程菌发酵生产L-缬氨酸
1、分别将实施例1和实施例2改造获得的工程菌YPVal-pflB01、YPVal-pflB02、YPVal-pflB03、YPVal-pflB04、YPVal-pflB05、YPVal-pflB06、YPVal-pflB07、YPVal-pflB08、YPVal-pflB09和YPVal-pflB10以及出发菌缬氨酸生产菌CGMCC 22721和大肠杆菌W3110在发酵罐（上海百仑生物科技有限公司，型号为BLBIO-5GC-4-H）中进行发酵，得到发酵液。
每个菌株重复发酵三次。
发酵时采用的发酵培养基的组成如表3所示。
发酵的控制工艺如表4所示。
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2、采用高效液相色谱的方法分别检测发酵液中的L-缬氨酸产量。
缬氨酸生产菌CGMCC 22721以及以缬氨酸生产菌CGMCC 22721出发获得的工程菌YPVal-pflB01、YPVal-pflB02、YPVal-pflB03、YPVal-pflB04、YPVal-pflB05三次发酵的检测结果见表5（P值<0.01表示差异极显著）。结果表明，与缬氨酸生产菌CGMCC 22721相比，YPVal-pflB01、YPVal-pflB02、YPVal-pflB03、YPVal-pflB04和YPVal-pflB05均可以显著提高L-缬氨酸的产量。即在缬氨酸生产菌CGMCC 22721中通过“敲除pflB基因”、“敲除pflB基因和adhE基因”、“敲除pflB基因和adhE基因且敲除ilvE(E)基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”、“敲除pflB基因、adhE基因和thiE基因且敲除ilvE(E)基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”或“敲除pflB基因、adhE基因、thiE基因和mdh基因且敲除ilvE基因(E)同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”获得的工程菌均可以提高L-缬氨酸的产量。
大肠杆菌W3110以及以大肠杆菌W3110出发获得的工程菌YPVal-pflB06、YPVal-pflB07、YPVal-pflB08、YPVal-pflB09、YPVal-pflB10三次发酵的检测结果见表6（P值<0.01表示差异极显著）。结果表明，与大肠杆菌W3110相比，YPVal-pflB06、YPVal-pflB07、YPVal-pflB08、YPVal-pflB09和YPVal-pflB10均可以显著提高L-缬氨酸的产量。即在大肠杆菌W3110中通过“敲除pflB基因”、“敲除pflB基因和adhE基因”、“敲除pflB基因和adhE基因且敲除ilvE(E)基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”、“敲除pflB基因、adhE基因和thiE基因且敲除ilvE(E)基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”或“敲除pflB基因、adhE基因、thiE基因和mdh基因且敲除ilvE(E)基因同时插入ptrc启动的来自枯草芽孢杆菌的ilvE(B)”获得的工程菌均可以提高L-缬氨酸的产量。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (6)
1.制备生产缬氨酸的工程菌的方法，包括如下步骤：
（a1）敲除或敲低大肠杆菌中丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因；
（a2）敲除或敲低大肠杆菌中乙醇脱氢酶的编码基因；
（a3）通过敲除或敲低大肠杆菌中分支链氨基酸转氨酶的编码基因且在大肠杆菌中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因；
所述大肠杆菌生产缬氨酸；
所述丙酮酸甲酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示；
所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示；
所述大肠杆菌中分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示；
所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：16所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（a4）：敲除或敲低大肠杆菌中硫胺磷酸合酶的编码基因；
所述硫胺磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID No：17所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（a5）：敲除或敲低大肠杆菌中苹果酸脱氢酶的编码基因；
所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：18所示。
4.通过权利要求1至3中任一所述的方法制备得到的工程菌。
5.权利要求4所述的工程菌的应用，为K1）、K2）或K3）：
K1）生产缬氨酸；
K2）制备用于生产缬氨酸的产品；
K3）制备含有缬氨酸的食品、饲料或药品。
6.一种生产缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求4所述的工程菌，收集发酵产物，从中获得缬氨酸。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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