CN117535335A - Bbd29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产l-谷氨酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了BBD29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产L‑谷氨酸中的应用。本发明提供了一种提高细菌L‑氨基酸产量的方法，包括：将细菌基因组中的BBD29_12340基因的启动子(SEQ ID No.2)或BBD29_09880基因的启动子(SEQ ID No.6)替换为特定DNA分子(SEQ ID No.1)，实现细菌L‑氨基酸产量的提高。所述L‑氨基酸可为L‑谷氨酸。本发明对提高L‑谷氨酸产量具有重要意义。

Description

BBD29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产L-谷氨酸中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及BBD29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产L-谷氨酸中的应用。
背景技术
L-谷氨酸是最常见的氨基酸品种之一，用途广泛，主要利用谷氨酸棒杆菌及黄色短杆菌等菌株生产，L-谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α-酮戊二酸通过生物合成而来的。
制约谷氨酸生产菌的发酵因素是一个十分活跃的研究课题，环境因素、代谢控制及关键酶如异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、柠檬酸合酶及谷氨酸脱氢酶等的酶活等因素，这些研究为高产L-谷氨酸提供了一定的理论依据。
2-甲基柠檬酸脱水酶催化2-甲基柠檬酸的脱水，形成2-甲基-乌头酸酯的反式异构体，是丙酸盐降解途径的一部分。
但L-谷氨酸的产量低造成的高成本仍然是限制L-谷氨酸大规模生产的主要因素，但对于编码2-甲基柠檬酸脱水酶的BBD29_12340基因启动子区的43位C点突变为T在谷氨酸发酵过程中提高L-谷氨酸产量方面还未见报道。
发明内容
本发明将提高L-谷氨酸产量的研究焦点定位于关键酶的启动子上，通过定点突变关键酶2-甲基柠檬酸脱水酶的启动子序列，来增强L-谷氨酸的高产起到了有益作用。
第一方面，本发明要求保护一种提高细菌L-氨基酸产量的方法。
本发明要求保护的提高细菌L-氨基酸产量的方法，可包括如下步骤(A)或(B)：
(A)将细菌基因组中的BBD29_12340基因的启动子替换为特定DNA分子(即BBD29_12340基因启动子突变体)，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
所述BBD29_12340基因的启动子包含(或为)如下任一：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(b2)来源于细菌且与(b1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
(B)将细菌基因组中的BBD29_09880基因的启动子替换为所述特定DNA分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
所述BBD29_09880基因的启动子包含(或为)如下任一：
(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(c2)来源于细菌且与(c1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
其中，所述特定DNA分子具体为如下任一：
(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1的第230位以外的若干个核苷酸进行保守替换后得到的具有启动子功能的DNA分子。
进一步地，在步骤(A)中，将所述细菌基因组中的所述BBD29_12340基因的启动子替换为所述特定DNA分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.2的第230位由C突变为T实现，其他核苷酸序列不变。
更进一步地，在所述方法中，将所述细菌基因组中的BBD29_12340基因或BBD29_09880基因的启动子替换为所述特定DNA分子后还可包括对所得重组细菌进行发酵培养的步骤。从发酵培养产物中可以获得L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
其中，进行所述发酵培养采用的培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素及其组合。在培养过程中，可调节培养物的pH(如控制pH为6.8-7.0)。在培养中，培养物的温度可以是30至40℃。在培养过程中，可控制流加糖浓度(如控制为50-55％，即100mL液体中含糖的质量是50-55g)，控制发酵体系残糖(如控制为0.5-1.0％，即100mL液体中含糖的质量是0.5-1.0g)。
在本发明的具体实施方式中，进行所述发酵培养时采用的培养基的配方见表1，余量为水。进行所述发酵培养时，发酵控制工艺见表2。
其中，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”是指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
进一步地，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
第二方面，本发明要求保护一种DNA分子(BBD29_12340基因启动子突变体)。
本发明所要求保护的DNA分子包含(或为)如下任一：
(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1的第230位以外的若干个核苷酸进行保守替换后得到的具有启动子功能的DNA分子。
第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的DNA分子在作为启动子启动目的基因表达中的应用。
其中，所述目的基因可为可视化标记基因，如GUS基因；也可以为待表达的功能基因。
在本发明中，所述目的基因具体为微生物基因组中用于生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)的功能基因BBD29_12340和/或BBD29_09880。所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(Pantoea)。进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。更进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
第四方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌。
进一步地，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。更进一步地，所述重组载体可为重组表达载体(质粒)或重组克隆载体(质粒)。
