CN117568299A - Bbd29_06325基因突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了BBD29_06325基因突变体及其应用。本发明提供了BBD29_06325蛋白突变体，是将BBD29_06325蛋白(SEQ ID No.3)的第404位氨基酸残基由D替换为其他氨基酸后得到的蛋白质。本发明的有益效果：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_06325基因编码区进行点突变BBD29_06325A1211G(即将SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列)，可以显著提高L‑谷氨酸产量(p<0.01)。本发明对提高L‑谷氨酸产量具有重要意义。

Description

BBD29_06325基因突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及BBD29_06325基因突变体及其应用。
背景技术
谷氨酸是最常用的调味添加剂被广泛应用到食品工业。以葡萄糖为原料大量生产谷氨酸主要是由谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌等菌属为代表的细菌发酵获得，通过柠檬酸循环中的中间体α-酮戊二酸的还原性胺化合成谷氨酸。
为了大量积累谷氨酸就必须严格地控制发酵环境，此外，还要控制pH、通风量、溶氧、温度、磷酸及金属离子等，这些条件对于建立良好的谷氨酸发酵都是很重要的。
此外，人们通过提高谷氨酸棒杆菌利用葡萄糖的效率或者提高还原当量，增加高能化合物量促进细胞代谢。通过改进这些工程细胞的生长和繁殖，既可提高大规模培养物中的细胞存活力，又可提高其分裂率，从而使发酵罐培养物中活细胞数量增多而提高产率、产量或生产效率。
高丝氨酸脱氢酶是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶，同时也是限速酶，它催化天冬氨酸p-半醛生成高丝氨酸，最终控制合成蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸。
谷氨酸发酵在利用糖发酵过程会产生许多降解产物或中间体。然而，除数种有用的降解产物或中间体外，还产有乳酸、玻拍酸等有机酸及其他氨基酸，如蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸。如果在不适合谷氨酸生产的条件下，这些物质的生成量明显地增加。
目前，关于BBD29_06325基因编码的高丝氨酸脱氢酶在谷氨酸发酵过程中对L-谷氨酸产量方面的影响还未见报道。
发明内容
为了更好地挖掘谷氨酸棒杆菌产谷氨酸的代谢潜力，减少谷氨酸发酵过程中其他氨基酸的生成，进一步提升生物制造的效率，本发明将产L-谷氨酸菌株的编码高丝氨酸脱氢酶基因BBD29_06325进行定点突变，以减少副产物的生成，进而提高L-谷氨酸的生物合成。
第一方面，本发明要求保护BBD29_06325蛋白突变体。
本发明所要求保护的BBD29_06325蛋白突变体是将BBD29_06325蛋白的第404位氨基酸残基由D替换为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_06325蛋白包含(或为)如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
进一步地，所述BBD29_06325蛋白突变体是将所述BBD29_06325蛋白的第404位氨基酸残基由D替换为G后得到的蛋白质。即所述BBD29_06325蛋白突变体的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面中所述BBD29_06325蛋白突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子可包含(或为)如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)与(B1)限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_06325蛋白突变体的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
进一步地，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
进一步地，所述表达盒由启动子、由所述启动子启动表达的所述核酸分子，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述核酸分子连接，且所述核酸分子与所述转录终止序列连接。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子。
进一步地，所述重组微生物为含有所述表达盒或所述重组载体的重组微生物。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(Pantoea)。进一步地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。更进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
在本发明中，所述重组微生物具体为重组菌。
进一步地，所述重组菌为将细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第一方面中所述核酸分子后得到的重组菌。
其中，编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一：
(C1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(C2)与(C1)限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_06325蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
具体地，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第一方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.4的第1211位由A突变为G(其他核苷酸序列不变)实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述细菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_06325A1211G实现的。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第一方面中所述的BBD29_06325蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸中的应用；
P2、前文第一方面中所述的BBD29_06325蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在提高细菌L-氨基酸产量中的应用；
P3、前文第一方面中所述的BBD29_06325蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸工程菌株中的应用。
第五方面，本发明要求保护一种提高细菌L-氨基酸产量的方法。
本发明要求保护的提高细菌L-氨基酸产量的方法，可包括如下步骤：将细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高。
第六方面，本发明要求保护一种构建产L-氨基酸工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建产L-氨基酸工程菌株的方法，可包括如下步骤：
(a1)将细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子，得到所述产L-氨基酸工程菌株。
其中，编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一：
(C1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(C2)与(C1)限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_06325蛋白的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
具体地，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第一方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌基因组中SEQ ID No.4的第1211位由A突变为G(其他核苷酸序列不变)实现。