进一步地，所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子、由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子。
进一步地，所述重组菌为含有所述表达盒或所述重组载体的重组菌。
在本发明的具体实施方式中，所述重组菌为重组菌A或重组菌B。
所述重组菌A为将细菌基因组中的BBD29_12340基因的启动子替换为前文第二方面中所述的DNA分子后得到的重组菌；
所述BBD29_12340基因的启动子包含(或为)如下任一：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(b2)来源于细菌且与(b1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
具体地，将所述细菌基因组中的所述BBD29_12340基因的启动子替换为前文第二方面中所述的DNA分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.2的第230位由C突变为T(其他核苷酸序列不变)实现。
所述重组菌B为将细菌基因组中的BBD29_09880基因的启动子替换为前文第二方面中所述的DNA分子后得到的重组菌；
所述BBD29_09880基因的启动子包含(或为)如下任一：
(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(c2)来源于细菌且与(c1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
上述(b2)和(c2)所述的DNA分子中，这里使用的术语“同一性”指与天然核苷酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示序列具有95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。下同。
其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子为野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_12340基因的启动子序列。在本发明中通过引入点突变，得到SEQ ID No.1所示的启动子突变体，具体是：将SEQ ID No.2的第230位由C突变为T，其他核苷酸序列不变。
所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
相应地，所述重组菌具体为重组菌YPG-12340或重组菌G12340或重组菌YPG-12340C-43T或重组菌G12340C-43T。
所述重组菌YPG-12340为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220基因组中BBD29_12340基因启动子(SEQ ID No.2)替换为突变后启动子序列(SEQ ID No.1)(具体可通过将SEQ ID No.2的第230位由C突变为T实现)，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌G12340为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869基因组中BBD29_12340基因启动子(SEQ ID No.2)替换为突变后启动子序列(SEQ ID No.1)(具体可通过将SEQ ID No.2的第230位由C突变为T实现)，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌YPG-12340C-43T是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组上BBD29_09880的启动子(即SEQ ID No.6)替换为BBD29-12340C-43T突变型启动子(即SEQ ID No.1)，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
所述重组菌G12340C-43T是将谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组上BBD29_09880的启动子(即SEQ ID No.6)替换为BBD29-12340C-43T突变型启动子(即SEQ ID No.1)，保持谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第二方面中所述的DNA分子或前文第四方面中所述的表达盒或重组载体或重组菌在生产L-氨基酸中的应用；
P2、前文第二方面中所述的DNA分子或前文第四方面中所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸工程菌株中的应用。
P3、前文第二方面中所述的DNA分子或前文第四方面中所述的表达盒或重组载体在制备含有L-氨基酸的食品、药品、饲料或化妆品中的应用。
其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
本发明的DNA分子可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的谷氨酸，所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明的DNA分子置于目的产物合成途径中基因上游并使DNA分子驱动目的产物合成途径中基因的合成即可实现目的产物的生产。
本发明研究发现：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_12340基因启动子区进行点突变BBD29_12340C-43T(即将SEQ ID No.2所示的野生型启动子替换为SEQ ID No.1所示的突变型启动子)，可以显著提高L-谷氨酸产量(p<0.01)。在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09880基因启动子(SEQ ID No.6)替换为突变型BBD29_12340C-43T启动子(SEQ ID No.1)，也可以显著提高L-谷氨酸产量(p<0.01)。可见，在谷氨酸棒杆菌中用SEQ ID No.1所示的突变型启动子启动用于生产谷氨酸的功能基因表达对于提高L-谷氨酸产量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。下文简称谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869为ATCC中编号为13869的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。下文简称谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
实施例1、在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_12340基因启动子区进行点突变BBD29_12340C-43T，构建重组菌
一、构建包含点突变的BBD29_12340基因编码区及其启动子区片段的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869基因组序列，设计并合成两对扩增BBD29_12340基因启动子区的引物，如下：
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGAACCAGTTACCAGAATC-3'，
P2：
P3：
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGGTAATACCTCGGCTTGCG-3'。
注：P1和P4上下划线部分是pK18mobsacB载体上自带的序列，加粗字体的碱基为突变位置。
经测序确认谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220染色体上保留有野生型的BBD29_12340基因及其启动子，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_12340基因启动子区中引入点突变，所述点突变为将BBD29_12340基因的野生型启动子核苷酸序列(SEQ ID No.2)的第230位胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T(对应于：将BBD29_12340基因起始密码子ATG的第一位记为+1,则这个突变位点为第-43位)，其他序列不变，得到SEQ ID No.1所示的突变启动子核苷酸序列。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，具体操作如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物对P1/P2和引物对P3/P4进行PCR扩增，获得两条大小分别为789bp和770bp且均带有突变碱基的BBD29_12340基因编码区及启动子区的DNA片段，分别命名为BBD29_12340Up(引物对P1/P2的扩增产物)和BBD29_12340Down(引物对P3/P4的扩增产物)。
其中，PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。
将上述经PCR扩增得到的两条DNA片段(BBD29_12340Up和BBD29_12340Down)进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化后，与经过酶切(Xba I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min。然后将连接产物转化DH5a，长出的单克隆用M13引物(M13F：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行PCR鉴定，获得阳性重组载体，命名为pK18-BBD29_12340C-43T。该载体经初步酶切鉴定正确后送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(C-T)的重组载体pK18-BBD29_12340C-43T保存备用。
重组载体pK18-BBD29_12340C-43T的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点XbaI/BamH I之间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.3的第37-1482位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
重组载体pK18-BBD29_12340C-43T中含有完整的SEQ ID No.3。SEQ ID No.3的第1-36位和第1483-1527位为pK18mobsacB质粒上自身序列；第37-543位为BBD29_12340基因启动子上游序列，第544-815位为BBD29_12335基因启动子突变序列；第816-1482位为BBD29_12340基因ORF的部分序列。其中，SEQ ID No.3的第773位为突变位点，该突变位点使得谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中BBD29_12340基因启动子区的第-43位(将BBD29_12340基因起始密码子ATG的第一位记为+1)的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)(对应SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的第230位)。
二、构建包含基因BBD29_12340C-43T的工程菌株
将步骤一中构建好的等位替换质粒pK18-BBD29_12340C-43T通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中，接着在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件如下：
培养基的组成：蔗糖10g/L；多聚蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；酵母粉5g/L；尿素2g/L；氯化钠2.5g/L；琼脂粉20g/L；余量为水；pH 7.0。
培养条件：32℃。
然后，对培养产生的单菌落分别通过步骤一中的引物P1和通用引物M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行鉴定，能扩增出如SEQ ID No.4所示的1527bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，各选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的八株菌株(即与基因组发生同源重组阳性的菌株)进一步采用P1和P4引物(序列参见步骤一)扩增后，将PCR产物进行测序，通过序列比对，均获得BBD29_12340基因启动子区的第-43位(将BBD29_12340基因起始密码子ATG的第一位记为+1)碱基序列发生突变(C-T)(对应SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的第230位)的菌株，即为等位替换成功的阳性菌株，分别命名为YPG-12340、G12340。
重组菌YPG-12340和G12340含有SEQ ID No.3的第544-815位所示的包括BBD29_12340基因突变启动子的片段。
重组菌YPG-12340与谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21220的区别仅在于：YPG-12340为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220基因组上SEQ ID No.2所示的BBD29_12340基因的野生型启动子替换为突变启动子(即SEQ ID No.1)，并保持其他序列不变得到的菌株。
重组菌G12340与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的区别在于：G12340为将ATCC13869基因组上SEQ ID No.2所示的BBD29_12340基因的野生型启动子替换为突变启动子(即SEQ ID No.1)，并保持其他序列不变得到的菌株。