在本发明的具体实施方式中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子通过向所述细菌中导入实施例中的重组载体pK18-BBD29_06325A1211G实现。
进一步地，在所述方法中，将所述细菌基因组中的编码所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后还可包括对所得重组细菌进行发酵培养的步骤。从发酵培养产物中可以获得所述L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
进行所述发酵培养过程中，培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素及其组合。进行所述发酵培养过程中，可以调节培养物的pH(如控制pH为6.8-7.0)。进行所述发酵培养过程中，培养物的温度可以是30至40℃。在进行所述发酵培养过程中，可以控制流加糖浓度(如控制为50-55％，即100mL液体中含糖的质量是50-55g)，控制发酵体系残糖(如控制为0.5-1.0％，即100mL液体中含糖的质量是0.5-1.0g)。
在本发明的具体实施方式中，进行所述发酵培养时采用的培养基的配方以及发酵控制工艺具体参见实施例中相关描述。
在上述各方面中，所述细菌为具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌。所述“具有生产L-氨基酸(如L-谷氨酸)能力的细菌”指细菌具有以下能力：利用外界物质(如培养基)，在细菌体内产生并累积L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力，进一步还可包括将L-氨基酸(如L-谷氨酸)分泌到培养体系中的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸(如L-谷氨酸)。
所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。所述“修饰后的细菌”是指将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述细菌可为棒杆菌属细菌，如谷氨酸棒杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21220或野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869。
相应地，前文第三方面中所要求保护的重组微生物(重组菌)具体为重组菌YPG-06325或重组菌G06325。
所述重组菌YPG-06325为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220基因组中SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因替换为SEQ ID No.2所示的突变后BBD29_06325基因。具体可通过将SEQ ID No.4的第1211位由A突变为G实现，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌G06325为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869基因组中SEQ IDNo.4所示的BBD29_06325基因替换为SEQ ID No.2所示的突变后BBD29_06325基因序列。具体可通过将SEQ ID No.4的第1211位由A突变为G实现，并保持其他序列不变得到的菌株。
在上述各方面中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
本发明的BBD29_06325蛋白突变体可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的谷氨酸，所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明BBD29_06325蛋白突变体的编码基因置于目的产物合成途径中，并对合成途径中的基因进行表达，即可实现目的产物的生产。
本发明实验证明：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_06325基因编码区进行点突变BBD29_06325A1211G，即将SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因编码区野生型序列替换为SEQID No.2所示的突变序列，能够显著提高发酵生产L-谷氨酸的产量(p<0.01)。本发明对提高棒杆菌属细菌发酵生产L-谷氨酸的产量具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。下文简称谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。保藏人宁夏伊品生物科技股份有限公司已经授权黑龙江伊品生物科技有限公司使用该菌株。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869为ATCC中编号为13869的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。下文简称谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
实施例1、在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_06325基因编码区进行点突变BBD29_06325A1211G，构建重组菌
一、构建包含点突变的BBD29_06325基因编码区片段的重组载体
首先，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869基因组序列，设计并合成两对扩增BBD29_06325基因编码区及其下游序列的引物(加粗字体的碱基为突变位置)，如下：
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTCTGCTGAGCTTGCTGATG-3'，
P2：5'-GATCAGACGTGCATCACCATCGCGCTCTTCCTGTCGGATTG-3'，
P3：5'-CAATCCGACAGGAAGAGCGCGATGGTGATGCACGTCTGATC-3'，
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGCGAGACACGTTGAATCG-3'。
注：P1和P4上下划线部分是pK18mobsacB载体上自带的序列。
然后，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_06325基因)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_06325基因编码区中引入点突变。所述点突变为将BBD29_06325基因编码区的野生型核苷酸序列(SEQ ID No.4)的第1211位腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G，其他序列不变，得到SEQ ID No.2所示的BBD29_06325基因突变序列。SEQ ID No.4编码SEQ ID No.3所示的BBD29_06325野生蛋白；上述点突变导致BBD29_06325野生蛋白的第404位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)，即得到SEQ ID No.1所示BBD29_06325突变蛋白。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示的BBD29_06325突变蛋白。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，具体操作如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以上述引物对P1/P2和引物对P3/P4进行PCR扩增，扩增体系和反应程序如下：
PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃过度延伸10min。
通过上述PCR扩增获得两条大小分别为889bp和837bp的BBD29_06325基因编码区及启动子区的DNA片段(均带有突变碱基)。将引物对P1/P2的扩增产物命名为BBD29_06325Up，引物对P3/P4的扩增产物命名为BBD29_06325Down。
接着，将上述两条DNA片段(BBD29_06325Up和BBD29_06325Down)进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将纯化产物与经Xba I和BamH I双酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用NEBuilder酶50℃连接30min，然后连接产物转化DH5a，长出的单克隆用M13引物(M13F：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行PCR鉴定，获得的阳性重组载体命名为pK18-BBD29_06325A1211G。