实施例2、在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09880基因启动子替换为突变型BBD29_12340C-43T启动子，构建重组菌
为进一步证明SEQ ID No.1所示的BBD29_BBD29_12340C-43T启动子的高效启动作用，本实施例在野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220中，由此突变启动子替换编码谷氨酸脱氢酶的基因BBD29_09880的自身启动子(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6分别为BBD29_09880的ORF(CDS)和其启动子序列)，构建由此突变启动子启动的高产谷氨酸菌株。
一、构建PK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880的重组载体
采用NEBuilder重组技术构建PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880载体，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P5：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATGATCTTCTGGCCGCTG-3'，
P6：5'-CTAGTAGATAGGATTGCAATGACAGTTGATGAGCAG-3'，
P7：5'-CTGCTCATCAACTGTCATTGCAATCCTATCTACTAG-3'，
P8：5'-GGTGGGGGAGTTGGTCATAGCCCCCGAGTGTAATGA-3'，
P9：5'-TCATTACACTCGGGGGCTATGACCAACTCCCCCACC-3'，
P10：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGGCTTTGTGCCATCAACTT-3'
具体操作如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物对P5/P6和引物对P9/P10进行PCR扩增，获得两条大小分别为764bp和797bp的PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880的DNA片段，将引物对P5/P6的扩增产物命名为PBBD29_12340C-43T Up，将引物对P9/P10的扩增产物命名为PBBD29_12340C-43T Down；以谷氨酸棒杆菌YPG-12340为模板，以引物对P7/P8进行PCR扩增，获得大小为308bp的PBBD29_12340C-43T的DNA片段，命名为PBBD29_12340C-43T。
PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。
将经上述PCR扩增得到的三条DNA片段(PBBD29_12340C-43T Up、PBBD29_12340C-43T和PBBD29_12340C-43T Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将纯化产物与经过酶切(XbaI/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用NEBuilder酶50℃连接30min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆经M13引物(M13F：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)PCR鉴定获得阳性重组载体，命名为pK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880。
将初步酶切正确的重组质粒PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880送测序公司测序鉴定，并将含有正确PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880的重组载体pK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880保存备用。
重组载体pK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点Xba I/BamH I之间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.7的第1-1723位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
重组载体pK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880中含有完整的SEQ ID No.7(由于BBD29_12340启动子在基因组上是正向的，即BBD29_12340基因是正向的，而BBD29_09880基因在基因组上是反向的，所以要想用BBD29_12340C-43T突变启动子启动BBD29_09880基因，应该将BBD29_12340C-43T突变启动子反向互补整合到基因组上来启动BBD29_09880基因的表达)。SEQ ID No.7的第1-710位为BBD29_09880的5’端部分序列；第711-982位为BBD29_12340C-43T突变启动子序列(其中第753位为突变位点)；第983-1723位为BBD29_09885基因ORF的5’端部分序列。
二、构建包含基因PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880的工程菌株
构建方法：将步骤一中的重组质粒(pK18-PBBD29_12340C-43T-BBD29_09880)通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见实施例1步骤二，对培养产生的单菌落分别通过引物P11和P12进行鉴定，能扩增出1017bp(如SEQID No.8所示)大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用引物P13和P14扩增后，扩增出大小为1058bp(序列如SEQ ID No.9所示)的菌为谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220和ATCC13869基因组上BBD29_12340C-43T启动子替换BBD29_09880原始启动子的阳性菌株，分别命名为YPG-12340C-43T和G12340C-43T。
PCR鉴定引物如下所示：
P11：5'-TAACGGTTGCGCCGAGTT-3'(对应上同源臂BBD29_09880)，
P12：5'-GGCATGGAATTTGGGGTTTG-3'(对应BBD29-12340C-43T启动子区)，
P13：5'-CTAGTTAAGTTTGGCTTGCC-3'(对应BBD29-12340C-43T启动子区)，
P14：5'-TGCATGAGGGTGGACAGC-3'(对应下同源臂BBD29_09885)。