重组载体pK18-BBD29_06325A1211G的结构描述：将pK18mobsacB质粒的酶切位点Xbal I和BamH I之间的小片段替换为SEQ ID No.5的第37-1647位所示的DNA片段后得到的重组质粒(保持pK18mobsacB载体的其他序列不变)。
重组载体pK18-BBD29_06325A1211G中含有完整的SEQ ID No.5。SEQ ID No.5的第1-36位和第1648-1685位为pK18mobsacB质粒上自身序列；第37-1000位为谷氨酸棒杆菌基因组上BBD29_06325基因编码区后半部分序列；第1001-1647位为BBD29_06325基因编码区下游序列。其中，SEQ ID No.5的第873位为突变位点，该突变位点使得谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中BBD29_06325基因编码区的第1211位的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)(对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第1211位)。
二、构建包含基因BBD29_06325A1211G的工程菌株
将步骤一构建得到的重组载体pK18-BBD29_06325A1211G通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中。然后在培养基中进行培养，培养基的组成：蔗糖10g/L；多聚蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；酵母粉5g/L；尿素2g/L；氯化钠2.5g/L；琼脂粉20g/L；余量为水；pH 7.0。培养条件：32℃。
接着，分别用步骤一中的引物P1和通用引物M13R(5’-CAG GAAACAGCTATGACC-3’)对培养产生的单菌落进行鉴定，能扩增出如SEQ ID No.6所示的1692bp大小条带的菌株为阳性菌株。然后，将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，各选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的十六株菌株，即与基因组发生同源重组阳性的菌株，进一步采用P1和P4引物(序列参见步骤一)扩增后，获得BBD29_06325基因编码区的第1211位碱基序列发生突变(A-G)(对应SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的第1211位)的菌株，即为等位替换成功的阳性菌株，依据原始菌株的不同分别命名为YPG-06325、G06325。
重组菌YPG-06325和G06325均含有SEQ ID No.5的第37-1647位所示的包括突变的基因BBD29_06325A1211G的片段。重组菌YPG-06325为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220基因组中SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因编码区的野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列后得到的菌株(保持其他序列不变)。重组菌G06325为将ATCC13869的基因组中SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因编码区的野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列后得到的菌株(保持其他序列不变)。
实施例2、L-谷氨酸发酵实验
将上述实施例1构建得到的重组菌株YPG-06325和G06325，以及对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中进行发酵实验。发酵结束采用SBA生物传感仪器(SBA-40E)检测L-谷氨酸产量与OD(562nm)。
其中，发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L；磷酸0.38g/L；硫酸镁1.85g/L；氯化钾1.6g/L；生物素550μg/L；维生物素B1 300μg/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰10g/dl；KH2PO42.8g/L；维生素C 0.75mg/L；维生素B12 2.5μg/L；对氨基苯甲酸0.75mg/L；消泡剂0.0015ml/dl；甜菜碱1.5g/L；甘蔗糖蜜7ml/L；玉米浆77ml/L；天冬氨酸1.7g/L；毛发粉2g/L；余量为水。
控制工艺如表1所示。
表1、发酵控制工艺
每个菌株重复三次。
L-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析，实验结果P<0.05(*)表示具有显著性差异，P<0.01(**)表示具有极显著性差异。
结果如表2和表3所示。可见：在谷氨酸棒杆菌中将BBD29_06325基因编码区进行点突变BBD29_06325A1211G，即将SEQ ID No.4所示的BBD29_06325基因编码区野生型序列替换为SEQ ID No.2所示的突变序列，能显著提高L-谷氨酸的发酵产量(p<0.01)。
表2、谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
表3、野生型菌株ATCC13869及其突变株的L-谷氨酸发酵实验结果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.BBD29_06325蛋白突变体，是将BBD29_06325蛋白的第404位氨基酸残基由D替换为其他氨基酸后得到的蛋白质；
所述BBD29_06325蛋白包含如下任一：
(A1)如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
(A2)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的BBD29_06325蛋白突变体，其特征在于：所述BBD29_06325蛋白突变体是将所述BBD29_06325蛋白的第404位氨基酸残基由D替换为G后得到的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述BBD29_06325蛋白突变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)与(B1)限定的DNA序列具有95％以上同一性且编码所述BBD29_06325蛋白突变体的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组微生物为重组菌；
进一步地，所述重组菌为将细菌基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为权利要求3或4所述核酸分子后得到的重组菌。
7.如下任一应用：
P1、权利要求1或2所述的BBD29_06325蛋白突变体或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产L-氨基酸中的应用；
P2、权利要求1或2所述的BBD29_06325蛋白突变体或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的表达盒或重组载体在提高细菌L-氨基酸产量中的应用；
P3、权利要求1或2所述的BBD29_06325蛋白突变体或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的表达盒或重组载体在构建产L-氨基酸工程菌株中的应用。
8.一种提高细菌L-氨基酸产量的方法，包括如下步骤：将细菌基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为权利要求3或4所述核酸分子，实现细菌所述L-氨基酸产量的提高。
9.一种构建产L-氨基酸工程菌株的方法，包括如下步骤：将细菌基因组中的编码权利要求1中所述BBD29_06325蛋白的核酸分子替换为权利要求3或4所述核酸分子，得到所述产L-氨基酸工程菌株。
10.根据权利要求6所述的重组菌或权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌；和/或
所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
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