重组菌YPG-12340C-43T含有SEQ ID No.1所示的BBD29-12340C-43T启动子；具体地，重组菌YPG-12340C-43T是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组上BBD29_09880的启动子(即SEQ ID No.6)替换为BBD29-12340C-43T突变型启动子(即SEQ ID No.1)，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌G12340C-43T含有SEQ ID No.1所示的BBD29-12340C-43T启动子；具体地，重组菌G12340C-43T是将谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组上BBD29_09880的启动子(即SEQ IDNo.6)替换为BBD29-12340C-43T突变型启动子(即SEQ ID No.1)，保持谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
实施例3、L-谷氨酸发酵实验
将上述实施例1和实施例2构建的重组菌株(YPG-12340、G12340、YPG-12340C-43T和G12340C-43T)和对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。发酵结束采用SBA生物传感仪器(SBA-40E)检测L-谷氨酸产量与OD(562nm)。每个菌株重复三次。对L-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析，实验结果P<0.05(*)表示具有显著性差异，P<0.01(**)表示具有极显著性差异。
结果如表3和表4所示。可见，在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_12340基因启动子区进行点突变BBD29_12340C-43T(即将SEQ ID No.2所示的野生型启动子替换为SEQ ID No.1所示的突变型启动子)，能显著提高L-谷氨酸产量(p<0.01)。在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_09880基因启动子(SEQ ID No.6)替换为突变型BBD29_12340C-43T启动子(SEQ ID No.1)，也能显著提高L-谷氨酸产量(p<0.01)。
表1、发酵培养基配方(其余为水)
试剂名称 配比
葡萄糖 5.0g/L
磷酸 0.38g/L
硫酸镁 1.85g/L
氯化钾 1.6g/L
生物素 550μg/L
维生物素B1 300μg/L
硫酸亚铁 10mg/L
硫酸锰 10g/dl
KH2PO4 2.8g/L
维生素C 0.75mg/L
维生素B12 2.5μg/L
对氨基苯甲酸 0.75mg/L
消泡剂 0.0015ml/dl
甜菜碱 1.5g/L
甘蔗糖蜜 7ml/L
玉米浆 77ml/L
天冬氨酸 1.7g/L
毛发粉 2g/L
表2、发酵控制工艺
表3、谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
注：表中的P<0.01表示YPG-12340和YPG-12340C-43T的L-谷氨酸产量均与CGMCCNo.21220存在极显著差异。
表4、野生型菌株ATCC13869及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
注：表中的P<0.01表示G12340和G12340C-43T的L-谷氨酸产量均与ATCC13869存在极显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.一种提高细菌L-氨基酸产量的方法，包括如下步骤(A)或(B)：
(A)将细菌基因组中的BBD29_12340基因的启动子替换为特定DNA分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
所述BBD29_12340基因的启动子包含如下任一：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(b2)来源于细菌且与(b1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；
(B)将细菌基因组中的BBD29_09880基因的启动子替换为特定DNA分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高；
所述BBD29_09880基因的启动子包含如下任一：
(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(c2)来源于细菌且与(c1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；
所述特定DNA分子，为如下任一：
(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1的第230位以外的若干个核苷酸进行保守替换后得到的具有启动子功能的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
4.DNA分子，包含如下任一：
(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1的第230位以外的若干个核苷酸进行保守替换后得到的具有启动子功能的DNA分子。
5.权利要求4所述的DNA分子在作为启动子中的应用。
6.含有权利要求4所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组菌A或重组菌B；
所述重组菌A为将细菌基因组中的BBD29_12340基因的启动子替换为权利要求4所述的DNA分子后得到的重组菌；
所述BBD29_12340基因的启动子包含如下任一：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(b2)来源于细菌且与(b1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；
所述重组菌B为将细菌基因组中的BBD29_09880基因的启动子替换为权利要求4所述的DNA分子后得到的重组菌；
所述BBD29_09880基因的启动子包含如下任一：
(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(c2)来源于细菌且与(c1)具有95％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
8.根据权利要求7所述重组菌，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
9.如下任一应用：
P1、权利要求4所述的DNA分子或权利要求6-8中任一所述的表达盒或重组载体或重组菌在生产L-氨基酸中的应用；
P2、权利要求4所述的DNA分子或权利要求6-8中任一所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸工程菌株中的应用；
P3、权利要求4所述的DNA分子或权利要求6-8中任一所述的表达盒或重组载体在制备含有L-氨基酸的食品、药品、饲料或化妆品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
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